[go: up one dir, main page]

CN108588121B - 诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法 - Google Patents

诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108588121B
CN108588121B CN201810204392.1A CN201810204392A CN108588121B CN 108588121 B CN108588121 B CN 108588121B CN 201810204392 A CN201810204392 A CN 201810204392A CN 108588121 B CN108588121 B CN 108588121B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
embryo
epoa
epo
zebrafish
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201810204392.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108588121A (zh
Inventor
折剑青
袁祖贻
吴岳
周博
梁潇
娄博文
邓杨阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University filed Critical First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University
Priority to CN201810204392.1A priority Critical patent/CN108588121B/zh
Publication of CN108588121A publication Critical patent/CN108588121A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108588121B publication Critical patent/CN108588121B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/40—Fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法，该方法通过对Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子的Epob基因进行基因沉寂来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型。本发明的方法提出了通过对Epob基因进行基因沉寂来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型，该方法操作简单，诱导效果稳定、明显。在本发明的方法过程中还能够对单一斑马鱼胚胎同时实现基因测序及RT‑PCR测定。

Description

诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及斑马鱼，具体涉及一种诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法。
背景技术
斑马鱼作为一种新兴的生物模型，因其胚胎透明易于观察、养殖成本较低、基因编辑操作容易，被广泛用于科学研究和基因敲除模型的制备中。既往针对斑马鱼基因下调的研究多通过相应基因Morpholino注射进行基因下调RNA干预。但由于Morpholino在斑马鱼体内只能起效5-7天，越来越多的研究对于Morpholino不可避免的脱靶效应提出质疑，目前研究建议使用新兴的基因编辑技术(如CRISPR/Cas9)，构建基因敲除的斑马鱼模型，从而实现稳定、长期的基因功能检查及干预。
与此同时，伴随着基因编辑生物模型的广泛开发及实验观察，许多研究提示Morpholino与基因敲除可能导致不同的斑马鱼表型。这种表型的不同不仅仅是因为Morpholino技术的副作用以及脱靶效应，更多的来源于基因敲除后的相关基因代偿影响。然而，由于一些目的基因在生物发育中的重要性，其基因敲除纯合子模型都不能存活，只能获得稳定繁殖的杂合子成年斑马鱼。所以对这些目的基因的纯合子斑马鱼基因代偿研究，仅能在胚胎期尚有存活纯合子个体的时候进行观察。此外，需要首先将杂合子杂交，获得由纯合子、野生型、杂合子混的存在的斑马鱼胚胎，进一步对胚胎期斑马鱼进行测序筛选出纯合子斑马鱼，而后对纯合子斑马鱼胚胎进行表型观察分析或利用RT-PCR等技术进行基因代偿研究。
促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，在抑制原始红细胞凋亡、促进红细胞生成中起到重要作用。然而，由于EPO的作用重要且复杂，既往研究针对EPO基因敲除的动物模型由于严重贫血均不能有效存活，限制了对EPO的进一步认识和研究。目前，针对Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子基因代偿的研究十分稀少，更没有相关诱导血红蛋白表型的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，针对Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子，提供一种诱导血红蛋白表型的方法，解决现有技术中在该领域的技术空白。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法，该方法通过对Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子的Epob基因进行基因沉寂来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型。
本发明还具有如下区别技术特征：
该方法具体包括以下步骤：
步骤一，Epoa基因敲除斑马鱼动物模型的构建：
1)建立含有EPO基因片段靶序列的大肠杆菌质粒：
1-0)Ensemble数据库获取斑马鱼EPO基因序列
ENSDART00000020288.9，数据库网址为http://www.ensembl.org；
1-1)针对EPO基因外显子2区域使用Zifit Target Version4.2进行靶序列选择和引物设计，然后合成所设计的引物；
其中，所选择的EPO外显子2区域的靶序列为：
CATCTGTGACCTGCGCGT；
其中，所设计和合成的引物为：
前向引物TAGGACGCGCAGGTCACAGATG；
逆向引物AAACCATCTGTGACCTGCGCGT；
1-2)合成含有EPO基因片段靶序列的大肠杆菌质粒；
1-2A)引物退火：2μL前向引物、2μL逆向引物、2μLNEB缓冲液、14μL蒸馏水混合，混合物95℃下孵育5min，然后以0.1℃/sec的速度降温至50℃，50℃下孵育10min，然后以1℃/sec降温至4℃，得退火寡聚物；
1-2B)限制内切：1μL 1-2A)所得的退火寡聚物、400ng pT7-gRNA质粒、1μL NEB缓冲液、1μL T4DNA连接酶、0.5μL BsmBI酶、0.3μL BglII酶、0.3μl SalI酶、0.5μL T4连接酶和无DNA水混合，混合后总容量为10μL；混合物先在37℃下孵育60min，再在16℃下孵育45min，如此循环三次；然后混合物升温至37℃并孵育30min，然后升温至55℃并孵育30min，再升温至80℃并孵育15min，降温至4℃，得限制内切产物；
1-2C)将限制内切产物转导入大肠杆菌中：大肠杆菌在-80℃冰箱中保存，取出后在冰上放置20～30min，将步骤1-2B)中所合成的限制内切产物与50μL大肠杆菌混合，混合物在冰上放置20min，再在42℃水浴中放置90sec，再在冰上放置至少90sec；将以上混合物中加入1mLLB培养液在37℃、220rpm恒温箱培养板进行培育45min，然后将以上混合物在4℃离心机6000rpm离心5min，取离心后上清液900μL，平铺在LB培养基中，37℃恒温温箱隔夜培养；
1-2D)将隔夜培养菌群挑选单一菌落在3mL培养液中，37℃、220rpm隔夜培养；使用GETM Healthcare Illustra kit提取质粒进行基因测序；获得含有目的基因序列的质粒为阳性质粒，EPO外显子2区域靶序列：CATCTGTGACCTGCGCGT；
2)基于CRISPR基因敲除技术建立并培育EPO基因敲除斑马鱼模型：
2-1)将含有目的序列的阳性质粒1～3ug、NEB 3:1缓冲液5μL、10％BSA 5μL、BamHI-HF 1μL混合，无DNA水将体积调整为50μL，37℃隔夜水浴；加入100ug/mL蛋白酶K 0.5μL及0.5％SDS 2.5μL，在50℃加热20min，使用QiagenTM PCR purification kit提取DNA，琼脂凝胶电泳验证，得目标DNA；
2-2)使用
Figure GDA0002471074660000041
T7Transcription Kit，
Figure GDA0002471074660000042
T7Transcription Kit的商标品牌为Invitrogen，将目标DNA逆转录为EPO gRNA；使用不含目的Epo靶序列的空白质粒提取对照RNA，不含目的Epo靶序列的空白质粒即不含有EPO外显子2区域靶序列的质粒；对照RNA即无法造成基因敲除的对照序列；
2-3)Cas9质粒来自商标品牌为Addgene的编号#63154质粒，使用T7/T3Transcription Kit合成Cas9RNA，T7/T3 Transcription Kit的商标品牌为Invitrogen；
2-4)将EPO gRNA与Cas9RNA混合于0.1mol/LKCl溶质中，在斑马鱼受精卵单细胞进行注射；混合后EPO gRNA的浓度为200pg/μL，混合后Cas9RNA的浓度为200pg/μL，使用对照RNA与Cas9混合注射作为对照观察组；
在受精72小时后，提取胚胎基因组DNA进行PCR扩增，进行基因测序，使用ClustalW2进行序列比对进一步明确基因敲除有效性，ClustalW2的数据库网址为http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/；
2-5)将EPO gRNA注射后获得嵌合体鱼培养至3月左右成年鱼大小，EPO gRNA注射后获得嵌合体鱼即含有多种混合基因突变细胞的嵌合体斑马鱼，取鱼鳍组织基因测序，将基因测序阳性成年鱼与野生背景斑马鱼杂交获得EPO+/-杂合子斑马鱼，将成年杂合子背景斑马鱼杂交获得EPO-/-纯合子斑马鱼胚胎，通过基因测序结果判断纯合子基因变异序列；
步骤二，获得混合胚胎群：
通过Epoa杂合子成年斑马鱼杂交获得包含Epoa基因的纯合子、杂合子和野生型的混合胚胎群；
步骤三，基因沉寂诱导：
对步骤二获得的混合胚胎群的Epob基因进行基因沉寂，来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎的血红蛋白表型；
步骤四，获得诱导后的Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子：
对步骤三中获得的诱导后的混合胚胎群中的每个胚胎切割尾部1/5胚胎总长度的部分，进行基因组DNA提取送检基因测序；
将每个胚胎余下的胚胎部分进行RNA提取及cDNA逆转录，对所获得cDNA分别进行Epob和Epoa的基因表达RT-PCR检测，根据检测结果获得诱导后的Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子。
具体的，步骤三中，所述的基因沉寂诱导的具体过程为：
步骤3.1，Epoa基因敲除斑马鱼的混合胚胎群在胚胎单细胞或双细胞期，注射Epob吗啉试剂进行基因沉寂，其中：注射液浓度为6μg/μl，溶质为0.1M的KCL溶液；吗啉序列为5'-GCTCCAATGTAATGGCTTACCTGAA-3(Gene ToolTM)；
步骤3.2，28.5℃恒温箱培育，于胚胎受精后8h收集成功孵化胚胎，继续28.5℃恒温箱培育；
步骤3.3，于胚胎受精后24h使用显微镊进行胚胎脱膜，于胚胎受精后48h收集胚胎。
具体的，步骤四中，所述的切割过程中采用一种实验装置，所述的实验装置为同时进行斑马鱼胚胎基因测序及表型观察的实验装置，包括孔板主体，孔板主体上设置有沿着横向和纵向均呈阵列式分布的试剂孔，所述的孔板主体配套有制槽顶盖和切割顶盖；
所述的制槽顶盖的底面上设置有与试剂孔一一对应配合的第一顶塞，每个第一顶塞上设置有相同的制槽板，位于同一纵向列的每个第一顶塞上的制槽板在同一个纵向竖直平面内布设；
所述的切割顶盖的底面上设置有与试剂孔一一对应配合的第二顶塞，每个第二顶塞上设置有相同的切样刀，位于同一横向排的每个第二顶塞上的切样刀在同一个横向竖直平面内布设；
所述的切样刀所在的横向竖直平面与制槽板所在的纵向竖直平面相互垂直；
所述的切样刀的竖向长度大于制槽板的竖向长度。
所述的制槽板位于第一顶塞端面的纵向直径所在的纵向竖直平面内。
所述的切样刀位于第二顶塞端面的一条与横向直径平行的横向切割弦上，所述的横向切割弦距离第二顶塞端面圆心的距离为第二顶塞直径的30％。
所述的孔板主体的顶面四角设置有导向销，所述的制槽顶盖上设置有与导向销配合的第一导向通孔，所述的切割顶盖上设置有与导向销配合的第二导向通孔。
所述的孔板主体为96孔板。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
(Ⅰ)本发明的方法提出了通过对Epob基因进行基因沉寂来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型，该方法操作简单，诱导效果稳定、明显。在本发明的方法过程中还能够对单一斑马鱼胚胎同时实现基因测序及RT-PCR测定。
(Ⅱ)本发明的装置能够简单准确实现斑马鱼胚胎的基因测序及表型观察，为斑马鱼研究提供一种简单可行的实验装置。
(Ⅲ)本发明的装置能够一次切割多个斑马鱼胚胎样品，并且每个样品能够被准确地切割为五分之一部分和五分之四部分，制样标准，增加实验的精准性。
附图说明
图1是斑马鱼胚胎48h在对照、Epoa基因下调、Epoa基因敲除不同条件下血红蛋白染色，提示Epoa基因敲除斑马鱼可能存在基因代偿。
图2是显微镜下斑马鱼鱼体鱼尾分离示意图。
图3是Epoa基因敲除纯合子、杂合子、野生型斑马鱼胚胎基因测序结果图。
图4是Epoa基因敲除纯合子、杂合子、野生型斑马鱼胚胎Epoa、Epob表达量的比较图。
图5是本发明的外部整体结构示意图。
图6是孔板主体的结构示意图。
图7是制槽板的正视结构示意图。
图8是制槽板的左视结构示意图。
图9是切样刀的正视结构示意图。
图10是切样刀的左视结构示意图。
图11是制槽板的使用状态示意图。
图12是切样刀的使用状态示意图。
图13是斑马鱼胚胎血红蛋白染色效果示意图。
图14是Epob实时定量PCR结果。
图中各个标号的含义为：1-孔板主体，2-试剂孔，3-制槽顶盖，4-切割顶盖，5-导向销，6-琼脂培养基，7-凹槽；31-第一顶塞，32-制槽板，33-第一导向通孔；41-第二顶塞，42-切样刀，43-第二导向通孔。
以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
如图1所示，本研究组在利用CRISPR技术构建Epoa基因敲除斑马鱼中发现，Epoa基因敲除斑马鱼幼鱼在胚胎发育10天以内可通过外界环境中氧气获得生存，因此有可能通过构建Epoa基因敲除斑马鱼，实现胚胎期Epoa基因敲除的表型观察研究。但进一步的研究结果提示，CRISPR技术构建Epoa基因敲除斑马鱼胚胎与Morpholino技术下Epoa基因下调胚胎存在不同的血红蛋白染色表型，即Epoa基因下调斑马鱼胚胎中基本无血红蛋白染色，而Epoa基因敲除斑马鱼胚胎中血红蛋白染色与对照正常斑马鱼血红蛋白染色基本一致。这一表型的不同提示Epoa基因敲除斑马鱼中可能存在基因代偿。回顾NCBI基因库，我们发现斑马鱼体内还存在一种既往未被人们研究的Epob基因。那么，是否通过Epob基因沉寂可以进一步诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎血红蛋白表型改变，就是本研究方法的关键问题。
但前文已经提及，由于Epoa纯合子成年鱼无法存活，我们获得的斑马鱼胚胎为Epoa杂合子杂交后的后代，就需要通过基因测序首先筛选Epoa纯合子、杂合子、野生型，而后对杂交中获得的纯合子、杂合子、野生型进行Epob基因沉寂，再分别对Epoa纯合子、杂合子、野生型分别进行血红蛋白表型观察。
本发明的目的在于针对Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子基因代偿，提出一种同时进行Epoa杂合子杂交胚胎基因测序验证，以及Epob代偿表达的方法。本发明的目的在于提出一种对基因敲除杂合子斑马鱼成年鱼杂交后胚胎基因代偿的验证方法。本发明的目的还在于提供一种基于CRISPR技术构建Epoa基因敲除斑马鱼动物模型后的Epob基因表达的引物设计及RT-PCR验证方法。
本发明所述的Epoa基因指的是斑马鱼Erythropoietin a基因，该Epoa基因的NCBIGene ID为：100004455；Ensembl:ENSDARG00000055163；FIN:ZDB-GENE-061218-3。
本发明所述的Epob基因指的是斑马鱼Erythropoietin b基因，该Epob基因的NCBIGene ID为:100002479；Ensembl:ENSDARG00000100737；ZFIN:ZDB-GENE-141216-428。
根据上述美国国立生物技术信息中心的索引ID即可查询获得Epoa基因和Epob基因的基因序列。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例给出一种诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法，该方法通过对Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子的Epob基因进行基因沉寂来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型。
该方法具体包括以下步骤：
步骤一，Epoa基因敲除斑马鱼动物模型的构建：
1)建立含有EPO基因片段靶序列的大肠杆菌质粒：
1-0)Ensemble数据库(http://www.ensembl.org)获取斑马鱼EPO基因序列(ENSDART00000020288.9)；
1-1)针对EPO基因外显子2区域使用Zifit Target Version4.2进行靶序列选择和引物设计，然后合成所设计的引物；
其中，所选择的EPO外显子2区域的靶序列为：
CATCTGTGACCTGCGCGT；
其中，所设计和合成的引物为：
前向引物TAGGACGCGCAGGTCACAGATG；
逆向引物AAACCATCTGTGACCTGCGCGT；
1-2)合成含有EPO基因片段靶序列的大肠杆菌质粒；
1-2A)引物退火：2μL前向引物、2μL逆向引物、2μLNEB缓冲液、14μL蒸馏水混合，混合物95℃下孵育5min，然后以0.1℃/sec的速度降温至50℃，50℃下孵育10min，然后以1℃/sec降温至4℃，得退火寡聚物；
1-2B)限制内切：1μL 1-2A)所得的退火寡聚物、400ng pT7-gRNA质粒、1μL NEB缓冲液、1μL T4DNA连接酶、0.5μL BsmBI酶、0.3μL BglII酶、0.3μl SalI酶、0.5μL T4连接酶和无DNA水混合，混合后总容量为10μL；混合物先在37℃下孵育60min，再在16℃下孵育45min，如此循环三次；然后混合物升温至37℃并孵育30min，然后升温至55℃并孵育30min，再升温至80℃并孵育15min，降温至4℃，得限制内切产物；
1-2C)将限制内切产物转导入大肠杆菌中：大肠杆菌在-80℃冰箱中保存，取出后在冰上放置20～30min，将步骤1-2B)中所合成的限制内切产物与50μL大肠杆菌混合，混合物在冰上放置20min，再在42℃水浴中放置90sec，再在冰上放置至少90sec；将以上混合物中加入1mLLB培养液在37℃、220rpm恒温箱培养板进行培育45min，然后将以上混合物在4℃离心机6000rpm离心5min，取离心后上清液900μL，平铺在LB培养基中，37℃恒温温箱隔夜培养；
1-2D)将隔夜培养菌群挑选单一菌落在3mL培养液中，37℃、220rpm隔夜培养；使用GETM Healthcare Illustra kit提取质粒进行基因测序；获得含有目的基因序列(EPO外显子2区域靶序列：CATCTGTGACCTGCGCGT)的质粒为阳性质粒；
2)基于CRISPR基因敲除技术建立并培育EPO基因敲除斑马鱼模型：
2-1)将含有目的序列的阳性质粒1～3ug、NEB 3:1缓冲液5μL、10％BSA 5μL、BamHI-HF 1μL混合，无DNA水将体积调整为50μL，37℃隔夜水浴；加入100ug/mL蛋白酶K 0.5μL及0.5％SDS 2.5μL，在50℃加热20min，使用QiagenTM PCR purification kit提取DNA，琼脂凝胶电泳验证，得目标DNA；
2-2)使用
Figure GDA0002471074660000121
T7Transcription Kit(InvitrogenTM)将目标DNA逆转录为EPO gRNA；使用不含目的Epo靶序列的空白质粒(即不含有EPO外显子2区域靶序列的质粒)提取对照RNA(即无法造成基因敲除的对照序列)；
2-3)Cas9质粒来自AddgeneTM(Plasmid#63154)，使用T7/T3Transcription Kit(InvitrogenTM)合成Cas9RNA；
2-4)将EPO gRNA与Cas9RNA混合于0.1mol/LKCl溶质中，在斑马鱼受精卵单细胞进行注射；混合后EPO gRNA的浓度为200pg/μL，混合后Cas9RNA的浓度为200pg/μL。使用对照RNA与Cas9混合注射作为对照观察组；
在受精72小时后，提取胚胎基因组DNA进行PCR扩增。进行基因测序，使用ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行序列比对，进一步明确基因敲除有效性；
2-5)将EPO gRNA注射后获得嵌合体鱼(即含有多种混合基因突变细胞的嵌合体斑马鱼)培养至3月左右成年鱼大小，取鱼鳍组织基因测序，将基因测序阳性成年鱼与野生背景斑马鱼杂交获得EPO+/-杂合子斑马鱼，将成年杂合子背景斑马鱼杂交获得EPO-/-纯合子斑马鱼胚胎。通过基因测序结果判断纯合子基因变异序列。
步骤二，获得混合胚胎群：
通过Epoa杂合子成年斑马鱼杂交获得包含Epoa基因的纯合子、杂合子和野生型的混合胚胎群；
步骤二的具体过程为：
步骤2.1，交配前一日将Epoa杂合子成年斑马鱼雌雄各一只放入斑马鱼专用孵化器，用隔板进行隔离；
步骤2.2，次日取出隔板，斑马鱼自由交配2～4h；
步骤2.3，将交配后斑马鱼放回鱼缸，用网筛收集斑马鱼鱼卵；
步骤2.4，加入斑马鱼专用E3培养液，挑选孵化成功胚胎转移至干净无菌培养皿中，再次加入斑马鱼专用E3培养液，在28.5℃恒温箱中孵化24h；
步骤2.5，24h后取出胚胎，使用显微镜专用尖镊进行胚胎破膜，筛选破膜后完整胚胎再次加入斑马鱼专用E3培养液，转移至28.5℃恒温箱中继续孵化24h，即胚胎受精后48h，获得混合胚胎群。
步骤三，基因沉寂诱导：
对步骤二获得的混合胚胎群的Epob基因进行基因沉寂，来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎的血红蛋白表型；
基因沉寂诱导的具体过程为：
步骤3.1，Epoa基因敲除斑马鱼的混合胚胎群在胚胎单细胞或双细胞期，注射Epob吗啉试剂进行基因沉寂，其中：注射液浓度为6μg/μl，溶质为0.1M的KCL溶液；吗啉序列为5'-GCTCCAATGTAATGGCTTACCTGAA-3(Gene ToolTM)；
步骤4.2，28.5℃恒温箱培育，于胚胎受精后8h收集成功孵化胚胎，继续28.5℃恒温箱培育；
步骤4.3，于胚胎受精后24h使用显微镊进行胚胎脱膜，于胚胎受精后48h收集胚胎。
如图13所示，Epob基因沉默及对照条件下，斑马鱼胚胎48h在对照即Epoa基因敲除条件下血红蛋白染色，Epob沉寂后血红蛋白较对照减少。
如图14所示，A：Epob沉默后斑马鱼胚胎Epob表达较对照明显降低；B：斑马鱼Epob吗啉结合位点。
步骤四，获得诱导后的Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子：
对步骤三中获得的诱导后的混合胚胎群中的每个胚胎切割尾部1/5胚胎总长度的部分，进行基因组DNA提取送检基因测序；
切割过程中采用一种实验装置，所述的实验装置为同时进行斑马鱼胚胎基因测序及表型观察的实验装置，具体如实施例2所述。
将每个胚胎余下的胚胎部分进行RNA提取及cDNA逆转录，对所获得cDNA分别进行Epob和Epoa的基因表达RT-PCR检测，根据检测结果获得诱导后的Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子。
该步骤获得图3和图4。
从图3中可以看出：(a)Epoa基因敲除斑马鱼野生型、杂合子、纯合子基因序列及基因测序结果。(b)CRISPR基因敲除靶点序列：CATCTGTGACCTGCGCGT。(c)野生型斑马鱼靶点测序结果与基因序列一致，使用逆向PCR引物获得测序结果为：
AGGACGCGCAGGTCACAGATGG,基因测序波形未见其他波形。(d)纯合子靶点测序结果与基因序列不一致，在AGGACGCGCAGGT后出现终止子ATT，基因测序波形未见其他波形。(e)杂合子测序结果为根据主导碱基而定，基因测序波形可见纯合子和野生型基因测序波形。
从图4中可以看出：(a)Epoa基因敲除斑马鱼野生型、杂合子、纯合子的相对表达量；以野生型作为参照表达量为1。(b)Epoa在纯合子中不表达，在杂合子中表达在两者居中。(c)Epob在纯合子表达约为野生型的两倍，在杂合子中表达与野生型无明显差别。
具体的，如图2所示，在A部位用显微镜专用尖镊将斑马鱼胚胎分离为B头体部及C尾部，分别用于RT-PCR表达量测序以及基因组测序。在胚胎受精后48h，将拟观察转移至96孔板中，每个孔中放入1只胚胎；使用显微镜专用尖镊夹断斑马鱼尾部1/5部位，将斑马鱼鱼体4/5部分转移至EP管中用于后续RT-PCR验证，将斑马鱼鱼尾1/5部分转移至PCR管中用于基因组DNA提取。
具体的，对斑马鱼鱼体4/5部分进行RT-PCR验证的过程如下：
(a)使用RNeasy Mini Kit(Cat No./ID:74104，QiagenTM)进行单胚胎mRNA提取，提取后使用分光光度计(Eppendorf
Figure GDA0002471074660000151
D30，EppendorfTM)测定mRNA浓度。
(b)使用
Figure GDA0002471074660000161
First Strand cDNA Synthesis Kit(E6300S，BioLabsTM)对步骤(a)中获得mRNA进行cDNA提取。
(c)将所提取cDNA进行针对Epoa、Epob及管家基因β-actin进行RT-PCR验证，验证引物序列如表1所示。
表1|RT-PCR引物序列
Figure GDA0002471074660000162
具体的，对斑马鱼鱼尾1/5部分进行基因组DNA提取及测序过程如下：
(a)将斑马鱼鱼尾1/5部分放入RT-PCR管中，编号标记；
(b)使用注射器移出管中多余液体；
(c)每管加入20μL裂解液(10mM Tris pH＝8，1mM EDTA，0.3％Tween，0.3％Glycerol)；
(d)放入PCR仪中98℃10min；
(e)每管中加入10uL蛋白酶K(10mg/mL)；
(f)继续放入PCR仪中55℃5h以上，后98℃10min，将所得物质混合获得基因组DNA；
(g)取4.25μL基因组DNA，6.25μL Taq Mix Green，1μL前序及逆序引物进行Epoa基因片段的PCR扩增；Epoa PCR扩增引物序列如表2所示。
表2|
Figure GDA0002471074660000172
PCR扩增引物序列
Figure GDA0002471074660000171
(h)PCR流程：95℃-3min；(95℃-30s，57℃-30s，72℃-45s)*37循环；72℃-10min；4℃-∞；
(i)使用QIAquick PCR Purification Kit(Cat No./ID：28104，QiagenTM)进行DNA提纯
(j)将提纯后DNA送至基因测序公司进行检测验证。
实施例2：
本实施例给出一种同时进行斑马鱼胚胎基因测序及表型观察的实验装置，如图5至图12所示，包括孔板主体1，孔板主体1上设置有沿着横向和纵向均呈阵列式分布的试剂孔2，所述的孔板主体1配套有制槽顶盖3和切割顶盖4；
所述的制槽顶盖3的底面上设置有与试剂孔2一一对应配合的第一顶塞31，每个第一顶塞31上设置有相同的制槽板32，位于同一纵向列的每个第一顶塞31上的制槽板32在同一个纵向竖直平面内布设；
所述的切割顶盖4的底面上设置有与试剂孔2一一对应配合的第二顶塞41，每个第二顶塞41上设置有相同的切样刀42，位于同一横向排的每个第二顶塞41上的切样刀42在同一个横向竖直平面内布设；
所述的切样刀42所在的横向竖直平面与制槽板32所在的纵向竖直平面相互垂直；
所述的切样刀42的竖向长度大于制槽板32的竖向长度。
作为本实施例的一种优选方案，制槽板32位于第一顶塞31端面的纵向直径所在的纵向竖直平面内。
作为本实施例的一种优选方案，切样刀42位于第二顶塞41端面的一条与横向直径平行的横向切割弦上，所述的横向切割弦距离第二顶塞41端面圆心的距离为第二顶塞41直径的30％。使得每个样品能够被准确地切割为五分之一部分和五分之四部分。
作为本实施例的一种优选方案，孔板主体1的顶面四角竖向设置有导向销5，所述的制槽顶盖3上设置有与导向销5配合的第一导向通孔33，所述的切割顶盖4上设置有与导向销5配合的第二导向通孔43。便于对准。
作为本实施例的一种优选方案，孔板主体1为96孔板。
本实施例的装置在使用时，首选，将琼脂加热溶解导入孔板主体1的试剂孔2中，用于形成琼脂培养基6，加盖制槽顶盖3，使得第一顶塞31盖合在试剂孔2上，制槽板32伸入试剂孔2中且没入琼脂中，静止数分钟待琼脂冷却，拔除制槽顶盖3，在琼脂培养基6上会形成凹槽7。
然后将斑马鱼胚胎按照实验所需观察位置放置于凹槽7上，加入斑马鱼培养液及麻醉剂，进行相应显微镜下观察。
最后加盖切割顶盖4，对斑马胚胎的鱼尾部进行切割，切割完成后拔除切割顶盖4，自顶部空白处用加样器吸取尾部被切除组织，放入相应容器中进行基因组DNA的提取；斑马鱼胚胎的剩余部分可以继续进行后续培育观察。

Claims (8)

1.一种诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法，其特征在于，该方法通过对Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子的Epob基因进行基因沉寂来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤一，Epoa基因敲除斑马鱼动物模型的构建：
1)建立含有EPO基因片段靶序列的大肠杆菌质粒：
1-0)Ensemble数据库获取斑马鱼EPO基因序列ENSDART00000020288.9，数据库网址为http://www.ensembl.org；
1-1)针对EPO基因外显子2区域使用Zifit Target Version4.2进行靶序列选择和引物设计，然后合成所设计的引物；
其中，所选择的EPO外显子2区域的靶序列为：
CATCTGTGACCTGCGCGT；
其中，所设计和合成的引物为：
前向引物TAGGACGCGCAGGTCACAGATG；
逆向引物AAACCATCTGTGACCTGCGCGT；
1-2)合成含有EPO基因片段靶序列的大肠杆菌质粒；
1-2A)引物退火：2μL前向引物、2μL逆向引物、2μLNEB缓冲液、14μL蒸馏水混合，混合物95℃下孵育5min，然后以0.1℃/sec的速度降温至50℃，50℃下孵育10min，然后以1℃/sec降温至4℃，得退火寡聚物；
1-2B)限制内切：1μL 1-2A)所得的退火寡聚物、400ng pT7-gRNA质粒、1μL NEB缓冲液、1μL T4DNA连接酶、0.5μL BsmBI酶、0.3μL BglII酶、0.3μlSalI酶、0.5μL T4连接酶和无DNA水混合，混合后总容量为10μL；混合物先在37℃下孵育60min，再在16℃下孵育45min，如此循环三次；然后混合物升温至37℃并孵育30min，然后升温至55℃并孵育30min，再升温至80℃并孵育15min，降温至4℃，得限制内切产物；
1-2C)将限制内切产物转导入大肠杆菌中：大肠杆菌在-80℃冰箱中保存，取出后在冰上放置20～30min，将步骤1-2B)中所合成的限制内切产物与50μL大肠杆菌混合，混合物在冰上放置20min，再在42℃水浴中放置90sec，再在冰上放置至少90sec；将以上混合物中加入1mLLB培养液在37℃、220rpm恒温箱培养板进行培育45min，然后将以上混合物在4℃离心机6000rpm离心5min，取离心后上清液900μL，平铺在LB培养基中，37℃恒温温箱隔夜培养；
1-2D)将隔夜培养菌群挑选单一菌落在3mL培养液中，37℃、220rpm隔夜培养；使用GETMHealthcare Illustra kit提取质粒进行基因测序；获得含有目的基因序列的质粒为阳性质粒，EPO外显子2区域靶序列：CATCTGTGACCTGCGCGT；
2)基于CRISPR基因敲除技术建立并培育EPO基因敲除斑马鱼模型：
2-1)将含有目的序列的阳性质粒1～3ug、NEB 3:1缓冲液5μL、10％BSA 5μL、BamHI-HF1μL混合，无DNA水将体积调整为50μL，37℃隔夜水浴；加入100ug/mL蛋白酶K 0.5μL及0.5％SDS 2.5μL，在50℃加热20min，使用QiagenTM PCR purification kit提取DNA，琼脂凝胶电泳验证，得目标DNA；
2-2)使用
Figure FDA0002471074650000031
T7Transcription Kit，
Figure FDA0002471074650000032
T7Transcription Kit的商标品牌为Invitrogen，将目标DNA逆转录为EPO gRNA；使用不含目的Epo靶序列的空白质粒提取对照RNA，不含目的Epo靶序列的空白质粒即不含有EPO外显子2区域靶序列的质粒；对照RNA即无法造成基因敲除的对照序列；
2-3)Cas9质粒来自商标品牌为Addgene的编号#63154质粒，使用T7/T3 TranscriptionKit合成Cas9RNA，T7/T3 Transcription Kit的商标品牌为Invitrogen；
2-4)将EPO gRNA与Cas9RNA混合于0.1mol/LKCl溶质中，在斑马鱼受精卵单细胞进行注射；混合后EPO gRNA的浓度为200pg/μL，混合后Cas9RNA的浓度为200pg/μL，使用对照RNA与Cas9混合注射作为对照观察组；
在受精72小时后，提取胚胎基因组DNA进行PCR扩增，进行基因测序，使用ClustalW2进行序列比对进一步明确基因敲除有效性，ClustalW2的数据库网址为http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/；
2-5)将EPO gRNA注射后获得嵌合体鱼培养至3月左右成年鱼大小，EPO gRNA注射后获得嵌合体鱼即含有多种混合基因突变细胞的嵌合体斑马鱼，取鱼鳍组织基因测序，将基因测序阳性成年鱼与野生背景斑马鱼杂交获得EPO+/-杂合子斑马鱼，将成年杂合子背景斑马鱼杂交获得EPO-/-纯合子斑马鱼胚胎，通过基因测序结果判断纯合子基因变异序列；
步骤二，获得混合胚胎群：
通过Epoa杂合子成年斑马鱼杂交获得包含Epoa基因的纯合子、杂合子和野生型的混合胚胎群；
步骤三，基因沉寂诱导：
对步骤二获得的混合胚胎群的Epob基因进行基因沉寂，来诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎的血红蛋白表型；
步骤四，获得诱导后的Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子：
对步骤三中获得的诱导后的混合胚胎群中的每个胚胎切割尾部1/5胚胎总长度的部分，进行基因组DNA提取送检基因测序；
将每个胚胎余下的胚胎部分进行RNA提取及cDNA逆转录，对所获得cDNA分别进行Epob和Epoa的基因表达RT-PCR检测，根据检测结果获得诱导后的Epoa基因敲除斑马鱼的胚胎纯合子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中，所述的基因沉寂诱导的具体过程为：
步骤3.1，Epoa基因敲除斑马鱼的混合胚胎群在胚胎单细胞或双细胞期，注射Epob吗啉试剂进行基因沉寂，其中：注射液浓度为6μg/μl，溶质为0.1M的KCL溶液；吗啉序列为5'-GCTCCAATGTAATGGCTTACCTGAA-3'；
步骤3.2，28.5℃恒温箱培育，于胚胎受精后8h收集成功孵化胚胎，继续28.5℃恒温箱培育；
步骤3.3，于胚胎受精后24h使用显微镊进行胚胎脱膜，于胚胎受精后48h收集胚胎。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤四中，所述的切割过程中采用一种实验装置，所述的实验装置为同时进行斑马鱼胚胎基因测序及表型观察的实验装置，包括孔板主体(1)，孔板主体(1)上设置有沿着横向和纵向均呈阵列式分布的试剂孔(2)，所述的孔板主体(1)配套有制槽顶盖(3)和切割顶盖(4)；
所述的制槽顶盖(3)的底面上设置有与试剂孔(2)一一对应配合的第一顶塞(31)，每个第一顶塞(31)上设置有相同的制槽板(32)，位于同一纵向列的每个第一顶塞(31)上的制槽板(32)在同一个纵向竖直平面内布设；
所述的切割顶盖(4)的底面上设置有与试剂孔(2)一一对应配合的第二顶塞(41)，每个第二顶塞(41)上设置有相同的切样刀(42)，位于同一横向排的每个第二顶塞(41)上的切样刀(42)在同一个横向竖直平面内布设；
所述的切样刀(42)所在的横向竖直平面与制槽板(32)所在的纵向竖直平面相互垂直；
所述的切样刀(42)的竖向长度大于制槽板(32)的竖向长度。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的制槽板(32)位于第一顶塞(31)端面的纵向直径所在的纵向竖直平面内。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的切样刀(42)位于第二顶塞(41)端面的一条与横向直径平行的横向切割弦上，所述的横向切割弦距离第二顶塞(41)端面圆心的距离为第二顶塞(41)直径的30％。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的孔板主体(1)的顶面四角竖向设置有导向销(5)，所述的制槽顶盖(3)上设置有与导向销(5)配合的第一导向通孔(33)，所述的切割顶盖(4)上设置有与导向销(5)配合的第二导向通孔(43)。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的孔板主体(1)为96孔板。
CN201810204392.1A 2018-03-13 2018-03-13 诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法 Expired - Fee Related CN108588121B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810204392.1A CN108588121B (zh) 2018-03-13 2018-03-13 诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810204392.1A CN108588121B (zh) 2018-03-13 2018-03-13 诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108588121A CN108588121A (zh) 2018-09-28
CN108588121B true CN108588121B (zh) 2020-06-23

Family

ID=63626209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810204392.1A Expired - Fee Related CN108588121B (zh) 2018-03-13 2018-03-13 诱导Epoa基因敲除斑马鱼胚胎纯合子血红蛋白表型的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108588121B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998015627A1 (en) * 1996-10-10 1998-04-16 University Of Southampton Production of recombinant peptide by transgenic fish

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998015627A1 (en) * 1996-10-10 1998-04-16 University Of Southampton Production of recombinant peptide by transgenic fish

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genetic compensation induced by deleterious;Andrea Rossi，et.al.;《nature》;20150813;第524卷(第2015期);全文 *
Guidelines for morpholino use in zebrafish;Didier Y. R. Stainier，et.al.;《PLOS Genetics》;20171019;第13卷(第10期);全文 *
Reverse Genetics in Zebrafish: Mutants, Morphants, and Moving Forward;Nathan D. Lawson;《trends in cell biology》;20160229;第26卷(第2期);全文 *
Targeting erythropoietin protects against proteinuria in type 2 diabetic patients and in zebrafish;Jianqing She等;《MOLECULAR METABOLISM》;20171122;第8卷(第2018期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108588121A (zh) 2018-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107217075B (zh) 一种构建epo基因敲除斑马鱼动物模型的方法及引物、质粒与制备方法
Henao-Mejia et al. Generation of genetically modified mice using the CRISPR–Cas9 genome-editing system
Zuo et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs
Yang et al. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering
Harms et al. Mouse genome editing using the CRISPR/Cas system
Ruan et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs
Hashimoto et al. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing
Wang et al. TALEN-mediated editing of the mouse Y chromosome
Horb et al. Xenopus resources: transgenic, inbred and mutant animals, training opportunities, and web-based support
WO2018177351A1 (zh) 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
Kohno et al. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee
Zhang et al. Construction of BIBAC and BAC libraries from a variety of organisms for advanced genomics research
Pritchard et al. Direct generation of conditional alleles using CRISPR/Cas9 in mouse zygotes
Zhang et al. Crispr/Cas9‐mediated cleavages facilitate homologous recombination during genetic engineering of a large chromosomal region
Schilit et al. Pronuclear Injection‐Based Targeted Transgenesis
Iwata et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes via in vitro and in vivo electroporation
CN116019063B (zh) 一种小鼠条件性诱导Hmox1基因敲除模型的构建方法及应用
Colijn et al. High-throughput methodology to identify CRISPR-generated Danio rerio mutants using fragment analysis with unmodified PCR products
Feng et al. Highly efficient CRISPR-mediated gene editing in a rotifer
Clark et al. Genome editing in East African cichlids and tilapias: state-of-the-art and future directions
Li et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system
Imai et al. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method
Corkins et al. Tissue-targeted CRISPR–Cas9-mediated genome editing of multiple homeologs in F0-generation Xenopus laevis embryos
Leidy-Davis et al. Viable mice with extensive gene humanization (25-kbp) created using embryonic stem cell/blastocyst and CRISPR/zygote injection approaches
Takasu et al. Targeted mutagenesis in Bombyx mori using TALENs

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200623

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee