CN108776163B - 一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测胆固醇的酶生物传感器，由丝网印刷电极及吸附在所述丝网印刷电极的物质识别酶膜组成，所述物质识别酶膜由胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、聚乙烯醇、壳聚糖、碳纳米管混合制备而成；所述传感器的制备方法包括通过静电纺丝技术制备所述修饰后的丝网印刷电极，即胆固醇氧化酶/胆固醇酯酶/聚乙烯醇/壳聚糖/碳纳米管/丝网印刷电极；再将所述修饰后的电极置于戊二醛蒸汽中交联；所述传感器在胆固醇检测上的应用；该传感器以电子检测为手段，无需标记，灵敏度高、特异性强，操作简单，可应用于胆固醇的快速、灵敏检测，回收率在97.81％‑99.97％，稳定性高，可重复性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用。
背景技术
胆固醇是构成动物组织细胞膜的重要组成成分，而且也是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的原料。血清中比较正常的胆固醇水平为120～200mg/dL(3.1～5.2mmol/L)，游离的胆固醇不到10％。胆固醇过高会威胁人体的健康，如冠心病、糖尿病、高血压等均与高胆固醇有密切关系。每增加1％的血浆总胆固醇浓度，心血管疾病的危险性就会升高约2％。常用于胆固醇的检测方法包括热学测定法、分子发光法、比色法、电化学法。目前研究较多的是检测胆固醇的酶生物传感器法。其中，电化学酶生物传感器是一种将电化学分析方法与酶生物技术相结合的生物传感器，既拥有酶的专一催化性，又具备生物传感器灵敏、快速、操作简便的优点，在食品安全与营养成分检测方面显示出广阔的应用前景。
然而现有技术中的检测胆固醇的酶生物传感器灵敏度和特异性较低，如何建立一种灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法成为迫待解决的问题，因此，针对血清或者食物样品，设计出简单、高选择性、低成本、快速和高灵敏的胆固醇方法仍然极具临床意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用，该检测胆固醇的酶生物传感器以电子检测为手段，无需标记，灵敏度高、特异性强，易于集成化，且操作简单、方便携带，可应用于胆固醇的快速、灵敏检测。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供一种检测胆固醇的酶生物传感器，由丝网印刷电极及吸附在所述丝网印刷电极表面的物质识别酶膜组成，所述物质识别酶膜由胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、聚乙烯醇、壳聚糖、碳纳米管混合制备而成。本发明的目的之二在于提供一种检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、碳纳米管的前处理：碳纳米管用浓硫酸和浓硝酸的混合液浸泡氧化处理后，用蒸馏水冲洗后烘干；
步骤2、纺丝液的制备：称取聚乙烯醇溶解于N、N-二甲基甲酰胺，配制20％的聚乙烯醇溶液，同时配制4％的壳聚糖溶液；将所述聚乙烯醇与壳聚糖以2:1的质量比混合，磁力搅拌，加入胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和所述步骤1处理好的碳纳米管，混合均匀，获得纺丝液；
步骤3、丝网印刷电极的前处理：制备丝网印刷电极，并用砂纸打磨抛光，然后用去离子水冲洗；再依次放入50％HNO3水溶液和50％乙醇水溶液中超声后，用蒸馏水冲洗，晾干；
步骤4、复合纳米纤维的制备：将所述步骤2所得的电纺液注入静电纺丝装置的注射器中设置仪器参数，以所述步骤3所得的丝网印刷电极为接受器，将所述胆固醇氧化酶/胆固醇酯酶/聚乙烯醇/壳聚糖/碳纳米管复合纳米纤维电纺于所述丝网印刷电极表面；
步骤5、将所述修饰后的丝网印刷电极置于戊二醛蒸汽中交联后，置于Nafion溶液交联2.5～8h后，置于2.5％Nafion溶液中5-15min，室温晾干即可。
本发明的目的之三在于提供所述的酶生物传感器在胆固醇检测方面的应用，先根据配置好的一系列梯度浓度的胆固醇标准品溶液，制作胆固醇浓度对电流响应值的标准曲线；再检测待测样品中的电流响应值，通过标准曲线获得待测样品中胆固醇的浓度。
本发明具有的有益效果：
1、本发明提供的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，以电流为特征检测信号的传感器，当酶电极与被测样品接触时，酶就会催化底物，发生氧化还原反应(当测定胆固醇时，溶液中的胆固醇向电极表面扩散，在胆固醇氧化酶的催化下与氧气反应生成4-烯胆甾-3-酮和过氧化氢)，反应过程中产生了电子转移，在阴极和阳极之间加上一恒定的电压，电子转移就会转换为电极之间的电流。该电流的大小与被测样品中胆固醇的浓度呈一定的比例，可通过预先得到的标准曲线根据电流值求出对应的胆固醇浓度；本发明中碳纳米管具有良好的化学表面活性，生物相容性和高比表面积，可以增大传感器的比表面积，加快电子传递；修饰的丝网印刷电极通过多壁碳纳米管的大比表面积和催化性，以及离子液体与胆固醇的非共价相互作用力，协同发挥出优异的萃取吸附性能，可有效增加胆固醇在电极表面的富集和电子传递速率，对胆固醇具有明显的富集效应和电催化性能，可实现灵敏和特异性的快速检测；此外丝网印刷电极具有良好的催化活性、导电性，在大大缩短传感器反应时间的同时，拓宽了传感器的检测范围；利用壳聚糖的包埋作用，将胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶包埋起来，并利用聚乙烯醇的载体特性，负载更多的酶。
2、灵敏度高、特异性强、可重复性高：通过电子检测手段起增效和增敏作用，可实现对胆固醇的快速、灵敏、高选择性检测，方法的检出限为0.3mM，线性检测范围为0.82～8.21mM，回收率在97.81％-99.97％，精确度高，稳定性高，可重复性高；
3、操作简单：以电子检测为手段，无需标记，易于集成化，且操作简单，是检测胆固醇的极佳方法，用于食品中胆固醇的检测准确、快速、安全，为食品中胆固醇的质量控制提供了良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的酶生物传感器的整体结构示意图，其中1工作与辅助电极，2为参比电极，3为电极基底，4为绝缘树脂层，5为电极导线；
图2为本发明所述酶生物传感器对不同浓度胆固醇的响应电流的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1检测胆固醇的酶生物传感器及其制备
一、如图1所示，检测胆固醇的酶生物传感器，由丝网印刷电极及吸附在所述丝网印刷电极表面的物质识别酶膜组成，所述物质识别酶膜由胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、聚乙烯醇、壳聚糖、碳纳米管混合制备而成；所述丝网印刷电极包括工作与辅助电极1、参比电极2、电极基底3、印制在所述电极基底3上的绝缘树脂层4、所述各电极对应连接的电极导线5，所述工作与辅助电极1、参比电极2和电极导线5，位于所述电极基底3与绝缘树脂层5之间，其中所述工作与辅助电极1、参比电极2相邻设置，所述绝缘树脂层5上设有一圆形的孔，所述工作与辅助电极1、参比电极2部分外露于所述绝缘树脂层5。
优选地，所述识别酶膜的原材料包括聚乙烯醇-壳聚糖溶液、浓度为2～4mg/g胆固醇氧化酶、浓度为1～3mg/g胆固醇酯酶以及加入量为80～120μg/g的碳纳米管，所述聚乙烯醇-壳聚糖溶液为20％的聚乙烯醇溶液和4％的壳聚糖溶液以2:1的质量比混合；
优选地，所述聚乙烯醇-壳聚糖溶液、胆固醇氧化酶水溶液、胆固醇酯酶水溶液的体积比为1：1：1。
将所述检测胆固醇的酶生物传感器放入待测液4中，可检测待测液4中胆固醇的含量。
二、丝网印刷电极的制备
制备丝网印刷电极的具体方法为：
S1、电极基板打孔与清洗：通过打孔器将电极基板两侧的定位孔打孔，并用无水乙醇清洗基板表面，静置晾干；
S2、电极导线印刷：以银浆为导线材料进行印刷，印刷结束后，在烘箱80℃烘干10分钟；
S3、工作与辅助电极印刷：通过第一次印刷的定位标识对准网版，以碳浆为电极材料进行印刷，印刷结束后，在烘箱80℃烘干5分钟；
S4、参比电极印刷：通过前两次的定位标识对准网版，以Ag/AgCl浆为材料进行印刷，在烘箱80℃烘干5分钟；
S5、绝缘树脂层印刷：通过前三次的定位标识对准网版，选用热固性绝缘树脂作为电极的绝缘层，在烘箱120℃烘干10分钟；
S6、电极废条排查：挑出电极图形不完整的电极并进行标记，标记后进行斩切装瓶。
其中图1中的(A)图为丝网印刷电极拆分结构图，图(B)为做好的丝网印刷电极结构图。
三、检测胆固醇的酶生物传感器的制备
(1)碳纳米管的前处理：碳纳米管用浓硫酸和浓硝酸(3:1，v/v)的混合液浸泡氧化处理0.5h，结束后用蒸馏水冲洗，置于60℃烘箱中烘干。
(2)纺丝液的制备：称取适量聚乙烯醇溶解于N、N-二甲基甲酰胺，配制20％的聚乙烯醇溶液，同时配制4％的壳聚糖溶液，将聚乙烯醇与壳聚糖以2:1(w:w)的比例混合，磁力搅拌30min，加入胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、处理好的碳纳米管，混合均匀，获得纺丝液。所述胆固醇氧化酶的浓度为2～4mg/g，胆固醇酯酶的浓度为1～3mg/g，碳纳米管的加入量为80～120μg/g。
(3)丝网印刷电极的前处理：将所述制备好的丝网印刷电极用2000目的砂纸打磨抛光，然后用去离子水冲洗。再依次放入50％HNO3水溶液和50％乙醇水溶液各超声2min。用蒸馏水冲洗，晾干。
(4)复合纳米纤维的制备：将电纺液注入静电纺丝装置的注射器中，设置仪器参数，以打磨后的丝网印刷电极为接受器，电纺胆固醇氧化酶/胆固醇酯酶/聚乙烯醇/壳聚糖/碳纳米管复合纳米纤维于电极表面，电纺时间为10min。
(5)将所述修饰后的丝网印刷电极置于戊二醛蒸汽中交联后，置于Nafion溶液交联2.5～8h后，置于2.5％Nafion溶液中5-15min，室温晾干即可。
实施例2生物传感器的应用
1、工作曲线的制作
(1)胆固醇标准品的配置：称取胆固醇203.5mg，溶于5mL异丙醇和5mLTriton X-100，30℃加热并搅拌至溶解，再用pH值为7.0的PBS缓冲溶液定容至50mL。然后逐级稀释，配置成一系列梯度浓度的胆固醇标准品溶液。
(2)用制备好的生物传感器检测pH为7.0的PBS缓冲液的电流，待电流稳定后记录背景电流。然后在电解池中加入不同浓度的胆固醇标准品，记录稳态电流值，扣除背景电流后即为对胆固醇的实际响应电流。制作胆固醇浓度对电流响应值的标准曲线。所述工作曲线的回归方程为y＝0.2672x+0.2275(R2＝0.9870)，其中y为电流响应值，x为胆固醇的浓度，如图1所述。方法的检出限为0.3mM(3×10-4mol.L-1)，线性检测范围为0.82～8.21mM(8.2×10-4～8.21×10-3mol.L-1)。
2、样品的检测：取400μL人体血清样品，加入到4mL PBS溶液中，混合均匀。用生物传感器检测人体血清样品中的电流响应值，通过标准曲线获得血清样品中胆固醇的浓度。
实施例3检测胆固醇的酶生物传感器的性能测试
1、取400μL不同的人体血清样品3份，分别加入到4mL PBS溶液中，混合均匀。用生物传感器检测人体血清样品中的电流响应值，通过标准曲线获得血清样品中胆固醇的浓度。
2、检测结果如表1所示：
表1血清样本的检测
从表1可以看出，回收率在97.81％-99.97％，说明本发明的检测胆固醇含量的方法，精确度高，稳定性高，可重复性高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种检测胆固醇的酶生物传感器，其特征在于，由丝网印刷电极及吸附在所述丝网印刷电极表面的物质识别酶膜组成，所述物质识别酶膜由胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、聚乙烯醇、壳聚糖、碳纳米管混合制备而成；
所述丝网印刷电极包括工作与辅助电极、参比电极、电极基底、印制在所述电极基底上的绝缘树脂层、所述各电极对应连接的电极导线，所述工作与辅助电极、参比电极和电极导线，位于所述电极基底与绝缘树脂层之间，其中所述工作与辅助电极、参比电极相邻设置，所述绝缘树脂层上设有一圆形的孔，所述工作与辅助电极、参比电极部分外露于所述绝缘树脂层；
所述物质识别酶膜的原材料包括聚乙烯醇-壳聚糖溶液、浓度为2～4mg/g胆固醇氧化酶、浓度为1～3 mg/g胆固醇酯酶以及加入量为80～120μg/g的碳纳米管，所述聚乙烯醇-壳聚糖溶液为20%的聚乙烯醇溶液和4%的壳聚糖溶液以2:1的质量比混合，所述聚乙烯醇-壳聚糖溶液、胆固醇氧化酶水溶液、胆固醇酯酶水溶液的体积比为1:1:1。
2.一种如权利要求1所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、碳纳米管的前处理：碳纳米管用浓硫酸和浓硝酸的混合液浸泡氧化处理后，用蒸馏水冲洗后烘干；
步骤2、纺丝液的制备：称取聚乙烯醇溶解于N、N-二甲基甲酰胺，配制20%的聚乙烯醇溶液，同时配制4%的壳聚糖溶液；将所述聚乙烯醇与壳聚糖以2:1的质量比混合，磁力搅拌，加入胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和所述步骤1处理好的碳纳米管，混合均匀，获得纺丝液；
步骤3、丝网印刷电极的前处理：制备丝网印刷电极，并用砂纸打磨抛光，然后用去离子水冲洗；再依次放入50%HNO3水溶液和50%乙醇水溶液中超声后，用蒸馏水冲洗，晾干；
步骤4、复合纳米纤维的制备：将所述步骤2所得的纺丝液注入静电纺丝装置的注射器中设置仪器参数，以所述步骤3所得的丝网印刷电极为接受器，将所述胆固醇氧化酶/胆固醇酯酶/聚乙烯醇/壳聚糖/碳纳米管复合纳米纤维电纺于所述丝网印刷电极表面；
步骤5、将步骤4修饰后的丝网印刷电极置于戊二醛蒸汽中交联后，置于Nafion溶液交联2.5～8h后，置于2.5% Nafion溶液中5-15min，室温晾干即可。
3.如权利要求2所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述浓硫酸和浓硝酸的体积比为3:1；浸泡氧化处理时间为0.5h，烘干时置于60℃烘箱。
4.如权利要求2所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2中磁力搅拌时间为30min。
5.如权利要求2所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3中用2000目的砂纸打磨抛光，所述超声时间为2min。
6.如权利要求2所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3中制备丝网印刷电极的具体方法为：
S1、电极基板打孔与清洗：通过打孔器将电极基板两侧的定位孔打孔，并用无水乙醇清洗基板表面，静置晾干；
S2、电极导线印刷：以银浆为导线材料进行印刷，印刷结束后，在烘箱80℃烘干10分钟；
S3、工作与辅助电极印刷：通过第一次印刷的定位标识对准网版，以碳浆为电极材料进行印刷，印刷结束后，在烘箱80℃烘干5分钟；
S4、参比电极印刷：通过前两次的定位标识对准网版，以Ag/AgCl浆为材料进行印刷，在烘箱80℃烘干5分钟；
S5、绝缘树脂层印刷：通过前三次的定位标识对准网版，选用热固性绝缘树脂作为电极的绝缘层，在烘箱120℃烘干10分钟；
S6、电极废条排查：挑出电极图形不完整的电极并进行标记，标记后进行斩切装瓶。
7.如权利要求2所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤4中电纺时间为10min。
8.权利要求1所述的酶生物传感器、或权利要求2-7任一所述的制备方法制得的酶生物传感器在胆固醇检测方面的应用，其特征在于，其使用方法为先根据配置好的一系列梯度浓度的胆固醇标准品溶液，制作胆固醇浓度对电流响应值的标准曲线；再检测待测样品中的电流响应值，通过标准曲线获得待测样品中胆固醇的浓度。
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