CN108864307A

CN108864307A - 信号肽优化靶向cd19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的t细胞及制备方法和应用

Info

Publication number: CN108864307A
Application number: CN201810813178.6A
Authority: CN
Inventors: 李香群; 盖丽云; 李政利; 李刚毅
Original assignee: BEIJING DOING -TIMES BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING DOING -TIMES BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明公开了一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用，所述信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4‑1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域，其中，所述跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示，该靶向CD19的嵌合抗原受体在T细胞中更加高效、稳定表达，以更好地发挥对靶细胞的杀伤作用。

Description

信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用

技术领域

本发明是关于免疫学与分子生物学技术领域，特别是关于一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用。

背景技术

过继性免疫细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)是指从肿瘤患者分离免疫活性细胞，在体外进行扩增与功能鉴定后，然后再回输给患者，从而直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。

免疫治疗(Immunotherapy)是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞技术是新近迅速发展的一种细胞免疫治疗技术，CAR是一个人工合成的融合受体，在结构上包括胞外抗原结合区、跨膜区、胞内信号转导区与共刺激信号区。胞外区为识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体可变区序列(single chain variable fragment，ScFV)，跨膜区连接胞外区与胞内区，常用的跨膜区分子有CD3、CD4、CD8与CD28等，胞内区具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，最常用的是T细胞受体TCR/CD3ζ链和免疫球蛋白FC受体FCεRIγ，主要负责信号转导功能；人们通过分子克隆方法将上述元件在体外进行重组，形成重组质粒，通过病毒载体、电穿孔等手段将重组质粒转导入T细胞，继之在体外培养扩增，最后回输到病人体内，起到治疗肿瘤的目的，这种经过基因修饰与改造的T细胞即称为CAR-T细胞。CAR-T细胞通过ScFV段识别并结合肿瘤抗原，再通过CD3ζ链和共刺激信号区激活T细胞，这样改造的CAR-T细胞识别、杀伤肿瘤细胞就具有了两大特点：①靶向性；②克服了MHC限制性，即不再依赖MHC，因此突破了肿瘤细胞通过下调MHC的表达而发生免疫逃逸这一难题。

鉴于CAR-T技术的优势，近年来该技术发展迅猛。2017年8月31日，诺华(Novartis)公司突破性CAR-T细胞疗法Kymriah(tisagenlecleucel，曾用名CTL019)获得FDA批准上市，这是人类历史上首款CAR-T细胞疗法，适应症是急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的25岁以下患者。2017年10月18日，美国FDA批准了Kite Pharma的CAR-T疗法Yescarta(axicabtageneciloleucel)上市，适应症是特定类型的非霍奇金淋巴瘤。

信号肽是指引导新合成的肽链跨越细胞膜的一小段多肽，一般由15-30个氨基酸残基组成，位于新合成肽链的N端。它不仅能引导分泌蛋白或膜蛋白出胞，还能引导蛋白质在细胞内不同区域进行正确定位。信号肽在外源蛋白的表达中起重要作用，选择合适的信号肽能够促进重组蛋白的表达。

嵌合抗原受体是跨膜蛋白，当它在T细胞中表达后，依赖于胞外的ScFV段识别靶抗原。已经有文献报道信号肽可影响CAR的表达，Seogkyoung等在构建IL13R CAR-T的过程中发现，以VHCAMP的信号肽作为CAR的信号肽，CAR的表达量为78.8％，以hIL3信号肽作为CAR的信号肽，CAR的表达量为14.9％，说明信号肽的选择对CAR的构建至关重要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用，其能够使得靶向CD19的嵌合抗原受体在T细胞中更加高效、稳定表达，以更好地发挥对靶细胞的杀伤作用。

为实现上述目的，本发明提供了一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域，其中，所述嵌合抗原受体的N-端以跨膜蛋白信号肽与抗CD19抗体单链可变区的重链可变区相连接，该跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示，其中，分别包含跨膜蛋白信号肽氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的嵌合抗原受体的氨基酸序列依次对应于SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13，即在跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示时，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；在跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示时，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID No.12所示；在跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示时，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

本发明选取了上述三种跨膜蛋白信号肽(CD8信号肽(SEQ ID No.1)、GM-CSFR信号肽(SEQ ID No.2)与免疫球蛋白轻链К信号肽(SEQ ID No.3))，对靶向CD19的抗原受体序列进行了优化，以使CD19 CAR(即，靶向CD19的抗原受体)在T细胞中更加稳定高效表达，进而更好地发挥对靶细胞的杀伤作用。

在一优选的实施方式中，所述抗CD19抗体单链可变区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述CD8蛋白分子的铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNo.7所示。

在一优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示，所述4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

本发明还提供了表达上述嵌合抗原受体的T细胞。

本发明还提供了上述T细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得；(2)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒的制备及效价测定；(3)进而用步骤(2)制备好的靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒感染T细胞，以完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备。

在一优选的实施方式中，所述靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得包括以下步骤：(1)合成靶向CD19的嵌合抗原受体的基因序列：合成跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域的基因序列；(2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。

在一优选的实施方式中，上述步骤(1)中所述嵌合抗原受体的基因序列如SEQ IDNo.22或SEQ ID No.23或SEQ ID No.24所示。

在一优选的实施方式中，所述靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒制备及效价测定包括以下步骤：(1)第0天铺板：0.25％胰酶消化293T细胞，铺在含有10ml DMEM(含有10％FBS)的10cm培养皿中，于37℃，5％CO₂恒温培养箱培养，保证24h后细胞汇合度达到90-95％；(2)293T细胞转染：转染前2小时，将293T细胞换液，将靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体以及辅助载体与PEI混合，吹打均匀，室温静置13-17min，得到DNA/PEI混合物，将制备好的DNA/PEI混合物逐滴加到293T细胞中，继续培养4-6小时，换液；(3)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒制备：分别收集上述293T细胞转染24小时与48小时的细胞上清，0.45μM滤器过滤后，20，000rpm，4℃，超速离心，用PBS溶解病毒沉淀，-80℃冻存病毒沉淀，待用；(4)慢病毒效价测定：将293T细胞铺于24孔板，1×10⁵/孔，分别将0.25μL、0.5μL、1μL、3μL、10μL慢病毒悬液感染293T细胞，48小时后，收集细胞，流式免疫荧光染色，按照公式10⁵×[GFP阳性细胞数/病毒体积(ml)×1/100]，计算CAR-T19慢病毒效价。

在一优选的实施方式中，将靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒感染T细胞，以完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备包括以下步骤：(1)将血液转至离心管，用等体积的1640基础培养基稀释2倍，混合均匀；(2)将4ml Ficoll淋巴细胞分离液转移到新的离心管，将2倍体积上述稀释好的血液轻轻加到Ficoll淋巴细胞分离液上面；(3)室温，水平离心15-25min；(4)用吸管轻轻吸取白膜层，即淋巴细胞层，用PBS洗涤三次后，转移到细胞培养皿，加入300U/ml的IL-2、1μg/ml的CD3抗体与1μg/ml的CD28抗体，活化24-48h；(5)将靶向CD19的嵌合抗原受体的慢病毒加到细胞中，6-10h后换液，继续培养2-4天；(6)流式免疫荧光染色检测CAR 19的表达情况，以明确感染效率，若感染效率在20％以上，说明CAR-T细胞转导成功，继续培养7-10天，得到足够回输的CAR-T细胞数量，成功完成靶向CD19嵌合抗原受体T细胞制备。

上述嵌合抗原受体或表达该嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗血液恶性肿瘤或淋巴瘤的药物或制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

T细胞是一种较难转导的细胞，慢病毒转导技术的出现虽然在一定程度上克服了这一难题，但由于肿瘤病人的T细胞与正常人T细胞状态有所不同，所以在基因编辑修饰T细胞的肿瘤免疫治疗中，仍然存在着因个体差异不同，某些病人T细胞转导效率低的情况。而嵌合抗原受体T细胞治疗的关键之一就是要把嵌合抗原受体T细胞成功转导入T细胞，并且要求其在T细胞表面表达稳定、持久，从而与靶细胞表面的抗原结合，发挥杀伤靶细胞效应。所以从不同角度进行优化，实现嵌合抗原受体在T细胞的稳定表达是一个非常重要的问题。在本发明中，CD19嵌合抗原受体序列经过信号肽优化后，在T细胞中表达更加稳定、高效，如图1流式免疫荧光染色所示，优化信号肽后，CAR19的表达效率得到了较大程度的提高，最大能提高1.37倍，从而可能对CD19阳性B细胞白血病与淋巴瘤起到更加良好的治疗效果。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的CD19 CAR在T细胞中的表达情况；

图2是根据本发明一实施方式的CD19 CAR对靶细胞的杀伤作用。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例1靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得

(1)合成靶向CD19的嵌合抗原受体的基因序列：合成跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域的基因序列，并在5'端加EcoRI酶切位点，在3'端加SalI酶切位点；其中跨膜蛋白信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示，所述抗CD19抗体单链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述CD8蛋白分子的铰链区的核苷酸序列如SEQID NO.18所示，所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19示，所述4-1BB共刺激结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，最终合成的抗CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.24所示；

(2)以EcoRI与SalI两个酶切位点酶切后克隆入慢病毒载体，测序、鉴定，将测序验证正确的慢病毒载体转化感受态细胞Stbl3，用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒的大量抽提，利用分光光度计进行质粒定量，然后分装，-20℃冻存。

实施例2靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒的制备及效价测定

材料：293T细胞在含10％FBS的DMEM培养基中培养，耗材包括DMEM(Hyclone,SH30022.01)、X-VIVO 15(Lonza，04-418Q)、FBS(Gibcol，P30-3302)、胰酶(Gibco,25200-056)、PBS(Hyclone,SH30256.01)、PEI(聚乙烯亚胺)(24765-2)、CAR-T 19染色试剂盒(上海近岸生物科技有限公司)，具体流程如下：

(1)第0天铺板：0.25％胰酶消化293T细胞，铺在含有10ml DMEM(含有10％FBS)的10cm培养皿中，37度，5％CO₂恒温培养箱培养，保证24后细胞汇合度达到90-95％。

(2)293T细胞转染：转染前2小时，293T细胞换液。将靶向CD19嵌合抗原受体慢病毒载体以及辅助载体与PEI混合，吹打均匀，室温静置15min，得到DNA/PEI混合物。将制备好的DNA/PEI混合物逐滴加到293细胞中，继续培养4-6小时，换液。

(3)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒制备：分别收集上述293T细胞转染24小时与48小时的细胞上清，0.45μM滤器过滤后，20，000rpm，4度，超速离心，用PBS溶解病毒沉淀，-80℃冻存病毒沉淀，待用。

(4)慢病毒效价测定：将293T细胞铺于24孔板，1×10⁵/孔，分别将0.25μL、0.5μL、1μL、3μL、10μL慢病毒悬液感染293T细胞，48小时后，收集细胞，流式免疫荧光染色，按照公式10⁵×[GFP阳性细胞数/病毒体积(ml)×1/100]，计算CAR-T19慢病毒效价，待CAR-T19慢病毒效价达到8×10⁸/ml，即可进行下一步试验。

实施例3靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备

将4毫升室温Ficoll淋巴细胞分离液加入15毫升离心管，用10毫升移液管将8毫升1640培养基等体积稀释的外周血PBMC加到淋巴细胞分离液上面，2000rpm，水平，室温、离心20分钟，用3毫升吸管轻轻吸取白膜细胞层，将之转移到新的15毫升离心管，用10倍体积的PBS洗3次，用X-VIVO15培养基重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁶/毫升，吸取2毫升淋巴细胞悬液，转移到6孔板，加入300U/ml的IL-2、1μg/ml的CD3抗体与1μg/ml的CD28抗体，活化T细胞24-48h，T细胞活化后，制备好的慢病毒以Moi1.25的比例感染T细胞，感染72小时后，利用CAR-T 19染色试剂盒进行流式免疫荧光染色，分析CAR-T 19的感染效率，分析含有哪种信号肽的CAR表达最强、最稳定，若感染效率在20％以上，则说明CAR-T细胞转导成功，继续培养扩增7-10天，获得足够回输的CAR-T细胞数量，成功完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备。结果如图1所示，CD8信号肽、免疫球蛋白信号肽与GM-CSFR信号肽的CD19嵌合抗原受体转导T细胞后，阳性率分别为22.1％、27.9％、20.3％，此结果说明信号肽的优化可以提高CD19嵌合抗原受体在T细胞的表达。

CD19嵌合抗原受体T细胞细胞毒性功能验证。利用eFluor670对CD19阳性靶细胞NALM6进行活细胞标记，将制备好的CAR-T细胞与靶细胞以0.5:1、1:1、3:1、6:1的效靶比共培养，4小时后，收集细胞，7-AAD染色，流式分析eFluor670阳性细胞群中7-AAD阳性细胞的比例，判断CAR-T对靶细胞的杀伤效率，结果如图2所示，CD19嵌合抗原受体T细胞与靶细胞共同孵育5小时，在效靶比0.5:1的条件下，靶细胞凋亡率为15％左右，效靶比3:1与6：1的条件下，靶细胞凋亡率分别为31％与29％，从中可以看出随着效靶比的提高，靶细胞凋亡率升高，说明杀伤率在提高。CD19嵌合抗原受体T细胞与靶细胞共同孵育15小时，效靶比0.5:1、3:1、6:1分别对应的靶细胞凋亡率分别为58％、63％与59％，这说明本发明制备的嵌合抗原受体T细胞对靶细胞的杀伤在一定范围内就有剂量依赖性与时间依赖性，也从侧面反映了其特异性。

本发明优化了CD19嵌合抗原受体T细胞序列，利用此序列制备的CAR-T细胞，CD19CAR的表达更高，更稳定，能较好地杀伤CD19阳性靶细胞，在肿瘤治疗上具有广泛前景。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 北京多赢时代科技有限公司

<120> 信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用

<130> P181069DD1F

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> CD8信号肽(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> GM-CSFR信号肽(Homo sapiens)

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Pro Leu Leu Ile Pro

20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 免疫球蛋白轻链К信号肽(Homo sapiens)

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> CAR19 ScFV 轻链可变区(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> CAR ScFV重链可变区(Homo sapiens)

<400> 5

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Gly-Ser linker（Homo sapiens）

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 45

<212> PRT

<213> CD8蛋白分子铰链区(Homo sapiens)

<400> 7

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 8

<211> 24

<212> PRT

<213> 跨膜区(Homo sapiens)

<400> 8

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 4-1BB共刺激分子结构域(Homo sapiens)

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> CD3ζ胞内信号传导结构域(Homo sapiens)

<400> 10

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 11

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 12

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Pro Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

145 150 155 160

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

165 170 175

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

180 185 190

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

195 200 205

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

210 215 220

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 13

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn

100 105 110

Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

130 135 140

Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu

145 150 155 160

Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val

165 170 175

Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val

180 185 190

Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg

195 200 205

Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met

210 215 220

Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His

225 230 235 240

Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 14

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgccagg 60

ccc 63

<210> 15

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ccccctgctg 60

atcccc 66

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60

<210> 17

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 18

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 19

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 20

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 21

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 22

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgccagg 60

cccgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgc 1458

<210> 23

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ccccctgctg 60

atccccgaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ccaagctgga gatcacaggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 420

ggcggcggat ctgaggtgaa actgcaggag tcaggacctg gcctggtggc gccctcacag 480

agcctgtccg tcacatgcac tgtctcaggg gtctcattac ccgactatgg tgtaagctgg 540

attcgccagc ctccacgaaa gggtctggag tggctgggag taatatgggg tagtgaaacc 600

acatactata attcagctct caaatccaga ctgaccatca tcaaggacaa ctccaagagc 660

caagttttct taaaaatgaa cagtctgcaa actgatgaca cagccattta ctactgtgcc 720

aaacattatt actacggtgg tagctatgct atggactact ggggccaagg aacctcagtc 780

accgtctcct caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1020

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440

atgcaggccc tgccccctcg c 1461

<210> 24

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc 60

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 180

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 360

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 420

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 480

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 540

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 600

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 660

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 720

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 780

tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 960

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1020

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1080

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1140

gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440

gccctgcccc ctcgc 1455

Claims

1.一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域，其中，所述嵌合抗原受体的N-端以跨膜蛋白信号肽与抗CD19抗体单链可变区的重链可变区相连接，该跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNo.11或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示，其中，分别包含跨膜蛋白信号肽氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的嵌合抗原受体的氨基酸序列依次对应于SEQID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗CD19抗体单链可变区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述CD8蛋白分子的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，所述4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

4.表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体的T细胞。

5.如权利要求4所述的T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得；

(2)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒的制备；

(3)用步骤(2)制备好的靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒感染T细胞，以完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备。

6.如权利要求5所述的T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得包括以下步骤：

(1)合成靶向CD19的嵌合抗原受体的基因序列：合成跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域的基因序列；

(2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。

7.如权利要求6所述的T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID No.22或SEQ ID No.23或SEQ ID No.24所示。

8.如权利要求6所述的T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒制备包括以下步骤：

(1)铺板：0.25％胰酶消化293T细胞，铺在含有DMEM的培养皿中，于37℃，5％CO₂恒温培养箱培养，保证24h后细胞汇合度达到90-95％；

(2)293T细胞转染：转染前2小时，将293T细胞换液，将靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体以及辅助载体与PEI混合，吹打均匀，室温静置13-17min，得到DNA/PEI混合物，将制备好的DNA/PEI混合物逐滴加到293T细胞中，继续培养4-6小时，换液；

(3)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒制备：分别收集上述293T细胞转染24小时与48小时的细胞上清，用滤器过滤后，超速离心，用PBS溶解病毒沉淀，-80℃冻存病毒沉淀，待用。

9.如权利要求8所述的T细胞的制备方法，其特征在于，将靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒感染T细胞，以完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备包括以下步骤：

(1)将血液转至离心管，用等体积的1640基础培养基稀释，混合均匀；

(2)将淋巴细胞分离液转移到新的离心管，将2倍体积上述稀释好的血液轻轻加到淋巴细胞分离液上面；

(3)室温，水平离心15-25min；

(4)用吸管轻轻吸取淋巴细胞层，用PBS洗涤三次后，转移到细胞培养皿，加人IL-2、CD3抗体与CD28抗体，活化24-48h；

(5)将靶向CD19的嵌合抗原受体的慢病毒加到细胞中，孵育6-10h，换液，继续培养2-4天；

(6)流式免疫荧光染色检测CAR 19的表达情况，以明确感染效率，若感染效率在20％以上，继续培养7-10天，则成功完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备。

10.权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体或权利要求4所述的表达该嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗血液恶性肿瘤或淋巴瘤的药物或制剂中的应用。