CN108949773A - 兰花胚珠发育调控基因及其方法 - Google Patents
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Abstract
一种兰花胚珠发育调控基因包含至少一核酸分子，而该核酸分子用以控制一胚珠的发育，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列。一种兰花胚珠发育调控基因的转殖方法包含：提供该核酸分子；将该核酸分子导引至一植物细胞，以获得一已转殖植物细胞；及利用该已转殖植物细胞的核酸分子控制一胚珠的发育。
Description
技术领域
本发明关于一种兰花胚珠发育调控基因(gene regulation)及其转殖方法；特别是关于一种兰花胚珠发育调控基因及其转殖方法选择MADS-box B-sister群基因PeMADS28及其组合。
背景技术
现有兰花基因相关调控技术，如中国台湾专利公告第I228511号的〝于兰花中控制花发育之基因〞发明专利，其揭示一种控制兰科植物的花发育的基因。一种核酸分子可在兰花中控制花发育，而核酸分子的序列选自一种由PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4、PeMADS5、其反转录股及其简并序列所组成的群。其中PeMADS2用于控制花萼的发育，而PeMADS3用于控制唇瓣的发育，且PeMADS4用于控制唇瓣及蕊柱的发育，且PeMADS5用于控制花瓣及雄蕊的发育。
另一现有兰花基因相关调控技术，如中国台湾专利公告第I289143号的〝控制花型及/或花开寿命之基因〞发明专利，其揭示一种控制兰科植物的花型及/或花开寿命的基因。一种经单离的核酸分子可控制花型及/或花开寿命，而该核酸分子选自一种由编码PeMADS6蛋白质的分子及编码PeMADS6蛋白质的反转录股分子所组成的群。
另一现有兰花基因相关调控技术，如中国台湾专利公告第I545197号的〝控制合蕊柱发育之基因、蛋白质及方法〞发明专利，其揭示一种兰科植物的控制合蕊柱发育的基因、蛋白质及方法，其提供一种可控制合蕊柱发育的核酸分子。该核酸分子可包含于一载体及一细胞。该控制合蕊柱发育的蛋白质及其方法适用于制造转殖植物的方法。
事实上，相同发明人的前述中国台湾专利公告第I228511号、第I289143号及第I545197号虽然已揭示各种兰花基因相关调控技术，但仍存在有必要进一步提供兰花基因其它相关技术的潜在需求，以便提供具有利用价值的其它兰花基因的调控功能及机制。前述诸专利仅为本发明技术背景的参考及说明目前技术发展状态而已，其并非用以限制本发明。
有鉴于此，本发明为了满足上述需求，其提供一种兰花胚珠发育调控基因及其方法，其提供一种兰花胚珠发育调控基因包含一核酸分子，而该核酸分子用以控制一胚珠的发育或具有一控制胚珠发育功能，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列，以便提供兰花胚珠发育调控基因及提升其经济价值。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种兰花胚珠发育调控基因及其方法，其提供一种兰花胚珠发育调控基因包含一核酸分子，而该核酸分子用以控制一胚珠的发育或具有一控制胚珠发育功能，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列，以达成提供兰花胚珠发育调控基因及提升其经济价值的目的。
为了达成上述目的，本发明较佳实施例的兰花胚珠发育调控基因包含至少一核酸分子，而该核酸分子用以控制一胚珠的发育，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列。
本发明较佳实施例的该核酸分子提供于一载体或一穿梭载体。
本发明较佳实施例的该载体提供于一细胞植物。
本发明较佳实施例的该核酸分子提供于一拟原球体。
本发明较佳实施例的该核酸分子用以编码一蛋白质或其它基因产物，且该蛋白质具有SEQ ID No.2。
本发明较佳实施例的该胚珠为一蝴蝶兰胚珠、一白花蝴蝶兰胚珠、一姬蝴蝶兰胚珠或其它兰花胚珠。
为了达成上述目的，本发明较佳实施例的兰花胚珠发育调控基因的转殖方法包含：
提供至少一核酸分子，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列；
将该核酸分子导引至一植物细胞，以获得一已转殖植物细胞；及
利用该已转殖植物细胞的核酸分子控制一胚珠的发育。
本发明较佳实施例的该核酸分子通过单离方式获得。
本发明较佳实施例的该已转殖植物细胞用以改变一植物体内控制胚珠发育的一蛋白质表现量。
本发明较佳实施例利用该已转殖植物细胞再生制造一已转殖植物。
本发明较佳实施例的该植物细胞选自一兰科植物细胞。
本发明较佳实施例的该核酸分子用以控制一胚珠的发育，而该胚珠为一蝴蝶兰胚珠、一白花蝴蝶兰胚珠、一姬蝴蝶兰胚珠或其它兰花胚珠。
附图说明
图1为本发明较佳实施例的兰花MADS-box B-sister群基因及ABCDE模型与花轮的关系示意图。
图2为本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰经授粉后，PeMADS28基因在不同胚珠发育时期的表现图。
图3为本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰经授粉后，PeMADS28基因在不同胚珠发育时期的表现量与时间的关系示意图。
图4(A)至图4(J)为本发明较佳实施例在台湾白花蝴蝶兰的发育时期胚珠的切片中姬蝴蝶兰PeMADS28基因转录物的原位杂交的显微影像图。
图5(A)至图5(D)为野生型阿拉伯芥与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的叶子表型分析的影像图。
图6(A)至图6(H)为野生型阿拉伯芥与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的花序表型分析的影像图。
图7(A)至图7(C)为野生型阿拉伯芥与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的种子及果荚表型分析的影像图。
附图标记
1：B-sister群基因
10：PeMADS28基因表现时期
具体实施方式
为了充分了解本发明，在下文将举例较佳实施例并配合附图作详细说明，且其并非用以限定本发明。
本发明较佳实施例的兰花胚珠发育调控基因适用于提供其基因产物(geneproduct)或其编码蛋白质，但其并非用以限定本发明的范围。再者，本发明较佳实施例的兰花胚珠发育调控基因及其调控方法适用于以各种基因工程进行基因转殖(transgenic)于各种植物细胞或植物体，但其并非用以限定本发明的范围。
举例而言，本发明较佳实施例的兰花包含蝴蝶兰(Phalaenopsis)、台湾蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)、白花蝴蝶兰胚珠、姬蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris)或其它各种兰花(例如：文心兰或石斛兰)，但其并非用以限定本发明的范围。
一般而言，典型的开花植物，其胚珠与卵细胞在开花时就已发育完全，并等待后续的授精(fertilization)作用而已。然而，由于蝴蝶兰的胚珠发育是需要受到授粉(pollinium)作用的精确调控，因此其开花时尚不具备已发育完全(undeveloped)的胚珠。
本发明较佳实施例的一种兰花胚珠发育调控基因包含至少一核酸分子，而该核酸分子具有用以控制一胚珠发育的功能，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列，其称为姬蝴蝶兰MADS-box B-sister群基因(Bs)的PeMADS28基因。
举例而言，图1揭示本发明较佳实施例的兰花MADS-box B-sister群基因及ABCDE模型(model)与花轮(floral whorl)的关系示意图。请参照图1所示，本发明较佳实施例的兰花MADS-box的B-sister群基因1(标示于图1的右上方)其提供一种花型控制机制，且通过花型控制基因A、B、C、D、E、Bs的单独或其组合表现而达成控制花型器官的发育。
一般而言，在ABCDE模型中由基因A及E的活性决定兰花的萼片(sepal)的发育，且由基因A、B及E的活性决定兰花的花瓣(petal)的发育。另外，在通过授粉(pollinium)后，由基因B、C及E的活性决定兰花的雄蕊(stamen)的发育，且由基因C及E的活性决定兰花的心皮(carpel)及合蕊柱(gynostemium)的发育。
请再参照图1所示，本发明较佳实施例在ABCDE模型中可利用由基因Bs、D及E的活性决定或调控兰花胚珠的发育(ovule development)，如图1的右侧所示。
请再参照图1所示，该核酸分子提供于一载体(vector)或一穿梭(shuttle)载体，且该载体用以保存或生产该核酸分子。举例而言，该载体提供于一细胞植物，且该核酸分子可选择提供于一拟原球体(protocon-like body)或其它。
本发明另一较佳实施例的该核酸分子用以编码一蛋白质(例如：蛋白质具有SEQID No.2的序列)或其它基因产物(gene product)，即其由该核酸分子进行编码。该核酸分子可为基因体DNA、cDNA、mRNA、人造mRNA或其任意组合。
图2揭示本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰经授粉后第0至100天，PeMADS28基因在不同胚珠发育时期的表现图。请参照图2所示，本发明较佳实施例以在胚珠发育(ovuledevelopment)过程中经授粉后日期(day after pollinium，DAP)进行表示，相对于DAP第32至48天期间，即图2标示为PeMADS28基因表现时期10，在此时期PeMADS28基因大量表现。
图3揭示本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰经授粉后第0至100天，PeMADS28基因在不同胚珠发育时期的表现量与时间的关系示意图。请参照图2及图3所示，本发明较佳实施例以在胚珠发育过程中经授粉后时间(DAP)进行表示，相对于DAP第32至48天期间，PeMADS28基因表现量相对达到最大量，即图3标示为PeMADS28基因表现时期10，并随后逐渐减少，即在受精后(相对于DAP第64天前)，且相对于DAP第64天后，在种子发育(seed development)过程中仍出现相对较低的PeMADS28基因表现量。
本发明较佳实施例的一种兰花胚珠发育调控基因的转殖方法包含：提供至少一核酸分子，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列。本发明较佳实施例的该核酸分子通过单离方式或其它适当方式获得。
本发明较佳实施例的一种兰花胚珠发育调控基因的转殖方法包含：将该核酸分子导引至一植物细胞，以获得一已转殖植物细胞。举例而言，本发明较佳实施例可选择采用基因枪方式(gene gun)、真空侵入方式(vacuum infiltration)或其它适当方式进行将该核酸分子导引至该植物细胞。
本发明较佳实施例的一种兰花胚珠发育调控基因的转殖方法包含：利用该已转殖植物细胞的核酸分子控制一胚珠的发育。接着，本发明可选择利用该已转殖植物细胞再生制造一已转殖植物。举例而言，一预定植株可选择由该已转殖植物细胞生成，以获得一预定转殖植物。
举例而言，该已转殖植物细胞的核酸分子控制一胚珠的发育，且该胚珠为一蝴蝶兰胚珠、一白花蝴蝶兰胚珠、一姬蝴蝶兰胚珠或其它兰花胚珠。
本发明较佳实施例的该已转殖植物细胞用以改变一植物体内控制胚珠发育的一蛋白质表现量。举例而言，该植物细胞选自一兰科植物细胞或其它植物细胞(例如：白花蝴蝶兰)。
图4(A)至图4(J)揭示本发明较佳实施例在台湾白花蝴蝶兰(Phalaenopsisaphrodite subsp.formosana)的发育时期胚珠(ovule developing)的切片中姬蝴蝶兰PeMADS28基因转录物的原位杂交(in situ hybridization)的显微影像图。请参照图4(A)及图4(B)所示，在PeMADS28基因转录物的原位杂交上相对于DAP第4天，在子房胎盘(placenta，标示p)侦测到PeMADS28 mRNA。
请参照图4(C)及图4(D)所示，在PeMADS28基因转录物的原位杂交上相对于DAP第32天，在子房胎盘(标示p)及胚珠原基(ovule primordia，标示op)侦测到PeMADS28 mRNA。
请参照图4(E)及图4(F)所示，在PeMADS28基因转录物的原位杂交上相对于DAP第40天，在子房胎盘(标示p)及胚珠原基(标示op)仍可侦测到PeMADS28 mRNA。
请参照图4(G)及图4(H)所示，在PeMADS28基因转录物的原位杂交上相对于DAP第48天，在内珠被(inner integument，标示ii)、外珠被(outer integument，标示oi)及胚囊(embryo sac，标示es)侦测到PeMADS28 mRNA。
请再参照图4(C)至图4(H)所示，相对于DAP第32至48天侦测到PeMADS28基因，显示其被侦测到的基因表现的期间为子房胎盘及内珠被与外珠被发育的时期。
请参照图4(I)及图4(J)所示，在PeMADS28基因转录物的原位杂交上相对于DAP第56天，在胚珠(标示ov)仍可侦测到PeMADS28 mRNA。
图5(A)至图5(D)揭示野生型(wild type，WT)阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖(transgenic)阿拉伯芥的叶子表型分析的影像图。请参照图5(A)及图5(B)所示，20天阿拉伯芥野生株与20天PeMADS28基因转殖株进行比对观察。相对于阿拉伯芥野生株，在转殖株的发育早期期间(stage)PeMADS28基因转殖株显示其轮状叶(rosette leaf)生长形成相对较小的表现型，且其轮状叶形成相对较卷曲(curled)的表现型，如图5(B)所示。
请参照图5(C)及图5(D)所示，相对于阿拉伯芥野生株，在转殖株的发育早期期间PeMADS28基因转殖株显示其明显具有生长开花时间相对较早的表现型，如图5(D)所示。
图6(A)至图6(H)揭示野生型阿拉伯芥与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的花序表型(phenotype of floral inflorescence)分析的影像图。请参照图6(A)及图6(B)所示，将野生型阿拉伯芥的花朵的侧视图与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的花朵的侧视图之间进行比对观察。
请参照图6(C)及图6(D)所示，另外，将野生型阿拉伯芥的花朵的上视图与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的花朵的上视图之间进行比对观察。请参照图6(A)至图6(D)所示，相对于阿拉伯芥野生株的花朵，如图6(A)及图6(C)所示，PeMADS28基因转殖株的花朵显示其明显具有花朵尺寸相对较小的表现型及具有萼片破裂(cracked sepal)的表现型，如图6(B)及图6(D)所示。
请参照图6(E)及图6(F)所示，将野生型阿拉伯芥的花序(floral inflorescence)的侧视图与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的花序的侧视图之间进行比对观察。
请参照图6(G)及图6(H)所示，将野生型阿拉伯芥的茎生叶(leaf)的侧视图与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的茎生叶的侧视图之间进行比对观察。
图7(A)至图7(C)揭示野生型阿拉伯芥与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的种子(seed)及果荚(silique)表型分析的影像图。请参照图7(A)所示，将野生型阿拉伯芥的种子的侧视图(图7(A)的左侧所示)与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的种子的侧视图(图7(A)的右侧所示)之间进行比对观察。相对于野生型阿拉伯芥的种子，PeMADS28基因转殖的种子显示其在尺寸上具有相对较大(即其重量相对较重)的表现型，如表1所示。
请参照图7(B)所示，将野生型阿拉伯芥的果荚的侧视图(图7(B)的上侧所示)与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的果荚的侧视图(图7(B)的下侧所示)之间进行比对观察。相对于野生型阿拉伯芥的果荚，PeMADS28基因转殖的果荚显示其在长度上具有相对较短的表现型，如表1所示。
请参照图7(C)所示，将野生型阿拉伯芥的果荚的剖视图(图7(C)的上侧所示)与本发明较佳实施例的姬蝴蝶兰PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的果荚的剖视图(图7(C)的下侧所示)之间进行比对观察果荚内种子数量。相对于野生型阿拉伯芥的果荚内种子数量，PeMADS28基因转殖的果荚内种子数量显示其具有相对较少种子数量的表现型，如表1所示。
表1：野生型与PeMADS28基因转殖阿拉伯芥的果荚长度、果荚内种子数量及种子重量
前述较佳实施例仅举例说明本发明及其技术特征，该实施例的技术仍可适当进行各种实质等效修饰及/或替换方式予以实施；因此，本发明的权利范围须视权利要求书所界定的范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 萧郁芸
林士哲
刘仲健
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His Gln Gln Leu Glu Asn Leu Arg Arg Lys Glu His Ile Leu Ala Asp
145 150 155 160
Gln Asn Thr Cys Leu Tyr Arg Ser Ile Met Pro Glu His Glu Val Glu
165 170 175
Met Glu Gln Glu Arg Gln Met Glu Glu Glu His Lys Leu Arg Glu Met
180 185 190
Ser Leu Leu Glu Pro Phe Gly His Phe Leu Glu Asp Ser Arg Ser Met
195 200 205
Leu Gln Leu Gly Pro Gln Thr Leu Pro Phe Gln Leu Gln Pro Thr Gln
210 215 220
Pro Asn Leu Gln Tyr Ser Glu Leu His Gly His Gly Leu Gln Leu Trp
225 230 235 240
Claims (10)
1.一种兰花胚珠发育调控基因，其特征在于，包含至少一核酸分子，而该核酸分子用以控制一胚珠的发育，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列。
2.如权利要求1所述的兰花胚珠发育调控基因，其特征在于，该核酸分子提供于一载体或一穿梭载体。
3.如权利要求2所述的兰花胚珠发育调控基因，其特征在于，该载体提供于一细胞植物。
4.如权利要求1所述的兰花胚珠发育调控基因，其特征在于，该核酸分子提供于一拟原球体。
5.如权利要求1所述的兰花胚珠发育调控基因，其特征在于，该核酸分子用以编码一蛋白质，且该蛋白质具有SEQ ID No.2。
6.一种兰花胚珠发育调控基因的转殖方法，其特征在于，包含：
提供至少一核酸分子，且该核酸分子具有SEQ ID No.1的序列；
将该核酸分子导引至一植物细胞，以获得一已转殖植物细胞；及
利用该已转殖植物细胞的核酸分子控制一胚珠的发育。
7.如权利要求6所述的兰花胚珠发育调控基因的转殖方法，其特征在于，该核酸分子通过单离方式获得。
8.如权利要求6所述的兰花胚珠发育调控基因的转殖方法，其特征在于，该已转殖植物细胞用以改变一植物体内控制胚珠发育的一蛋白质表现量。
9.如权利要求6所述的兰花胚珠发育调控基因的转殖方法，利用该已转殖植物细胞再生制造一已转殖植物。
10.如权利要求6所述的兰花胚珠发育调控基因的转殖方法，其特征在于，该植物细胞选自一兰科植物细胞。
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