CN108660068B - 生物反应芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物反应芯片及其制备方法，包括：提供一微腔芯片，所述微腔芯片包括基底及形成于所述基底内的多个反应单元；首先于所述基底的平台面及所述反应单元的内侧壁形成亲水涂层；然后采用湿法化学修饰或转印的方法于所述基底的表面形成疏水涂层，以得到各反应单元内反应液体互不串扰的生物反应芯片。本发明通过基底平台面的疏水处理及反应单元内壁的亲水处理消除各反应单元的串扰；同时，工艺步骤简单，上样率高达95％以上，可以顺利检测到荧光信号，提高dPCR检测结果的可靠性，并且微腔式芯片便于保存，可随时进行复查分析。

Description

生物反应芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及数字PCR生物检测领域，特别是涉及一种生物反应芯片及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。1985年问世以来，PCR技术经历了定性(终点PCR)、相对定量(实时定量PCR，Real-time PCR，简称qPCR)和绝对定量(数字PCR，简称dPCR)三个阶段。

作为第二代PCR技术，qPCR技术已发展成为一种最普遍应用的定量分析技术，广泛应用于临床疾病诊断、检验检疫、食品安全等领域。qPCR的分析结果高度依赖循环阈值(Cycle threshold，Ct值)，而Ct值又由PCR效率决定。当样本中检测靶标纯度、浓度很低时，会显著降低qPCR的反应效率和成功率。qPCR是一种相对定量的检测技术，当前主要应用在待测样本需要相对定量的场合，在检测低频稀有突变、微小表达差异(小于1.5倍)、微量核酸样本时，qPCR通常无法成功。qPCR通常是利用移液枪将反应体系分布在96或384孔板中，经过后续扩增与荧光信号检测完成实验。单个孔的反应体积一般在微升级别，受到移液枪和其他相关系统精度的限制，在少量样本的分析中面临挑战。Fludigm的微流控芯片可将每个反应液滴体积降至纳升级别，显著降低了检测限度。然而该芯片制备过程复杂，成本高昂，且对于常见分析，微升级别的反应体系已经能满足其分析精度要求。

作为第三代PCR技术，dPCR技术近年来迅猛发展。其将DNA溶液分散至皮升至纳升的微量反应体系中，每个反应体系的DNA模板数至多1个；在PCR循环反应之后，根据发出荧光信号的微量反应体系所占有的比例来判定原始DNA浓度。dPCR不依赖于Ct值，不受扩增效率的影响，因此具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。因此，该技术灵敏度高、特异性强、检测通量高、定量准确，可广泛应用于临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面。

dPCR需要提供的反应空间比qPCR要多得多以及小得多，提供可靠、高质量、高密度的反应单元是dPCR的核心。当前主要通过微流控芯片和微腔式芯片等分液方法实现。微流控芯片利用微滴发生器一次生成数万至数百万个油包水微滴，但其微流控芯片易堵塞，且液滴容易相互融合。微腔式液滴分割技术通过在基底上制备出阵列微孔作为反应单元(芯片)，对试剂的兼容性较高，且不会发生液滴的融合现象。PCR反应液在微腔反应单元内的加载方式可采用微流控或刮涂方式完成，后者成本较低、简单易行，但对芯片要求更高，具体要求如下：1.微腔反应单元需要具有一定的高密度满足dPCR计算结果的可靠性；2.微孔基材对PCR过程没有抑制作用；3.样本在芯片上较高的加载效率和加载稳定性，同时消除样本在微孔间平台上的停留，避免反应单元间的串扰。

现有技术中提出了一些芯片处理方法，但是普遍工艺复杂、上样率低，不适合于大规模批量应用。因此，提出一种零串扰、开发成本低、工艺步骤简单、上样率高、适合大批量稳定生产的适用于生物反应的高密度芯片以及芯片表面处理方法是芯片式dPCR快速推广和应用的首要条件。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种生物反应芯片及其制备方法，用于解决现有技术中生物反应芯片开发成本高、工艺步骤复杂、上样率低等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种生物反应芯片的制备方法，所述生物反应芯片的制备方法至少包括：

提供一微腔芯片，所述微腔芯片包括基底及形成于所述基底内的多个反应单元；

于所述基底的平台面及所述反应单元的内侧壁形成亲水涂层；

采用湿法化学修饰或转印的方法于所述基底的表面形成疏水涂层，以得到各反应单元内反应液体互不串扰的生物反应芯片。

优选地，提供一基底，通过微加工工艺于所述基底上形成微孔，所述微孔作为反应单元。

优选地，所述亲水涂层的材料为金、氧化铝、氧化钛、氧化硅、碳化硅、碳或聚乙二醇。

更优选地，所述亲水涂层采用原子层沉积、分子层沉积、溅射、热蒸发、化学气相沉积或湿法化学修饰法形成。

优选地，所述疏水涂层的材料为硅胶、疏水硅烷或石墨。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种生物反应芯片，所述生物反应芯片至少包括：

基底；

多个反应单元，设置于所述基底内，用于加载反应液；

疏水涂层，位于所述基底平台上，用于将所述基底平台面的接触角调整至90度以上；

亲水涂层，位于所述反应单元的内壁，用于将所述反应单元内壁的接触角调整至90度以下。

优选地，所述基底的材质为硅、氧化硅、玻璃、塑料或硅胶。

优选地，所述反应单元为通孔或盲孔。

更优选地，所述反应单元的深宽比不小于4。

优选地，所述反应单元的的横截面为圆形或多边形。

优选地，各反应单元的排列方式为矩形阵列结构或六角密排结构。

优选地，所述反应单元可容纳的独立反应体积为皮升级。

优选地，所述亲水涂层的材料为金、氧化铝、氧化钛、氧化硅、碳化硅、碳或聚乙二醇。

优选地，所述疏水涂层的材料为硅胶、疏水硅烷或石墨。

优选地，反应液在所述反应单元内的加载率为95％～100％。

如上所述，本发明的生物反应芯片及其制备方法，具有以下有益效果：

本发明的生物反应芯片及其制备方法通过基底平台面的疏水处理及反应单元内壁的亲水处理使基底平台面接触角大于90度，芯片反应单元内部接触角小于90度，通过毛细管作用可以将样本顺利拉进反应单元内部，同时芯片基底表面无样本残留，以消除各反应单元的串扰；同时，工艺步骤简单，上样率高达95％以上，可以顺利检测到荧光信号，提高dPCR检测结果的可靠性，并且微腔式芯片便于保存，可随时进行复查分析。

附图说明

图1显示为本发明的生物反应芯片的制备方法的流程示意图。

图2显示为本发明的生物反应芯片的制备方法的一种实施方式。

图3显示为本发明提供基底的示意图。

图4显示为本发明形成微孔芯片的一种实施方式。

图5显示为本发明形成亲水涂层的一种实施方式。

图6显示为本发明生物反应芯片的一种实施方式。

图7显示为本发明的生物反应芯片的制备方法的另一种实施方式。

图8显示为本发明形成微孔芯片的另一种实施方式。

图9显示为本发明形成亲水涂层的另一种实施方式。

图10显示为本发明的生物反应芯片的另一种实施方式。

图11显示为本发明的生物反应芯片的接触角的示意图。

元件标号说明

1 基底

2 反应单元

3 微腔芯片

4 亲水涂层

5 疏水涂层

S1～S2 步骤

S11～S41 步骤

S12～S42 步骤

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

请参阅图1～图11。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

如图1所示，本发明提供一种生物反应芯片的制备方法，包括：

步骤S1：提供一微腔芯片，所述微腔芯片包括基底及形成于所述基底内的多个反应单元。

步骤S2：于所述基底的平台面及所述反应单元的内侧壁形成亲水涂层。

步骤S3：采用湿法化学修饰或转印的方法于所述基底的表面形成疏水涂层。

步骤S4：得到各反应单元内反应液体互不串扰的生物反应芯片。

实施例一

如图2所示，本实施例提供一种生物反应芯片的制备方法，所述生物反应芯片的制备方法包括：

步骤S11：提供一微腔芯片3。

具体地，制备所述微腔芯片3的步骤包括：

步骤S111：如图3所示，提供一基底1，所述基底1的材质包括但不限于硅、氧化硅、玻璃、塑料及硅胶，不以本实施例为限。

步骤S112：如图4所示，通过光刻、刻蚀等微加工手段于所述基底1上形成微孔，各微孔作为反应单元2。在本实施例中，1cm²的所述基底1上形成有3万个(或3万以上)微孔，以获得高密度的反应单元进而确保计算结果的可靠性，在实际应用中，微孔的密度可根据反应或实验需要设定，不以本实施例为限。在本实施例中，所述反应单元2为盲孔。所述反应单元2的深宽比不小于4，以利于提高毛细力，更易将样本(反应液)转移至各个独立的反应单元2中。所述反应单元2的横截面包括但不限于圆形、矩形、六边形及椭圆形，在实际应用中，任意多边形及圆形结构均适用于本发明，不以本实施例为限。各反应单元2在所述基底1表面的排列方式包括但不限于矩形阵列结构及六角密排结构，任意排列结构均适用于本发明，在此不一一赘述。所述反应单元2可容纳的独立反应体积为皮升(pL)级。

步骤S21：通过原子层沉积于所述微腔芯片3的表面形成Al₂O₃涂层。

具体地，如图5所示，在本实施例中，通过原子层沉积的方式于所述基底1的平台面、所述反应单元2的内侧壁及所述反应单元2的底部形成5nm厚的Al₂O₃涂层，所述Al₂O₃涂层为亲水涂层4。

需要说明的是，所述亲水涂层4的材料包括但不限于具有亲水特性的无机材料(金、氧化铝、氧化钛、氧化硅、碳化硅、碳)及具有亲水特性的有机材料(聚乙二醇)，在实际应用中，任意不抑制反应液发生生物反应的、具有亲水特性的材质均适用于本发明，在此不一一赘述。

需要说明的是，形成所述亲水涂层4的方法包括但不限于真空沉积(原子层沉积、分子层沉积、溅射、热蒸发、化学气相沉积)及湿法化学修饰法，在本实施例中优选为真空沉积法，以简化工艺步骤。

步骤S31：通过表面热压于所述基底1上表面的Al₂O₃涂层上形成PDMS涂层。

具体地，如图6所示，在本实施例中，将柔性聚二甲基硅氧烷(PDMS)覆盖于所述基底1表面的亲水涂层4上，在温度100℃、压力为0.1MPa下热压3S将所述聚二甲基硅氧烷层转移至所述基底1的表面平台上，所述PDMS涂层为疏水涂层5。

需要说明的是，所述疏水涂层5的材料包括但不限于硅胶、疏水硅烷及石墨，在实际应用中，任意不抑制反应液发生生物反应的、具有疏水特性的材质均适用于本发明，在此不一一赘述。

需要说明的是，形成所述疏水涂层5的方法包括但不限于湿法化学修饰及转印，在本实施例中优选为热压转印的方式，以简化工艺步骤。

步骤S41：得到各反应单元2内反应液体互不串扰的生物反应芯片。

具体地，最终，所述生物反应芯片的基底平台面被疏水涂层5覆盖，所述基底平台面的接触角大于90°；所述生物反应芯片的反应单元内壁及底部被亲水涂层4覆盖，所述反应单元内壁的接触角小于90°。

实施例二

如图7所示，本发明提供一种生物反应芯片的制备方法，与实施例一的不同之处在于，所述反应单元2为通孔，湿法化学修饰形成所述疏水涂层5。具体包括一下步骤：

步骤S12：提供一微腔芯片3。

具体地，如图8所示，提供一基底1，通过光刻、刻蚀等微加工手段于所述基底1上形成微孔，各微孔作为反应单元2。在本实施例中，所述反应单元2为通孔。其他结构与实施例一类似，在此不一一赘述。

步骤S22：通过原子层沉积于所述微腔芯片3的表面形成Al₂O₃涂层。

具体地，如图9所示，在本实施例中，通过原子层沉积的方式于所述基底1的平台面及所述反应单元2的内侧壁形成Al₂O₃涂层，所述Al₂O₃涂层为亲水涂层4。

步骤S32：通过甲基三甲氧基硅烷化学修饰于所述基底1的平台面形成疏水涂层5。

具体地，如图10所示，在本实施例中，将步骤S22得到的亲水芯片在0.15％HNO₃中超声2min，然后放入甲基三甲氧基硅烷的庚烷溶液中45min取出，再放入0.15％HNO₃中，15min后在40℃下继续反应30min，完成疏水处理。

需要说明的是，任意通过湿法化学修饰的方式形成的疏水涂层5均适用于本发明，具体材料及反应条件根据实际需要设定，不以本实施例为限。

步骤S42：得到各反应单元2内反应液体互不串扰的生物反应芯片。

具体地，最终，所述生物反应芯片的基底平台面被疏水涂层5覆盖，所述基底平台面的接触角大于90°；所述生物反应芯片的反应单元内壁及底部被亲水涂层4覆盖，所述反应单元内壁的接触角小于90°。

实施例三

本实施例提供一种生物反应芯片，所述生物反应芯片包括：

基底1、反应单元2、疏水涂层4及亲水涂层5。

具体地，如图6及图10所示，所述基底1的材质包括但不限于硅、氧化硅、玻璃、塑料及硅胶。在本实施例中，所述基底1的材质为硅。

如图6及图10所示，所述反应单元2位于所述基底1内，用于加载反应液。

具体地，本实施例中，1cm²的所述基底1上形成有3万个(或3万以上)所述反应单元2，以获得高密度的反应单元进而确保计算结果的可靠性，在实际应用中，所述反应单元2的密度可根据反应或实验需要设定，不以本实施例为限。所述反应单元2为盲孔或通孔。所述反应单元2的深宽比不小于4，以利于提高毛细力，更易将样本(反应液)转移至各个独立的反应单元2中。所述反应单元2的横截面包括但不限于圆形、矩形、六边形及椭圆形，在实际应用中，任意多边形及圆形结构均适用于本发明，不以本实施例为限。各反应单元2在所述基底1表面的排列方式包括但不限于矩形阵列结构及六角密排结构，任意排列结构均适用于本发明，在此不一一赘述。所述反应单元2可容纳的独立反应体积为皮升(pL)级。

如图6及图10所示，所述亲水涂层4位于所述反应单元2的内壁，用于将所述反应单元内壁的接触角调整至90°以下。

具体地，所述亲水涂层4的材料包括但不限于具有亲水特性的无机材料(金、氧化铝、氧化钛、氧化硅、碳化硅、碳)及具有亲水特性的有机材料(聚乙二醇)，任意不抑制反应液发生生物反应的、具有亲水特性的材质均适用于本发明，在此不一一赘述。

具体地，如图11所示，所述反应单元2的内壁的接触角θ1为所述反应单元2的内侧壁与反应液接触边缘的切线夹角，在本实施例中，所述反应液在所述反应单元2中的液面为凹面。

如图6及图10所示，所述疏水涂层5位于所述基底1的平台面上，用于将所述基底平台面的接触角调整至90°以上。

具体地，所述疏水涂层5的材料包括但不限于硅胶、疏水硅烷及石墨，在实际应用中，任意不抑制反应液发生生物反应的、具有疏水特性的材质均适用于本发明，在此不一一赘述。

具体地，如图11所示，所述基底1的平台面的接触角θ2为所述疏水涂层5的上表面与反应液接触边缘的切线夹角，在本实施例中，所述反应液在所述疏水涂层5上表面的形状大于半球形。

具体地，反应液在本发明的所述反应单元内的加载率(上样率)为95％～100％。

本发明的生物反应芯片及其制备方法通过基底平台面的疏水处理及反应单元内壁的亲水处理使基底平台面接触角大于90度，芯片反应单元内部接触角小于90度，进而对芯片基材和反应位点的表面状态进行调节；同时增加反应单元的深宽比，有利于提高毛细力，更易将样本转移至各个独立的反应单元中；以此有效消除各反应单元之间的串扰，大大提高加载效率和加载稳定性，且工艺步骤简单、上样率高达95％以上，适于大规模应用。

综上所述，本发明提供一种生物反应芯片及其制备方法，包括：提供一微腔芯片，所述微腔芯片包括基底及形成于所述基底内的多个反应单元；于所述基底的平台面及所述反应单元的内侧壁形成亲水涂层；采用湿法化学修饰或转印的方法于所述基底的表面形成疏水涂层，以得到各反应单元内反应液体互不串扰的生物反应芯片。本发明的生物反应芯片及其制备方法通过基底平台面的疏水处理及反应单元内壁的亲水处理使基底平台面接触角大于90度，芯片反应单元内部接触角小于90度，通过毛细管作用可以将样本顺利拉进反应单元内部，同时芯片基底表面无样本残留，以消除各反应单元的串扰；同时，工艺步骤简单，上样率高达95％以上，可以顺利检测到荧光信号，提高dPCR检测结果的可靠性，并且微腔式芯片便于保存，可随时进行复查分析。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (11)

1.一种生物反应芯片的制备方法，其特征在于，所述生物反应芯片的制备方法如下：

提供一微腔芯片，所述微腔芯片包括基底及形成于所述基底内的多个反应单元，其中，所述反应单元的深宽比不小于4；

采用原子层沉积的方法于所述基底的平台面及所述反应单元的内侧壁形成氧化铝亲水涂层；

采用湿法化学修饰或转印的方法于所述基底的表面形成疏水涂层，以得到各反应单元内反应液体互不串扰的生物反应芯片。

2.根据权利要求1所述的生物反应芯片的制备方法，其特征在于：提供一基底，通过微加工工艺于所述基底上形成微孔，所述微孔作为反应单元。

3.根据权利要求1所述的生物反应芯片的制备方法，其特征在于：所述疏水涂层的材料为硅胶、疏水硅烷或石墨。

4.一种生物反应芯片，采用如权利要求1-3任意一项所述的生物反应芯片的制备方法制备形成，其特征在于，所述生物反应芯片至少包括：

基底；

多个反应单元，设置于所述基底内，用于加载反应液；

疏水涂层，位于所述基底平台面上，用于将所述基底平台面的接触角调整至90度以上；

亲水涂层，位于所述反应单元的内壁，用于将所述反应单元内壁的接触角调整至90度以下。

5.根据权利要求4所述的生物反应芯片，其特征在于：所述基底的材质为硅、氧化硅、玻璃、塑料或硅胶。

6.根据权利要求4所述的生物反应芯片，其特征在于：所述反应单元为通孔或盲孔。

7.根据权利要求4所述的生物反应芯片，其特征在于：所述反应单元的的横截面为圆形或多边形。

8.根据权利要求4所述的生物反应芯片，其特征在于：各反应单元的排列方式为矩形阵列结构或六角密排结构。

9.根据权利要求4所述的生物反应芯片，其特征在于：所述反应单元可容纳的独立反应体积为皮升级。

10.根据权利要求4所述的生物反应芯片，其特征在于：所述疏水涂层的材料为硅胶、疏水硅烷或石墨。

11.根据权利要求4所述的生物反应芯片，其特征在于：反应液在所述反应单元内的加载率为95％～100％。

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