CN108517355A - 一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品致病菌检测技术领域，具体涉及一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括收集待测样品，制成样品溶液；乳制品前处理；制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片；制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片处理样品；提取金黄色葡萄球菌DNA；PCR检测。本发明针对金黄色葡萄球菌建立一种从乳品中灵敏快速实用性强无需前增菌的PCR检测方法，检测时间为4小时，且检测限低，检测灵敏度高，不容易出现假阳性或者假阴性结果，可以确保食品从农场到餐桌流通过程中的食品安全实时检测。

Description

一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

技术领域

本发明属于食品致病菌检测技术领域，具体涉及一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法。

背景技术

近年来，全球食源性疾病发病率呈不断上升的趋势。据报道，发达国家每年约30％的人口患食源性疾病。尽管没有关于发展中国家食源性疾病的系统性报道，但情况可能更严重。WHO报告表明，全球食源性疾病患者达数亿人，每年约有几亿腹泻病例，导致约300万5岁以下儿童死亡，其中约70％是因生物源性污染食品所致。在发展中国家，估计每年腹泻及其相关疾病有2.7亿病例，导致240万5岁以下儿童死亡,食源性疾病不但严重危害人们的健康，而且造成大量经济损失。据报道，全球每年发生40-60亿例食源性疾病，发展中国家每年约有180万人口死于食源性疾病，即使是在发达国家，每年亦有10％以上的人群感染食源性疾病。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。食源性疾病并不随经济发展和技术进步而减少或消失，世界范围内食品安全恶性事件接连发生，食源性疾病未能受到有效控制，食源性疾病发生率居高不下，食品安全形势严峻。目前我国对于食源性病原菌的检测、鉴定仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型水平，这些传统的方法操作复杂、检测周期较长，而且无法对难以培养的病原菌进行检测；而一些简单的分子生物学和免疫学方法假阳性或者假阴性率又较高，因此快速、简便、特异的检测方法成为研究的热点。

现有技术中，常用的食源性致病菌快速检测方法简要介绍如下：

1.PCR技术：PCR技术是在1971年首先提出的。该方法通过对人工难以培养的微生物相应DNA片段的扩增，检测扩增产物含量，从而快速地对食品中致病菌含量进行检测。检测时，首先在高温下(95℃)使得蛋白质变性，DNA双链变成单链；再迅速降温(55℃)，每条DNA单链退火，这就是所谓的热循环。之后温度重新上升到95℃，开始新的循环。经一套扩增循环(21到31次)将一个单分子DNA扩增到10⁷分子。整个过程可以在1h内通过自动热量循环器完成。理论上，只要样品中含有一分子沙门氏菌的DNA，通过PCR技术完全可以在短时间内检测到。这种测定方法的优点是测定结果迅速，灵敏度和特异性高，检测成本低。PCR技术采用DNA扩增和自动化程序对特定的致病菌进行检测，己经成功地对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞李斯特菌等致病菌进行了有效测定。

2.酶联免疫法ELISA：抗原-抗体反应法是测定特异性致病菌及其产生毒素最常用的方法。ELISA是利用抗原和抗体之间的反应，在临床医学领域的许多方面都有应用。抗体在抗血清中可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。这两种抗体在ELISA技术中对于沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7、李斯特菌等血清型细菌有很好的检测效果。

3.生物感应器Biosensor：生物传感器主要由生物识别元件和信号转换器两大部分组成。生物识别元件又称感受器，由具有分子识别能力的生物活性物质(如酶、微生物、动植物组织切片)构成。信号转换器(如热敏电阻、光纤等)是一个电化学、光学或热敏检测元件。当生物识别元件与待测物发生特异作用后，所得产物(光、热等)通过信号转换器转变成可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。由于生物传感器具有经济、简便、专一性强等特点，在现代食品微生物检测中前景广阔。

4.基因芯片技术Microarray：基因芯片是20世纪90年代初发展起来的一种全新的微量分析技术，它是采用微加工和微电子技术将大量的人工设计好的基因片断有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上而得到的一种信息检测芯片。其原理简单来说就是，将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，通过扫描仪定量分析荧光分布模式从而来确定检测样品是否存在某些特定微生物。由于基因芯具有简便快速、高通量、可并行检测、特异性强等优点，因而在食品检测领域有着广泛的发展前景。

上述所列举的快速检测方法，虽然已经在食品安全领域得到广泛运用，但是依然存在很多缺陷，无法有效满足现阶段食品安全的要求。生物传感器和基因芯片技术虽然展现了对致病菌检测的高通量优势，但这些方法对于检测设备往往有较高的要求，检测成本大幅上升，同时也对实验室检测人员的操作技能有很高的要求。常规PCR和免疫学检测方法，通常面临的问题是检测方法灵敏度不够高，一般食品样品经过选择性增菌处理后，待检细菌浓度要达到10⁴-10⁵cfu/ml才能得到比较准确结果，当食品样品中存在防腐剂，天然抗菌，抑菌成分时，往往待检致病菌浓度达不到检测限，导致出现假阳性或者假阴性结果。此外，食品中含有大量的PCR反应抑制因子，比如脂肪、蛋白质、酶、抗生素、有机和无机化学物质，多糖类物质等，这些抑制因子极大地影响了PCR方法对食品中致病菌检测的应用。目前，对于克服PCR反应抑制因子的方法是通过检测前12-24小时增菌的手段，提高检测的灵敏度，但同时也延长了检测时间。

综上，现有技术存在的问题是，生物传感器和基因芯片技术对设备要求高、检测成本高，常规PCR方法和酶联免疫法灵敏度不够高，容易出现假阳性或者假阴性结果。

发明内容

本发明提供的一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，解决了现有技术的生物传感器和基因芯片技术对设备要求高、检测成本高的问题，也解决了常规PCR和酶联免疫法灵敏度不够高，容易出现假阳性或者假阴性结果的问题。

本发明的目的是提供一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括以下步骤：

S1，收集待测样品，去脂肪，制成去脂肪样品溶液；

S2，乳制品前处理

将无水乙醇、氨水和石油醚分别加入到样品溶液中，混匀，得到的混合物离心，弃去上清液，将沉淀溶于10mmol/L的TE缓冲液中，得到去脂肪样品溶液；其中，无水乙醇、氨水、石油醚、样品溶液和TE缓冲液的体积比例为1：1：1：25：1；

S3，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片

将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆按照1～5:1～5的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液，溶质为SDS；除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液；制备滤纸圆片，灭菌，浸泡于无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，充分浸湿滤纸圆片，干燥，用超纯水清洗滤纸圆片，再次干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片；

S4，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片处理样品

向去脂肪样品溶液加入0.25倍体积的乙酸乙酯，混匀，离心，去掉上清液，沉淀用灭菌超纯水悬浮，加入所述纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，充分浸湿，取出滤纸圆片干燥；将干燥的纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定的滤纸圆片浸入到灭菌的10g/100ml的SDS溶液中，搅拌，取出滤纸圆片并放入到10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液中，搅拌，用无菌去离子水清洗滤纸圆片两次；清洗过后的滤纸圆片再次干燥，得到金黄色葡萄球菌吸附滤纸；

S5，提取金黄色葡萄球菌DNA

将金黄色葡萄球菌吸附滤纸浸泡在含有牛血清白蛋白的蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精DNA溶液和去离子水；沸水浴，得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，离心，取上清并加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，离心，弃去上清液，保留沉淀的DNA，加入无菌去离子水溶解沉淀的DNA，得到DNA模板，备用；

S6，PCR检测

PCR检测使用的引物序列为：

nuc1：5’-gcagatttacgagatagaggaaca-3’

nuc2：5’-tttatgtggttatttcctgac-3’

如果获得的PCR检测产物片段为827bp，则结果为阳性。

优选的，上述乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法中，S3中，S1的具体步骤为：如果待测乳品为生牛乳，则直接作为样品溶液备用；如果待测乳品为乳粉，则将乳粉与灭菌超纯水混合按照1g：1ml的比例混合均匀，至固体彻底溶解，得到均质液，作为样品溶液备用；如果待测乳品为奶酪，则将奶酪磨碎，加入2g/100ml柠檬酸钠溶液，混合均匀制成均质液，作为样品溶液备用，其中奶酪与柠檬酸钠溶液的比例为25g：90ml。

优选的，上述乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法中，所述去脂肪的具体步骤如下：将无水乙醇、浓氨水和石油醚分别加入到待测样品中，混匀，得到的混合物12000gpm离心5min，弃去上清液，将沉淀溶于10mmol/L、pH＝8的TE缓冲液中，得到去脂肪样品溶液；其中无水乙醇、浓氨水、石油醚、待测样品、TE缓冲液的体积比例为1：1：1：25：1

优选的，上述乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法中，S3中，S2中离心的条件为12000gpm离心5min，TE缓冲液的pH＝8。

优选的，上述乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法中，S4中，S3中，纳米氢氧化钛的粒径为100-200nm，纳米氢氧化锆的粒径为50-100nm。

优选的，上述乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法中，S4中，S3的具体步骤为，将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆按照1～5:1～5的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH 7.8的TE缓冲液，溶质为SDS，30℃搅拌至固体完全溶解，用孔直径0.22μm的膜过滤除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液，备用；将洁净的滤纸制备成直径为4.00mm滤纸圆片，放入到瓶内，121℃高压灭菌15min，灭菌的滤纸圆片放入到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，充分浸湿滤纸圆片；将处理过的滤纸圆片置于通风处干燥，备用；将固定了纳米氢氧化钛/氢氧化锆的在灭菌超纯水中清洗，再次通风干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片。

优选的，上述乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法中，S4中，去脂肪样品溶液、乙酸乙酯、灭菌超纯水、SDS溶液和TE缓冲液的体积比例为1：0.25：0.1：5：5。

优选的，上述乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法中，S6中，蛋白溶液、鲑鱼精DNA溶液和无菌超纯水的体积比例为5:1:4。

与现有技术相比，一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，具有以下

有益效果：

(1)本发明的目的是建立有效的样品处理方法提高致病菌从食品(特别是乳品)中的回收率，消除PCR反应抑制因子。本发明针对金黄色葡萄球菌为检测目标，建立一种从乳品中灵敏快速实用性强无需前增菌的PCR检测方法：利用无水乙醇、氨水和石油醚进行乳制品中脂肪去除的前处理；将特定浓度金属氢氧化物固定在滤纸片中，利用金属氢氧化物表面的羟基基团可与微生物细胞表面的配体结合特性，对乳制品中金黄色葡萄球菌进行吸附富集。根据实验工作证实，纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆可以更为有效从乳制品中吸附富集金黄色葡萄球菌，并且可以更为方便的固定在滤纸上，另外在样品处理过程中添加定量鲑鱼精DNA可以进一步去除PCR反应抑制因子，提高检测灵敏度。

(2)本发明的方法是一种从乳品中灵敏快速实用性强无需前增菌的PCR检测方法，大大缩短目前常规金黄色葡萄球菌检测及快速检测方法的检测时间，新建立的检测方法对样品的检测时间为4小时，且检测限仅为10cfu/25g(液体乳品以10cfu/25ml计)，检测灵敏度高，不容易出现假阳性或者假阴性结果，可以确保食品从农场到餐桌流通过程中的食品安全实时检测，进而更好地确保消费者健康。所用试剂耗材(纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片等)可以在冷冻条件下稳定保存至少12个月。经申请人实验证明，如果不采用纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片、不使用鲑鱼精DNA除杂质，PCR检测结果难以辨别，甚至无法得到PCR扩增结果。

附图说明

图1是不同样品的阳性和阴性检测结果电泳图；

其中，M泳道为DNA maker，1、3-28号泳道为阳性检测结果，2号泳道为阴性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。

实施例1

一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括以下步骤：

S1，收集待测样品，去脂肪，制成去脂肪样品溶液；

S11，收集待测样品

本实施例1收集的待测样品为人工污染样品，人工污染生牛乳样品按以下方法制备：取25ml生牛乳样品人工污染1ml金黄色葡萄球菌菌悬液(浓度范围分别为10⁰cfu/ml、10¹cfu/ml、10²cfu/ml、10³cfu/ml、10⁴cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁸cfu/ml)；人工污染乳粉样品按照以下方法制备：取25g全脂乳粉加入25ml灭菌超纯水，磁力搅拌、均质，至固体彻底溶解，得到均质液，将1ml不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液人工污染到50ml均质液中，使金黄色葡萄球菌的浓度依次为10⁰cfu/ml、10¹cfu/ml、10²cfu/ml、10³cfu/ml、10⁴cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁸cfu/ml；脱脂乳粉与全脂乳粉的污染方法相同，此处不予赘述；人工污染奶酪样品的制备方法为：取25g奶酪在研钵中磨碎，加入40℃2g/100ml柠檬酸钠溶液90ml混匀，搅拌、均质，制成均质液，然后对奶酪均质液人工污染金黄色葡萄球菌菌悬液，并稀释成的浓度依次为10⁰cfu/ml、10¹cfu/ml、10²cfu/ml、10³cfu/ml、10⁴cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁸cfu/ml。

上述人工污染的样品放入4℃冰箱中保存过夜，确保致病菌有效的吸附在样品上，得到人工污染样品，检测开始前要对样品中的待检致病菌浓度进行实际测试，测试方法参照现行国家食品中各种致病菌检测方法进行。

S12，待测样品去脂肪

将1ml无水乙醇、1ml浓氨水(市售25～28％的浓氨水)和1ml石油醚分别加入到25ml人工污染样品中，混匀，得到的混合物12000gpm离心5min，弃去上清液，将沉淀溶于1ml10mmol/L、pH＝8的TE缓冲液(即1×TE、pH＝8)中，得到去脂肪样品溶液。

S3，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片

将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆按照5:1的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液，溶质为SDS；除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液；制备滤纸圆片，灭菌，浸泡于无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，充分浸湿滤纸圆片，干燥，用超纯水清洗滤纸圆片，再次干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，具体步骤如下：

将纳米氢氧化钛(粒径为100-200nm)和纳米氢氧化锆(粒径为50-100nm)(宣城晶瑞新材料有限公司)按照5:1的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液(即1×TE、pH＝7.8)，溶质为SDS，30℃磁力搅拌30min至固体完全溶解，用孔直径0.22μm的膜过滤除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液，备用；将洁净的滤纸用打孔器制备成直径为4.00mm滤纸圆片，放入到耐高温的广口瓶内，121℃高压灭菌15min，灭菌的滤纸圆片按照无菌操作流程放入到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，磁力搅拌5min，充分浸湿滤纸圆片；将处理过的滤纸圆片放入到无菌一次性平皿中，放入到提前灭菌处理过的超净工作台内，鼓风干燥，备用；将固定了纳米氢氧化钛/氢氧化锆的在灭菌超纯水中震荡清洗两次，除去固定结合不牢固的金属氢氧化物，随后将清洗过的纳米氢氧化钛/氢氧化锆滤纸圆片放入到无菌一次性平皿中，放入到提前灭菌处理过的超净工作台内，再次鼓风干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，备用。

S4，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片处理样品

向1ml去脂肪样品溶液加入0.25倍体积的乙酸乙酯，振荡器混匀2min，然后以14000g离心10min，去掉上清液，沉淀用100μL灭菌超纯水悬浮，加入直径4.00mm的所述纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，充分浸湿，这时金黄色葡萄球菌吸附在滤纸圆片上，取出滤纸圆片放入到超净工作台中进行鼓风干燥，备用；将干燥的纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定的滤纸圆片浸入到5ml灭菌的10g/100ml的SDS溶液(溶剂超纯水)中，涡旋震荡搅拌2min，取出滤纸圆片并放入到5ml 10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液中，涡旋震荡搅拌2min，用无菌去离子水清洗滤纸圆片两次；清洗过后的滤纸圆片再次放入到超净工作台中进行鼓风干燥，得到金黄色葡萄球菌吸附滤纸，备用。

S5，提取金黄色葡萄球菌DNA

将金黄色葡萄球菌吸附滤纸浸泡在0.5ml含有100μl 5mg/ml牛血清白蛋白的蛋白溶液中，加入100μl 0.05mg/ml鲑鱼精DNA溶液和400μl无菌超纯水。将离心管放入沸水中，沸水浴热裂解细胞10min，将得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，12000rpm离心5min，将上清液转移至干净离心管内，加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，以沉淀DNA，离心管再次12000离心15min，弃去上清液，保留沉淀，加入100μl无菌去离子水溶解沉淀的DNA，DNA样品分装，每份10μl，得到DNA模板，备用。

S6，PCR检测

针对金黄色葡萄球菌毒力基因(nuc)设计特异引物序列，优化反应条件。所述引物序列为：

nuc1：5’-gcagatttacgagatagaggaaca-3’

nuc2：5’-tttatgtggttatttcctgac-3’

50μl PCR反应体系：5μl 10×PCR buffer，4μl dNTPs混合物，0.5μl引物nuc1(40μmol/L)，0.5μl引物nuc2(40μmol/L)，0.25μl(5U/μl)Taq DNA聚合酶，模板1μl，ddH₂O 38.75μl。

PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸1min，40个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。

如果获得的PCR检测产物片段为827bp，则结果为阳性，阳性和阴性检测结果电泳图如图1所示。其中，M泳道为DNA maker，1、3-28号泳道为阳性检测结果，2号泳道为阴性检测结果。

实施例2

一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括以下步骤：

实施例2的待测样品为实际乳品，如果待测乳品为生牛乳，则直接作为样品溶液备用，进行后续S2的操作；如果待测乳品为乳粉，则将乳粉与灭菌超纯水混合按照1g：1ml的比例混合均匀，至固体彻底溶解，得到均质液，作为样品溶液备用，进行后续S2的操作；如果待测乳品为奶酪，则将奶酪磨碎，加入2g/100ml柠檬酸钠溶液，混合均匀制成均质液，作为样品溶液备用，进行后续S2的操作。其余S2～S6的步骤与实施例1相同，此处不予赘述。

实施例3

一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括以下步骤：

将实施例1的S3中的“纳米氢氧化钛(粒径100-200nm)和纳米氢氧化锆(粒径50-100nm)，按照5:1的质量比例混合”中的比例改为“4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或者1:5中任一个”，其余操作同实施例1。

下面是实施例1的方法为例，说明本发明的效果。

一、不同引物的检测效果

我们对不同的食品中常见微生物进行实际测试，利用本发明实施例1的方法制备人工污染样品和提取不同微生物的DNA，并利用本发明实施例1中的引物进行PCR反应，作为实验组，验证检测方法的特异性。

以已经公开发表的金黄色葡萄球菌检测引物特异性(Coa1：5’-CGCGGATCCAGCTTATTTACATGGGAT-3’；Coa2：5’-CCGCTCGAGTTAT TTTGTTACTCTAGGC-3’，针对血浆凝固酶Coa设计)作为对照，其余操作同实验组。同时以现行国家食品中常见微生物检测标准方法作为对比，来验证本发明新建立的PCR检测方法的实用性，结果见表1。

表1不同引物检测的特异性

注：表1中“+”表示阳性结果，“—”表示阴性结果。

本发明方法中为了检验nuc引物序列的特异性，共计检测了180株ATCC菌株，并且与已经发表的金黄色葡萄球菌血浆凝固酶编码基因Coa引物序列特异性做了比对。表1的结果表明本发明实施例1方法所设计的nuc引物序列的特异性极好，97株ATCC金黄色葡萄球菌均为阳性结果，83株ATCC其他葡萄球菌及非葡萄球菌均为阴性结果。然而，血浆凝固酶Coa引物序列特异性则并非很好，某些ATCC金黄色葡萄球菌菌株为阴性结果，部分ATCC其他葡萄球菌及非葡萄球菌为阳性结果。因此，本发明所设计的nuc引物序列的特异性完全可以满足对该致病菌检测的要求，且优于现有公开的引物序列。

二、检测限的确定

利用实施例1的方法将不同浓度的金黄色葡萄球菌人工污染到乳品中，并利用实施例1的方法检测方法进行检测，确定实施例1的检测灵敏度，全脂乳粉结果见表2。由表2可知，实施例1的检测方法的检测灵敏度为10cfu/25g(液体乳品以10cfu/25ml计)，为方便起见，以下均计作“cfu/25g”，且稳定性良好。脱脂乳粉、奶酪和生牛乳的检测结果与全脂乳粉的检测结果完全相同，此处仅以全脂乳粉的结果作为示例，即在菌体浓度为1cfu/25g时，检测结果为阴性，当菌体浓度大于等于10cfu/25g时，检测结果为阳性。说明本发明的方法对于全脂乳粉、脱脂乳粉、奶酪和生牛乳均通用。

表2用全脂乳粉制备的人工污染乳品的灵敏度

注：表2中“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。

三、与现行国家标准方法的比较

采集市售新鲜全脂乳粉、脱脂乳粉、奶酪和生牛乳各500份，分别采用本发明实施例1的快速检测方法和现行国家检测标准进行检测对比，用来验证该快速检测方法的实用性，结果见表3。由表3可知，实施例1的方法与现有国家标准方法的检出率、符合率和活体菌检测率均相同，活体菌检出率为100％，实用性极佳，且实施例1的方法检测时间明显缩短，仅为4小时。

表3实际样品测试结果

四、保存时长实验

本发明的检测方法中所用到的主要试剂耗材有纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，各种缓冲液等。其中，纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片采用实施例1的方法制备，各种缓冲液如未特殊提及，则采用现有方法制备。

为了测试本发明方法中所用到试剂耗材的稳定性，将方法中所用的试剂耗材均保存在-20℃冷冻条件下，分别保存3个月、6个月、12个月，随后分别采集市售的全脂奶粉、脱脂奶粉、奶酪和生牛乳各500份进行测试比对，并与现行国家检测标准比对，确认本发明方法所用的试剂耗材在长时间保存下的稳定性与实用性。

表4人工污染样品保存时长实验测试结果

注：表4中“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。

表4的结果显示，将上述试剂耗材在-20℃保存3个月、6个月、12个月后对全脂乳粉、脱脂乳粉、奶酪、生牛乳等样品测试其检测灵敏度，其检测灵敏度为10cfu/25g，结果证明本发明方法中的试剂耗材均可以在-20℃冷冻条件下至少保存12个月，其检测灵敏度不会受到影响。

为了测试本发明方法中所用到试剂耗材的稳定性，将方法中所用的试剂耗材均保存在-20℃冷冻条件下，分别保存3个月、6个月、12个月，随后分别采集市售的全脂奶粉、脱脂奶粉、奶酪和生牛乳各500份进行测试比对，并与现行国家检测标准比对，确认本发明方法所用的试剂耗材在长时间保存下的稳定性与实用性。表5是实际样品的测试结果，表5结果显示本发明方法所用到的试剂耗材以及国家标准方法制备的试剂耗材在-20℃保存3个月、6个月、12个月条件下对全脂乳粉、脱脂乳粉、奶酪、生牛乳等样品进行检测，并采用国家检测标准比对，本发明方法的检出率，符合率与国家检测标准方法均一致，活体菌检测率达到100％，结果证实本发明方法的实用性极好，所用试剂耗材(纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片等)可以在冷冻条件下稳定保存至少12个月。

表5实际样品保存时长实验测试结果

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均能选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例1，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，收集待测样品，去脂肪，制成去脂肪样品溶液；

S2，乳制品前处理

将无水乙醇、氨水和石油醚分别加入到样品溶液中，混匀，得到的混合物离心，弃去上清液，将沉淀溶于10mmol/L的TE缓冲液中，得到去脂肪样品溶液；其中，无水乙醇、氨水、石油醚、样品溶液和TE缓冲液的体积比例为1：1：1：25：1；

S3，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片

将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆按照1～5:1～5的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液，溶质为SDS；除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液；制备滤纸圆片，灭菌，浸泡于无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，充分浸湿滤纸圆片，干燥，用超纯水清洗滤纸圆片，再次干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片；

S4，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片处理样品

向去脂肪样品溶液加入0.25倍体积的乙酸乙酯，混匀，离心，去掉上清液，沉淀用灭菌超纯水悬浮，加入所述纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，充分浸湿，取出滤纸圆片干燥；将干燥的纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定的滤纸圆片浸入到灭菌的10g/100ml的SDS溶液中，搅拌，取出滤纸圆片并放入到10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液中，搅拌，用无菌去离子水清洗滤纸圆片两次；清洗过后的滤纸圆片再次干燥，得到金黄色葡萄球菌吸附滤纸；

S5，提取金黄色葡萄球菌DNA

将金黄色葡萄球菌吸附滤纸浸泡在含有牛血清白蛋白的蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精DNA溶液和去离子水；沸水浴，得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，离心，取上清并加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，离心，弃去上清液，保留沉淀的DNA，加入无菌去离子水溶解沉淀的DNA，得到DNA模板，备用；

S6，PCR检测

PCR检测使用的引物序列为：

nuc1：5’-gcagatttacgagatagaggaaca-3’

nuc2：5’-tttatgtggttatttcctgac-3’

如果获得的PCR检测产物片段为827bp，则结果为阳性。

2.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S1的具体步骤为：如果待测乳品为生牛乳，则直接作为样品溶液备用；如果待测乳品为乳粉，则将乳粉与灭菌超纯水混合按照1g：1ml的比例混合均匀，至固体彻底溶解，得到均质液，作为样品溶液备用；如果待测乳品为奶酪，则将奶酪磨碎，加入2g/100ml柠檬酸钠溶液，混合均匀制成均质液，作为样品溶液备用，其中奶酪与柠檬酸钠溶液的比例为25g：90ml。

3.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，所述去脂肪的具体步骤如下：将无水乙醇、浓氨水和石油醚分别加入到待测样品中，混匀，得到的混合物12000gpm离心5min，弃去上清液，将沉淀溶于10mmol/L、pH＝8的TE缓冲液中，得到去脂肪样品溶液；其中无水乙醇、浓氨水、石油醚、待测样品、TE缓冲液的体积比例为1：1：1：25：1。

4.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S2中离心的条件为12000gpm离心5min，TE缓冲液的pH＝8。

5.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S3中，纳米氢氧化钛的粒径为100-200nm，纳米氢氧化锆的粒径为50-100nm。

6.根据权利要求5所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S3的具体步骤为，将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆按照1～5:1～5的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH 7.8的TE缓冲液，溶质为SDS，30℃搅拌至固体完全溶解，用孔直径0.22μm的膜过滤除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液，备用；将洁净的滤纸制备成直径为4.00mm滤纸圆片，放入到瓶内，121℃高压灭菌15min，灭菌的滤纸圆片放入到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，充分浸湿滤纸圆片；将处理过的滤纸圆片置于通风处干燥，备用；将固定了纳米氢氧化钛/氢氧化锆的在灭菌超纯水中清洗，再次通风干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片。

7.根据权利要求5所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S4中，去脂肪样品溶液、乙酸乙酯、灭菌超纯水、SDS溶液和TE缓冲液的体积比例为1：0.25：0.1：5：5。

8.根据权利要求5所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S6中，蛋白溶液、鲑鱼精DNA溶液和无菌超纯水的体积比例为5:1:4。