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CN109195991B - 对糖基化pd-l1特异的双重功能抗体及其使用方法 - Google Patents

对糖基化pd-l1特异的双重功能抗体及其使用方法 Download PDF

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CN109195991B CN201780027832.4A CN201780027832A CN109195991B CN 109195991 B CN109195991 B CN 109195991B CN 201780027832 A CN201780027832 A CN 201780027832A CN 109195991 B CN109195991 B CN 109195991B
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Abstract

提供了相对于未糖基化的PD‑L1而特异性地与糖基化PD‑L1结合，阻断PD‑L1与PD‑1的结合并促进PD‑L1的内化和降解的抗体。提供了识别糖基化PD‑L1蛋白上的特定表位并且表现出阻断PD‑L1与PD‑1结合以及还促进细胞上的PD‑L1内化的双重功能的抗体。在一些方面，还提供了在PD‑L1细胞外结构域的氨基和羧基末端位置包含糖基化氨基酸残基的PD‑L1多肽。还提供了使用此类抗体治疗癌症，特别是PD‑L1阳性癌症的方法。

Description

对糖基化PD-L1特异的双重功能抗体及其使用方法
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交的序列表，其由此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝(于2017年3月23日创健的)被命名为24258_105007_SL.txt，大小为40,452字节。
相关领域
本公开总体上涉及分子生物学、医学和肿瘤学领域。更特别地，提供了特异性地结合糖基化PD-L1的新抗体以及其用于治疗癌症的用途。
背景
T细胞活化的持续性已经彻底改变了对广谱恶性癌症的治疗。例如，伊匹木单抗(FDA批准的第一个靶向T细胞反应的检查点阻断)的开发使得治疗转移性黑色素瘤成为可能(Hodi,F.S.等，2010,NEJM,363:711-723；Robert,C.等，2013,Clin.Cancer Res.,19:2232-2239；and Robert,C.等，2011,NEJM,364:2517-2526)。虽然抗细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)单克隆抗体在治疗黑素瘤患者方面显示出有希望的结果，但靶向PD-1和PD-L1的第二代检查点抑制剂在III期临床试验中表现出更好的临床活性和安全性(Topalian,S.L.等，2012,NEJM,366:2443-54和Brahmer,J.R.等，2012,NEJM,366:2455-2465)。因为PD-L1还具有诱导癌细胞进展的致癌潜力(Topalian,S.L.等，Id.；Page,D.B.等，2014,Ann.Rev.Med.,65:185-202)。除了其免疫抑制活性以外，靶向PD-1/PD-L1相互作用通过阻断经由PD-1的免疫抑制同时减少经由PD-L1的细胞进展而提供双重功效，并且预期具有更敏感的结果(Topalian,S.L.等，同上；Brahmer,J.R.等，同上；和Hamid,O.,2013,NEJM,369:134-144)。2014年，美国正在进行10多项临床试验，测试抗PD-L1和/或抗PD-1抗体作为单一药剂或联合使用的效力(Page,D.B.等，同上)。美国FDA批准了两种用于治疗某些癌症的抗PD-1治疗性抗体(派姆单抗(pembrolizumab))和(尼沃鲁单抗(nivolumab))。然而，PD-L1的病理生理功能和调节机制仍未完全确定。
重新唤醒沉默的免疫反应，特别是效应T细胞，最近被添加到治疗选项的所有库中，其中治疗选项包括手术切除、化学疗法、放射疗法和靶向疗法。虽然使用抗CTLA-4单克隆抗体时(Dunn，GP等，2002,Nat.Immunol.,3:991-998；and Leach,D.R.等，1996,Science,271:1734-1736)最初证明在治疗转移性黑色素瘤方面取得了成功，但已经显示其也诱导自身免疫反应。与仅影响免疫细胞的抗-CTLA-4抗体不同，抗PD-L1抗体和抗PD-1抗体在细胞水平和肿瘤部位起作用以阻断表达PD-1的效应T细胞与表达PD-L1的肿瘤细胞之间的相互作用。这产生了来自肿瘤细胞和T细胞的双重影响，从而限制了副作用并提供了更好的治疗功效(Okazaki，T.等，2013,Nature immunology,14:1212-1218)。需要更好地理解PD-L1介导的免疫抑制和对肿瘤细胞的促致癌作用的病理生理机制，以开发针对该途径的更强效的治疗剂。仍然需要成功地靶向PD-1/PD-L1途径并激活免疫系统的效应细胞以攻击肿瘤细胞并治疗癌症的新的和更有效的治疗剂和方法。
概述
本发明人已发现，在肿瘤细胞上表达的PD-L1(也称为CD274、PDCD1L1或B7-H1)的糖基化促进或增强与免疫效应细胞诸如T细胞上表达的PD-1的结合，从而增强对T细胞抗肿瘤细胞的活性的抑制。本发明人还发现PD-L1的糖基化也可以稳定PD-L1在细胞表面上的表达，从而减少PD-L1的内化率和细胞内降解。本发明人已鉴定了相对于未糖基化的人ICP多肽而言优先与糖基化人PD-L1多肽结合的抗体。如本文中所用，此类优先结合糖基化人PD-L1的抗体被称为“抗glycPD-L1抗体”。如本文所述的抗glycPD-L1抗体还具有双重功能，因为它们阻断PD-L1/PD-1相互作用并且还促进表达PD-L1的细胞上PD-L1的内化和细胞内降解；因此，这些抗体被称为“双功能”抗体。因此，提供了表现出抑制PD-1/PD-L1结合和促进PD-L1内化和降解的双重功能的此类抗glycPD-L1抗体。
还提供了通过施用一种或多种抗glycPD-L1抗体在有此需要的受试者中治疗癌症，特别是其细胞表达或过表达PD-L1的癌症的方法。如本文所述的抗glycPD-L1抗体抑制或阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用，并且还降低肿瘤细胞上的PD-L1水平，从而抑制由PD-1/PD-L1相互作用引起的免疫抑制，并促进表达PD-1的效应T细胞对表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞毒活性的持续存在。通过抑制PD-1/PD-L1相互作用并降低肿瘤细胞表面上糖基化PD-L1的水平，所述抗glycPD-L1抗体可增强效应T细胞反应并介导抗肿瘤活性。如本文中所用，术语肿瘤和癌症可互换使用。除非另有说明，否则本文所用的“PD-L1”是指PD-L1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-L1(其氨基酸序列是SEQ ID NO:1)；“PD-1”是指PD-1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-1。
本发明人还发现人PD-L1在人PD-L1蛋白(例如，如SEQ ID NO:1所示)的氨基酸位置N35、N192、N200和/或N219处的细胞外结构域中的四个位点处被糖基化。所述抗glycPD-L1抗体可以与这些位点中的一个或多个结合，例如，可以不与在这些糖基化位点中的一个或多个位点处具有突变(例如，糖基化共有序列中的谷氨酰胺对天冬酰胺的取代)，因而在这些一个或多个位点处未被糖基化的PD-L1结合。因此，在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体特异性地与PD-L1糖肽或其肽中的一个或多个糖基化基序结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与包含糖基化基序和相邻肽的PD-L1糖肽结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与在三维上位于一个或多个糖基化基序附近的肽序列结合。因此，在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体识别并选择性地结合糖基化的PD-L1的构象表位。举例来说，在某些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1结合的Kd相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％，但在一些实施方案中，不超过相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的5％、10％、15％、20％或25％，但仍然表现出双重抗糖基化PD-L1功能。应理解，涵盖在前述Kd值之间的值以及等于前述Kd值的值。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化的PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的一半，但仍表现出双重抗糖基化PD-L1功能。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd至多为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的1/5。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd至多为相对于未糖基化的PD-L1蛋白所展示的Kd的1/10。在某些实施方案中，抗glycPD-L1抗体优先与表达WT糖基化PD-L1的细胞结合，其结合频率为针对表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合频率的至少1.5倍、2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍、9倍或10倍(如例如在细胞流式细胞术测定中测定的，以及如例如通过两个细胞群的测量的荧光强度(MFI)(当用荧光标记物标记抗体时)所测量的)，在所述细胞流式细胞术测定中，将表达WT PD-L1和未糖基化的PD-L1的细胞混合并差异标记，然后例如如实施例6中所述与用可检测的标记物标记的待测定的抗体接触。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体以5-20nM、5-10nM或10-20nM的亲和力选择性结合糖基化的PD-L1蛋白。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体，更优选嵌合抗体或人源化抗体或人抗体。术语“特异性结合”和“选择性结合”在本文中可互换使用。
与非糖基化PD-L1相比，本文所述的抗glycPD-L1抗体特异性结合糖基化PD-L1；减少、阻断或抑制PD-L1与PD-1的结合；并促进PD-L1的内化和细胞内降解。在某些实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体结合作为非线性构象表位的PD-L1表位。另外，并且不受理论束缚，抗glycPD-L1抗体结合包含糖基化氨基酸或在PD-L1的三维结构中靠近糖基化氨基酸的PD-L1表位；据信PD-L1的这种糖基化区域特别参与PD-L1/PD-1相互作用。通过结合PD-L1区域中被糖基化的表位氨基酸，所述抗glycPD-L1抗体可以有效地起作用以掩蔽或中和糖基化PD-L1蛋白中参与PD-L1/PD-1相互作用和/或稳定肿瘤细胞表面上的PD-L1表达的结合部位或区域。
所述抗glycPD-L1抗体凭借其与糖基化PD-L1的结合而发挥双重功能，因此在本文中称为“双功能”抗体。尽管不受理论束缚，但据信ECD的N-末端糖基化位点(N35)主要涉及PD-L1/PD-1结合，而ECD的更C-末端的糖基化位点(N192、N200和N219)主要涉及PD-L1在细胞膜上的稳定化，尽管这些区域中的每一个都可能有助于PD-L1/PD-1结合和膜上PD-L1的稳定化。因此，结合、阻断和/或掩蔽N35处糖基化的抗glycPD-L1抗体可抑制PD-L1/PD-1结合，并且结合、阻断和/或掩蔽N192、N200和/或N219处的糖基化的抗体促进PD-L1内化和降解。本文提供的抗体具有两种功能性。
在特定方面提供的是双重功能抗glycPD-L1单克隆抗体STM073(其具有SEQ IDNO:3的VH结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:11的VL结构域氨基酸序列，如也在下文表3中提供的)和STM108(其具有SEQ ID NO:19的VH结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:27的VL结构域氨基酸序列，如也在下文表3中提供的)，以及对糖基化PD-L1特异的其结合片段和其嵌合和人源化形式。在一个实施方案中，STM073特异性结合PD-L1上对应于包括本文中SEQ ID NO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置H69、Y112、R113和K124的氨基酸残基的表位。该STM073表位在氨基酸序列内是非连续的，是构象表位。在一个实施方案中，人PD-L1多肽中包含STM073 MAb表位的部分具有序列VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:85)，其中包含被MAb STM073识别的表位的氨基酸残基H69、Y112、R113和K124加以下划线，位置78处的氨基酸残基组氨酸(H)与位置108处的氨基酸残基天冬氨酸(D)之间的短划线代表SEQ IDNO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置79-107处的氨基酸。提供了结合STM073表位的抗体和与STM073竞争结合PD-L1的抗体。
在另一个实施方案中，STM108 MAb特异性结合PD-L1上对应于包含本文中SEQ IDNO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置S80、Y81、K162和S169的氨基酸残基的表位。该STM108表位在氨基酸序列内是非连续的，是构象表位。在一个实施方案中，人PD-L1多肽中包含STM073MAb表位的部分具有序列LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ(SEQ ID NO:1的残基74-173)，其中包含被mAb STM108识别的表位的氨基酸残基S80、Y81、K162和S169加以下划线，并且在位置84处的氨基酸残基与位置158处的氨基酸残基谷氨酸(E)之间的短划线代表SEQ ID NO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置85-157处的氨基酸，即来自SEQ ID NO:1的氨基酸19-290的成熟PD-L1蛋白。提供了结合STM108表位的抗体和与STM108竞争与PD-L1结合的抗体。
STM073 MAb的重链和轻链可变(V)结构域的核酸(DNA)和相应的氨基酸序列示于下表3中。表3提供了STM073的成熟(即不含信号肽)VH和VL结构域(分别为SEQ ID NOS 2、3、10和11)和含有信号肽的VH和VL结构域序列(分别为SEQ ID NO:87、88、89和90)的核苷酸和氨基酸序列。含有信号序列的重链和轻链结构域的重链DNA和蛋白质V结构域序列示于表3中，氨基末端信号序列(分别为VH结构域的核苷酸1-58和氨基酸1-19以及VL结构域的核苷酸1-66和氨基酸1-22)以斜体字体表示。表3中还显示了使用Kabat和Chothia编号定义的STM073 MAb重链和轻链V结构域CDR。
在一个实施方案中，特异性结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含SEQ ID NO:3的VH结构域和SEQ ID NO:11的VL结构域。在一个实施方案中，所述双重功能抗glycPD-L1抗体与包含SEQ ID NO:3的VH结构域和SEQ ID NO:11的VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。在一个实施方案中，特异性结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含含有分别具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合的VH结构域。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含如下VH结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3或其组合。在一个实施方案中，特异性结合PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含这样的VL结构域，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含这样的VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQID NO:16的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，特异性结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含(a)如下VH结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合；和(b)如下VL结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1-3。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含上述VH和VL结构域及其中的CDR的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。
在一个实施方案中，特异性结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有80％,85％,90％,95％，98％或99％同一性的VH结构域和/或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有80％，85％，90％，95％，98％或99％同一性的VL结构域，并且抑制或阻断糖基化PD-L1对PD-1的结合。在一个实施方案中，特异性结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含含有如下CDR 1-3的VH结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列或分别相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少1、2、3、4或5个氨基酸取代，所述双重功能抗glycPD-L1抗体阻断糖基化PD-L1与PD-1的结合。在一个实施方案中，特异性结合PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含含有如下CDR 1-3的VL结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代。在一个实施方案中，特异性结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含(a)包含如下CDR 1-3的VH结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列或分别相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代；(b)包含如下CDR 1-3的VL结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代，所述抗体阻断糖基化PD-L1与PD-1的结合。优选地，这些抗体具有人框架区，即是STM073的人源化形式，并且任选地具有人恒定区。还提供了使用AbM、Contact或IMGT定义的CDR的人源化形式的STM073，其具有人框架区和任选地人恒定区。本领域技术人员将理解，可以在人源化抗体的框架区和/或CDR中产生一个或多个氨基酸取代以改善结合亲和力。
在一些实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含上述VH和VL结构域及其中的CDR的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化的PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的一半。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的至多1/5。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化的PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1蛋白所展示的Kd的至多1/10。在一个实施方案中，在如实施例6中所述的细胞流式细胞术结合测定中，抗体表现出表示为MFI的与表达WT PD-L1的细胞的结合为与表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合的MFI的1.5倍、2倍、3倍、4倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一个实施方案中，STM073抗体或其人源化或嵌合形式或竞争与前述糖基化PD-L1的结合的抗体的结合亲和力为5-20nM或5-10nM(包括下限和上限值)。在一个实施方案中，所述抗体抑制PD-1与PD-L1的相互作用特别地抑制效应T细胞表达的PD-1与肿瘤细胞表达的PD-L1(特别是糖基化PD-L1)的相互作用，并且特别地通过增加PD-L1的内化和细胞内降解而降低肿瘤细胞表面上的PD-L1(特别是糖基化PD-L1)的水平。通过本文提供的抗糖基化PD-L1抗体结合后在肿瘤细胞上表达的PD-L1的内化是抗glycPD-L1抗体的有益特征，因为在肿瘤细胞上较少的糖基化PD-L1可用于与T细胞上的PD-1相互作用，从而增强针对肿瘤细胞的T细胞细胞毒性效应子功能并降低由PD-L1/PD-1相互作用产生的T细胞无反应性。
在另一个具体实施方案中，提供了特异性结合糖基化的PD-L1的抗体或其结合片段，其为抗glycPD-L1单克隆抗体STM108。STM108 MAb的成熟重链和轻链可变(V)结构域(SEQ ID NO:18、19、26和27)的核酸(DNA)和相应的氨基酸序列示于下表3中。未加工的重链V结构域序列(即，在N-末端含有信号序列的那些)的DNA和氨基酸序列也示于表3中(SEQ IDNO:91和92)，氨基末端信号序列是以斜体字体表示(VH结构域的核苷酸1-57和氨基酸1-19)。表3中还显示了根据Kabat和Chothia定义的STM108 MAb重链和轻链V结构域CDR。
在一个实施方案中，特异性地且优先结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH结构域和SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL结构域。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH结构域和SEQID NO:27的氨基酸序列的VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。在一个实施方案中，特异性地和优先结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含如下VH结构域，其含有分别具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含如下VH结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:24的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQID NO:25的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，特异性地且优先结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含如下VL结构域，所述VL结构域包含分别具有SEQID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含如下VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，特异性地且优先结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含(a)如下VH结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的Chothia CDR1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合；(b)如下VL结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1-3。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含上述VH和VL结构域及其中的CDR的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。
在一个实施方案中，特异性地且优先结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的VL结构域。在一个实施方案中，特异性地且优先结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含如下VH结构域，其含有其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQID NO:24的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，特异性地且优先结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含含有如下CDR 1-3的VL结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代。在一个实施方案中，特异性地且优先结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体包含(a)如下VH结构域，其含有其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列、或分别相对于SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的CDR 1-3，或其组合；和/或(b)VL结构域，其包含其中至少1个、2个或所有3个CDR分别相对于SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的CDR 1-3。
还提供了使用AbM、Contact或IMGT定义的CDR的STM108的人源化形式，其具有人框架区和任选地人恒定区。优选地，这些抗体具有人框架区，即为STM108的人源化形式，并且任选地具有人恒定区。
在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含上述VH和VL结构域及其中的CDR的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。STM108的人源化形式可在CDR和/或框架区中具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其改善抗体的一个或多个性质，诸如抗原亲和力。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的一半。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的至多1/5。在一个实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1蛋白所展示的Kd的至多1/10。在一个实施方案中，在如实施例6中描述的细胞流式细胞术结合测定中，所述抗体表现出表示为MFI的与表达WT PD-L1的细胞的结合为与表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合的MFI的1.5倍、2倍、3倍、4倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一个实施方案中，STM108 MAb或其嵌合或人源化形式对糖基化PD-L1的结合亲和力为5-20nM或5-10nM，包括下限和上限值。在一个实施方案中，所述抗体抑制PD-1与PD-L1的相互作用，并且特别地抑制由效应T细胞表达的PD-1与由肿瘤细胞表达的PD-L1(特别是糖基化PD-L1)的相互作用。抗体优选具有人框架区，并且在某些实施方案中，具有人恒定区。
本发明实施方案还包括分离的双重功能抗glycPD-L1单克隆抗体，或其嵌合或人源化形式，其结合人PD-L1氨基酸序列DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:86)内的表位，其是SEQ ID NO:1的人PD-L1序列的肽部分。在一个实施方案中，抗体结合的表位包括非连续氨基酸，并且表位是构象表位。在一个实施方案中，抗体特异性结合对应于非连续氨基酸残基的人PD-L1表位，所述非连续氨基酸残基包含在以下序列中显示为加以下划线的氨基酸残基的人PD-L1氨基酸序列SEQ ID NO:1的位置Y112、R113和S117：DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:86)。
在另一方面提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如单克隆抗体，或其结合片段，特别是人源化抗体或人抗体，其特异性结合选自VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:85)或DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列内的表位，所述序列位于SEQ ID NO:1的成熟人PD-L1多肽序列内。所述抗体优选具有人框架区，并且在某些实施方案中具有人恒定区。在另一方面提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如单克隆抗体，或其结合片段，特别是人源化抗体或人抗体，其特异性地与氨基酸序列LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ内表位结合，所述氨基酸序列为SEQID NO:1的氨基酸74至84和158至173。抗体优选具有人框架区，并且在某些实施方案中，具有人恒定区。
在某个实施方案中，提供分离的抗glycPD-L1抗体，特别是单克隆抗体，人源化抗体或人抗体，其结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H69、Y112、R113和K124的表位。在一个方面，提供了分离的抗glycPD-L1抗体，其特异性结合糖基化人PD-L1，使得当与人PD-L1结合时，抗体结合以下氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO:1的H69、Y112、R113和K124。在另一个实施方案中，提供了分离的抗glycPD-L1抗体，特别是单克隆抗体、人源化抗体或人抗体，其结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基S80、Y81、K162和S169的表位。在一个方面，提供了分离的抗glycPD-L1抗体，其特异性结合糖基化人PD-L1，使得当与人PD-L1结合时，抗体结合以下氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO:1的S80、Y81、K162和S169。
在另一个方面，提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，特别是单克隆抗体、人源化抗体或人抗体，其特异性结合糖基化人PD-L1，使得当与人PD-L1结合时，抗体结合以下氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO:1的Y112、R113和S117。
在另一方面提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，特别是单克隆抗体，人源化抗体或人抗体，其特异性结合糖基化人PD-L1，使得当与人PD-L1结合时，抗体结合SEQ IDNO:1的V68至V128的氨基酸区域内或SEQ ID NO:1的D108至V128的氨基酸区域内的至少一个氨基酸。在一个方面，提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，其特异性结合糖基化人PD-L1，使得当与人PD-L1结合时，所述单克隆抗体结合以下氨基酸残基的组：来自SEQ IDNO:1的V68至V128的氨基酸区域内的H68、Y112、R113和K124。在一个方面，提供了分离的双重功能抗-glyGDD-L1抗体，其特异性结合糖基化人PD-L1，使得当与人PD-L1结合时，所述单克隆抗体结合以下氨基酸残基的组：来自SEQ ID NO:1的D108至V128的氨基酸区域内的Y112、R113、S117。
在一个方面，双重功能抗glycPD-L1抗体在SEQ ID NO:1的L74至R84和/或E158至Q173的区域内结合，优选结合SEQ ID NO:1的残基S80、Y81、K162和S169中的一个或多个。
在另一方面提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体或其结合片段，特别是单克隆抗体、人源化抗体或人抗体，相对于非糖基化人PD-L1蛋白，其特异性地结合糖基化人PD-L1蛋白，使得当与人PD-L1结合时，所述抗体结合PD-L1蛋白(SEQ ID NO:1)的至少氨基酸区域V68-V128或至少氨基酸区域D108-V128或其组合。抗体优选具有人框架区，并且在某些实施方案中，具有人恒定结构域。
在另一方面提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体或其结合片段，其包含(a)VH结构域，其包含含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1；含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR2；和其包含有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3；(b)VL结构域，其包含含有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；含有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2；和含有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3。在一个实施方案中，抗体是人源化抗体，其具有人框架区和任选地人抗体恒定结构域。
在另一方面提供了分离的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:2或18的编码VH结构域的核苷酸序列和/或选自SEQ ID NO:10或26的编码VH结构域的核苷酸序列。一个实施方案提供了编码双重功能抗glycPD-L1抗体的VH结构域的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2或18的核苷酸序列具有至少90-98％同一性。另一个实施方案提供编码双重功能抗glycPD-L1抗体的VL结构域的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQID NO:19或26的核苷酸序列具有至少90-98％同一性。在一些实施方案中，编码VH和/或VL结构域的核苷酸序列分别与SEQ ID NO:2或18或分别与SEQ ID NO:10或26具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
在某些方面，双重功能抗glycPD-L1抗体是IgG、IgM、IgA、其同种型，诸如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG4或其抗原结合片段。在其他方面，抗glycPD-L1抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv、双特异性抗体、双特异性scFv或单结构域抗体。在一些方面，抗glycPD-L1抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一个方面，重组地产生双重功能抗glycPD-L1抗体。在其他方面，将双重功能抗glycPD-L1抗体与成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。
在一个方面，提供了在药学上可接受的载体或介质中的包含双重功能抗glycPD-L1抗体(例如，本文中所述的相对于未糖基化的PD-L1而言与糖基化PD-L1选择性地和优先结合，并且实现PD-L1的内化和/或降解的抗体)的组合物。
在另一个方面，提供了分离的多肽，其包含人PD-L1的至少7个(例如，至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)连续氨基酸的肽，所述肽包含对应于人PD-L1的细胞外结构域(ECD)内的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸。在一个实施方案中，分离的多肽包含人PD-L1的至少7个(例如，至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)连续氨基酸的肽，所述肽包含对应于人PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸，其中相应于PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的氨基酸的至少一个是糖基化的。在一个实施方案中，将分离的多肽与免疫原性多肽(例如，匙孔血蓝蛋白，KLH)融合或缀合。在某些方面，所述多肽还在其氨基(N)-或羧基(C)-末端包含半胱氨酸(Cys)残基。例如，所述多肽可以通过Cys残基处的二硫键联与免疫原性多肽缀合。在一个特定实施方案中，将包含至少一个在对应于人PD-L1的位置N35、N192、N200或N219处糖基化的氨基酸残基的PD-L1肽用作免疫原以产生抗glycPD-L1抗体。
在另一方面，提供了包含多肽的组合物，所述多肽包含人PD-L1的至少7个(例如，至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)连续氨基酸的肽，所述肽包含对应于人PD-L1的ECD内的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸，其中对应于PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的至少一个所述氨基酸被糖基化，其中将所述多肽配制在药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物中。
在又一方面，提供了包含多肽的免疫原性组合物，所述多肽包含人PD-L1的至少7个连续氨基酸的肽片段，其包含对应于人PD-L1多肽的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸，其中对应于PD-L1多肽的ECD内的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸被糖基化，并且其中将所述多肽配制在药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物中。在一些方面，免疫原性组合物还包含佐剂，例如明矾或弗氏佐剂。
在另一方面，提供了用于治疗有需要的受试者(诸如患有癌症的受试者)的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体。在具体的实施方案中，抗glycPD-L1抗体是MAb STM073或STM108之一的人源化或嵌合形式。在其他实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体是与MAb STM073或MAb STM108竞争与糖基化PD-L1的结合的抗体。在一个实施方案中，提供了治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的抗体。在某些优选实施方案中，癌细胞对PD-L1特别是糖基化PD-L1呈阳性。癌细胞还可对一种或多种其他癌细胞标志物例如但不限于EGFR呈阳性。在非限制性实施方案中，受试者中待治疗的癌症、疾病或病状是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些实施方案中，待治疗的癌症是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、骨癌、成人脑/CNS肿瘤、儿童脑/CNS肿瘤、男性乳腺癌、青少年癌症、儿童癌症、年轻人癌症、未知的原发性癌症、Castleman病、宫颈癌、子宫内膜癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌或下咽癌、白血病(例如，成人急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性粒单核细胞性白血病(CMML)、儿童白血病)、肺癌(例如，非小细胞、小细胞)、肺类癌瘤、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、海军腔癌、鼻窦癌症、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如，成人软组织癌)、皮肤癌(例如，基底和鳞状细胞、黑素瘤、默克尔细胞)、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或威尔姆斯瘤。
在某些方面，将抗glycPD-L1抗体配制在药学上可接受的组合物中。在进一步的方面，全身性或肠胃外施用抗体。在特定方面，通过静脉内、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、鞘内或局部施用抗体。在其他方面，可向有需要的受试者施用一种类型或共施用不止一种类型的双重功能抗glycPD-L1抗体。抗体的共同施用可涉及在施用另一抗体之前、之后或同时施用一种抗体。
在一个方面，提供了治疗患有癌症或肿瘤，特别是在癌症或肿瘤细胞表面上表达PD-L1的癌症或肿瘤的受试者的方法。此类方法包括向有此需要的受试者施用有效量的双重功能抗glycPD-L1抗体，以抑制或阻断PD-L1与PD-1的相互作用，并阻止免疫抑制以及促进受试者的效应T淋巴细胞对癌症或肿瘤细胞的杀伤。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体是STM073或STM108的嵌合或人源化形式，或与这些抗体中的一种或两种竞争与糖基化PD-L1的选择性结合的抗体。
在一些方面，该方法包括向接受抗glycPD-L1抗体治疗的受试者施用至少第二抗癌疗法或药物。第二抗癌疗法可构成但不限于手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。第二抗癌药物也不是限制性的，并且能够由临床医生、本领域技术人员的医学专业人员(例如，肿瘤学家)通过实践或凭经验确定。如本领域技术人员所理解的，至少第二种抗癌疗法或药物的施用可以在施用双重功能抗glycPD-L1抗体之前、之后或同时进行。
在另一方面提供了确定癌症患者是否可能受益于阻断PD-L1与PD-1结合的药剂治疗(即，是利用所述药剂进行治疗的候选者)的方法，该方法包括使用如本文所述的抗体测试糖基化PD-L1在源自患者癌细胞样品的细胞上的存在，其中检测抗体与患者癌细胞的结合表明患者是疗法的候选者。该方法还可包括，如果发现受试者的癌细胞对糖基化PD-L1蛋白的表达呈阳性，则向患者施用有效量的阻止PD-L1与PD-1的结合的药剂。在一个实施方案中，阻止PD-L1与PD-1结合的药剂是抗glycPD-L1抗体，优选双重功能抗glycPD-L1抗体、抗-PD-1抗体或其组合。在一个实施方案中，将抗glycPD-L1抗体和/或抗-PD-1抗体与另一种抗癌药物或治疗剂组合施用。在一个实施方案中，将抗glycPD-L1抗体与另一种抗glycPD-L1抗体(诸如本文所述的)组合施用。在一个实施方案中，该方法还涉及从患者获得癌细胞样品。
在又一方面，提供了用于评估生物样品中PD-L1蛋白的糖基化、N-连接的糖基化或N-糖基化的方法，其中该方法包括使含PD-L1的样品与如本文所述的抗体接触。在一些方面，该方法是体外方法或测定。在某些方面，所述生物样品是细胞样品、组织样品、体液(例如血浆、血清、血液、尿液、痰、淋巴液、腹水、腹腔积液、脑液或脊髓液等)。在特定实施方案中，所述样品是细胞样品或来自获自患有癌症或肿瘤的受试者的肿瘤或癌症的细胞样品。可使用如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体对此类癌症或肿瘤细胞样品测定在癌症或肿瘤细胞表面上的糖基化PD-L1，由此特别地确定：如果糖基化PD-L1存在于受试者的癌症或肿瘤细胞上，那么所述细胞有可能是用所述抗glycPD-L1抗体治疗的适当靶标。
在另一方面提供了制备抗体的方法，其中所述方法包括向受试者(例如，动物)施用根据所述实施方案的多肽(例如，包含人PD-L1的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含对应于人PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸，其中对应于PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的至少一个所述氨基酸被糖基化)，并从受试者中分离抗体。举例来说，动物可以是非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、山羊或人。在某些方面，方法还包括使用本领域已知的方法和程序鉴定抗体的CDR并使CDR周围的序列(即，框架序列)人源化以产生人源化抗体。在另外的方面，该方法包括重组表达人源化抗体。因此，在一个另外的实施方案中，提供了通过前述方法产生的分离的抗体。因此，在一些实施方案中，提供了分离的抗体，相对于未糖基化的PD-L1，所述抗体选择性地与糖基化PD-L1多肽的表位，诸如构象表位(例如，包含人PD-L1的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含对应于人PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸，其中对应于PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的至少一个所述氨基酸被糖基化)结合。另一方面提供了用于免疫受试者以产生免疫反应例如针对抗原的抗体反应的方法，包括向受试者施用有效量的实施方案的多肽(例如，糖基化PD-L1多肽)作为免疫原性抗原。
在具体的实施方案中，本发明提供了制备具有两个不同抗原结合结构域的双互补位抗体的方法，所述两个抗原结合结构域各自结合不与糖基化PD-L1的另一抗原结合结构域的表位重叠的表位，并且至少一个结合结构域(和在某些实施方案中，两个结合结构域)优先结合PD-L1的糖基化形式，例如通过结合含有本文所列的一个或多个糖基化位点的表位。这些抗体可以交联细胞表面蛋白，促进内化、溶酶体运输和降解。通过使用本领域已知的以及还有共同未决的临时申请号62/361,298中所述的筛选方法筛选相对于PD-L1的非糖基化形式而优先与糖基化PD-L1蛋白结合的抗体，鉴定结合糖基化PD-L1的非重叠表位的两种抗体(其中与PD-L1的非糖基化形式相比，一种或两种抗体优先与PD-L1的糖基化形式结合)，可产生此类双互补位抗体。可以使用针对任何含有糖基化的表位或者本文所述的抗体优先与糖基化PD-L1结合的抗体。两个抗原结合结构域可以排列在抗体分子中，例如，如Dimasi等，J.Mol.Biol.,393:672-692(2009)中所述。在具体的实施方案中，将所述抗原结合结构域之一工程化为单链Fv形式，然后，例如，通过肽接头将其连接到具有另一个抗原结合结构域的抗体的重链和/或轻链的N末端或连接到CH3结构域的C末端。
在另一方面，提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其中如本文所述的抗glycPD-L1抗体，特别是在与糖基化PD-L1结合后显示有效内化活性的抗体与抗肿瘤药物和药剂化学连接，以产生抗glycPD-L1抗体-药物缀合物，如本文所述和示例的。在一些实施方案中，抗glycPD-L1MAb ADC在杀死肿瘤或癌细胞方面以及在用于治疗患有癌症的受试者的抗肿瘤疗法中非常有效。在实施方案中，ADC的抗glycPD-L1抗体组分是双特异性、多特异性、双互补位或多互补位抗体，或其抗原结合部分。在其他实施方案中，抗glycPD-L1抗体与抗有丝分裂剂(诸如美登素衍生物，例如美登木素生物碱诸如DM1或DM4)，或与微管蛋白聚合性奥里斯他汀(auristatin)例如单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)或单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)化学连接，如本文中进一步描述的。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体的接头在细胞外液中是稳定的，但一旦ADC进入肿瘤或癌细胞就被组织蛋白酶切割，从而激活MMAE或其他毒素药物的抗有丝分裂机制。在一个实施方案中，ADC的抗体组分是如本文所述的STM073 MAb或STM108 MAb。在一个实施方案中，含STM108MAb的ADC(STM108-ADC)通过可切割的接头与MMAE化学连接。在一个特定的实施方案中，所述TM108-ADC包含其中STM108 MAb通过其C-区中的半胱氨酸残基与马来酰亚胺和己酸(MC)连接基团化学连接的结构，所述连接基团化学连接至组织蛋白酶可切割的接头，诸如由缬氨酸(Val)和瓜氨酸(Cit)组成的“vc”，其化学连接至间隔子“PAB”(即，对氨基苯甲酸)，所述间隔子化学连接至MMAE细胞毒素，从而产生ADC，根据其组分结构命名为STM108-MC-vc-PAB-MMAE。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步证明本文所述的但非限制性的实施方案的某些方面。该专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1A-1H.PD-L1在癌细胞中被糖基化。1A.原发性乳腺癌患者样品中PD-L1蛋白的表达。代表性乳腺癌患者样品中PD-L1的Western印迹分析。1B.在四种代表性乳腺癌细胞系、四种黑素瘤细胞系、三种肺癌细胞系和三种结肠癌细胞系中的PD-L1的Western印迹分析。1C.shCTRL和A431细胞的两个独立的shPD-L1稳定克隆中PD-L1表达的Western印迹分析。将PD-L1瞬时转染到shPD-L1#5克隆中。D.在用或不用PNG酶F处理的情况下，纯化的PD-L1蛋白的糖蛋白染色。考马斯蓝染色小组代表PD-L1蛋白的总量。出现在泳道4和5中的上部条带来自PNG酶F的加载。(-)Ctrl，非糖蛋白的对照；(+)Ctrl，糖蛋白的对照。E.PD-L1-GFP、HA-PD-L1和PD-L1-Flag蛋白的糖基化模式。用PNG酶F和Endo H处理细胞裂解物并通过Western印迹分析。F.GFP标记的PD-L1全长(WT)、细胞外结构域(ECD)或细胞内结构域(ICD)在293T细胞中瞬时表达。然后用或不用5μg/ml衣霉素(TM)处理细胞过夜。使用Western印迹检查PD-L1的蛋白质表达。G.本文所述的实验研究中使用的代表性PD-L1蛋白质表达构建体的示意图，显示全长PD-L1蛋白及其组分细胞外结构域(ECD)、细胞内结构域(ICD)、信号肽(SP)、跨膜结构域(TM)。在该图中，PD-L1的ECD结构域中的四个N-糖基化位点(NXT基序)以红色显示。数字表示PD-L1多肽中氨基酸残基的位置。H.PD-L1 WT的蛋白质表达模式和PD-L1的糖基化突变体(NQ突变体)的Western印迹分析。泳道14表示用衣霉素(TM)处理过夜的非糖基化的野生型(WT)PD-L1。在图中，黑色圆圈表示糖基化的PD-L1，黑色箭头表示非糖基化的PD-L1。
图2A-2G.糖基化稳定了PD-L1表达，并且是癌细胞相关免疫抑制所必需的。A和B：表达PD-L1-Flag的293T细胞中PD-L1蛋白的Western印迹分析结果。以指定的间隔用20mM环己酰亚胺(CHX)(A)和5μM MG132(蛋白酶体抑制剂)(B)处理细胞，并通过Western印迹分析。使用光密度计定量PD-L1蛋白的强度。C.如(A)中所述测定的PD-L1WT和PD-L1糖基化突变体N35Q、N192Q、N200Q、N219Q和4NQ的蛋白质稳定性的Western印迹分析。在Western印迹分析结果之下：通过密度测定法定量PD-L1 WT和四种NQ突变体的蛋白质半衰期。D.在进行或不进行TM或抗PD-L1抗体处理的情况下PD-1与PD-L1蛋白的相互作用。共焦图像显示在表达PD-L1 WT的293T细胞的膜上的结合型PD-1/Fc融合蛋白(左侧的染色小组)。在PD-L1/PD-1相互作用测定中定量结合的PD-1蛋白(右图)。E.PD-1与PD-L1 WT或4NQ蛋白的结合亲和力。将表达PD-L1 WT或4NQ的293T细胞的裂解物与或不与PD-1/Fc融合蛋白一起孵育。然后用抗Flag抗体免疫沉淀PD-L1蛋白，并通过Western印迹分析。F.共免疫沉淀测量表达PD-L1 WT或4NQ的293T细胞中PD-1与PD-L1的相互作用。G.Jurkat T细胞和表达PD-L1 WT或4NQ的细胞的共培养物中可溶性IL-2表达的水平。在(D)、(E)和(G)所示的实验之前，用MG132预处理细胞。在该图中，黑色圆圈表示糖基化PD-L1；箭头表示非糖基化PD-L1；TM：衣霉素；*表示Student’s t检验具有统计学意义。所有误差棒表示为3次独立实验的平均值±SD。
图3A-3D.PD-L1蛋白在癌细胞中的表达。A.肺癌细胞中PD-L1的Western印迹分析。B.结肠癌细胞中PD-L1的Western印迹分析。C.乳腺癌细胞中PD-L1的Western印迹分析。D.卵巢癌细胞中PD-L1的Western印迹分析。黑圈＝糖基化PD-L1；箭头＝非糖基化PD-L1。
图4A-4D.PD-L1在癌细胞中被糖基化。A.使用不同抗PD-L1抗体进行的癌细胞中PD-L1的Western印迹分析。选择四种BLBC细胞系HCC1937、SUM149、MB-231和BT20，以及两种非BLBC细胞系MB-483和MB-474，以使用不同抗体分析PD-L1的表达。B.shCTRL以及MDA-MB-231和A431细胞的两个独立的shPD-L1稳定克隆中PD-L1的Western印迹分析。C.Flag-PD-L1的双重表达构建体和PD-L1的shRNA的示意图。D.DDA-MB-231和A431细胞中PD-L1蛋白的糖基化模式。用PNG酶F处理细胞裂解物并通过Western印迹分析。黑圈＝糖基化PD-L1；箭头＝非糖基化PD-L1。
图5A-5E.糖基化和非糖基化PD-L1蛋白的表达。A.在衣霉素(TM)处理的细胞中的PD-L1-Myc、PD-L1-Flag和HA-PD-L1蛋白的Western印迹分析。B.衣霉素(TM)处理或未处理细胞中的PD-L1-GFP-WT、PD-L1-GFP-ECD和PD-L1-GFP-ICD蛋白的Western印迹分析。C.衣霉素(TM)处理的细胞中的PD-L1-Myc、PD-L1-Flag、HA-PD-L1、PD-L1-GFP-WT、PD-L1-GFP-ECD和PD-L1-GFP-ICD蛋白的Western印迹分析。通过光密度测定法定量测定糖基化PD-L1蛋白(黑色条)或非糖基化PD-L1蛋白(红色条)的强度(在Western印迹分析下的柱状图中)。D.从上面(C)中所示的柱状图中获得的糖基化PD-L1蛋白(黑色条)或非糖基化PD-L1蛋白(红色条)的强度平均值。误差棒代表标准偏差(SD)。E.表达PD-L1的HEK 293T细胞中PD-L1蛋白的糖基化模式。用或不用PNG酶F或O-糖苷酶处理细胞裂解物，并通过Wes tern印迹分析。黑圈＝糖基化PD-L1；箭头＝非糖基化PD-L1。衣霉素是抑制蛋白质的N-连接糖基化的核苷类抗生素。
图6A和6B.PD-L1蛋白的N-糖基化位点。A.来自不同物种的PD-L1氨基酸序列的序列比对。将四个NXT基序N35、N192、N200和N219加框并以红色显示，两个非NXT基序N63和N204以绿色显示。红框＝保守的NXT基序。图6A：共有序列(SEQ ID NO:74)；Q9NZQ7_HUMAN(SEQ ID NO:75)；Q9EP73_MOUSE(SEQ ID NO:76)；D4AE25_RAT(SEQ ID NO:77)；C5NU11_BOVINE(SEQ ID NO:78)；Q4QTK1_PIG(SEQ ID NO:79)；和F7DZ76_HORSE(SEQ ID NO:80)。图6B：共有序列(SEQ ID NO:94)；Q9NZQ7_HUMAN(SEQ ID NO:95)；Q9EP73_MOUSE(SEQ ID NO:96)；D4AE25_RAT(SEQ ID NO:97)；C5NU11_BOVINE(SEQ ID NO:98)；Q4QTK1_PIG(SEQ IDNO:99)和F7DZ76_HORSE(SEQ ID NO:100)。
图7A-7H.N-糖肽的基于LC-MS/MS的鉴定。N-糖肽的基于LC-MS/MS的鉴定对应于来自HEK 293细胞的PD-L1的以下四个N-糖基化位点中的每一个：N35(A和E)、N192(B和F)、N200(C和G)和N219(D和H)。当检测到糖型的代表性亚组时，LC-MS谱(A-D)显示为在洗脱时间段(如图中标记的)内平均的谱。对于每个N-糖基化位点，显示一个代表性HCD MS2谱(E-H)以举例说明其基于y1离子(携带附接于N-糖基化Asn的GlcNAc的胰蛋白酶化肽骨架)以及定义其肽序列的b和y离子的检测的鉴定。用于聚糖的卡通符号(参见插图)符合由功能性糖组学联盟推荐的标准表示：额外的Hex和HexNAc暂时被指定为从三甘露糖基核心(Man3-GlcNAc2)的lacNAc(Gal-GlcNAc)或lacdiNAc(GalNAc-GlcNAc)延伸，所述三甘露糖基核心可以是岩藻糖基化的或未岩藻糖基化的核心。图7E-7H中描绘的序列分别示于SEQ ID NO:81-84中。
图8A-8H.PD-L1糖基化改变PD-L1的蛋白质稳定性和免疫抑制功能。A-B.表达PD-L1-Flag的HEK 293T细胞中的PD-L1蛋白的Western印迹分析。用20mM环己酰亚胺(CHX)(A)和5μM MG132(B)处理用或不用衣霉素处理的细胞，进行指定的间隔(小时)并通过Western印迹进行分析。C.用或不用衣霉素处理并用20mM环己酰亚胺(CHX)处理指定时间的A431细胞中PD-L1的Western印迹分析。下图显示糖基化对比非糖基化PD-L1蛋白的密度测定定量。D.PD-L1/PD-1相互作用测定的示意图。E.共聚焦图像显示A431细胞中膜定位的PD-L1 WT或4NQ蛋白。F.PD-L1 WT或PD-L1 4NQ蛋白的膜定位。在对膜定位的PD-L1 WT或4NQ蛋白进行生物素化后，生物素化的蛋白质被链霉抗生物素蛋白琼脂糖拉下来。通过Western印迹检查膜定位的PD-L1 WT或4NQ蛋白。从样品的密度测定法定量获得的膜结合型PD-L1 WT或4NQ蛋白的比例显示在印迹下方。G.表达PD-1WT、N35Q、N192Q、N200Q、N219Q或4NQ的细胞中PD-1与PD-L1蛋白的相互作用。所有误差棒表示为3个独立实验的平均值±SD。H.设计用于检测分别在经由PD-1/PD-L1的T细胞/肿瘤细胞相互作用后的IL-2产生的ELISA的示意图。将表达PD-L1的肿瘤克隆与过表达PD-1的Jurkat T细胞共培养。如例如下文实施例1、4和5中所述，使用ELISA测量来自Jurkat细胞的IL-2产生。在A-C中，黑色圆圈＝糖基化PD-L1；箭头＝非糖基化PD-L1。
图9A-9F.癌症细胞相关免疫抑制需要PD-L1的糖基化。A.流式细胞术测量膜结合的PD-1与在BT549细胞上表达的PD-L1 WT或PD-L1 4NQ突变蛋白的相互作用。在实验之前用MG132预处理细胞。B.时间间隔显微镜检查图像显示PD-L1与PD-1之间在最后一个时间点的动态相互作用。表达PD-L1 WT或4NQ的细胞的红色荧光(核限制RFP)和绿色荧光(绿色荧光标记的PD-1/Fc蛋白)合并图像(20x)。(B)中右侧的动力学图显示在每小时时间点时PD-1/Fc蛋白与BT549细胞上表达的PD-L1 WT或PD-L1 4NQ蛋白的定量结合。C.T细胞介导的肿瘤细胞杀伤(TTK)测定涉及在BT549细胞上表达的PD-L1 WT或4NQ PD-L1蛋白。在96小时时在半胱天冬酶3/7底物存在的情况下表达PD-L1 WT或4NQ的细胞以及表达PD-1的T细胞共培养物的代表性相位、红色荧光(核限制RFP)和/或绿色荧光(NucViewTM 488半胱天冬酶3/7底物)合并图像(10x)。用抗CD3抗体(100ng/ml)和IL-2(10ng/ml)活化T细胞。将绿色荧光细胞计为死细胞。死亡细胞对与PD-L1 WT或PD-L1 4NQ蛋白质相关的总细胞的定量比率显示在图像右侧的柱状图中。D.携带源自注射的4T1细胞的肿瘤的BALB/c小鼠中的肿瘤生长，所述4T1细胞表达PD-L1 WT或PD-L1 4NQ突变蛋白。使用IVIS100通过生物发光成像在体内显示4T1-luc细胞的肿瘤生长(在D中的左侧)。D中右侧：显示携带源自表达PD-L1 WT对比PD-L14NQ蛋白的4T1细胞的肿瘤的小鼠中的肿瘤体积的盒图和显示所述小鼠中的肿瘤大小的照片。测量肿瘤并在终点解剖肿瘤。n＝8只小鼠/组(右)。E.CD8+CD3+T细胞群中IFNγ的细胞内细胞因子染色。通过双向ANOVA确定显著性，*p<0.05和**p<0.001；n＝7只小鼠/组。*表示通过学生t检验在统计学上显著的。所有误差棒表示为3次独立实验的平均值±SD。F.显示携带源自用100μg的STM073 MAb(“73”)或100μg的IgG对照处理的表达PD-L1 WT(糖基化的)蛋白的4T1细胞的肿瘤的小鼠中的肿瘤体积的盒图。测量肿瘤并在终点解剖。n＝7只小鼠/组。用STM073治疗导致肿瘤体积减小。
图10A-10C.PD-L1蛋白的糖基化和非糖基化形式以及Western印迹分析的示意图。野生型糖基化PD-L1蛋白(PD-L1 WT)和四种PD-L1蛋白变体的示意图描述，在PD-L1蛋白的四个N-糖基化位点(N35/3NQ；N192/3NQ；N200/3NQ和N219/3NQ)当中，每种蛋白具有一个糖基化氨基酸残基和三个非糖基化氨基酸残基。以黑色指示的氨基酸表示糖基化残基；红色显示的氨基酸位点在变体PD-L1蛋白中是非糖基化的。B.产生表达PD-L1蛋白的N5/3NQ、N192/3NQ、N200/3NQ和N219/3NQ形式的BT 549的稳定克隆。如通过Western印迹分析所测定的，一些抗glycPD-L1抗体显示出对某些PD-L1糖基化变体相对于其它变体有更高水平的结合，证明那些MAb是位点特异性的。如B中所示，例如，MAb STM073识别并结合N35/3NQ、N192/3NQ和N200/3NQ PD-L1变体，表明该单克隆抗体与糖基化PD-L1的N35、N192和N200区域结合。C.显示STM073 MAb与肝癌细胞系裂解物结合的Wes tern印迹结果。
图11.抗glycPD-L1抗体增强T细胞的肿瘤细胞杀伤。将STM073 MAb以不同的量用于如实施例10中所述的细胞的细胞毒性测定，以评估PBMC来源的T细胞针对肿瘤细胞(BT549)的细胞毒性。图11显示实时用MAb STM073处理的BT549(RFP PD-L1(WT))细胞的细胞死亡。在图11中，底部绘制的线(实心橙色菱形)表示对照(无来自PBMC的T细胞)；实心紫色倒三角形表示无抗体对照；实心绿色三角形表示用于测定的10μg/ml的STM073 MAb；实心红色正方形表示用于测定的20μg/ml的STM073 MAb；以及实心蓝色圆圈表示用于测定的40μg/ml的STM073 MAb。如图11所示，证明了随时间推移的对携带PD-L1的肿瘤细胞的剂量成比例杀伤。
图12A-12C.结合测定。图12A-12C显示如实施例10中所述的结合测定的结果，其中看到STM073 MAb(A)和STM108 MAb(B)相对于测定对照(即，无PD-1/Fc；无Ab；mIgG Ab对照(C))以剂量依赖性方式阻断PD-1与表达WT PD-L1的BT549靶细胞的结合。
图13.抗glycPD-L1抗体对PD-L1的内化。图13显示来自A431细胞的PD-L1蛋白的Western印迹的结果，所述A431细胞在无血清培养基中培养过夜，并用如本文所述的抗glycPD-L1抗体(10μg)处理2天。提供了更短和更长的印迹暴露。将微管蛋白作为对照。指定为“73”的泳道代表用STM073 MAb处理A431细胞，并且显示相对于利用对照的处理(IgG泳道)而言，STM073处理的细胞中PD-L1水平降低。该结果支持如本文所述的抗glycPD-L1抗体(诸如STM073)促进或增强PD-L1的内化和降解。
图14A-14E.抗glycPD-L1抗体的细胞内化的可视化。标记STM073和STM108 MAb并将其与不同的癌细胞类型一起孵育，然后使用如实施例11中所述的IncuCyte仪器显现内化。图14A：用STM073孵育的野生型BT 549细胞(人导管癌、乳腺癌细胞系)；图14B：与STM073一起孵育的经分子工程化以表达PD-L1 WT(糖基化的)的BT 549细胞；图14C：与STM073一起孵育的NCI-H226细胞(人肺癌细胞系、鳞状细胞间皮瘤)；图14D：与STM073一起孵育的MCF-7细胞(人乳腺癌细胞系，腺癌)；和图14E：与STM108一起孵育的表达PD-L1 WT(糖基化的)的BT 549细胞。
图15A-15C.抗glycPD-L1抗体结合后PD-L1的内化和降解。图15A-15C显示用双重功能抗glycPD-L1抗体孵育的表达PD-L1的细胞的活细胞成像结果。在图15A-15C中，抗PD-L1抗体是缀合有红色荧光染料pHrodoTM Red(琥珀酰亚胺酯(pHrodoTM Red,SE),(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)的STM108 MAb。pHrodoTM Red染料缀合物在细胞外是无荧光的，但在吞噬体中发出明亮的红色荧光，这使得它们成为用于从生物颗粒的吞噬作用到受体内化的研究的有用试剂。绿色染色反映了用Green DND-26染色的细胞，所述染料是可透过细胞的绿色染料，其对活细胞(通过活细胞成像技术成像的)中的酸性区室(溶酶体)进行染色。图15A显示在第一时间点(时间0)，STM108被内化到细胞中，如通过箭头指示的细胞的强烈红色细胞内染色所描绘的。图15B显示在图15A中的时间点之后2分钟时图15A中描绘的相同细胞中的弱化细胞内红色染色。图15C显示在图15A中的时间点后4分钟缺乏红色细胞内染色，这反映了细胞内STM108抗体和/或抗体-抗原复合物的降解。
图16A-16L.肿瘤细胞对比总T细胞中抗PD-L1抗体结合的PD-L1的内化。图16A-16L显示细胞的图像，其显示双重功能抗glycPD-L1抗体内化到PD-L1阳性肿瘤细胞中，但不能内化到活化或非活化的T细胞中。图16A-16D显示在与以下抗体孵育后来自外周血的非活化的总T细胞的图像：小鼠IgG抗体对照(图16A)；非内化的抗glycPD-L1MAb STM004(图16B)；双重功能抗glycPD-L1 MAb STM073(图16C)；和双重功能抗glycPD-L1抗体STM108(图16D)。图16A-16D显示所测试的抗体均未内化到非活化的总T细胞中。图16E-16H显示在与以下抗体孵育后来自外周血的活化的总T细胞的图像：小鼠IgG抗体对照(图16E)；非内化STM004(图16F)；双功能STM073(图16G)；和双功能STM108(图16H)。对于T细胞活化，将总T细胞与珠粒(例如，惰性超顺磁性珠粒)混合，所述珠粒以1:1的比例与抗CD3和抗CD28抗体(例如，ThermoFisher Scientific，Rochester，NY)共价偶联。图16E-16H显示，对于任何测试的抗体，实际上未观察到至活化的总T细胞中的内化。图16I-16L显示在与以下抗体一起孵育后NCI-H226细胞(人肺癌细胞系，鳞状细胞间皮瘤)的图像：小鼠IgG抗体对照(图16I)；非内化的抗glycPD-L1抗体STM004(图16J)；双重功能抗glycPD-L1 MAb STM073(图16K)；和双重功能抗glycPD-L1 MAb STM108(图16L)。图16I-16L显示，与对照抗体mIgG(图16I)和非内化的STM004 MAb相比，如通过红色细胞内染色所证明的，在与这些细胞一起孵育后，双重功能内化性STM073和STM108 MAb被内化到NCI-H226细胞中。
图17A-17D.抗glycPD-L1抗体-ADC的抗肿瘤功效。图17A-17D呈现评估与注射对照(单独的IgG和STM108 MAb)的带有肿瘤的动物相比，在用STM108 ADC注射带肿瘤的动物后，包含与MMAE偶联(以产生如本文所述的抗体-药物缀合物(STM108-ADC))的双重功能抗glycPD-L1 MAb STM108的ADC在杀死表达PD-L1的肿瘤细胞和不表达PD-L1的肿瘤细胞方面以及在减小肿瘤移植小鼠的肿瘤体积方面的功效的实验结果。图17A显示与暴露于不同浓度的STM108-ADC(即，“ADC108”)后的经分子工程改造以敲除其PD-L1表达的MB231细胞(“MB231 PDL1 KO”)的存活率％(实心黑色方块)相比，暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后表达PD-L1的MDA-MB231(人乳腺癌细胞系)肿瘤细胞(“MB231”)的存活率％(实心黑色圆圈)。在图17B中，使用MDA-MB231乳腺癌小鼠模型，其中用IgG-MMAE对照(100μg)，或用50μg、100μg或150μg的STM108 ADC(“ADC”)或用100μg的STM108 MAb处理用来源于MB231细胞的肿瘤移植的动物，如图17B中的图表上所指示的。在施以100μg STM108-ADC的5只小鼠中的3只和施以150μg STM108-ADC的5只小鼠中的4只中观察到完全反应(“CR”)。图17C显示与暴露于不同浓度的STM108-ADC(即，“ADC108”)后的天然不表达PD-L1(“4T1”)的4T1细胞的存活率％(空心红色方块)相比，暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后的经分子工程改造以在细胞表面上表达人PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1 hPDL1”)的存活率％(空心红色圆圈)。在图17D中，使用4T1同基因乳腺癌小鼠模型，其中动物(Balb/c小鼠)用来源于经分子工程改造以在细胞表面上表达PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1 hPD-L1”)的肿瘤移植，或者其中Balb/c小鼠用来源于不在细胞表面上天然表达PD-L1的未转染的4T1乳腺癌细胞(“4T1”)的肿瘤移植。荷有来源于两种类型的4T1细胞的肿瘤的动物用IgG-MMAE对照(100μg)进行处理，或用STM108 MAb(100μg)进行处理，或用STM108 ADC(100μg)进行处理，如图17D的图表上所指示的。参见实施例14。
根据以下详细描述和说明性示例，所描述的实施方案的其他方面、特征和有利方面将变得显而易见。
具体实施方式
在肿瘤细胞上表达的程序化死亡配体-1蛋白(PD-L1)与在免疫效应细胞例如T细胞上表达的程序化死亡-1蛋白(PD-1)之间的细胞外相互作用对肿瘤相关的免疫逃逸具有显著影响。尽管使用抗PD-1或抗PD-L1抗体进行的免疫检查点阻断获得了临床成功，但PD-L1与PD-1相互作用背后的调节机制和结构特征仍然在很大程度上是未知的。根据本文所述的发现，已经证明PD-L1的N-连接糖基化稳定肿瘤细胞上存在的PD-L1蛋白配体，并且还促进和增强其与PD-1的结合，这促进了对T细胞介导的免疫反应的抑制。相反，已发现N-连接糖基化的异常或丧失，诸如来自肿瘤细胞上表达的PD-L1多肽的部分或完全去糖基化，对PD-L1/PD-1相互作用产生不利影响，例如减弱或破坏所述相互作用，并促进肿瘤细胞上的PD-L1的内化和降解，这进而抑制免疫抑制并促进效应T细胞的细胞毒性活性和对肿瘤细胞的杀伤。另外，由于其肿瘤表达高度糖基化的PD-L1的患者的存活率差，基于本文的发现，糖基化PD-L1被识别为癌症治疗的有效治疗靶标。本文中提供和描述了癌症治疗剂，诸如双功能抗glycPD-L1抗体，其特异性地且优先地与糖基化PD-L1结合并与其相互作用以破坏糖基化PD-L1/PD-1相互作用并使在肿瘤细胞表面表达的PD-L1不稳定，从而抑制免疫抑制并促进T细胞抗肿瘤细胞的效应子功能，从而治疗癌症。利用本文所述的双功能抗糖基化PD-L1抗体治疗肿瘤相对于对PD-L1的糖基化形式不特异的抗PD-L1抗体提供了增强的对免疫抑制的抑制作用。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体是单克隆抗体，在本文中指定为“MAb”。
本文中提供了双功能抗glycPD-L1抗体，其结合PD-L1的细胞外结构域(ECD)中对应于糖基化位点(特别是在PD-L1 ECD的N-末端和C-末端部分中)的表位，或者可选地结合以阻断或掩蔽那些糖基化位点。PD-L1蛋白中被糖基化的氨基酸位于其细胞外结构域中，如本文中的SEQ ID NO:1中编号的PD-L1的位置35、192、200和219处，如图1G所示。根据本发现，本文所述的抗glycPD-L1抗体具有双重功能，因为其减少、阻断或抑制PD-L1与PD-1的结合，并且还促进PD-L1内化和降解以降低在肿瘤细胞上表达的PD-L1的水平。在一些实施方案中，所述双功能性抗glycPD-L1抗体结合非线性构象表位。另外，并且不希望受理论束缚，抗glycPD-L1抗体结合含有糖基化氨基酸或在三维空间中接近糖基化氨基酸的表位；此类糖基化氨基酸据认为特别地参与PD-L1/PD-1相互作用，并且还参与维持肿瘤细胞表面上的PD-L1。不受理论束缚，与糖基化PD-L1的ECD N末端内的N35相关的聚糖结构可包含或促成被PD-1蛋白识别和结合并且在PD-1/PD-L1相互作用中起重要作用的糖基化PD-L1蛋白的功能结构或构型。通过结合包含PD-L1 ECD的N末端区域中的位置35处的氨基酸的表位或靠近位置35的表位，所述双功能抗glycPD-L1抗体掩蔽可能特别地参与PD-L1/PD-1相互作用的糖基化PD-L1蛋白的结合位点或区域。通过结合或经由结合、掩蔽PD-L1 ECD的包含糖基化氨基酸残基(N192、N200和N219)的C-末端区域中的氨基酸，所述双功能抗glycPD-L1抗体有效地掩蔽糖基化PD-L1蛋白的结合位点或区域，所述位点或区域可能特别地参与肿瘤细胞表面上的PD-L1的稳定化，从而促进PD-L1内化和降解并降低肿瘤细胞上PD-L1的水平。
本文所述的双功能抗glycPD-L1抗体可与包含或掩蔽PD-L1 ECD的N-和C-末端区域二者中的氨基酸，特别是非线性构象表位内的氨基酸的表位结合，导致PD-L1蛋白的参与PD-L1/PD-1相互作用和肿瘤细胞表面上PD-L1的稳定化的那些含有聚糖的残基或区域被抗glycPD-L1抗体掩蔽或隐藏。此类抗glycPD-L1抗体抑制或阻断PD-L1与PD-1的结合，并且还降低肿瘤细胞表面上的PD-L1水平，使得较少的PD-L1分子可用于与PD-1结合。抗glycPD-L1抗体当与效应T细胞和携带PD-1的肿瘤或癌症细胞以混合物提供时，将促进T细胞对此类肿瘤或癌细胞的杀伤，所述T细胞不被PD-1/PD-L1相互作用免疫抑制。(参见，例如，图11和实施例9)。
本文所述的实施例提供了显示本文所述的抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1的结合相对于与非糖基化PD-L1的结合的显着差异(例如2-3倍)的实验结果。在实施方案中，相对于非糖基化PD-L1，抗glycPD-L1抗体表现出在纳摩尔浓度范围内(例如，约5-20nM或约10-20nM)的对糖基化PD-L1的结合亲和力。实施例还显示抗glycPD-L1抗体被表达PD-L1的肿瘤细胞而不是T细胞(活化的或未活化的)内化(图16A-16L)；抗glycPD-L1抗体还在含有源自肿瘤细胞系的肿瘤的小鼠模型中降低表达PD-L1的肿瘤细胞的活力和肿瘤体积(图17A-17D)。
定义
如本文中所用，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可意指一个/种或多个/种。
如本文中所用，除非明确指出仅指代替代物或替代物是相互排斥的，否则术语“或”意指“和/或”，尽管本公开支持仅指代替代物以及“和/或”的定义。
如本文中所用，术语“另一个”意指至少第二个或更多个。
如本文中所用，术语“约”用于表示值包括采用来测定所述值的装置、方法的固有误差变化，或研究对象之间存在的变化。
如本文中所用，术语“程序化死亡配体-1”或“PD-L1”是指多肽(术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用)或来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PD-L1，除非另有说明，否则在某些实施方案中，包括各种PD-L1同种型、相关的PD-L1多肽，包括其SNP变体。
下文中提供人PD-L1的示例性氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot:Q9NZQ7.1；GI:83287884)：
在SEQ ID NO:1中，氨基末端氨基酸1-18构成人PD-L1蛋白的信号序列。因此，成熟的人PD-L1蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸19-290组成。
包含本文所述的多肽和肽的氨基酸残基的缩写以及这些氨基酸残基的保守取代显示于下表1中。含有一个或多个保守氨基酸取代的多肽或本文所述的多肽的保守修饰的变体是指其中原始或天然存在的氨基酸被具有相似特征的其他氨基酸取代的多肽，所述特征是例如相似的电荷、疏水性/亲水性、侧链大小、主链构象、结构和刚性等。因此，通常可以在不改变多肽的生物活性、功能或其他所需性质(例如其对抗原的亲和力或特异性)的情况下进行这些氨基酸改变。通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性。此外，在结构或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏多肽的生物活性。
表1.氨基酸残基和保守氨基酸取代的实例
术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“Ig”在本文中被广义地可互换使用，并且特别涵盖例如单独的抗-PD-L1抗体，诸如本文所述的单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体、维持抗原结合活性的抗体的肽片段)、抗未糖基化的PD-L1抗体和抗糖基化PD-L1抗体；具有多表位或单表位特异性的抗PD-L1抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体或双互补位抗体，只要它们表现出所需的生物学活性)、单链抗-PD-L1抗体和抗-PD-L1抗体的片段，如下所述的。抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟的抗体。抗体可来自其他物种，例如小鼠、大鼠、兔等。术语“抗体”旨在包括能够与特定分子抗原结合的免疫球蛋白类多肽中的B细胞的多肽产物。抗体通常由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)；并且其中重链和轻链的氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区，每条链的羧基末端部分包括恒定区(参见AntibodyEngineering，Borrebaeck(编辑),1995,第2版，Oxford University Press.；Kuby,1997,Immunology，第3版，W.H.Freeman and Company,New York)。在一些具体的实施方案中，由本文提供的抗体结合的特定分子抗原包括PD-L1抗原多肽、PD-L1肽片段或PD-L1表位。PD-L1多肽、PD-L1肽片段或PD-L1表位可以是未糖基化的或糖基化的。在一个特定实施方案中，PD-L1多肽、PD-L1肽片段或PD-L1表位是糖基化的，与PD-L1抗原结合的抗体或其肽片段可以例如通过免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其他技术鉴定。当抗体或其片段以高于任何交叉反应抗原的亲和力(如使用实验技术诸如放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)所测定的)结合PD-L1抗原时，所述抗体或其片段与PD-L1抗原特异性结合。通常，特异性或选择性结合反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更通常地是背景信号或噪声的5-10倍。关于抗体特异性的讨论，参见例如Fundamental Immunology第2版，Paul编辑，1989,Raven Press,New York，第332-336页。
本文提供的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、内抗体(intrabody)、抗独特型(抗-Id)抗体以及上述任一种的功能性片段(例如，抗原结合片段，诸如糖基化PD-L1结合片段)。结合片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，诸如肽部分，其保留了从其衍生该片段的抗体的部分或全部结合活性。功能性片段(例如，抗原结合片段，诸如PD-L1结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性、双互补位、单价的(例如，具有单个VH或VL结构域)或二价的，等等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，抗原结合结构域或含有结合PD-L1抗原特别是糖基化PD-L1抗原的抗原结合部位(例如，抗PD-L1抗体的一个或多个互补决定区(CDR))的分子。此类抗体片段的描述可见于，例如，Harlow和Lane,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York(1989)；Molec.Biology and Biotechnology:A ComprehensiveDesk Reference,Myers(编辑),New York:VCH Publisher,Inc.；Huston等，1993,CellBiophysics,22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.,178:497-515中以及Day,E.D.,1990,Advanced Immunochemistry，第2版，Wiley-Liss,Inc.,New York,NY中。本文提供的抗体可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、任何类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是完全人的，诸如完全人单克隆抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是人源化的，诸如人源化单克隆抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，本文提供的抗体是IgG抗体，或其一类(例如，人IgG1或IgG4)或亚类，特别是IgG1亚类抗体。
四链抗体单元是异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。在IgG的情况下，四链(未还原的)抗体单元的分子量通常为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个二硫键相互连接，这取决于H链同种型。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。在N末端，每个H链具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链中的每一个的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N-末端具有可变结构域(VL)，随后在其羧基末端具有恒定结构域(CL)。VL结构域与VH结构域对齐，并且CL结构域与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。有人认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合部位(尽管某些VH和VL结构域可以分别独立于对应的VH或VL而结合抗原)。本领域技术人员理解免疫球蛋白分子的基本结构。例如，不同类别抗体的结构和性质可见于Stites,Daniel P.等，1994,Basic and Clinical Immunology，第8版，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,CT,，第71页和第6章。
如本文中所用，术语“抗原”或“靶抗原”是抗体可选择性结合的预定分子。靶抗原可以是多肽、肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是小分子。在某些实施方案中，靶抗原是多肽或肽，优选糖基化PD-L1多肽。
如本文中所用，术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”和类似术语是指抗体的这样的部分(例如，抗体的CDR是抗原结合区)，该部分包括与抗原相互作用并赋予抗体作为结合剂的其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。抗原结合区可以源自任何动物物种，诸如啮齿类动物(例如兔、大鼠或仓鼠)和人。在一些具体的实施方案中，抗原结合区可以是人源的。
“分离的”抗体基本上不含来自细胞或组织来源的细胞物质或其他污染性蛋白质和/或抗体所源自的其他污染物成分，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括抗体制剂，其中抗体与从中分离或重组产生其的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％,25％,20％,15％,10％,5％或1％(按干重计)的异源蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白质”)的抗体制剂。在某些实施方案中，当重组产生抗体时，其基本上不含培养基，例如，培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、15％、10％、5％或1％。在某些实施方案中，当通过化学合成产生抗体时，其基本上不含化学前体或其他化学物质，例如，其与化学前体或参与蛋白质合成的其他化学物质分离。因此，此类抗体制剂具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(按干重计)的除目标抗体外的化学前体或化合物。污染组分还可包括但不限于会干扰抗体治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质溶质。在某些实施方案中，将抗体纯化(1)至大于或等于95重量％(诸如95重量％、96重量％、97重量％、98重量％或99重量％)的抗体,如通过Lowry方法(Lowry等，1951,J.Bio.Chem.193:265-275)测定的，(2)至足以通过使用旋转杯式测序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)至使用考马斯蓝或银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE检测的均一性。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。在一些实施方案中，分离本文提供的抗体。
如本文所用，术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。说明性地，此类相互作用包括非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价键或非共价键、相互作用或力结合在一起的两个或更多个分子的结合。抗体的单个抗原结合部位与其靶标(抗原)分子(诸如PD-L1)上的表位之间的总的非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。抗体与单价抗原的结合(kon)对解离(koff)的比率(kon/koff)是结合常数Ka，其是亲和力的量度。Ka的值因抗体与抗原的不同复合物而异，并且取决于kon和koff两者。本文提供的抗体的结合常数Ka可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员已知的任何其他方法确定。一个结合部位处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间相互作用的真实强度。当含有多个抗原决定簇的复合抗原诸如糖基化PD-L1与含有多个结合部位的抗体接触时，抗体与抗原在一个部位的相互作用将增加在第二结合部位处相互作用的可能性。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。与其各个结合部位的亲和力相比，抗体的亲合力可以是其结合能力的更好量度。例如，高亲合力可以补偿低亲和力，如有时对于五聚体IgM抗体所发现的，所述五聚体IgM抗体可具有比IgG低的亲和力，但由其多价性导致的IgM的高亲合力使其能够有效地与抗原结合。
“结合亲和力”通常是指分子(例如结合蛋白诸如抗体)的单个结合部位与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原或报告分子和配体)之间的1:1相互作用。结合分子X对其结合伴侣Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持与抗原结合更长时间。用于测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何方法都可用于本公开的目的。一些具体的说明性实施方案包括以下：在一个实施方案中，“Kd”或“Kd值”通过本领域已知的测定法测量，例如通过结合测定法。Kd可以在放射性标记的抗原结合测定(RIA)中测量，例如，用目标抗体的Fab部分及其抗原进行测定(Chen等，1999,J.MolBiol 293:865-881)。Kd或Kd值也可通过使用表面等离子体共振(SPR)测定(通过Biacore)，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)或通过生物层干涉测量法测(BLI)(使用例如OctetQK384系统(ForteBio,Menlo Park,CA))或通过石英晶体微量天平(QCM)技术来测量。“结合速率(on-rate)”或“缔合速率(rate ofassociation)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)或OctetQK384系统(ForteBio,MenloPark,CA)，通过上述相同的表面等离子体共振或生物层干涉测量技术来测定。
术语“抗-PD-L1抗体”、“与PD-L1特异性结合的抗体”或“对PD-L1特异的抗体”、“与PD-L1表位特异性结合的抗体”、“与PD-L1选择性结合的抗体”、“与PD-L1表位选择性结合的抗体”、“与PD-L1表位优先结合的抗体”和类似术语在本文中可互换使用，是指与非糖基化PD-L1或PD-L1的糖基化突变体相比，能够特别地以足够的亲和力和特异性结合PD-L1(即，糖基化的PD-L1或WT PD-L1)的抗体。本文提供的抗glycPD-L1抗体的“优先结合”可以基于抗体与细胞上表达的PD-L1，即糖基化PD-L1或PD-L1 WT、或细胞上表达的糖基化PD-L1的结合相对于适当的对照(诸如与非糖基化或变体PD-L1(例如，4NQ PD-L1)或与表达PD-L1的非糖基化或变体形式的细胞(例如，经分子工程化的细胞、细胞系或肿瘤细胞分离物，诸如本文中例如于实施例6中所描述的)的结合)的荧光强度的定量来测定或确定。所述抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1多肽或与表达糖基化PD-L1(PD-L1 WT)的细胞的优先结合与所述抗体与非糖基化或突变的糖基化PD-L1多肽或表达非糖基化或突变的糖基化PD-L1的细胞的结合相比，至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多倍的测量的荧光结合强度(MFI)值(如通过细胞流式细胞术所评估的)指示，并且其中待测抗体可通过荧光标记或标志直接或间接检测。在一个实施方案中，抗体用荧光标记物诸如FITC直接标记。在实施方案中，优先或选择性地结合糖基化PD-L1的抗glycPD-L1抗体展示出同一抗体对于结合如本文所述的非糖基化PD-L1或PD-L1糖基化变体例如4NQ PD-L1(其未被糖基化)的MFI值的1.5倍至25倍，或2倍至20倍，或3倍至15倍，或4倍至8倍，或2倍至10倍，或2倍至5倍或更多倍的MFI值。所有前述值之间的和等于所有前述值的荧光强度倍数值意欲被包括。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体特异性地且优先地与糖基化PD-L1多肽，诸如糖基化的PD-L1抗原、肽片段或表位(例如，人糖基化的PD-L1诸如人糖基化PD-L1多肽、抗原或表位)结合。特异性地与PD-L1(例如，糖基化或野生型人PD-L1)结合的抗体可与PD-L1的细胞外结构域(ECD)或源自其ECD的肽结合。特异性地与PD-L1抗原(例如人PD-L1)结合的抗体可以与相关抗原(例如食蟹猴(cyno)PD-L1)交叉反应。在一个优选实施方案中，特异性地与PD-L1抗原结合的抗体不与其他抗原交叉反应。可以例如通过免疫荧光结合测定、免疫测定方法、免疫组织化学测定方法、Biacore或本领域技术人员已知的其他技术鉴定特异性地与PD-L1抗原结合的抗体。
在某些其它实施方案中，如本文中所述，与PD-L1结合的抗体具有小于或等于20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM和/或大于或等于0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体与PD-L1的表位结合，该表位在来自不同物种的PD-L1蛋白之间(例如，人与食蟹猴PD-L1之间)是保守的。当抗体以比针对任何交叉反应性抗原的亲和力高(如使用实验技术(诸如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定的)的亲和力与PD-L1抗原结合时，所述抗体与PD-L1抗原特异性结合。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍并且可以是背景的10倍以上。关于抗体特异性的讨论，参见例如Fundamental Immunology第2版，Paul，编辑，1989,Raven Press,New York第332-336页。在此类实施方案中，抗体与“非靶标”蛋白质的结合程度将小于抗体与其特定靶蛋白的结合的约10％，例如，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定的。
如本文所述的抗PD-L1抗体包括抗糖基化PD-L1抗体或抗野生型PD-L1抗体(其中野生型PD-L1蛋白被糖基化)，其对糖基化PD-L1是特异的。在一些实施方案中，抗糖基化PD-L1抗体与PD-L1的线性糖基化基序结合。在一些实施方案中，抗糖基化PD-L1抗体与三维中位于一个或多个糖基化基序附近的肽序列结合。在一些实施方案中，相对于未糖基化PD-L1，抗糖基化PD-L1抗体选择性地与PD-L1的一个或多个糖基化基序或具有PD-L1的糖基化基序的PD-L1肽结合。在其他实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含glycPD-L1蛋白的氨基酸序列的线性表位结合。在一些实施方案中，抗糖基化PD-L1抗体选择性地与PD-L1的一个或多个糖基化基序结合，其中糖基化基序包含SEQ ID NO:1的PD-L1多肽的N35、N192、N200和/或N219。在其他实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含PD-L1蛋白的氨基酸的构象(非线性)表位结合。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体或其结合部分与糖基化PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体或其结合部分与糖基化PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化PD-L1所展示的Kd的50％。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体或其结合部分与糖基化PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化PD-L1所展示的Kd的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在另外的方面，抗glycPD-L1抗体或其结合部分与糖基化PD-L1结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1表现出来的Kd的至多1/10-1/5。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体或其结合部分与糖基化PD-L1结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的至多1/10。在某些实施方案中，抗体与糖基化PD-L1结合的Kd不超过与未糖基化的PD-L1结合所展示的Kd的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体或其结合部分以纳摩尔浓度亲和力(诸如5-20nM或10-20nM(包括下限值和上限值)的亲和力)与糖基化PD-L1结合。
在一个实施方案中，在如实施例6中所述的细胞流式细胞术结合测定中，抗体表现出与表达WT PD-L1的细胞的结合(以MFI表示)是与表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合的MFI的1.5倍、2倍、3倍、4倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍，在某些实施方案中，不超过与表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合的MFI的10倍、20倍、50倍或100倍。
如本文中所用，关于抗体，术语“重(H)链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约115个至130个或更多个氨基酸的可变(V)区(也称为V结构域)和包括恒定(C)区域的羧基末端部分。恒定区(或恒定结构域)可以是五种不同类型(例如，同种型)(基于重链恒定区的氨基酸序列称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、伊普西隆(ε)、伽马(γ)和缪(μ))之一。不同的重链相异在于大小：α、δ和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε含有约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链产生五种众所周知的抗体类别(例如，同种型)，即分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体重链可以是人抗体重链。
如本文中所用，关于抗体，术语“轻(L)链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约100个至约110个或更多个氨基酸的可变结构域，并且羧基末端部分包含恒定区。轻链(V和C结构域两者)的近似长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同类型的轻链，称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。抗体轻链可以是人抗体轻链。
如本文中所用，术语“可变(V)区”或“可变(V)结构域”是指抗体多肽的轻(L)或重(H)链的一部分，其通常位于L或H链的氨基末端。H链V结构域的长度为约115至130个氨基酸，而L链V结构域的长度为约100至110个氨基酸。H和L链的V结构域用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。H链的V结构域可以称为“VH”。L链的V区可以称为“VL”。术语“可变”是指V结构域的某些区段在不同抗体间在序列上广泛不同的事实。虽然V结构域介导抗原结合并且定义特定抗体对其特定抗原的特异性，但变化性不是均匀地分布在抗体V结构域的110个氨基酸跨度上。相反，V结构域由被称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)的具有更大可变性(例如，极端变化性)的更短区域(各自长度为约9-12个氨基酸)隔开的被称为框架区(FR)的约15-30个氨基酸的不太可变(例如，相对不变的)的区段组成。抗体H和L链的V结构域各自包含四个FR，主要采取β折叠片构型，所述β折叠片构型通过三个高变区(其形成环形)连接，并在一些情况下形成β折叠片结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见，例如，Kabat等，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD))。C结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。V结构域在不同抗体类别或类型之间在序列上差异很大。序列的可变性集中在CDR中，CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。在具体的实施方案中，抗体的可变结构域是人或人源化可变结构域。
如本文中所用，术语“互补决定区”、“CDR”、“高变区”、“HVR”和“HV”可互换使用。“CDR”是指抗体VHβ-折叠片框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或者是指抗体VLβ-折叠片框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。当在本文中使用时，该术语是指在序列上是高变的和/或形成结构上限定的环的抗体V结构域的区域。通常，抗体包含六个高变区：VH结构域中的三个(H1、H2、H3)和VL结构域中的三个(L1、L2、L3)。因此，CDR通常是散布在V结构域的框架区序列内的高度可变序列。“框架”或“FR”残基是存在于CDR两侧的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、线性抗体、双特异性或双互补位抗体中。
许多高变区描绘正在使用中并且包含在本文中。CDR区是本领域技术人员公知的，并且已被例如Kabat定义为抗体V结构域内最具高变性的区域(Kabat等，1977,J.Biol.Chem.252:6609-6616；Kabat,1978,Adv.Prot.Chem.32:1-75)。Kabat CDR基于序列可变性并且是最常用的(参见，例如，Kabat等，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.)。CDR区序列也已被Chothia在结构上定义为不属于保守β-折叠框架的部分的那些残基，因此能够采用不同的构象(Chothia等，1987,J.Mol.Biol.196:901-917)。Chothia相反地指的是结构环的位置。当使用Kabat CDR编号体系编号时，ChothiaCDR-H1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入放置在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处终止；如果仅存在35A，则环在33处终止；如果35A和35B都存在，则环在34处终止)。编号系统和术语在本领域中都是公认的。
最近，通用编号系统已被开发并被广泛采用，ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等，2003,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。IMGT是一个综合信息系统，专门研究免疫球蛋白(Ig)、T细胞受体(TR)和人及其他脊椎动物的主要组织相容性复合体(MHC)。在本文中，CDR按照轻链或重链内的氨基酸序列和位置进行标示。由于免疫球蛋白V结构域的结构内CDR的“位置”在物种之间是保守的并且存在于称为环的结构中，因此通过使用根据结构特征、CDR和框架残基对齐可变结构域序列的编号系统，其易于鉴定。该信息可用于移植和将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基替换到通常来自人抗体的受体框架中。Honegge等，2001,J.Mol.Biol.309:657-670已开发了另一种编号系统(AHon)。编号系统(包括例如Kabat编号和IMGT唯一编号系统)之间的对应关系是本领域技术人员公知的(参见，例如，Kabat，同上；Chothia等，,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917,同上；Martin，2010,Antibody Engineering，第2卷，第3章，Springer Verlag；以及Lefranc等，1999,Nuc.AcidsRes.,27:209-212)。
CDR区序列也已由AbM、Contact和IMGT定义。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件使用(参见例如Martin，同上)。“接触”高变区基于对可用的复杂晶体结构的分析。来自这些高变区或CDR中的每一个的残基如下所述。
CDR区序列的示例性描绘在下表3中说明。通过比较多种结构确定了标准抗体可变区内CDR的位置(Al-Lazikani等，1997,J.Mol.Biol.273:927-948；Morea等，2000,Methods20:267-279)。因为高变区内残基的数量在不同的抗体中不同，所以相对于规范位置的额外残基通常用a、b、c等相邻于标准可变区编号方案中的残基编号来进行编号(Al-Lazikani等，同上)。这种命名法同样为本领域技术人员所熟知。
表2.CDR区序列的示例性描述
IMGT Kabat AbM Chothia Contact
VH CDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
VH CDR2 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
VH CDR3 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变(例如，氨基酸序列变化，包括改变、添加和/或缺失)的抗体，所述改变导致与不具有这些改变的亲本抗体相比，所述抗体对抗原的亲和力改善。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原诸如糖基化的PD-L1具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。关于综述，参见Hudson和Souriau，2003,Nature Medicine 9:129-134；Hoogenboom,2005,Nature Biotechnol.23:1105-1116；Quiroz和Sinclair,2010,RevistaIngeneria Biomedia 4:39-51。
“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中，H和/或L链的一部分(例如V结构域)与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应氨基酸序列相同或同源，而一个或多个链的其余部分(例如，C结构域)与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要其展示出所需的生物活性即可(参见，例如，美国专利第4,816,567号；和Morrison等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。
“人源化”非人(例如鼠)抗体是抗体的嵌合形式，其是指其中天然CDR残基被来自非人物种(例如，供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和对抗原结合和相互作用的能力的相应CDR的残基取代的人免疫球蛋白序列(例如，受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基也可以被相应的非人残基取代。另外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善人源化抗体的性能。还可在CDR区中进行一个或多个修饰以改善和改进人源化抗体的性能，例如，在亲和力成熟的抗体中。人源化抗体H或L链可包含基本上全部的至少一个或多个可变区，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的CDR，并且全部或基本上全部FR为人免疫球蛋白序列的那些FR。在某些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区的一部分。虽然本领域技术人员已知，但如果需要，可在例如以下文献中找到进一步的细节：Jones等，1986,Nature,321:522-525；Riechmann等，1988,Nature,332:323-329；和Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596；Carter等，1992,Proc.Natl.Acd.Sci.USA,89:4285-4289；以及美国专利第6,800,738号(2004年10月5日授权),6,719,971(2005年9月27日授权)、第6,639,055号(2003年10月28日授权)、第6,407,213号(2002年6月18日授权)和第6,054,297号(2000年4月25日授权)。
术语“人抗体”和“完全人抗体”在本文中可互换使用，并且是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用以下用于制备人抗体的技术(如由本领域技术人员实践的)中的任一种技术制备的抗体。人抗体的这种定义明确地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等，1991,J.Mol.Biol.,222:581)和酵母展示文库(Chao等，2006,Nature Protocols 1:755-768)。也可用于制备人单克隆抗体的方法是Cole等，1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss，第77页；Boerner等，1991,J.Immunol.,147(1):86-95中描述的方法。另见van Dijk和van de Winkel,2001,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74。可通过向转基因动物(例如，小鼠)施用抗原来制备人抗体，所述转基因动物的内源Ig基因座已经被废除，并且所述动物已被遗传修饰以携带编码人抗体的人免疫球蛋白基因，使得人抗体响应于抗原攻击而产生(关于XENOMOUSETM技术，参见，例如，Jakobovits,A.,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-6；Brüggemann和Taussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-8；以及美国专利第6,075,181号和第6,150,584号)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，另见例如Li等，2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562。在一些具体的实施方案中，人抗体包含人源的可变区和恒定区。在某些实施方案中，“完全人”抗糖基化抗-PD-L1抗体还可包括结合PD-L1多肽，并且由PD-L1列编码的抗体，所述核苷酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体。在一个具体实施方案中，本文提供的抗PD-L1抗体是完全人抗体。术语“完全人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，如Kabat等所述。(参见Kabat等，1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。短语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组、组合人抗体文库中分离的抗体；从动物(例如小鼠或牛)分离的抗体，所述动物是人免疫球蛋白基因的转基因和/或转染色体动物(参见，例如Taylor,L.D.等，1992,Nucl.Acids Res.20:6287-6295)；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见，Kabat,E.A.等，Id)。然而，在某些实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然源自人种系VH和VL序列并与之相关、但在体内可能不天然存在于人抗体种系库中的序列。
如本文中所用，术语“表位”是单个抗体分子所结合的抗原分子表面上的一个或多个部位或一个或多个区域，诸如抗原(例如，PD-L1多肽或糖基化PD-L1多肽)表面上的局部区域，其能够被抗PD-L1或抗glycPD-L1抗体的一个或多个抗原结合区结合。表位可以是免疫原性的并且能够在动物中引发免疫反应。表位不一定是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是线性表位或构象表位。促成表位的多肽区域可以是多肽的连续氨基酸，形成线性表位，或者表位可以由多肽的两个或更多个非连续氨基酸或区域形成，通常称为构象表位。表位可以是或可以不是抗原的三维表面特征。在某些实施方案中，PD-L1表位是PD-L1多肽的三维表面特征。在其他实施方案中，PD-L1表位是PD-L1多肽的线性表面特征。在一些实施方案中，PD-L1表位在一个或多个位点被糖基化。通常，抗原具有几个或许多不同的表位，并且可以与许多不同的抗体反应。在一个特定实施方案中，本文所述的抗glycPD-L1抗体结合PD-L1，尤其是糖基化PD-L1的表位，所述表位是构象表位。
当两种抗体在三维空间中识别相同、重叠或相邻的表位时，抗体与参考抗体结合“表位”或“基本上相同的表位”或“相同的表位”。用于确定两种抗体是否与在三维空间上相同、重叠或相邻的表位结合的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，其可以以多种不同形式配置，例如，使用标记的抗原或标记的抗体。在一些测定中，将抗原固定在96孔板上或在细胞表面上表达，并且使用可检测的信号(例如，放射性、荧光或酶标记)测量未标记抗体阻断标记的抗体与抗原结合的能力。另外，可以确定抗体的表位，然后使用本领域已知的以及例如本文实施例8中所述的方法进行比较。
当在抗PD-L1抗体(所述抗体竞争PD-L1靶蛋白或其肽上的相同表位或结合位点)的背景下使用的术语“竞争”意指如通过测定法测定的竞争，其中所研究的抗体阻止、阻断或抑制参考分子(例如，参考配体或参考抗原结合蛋白，诸如参考抗体)与共同抗原(例如，PD-L1或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定可用于确定测试抗体是否与参考抗体竞争与PD-L1(例如，人PD-L1或人PD-L1)的结合。可使用的测定的实例包括固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心竞争测定(参见，例如，Stahli等，1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Kirkland等，1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定；固相直接标记夹心测定(参见，例如，Harlow和Lane，1988,Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press)；使用标记的碘(I125标记)的固相直接标记RIA(参见，例如，Morel等，1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Cheung等，1990,Virology 176:546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等，1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，此类测定涉及使用与固体表面结合的纯化的抗原(例如，PD-L1诸如人PD-L1或糖基化PD-L1)，或具有未标记的测试抗原结合蛋白(例如，测试抗-PD-L1抗体)或标记的参考抗原结合蛋白(例如，参考抗PD-L1抗体)的细胞。竞争性抑制可以通过测定在已知量的测试抗原结合蛋白存在的情况下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定法鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和/或与与参考抗体结合的表位充分接近的相邻表位结合的抗体，从而引起空间位阻发生。本文描述了用于确定竞争性结合的方法的其他细节。通常，当竞争性抗体蛋白过量存在时，其将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少15％，或至少23％，例如但不限于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高，以及所述量之间的百分比数量。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、96％或97％、98％、99％或更多。
如本文中所用，术语“阻断性”抗体或“拮抗剂”抗体是指阻止、抑制、阻断或降低与其结合的抗原的生物活性或功能活性的抗体。阻断性抗体或拮抗剂抗体可以基本上或完全阻止、抑制、阻断或降低抗原的生物活性或功能。例如，阻断性抗PD-L1抗体可以阻止、抑制、阻断或减小PD-L1与PD-1之间的结合相互作用，从而阻止、抑制、阻断或减小与PD-1/PD-L1相互作用相关的免疫抑制功能。术语阻断、抑制和中和在本文中可互换使用，并且是指本文所述的抗PD-1抗体阻止或以其他方式破坏或减小PD-1/PD-L1相互作用的能力。
如本文中所用，术语“多肽”或“肽”是指通过肽键连接的串联排列的三个或更多个氨基酸的氨基酸聚合物。“多肽”可以是蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽等。包含多肽的氨基酸可以是天然来源的或合成的。可以从生物样品中纯化多肽。例如，PD-L1多肽或肽可由人PD-L1或糖基化PD-L1的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，所述多肽具有人PD-L1或糖基化PD-L1的至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或285个连续氨基酸。在某些实施方案中，PD-L1多肽包含PD-L1多肽或糖基化PD-L1多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少连续的100个氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个连续氨基酸残基。
如本文中所用，术语“类似物”是指具有与参考多肽相似或相同的功能，但不一定包含参考多肽的相似或相同氨基酸序列或者具有参考多肽的相似或相同结构的多肽。参考多肽可以是PD-L1多肽、PD-L1多肽的片段、抗PD-L1抗体或抗glycPD-L1抗体。与参考多肽具有相似氨基酸序列的多肽是指具有与参考多肽的氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列的多肽，所述参考多肽可以是如本文所述的PD-L1或抗PD-L1抗体。具有与参考多肽相似的结构的多肽是指具有与参考多肽相似的二级、三级或四级结构的多肽，所述参考多肽可以是本文所述的PD-L1多肽或PD-L1抗体。多肽的结构可通过本领域技术人员已知的方法测定，包括但不限于X射线晶体学、核磁共振和晶体电子显微镜术(crystallographic electron microscopy)。优选地，类似物起双重功能抗glycPD-L1抗体的作用。
如本文中所用，术语“变体”当与PD-L1多肽或抗PD-L1抗体结合使用时，是指与天然的或未修饰的PD-L1序列或抗PD-L1抗体序列相比，具有一个或多个(诸如，例如，约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的多肽或抗PD-L1抗体。例如，PD-L1变体可由对天然PD-L1的氨基酸序列的一个或多个(诸如，例如，约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)改变产生。还举例来说，抗PD-L1抗体的变体可由一个或多个(诸如，例如，约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)对天然的或先前未修饰的抗PD-L1抗体的氨基酸序列的改变产生。可从编码变体的相应核酸分子制备多肽变体。在某些实施方案中，变体是抗glycPD-L1抗体，其在一个或多个CDR或框架区中具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，并且优选地，具有作为双重功能抗glycPD-L1抗体的类似物功能。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或者两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所确定的。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且根据所比较的最小分子的大小来计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)必须通过特定的数学模型或计算机程序(例如，“算法”)来解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.，编辑，1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W，编辑，1993,New York:Academic Press；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.，编辑，1994,NewJersey:Humana Press；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,1987,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.，编辑，1991,New York:M.Stockton Press以及Carillo等，1988,SIAM J.AppliedMath.,48:1073。
在计算百分比同一性时，可以以给出序列之间最大匹配的方式对齐所比较的序列。可用于测定百分比同一性的计算机程序的实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid Res.,12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)，其为用于对齐两个多肽或多核苷酸以测定其百分比序列同一性的计算机算法。可以对齐序列以使它们各自的氨基酸或核苷酸序列最佳匹配(如由算法确定的“匹配跨度”)。空位开放罚分(其计算为平均对角线的3倍，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值，“对角线”是通过特定的比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分数或数字；并且将空位延伸罚分(其通常为空位开放罚分的1/10)以及比较矩阵(诸如PAM 250或BLOSUM 62)与算法结合使用。在某些实施方案中，标准比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure,5:345-352；关于BLOSUM62比较矩阵，参见Henikoff等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919)也用于该算法。使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的百分比同一性的示例性参数包括以下参数：(i)算法：Needleman等，1970,J.Mol.Biol.,48:443-453；(ii)比较矩阵：来自Henikoff等的BLOSUM 62，同上；(iii)空位罚分：12(但没有对终末空位的罚分)；(iv)空位长度罚分：4；(v)相似度阈值：0。
用于对齐两个氨基酸序列的某些比对方案可导致仅匹配两个序列的短区域，并且即使两个全长序列之间没有显著关系，该小的对齐区域也可具有非常高的序列同一性。因此，如果需要，可调整所选择的比对方法(例如，GAP程序)，以产生跨越靶多肽的代表性数目的氨基酸(例如，至少50个连续氨基酸)的比对。
相对于参考多肽序列的百分比(％)氨基酸序列同一性被定义为候选序列中在对齐序列和引入空位(如果需要的话)以实现最大的序列百分比同一性后，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分的情况下，与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以在本领域技术人员的技能范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现。本领域技术人员可确定用于对齐序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文中所用，术语“衍生物”是指包含已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的参考多肽的氨基酸序列的多肽。参考多肽可以是PD-L1多肽或抗PD-L1抗体。如本文中所用，术语“衍生物”还指已被化学修饰(例如通过将任何类型的分子与多肽共价连接)的PD-L1多肽或抗PD-L1抗体。例如，PD-L1多肽或抗PD-L1抗体可以被化学修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体的键联、与肽或蛋白质标签分子或其它蛋白质的键联等。以在所连接的分子的类型或位置方面与天然存在的或起始的肽或多肽不同的方式修饰衍生物。衍生物还可包括天然存在于肽或多肽上的一个或多个化学基团的缺失。PD-L1多肽或抗PD-L1抗体的衍生物可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰进行化学修饰，包括但不限于特定异性的化学切割、乙酰化、配制(formulation)、衣霉素的代谢合成等。另外，PD-L1多肽或抗PD-L1抗体的衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。多肽衍生物具有与参考多肽相似或相同的功能，所述参考多肽可以是本文所述的PD-L1多肽或抗PD-L1抗体，尤其是双功能抗glycPD-L1单克隆抗体。
如本文中所用，术语“融合蛋白”是指包含至少两种异源多肽的氨基酸序列的多肽。当与PD-L1多肽或抗PD-L1抗体结合使用时，术语“融合”是指PD-L1多肽或抗PD-L1抗体、其变体和/或其衍生物与异源肽或多肽的连接、融合或偶联。在某些实施方案中，融合蛋白保留PD-L1多肽或抗PD-L1抗体的生物活性。在某些实施方案中，融合蛋白包括与异源肽或多肽偶联、融合或连接的PD-L1抗体VH区、VL区、VH CDR(一个、两个或三个VH CDR)和/或VLCDR(一个、两个或三个VL CDR)，其中融合蛋白与PD-L1蛋白或肽上的表位结合。在其他实施方案中，提供了与Fc结构域(优选人Fc结构域)融合的糖基化PD-L1肽。融合蛋白可以通过本领域实践的化学偶联反应或通过分子重组技术来制备。
如本文中所用，术语“组合物”是指以任选地指定的或有效的量含有指定组成成分(例如，本文提供的多肽或抗体)的产品，以及由以任选地指定的或有效的量的特定组成成分组合或相互作用而直接或间接产生的任何所需产品。
如本文中所用，术语“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、媒介物或稳定剂，其在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒。通常，生理上可接受的载体是含水pH缓冲溶液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。术语“载体”还可以指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，完全或不完全弗氏佐剂)、赋形剂或媒介物。此类载体，包括药物载体，可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用组合物(例如，药物组合物)时，水是一种示例性载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂(例如，药物赋形剂)包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。口服组合物，包括制剂，可以包括标准载体，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于Remington’sPharmaceutical Sciences,1990,Mack Publ ishing Co.,Easton,PA中。组合物，包括药物化合物，可含有治疗有效量的抗PD-L1抗体，诸如抗glycPD-L1抗体,例如以分离或纯化的形式与适量的载体一起存在，以便提供用于向受试者(例如，患者)适当施用的形式。组合物或制剂应适合施用模式。
如本文中所用，术语“赋形剂”是指通常用作稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂的惰性物质，包括但不限于蛋白质(例如，血清白蛋白等)、氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如，烷基磺酸酯、辛酸酯等)、表面活性剂(例如SDS、聚山梨醇酯、非离子表面活性剂等)、糖类(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如，甘露醇、山梨糖醇等)。关于参考资料，另见Remington’s PharmaceuticalSciences,同上，其通过引用整体并入本文。
如本文中所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当在适当的情况下向动物诸如人施用时不产生不利的、过敏的或其他不良或不想要的反应的分子实体、制剂和组合物。根据本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Science(同上)举例说明的。此外，对于动物(例如人)施用，将理解制剂应满足联邦或州政府的管理机构诸如FDA生物制品标准办公室所要求的或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更特别是人的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
术语“药物制剂”是指以诸如使得活性成分(例如，抗PD-L1抗体和抗glycPD-L1抗体)的生物活性有效的形式存在，并且不含对于向其施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。此类制剂可以是无菌的，即无菌的或不含所有活的微生物及其孢子等。
术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
如本文中所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指向有此需要的受试者施予或施用治疗剂，或为了获得至少一种阳性治疗效果或益处的目的，诸如治疗疾病或健康相关的病况，对受试者实施程序或用药方式。例如，治疗可包括施用药学有效量的抗体或其组合物或制剂以治疗各种类型的癌症，所述抗体与糖基化PD-L1特异性结合。术语“治疗方案”、“给药方案”或“给药治疗方案(dosing protocol)”可互换使用，并且指治疗剂(诸如所述抗glycPD-L1抗体)的时间安排和剂量。如本文中所用，术语“受试者”是指患有癌症或被诊断为患有癌症的人或非人动物，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在优选实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是癌症患者。在一个实施方案中，有需要的受试者将受益于或预期将受益于双重功能抗glycPD-L1抗体治疗。
如本文中所用，术语“治疗益处”或“治疗有效性”是指促进或增强(特别是作为使用双重功能抗glycPD-L1抗体和所述方法的性能的结果)在病况的医学治疗、疗法、剂量给药方面有需要的受试者(例如，患有癌症或被诊断为患有癌症的受试者)的健康状况。这包括但不限于降低疾病体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可包括，例如，肿瘤尺寸的减小、肿瘤的侵袭性或严重性的降低、癌细胞向外周组织或器官的浸润的减少；肿瘤或癌症的生长速度的减小，或转移的阻止或减少。癌症的治疗还可指在受试者中实现持续反应或延长患有癌症的受试者的存活时间。
如本文中所用，术语“施用(administer)”或“施用(administration)”是指例如通过注射或口服途径将物质(当其存在于身体外部时)物理地递送至患者体内的行为，诸如通过口服、皮下、粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当正在治疗性治疗疾病、病症或病况或其症状时，该物质的施用通常在疾病、病症或病况或其症状发作后进行。预防性治疗涉及在疾病、病症或病况或其症状发作之前的时间施用该物质。
如本文中所用，术语“有效量”是指治疗剂(例如，本文提供的抗体或药物组合物)的数量或量，所述量足以减轻、降低、缓解和/或改善癌症或与其相关的症状的严重度和/或持续时间。该术语还包括减缓或改善癌症发展或进展所必需的量；减少或改善癌症的复发、发展或发作；和/或改善或增强另一种癌症疗法(例如，除了施用本文提供的抗PD-L1抗体或抗glycPD-L1抗体外的疗法)的预防或治疗效果。在一些实施方案中，本文提供的抗体的有效量为约或等于0.1mg/kg(每kg受试者体重的抗体mg数)至约或等于100mg/kg。在某些实施方案中，其中提供的抗体的有效量为约或等于0.1mg/kg、为约或等于0.5mg/kg、为约或等于1mg/kg、为约或等于3mg/kg、为约或等于5mg/kg、为约或等于10mg/kg、为约或等于15mg/kg、为约或等于20mg/kg、为约或等于25mg/kg、为约或等于30mg/kg、为约或等于35mg/kg、为约或等于40mg/kg、为约或等于45mg/kg、为约或等于50mg/kg、为约或等于60mg/kg、为约或等于70mg/kg,80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。这些量意味着包括其中的量和范围。在一些实施方案中，“有效量”还指实现指定结果(例如，阻止、阻断或抑制细胞表面PD-1与细胞表面PD-L1的结合；或阻止、阻断或抑制PD-1/PD-L1介导的免疫抑制)的本文提供的抗体的量。
在施用其他疗法(例如，其他药剂、癌症药物、癌症疗法)的背景下，术语“组合”包括使用不止一种疗法(例如，药物疗法和/或癌症疗法)。“与一种或多种其他治疗剂联合”施用包括以任何顺序同时(例如，并行)和连续施用。术语“组合”的使用不限制向受试者施用疗法的顺序。作为非限制性实例，可以在向患有或经诊断患有癌症的受试者施用第二疗法(例如，药剂)之前(例如，1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、8周、9周、10周、11周或12周)、与之同时或之后(例如，1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周或更长时间)施用第一疗法(例如药剂，诸如抗glycPD-L1抗体)。
疗法的组合(例如药剂，包括治疗剂的使用)可能比任何两种或更多种单一疗法的累加效应更有效(例如，具有协同效应)，或者可具有不能被先验地预测的其他益处，诸如改善的副作用特征、增加的疗效或治疗效果的持续时间、所述组合在其中有效的更广泛的患者群体等。此类效果通常是出乎意料的并且不能预测。例如，治疗剂组合的协同效应经常允许使用较低剂量的一种或多种药剂和/或以较低频率向癌症患者施用药剂。使用较低剂量的治疗剂和癌症疗法和/或不太频繁地施用疗法的能力降低了与向受试者施用疗法相关的毒性的可能性，而不降低疗法的疗效。另外，协同效应可在癌症的治疗或缓解中改善治疗效果。而且，通过疗法(例如，治疗剂)组合证明的协同效应可以避免或减少与使用任何单一疗法相关的不利或不想要的副作用。
双重功能抗糖基化PD-L1抗体
本文中提供了与糖基化PD-L1蛋白(例如，具有特定N-聚糖结构的PD-L1蛋白；PD-L1的特定糖肽)或糖基化PD-L1肽结合，并且具有双重功能(即它们减少或阻断PD-L1/PD-1相互作用的结合，并且还促进肿瘤细胞上的PD-L1内化和降解)的抗体或其结合片段，以及此类抗体在疾病(特别是癌症)治疗中的用途。与未糖基化的PD-L1相比，抗体优先与糖基化PD-L1结合。如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体可以属于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE Ig类别，以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。说明性地，双重功能抗glycPD-L1抗体可以是嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、人源化抗体或人抗体。在一个优选实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，单克隆抗glycPD-L1抗体是STM073或STM108。在另一个优选实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体是人源化抗体或嵌合抗体，特别是STM073或STM108的人源化或嵌合形式。通过已知的方法并如本文所述，可以产生多克隆或单克隆抗体、抗体片段、结合结构域和CDR(包括任何上述的工程化形式)，其对糖基化PD-L1抗原、一个或多个其各自的表位或任何上述的缀合物是特异的，无论此类抗原或表位是从天然来源分离的还是天然化合物的合成衍生物或变体。抗体可以是双特异性的或双互补位的。
在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如包含来自被移植到异源非人、人或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)的非人供体的抗原结合序列(例如，V结构域和/或CDR)的抗体。在一个实施方案中，所述非人供体序列来自小鼠或大鼠。在具体的实施方案中，VH和VL结构域是非人例如小鼠的，并且恒定结构域是人的。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变(例如，人噬菌体文库的噬菌体展示筛选等)获得的。在一个实施方案中，嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，鼠轻链V区与人κ轻链C区融合。在一个实施方案中，鼠重链V区与人IgG1 C区融合。
在一个实施方案中，抗体是源自骆驼科动物抗体，优选来自缺乏轻链的重链骆驼科动物抗体的免疫球蛋白单可变结构域，其被称为VHH结构域序列或NanobodiesTM。NanobodyTM(Nb)是天然存在的单链抗体的最小功能片段或单可变结构域(VHH)，并且是本领域技术人员已知的。它们来源于骆驼科动物中看到的仅有重链的抗体(Hamers-Casterman等，1993,Nature,363:446-448；Desmyter等，1996,Nat.Struct.Biol.,第803-811页)。在“骆驼科动物”家族中，发现缺乏轻多肽链的免疫球蛋白。“骆驼科动物”包括旧世界骆驼科动物(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Camelus dromedarius))和新世界骆驼科动物(例如，羊驼(Lama paccos)、驼羊(Lama glama)及骆马(Lamavi cugna))。单可变结构域重链抗体在本文中称为NanobodyTM或VHH抗体。Nb的小尺寸和独特的生物物理特性在识别不常见或隐藏的表位以及结合到蛋白质靶标的空腔或活性部位方面优于常规抗体片段。另外，Nb可被设计为多特异性和多价抗体，与报告分子连接，或被人源化。Nbs是稳定的，在胃肠系统中具有活性并且可以容易地制造。
在另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。通过将具有不同特异性的两种抗原结合部位统一到单一构建体中，双特异性抗体具有将具有精确特异性的两种离散抗原结合在一起，因此具有作为治疗剂的巨大潜力。双特异性抗体最初通过融合两个杂交瘤来制备，每个杂交瘤能够产生不同的免疫球蛋白。还通过连接两个scFv抗体片段同时省略完整免疫球蛋白中存在的Fc部分来产生双特异性抗体。此类构建体中的每个scFv单元可含有通过合成多肽接头彼此连接的来自重(VH)和轻(VL)抗体链中的每一个的一个可变结构域，后者通常经基因工程改造以具有最低免疫原性，同时保持最大程度的抗蛋白水解抗性。各个scFv单元可通过许多已知技术连接，包括掺入桥连两个scFv单元从而产生双特异性单链抗体的短(通常少于10个氨基酸)多肽间隔子。因此，所得双特异性单链抗体是在单个多肽链上含有具有不同特异性的两个VH/VL对的种类，其中各自scFv单元中的VH和VL结构域被多肽接头分开足够长以允许这两个结构域之间的分子内缔合，使得如此形成的scFv单元通过多肽间隔子彼此连续地系连，保持足够短以防止例如一个scFv单元的VH结构域与另一个scFv单元的VL之间的不希望的缔合。
在另一个实施方案中，抗体是双互补位抗体。如本文中所用，术语“双互补位抗体”是指包含两个抗原结合结构域的双特异性结合分子，所述两个抗原结合结构域识别并结合相同蛋白质靶标(例如，如本文所述的肿瘤相关的PD-L1靶抗原或糖基化PD-L1靶抗原)上的两个不同的非重叠表位、抗原决定簇或结构域。在一个实施方案中，如本文所述，针对glycPD-L1或其一个或多个肽部分的双互补位抗体包含第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域，其中所述两个结合结构域与同一靶glycPD-L1蛋白的两个不同的非重叠表位结合。被第一和第二免疫球蛋白结合结构域识别的表位之一或两者可以是糖基化的或含有糖基化残基。优选地，相对于未糖基化的形式，至少一种免疫球蛋白优先与glycPD-L1蛋白的糖基化形式结合。
在另一个实施方案中，双互补位抗体包含与glycPD-L1靶分子上的表位结合的免疫球蛋白(优选四价IgG)和与同一glycPD-L1靶分子上的不同且非重叠的表位结合的scFv，其中免疫球蛋白和scFv通过接头连接，以允许免疫球蛋白和scFv与glycPD-L1靶分子上的不同且非重叠的表位结合。因此，双互补位抗体由两种抗glycPD-L1抗体产生，所述两种抗体结合同一glycPD-L1靶标上的不同表位(或结构域)(即，双互补位结合)以增强结合亲和力/亲合力，增加肿瘤细胞上的抗体负荷以增强效应功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，和/或改善或增加肿瘤停留时间。另外，靶向肿瘤相关的glycPD-L1抗原上的两个非重叠表位的二价双互补位抗体具有诱导细胞膜中的glycPD-L1靶分子簇聚的潜力，这反过来可促进内化、溶酶体运输和降解增加。可使用本领域已知的技术产生针对靶蛋白/抗原上的两个不同的非重叠表位的双互补位抗体。参见，例如，B.Roberts等，1999,Int.J.Cancer，第81卷：285-291(癌胚抗原，EA)；D.Lu等，1999,J.Immunol.Methods，第230卷：159–71(血管内皮生长因子受体2,VEGF2)；WO 2009/068627,Ablynx NV,于2009年6月4日公布的；WO 2010/142534和Ablynx NV，于2010年12月16日公布的。
在一个实施方案中，二价双互补位抗体可通过使用来自如本文所述鉴定的两种不同抗glycPD-L1抗体的可变结构域序列来产生，所述抗体识别并结合给定的glycPD-L1靶蛋白上的不同的非重叠表位，其中该抗体含有附接于第二抗PD-L1抗体的H链和/或L链的N末端，或者，可选地CH3结构域的C末端的抗glycPD-L1抗体之一的单链可变片段(scFv)，所述第二抗PD-L1抗体识别glycPD-L1上的不同的非重叠表位。scFv可通过肽接头(例如，诸如用于连接scFv中的结合结构域的那些接头)与第二抗PD-L1抗体连接。参见，例如，Dimasi等，J.Mol.Biol.,393:672-692(2009)。所得的结合分子产物或双互补位抗体在分子的每个臂上含有四个抗glycPD-L1结合单元或两个结合单元，所述结合单元能够与glycPD-L1上的两个不同表位相互作用并结合。根据该实施方案，靶向在肿瘤细胞表面上表达的glycPD-L1上的两个非重叠表位的二价双互补位抗体可通过表位结合有效地交联glycPD-L1以诱导细胞表面上的glycPD-L1聚集，从而导致形成引发和促进增强的内化和溶酶体降解的大型复合物。在一个实施方案中，将双互补位抗体与毒素或抗癌药物连接以产生如本文进一步描述的抗体-药物缀合物(ADC)。此类抗PD-L1双互补位抗体和溶酶体运输的增强的内化和内吞作用最终导致向靶细胞内递送更大量的毒素以及更大的肿瘤细胞杀伤或消退。如针对双互补位抗HER2 ADC所述(J.Y.Li等，2016,Cancer Cell，第29卷：117-129)，在体外和体内均观察到此类效应。说明性地，可以产生双互补位抗glycPD-L1抗体或抗glycPD-L1 ADC，其与糖基化的膜结合型PD-L1的两个非重叠表位特异性结合，以阻止或阻断其与其PD-1同源结合伴侣的相互作用并促进其内化和降解，以及如果使用抗glycPD-L1 ADC的话，杀死肿瘤细胞。在特定的实施方案中，抗glycPD-L1抗体是STM073、STM108或其ADC形式。
在其他实施方案中，本发明所涵盖的抗glycPD-L1结合分子或抗体可以是多互补位的，即含有识别并结合同一glycPD-L1靶分子上的三个、四个或更多个不同的，优选非重叠的表位或抗原决定簇的抗原结合结构域。在其他实施方案中，抗glycPD-L1抗体是双-或多互补位且多价的，即还包含识别并结合不同靶glycPD-L1分子上的一个或多个不同表位或抗原决定簇的抗原结合部位或“互补位”。
适合于使用的抗体片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，其由VL、VH、CL和CH1结构域组成；(ii)“Fd”片段，其由VH和CH1结构域组成；(iii)“Fv”片段，其由单一抗体的VL和VH结构域组成；(iv)“dAb”片段，其由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合以形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利第5,091,513号)；(ix)通过基因融合构建的双抗体、多价或多特异性片段(美国专利申请公开号20050214860)。可通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定Fv、scFv或双抗体分子。包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu等，Cancer Res.,56:3055-3061)也是有用的。另外，在实施方案中还设想了抗体样结合肽模拟物。Liu等，2003,CellMol.Biol.,49:209-216)报导了“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其是用作简化抗体(pared-down antibody)并且具有更长的血清半衰期以及较少麻烦的合成方法的某些有利方面的肽。
可用抗原，诸如糖基化PD-L1多肽或肽接种动物，以产生免疫反应，并产生对糖基化PD-L1多肽特异的抗体。通常，将抗原与另一分子结合或缀合以增强免疫反应。如本文中所用，缀合物是与抗原结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质，所述抗原用于在动物中引发免疫反应。响应于抗原接种而在动物中产生的抗体包含多种不同的分子(多克隆抗体)，其由多种单独的抗体产生性B淋巴细胞产生。多克隆抗体是抗体种类的混合群体，其中每个抗体种类可以识别相同抗原上的不同表位。给予动物中多克隆抗体产生的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别已对动物进行免疫的抗原性化合物上的表位集合。通过亲和纯化进一步增强该特异性，以仅选择识别目标抗原或表位的抗体。
单克隆抗体是抗体的单一克隆种类，其中每个抗体分子识别相同的表位，因为所有产生抗体的细胞都来源于单个产生抗体的B淋巴细胞。用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常以与制备多克隆抗体相同的方式开始。在一些实施方案中，将啮齿类动物诸如小鼠和大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，将兔、绵羊或青蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是公知的并且可以提供某些有利方面。常规使用小鼠(例如，BALB/c小鼠)并且所述小鼠通常产生高百分比的稳定融合物。用于单克隆抗体生产的杂交瘤技术涉及将从先前用糖基化PD-L1蛋白或肽免疫的小鼠分离的单个抗体产生性B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(例如，小鼠骨髓瘤细胞系)融合。该技术提供了将单个抗体产生性细胞增殖无限数代的方法，使得可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构上相同的抗体，即单克隆抗体。
可使用单克隆和其他抗体以及重组DNA技术产生工程化抗体，以产生保留原始抗体的抗原或表位结合特异性的其他抗体或嵌合分子，即该分子具有特异性结合结构域。此类技术可涉及将编码免疫球蛋白可变区或抗体的CDR的DNA引入遗传物质中，以用于不同抗体的框架区、恒定区或恒定区加框架区。参见，例如，美国专利第5,091,513号和第6,881,557号，其通过引用并入本文。
通过本文所述的已知方法，可以产生多克隆或单克隆抗体、具有结合活性的抗体片段、结合结构域和CDR(包括上述任何一种的工程化形式)，所述抗体或其片段、结合结构域和CDR与糖基化PD-L1蛋白、其各自的表位中的一个或多个表位特异性结合，并且具有阻断PD-L1与PD-1结合并促进肿瘤细胞中的PD-L1内化的双重功能，或任何上述种类的缀合物，无论此类抗原或表位是从天然来源分离的，还是天然化合物的合成衍生物或变体。
抗体可以从任何动物来源产生，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是绵羊、鼠(例如，小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。另外，可通过筛选人组合抗体文库来获得人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在动物免疫不存在的情况下产生特异性抗体，如美国专利第6,946,546号(其通过引用并入本文)中所述的。在Marks等，1992,Bio/Technol.,10:779-783；Stemmer,1994,Nature,370:389-391；Gram等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580；Barbas等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3809-3813和Schier等，1996,Gene,169(2):147-155中进一步描述了这些技术。
用于在各种动物物种中产生多克隆抗体以及用于产生各种类型的单克隆抗体(包括人源化、嵌合和完全人抗体)的方法是本领域公知的并且是高度可再现的。例如，以下美国专利提供了对此类方法的描述，并且通过引用并入本文：美国专利第3,817,837号；第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,196,265号、第4,275,149号、第4,277,437号、第4,366,241号、第4,469,797号、第4,472,509号、第4,606,855号、第4,703,003号、第4,742,159号、第4,767,720号、第4,816,567号、第4,867,973号、第4,938,948号、第4,946,778号、第5,021,236号、第5,164,296号、第5,196,066号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,420,253号、第5,565,332号、第5,571,698号、第5,627,052号、第5,656,434号、第5,770,376号、第5,789,208号、第5,821,337号、第5,844,091号、第5,858,657号、第5,861,155号、第5,871,907号、第5,969,108号、第6,054,297号、第6,165,464号、第6,365,157号、第6,406,867号、第6,709,659号、第6,709,873号、第6,753,407号、第6,814,965号、第6,849,259号、第6,861,572号、第6,875,434号、第6,891,024号、第7,407,659和第8,178,098号.。
预期本文提供的针对糖基化PD-L1的抗体将具有中和、阻断、抑制或抵消糖基化PD-L1的作用的能力，而无论动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源如何。某些动物物种可能不太适合用于产生治疗性抗体，因为它们更可能由于通过抗体的“Fc”部分激活补体系统而引起免疫或过敏反应。然而，可将完整抗体酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，并消化成具有结合结构域或CDR的肽片段。去除Fc部分降低了该抗体片段引发不希望的免疫反应的可能性，因此，没有Fc部分的抗体可优先用于预防性或治疗性治疗。如上所述，还可将抗体构建成嵌合抗体、人源化抗体，或者部分或完全人抗体，以减少或消除由于向动物施用已在另一物种中产生的或具有来自另一物种的氨基酸序列的抗体而导致的潜在的不利免疫作用。
抗体蛋白可以是重组的，或在体外合成的。预期在如本文所述的含有抗glycPD-L1抗体的组合物中，每ml存在约0.001mg至约10mg的总抗体多肽。因此，组合物中抗体蛋白质的浓度可以是约，至少约或至多约或等于0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更高(或可从其推出的任何范围)。其中，约、至少约、至多约或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可以是结合糖基化PD-L1的抗体。
可将保留结合活性的抗体或抗体的免疫部分与其他蛋白质化学缀合，或重组表达为与其它蛋白质的融合蛋白。出于如本文所述的目的，所有此类融合蛋白都包括在抗体或抗体的免疫部分的定义中。在一些实施方案中，涵盖了针对糖基化PD-L1或多肽产生的双重功能抗体和抗体样分子，所述抗体和抗体样分子与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物或有效负载。为了增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，可将抗体与至少一种所需分子或部分连接或共价结合或复合。此类连接的分子或部分可以是，但不限于，至少一种效应分子或报告分子。效应分子包含具有所需活性(例如，细胞毒活性)的分子。可被附着于抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相反，报告分子定义为可以使用测定法检测的任何部分。可与抗体缀合的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记物、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体，诸如生物素等。本领域已知几种将抗体与缀合物分子或部分附接或缀合的方法。一些附接方法涉及使用金属螯合物，采用(作为非限制性实例)有机螯合剂诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)、亚乙三胺四乙酸、N-氯-对-甲苯磺酰胺和/或附接于抗体的四氯-3-6α-二苯基甘脲-3。抗体，特别是本文所述的抗体，也可在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐存在的情况下与酶反应。在这些偶联剂存在的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来常规地制备具有荧光素标记物的缀合物。在另一个实施方案中，可将如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体与化合物或物质(诸如聚乙二醇(PEG))偶联或连接，以增加其在施用后在血浆、血清或血液中的体内半衰期。
在一个特定实施方案中提供了相对于非糖基化PD-L1蛋白而特异性地且优先地与糖基化PD-L1蛋白结合并且具有阻断PD-L1/PD-1结合和促进PD-L1内化和降解的双重活性的抗体，诸如单克隆抗体，以及其人源化和嵌合形式，及其抗原结合片段。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体特异性地或优先地结合PD-L1蛋白，所述PD-L1蛋白在PD-L1蛋白的氨基酸序列的位置35、192、200和/或219(例如，如SEQ ID NO:1中所示的)处被糖基化。例如，抗glycPD-L1抗体的特异性或选择性结合涉及抗体与糖基化PD-L1抗原的结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的一半。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的至多1/5。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的至多1/10。在一个实施方案中，在如实施例6中所述的细胞流式细胞术结合测定中，抗体表现出的以MFI表示的对表达WT PD-L1的细胞的结合是以MFI表示的对表达未糖基化PD-L1的细胞的结合的1.5倍、2倍、3倍、4倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一个实施方案中提供了对糖基化PD-L1特异并且优先与其结合的双重功能抗体或其结合片段，其特异性结合由STM073结合的PD-L1表位。在某些实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体结合PD-L1上的表位，其包含SEQ ID NO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置H69、Y112、R113和K124。在一个实施方案中，表位的氨基酸是非连续的，并且表位是构象表位。包含STM073 MAb表位的人PD-L1多肽的区域具有序列VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(即，SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:1的V68-V128)，其中包含MAbSTM073所识别的表位的氨基酸残基H69、Y112、R113和K124加以下划线。在STM073表位序列中，位置78处的氨基酸残基组氨酸(H)与位置108处的氨基酸残基天冬氨酸(D)之间的短划线表示SEQ ID NO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置79-107处的氨基酸。
在另一个实施方案中提供了对糖基化PD-L1特异并且优先与其结合的双重功能抗体或其结合片段，其为抗glycPD-L1单克隆抗体STM108或其人源化或嵌合形式。在某些实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体特异性结合PD-L1上的表位，其包含本文中的SEQ IDNO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置S80、Y81、K162和S169。包含STM108MAb表位的人PD-L1多肽的区域具有氨基酸序列LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ(即，SEQ ID NO:1的L74-Q173)，其中包含MAb STM108所识别的表位的氨基酸残基S80、Y81、K162和S169加以下划线。在STM108表位区域中，位置84处的氨基酸残基精氨酸(R)与位置158处的氨基酸残基谷冬氨酸(E)之间的短划线表示SEQ ID NO:1的人PD-L1氨基酸序列的位置85-157处的氨基酸。因此，STM108 MAb表位的氨基酸是非连续的，并且表位是构象表位。
STM073 MAb的重链和轻链可变(V)结构域的核酸(DNA)和相应的氨基酸序列示于下表3中。表3提供了STM073的成熟(即，不含信号肽)VH和VL结构域的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:2、3、10和11)以及含有信号肽的VH和VL结构域序列(分别为SEQ ID NO:87、88、89和90)。在表3中所示的重链DNA和蛋白质V结构域序列中，氨基末端信号序列以斜体字体表示。表3中还显示了STM073 MAb重链和轻链V结构域CDR，如由Kabat和Chothia定义所确定的。
在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含SEQ ID NO:3的VH结构域和SEQ ID NO:11的VL结构域。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含SEQ ID NO:3的VH结构域和SEQ ID NO:11的VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。在一个实施方案中，特异性且优先结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含如下VH结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含如下VH结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR1-3，或分别具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3或其组合。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含如下VL结构域，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQID NO:16的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含如下VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VL结构域包含分别具有SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含(a)如下VH结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合；和(b)如下VL结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR1-3。在一些实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含上述VH和VL结构域及其中的CDR的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。
在一个实施方案中，特异性结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的VH结构域和/或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的VL结构域，并且抑制或阻断糖基化PD-L1与PD-1的结合，并促进细胞膜上的PD-L1表达的去稳定化。在一个实施方案中，特异性地且优选结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含含有如下CDR 1-3的VH结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:4、SEQID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列或分别相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:9的氨基酸序列具有至少1、2、3、4或5个氨基酸取代，所述双重功能抗glycPD-L1抗体阻断糖基化PD-L1与PD-1的结合并且促进细胞膜上PD-L1表达的去稳定化。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗g lycPD-L1抗体包含含有如下CDR1-3的VL结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗g lycPD-L1抗体包含(a)包含如下CDR 1-3的VH结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列或分别相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代；和(b)包含如下CDR 1-3的VL结构域，其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代，所述抗体阻断糖基化PD-L1与PD-1的结合并且促进细胞膜上PD-L1表达的去稳定化。还提供了使用AbM、Contact或IMGT定义的CDR，具有人框架区和任选地人恒定结构域的STM073的人源化形式。
上述双重功能抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的一半。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1所展示的Kd的至多1/5。在一个实施方案中，双重功能抗g lycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1蛋白所展示的Kd的至多1/10。在一个实施方案中，双重功能抗g lycPD-L1抗体对糖基化PD-L1的结合亲和力为5-20nM或5-10nM，包括下限值和上限值。在一个实施方案中，在如实施例6中所述的细胞流式细胞术结合测定中，抗体表现出的以MFI表示的与表达WT PD-L1的细胞的结合是以MFI表示的与表达未糖基化PD-L1的细胞的结合的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一个实施方案中，所述抗体抑制PD-1与PD-L1的相互作用，并且特别地抑制效应T细胞表达的PD-1与由肿瘤细胞表达的PD-L1(特别地糖基化PD-L1)的相互作用。抗体还促进PD-L1的内化和PD-L1的降解，从而降低细胞表面上的PD-L1水平。
在另一个特定实施方案中，提供了抗体或其结合片段，其特异性地且优先地结合糖基化PD-L1，所述抗体为抗glycPD-L1单克隆抗体STM108。STM108 MAb的成熟重链和轻链可变(V)结构域的核酸(DNA)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:18、19、26和27)示于下表3中。未加工的重链V结构域(即在N-末端含有信号序列)的DNA和氨基酸序列也示于表3中(分别为SEQ ID NO:91和92)。表3中还显示了根据Kabat和Chothia定义的STM108 MAb重链和轻链V结构域CDR。
在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH结构域和SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL结构域。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH结构域和SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含如下VH结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含如下VH结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VH结构域包含分别具有SEQID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含如下VL结构域，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，双重功能抗glycPD-L1抗体与包含如下VL结构域的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR 1-3。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含(a)VH结构域，其包含分别具有SEQID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的Chothia CDRs1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3，或其组合；和(b)VL结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1-3。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与包含上述VH和VL结构域及其中的CDR的抗体竞争与糖基化PD-L1的特异性结合。
在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有80％，85％，90％，95％、98％或99％同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有80％，85％，90％，95％，98％或99％同一性的VL结构域。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含如下VH结构域，其含有其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的CDR 1-3，或分别具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含如下VL结构域，其含有其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的的CDR 1-3。在一个实施方案中，特异性地且优先地结合糖基化PD-L1的双重功能抗glycPD-L1抗体包含(a)VH结构域，其含有其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或分别相对于SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代或其组合的CDR1-3；和/或(b)VL结构域，其含有其中至少1个、2个或全部3个CDR分别相对于SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代的CDR 1-3。还提供了使用AbM、Contact或IMGT定义的CDR，具有人框架区和任选地人恒定结构域的STM108的人源化形式。
在一些实施方案中，上述抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1结合的Kd小于相对于未糖基化的PD-L1蛋白所展示的Kd的一半。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1蛋白所展示的Kd的至多1/5。在一个实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1蛋白结合的Kd为相对于未糖基化的PD-L1蛋白所展示的Kd的至多1/10。在一个实施方案中，STM108MAb式对糖基化PD-L1的结合亲和力为5-20nM或5-10nM，包括下限和上限值。在一个实施方案中，在如实施例6中描述的细胞流式细胞术结合测定中，所述抗体表现出的以MFI表示的与表达WT PD-L1的细胞的结合是以MFI表示的与表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合的1.5倍、2倍、3倍、4倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。这些抗glycPD-L1抗体抑制PD-1与PD-L1的相互作用，特别是抑制效应T细胞表达的PD-1与由肿瘤细胞表达的PD-L1(特别是糖基化PD-L1)的相互作用。
还包括在一个实施方案中的是分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，其结合人PD-L1氨基酸序列DAGVYRCMISYGGADYKRITV(即，SEQ ID NO:1的D108-V128)内的表位。在一个实施方案中，分离的双重功能抗glycPD-L1抗体特异性结合如下人PD-L1表位，所述表位是非连续的，并且包括在以下序列：DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:86)中显示为加以下划线的氨基酸残基的人PD-L1氨基酸序列SEQ ID NO:1的位置Y112、R113和S117。
在一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，其包含(a)VH结构域，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的Chothia CDR H1或具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的Kabat CDR H1；具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的Chothia CDR H2或具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的Kabat CDR H2；和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR H3或具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的Kabat CDR H3；和VL结构域，其包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR L1；具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR L2；和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR L3。还提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，其是具有如表2(同上)所述的根据IMGT、AbM或Contact的定义的CDR的STM073的人源化形式。
在另一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，其包含(a)VH结构域，其包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的Chothia CDR H1或具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的Kabat CDR H1；具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的Chothia CDR H2或具有SEQ IDNO:23的氨基酸序列的Kabat CDR H2；和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的Chothia CDRH3或具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的Kabat CDR H3；和VL结构域，其包含具有SEQ IDNO:28的氨基酸序列的CDR L1；具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR L2；和具有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的CDR L3。还提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，其是具有如表2(同上)所述的根据IMGT、AbM或Contact的定义的CDR的STM108的人源化形式。
在另一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，其特异性地与选自VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:85)、DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:86)或LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ(其分别为SEQ ID NO:1的氨基酸74至84和158至173)的氨基酸序列内的表位结合，所述序列位于SEQ ID NO:1的人PD-L1多肽序列内，即包含SEQ ID NO:1的氨基酸19-290的成熟PD-L1蛋白。在一个实施方案中，所述抗体抑制PD-1与PD-L1的相互作用，特别地抑制效应T细胞表达的PD-1与肿瘤细胞表达的PD-L1(特别是糖基化PD-L1)的相互作用，以及促进PD-L1从细胞膜内化到细胞内和PD-L的细胞内降解。
在另一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，诸如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，其与MAb STM073或如本文所述的分离的抗glycPD-L1 MAb结合相同的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H69、Y112、R113和K124。在另一个实施方案中，提供了分离的双功能抗glycPD-L1抗体，例如单克隆抗体、其嵌合或人源化形式，或其结合片段，当与糖基化PD-L1结合时，其与下列氨基酸残基中的至少一个接触：SEQ ID NO:1的H69、Y112、R113和K124。在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体接触包含PD-L1(即，糖基化人PD-L1)的一个或多个表位区域的至少两个、至少三个或四个氨基酸残基接触。
在另一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，其与MAb STM108或结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基S80、Y81、K162和S169的表位的分离的抗glycPD-L1 MAb结合相同的表位。在另一个实施方案中，提供了分离的双功能抗-glyGDD-L1抗体，所述抗体当与糖基化的PD-L1结合时，接触下列氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO:1的S80、Y81、K162和S169。
在另一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，所述抗体或其结合片段当与糖基化PD-L1结合时，接触下列氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO:1的Y112、R113和S117。
在另一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，所述抗体或其结合片段当与糖基化PD-L1结合时，接触SEQ ID NO:1的V68至V128的氨基酸区域内或SEQ ID NO:1的D108至V128的氨基酸区域内或SEQ ID NO:1的L74至Q173的氨基酸区域内或SEQ ID NO:1的L74至R84的氨基酸区域内以及SEQ ID NO:1的E158至Q173的氨基酸区域内的至少一个氨基酸。在另一个实施方案中，提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，所述抗体或其结合片段当与糖基化PD-L1结合时，接触以下组的氨基酸残基中的至少一个：SEQ ID NO:1的与V68至V128的氨基酸区域内的H69、Y112、R113和K124。在另一个实施方案中，提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，所述抗体或其结合片段当与糖基化PD-L1结合时，接触以下组的氨基酸残基中的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个：SEQ ID NO:1的V68至V173的氨基酸区域内的H69、S80、Y81、Y112、R113、K124、K162、S169。在一个实施方案中，提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，所述抗体或其结合片段当与糖基化PD-L1结合时，接触以下组的氨基酸残基：SEQ ID NO:1的D108至V128的氨基酸区域内的Y112、R113、S117。
在另一个实施方案中提供了分离的双重功能抗glycPD-L1抗体，例如其单克隆抗体、嵌合或人源化形式，或其结合片段，所述抗体或其结合片段当与糖基化的PD-L1结合时，结合PD-L1蛋白(SEQ ID NO:1)的至少氨基酸区域V68-V128或至少氨基酸区域D108-V128，或其组合。
另一个实施方案提供了分离的核酸，其包含编码VH结构域的SEQ ID NO:2或18的核苷酸序列和编码抗体VL结构域的SEQ ID NO:10或26的核苷酸序列。在一个实施方案中，提供了编码抗glycPD-L1抗体VH结构域的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQID NO:2或18的核苷酸序列具有至少90-98％同一性。在一个实施方案中，提供了编码抗glycPD-L1抗体VL结构域的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19或26的核苷酸序列具有至少90-98％同一性。在一些实施方案中，编码VH和/或VL结构域的核苷酸序列分别与SEQ ID NO:2或18或者SEQ ID NO:10或26具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
表3.抗glycPD-L1 MAb的核苷酸和氨基酸序列
疾病治疗
在某些方面，可施用如本文实施方案中所述的抗体或其抗原结合片段(诸如特异性地与糖基化PD-L1结合的双重功能抗体)以在患有癌症的受试者中治疗癌症或在易于(诸如遗传易感性，先前对致癌物的环境暴露，先前的癌症发病等)发生癌症的受试者中预防癌症。因此，本文提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种双重功能抗glycPD-L1抗体(以治疗癌症)来治疗癌症的方法。如本文所述，治疗涉及减少、预防、抑制或阻断癌细胞的生长、增殖、迁移等，并且包括引起癌细胞的细胞杀伤或凋亡。治疗还可以阻止肿瘤细胞转移或引起肿瘤细胞转移的消退。本文描述的方法为正在接受治疗(特别是关于表达糖基化PD-L1细胞表面蛋白的肿瘤细胞的治疗)的受试者(例如，人患者)提供益处，所述糖基化PD-L1细胞表面蛋白可与在免疫效应细胞诸如T细胞(特别是杀伤细胞或细胞毒性T细胞)的细胞表面上表达的PD-1结合/相互作用。
预期用有效量的至少一种如上所述的双重功能抗glycPD-L1抗体治疗这些受试者会导致一种或多种抗体与肿瘤细胞上的糖基化PD-L1结合，并阻止、阻断或抑制PD-L1和PD-1的相互作用，并促进PD-L1的内化和降解，以阻止、阻断或抑制表达PD-L1的肿瘤细胞与表达PD-1的T细胞的相互作用，从而阻止或避免T细胞活性的免疫抑制并允许T细胞被活化以杀死携带PD-L1的肿瘤细胞。在一个优选实施方案中，双重功能抗PD-L1抗体与人PD-L1结合，并且所述受试者是人患者。因此，本文提供的方法对于需要通过本方法的实践实现的抗癌结果，能够从中受益或希望获得所述抗癌结果的益处的受试者是有利的。受试者寻求涉及以治疗有效量施用至少一种双重功能抗glycPD-L1抗体的方法的治疗益处或接受此类治疗益处为本领域提供了有利方面。另外，与其他治疗方法和治疗方式相比，本方法提供了消除或避免副作用、不良后果、禁忌症等的进一步有利方面，或降低了发生此类问题的风险或可能性。
在一些具体的实施方案中，给患有癌症或易患癌症的受试者施用治疗有效量的作为双重功能抗glycPD-L1抗体的STM073或STM108的人源化或嵌合形式。施用不止一种类型的抗glycPD-L1抗体以治疗癌症可以是有利的。例如，可向有此需要的患者施用STM073和STM108两者的嵌合或人源化形式。或者，可将STM073的嵌合或人源化形式与另一种抗glycPD-L1抗体共同施用于有此需要的患者，或者可将STM108的嵌合或人源化形式与另一种抗glycPD-L1抗体共同施用于有此需要的患者。抗glycPD-L1抗体的共同施用可以比单独施用任一种抗体更具治疗或预防有效性和/或可允许以比单独的任一种抗体更低的剂量或更低的频率施用。
本发明治疗方法对其有用的癌症包括任何恶性细胞类型，诸如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那些，特别是具有在其表面上表达糖基化PD-L1的细胞的肿瘤。通常，肿瘤是指任何大小的恶性或潜在恶性肿瘤或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。实体瘤是异常的组织块或生长，通常不包含囊肿或液体。示例性实体瘤可包括但不限于选自胰腺、胆囊、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、睾丸、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳腺的器官的肿瘤。示例性血液肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。可使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌、黑色素瘤、浅表性扩散黑色素瘤、雀斑痣恶性黑色素瘤(lentigo malignantmelanoma)、肢端雀斑痣样黑色素瘤、结节性黑色素瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴细胞NHL；高级小无核裂细胞NHL(high grade small non-cleavedcell NHL)；肿块性疾病NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤AIDS相关淋巴瘤和斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞性白血病、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)和慢性成髓细胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)。
癌症可能具体地属于以下组织学类型，但不必限于这些类型：赘生物，恶性；癌；癌，未分化的；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管上皮癌(cholangiocarcinoma)；肝细胞癌；结合性肝细胞癌和胆管癌(combined hepatocellularcarcinoma and cholangiocarcinoma)；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌(Chromophobe carcinoma)；嗜酸性粒细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌(Basophilcarcinoma)；透明细胞腺癌(Clear cell adenocarcinoma)；粒细胞癌(Granular cellcarcinoma)；滤泡性腺癌(Follicular adenocarcinoma)；乳头状和滤泡性腺癌；无包膜形成的硬化性癌(Nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌(Adrenalcortical carcinoma)；子宫内膜癌(Endometroid carcinoma)；皮肤附件癌(Skinappendage carcinoma)；大汗腺腺癌(Apocrine adenocarcinoma)；皮脂性腺癌(Sebaceousadenocarcinoma)；盯聍腺腺癌(Ceruminous adenocarcinoma)；粘液表皮样癌(Mucoepidermoid carcinoma)；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌(Papillaryserous cystadenocarcinoma)；粘液囊腺癌(Mucinous cystadenocarcinoma)；粘液腺癌(Mucinous adenocarcinoma)；印戒细胞癌(Signet ring cell carcinoma)；浸润性导管癌；髓样癌(Medullary carcinoma)；小叶癌(Lobular carcinoma)；炎性癌；佩吉特病(Paget’s disease)，乳腺；腺泡细胞癌(Acinar cellcarcinoma)；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢基质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤(Thecoma)，恶性；粒层细胞瘤，恶性；卵巢男性细胞瘤(Androblastoma)，恶性；Sertoli细胞癌；Leydig细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤(Extra-mammary paraganglioma)，恶性；嗜络细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素黑色素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤(Malig melanoma in giant pigmented nevus)；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合肿瘤，恶性；苗勒混合瘤(Mullerianmixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；勃勒纳瘤(Brennertumor)，恶性；叶状瘤(Phyllodes tumor)，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤(Ewing’ssarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节成神经细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其它规定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤和毛细胞白血病。
待治疗的癌症优选对PD-L1，特别是糖基化PD-L1呈阳性。在某些实施方案中，肿瘤细胞对肿瘤细胞标志物诸如EGFR或HER2/neu表达(例如在乳腺癌细胞上表达)也呈阳性。这些标志物的存在与否可表明利用靶向治疗剂诸如酪氨酸激酶抑制剂(例如用于EGFR阳性癌症的吉非替尼，或用于HER2/neu阳性癌症的赫赛汀)与如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体相组合的联合治疗将为有需要的受试者提供治疗益处。在某些实施方案中，癌症是BLBC。
可用于表征癌症以指导疗法的选择或监测疗法的其他标志物包括非小细胞肺癌和间变性大细胞淋巴瘤中的ALK基因重排和过表达；用于肝癌和生殖细胞肿瘤的甲胎蛋白(AFP)；用于多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病和一些淋巴瘤的β-2-微球蛋白(B2M)；用于绒毛膜癌和生殖细胞肿瘤的β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)；用于卵巢癌和乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因突变；用于慢性粒细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病和急性髓性白血病的BCR-ABL融合基因(费城染色体)；用皮肤黑色素瘤和结直肠癌的BRAF V600突变；用于胃肠道间质瘤和粘膜黑色素瘤的C-kit/CD117；用于乳腺癌的CA15-3/CA27.29；用于胰腺癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌的CA19-9；用于卵巢癌的CA-125；用于甲状腺髓样癌的降钙素；用于结直肠癌和一些其他癌症的癌胚抗原(CEA)；用于非霍奇金淋巴瘤的CD20；用于神经内分泌肿瘤的嗜铬粒蛋白A(CgA)；用于膀胱癌的染色体3、7、17和9p21；用于肺癌的细胞角蛋白片段21-1；用于非小细胞肺癌的EGFR基因突变分析；用于乳腺癌的雌激素受体(ER)/孕酮受体(PR)；用于膀胱癌的纤维蛋白/纤维蛋白原；用于卵巢癌的HE4；用于乳腺癌、胃癌和胃食管连接腺癌的HER2/neu基因扩增或蛋白质过度表达；用于多发性骨髓瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症的免疫球蛋白；用于结直肠癌和非小细胞肺癌的KRAS基因突变分析；用于生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤和神经母细胞瘤的乳酸脱氢酶；用于小细胞肺癌和神经母细胞瘤的神经元特异性烯醇化酶(NSE)；用于膀胱癌的核基质蛋白22；用于前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)；用于甲状腺癌的甲状腺球蛋白；和用于乳腺癌的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)。
双重功能抗glycPD-L1抗体可以多种形式用作抗肿瘤剂。一个特定的实施方案涉及使用抗体作为抗肿瘤剂的方法，因此，其包括使肿瘤细胞群与治疗有效量的抗体或含有该抗体的组合物接触足以阻断或抑制肿瘤细胞生长或实现肿瘤细胞的细胞凋亡的时间。在一个实施方案中，体内接触肿瘤细胞是通过向有需要的患者施用(例如通过静脉内、皮下、腹膜内或瘤内注射)治疗有效量的包含如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体的生理上可耐受的组合物来实现的。抗体可通过注射或通过在一段时间内逐渐输注而经胃肠外施用。有用的给药和递送方案包括静脉内、腹膜内、口服、肌内、皮下、腔内、鞘内、透皮、皮肤、蠕动方式或直接注射到含有肿瘤细胞的组织中。
例如，通常静脉内施用(诸如通过注射单位剂量)包含抗体的治疗组合物。当用于治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有与所需稀释剂(即载体或媒介物)结合的经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性物质。以与剂量制剂相容的方式以及以治疗有效量施用含有双重功能抗glycPD-L1抗体的组合物。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者系统利用活性成分的能力和所需治疗效果的程度。待施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且是每个个体特有的。然而，本文公开了用于全身应用的合适剂量范围，并且其取决于施用途径。还设想了用于初始和加强施用的合适方案，并且其通常可包括初始施用，然后通过随后的注射或其他施用以一个或多个间隔(小时)重复施用。示例性的多次施用适合于维持连续高的抗体血清和组织水平。或者，设想了足以将血液中的浓度维持在用于体内治疗的指定范围内的连续静脉内输注。
预期可以全身性或局部施用抗glycPD-L1抗体以治疗疾病，诸如抑制患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中的肿瘤细胞生长或杀死癌细胞。抗体可以单独施用或与抗增殖药物或抗癌药物联合施用。在一个实施方案中，施用抗glycPD-L1抗体以在手术或其他程序之前减少患者的癌症负荷。或者，可在手术后以周期性间隔施用其，以确保任何剩余的癌症(诸如，手术未能消除的癌症)的大小或生长能力降低和/或不能存活。如上所述，抗体的治疗有效量是经计算以达到所需效果的预定量。因此，用于抗glycPD-L1抗体施用的剂量范围是大到足以产生所需效果(其中肿瘤细胞分裂和细胞周期的症状减少)的剂量范围。最佳地，剂量不应大到引起不良副作用，诸如高粘度综合征、肺水肿、充血性心力衰竭、神经学作用等。通常，剂量将随着患者的年龄、病况、大小和性别以及疾病程度而变化，并且可由本领域技术人员诸如医师或临床医生确定。当然，在任何并发症的情况下，剂量可以由个体医师调整。
治疗方法
在某些实施方案中，所述组合物和方法涉及双重功能抗glycPD-L1抗体的单独施用或与第二种或另外的药物或疗法组合在一起施用。此类药物或疗法可用于治疗与PD-L1或糖基化PD-L1相关，优选与人PD-L1或糖基化人PD-L1与人PD-1的相互作用相关的任何疾病。例如，该疾病可以是癌症。包含至少一种抗PD-L1抗体(其优先与糖基化PD-L1蛋白结合并且阻断或抑制PD-L1与PD-1的结合以及促进PD-L1内化和降解)或其结合部分的组合物和方法在治疗癌症或其他疾病方面具有治疗或保护作用，特别是通过阻止、减少、阻断或抑制PD-1/PD-L1相互作用，从而提供治疗效果和治疗。
所述组合物和方法，包括联合疗法，具有治疗或保护作用，并且可以增强治疗或保护作用，和/或增强另一种抗癌或抗过度增殖疗法的治疗效果。治疗性和预防性方法和组合物可以以有效实现所需效果(诸如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供。该方法可涉及施用双重功能抗glycPD-L1抗体或其结合片段和第二疗法。第二疗法可以具有或可以不具有直接的细胞毒性作用。例如，第二疗法可以是上调免疫系统而不具有直接细胞毒性作用的药剂。可将组织、肿瘤和/或细胞暴露于包含一种或多种药剂(例如，抗体或抗癌剂)的一种或多种组合物或药物制剂，或通过将组织、肿瘤和/或细胞暴露于两种或更多种不同组合物或制剂，其中一种组合物提供例如1)抗体，2)抗癌剂，3)抗体和抗癌剂，或4)两种或多种抗体。在一些实施方案中，第二疗法也是相对于未糖基化的PD-L1而优先结合糖基化PD-L1的抗PD-L1抗体，优选抗glycPD-L1抗体，或者在其他实施方案中，为抗-PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体包括但不限于派姆单抗(Pembrolizumab)和尼沃鲁单抗(nivolumab)；示例性抗PD-L1抗体包括阿特珠单抗(atezolizumab)。此外，预期此类联合治疗可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。
举例来说，当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗性多肽，优选如本文所述的抗glycPD-L1抗体递送至靶细胞或置于直接与靶细胞并置，特别地与肿瘤或癌细胞表面上表达或高表达的靶抗原(例如PD-L1，特别是糖基化PD-L1)特异性结合的方法。通过治疗性抗glycPD-L1抗体或其结合片段的此类结合阻止、阻断、抑制或减少肿瘤或癌细胞表达的PD-L1与效应T细胞上的PD-1的相互作用，从而阻止与PD-L1/PD-1相互作用相关的免疫抑制。在一些实施方案中，还将化学治疗剂或放射治疗剂与抗glycPD-L1抗体或其结合片段结合施用或递送至受试者。为了实现细胞杀伤，例如，将一种或多种药剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。
抗glycPD-L1抗体可以在相对于另一种抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可以以从同时到在彼此之前或之后数分钟到数天到数周的间隔进行。在将抗体与抗癌剂分开提供给患者的实施方案中，通常确保在每次递送的时间之间的间隔没有超出有效时段，使得给药的化合物仍然能够对患者施加有利的组合效果。说明性地，在此类情况下，预期可以在彼此约12至24小时或72小时内，更特别地，在彼此约6-12小时内为患者提供抗体和抗癌疗法。在某些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中在各个施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在某些实施方案中，治疗过程或治疗周期将持续1-90天或更长时间(这样的范围包括居间天和最后一天)。设想了可以在第1天至第90天中的任何一天(这样的范围包括居间天和最后一天)或其任意组合施用一种药剂，并且在第1天至第90天中的任何一天(这个范围包括居间天和最后一天)或其任意组合施用另一种药剂。在一天(24小时)内，可一次或多次向患者施用药剂。此外，在治疗过程之后，设想了可存在不施用抗癌治疗的一段时间。该时间段可以持续诸如1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长(这样的范围包括居间天和上限时间点)，这取决于患者的状况，诸如预后、强度、健康等。必要时可重复治疗周期。可采用各种治疗组合。在下面显示的组合治疗方案的代表性实例中，抗体，诸如抗glycPD-L1抗体或其结合片段由“A”表示，并且抗癌疗法用“B”表示：
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，将本实施方案的任何抗体或疗法向患者的施用将遵循此类化合物的一般给药方案。因此，在一些实施方案中，存在监测不良事件和毒性，特别是可归因于联合治疗的不良事件和毒性的步骤。
在一个实施方案中，提供了涉及将双重功能抗glycPD-L1抗体单独地或与另一种抗药剂组合地施用于有此需要的患者，即癌症或肿瘤患者的方法。在施用抗glycPD-L1抗体之前，可以评估患者肿瘤或癌症的样品中PD-L1的存在。如果这样的评估结果显示患者的肿瘤或癌症对糖基化PD-L1呈阳性，则可根据患者的glycPD-L1+肿瘤或癌症更适合于抗glycPD-L1抗体治疗以及治疗继续进行更有可能获得有益效果的可能性，选择患者进行治疗。医学专业人员或医生可建议患者继续进行抗glycPD-L1抗体治疗方法，并且患者可根据医学专业人员或医生的建议决定进行治疗。另外，在治疗过程中，可测定患者的肿瘤或癌细胞的糖基化PD-L1的存在，作为监测治疗进展或有效性的方法。如果测定显示例如患者肿瘤或癌细胞上的糖基化PD-L1的变化、丢失或减少，则医学专业人员可以与患者一起决定是否应该继续或以某种方式(例如，更高的剂量，添加另一种抗癌剂或疗法等)改变治疗。
化学疗法
可根据本发明实施方案的治疗或治疗方法使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。此类药剂或药物根据其在细胞内的活性模式(例如，它们是否以及在何种阶段影响细胞周期以及细胞生长和增殖)分类。或者，可基于其直接交联DNA、嵌入DNA或通过影响细胞中的核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征化学治疗剂。
化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯诸如白消安、英丙舒凡和和哌泊舒凡；吖丙啶诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)、苔藓抑素；海绵多烯酮类化合物(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素；氮芥诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥；氯磷酰胺(chlorophosphamide)；雌莫司汀；异环磷酰胺；氮芥；盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)；美法仑、新氮芥、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲诸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如刺孢霉素，特别是刺孢霉素γ1和刺孢霉素ω1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关的色素蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马赛罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素诸如卡鲁睾酮、丙酸曲他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺物(anti-adrenal)诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充物诸如甲酰四氢叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；伊达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋胺；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(Ionidainine)；美登木素生物碱诸如美登素和美登木素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰胼；丙卡巴胼；PSK多糖复合物；雷佐生；利索新(rhizoxin)；细佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2’,2’-三氯三乙胺；单端孢菌毒素(特别是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形毒素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷(taxoid)，诸如紫杉醇、多西他赛吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸钠；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A，诸如维甲酸；卡培他滨；卡铂；丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白质转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)和任何上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
放射疗法
放射疗法包括利用导致DNA损伤的药剂的治疗。放射疗法已被广泛用于癌症和疾病治疗中，包括通常所知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还设想了DNA损伤因子的其它形式，诸如微波、质子束辐射(美国专利第5,760,395号和第4,870,287号)和紫外线照射。所有这些因子最有可能对DNA本身、DNA前体、DNA复制和修复以及染色体组装和维持造成广泛损害。X射线的示例性剂量范围为从持续长时间(3至4周)的50至200伦琴的日剂量至2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型、肿瘤细胞的摄取以及接受治疗的受试者的耐受性。
免疫治疗
在所述方法的一些实施方案中，免疫疗法可以与如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体的施用组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗剂通常依赖于免疫效应细胞和分子的使用来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗就是这样一个实例。其他检查点抑制剂也可以组合施用，包括伊匹木单抗。双重功能抗glycPD-L1抗体还可以与其他抗PD-1或抗PD-L1抑制剂，诸如针对PD-L1的抗体(其包括阿特珠单抗、度伐鲁单抗或阿维单抗)，或针对PD-1的抗体(包括尼沃鲁单抗、派姆单抗或匹利珠单抗(pidilizumab))组合施用。另外，实施方案的双重功能抗glycPD-L1抗体中的一种或多种可以彼此组合施用。免疫效应物可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的标志物(细胞表面蛋白质或受体)特异的抗体。单独的抗体可作为疗法的效应物，或者其可以募集其他细胞以实际实现细胞杀伤。还可将抗体缀合于药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)，以及仅用作靶向剂。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用，诸如T细胞上的PD-1/肿瘤细胞上的PD-L1相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和天然杀伤(NK)细胞。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向的标志物(蛋白质/受体)。最佳地，肿瘤标志物蛋白/受体不存在于大多数其他细胞诸如非癌细胞或正常细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些标志物中的任何一种在本实施方案的背景中都适合于用另一种药物或施用抗glycPD-L1抗体的疗法进行靶向。常见的肿瘤标志物包括例如CD20、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erbB和p155。免疫疗法的另一方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，其包括细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-12，GM-CSF，γ-IFN；趋化因子诸如MIP-1、MCP-1、IL-8；和生长因子诸如FLT3配体。
目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利第5,801,005号和第5,739,169号；Hui和Hashimoto,1998,Infection Immun.,66(11):5329-5336；Christodoulides等，1998,Microbiology,144(Pt 11):3027-3037)；细胞因子疗法，例如，αα、β和γ干扰素；IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等，1998，1998,ClinicalCancer Res.,4(10):2337-2347；Davidson等，1998,J.Immunother.,21(5):389-398；Hellstrand等，1998,Acta Oncologica,37(4):347-353))；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(24):14411-14416；Austin-Ward等，1998,Revista Medica de Chile,126(7):838-845；美国专利第5,830,880号和第5,846,945号)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012,Front.Immun.,3:3；Hanibuchi等，1998,Int.J.Cancer,78(4):480-485；美国专利第5,824,311号)。设想了一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。
手术
约60％的患有癌症的个体接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏，并且可以与其他疗法结合使用，诸如本文所述的抗-glycPD-L1抗体治疗、化学疗法、放射疗法、激素治疗、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法及其组合结合使用。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理移除。除了肿瘤切除以外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微外科手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成腔。治疗可通过用另外的抗癌疗法灌注、直接注射或局部施加于该区域来完成。可以例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复此类治疗。这些治疗也可以是不同的剂量。
蛋白质纯化
蛋白质(包括抗体，特别是抗glycPD-L抗体)纯化技术是本领域技术人员熟知的。这些技术在一个层面上涉及将细胞、组织或器官的匀浆和粗分级成多肽和非多肽级分。除非另有说明，否则可使用色谱和电泳技术进一步纯化目标蛋白质或多肽以实现部分或完全纯化(或纯化至同质)。特别适用于制备纯蛋白质或肽的分析方法是离子交换色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、羟基磷灰石色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱、免疫亲和色谱和等电聚焦。纯化肽的一种特别高效的方法是快速液相色谱(FPLC)或甚至高效液相色谱(HPLC)。如本领域通常已知的，可以改变进行各种纯化步骤的顺序，和/或可以省略某些步骤，并且仍然得到用于制备基本上纯化的多肽的合适方法。
纯化的多肽(诸如本文所述的抗glycPD-L1抗体)是指可从其他组分中分离或从其他组分中分离并相对于其天然可获得的状态纯化至任何程度的多肽。因此，分离的或纯化的多肽也指不含其天然存在于其中的环境(例如细胞、组织、器官、生物样品等)的多肽。通常，“纯化的”是指已经过分级分离以除去各种其他组分的多肽组合物，并且该组合物基本上保留其表达的生物活性。“基本上纯化的”组合物是指其中多肽形成组合物的主要组分，并因此构成组合物的蛋白质组分的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的组合物。
根据本公开，本领域技术人员已知用于定量多肽(诸如抗体蛋白质)的纯化程度的各种方法。这些方法包括，例如，确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的量。用于评估级分纯度的优选方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行比较，从而计算其中的纯度(通过“倍数纯化数”评估的)。“用于表示活性量的实际单位当然取决于选择用于纯化的特定测定技术，以及表达的多肽是否表现出可检测的活性。
一般不要求多肽总是以其最纯化的状态提供。实际上，设想了不太纯的产物在某些实施方案中可具有实用性。部分纯化可通过组合使用较少的纯化步骤，或通过使用相同的一般纯化方案的不同形式来完成。例如，应当理解，利用HPLC装置进行的阳离子交换柱色谱通常比使用低压色谱系统的同一技术产生更大的“倍数”纯化。表现出较低程度的相对纯化的方法可在蛋白质产物的总回收率或维持表达的蛋白质的活性方面具有优势。
亲和色谱是一种色谱方法，其依赖于待分离的物质(蛋白质)与其可特异性结合的分子之间的特异性亲和力(例如，受体-配体类型的相互作用)。通过将结合伴侣之一共价偶联到不溶性基质上来合成柱材料(树脂)。然后，柱材料能够特异性地从通过柱树脂的溶液中吸附物质。通过将条件改变为其中将破坏结合/不会发生结合的条件(例如，改变的pH、离子强度、温度等)来进行洗脱。基质应该是不会在很大程度上吸附分子，并且具有广泛的化学、物理和热稳定性的物质。配体应以不影响其结合特性的方式偶联。配体也应提供相对紧密的结合；然而，应该在不破坏所需样品蛋白质或配体的情况下洗脱结合的物质。
尺寸排阻色谱(SEC)是一种色谱方法，其中溶液中的分子基于其尺寸(或以更专业的术语来说，其流体力学体积)而分离。其通常应用于大分子或大分子复合物，诸如蛋白质和工业聚合物。通常，当使用水溶液将样品输送通过柱时，该技术称为凝胶过滤色谱，与之相对比的名称是凝胶渗透色谱，当将有机溶剂用作流动相时使用该名称。SEC的基本原理是不同尺寸的颗粒将以不同的速率通过固定相洗脱(过滤)，导致基于尺寸分离颗粒溶液。如果同时或几乎同时加载所有颗粒，则相同尺寸的颗粒应一起洗脱。
高效(又名高压)液相色谱(HPLC)是常用于在生物化学和分析化学中分离、鉴定和定量化合物的一种柱色谱形式。HPLC使用保持色谱填料(固定相)的柱子、使一个或多个流动相移动通过柱子的泵以及显示分子的保留时间的检测器。保留时间根据固定相、被分析的分子和所用溶剂之间的相互作用而变化。
药物制剂
当进行含有双重功能抗glycPD-L1抗体或糖基化PD-L1多肽的药物组合物的临床应用时，通常有益的是制备适合于预期应用的药物或治疗性组合物。通常，药物组合物可包含有效量的溶解或分散在药学上可接受的载体中的一种或多种多肽或其他试剂。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的多肽或抗体。在其他实施方案中，多肽或抗体可包含例如约2％至约75％的单位重量，或例如约25％至约60％，以及其间可衍生的任何范围，包括上限值和下限值。每种治疗上有用的组合物中的一种或多种活性化合物的量可以以在任何给定的单位剂量获得合适剂量的方式制备。制备此类药物制剂的领域的技术人员清楚诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑的因素，因此，各种剂量和治疗方案可以是想要的。
进一步根据某些方面，可在具有或不具有惰性稀释剂的药学上可接受的载体中提供适合施用的组合物。载体应是可同化的，并包括液体、半固体例如凝胶或糊剂，或固体载体。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或其组合。如本文中所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有含水溶剂(例如，水、醇/水溶液、乙醇、盐水溶液、肠胃外载体，诸如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯)、分散介质、包衣(例如卵磷脂)、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂)、惰性气体、对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)、等渗剂(例如，糖、氯化钠)、吸收延迟剂(例如，单硬脂酸铝、明胶)、盐、药物、药物稳定剂(例如，缓冲剂，氨基酸诸如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露醇等)、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，诸如类似材料及其组合，这对于本领域普通技术人员来说是已知的。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接受者或其中所含组合物的治疗有效性有害，否则其在用于实施该方法的可施用组合物中的用途是适合的。根据公知的参数调节药物组合物中各种组分的pH和精确浓度。根据某些方面，将组合物以任何方便和实用的方式(即通过溶液、悬浮、乳化、混合、包封、吸收、研磨等)与载体混合。此类程序对于本领域技术人员来说是常规的。
在某些实施方案中，组合物可包含不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体还是以气溶胶形式施用，以及其是否需要对施用途径(诸如注射)是无菌的。该组合物可以配制成静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、经粘膜、口服、局部、局域、通过吸入(例如，气溶胶吸入)、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、于脂质组合物(例如，脂质体)中，或通过其他方法或上述方法的任意组合，这对于本领域普通技术人员来说是已知的。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990。通常，可将此类组合物制成液体溶液或混悬液；还可制备适合用于在注射前加入液体制备溶液或混悬液的固体或可复水形式；并且，还可乳化制剂。
可将抗体配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质性质的组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如例如盐酸或磷酸)，或诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸等有机酸形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。
在另外的实施方案中，可使用包含多肽、一种或多种脂质和水性溶剂的药物脂质载体组合物。如本文中所用，术语“脂质”是指其特征在于不溶于水并且可用有机溶剂提取的广泛的物质中的任何物质。这种广泛种类的化合物是本领域技术人员所熟知的，并且如本文所用的术语“脂质”，其不限于任何特定的结构。实例包括含有长链脂族烃的化合物及其衍生物。脂质可以是天然存在的或合成的(即，由人设计或产生的)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域公知的，包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂质、糖鞘脂、糖脂、硫脂、具有醚-和酯-连接的脂肪酸的脂质、可聚合的脂质及其组合。当然，组合物和方法也包括被本领域技术人员理解为脂质的除本文具体描述的化合物之外的化合物。本领域普通技术人员熟悉可用于将组合物分散在脂质媒介物中的一系列技术。例如，可将抗体分散在含有脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价键合，作为悬浮物包含在脂质中，含有胶束或脂质体或与其复合，或者通过本领域普通技术人员已知的任何方法以其他方式与脂质或脂质结构缔合。分散可能会或可能不会导致脂质体的形成。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有结合其施用(即，适当的途径和治疗方案)经计算产生上文所述的所需反应的预定量的治疗性抗体或含有治疗性抗体的组合物。根据治疗次数和单位剂量，待施用的量取决于所需的效果。向患者或受试者施用的本发明实施方案的组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素来确定，诸如受试者的体重、年龄、健康和性别、所治疗疾病的类型、疾病渗透程度、先前或同时的治疗干预、患者的特发病、施用途径以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。在其他非限制性实例中，剂量还可包含每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重至约1000毫克/kg体重或更多，以及其中可衍生的任何范围。在可从本文所列数字导出的范围的非限制性实例中，可以基于上述数量施用约5毫克/kg体重至约100毫克/kg体重、约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重等的范围。上述剂量包括这些指定剂量之间的量，并且意图还包括范围的下限值和上限值。在任何情况下，负责施用的从业者将确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和用于个体受试者的一种或多种适当剂量。
治疗性组合物或制剂的特定性质不是限制性的。例如，可将合适的组合物与生理上可耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂和赋形剂一起于制剂中提供。在一些实施方案中，治疗制剂可以施用于哺乳动物用于兽医用途，诸如施用于家畜，以及以类似于其他治疗剂的方式在人中临床使用。通常，治疗功效所需的剂量将根据使用类型和施用方式以及个体受试者的特殊要求而变化，如上所述的。
作为生物标志物的糖基化PD-L1
提供了涉及使用至少一种双重功能抗glycPD-L1抗体在用于糖基化PD-L1的测定中用作生物标志物的用途。此类方法可用于从患有癌症或肿瘤的受试者获得的肿瘤或癌细胞的生物标志物评估。提供了确定患有癌症的受试者是否具有在此类细胞的细胞表面上表达糖基化PD-L1，特别是可检测水平的糖基化PD-L1的肿瘤或癌细胞。例如，如果测试受试者的癌症或肿瘤细胞并确定其在细胞表面上表达糖基化PD-L1，那么单独地或与另一种抗癌剂组合地使用所述抗糖基化glycPD-L1抗体治疗的受试者例如更可能会受益于该治疗。此类方法包括从患有癌症或肿瘤的受试者获得样品，使用本领域已知和使用的结合方法，在来源于受试者的癌症或肿瘤的细胞上对样品测试糖基化PD-L1的存在，或如上所述，如果发现受试者的癌症或肿瘤对糖基化PD-L1蛋白的细胞表面表达呈阳性，则向受试者单独地或与另一种抗癌剂组合地施用有效量的抗glycPD-L1抗体。在治疗之前将受试者诊断为具有表达糖基化PD-L1的癌症或肿瘤将允许更有效地治疗受试者并且对受试者有益，因为施用的抗glycPD-L1抗体更可能阻断或抑制受试者的表达糖基化PD-L1的癌症或肿瘤细胞与受试者的表达PD-1的T细胞的相互作用，从而阻止T细胞活性的免疫抑制并通过活化的T细胞杀伤促进肿瘤或癌细胞的杀伤。在一个实施方案中，该方法可涉及首先选择其癌症或肿瘤可适合于测试表达的糖基化PD-L1蛋白的存在的受试者。
类似的方法可用于在癌症治疗或疗法(包括利用抗glycPD-L1抗体和另一种抗癌药物或治疗的联合治疗)的过程中随时间推移以及在治疗停止后监测糖基化PD-L1在患者肿瘤细胞上的存在情况。此类方法还可用于伴随诊断方法使用，其中抗癌治疗方案或联合治疗涉及在治疗之前和治疗过程(例如，监测)中，测试或测定患者的肿瘤或癌症样品的表达糖基化PD-L1的肿瘤或癌细胞，以确定成功的结果或其可能性。
在其他实施方案中，可将抗glycPD-L1抗体缀合于可用于体内成像的标记物，例如放射性核素，诸如用于PET或SPECT的I124，用于光学成像的荧光染料，或用于MRI的顺磁性螯合物。可以例如通过静脉内或其他胃肠外施用模式向患者施用标记的抗glycPD-L1抗体，并且在等待适当量的时间后，检测标记的抗体的存在和位置以定位和定量肿瘤细胞。
其他药剂
设想了可将其他药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的治疗功效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞抑制和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导可以增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，可将细胞抑制剂或分化剂与本发明实施方案的某些方面组合使用，以改善治疗的抗过度增殖功效。设想了细胞粘附的抑制剂可改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)抑制剂和洛伐他汀。还设想了增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他药剂诸如抗体c225可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。
试剂盒和诊断剂
在另一个实施方案中，提供了含有治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒用于制备和/或施用涉及本文所述的抗glycPD-L1抗体的疗法。试剂盒可包含一个或多个密封的小瓶，其含有本文所述的任何药物组合物。试剂盒可包括例如至少一种抗糖基化的PD-L1抗体，以及制备、配制和/或施用一种或多种抗糖基化PD-L1抗体或进行所述方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还可包含合适的容器装置，其是不与试剂盒的组分反应的容器，例如Eppendorf管、测定板、注射器、瓶子或试管。容器可以由可消毒的材料诸如塑料或玻璃制成。
所述试剂盒还可包括说明书页，其概述了本文所述方法的程序步骤，并且将遵循与本文所述或本领域普通技术人员已知的基本相同的程序。指令信息处于包含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行时，所述机器可读指令使递送药学有效量的治疗剂的真实或虚拟程序显现。
融合体和缀合物
还可将本文提供的抗糖基化PD-L1抗体或糖基化PD-L1多肽表达为与其他蛋白质的融合蛋白质或与另一部分化学缀合的蛋白质。在一些实施方案中，抗体或多肽具有可通过同种型或亚类改变的Fc部分，可以是嵌合的或杂合的，和/或可被修饰，例如以改善效应子功能、控制半衰期或组织可及性、增强生物物理特性，诸如稳定性，并提高生产效率，这可与成本降低相关。可用于构建融合蛋白的许多修饰及其制备方法是本领域已知的，例如，如Mueller,J.P.等，1997,Mol.Immun.34(6):441-452；Swann,P.G.,2008,Curr.Opin.Immunol.,20:493-499和Presta,L.G.,2008,Curr.Opin.Immunol.,20:460-470所报道的。在一些实施方案中，Fc区是抗体的天然IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区是杂合体，例如含有IgG2/IgG4 Fc恒定区的嵌合体。对Fc区的修饰包括但不限于经修饰以防止与Fcγ受体和补体的结合的IgG4；经修饰以改善与一种或多种Fcγ受体的结合的IgG1；经修饰以使效应子功能(氨基酸变化)最小化的IgG1；具有改变的聚糖/无聚糖(通常通过改变表达宿主)的IgG1；和具有改变的对FcRn的pH依赖性结合的IgG1。Fc区可包括抗体整个铰链区，或小于整个铰链区。
另一个实施方案包括IgG2-4杂合体和IgG4突变体，其与FcR的结合降低，这增加了其半衰期。代表性IG2-4杂合体和IgG4突变体描述于例如Angal等，1993,Molec.Immunol.,30(1):105-108；Mueller等，1997,Mol.Immun.,34(6):441-452；和美国专利第6,982,323号(其全部通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，缺失IgG1和/或IgG2结构域。例如，Angal等(同上)描述了其中IgG1和IgG2结构域的丝氨酸241被脯氨酸取代的蛋白质。在一些实施方案中，涵盖了具有至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的融合蛋白或多肽。
在一些实施方案中，将抗糖基化PD-L1抗体或糖基化PD-L1多肽与至少一个部分连接或共价结合或形成复合物。这种部分可以是，但不限于，增加抗体作为诊断剂或治疗剂的功效的部分。在一些实施方案中，该部分可以是成像剂、毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸、化学治疗剂等。
在一些实施方案中，与抗glycPD-L1抗体或糖基化多肽或其部分缀合或融合的部分可以是酶，激素，细胞表面受体，毒素诸如但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)、白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒素或商陆抗病毒蛋白)、蛋白质(诸如肿瘤坏死因子、干扰素(例如α-干扰素、β-干扰素)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)或凋亡剂(例如，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β))、生物反应调节剂(诸如，例如，淋巴因子(例如，白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”))，或生长因子(例如生长激素(“GH”))、细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂，诸如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、基于微管溶素的微管抑制剂例如美登木素生物碱(Maytansinoid)，诸如美登木素生物碱DM1(N2'-脱乙酰-n2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-mayansans；mertansine或emtansine，这取决于所用的接头；和美登木素生物碱DM4(N2'-脱乙酰基-n2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-6-甲基麦角新碱；拉夫坦辛)，ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)，以及嘌呤霉素及其类似物或同源物)、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、噻替苯丁酸氮芥、美法仑、(卡莫司汀；BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))、抗有丝分裂剂和/或微管蛋白抑制剂，例如长春新碱和长春碱、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)、单甲基奥瑞斯他汀E(或去甲基-奥瑞斯他汀E)(MMAE)，例如，维多汀(vedotin)；或其组合。
抗体-药物缀合物(ADC)
抗体药物缀合物(ADC)是其中强效细胞毒性药物通过化学接头或偶联剂共价连接到抗体的生物治疗剂，所述抗体通常是单克隆抗体，其针对特定的靶抗原，特别是在肿瘤或癌细胞的表面上表达或过表达的靶抗原。此类“加载的”抗体被设计来向肿瘤或癌细胞递送致死性细胞毒性货物。ADC提供了将药物有效负载靶向肿瘤细胞同时减小副作用和最小化全身毒性的手段。ADC凭借其抗体组分与其靶抗原的特异性相互作用而与细胞表面表达的靶抗原结合。在与靶抗原结合后，ADC可被内化到细胞中，特别是当抗体具有提高的内化活性时，如本文所述的实施方案中的抗glycPD-L1抗体例如STM108和STM073一样。因此，当此类ADC被内化到细胞中时，它们直接作用以杀死细胞或靶向细胞内的分子，这导致细胞凋亡或细胞死亡。包含本文所述的抗glycPD-L1抗体，特别是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或人抗体的此类ADC，将抗体针对肿瘤和癌细胞上的糖基化PD-L1的特异性靶向与细胞毒性药物或化合物的癌症杀伤能力组合，从而为利用抗glycPD-L1抗体的治疗和疗法提供进一步有利方面。用于制备和使用ADC的技术是本领域已知的，并不意图限制于本文描述的抗glycPD-L1抗体。(参见，例如，Valliere Douglass,J.F.等，2015,Mol.Pharm.,12(6):1774-1783；Leal,M.等，2014,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1321:41-54；Panowski,S.等，2014,mAbs,6(1):34-45；Beck,A.2014,mAbs,6(1):30-33；Behrens,C.R.等，2014,mAbs,6(1):46-53和Flygare,J.A.等，2013,Chem.Biol.Drug Des.,81(1):113-121)。在一些实施方案中，可将上述部分的一些或全部(特别是毒素和细胞毒素)与抗glycPD-L1抗体缀合，以产生用于治疗癌症的有效ADC。在一些实施方案中，ADC的抗glycPD-L1抗体组分可以是双特异性、多特异性、双互补位或多互补位抗体。
用于将治疗剂或细胞毒性部分与抗体缀合的技术是公知的；参见，例如，Amon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,inMONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Reisfeld等(编辑),1985，第243-56页，Alan R.Liss,Inc.)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”,in CONTROLLEDDRUG DELIVERY(第2版),Robinson等，(编辑),1987，第623-53页，Marcel Dekker,Inc.)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,inMONOCLONAL ANTIBODIES'84:BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS,Pinchera等(编辑),1985，第475-506页)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in MONOCLONALANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY,Baldwin等(编辑),1985，第303-16页，Academic Press；Thorpe et al.,Immunol.Rev.62:119-158(1982)；Carter等，CancerJ.14(3):154-169(2008)；Al ley等，Curr.Opin.Chem.Biol.14(4):529-537(2010)；Carter等，Amer.Assoc.Cancer Res.Educ.Book.2005(1):147-154(2005)；Carter等，Cancer J.14(3):154-169(2008)；Chari,Acc.Chem Res.41(1):98-107(2008)；Doronina等，Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003)；Ducry等，Bioconjug Chem.21(1):5-13(2010)；Senter,Curr.Opin.Chem.Biol.13(3):235-244(2009)和Teicher,Curr Cancer DrugTargets.9(8):982-1004(2009)。关于ADC和ADC肿瘤学产品的综述见于Lambert,BritishJ.Clin.Pharmacol.,76(2):248-262(2013)和Bouchard等，Bioorganic&MedicinalChemistry Letters,24:5357-5363(2014)中。
在一些具体的实施方案中，通常通过具有不稳定键的化学接头将促进PD-L1内化到肿瘤细胞中的抗glycPD-L1抗体与高效生物活性药物或药剂(诸如细胞毒素和/或化学治疗剂，如上所述的毒素或细胞毒素，或放射性核素)缀合，以产生抗glyc PD-L1抗体-药物缀合物(ADC)(在本文中称为抗glyc PD-L1抗体-ADC)。例如，生物活性药物或细胞毒性剂用作“细胞毒性有效负载”，其被递送到细胞中，特别是表达由抗glycPD-L1抗体-ADC结合的细胞表面靶受体或分子的肿瘤或癌细胞。此类与其靶分子结合的抗glycPD-L1抗体-ADC被内化到细胞中，在所述细胞中释放细胞毒性药物有效负载。通过与高效细胞毒性有效载荷缀合增强本文所述的内化性抗glycPD-L1抗体的癌细胞杀伤活性提供了具有高抗肿瘤活性和被良好耐受的通常轻微的不利效应的抗癌ADC生物制剂。
如本文实施方案中所述的抗glycPD-L1抗体可以与本领域已知和使用的或有待商业化的各种类型的细胞毒性或DNA作用性有效负载连接。例如，美坦辛是最早从埃塞俄比亚灌木卵叶美登木(Maytenus ovatus)的树皮中分离出来的benzoansamacrolide。该细胞毒性剂及其衍生物(例如美登木素生物碱)在长春花生物碱结合部位附近与微管蛋白结合。它们被认为对位于微管末端的微管蛋白具有高亲和力，对分布在整个微管中的位点具有较低的亲和力。抑制微管动力学导致细胞停滞在细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡引起的细胞死亡。(Oroudjev等，Mol.Cancer Ther.,10L2700-2713(2010))。两种美坦辛衍生物(含巯基的美登木素生物碱)包括DM1和DM4(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)已广泛用于与不可逆的和可逆的接头组合。特别地，通过硫醚接头与抗体连接的DM1称为“emtansine”；通过SPP接头与抗体连接的DM1称为“mertansine”；通过SPDB接头连接的DM4称为“ravtansine”；通过sSPDB接头连接的DM4称为“soravtansine”(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体-ADC包含微管蛋白作用性美登木素生物碱有效负载DM1。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体-ADC包含微管蛋白作用性美登木素生物碱有效负载DM4。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体-ADC包含DNA作用性有效负载，例如DGN462(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体-ADC的抗glycPD-L1抗体组分是STM073，或其结合部分。在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体-ADC的抗glycPD-L1抗体组分是STM108或其结合部分。
在一个特定实施方案中，与抗glycPD-L1抗体缀合的细胞毒性剂是MMAE(单甲基奥瑞斯他汀E(或去甲基-奥瑞斯他汀E))，一种高毒性的抗肿瘤剂，其抗有丝分裂活性涉及通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂。维多汀(一种国际非专利名称)是指MMAE加上其与MMAE-抗体缀合物中抗体的连接结构。在更特定的实施方案中，ADC是STM073-MMAE或STM108-MMAE。
许多化学接头是已知的并被用于将细胞毒性或DNA作用性药物有效负载与抗体缀合以产生ADC。包含来单独地或组合地用于产生包含抗glycPD-L1抗体(特别是如本文所述的在结合其靶标后内化的那些抗体)的ADC的某些接头，包括SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)；SPDB(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯)；SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶二硫基)戊酸酯)；磺基-SPDB或sSPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2--吡啶二硫基)-2-磺基丁酯)；硫醚接头琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)和vc(缬氨酸-瓜氨酸二肽接头)。举例来说，工程化接头(诸如，SMCC、SPDB、S-SPDB)(Immunogen,Inc.)已被设计成在ADC与肿瘤结合之前是稳定的，然后一旦ACD被内化至癌细胞内后就优化有效负载效力。其他接头，诸如二肽vc接头(其是组织蛋白酶可切割的接头)可用于将抗体缀合于细胞毒性剂，诸如奥瑞斯他汀，其是源自多拉司他汀10的有丝分裂抑制剂，诸如单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)，诸如，维多汀。可将细胞毒素与抗体缀合，使得不止一个毒素分子附接于每个抗体分子，诸如，每个抗体平均可以有2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个毒素分子。
在一个特定实施方案中，MMAE通过马来酰亚胺己酰基(MC)附接基团与抗体半胱氨酸间接连接，所述附接基团与缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基-MMAE偶联(MC-vc-PAB-MMAE)。在“MC-vc-PAB-MMAE”线性结构中，“MC”由马来酰亚胺和己酸组成，并且是通常通过H链上的半胱氨酸基团附接于抗体的部分。反过来，“MC”附接于“vc”接头，该接头由缬氨酸(Val)和瓜氨酸(Cit)组成，并且是组织蛋白酶可切割的接头，其被肿瘤或癌细胞内的组织蛋白酶切割。“vc”附接于间隔子“PAB”(即对氨基苯甲酸)，其与MMAE细胞毒素连接。MC-vc-PAB-MMAE ADC在被蛋白酶诸如组织蛋白酶B切割时释放游离的膜可渗透性MMAE。在一个实施方案中，抗体的接头在细胞外流体中是稳定的，但一旦ADC进入肿瘤或癌细胞，就被组织蛋白酶切割，从而激活MMAE或其他毒素药物的抗有丝分裂机制。在另一个实施方案中，单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)通过马来酰亚胺己酰基(MC-MMAF)与抗体半胱氨酸连接。与MC-vc-PAB-MMAE ADC相反，MC-MMAF ADC是不可切割的，如MCC-DM1 ADC一样，必须被内化并在细胞内降解，在细胞内释放半胱氨酸-MC-MMAF作为活性药物。
在一个实施方案中，在将ADC内化到细胞中后，细胞毒性有效负载在溶酶体中释放。在溶酶体中，溶酶体酶消化ADC的抗体组分。在溶酶体降解后，药物(和药物-接头)有效负载被释放到细胞质中，在所述细胞质中药物结合细胞内靶标，最终导致细胞死亡。最佳地，释放的有效负载具有完全活性，仍然与接头附接。在与ADC结合的靶标导致至溶酶体的运输不佳的其他实施方案中，在靶细胞外稳定、但一旦在细胞内部就从抗体组分切割有效负载的接头提供了用于在细胞内但在溶酶体外释放有效负载的替代模式。在其他实施方案中，接头在细胞外流体中是稳定的，但一旦ADC已进入肿瘤或癌细胞就被组织蛋白酶切割，从而激活毒素药物的抗有丝分裂或其他细胞毒性机制。在其他实施方案中，通过可切割接头的作用释放的有效负载能够进入邻近的癌细胞并通过旁观者效应杀死它们，从而增强ADC的靶向和肿瘤杀伤活性。
在一个实施方案中，将本文所述抗glycPD-L1抗体(诸如双重功能STM073或STM108Mab)通过接头SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)偶联至DM1。在另一个实施方案中，将本文所述的抗glycPD-L1抗体诸如STM073或STM108通过接头SPDB(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯)或sSPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶二硫基)-2-磺基丁酸酯)偶联至DM4。在另一个实施方案中，将奥瑞斯他汀单甲基奥瑞斯他汀E通过马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(MC-vc-PAB-MMAE)与本文所述的抗glycPD-L1抗体(诸如STM073或STM108)的半胱氨酸残基连接。在一个特定的实施方案中，所述ADC是STM108-MC-vc-PAB-MMAE。在另一个特定的实施方案中，所述ADC是STM073-MC-vc-PAB-MMAE。
在一个实施方案中，抗glycPD-L1抗体-ADC每分子包含多个单位的药物(诸如MMAE)，诸如每分子包含1-10个、1-5个、2-5个、3-5个或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个(以及其间的值)单位的药物，诸如MMAE。在其他实施方案中，抗体-药物比率可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，以及2与10之间的范围和其间的值。在一些实施方案中，STM108或STM073抗体是双特异性、多特异性、双互补位或多互补位抗体，或其抗原结合部分。包含如本文所述的双重功能抗glycPD-L1抗体的此类ADC，例如上述STM108-MC-vc-PAB-MMAE，在杀死肿瘤和癌细胞以进行癌症治疗方面提供了已证实的和多方面的抗肿瘤作用。仅作为几个说明性的有利方面，抗人glycPD-L1抗体(例如MAb)-ADC，例如STM108-ADC，可阻断PD-1/PD-L1相互作用，从而增强针对肿瘤细胞的T细胞免疫力和效应子功能；其可以选择性地靶向肿瘤和癌细胞上表达的糖基化PD-L1；其可以在结合后内化肿瘤或癌细胞上的PD-L1，从而减少肿瘤或癌细胞上表面表达的PD-L1，并进一步降低PD-L1的致癌潜力；其可引起抗体已被内化于其中的肿瘤或癌细胞的细胞凋亡，并且毒性药物被释放以破坏并最终杀死细胞；并且其可通过从凋亡的肿瘤或细胞中释放毒性药物来杀死附近或邻近的肿瘤或癌细胞，从而促进旁观者效应。
在一些实施方案中，可将如本文所述的抗体与标记物(诸如肽)缀合，以促进纯化。在一些实施方案中，标记物是六组氨酸肽(SEQ ID NO:93)，即血凝素“HA”标签，其对应于源自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson,I.A.等，Cell,37:767-778(1984))或“flag”标签(Knappik,A.等，Biotechniques 17(4):754-761(1994))。
在其他实施方案中，与本文所述的抗体和多肽缀合的部分可以是可在测定中被检测到的成像剂。此类成像剂可以是酶、辅基、放射性标记物、非放射性顺磁性金属离子、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、生物发光分子、光亲和分子，或有色颗粒或配体诸如生物素。在一些实施方案中，合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物包括但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料包括但不限于伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料包括但不限于鲁米诺；生物发光材料包括但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性物质包括但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属，以及非放射性顺磁金属离子。
可使用本领域已知的技术将成像剂直接地或通过中间体(诸如，例如，本领域已知的接头)间接地与本文所述的抗体或多肽缀合。参见，例如，美国专利第4,741,900号，其报道了可以与本文所述的抗体和其他分子缀合以用作诊断剂的金属离子。一些缀合方法涉及使用附接于抗体的金属螯合络合物，所述金属螯合络合物采用诸如有机螯合剂，诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3,6α-二苯基甘脲-3。单克隆抗体也可以在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐/酯存在的情况下与酶反应。可在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备具有荧光素标记物的缀合物。
在一些实施方案中，可将如本文所述的抗glycPD-L1抗体或glycPD-L1多肽与第二抗体缀合以形成抗体异源缀合物，例如，如美国专利第4,676,980号中所述的。此类异源缀合物抗体可以另外地与半抗原(例如，荧光素)结合，或与细胞标志物(例如，但不限于4-1-BB、B7-H4、CD4、CD8、CD14、CD25、CD27、CD40、CD68、CD163、CTLA4、GITR、LAG-3、OX40、TIM3、TIM4、TLR2、LIGHT、ICOS、B7-H3、B7-H7、B7-H7CR、CD70、CD47)、或与细胞因子(例如，IL-7、IL-15、IL-12、IL-4TGF-β、IL-10、IL-17、IFNγ、Flt3、BLys)或趋化因子(例如，CCL21)结合。
在一些实施方案中，还可将本文所述的抗糖基化PD-L1抗体或糖基化PD-1多肽附着于固体支持物，其可用于进行靶抗原或其它分子的免疫测定或纯化，所述其它分子能够与已被固定于所述支持物的靶抗原(通过与本文所述的抗体或抗原结合片段的结合)结合。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
实施例
包括以下实施例以证明涉及与未糖基化的PD-L1和/或PD-L1糖基化突变体相比而优先与糖基化PD-L1结合的双功能抗glycPD-L1抗体和本文所述的使用方法的实施方案。代表性的双重功能抗glycPD-L1抗体是示例性的。本领域技术人员应理解，所公开的双重功能抗glycPD-L1抗体是实例，而不是限制性的。
实施例1材料和方法
细胞培养、稳定转染子和转染。所有细胞均获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。将这些细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12或RPMI 1640培养基中生长。使用嘌呤霉素(InvivoGen,San Diego,CA,USA)选择MDA-MB-468、BT549和293T细胞中的PD-L1稳定转染子。对于瞬时转染，使用SN脂质体(Hu,M.C.等，2004,Cell,117:225-237)和lipofectamineTM 2000(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)用DNA(诸如编码PD-L1的DNA)瞬时转染细胞。
使用慢病毒感染产生稳定细胞。用于敲低细胞中PD-L1表达(Shen,J.等，2013,Nature,497:383-387)的基于慢病毒的shRNA(pGIPZ质粒)购自shRNA/ORF Core Facility(UT MD Anderson Cancer Center)。基于MDA-MB-231或A431细胞中PD-L1蛋白表达的敲低效率，本发明人选择了两个shPD-L1克隆用于该研究。成熟反义序列如下：TCAATTGTCATATTGCTAC(shPD-L1#1,SEQ ID NO:34),TTGACTCCATCTTTCTTCA(shPD-L1#5,SEQID NO:35)。通过使用pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1双重表达构建体敲低内源性PD-L1并同时重建Flag-PD-L1，本发明人建立了内源性PD-L1敲低和Flag-PD-L1 WT或4NQ突变体表达细胞系。为了产生表达针对PD-L1和Flag-PD-L1的shRNA的慢病毒，本发明人用pGIPZ-非沉默(用于载体对照病毒)、pGIPZ-shPD-L1或pGIPZ-shPD-L1/PD-L1WT或pGIPZ-shPD-L1/PD-L14NQ突变体使用FuGENE 6转染剂转染了293T细胞。转染后24小时，更换培养基，然后以24小时的间隔收集培养基。将收集的含有慢病毒的培养基离心以消除细胞碎片，并通过0.45-μm过滤器过滤。在感染前12小时以50％汇合接种细胞，并用含有慢病毒的培养基替换培养基。感染24小时后，用新鲜培养基替换培养基，用1μg/ml嘌呤霉素(InvivoGen)选择感染细胞。
质粒。从shRNA/OR Core Facility(UT MD Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)获得人PD-L1克隆，并使用已知的分子生物学技术将其克隆到pCDH慢病毒表达载体中以建立PD-L1-Flag或PD-L1-Myc表达细胞系。另外，还将人PD-L1核酸克隆到pEGFP-N1和pCMV-HA哺乳动物细胞表达载体中以用于瞬时转染。使用pCDH/PD-L1-Flag表达载体作为模板，通过使用下表4中所示的引物进行定点诱变，产生PD-L1-Flag NQ突变体N35Q、N192Q、N200Q、N219Q和4NQ(N35Q/N192Q/N200Q/N219Q)。为了产生pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1双重表达构建体以敲低内源性PD-L1并同时重建Flag-PD-L1，选择靶向PD-L1 mRNA的3’-UTR区的shPD-L1构建体(shPD-L1#5)。将Flag-PD-L1野生型(WT)或4NQ突变体DNA克隆到pGIPZ-shPD-L1(Thermo Scientific,Pittsburgh,PA,USA)中，其表达对内源性PD-L1特异性的shRNA。使用酶消化和DNA测序确认所有构建体。
表4.用于定点诱变的引物
进行qRT-PCR测定以测量mRNA的表达(Shen等，2013,Nature,497:383-7和Chang等，2011,Nature Cell Biology,13:317-23)(见下表5)。用PBS洗涤细胞两次，并立即在QIAzol中裂解。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)对裂解的样品进行总RNA提取。为了测量mRNA的表达，根据制造商的说明书，使用随机六聚体(LifeTechnologies)，通过SuperScript III First-Strand cDNA合成系统从1μg纯化的总RNA合成cDNA。使用实时PCR仪(iQ5,BioRad,Hercules,CA,USA)进行qPCR。使用比较Ct方法进行所有数据分析。首先将结果针对内部对照β-肌动蛋白mRNA进行标准化。
表5.用于qRT-PCR的引物
抗体和化学品。以下抗体用于实施例中描述的实验：Flag(F3165；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)；Myc(11667203001；Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,USA)；HA(11666606001；Roche Diagnostics)；PD-L1(13684；Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)；PD-L1(329702；BioLegend,San Diego,CA,USA,)；PD-L1(GTX117446；GeneTex,Irvine,CA,USA)；PD-L1(AF156；R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)；PD-1(ab52587；Abcam,Cambridge,MA,USA)；B3GNT3(ab190458；Abcam)；B3GNT3(18098-1-AP；Proteintech,Chicago,IL,USA)；粒酶B(ab4059；Abcam)；EGFR(4267；Cell SignalingTechnology)；α-微管蛋白(B-5-1-2；Sigma-Aldrich)和β-肌动蛋白(A2228；Sigma-Aldrich)。为了在实验中使用，表皮生长因子(EGF)、环己酰亚胺和衣霉素购自Sigma-Aldrich。吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗和AG1478获自Calbiochem Corp(Billerica,MA,USA)。
免疫印迹分析和免疫细胞化学和免疫沉淀。如前所述(Lim等，2008,Gastroenterology,135:2128-40和Lee等，2007,Cell,130:440-455)进行免疫印迹分析。使用红外成像系统(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE,USA)进行条带强度的图像获取和定量。对于免疫沉淀，将细胞在缓冲液(50mM Tris·HCl，pH 8.0,150mM NaCl，5mM乙二胺四乙酸(EDTA)和0.5％Nonidet P-40(NP-40))中裂解并以16,000x g离心30分钟去除碎片。将澄清后的裂解物用抗体进行免疫沉淀。对于免疫细胞化学，将细胞在室温下在4％低聚甲醛中固定15分钟，在5％Triton X-100中透化5分钟，然后用一抗染色。使用的二抗是抗小鼠Alexa Fluor 488或594染料缀合物和/或抗兔Alexa Fluor 488或594染料缀合物(Life Technologies)。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI蓝)(Life Technologies)染色。固定后，使用多光子共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss,Thornwood,NY,USA)使细胞可视化。
PD-L1和PD-1(PD-L1/PD-1)相互作用测定。为了测量PD-1蛋白与PD-L1蛋白的相互作用，将细胞在室温下于4％低聚甲醛中固定15分钟，然后用重组人PD-1-Fc嵌合蛋白(R&DSystems)孵育1小时。使用的二抗是抗人Alexa Fluor 488染料缀合物(LifeTechnologies)。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI蓝)(Life Technologies)染色。然后使用微量板读数器Synergy Neo(BioTeK,Winooski,VT,USA)测量Alexa Fluor 488染料的荧光强度并将其针对总蛋白质量的强度进行标准化。为了拍摄图像，在固定后，使用共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss)使细胞可视化。
共培养实验和IL-2表达测量。如前所述进行Jurkat T细胞和肿瘤细胞的共培养以及IL-2表达测量(Sheppard，KA等，2004,FEBS letters,574:37-41)。为了分析肿瘤细胞对T细胞失活的影响，将肿瘤细胞与表达人PD-1的活化的Jurkat T细胞共培养，所述活化的Jurkat T细胞用Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)激活。将以5:1(Jurkat:肿瘤细胞)比例的共培养物孵育12或24小时。如制造商(Human IL-2ELISA试剂盒，Thermo Scientific)所述测量培养基中分泌的IL-2水平。
PD-L1的糖基化分析。为了证实PD-L1蛋白的糖基化，如制造商所述，用酶PNG酶F、Endo H、O-糖苷酶(New England BioLabs,Ipswich,MA,USA)处理细胞裂解物。为了对糖基化PD-L1蛋白进行染色，如制造商所述，使用Glycoprotein Staining试剂盒(Peirce/Thermo Scientific)对纯化的PD-L1蛋白进行染色。
人乳腺肿瘤组织样品的免疫组织化学染色。免疫组织化学(IHC)染色如前所述进行(Lee等，2007,Cell,130:440-455；Lo等，2007,Cancer Research,67:9066-9076；Chang,C.J.等，2011,Cancer cell,19:86-100)。简言之，将组织样本与针对PD-L1、EGFR、B3GNT3或粒酶B的抗体和缀合有生物素的二抗一起孵育，然后与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物一起孵育。使用氨基-乙基咔唑色原体进行可视化。对于统计分析，使用Fisher精确检验和Spearman种、相关系数；p值小于0.05被认为是统计学显著的。根据组织学评分，染色强度分为四组：高(得分3)、中(得分2)、低(得分1)和阴性(得分0)。
N-糖肽的鉴定。用10mM二硫苏糖醇(DTT)在37℃下还原纯化的His标记的PD-L1蛋白1小时，用于25mM碳酸氢铵缓冲液中的50mM碘乙酰胺在室温下于黑暗中烷基化1小时，然后在37℃下，用测序级胰蛋白酶以1:50的酶比底物比率处理过夜。然后将消化的产物用甲酸稀释至0.1％的最终浓度，并在LC-MS/MS分析之前通过ZipTip C18(Millipore)进一步净化。LC-MS/MS数据在IBC的Academia Sinica Mass Spectrometry Facility获得。通过纳米喷雾(nanospray)LC-MS/MS在Orbitrap Fusion Tribrid(Thermo Scientific)上分析肽混合物，所述Orbitrap Fusion Tribrid耦合至具有捕获柱Acclaim PepMap 100(2cm x 100μm i.d)(Dionex)的UltiMate 3000RSLCnano系统(Dionex)。将肽混合物加载到AcclaimPepMap RSLC 25cm×75μm i.d.柱(Dionex)上，并使用5％至35％溶剂B(100％乙腈和0.1％甲酸)的梯度以500nL/分钟的流速分离，持续60分钟。溶剂A是0.1％甲酸水溶液。用于在HCD下并行CID模式的MS和MS/MS数据采集的参数是：具有3秒循环时间的最高速模式；FTMS：扫描范围(m/z)＝400-2000；分辨率＝120K；AGC目标＝2x105；最大注射时间(ms)＝50；FTMSn(HCD)：隔离模式＝四极杆；隔离窗口＝1.6；碰撞能量(％)＝30，阶梯碰撞能量为5％；分辨率＝30K；AGC目标＝5x104；最大注射时间(ms)＝60；ITMSn(CID)：隔离模式＝四极杆；隔离窗口＝1.6；碰撞能量(％)＝30；AGC目标＝1x104。通过Proteome Discoverer 1.4将原始数据转换为Mascot通用格式(MGF)。对于糖肽鉴定，使用Byonic(2.0-25版)，利用以下搜索参数搜索HCD MS2数据：肽耐受性＝2ppm；片段耐受性＝6ppm；漏切割(missed cleavages)＝1；修饰：氨基甲酰基甲基半胱氨酸(固定的)、甲硫氨酸氧化(常见2)、N处脱酰胺(罕见1)。通过组合HCD与CID MS2结果手动进一步检查Byonic建议的糖肽命中。
统计分析。柱状图中的数据表示3个独立实验的相对于未处理组或对照组的平均倍数变化和标准偏差。使用SPSS(Ver.20,SPSS,Chicago,IL)进行统计学分析。使用Spearman相关和Mann-Whi tney检验分析蛋白质表达与BLBC亚群之间的相关性。对实验数据进行学生t检验。P值<0.05被认为在统计学上显著。
实施例2：PD-L1蛋白表达分析
为了阐明PD-L1的潜在机制，在人肿瘤组织和癌细胞系中检查了PD-L1的蛋白质表达。图1A和1B以及图3A-3D通过Western印迹分析说明肺癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌细胞系中的蛋白质表达；图4A显示了不同PD-L1抗体对细胞中PD-L1蛋白的结合。观察到大多数PD-L1蛋白在～45kDa(黑色圆圈)处被检测到，但是较小的级分也在33kDa处出现(黑色箭头)。通过靶向编码序列(shPD-L1#1)或3'UTR(shPD-L1#5)的慢病毒短发夹RNA(shRNA)敲低PD-L1下调了PD-L1的33-和45-kDa形式的表达(图4B)。PD-L1的重建恢复了shPD-L1#5克隆中两种形式的表达(图1C；图4C显示了载体设计)。这些结果显示Western印迹上的两个条带均为PD-L1蛋白，并且PD-L1的较高分子量形式表明翻译后修饰。
如对较高分子量(～45kDa)的PD-L1所观察到的，糖基化蛋白质经常在Western印迹中产生异质模式。为了测试对于PD-L1观察到的糖基化模式是否对应于所述糖基化形式，用重组糖苷酶(肽-N-糖苷酶F；PNG酶F)处理MDA-MB 231和HeLa细胞以除去N-聚糖结构，然后进行Western印迹分析。如图4D所示，在PNG酶F处理后，相当大部分的45-kDa PD-L1被还原成PD-L1的33-kDa形式。一致地，在纯化的His-标记的PD-L1中观察到聚糖结构的阳性染色，但在PNG酶F存在的情况下未观察到该阳性染色(图1D)。这些结果表明，PD-L1的较高分子量确实是PD-L1蛋白的糖基化形式。
为了概括PD-L1蛋白在细胞中的表达，产生各种过表达构建体以模拟蛋白质的内源表达。为了避免在N-末端信号肽处可能的切割，在N-或C-末端融合不同的标签序列(图5A和5B，在印迹上方)。与内源性PD-L1表达分析的结果相似，所有GFP-、HA-、Flag-或Myc-标记的PD-L1的瞬时转染在Western印迹上与其实际大小偏离～15kDa的分子量(图1E和5A和5B)。与去除PD-L1蛋白上的所有N-聚糖结构的PNG酶F处理相反，添加重组糖苷酶即内切糖苷酶H(Endo H)，仅部分减少了PD-L1糖基化，表明复杂类型的N-连接的聚糖结构(含有高甘露糖和杂合类型)以优势存在于PD-L1上。此外，当用N-连接的糖基化抑制剂衣霉素(TM)处理细胞时PD-L1的糖基化被完全抑制(图1F和5A-5D)，而用O-糖苷酶处理细胞时则没有(图5E)。总之，这些结果表明PD-L1在测试的细胞中被广泛地N-连接糖基化(Heifetz,A等，1979,Biochemistry,18:2186-2192)。
实施例3糖基化分析
使用两种PD-L1特异性抗体(抗PD-L1和抗-hB7-H1)的Western印迹分析表明PD-L1糖基化发生在其细胞外结构域(ECD，被抗-hB7-H1识别)而不在其细胞内结构域(ICD，被抗PD-L1识别)(图1F和5C)。为了确定糖基化位点，进行了来自不同物种的PD-L1氨基酸序列的序列比对，以寻找进化上保守的NXT基序，即共有的N-糖基化识别序列(Schwarz,F.等，2011,Current opinion in structural biology,21:576-582)。与早先的预测(Cheng等，2013,JBC,288:11771-85)和Vigdorovich等，2013,Structure,21:707-17)一致，鉴定了四个NXT基序(图1G以及图6A和6B)。为了确认这些序列是否确实被糖基化，通过纳米LC-MS/MS分析纯化的人PD-L1的胰蛋白酶肽。对于4个N-糖基化位点中的每一个，鉴定了携带复杂类型N-聚糖的糖肽(图7A-7H)，与对Endo H处理的表观抗性一致(图1E)。产生一系列天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)的取代以确定PD-L1蛋白上的特定糖基化位点。与WT PD-L1相比，所有四种突变体N35Q、N192Q、N200Q和N219Q均表现出一定程度的糖基化减少(图1H，泳道2、3、4和5)。对于三种非NXT NQ PD-L1突变体，未观察到糖基化的可检测差异(图1H，泳道11、12和13)。另外，在PD-L1 4NQ变体中完全消除了PD-L1糖基化，其中所有四个天冬酰胺被突变为谷氨酰胺，如由缺乏对应于45kDa处的糖基化形式的信号所示(图1H，泳道10(4NQ)和泳道14(WT))。基于PD-1/PD-L1复合物的晶体结构(Lin，DY等，2008,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,105:3011-3016)，PD-L1的这四个糖基化位点(N35、N192、N200和N219)暴露在蛋白质表面上。根据预测，PD-L1糖基化位点(PD-L1 4NQ)的突变不影响整体结构。这些结果表明，PD-L1仅在细胞中作为N-糖基化糖蛋白存在，并且所有四个NXT基序都被糖基化。
观察到的糖基化PD-L1的水平显著高于PD-L1蛋白的非糖基化形式(图1A和1B以及5C和5D)。基于该发现，本发明人研究了糖基化是否稳定PD-L1蛋白。为此，在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)存在的情况下测量蛋白质周转率，以测定糖基化对PD-L1蛋白质稳定性的影响。Flag-标记的PD-L1的周转率在衣霉素(TM)处理的HEK 293T细胞中比在DMSO处理的HEK 293T细胞中快得多(图2A；8A和8B)。对于A431细胞中的内源性PD-L1观察到类似的结果(图8C)。在MG132对蛋白酶体的抑制下，非糖基化PD-L1的水平在12小时内稳定升高(图2B)。一致地，非糖基化PD-L1 4NQ快速降解，半衰期短至4小时(图2C)，与非糖基化PD-L1 WT的半衰期相似(图2A)，表明糖基化受损导致通过26S蛋白酶体的PD-L1降解。
实施例4PD-L1的结合亲和力
在癌症进展期间，PD-L1是通过其与PD-1结合起作用的关键免疫抑制剂(Okazaki，T.等，2013,Nature immunology,14:1212-1218.)。因此，比较WT PD-L1与糖基化缺陷突变体PD-L1对PD-1的结合亲和力。PD-L1 WT和4NQ突变体PD-L1在MDA-MB-468和HEK-293T细胞中稳定表达，并且选择具有相似量的PD-L1 WT和4NQ表达的稳定克隆，然后将其与重组PD-1/Fc融合蛋白一起孵育，然后加入抗人IgG(Fc特异性)荧光缀合物以用于信号放大(Cheng,X.等，2013,The Journal of biological chemistry,288:11771-11785)(图8D)。虽然糖基化与非糖基化PD-L1之间的膜定位没有显著变化(图8E(共聚焦图像)和图8F(生物素化下拉))，在用或不用TM处理的稳定转染子之间在细胞膜上的PD-1结合方面观察到显著差异(图2D，右侧显示量化图)。此外，通过TM处理消除PD-L1糖基化或4NQ突变体的表达降低了PD-L1与PD-1的缔合(图2E和8G)。体外结合实验还证明了PD-L14NQ/PD-1/Fc相互作用的丧失，表明PD-L1的糖基化增强了其与PD-1的缔合(图2F)。由于免疫抑制活性与涉及细胞毒性T细胞的细胞间相互作用相关，因此进行共培养实验以测量IL-2表达水平，这是在暴露于PD-L1稳定克隆后Jurkat T细胞中被PD-L1与PD-1的相互作用抑制的T细胞免疫反应的指标(Yang,W等，2008,Investigative ophthalmology&visual science,49:2518-2525)(图8H)。一致地，PD-L1糖基化的丧失损害了其与PD-1的相互作用并增强了可溶性IL-2的释放(图2G)。这些结果表明，PD-L1糖表型的完整性是其免疫抑制功能所必需的。
实施例5PD-L1糖表型的功能性
PD-L1 WT和4NQ突变体在内源性PD-L1耗尽的MDA-MB-468和BT549细胞中稳定表达。使用这些细胞系，分析PD-1和PD-L1结合亲和力。如所显示的，糖基化变体PD-L1 4NQ与PD-1之间的缔合减少(图9A)。体外结合实验进一步证明了PD-L1与PD-1的缔合需要糖基化(图9B)。通过将表达BT549 PD-L1 WT和PD-L1 4NQ的稳定细胞系与人原代T细胞共培养(随时间的显微镜检查)，体外测量T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。与PD-1结合的丧失一致，PD-L14NQ稳定细胞系显示出更多T细胞介导的癌细胞杀伤(图9C)。另外，在同基因4T1小鼠模型中体内测量PD-L1的免疫抑制功能，在所述小鼠模型中在已接受表达PD-L1 WT或PD-L1 4NQ的4T1细胞的BALB/c小鼠中测量肿瘤生长。与具有表达PD-L1 WT的细胞的小鼠相比，具有表达PD-L1 4NQ的细胞的小鼠显示出肿瘤尺寸减小和更多活化的细胞毒性T细胞(图9D和9E)。总之，这些数据表明PD-L1糖基化的丧失损害了其与PD-1的相互作用，并削弱了PD-1/PD-L1相互作用使肿瘤细胞逃避T细胞免疫监视的能力。因此，其中PD-L1是非糖基化的或异常糖基化的肿瘤细胞提供了易于被功能性效应T细胞杀死的靶标。这种通过其膜表达的PD-L1的糖基化受损而阻止或阻断肿瘤细胞逃避T细胞免疫监视的机制进一步证实了PD-L1糖表型的完整性是其免疫抑制功能所必需的。
另外，使用如上所述的同基因4T1 BALB/c小鼠模型来确定在16天的动物研究期期间代表性双重功能抗体(即STM073)对动物内的肿瘤生长(即，免疫抑制功能)的影响。简言之，在该研究中，动物在第0天接受表达野生型(糖基化的)PD-L1的4T1细胞(1x105个4T1细胞)。在此后的第3、5、7、9、11和13天，通过注射用STM073MAb(100μg)或IgG对照抗体(100μg)处理4T1-动物。在治疗期间，评估动物的死亡率和肿瘤体积。图9F提供显示用STM073(“73”)MAb处理的小鼠中的肿瘤体积与对照动物中的肿瘤体积相比可测量地更小的盒图。
实施例6：结合糖基化PD-L1的单克隆抗体的产生
通过按照标准化方案将SP2/0鼠骨髓瘤细胞与分离自经人PD-L1免疫的BALB/c小鼠(n＝6)(Antibody Solution,Inc.)的脾细胞融合，获得产生针对糖基化人PD-L1产生的单克隆抗体的杂交瘤。在融合之前，使用FACS分析验证来自免疫小鼠的血清与PD-L1免疫原的结合。产生产生单克隆抗体(MAb)的杂交瘤并且所有MAb的同种型是IgG1。再次对产生抗体的杂交瘤测试特异性。
为了鉴定相较于非糖基化PD-L1而言对糖基化PD-L1抗原特异并且优先与其结合的抗glycPD-L1 MAb(即，糖基化PD-L1特异性MAb)，进行了不同类型的测定。在检测MAb与糖基化PD-L1的优先结合的筛选测试中，基于通过FACS分析(使用细胞膜结合蛋白)测量荧光强度来确定抗体结合。举例来说，使用BT549人乳腺癌细胞系进行测定。说明性地，根据常规方法用生物素标记过表达PD-L1 WT(完全糖基化的)的BT549细胞，然后与过表达PD-L1 4NQ(完全未糖基化的PD-L1变体)的BT549细胞混合。将混合细胞与抗PD-L1抗体例如抗glycPD-L1抗体一起孵育，然后与作为检测剂的缀合有FITC的二抗进一步孵育。洗涤后，通过FACS/流式细胞术分析测量荧光强度(测量的荧光强度，MFI)以评估抗PD-L1抗体与膜结合的PD-L1 WT(在细胞上)或4NQ PD-L1(在细胞上)的相对结合。选择在WT PD-L1相对于4NQ PD-L1上表示出显著更高的MFI的抗体用于进一步评估。STM073和STM108双功能MAb的荧光结合分析的结果显示在下表6中，其显示抗体与表达野生型(糖基化)PD-L1(BT549PD-L1WT细胞)结合相对于抗体与表达变体(非糖基化4NQ)PD-L1的BT549细胞(BT549PD-L1 4NQ细胞)结合的MFI值。表6中的实验结果显示，与BT549PD-L1 4NQ细胞(表达非糖基化PD-L1的细胞)相比，STM073 MAb与BT549PD-L1WT细胞(表达糖基化PD-L1的细胞)结合的MFI值高约5倍。类似地，与BT549PD-L1 4NQ细胞相比，STM108与BT549PD-L1WT细胞结合的MFI值经测定高约4倍。
表6.抗glycPD-L1 MAb的测量的荧光强度值
基于结合分析，选择42个产生MAb的候选杂交瘤，在ADCF培养基中生长，并浓缩和纯化其含有单克隆抗体的上清液。
在某些情况下，使用活细胞成像测定IncuCyteTM(Essen Bioscience)进一步对纯化的MAb测试中和或抑制PD-L1与PD-1之间相互作用(PD-L1/PD-1相互作用)的能力。对于该测定，将表达PD-L1的BT-549细胞与抗人PD-L1抗体和荧光标记的PD-1-Fc融合蛋白一起孵育。按照制造商的说明，每小时通过IncyCyteTMZoom定量配体与受体的结合。基于该测定，发现在测试的42种MAb中，15种MAb完全阻断PD-L1与PD-1的结合。显示出强阻断功效的15种MAb中的一些也在一定程度上结合非糖基化PD-L1。
在另一个测定中，将糖基化人PD-L1蛋白和非糖基化PD-L1(即用PNG酶F处理的PD-L1蛋白)涂覆在固相上并测试MAb对PD-L1抗原的结合亲和力。应理解，“PD-L1抗原”与“PD-L1蛋白”同义。与非糖基化PD-L1蛋白(PNG酶F处理的蛋白质)相比，十二(12)种MAb显示出较高的与糖基化PD-L1蛋白的亲和力相互作用。为了进一步的特异性分析，通过Western印迹和FACS流式细胞术分析法分析选定的MAb。从各种分析中，发现与PD-L的非糖基化形式相比，MAb诸如STM073和STM108特异性地与PD-L1的糖基化形式结合，这进一步证实了这些MAb对糖基化PD-L1抗原的特异性。
实施例7特定糖基化PD-L1结合性单克隆抗体的结合区域的鉴定
为了鉴定与糖基化PD-L1结合的单克隆抗glycPD-L1抗体的区域，野生型(糖基化的)PD-L1(PD-L1 WT)和糖基化变体蛋白N35/3NQ、N192/3NQ、N200/3NQ和N219/3NQ(其中位置35、192、200或219处的糖基化位点之一是该位置处的野生型天冬酰胺(N)，并且另外三个位置已突变为谷氨酰胺(Q)，因此其不被糖基化)(图10A)在PD-L1敲低BT549细胞中过表达。如通过Western印迹所测定的，与其他PD-L1突变体的结合水平相比，一些MAb以更高的结合水平识别特定PD-L1突变体，证明了此类MAb是位点特异性的。例如，MAb STM073结合突变体N35/3NQ、N192/3NQ和N200/3NQ，但不结合突变体N219/3Q，证明该抗体结合PD-L1的N35、N192和N200区域，但不结合N219(图10B)。另外，使用肝癌细胞裂解物的Western印迹分析还揭示了对于代表性抗glycPD-L1抗体诸如STM073的PD-L1糖基化的差异模式(图10C)。
通过免疫组织化学(IHC)染色进一步证实了这些MAb的组织病理学相关性，在细胞离心涂片(cytospin)染色分析中，抗glycPD-L1单克隆抗体一致地识别并结合PD-L1蛋白的糖基化部分，但不结合未糖基化的PD-L1蛋白。在人三阴性乳腺癌患者样品中，抗glycPD-L1单克隆抗体还以1:30的比例显示膜和细胞质染色。这些数据证明抗glycPD-L1单克隆抗体可用于生物标志物分析，以检测作为生物标志物的糖基化PD-L1。
实施例8糖基化PD-L1结合抗体的表位作图
小鼠单克隆抗glycPD-L1抗体STM073的表位作图由CovalX AG(Switzerland)进行。为了确定通常由抗glycPD-L1抗体特别是STM073 MAb识别的表位的性质(例如线性的或构象的)，进行研究以评估PD-L1抗原蛋白与抗PD-L1抗体之间的相互作用是否可被通过抗原的蛋白水解产生的非结构化肽抑制。如果通过PD-L1抗原的完全蛋白水解产生的肽能够抑制抗体对抗原的结合，则相互作用不是基于构象，因而表位是线性的。使用从抗原序列产生的一组重叠肽的简单竞争测定足以确定表位的序列。或者，如果通过PD-L1抗原的完全蛋白水解产生的肽不能抑制抗体对抗原的结合，则确定靶的构象是相互作用所必需的，并且表位是构象的，例如连续的(具有特殊构象，诸如环)或不连续的(归因于三级结构)。为了进一步阐明与构象表位的结合，还使用了共价标记、肽作图和高分辨率质谱术。
竞争测定显示，由PD-L1抗原产生的肽不抑制MAb STM073与PD-L1抗原的结合，证实了STM073 MAb表位是构象的而非线性的。使用化学交联，高质量MALDI质谱法和nLC-Orbitrap质谱法表征了PD-L1蛋白与抗体之间的相互作用表面。使用PD-L1的胃蛋白酶蛋白水解、所得胃蛋白酶产生的PD-L1肽与抗体和完整PD-L1蛋白的混合物的竞争测定，以及通过已知方法对抗原/抗体相互作用的分析，显示没有可检测的PD-L1肽对STM073单克隆抗体与PD-L1抗原的结合的抑制。因此，确定了抗-PD-L1 MAb STM073识别的PD-L1上的表位是构象的而非线性的。STM073的表位被确定为包括氨基酸残基H69、Y112、R113和K124，它们在始于V68并终于V128的序列中加以下划线(其中位置79至107的区域以短划线表示)VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:85)。发现STM108结合序列LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ内的表位，其分别是SEQ ID NO:1的氨基酸74至84和158至173，并且接触SEQ ID NO:1的残基S80、S81、K162和S169(在SEQ ID NO:1的残基74至173内)。
实施例9 T细胞杀伤测定
利用T细胞杀伤测定来测定如本文所述的抗glycPD-L1单克隆抗体对肿瘤细胞的细胞毒性活性。遵循的方案如下：在第0天，从表达糖基化野生型PD-L1-(PD-L1 WT)的BT549RFP靶细胞培养物中除去含血清的培养基，并用PBS轻轻冲洗两次。收获细胞并计数。将细胞悬浮液离心(1000RPM，4分钟)，将细胞以沉淀50,000个细胞/mL重悬于培养基中。使用手动多通道移液管，将细胞(100μL/孔，即5000个细胞/孔)接种到平底微量板的每个孔中。将板在环境温度下静置30分钟，然后将其置于IncuCyte活细胞成像仪中，在安排第一次扫描之前使其平衡20分钟。安排二十四小时(24小时)重复扫描(10倍物镜)，每3小时一次，第一次扫描立即开始。在接下来的18小时(过夜)中监测细胞汇合，直至达到所需的汇合(例如，20％)。
第二天早上，即测定当天(即，第1天)，在测定培养基中制备10μM IncuCyteTMCaspase 3/7凋亡绿色荧光检测试剂(Essen BioScience 4440)溶液(2.5μM的最终测定浓度的4倍)并在培养箱中温热至37℃。在测定培养基中以4x最终测定浓度制备抗CD3抗体(100ng/mL)+IL-2(10ng/mL)T细胞活化剂处理并温热至37℃。还制备了测试MAb。从培养箱中取出靶细胞板并吸出培养基，注意不要破坏细胞层。使用多通道移液管，将25μL温热的半胱天冬酶3/7溶液转移到每个孔中。此后，将25μL温热的抗CD3抗体+IL-2和抗体置于细胞板的适当孔中。添加含有效应细胞(PBMC或总T细胞)的另外50μL培养基以形成100μL的总测定体积。将去泡的细胞板置于IncuCyte仪中，并在第一次扫描之前使其平衡20分钟。安排24小时重复扫描，每2-3小时一次，持续长达5天。(目镜10x；器皿类型：Corning 3596；扫描模式：标准；扫描方式：每孔2个图像；信道：相位+“绿色”(如果使用NucLightTM Red靶细胞，则+“红色”)。
为了分析，通过计算视野中“大”绿色荧光物体(细胞核)随时间的总数，在IncuCyteTM软件中定量靶细胞凋亡。从红色物体计数(对应于红细胞核的数量)测量靶细胞的增殖。数据表示为每mm2荧光物体的数量。数据显示添加如本文所述的抗体，特别是STM073，增强了肿瘤细胞杀伤(图11)。
实施例10结合测定
为了确定如本文所述的抗glycPD-L1单克隆抗体是否特异性抑制PD-1与PD-L1的相互作用，进行以下结合测定。在测定的第0天，从表达PD-L1的BT549靶细胞培养物中除去含有血清的培养基，并用D-PBS轻轻漂洗两次。收获细胞并计数。将细胞悬浮液离心(1000RPM，5分钟)，将细胞沉淀以50,000个细胞/mL重悬于培养基中。使用手动多通道移液管将细胞(100μL/孔，即5000个细胞/孔)接种到平底微量板的每个孔中。将板在环境温度下静置30分钟。此后，将含有细胞的平板在5％CO2培养箱中孵育过夜。
在测定的第1天(即第二天早晨)，制备含有1μg/mL PD-1/Fc和1:400稀释的AlexFluor 488-山羊抗人IgG的培养基并在培养箱中加热至37℃。从培养箱中取出细胞板并吸出培养基，注意不要破坏细胞层。以剂量依赖性方式向每个孔中加入50μL测试抗体。向每个孔中加入50μL含有PD-1/Fc和Alex Fluor 488-山羊抗人IgG的培养基。将细胞板置于IncuCyte仪中，并在第一次扫描前平衡20分钟。24小时自动重复扫描(10x)计划每1-2小时扫描一次，进行长达24小时。物镜：10x；器皿类型：Corning 3596；扫描模式：标准；扫描方式(Scan Pattern)：每孔4张图像；信道：相位(Phase)+“绿色”。
图12A和12B显示代表性MAb STM073和STM108以剂量依赖性方式抑制PD-1/Fc与表达PD-L1的细胞的结合。对照测定结果显示在图12C中。
实施例11PD-L1内化测定
为了确定抗glycPD-L1单克隆抗体是否促进PD-L1内化和降解，将A431细胞在无血清培养基中孵育过夜，然后与10μg抗glycPD-L1抗体一起孵育两天。然后收获细胞，通过Western印迹评估细胞中的PD-L1。图13显示，与对照(IgG)相比，利用STM073的孵育显示细胞中的PD-L1水平降低。
按照制造商的说明书使用pHrodoTM Red Microscale Labeling试剂盒(ThermoFischer Scientific,Rochester,NY)，通过用pHrodoTM Red染料标记抗体来可视化STM073和STM108 MAb的细胞内化。简言之，对于分析，在0时刻接种细胞；接种后24小时，将细胞与标记的STM073或STM108 MAb(5μg/mL)一起孵育。1小时后，使用IncuCyte 仪开始细胞的图像扫描，安排24小时重复扫描(10x)，每1小时一次。物镜：10x；器皿类型：Corning 356407；扫描模式：标准；扫描方式：每孔3张图片；信道：相位+“红色”。图14A：用STM073孵育的野生型BT549细胞(人导管癌、乳腺癌细胞系)；图14B：与STM073一起孵育的过表达PD-L1 WT(糖基化)的BT 549细胞；图14C：用STM073孵育的NCI-H226细胞(人肺癌细胞系、鳞状细胞间皮瘤)；图14D：与STM073孵育的MCF-7细胞(人乳腺癌细胞系，腺癌)；和图14E：与STM108一起孵育的表达PD-L1 WT(糖基化)的BT 549细胞。
实施例12抗glycPD-L1抗体对PD-L1的结合促进PD-L1内化和降解
图15A-15C提供了在抗glycPD-L1 MAb STM108与在BT549-PD-L1细胞上表达的PD-L1结合后通过活细胞成像分析PD-L1内化和降解的实例。在图15A-15C中，所述抗PD-L1抗体是缀合有红色荧光染料pHrodoTM Red(琥珀酰亚胺酯(pHrodoTM Red,SE)的STM108，如上于实施例11中所述，使用pHrodoTM Red Microscale Labeling试剂盒(ThermoFisherScientific,Rochester,NY)。绿色染料反映用Green DND-26(其是一种可透过细胞的绿色染料)染色的细胞，所述染料对通过活细胞成像法成像的活细胞中的酸性区室(溶酶体)染色。图15A显示在第一时间点(时间0)，如通过箭头指示的细胞的强烈红色细胞内染色所观察到的，STM108抗体被内化到细胞中。图15B显示在图15A中的时间0之后2分钟时图15A中描述的同一细胞中的弱化细胞内红色染色。图15C显示在图15A中的时间0后4分钟缺乏红色细胞内染色，这反映了细胞内STM108抗体和/或抗体-抗原复合物的降解。这些图像反映了抗glycPD-L1抗体诸如STM108 MAb在与细胞表面上表达的PD-L1结合后实现PD-L1的内化和降解。
实施例13：肿瘤细胞对比总T细胞中被抗glycPD-L1抗体结合的PD-L1的内化
对抗glycPD-L1抗体测试在结合细胞表面表达的PD-L1后内化到PD-L1阳性肿瘤细胞中的能力(与活化或非活化的T细胞相比)。将抗glycPD-L1抗体STM004、STM073和STM108以及作为对照的小鼠IgG与来自外周血的非活化的总T细胞、来自外周血的活化的总T细胞和表达PD-L1的NCI-H226细胞一起孵育。对于T细胞活化，将总T细胞以1:1的比例与用抗CD3抗体和抗CD28抗体(例如，ThermoFisher Scientific,Rochester,NY)共价偶联的珠粒(例如，惰性、超顺磁珠粒)混合，以模拟通过抗原呈递细胞刺激的方式刺激T细胞(参见，例如，A.Trickett等，2003,J.Immunol.Methods,275，1-2期：251-255)。用pHrodoTM Red标记所有抗体，并如实施例11所述显现内化。图16A-16D和图16E-16H显示所测试的抗体均未内化到未活化的总T细胞或活化的总T细胞中。图16I-16L显示相较于未显示红色细胞内染色的标记的对照抗体mIgG(图16I)和标记的非内化STM004MAb(图16J)，双重功能内化性STM073和STM108 MAb在与这些细胞一起孵育后内化到NCI-H226细胞中，如通过红色细胞内染色所证明的。该实施例证明双重功能抗glycPD-L1抗体被选择性内化到表达PD-L1的肿瘤细胞中，但不被内化到活化或非活化的T细胞中。
实施例14PD-L1 ADC在肿瘤细胞杀伤和肿瘤体积减小方面的功效
进行体外和体内实验以评估包含与细胞毒素MMAE偶联的抗人glycPD-L1 MAb(即，STM108 MAb)在肿瘤杀伤和减小肿瘤体积方面的功效。如上所述，STM108-ADC包含通过半胱氨酸与MC-vc-PAB-MMAE化学连接的STM108 MAb，用于将MMAE细胞毒素有效负载特异性地递送至表达PD-L1的肿瘤或癌细胞。STM108-ADC(STM108-MC-vc-PAB-MMAE)的测量的物理特性如下：
ADC的A248nm 2.548
ADC的A280nm 3.635
A248nm/A280nm比率 0.70
药物抗体比率 4.13
结合本实施例，图17A-17D显示了评估STM108-ADC相较于对照(仅IgG和STM108MAb)而言在杀伤表达PD-L1以及不表达PD-L1的肿瘤细胞方面以及在减小肿瘤移植小鼠中的肿瘤体积方面的功效的实验结果。图17A显示与经分子工程化而敲除其PD-L1表达的MB231细胞在暴露于不同浓度的STM108-ADC(即“ADC108”)后的存活率％(实心黑色方块)相比，表达PD-L1的MDA-MB231(人乳腺癌细胞系)肿瘤细胞(“MB231”)在暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后的存活率％(实心黑色圆圈)。如所观察到的，即使在最高浓度下，STM108-ADC对在其表面上不表达PD-L1的MB231细胞的存活率也没有显著影响，而表达PD-L1的MB231细胞的存活率显著降低，特别是在1nM至100nM的STM108浓度下。在图17B中，使用MDA-MB231乳腺癌小鼠模型，其中用IgG-MMAE对照(100μg)、用50μg、100μg或150μg的STM108-ADC或用单独的STM108 MAb(100μg)处理移植有来自MB231细胞的肿瘤的动物。结果表明，与用IgG-MMAE对照处理的动物相比，在所有剂量水平用STM108-ADC处理的荷瘤动物中的肿瘤体积有效减小，并且在一定程度上，利用STM108 MAb(100μg)处理的荷瘤动物中的肿瘤体积也有一定程度的减小。另外，令人惊讶地发现，在约第18天时，利用STM108-ADC(100μg)处理的5只动物中有3只(3/5)和利用STM108-ADC(150μg)处理的5只动物中有4只(4/5)中发生发生完全缓解(“CR”)。
图17C显示与天然不表达PD-L1的4T1细胞(“4T1”)在暴露于不同浓度的STM108-ADC(即，“ADC108”)后的存活率％(空心红色方块)相比，经分子工程化而在细胞表面上表达人PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1 hPDL1”)在暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后的存活率％(空心红色圆圈)。如所观察到的，即使在最高浓度下，STM108-ADC对在其表面上不表达PD-L1的4T1细胞的存活率也没有显著影响，而表达PD-L1的4T1细胞的存活率在大于10nM至100nM的STM108-ADC浓度下降低。
使用其中用来源于已被分子工程化以在细胞表面上表达PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1 hPD-L1”)的肿瘤移植动物(Balb/c小鼠)的4T1同基因乳腺癌小鼠模型，或其中用来源于不在细胞表面上天然表达PD-L1的未转染的4T1乳腺癌细胞(“4T1”)的肿瘤移植Balb/c小鼠的4T1同基因乳腺癌小鼠模型。在MD Anderson的动物使用与关爱委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的指南下进行所有使用BALB/c小鼠(6至8周龄雌性；Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine,USA)的操作。根据每组中的平均肿瘤体积划分小鼠。将4T1细胞(与25μL基质胶基底膜基质(Matrixgel BasementMembrane Matrix)[BD Biosciences,San Jose,CA,USA]混合的25μL培养基中的1x105个细胞)注射到乳腺脂肪垫中。在小鼠的肿瘤细胞接种后第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天腹膜内注射IgG-MMAE对照(100μg)、STM108 MAb(100μg)或STM108-ADC(150μg)。用卡尺每3天测量肿瘤，并使用以下公式计算肿瘤体积：π/6x长度x宽度2。
如图17D中所观察到的，在荷有几乎没有或没有细胞表面PD-L1表达的4T1来源的肿瘤的动物中(空心圆/虚线)，结果显示对所有治疗类型，即IgG-MMAE对照、STM108 MAb或STM108-ADC，肿瘤体积随时间增加。在荷有来源于表达PD-L1的4T1细胞的肿瘤并用IgG-MMAE对照处理的动物中，经处理的动物中的肿瘤体积也随时间增加(实心黑色圆圈)。相反，在荷有源自表达PD-L1的4T1细胞的肿瘤并用STM108MAb(实心蓝色圆圈)或STM108-ADC(实心红色圆圈)处理的动物中，肿瘤体积有效减小。另外，令人惊讶地发现，到约第21天，用STM108-ADC处理的7只动物中有5只(5/7)发生完全缓解(“CR”)。
体内研究强调与包含如上所述的抗glycPD-L1 MAb(诸如STM108)的ADC在治疗癌症(例如两种类型的乳腺癌)中的用途相关的有益和有效的抗肿瘤和治疗方面，所述体内研究显示在治疗后25天内，例如到约第15-23天时，已用抗glycPD-L1 MAb ADC治疗的动物中肿瘤体积显著减少以及肿瘤完全缓解。
根据本公开，可以在没有过度实验的情况下产生和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经就实施方案和优选实施方案描述了组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可在不背离所描述的其概念、精神和范围的情况下对本文所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可替代本文所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的所述实施方案的精神、范围和概念内。
本文引用的所有专利、公开的专利申请和其他出版物在此通过引用并入本申请中。
序列表
<110> STCUBE, INC.
BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM
<120> 对糖基化PD-L1特异的双重功能抗体及其使用方法
<130> 24258.105007
<140>
<141>
<150> 62/361,312
<151> 2016-07-12
<150> 62/314,652
<151> 2016-03-29
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 290
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
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Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
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Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
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Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
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Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
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Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
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Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
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Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
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Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
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Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
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Glu Thr
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 2
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cagagaagag gctggagtgg gtcgcaacca ttagtagtgc tggtagttat acctactatc 180
cagacagtgt gaagggtcga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac accctgtacc 240
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attactactt tgactactgg ggccaaggcg ccactctcac agtctcctca 350
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
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<220>
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 13
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 14
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 15
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 16
Gln Gln Trp Ser Asp His Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 17
Gln Gln Trp Ser Asp His Pro Leu Thr
1 5
<210> 18
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 18
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggagcc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cttctggatt cagtttgagt aactatgtca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtaggta tatctactat 180
acagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagggaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attattgtgc aagagacggt 300
agtaccttgt actactttga ctattggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 19
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 19
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 20
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 21
Asn Tyr Val Met Ser
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 22
Ser Ser Gly Gly Arg Tyr
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 23
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 24
Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 25
Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 26
caagtgcaga ttttcagctt cctgctaatc agtgcctcag tcatactgtc cagaggacaa 60
actgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 120
acctgcagtg ccagctcaag tgtagattac atgtactggt accagcagaa gccaggatcc 180
tcccccagac tcctgattta tgacacatcc aacctggctt ctggagtccc tgttcgcttc 240
agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat 300
gctgccactt attactgcca gcagtggagt agttccccac ccatcacgtt cggtactggg 360
accaaggtgg agctgaaa 378
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 27
Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gln Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val
35 40 45
Asp Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met
85 90 95
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser
100 105 110
Pro Pro Ile Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 28
Ser Ala Ser Ser Ser Val Asp Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 29
Ser Ala Ser Ser Ser Val Asp Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 30
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 31
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 32
Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 33
Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 34
tcaattgtca tattgctac 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 35
ttgactccat ctttcttca 19
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 36
gtggtagagt atggtagcca aatgacaatt gaatgcaaa 39
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 37
tttgcattca attgtcattt ggctaccata ctctaccac 39
<210> 38
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 38
gagaggagaa gcttttccag gtgaccagca cactgag 37
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 39
ctcagtgtgc tggtcacctg gaaaagcttc tcctctc 37
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 40
gaccagcaca ctgagaatcc agacaacaac taatgagat 39
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 41
atctcattag ttgttgtctg gattctcagt gtgctggtc 39
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 42
gagagaggag aagcttttcc aagtgaccag cacactgaga 40
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 43
tctcagtgtg ctggtcactt ggaaaagctt ctcctctctc 40
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 44
gcataacgaa cctaaccctc ag 22
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 45
gcccaatgtc cactgtgata 20
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 46
gtaacctcag tcacctgcc 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 47
attccgctcc acaatctctg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 48
tcttcaacct cacgctcaag 20
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 49
gtgtgcaaag acgtcatcat c 21
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 50
caccatcacc ctcctttcta ttc 23
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 51
gaacaacagg tctgggattt ct 22
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 52
gccttttgcc atcgacatg 19
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 53
agtcagattc ttgcatccct g 21
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 54
caaggagagc attaggacca ag 22
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 55
ccccattaaa cctcaggact g 21
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 56
tcgtcatggt gtggtattcc 20
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 57
caggaagatg ggctgatcc 19
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 58
gaccgcactc atcttacacc 20
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 59
ggaggttggc tgaaggaata c 21
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 60
tcccctgctt taaccatcg 19
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 61
ttgtcaccta tactggcgtt g 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 62
ctgagtgatg gaacgagtga g 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 63
tagagatgac cagatgcaac g 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 64
gagtccaact tcacggctta t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 65
agtggtccag gaagacatag a 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 66
tgtgagggaa agatcaagtg g 21
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 67
gctctccaag gtaaatgagg ac 22
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 68
ccactgagtt cgtcaagagg 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 69
acttccttgc catctgtcac 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 70
tggctcgctg ataagttctg 20
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 71
gtgagtctgg tttgggagaa g 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 72
gcaaagacct gtacgccaac a 21
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 73
tgcatcctgt cggcaatg 18
<210> 74
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的共有序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Ile, Met 或 Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> Asp 或Asn
<400> 74
Ala Phe Thr Ile Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Val Thr Xaa Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Xaa
20 25 30
Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Lys Ile Ile
35 40 45
Gln Phe Val Asn Gly
50
<210> 75
<211> 53
<212> PRT
<213> 人
<400> 75
Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile
35 40 45
Gln Phe Val His Gly
50
<210> 76
<211> 53
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 76
Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp
20 25 30
Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile
35 40 45
Gln Phe Val Ala Gly
50
<210> 77
<211> 53
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 77
Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Gln Lys Leu Asp
20 25 30
Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Lys Glu Val Ile
35 40 45
Gln Phe Val Glu Gly
50
<210> 78
<211> 53
<212> PRT
<213> 牛（Bos taurus）
<400> 78
Ala Phe Thr Ile Thr Val Ser Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Arg Phe Pro Val Asp Lys Gln Leu Asn
20 25 30
Leu Leu Val Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Lys Ile Ile
35 40 45
Gln Phe Val Asn Gly
50
<210> 79
<211> 53
<212> PRT
<213> 野猪（Sus scrofa）
<400> 79
Ala Phe Thr Ile Thr Val Pro Lys Asp Met Tyr Glu Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Arg Phe Pro Val Asp Lys Gln Leu Asn
20 25 30
Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Lys Asp Lys Lys Ile Ile
35 40 45
Gln Phe Val Asn Gly
50
<210> 80
<211> 53
<212> PRT
<213> 马（Equus caballus）
<400> 80
Ala Phe Thr Ile Thr Val Thr Lys Asp Leu Tyr Val Val Asp Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Val Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Glu Pro Leu Asn
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asn Lys Lys Ile Ile
35 40 45
Gln Phe Val Asn Gly
50
<210> 81
<211> 23
<212> PRT
<213> 人
<400> 81
Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys
1 5 10 15
Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln
20
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人
<400> 82
Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile
1 5 10
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人
<400> 83
Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg
1 5 10 15
<210> 84
<211> 28
<212> PRT
<213> 人
<400> 84
Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro
1 5 10 15
Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr
20 25
<210> 85
<211> 61
<212> PRT
<213> 人
<400> 85
Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln
1 5 10 15
Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met
35 40 45
Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
50 55 60
<210> 86
<211> 21
<212> PRT
<213> 人
<400> 86
Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Arg Ile Thr Val
20
<210> 87
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 87
atgaacttgt ggctcagctt ggttttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggagcctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtaac tctgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtgctg gtagttatac ctactatcca 240
gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccttgtatt actgtacaag acattatgat 360
tactactttg actactgggg ccaaggcgcc actctcacag tctcctca 408
<210> 88
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 88
Met Asn Leu Trp Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Ser Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg His Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Ala Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 89
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 89
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt catactgtcc 60
agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120
gtcaccttga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcattggta ccagcagaag 180
ccaggatcct cccccagact cgtgatttat gacacatcca acctggcttc tggagtccct 240
gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacagtcag ccgaatggag 300
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagtg atcacccgct cacgttcggt 360
gctgggacca agctggagct gaaac 385
<210> 90
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 90
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Leu Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
50 55 60
Pro Arg Leu Val Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val
85 90 95
Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Asp His Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 91
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 91
atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
gtgatgctgg tggagtctgg gggagcctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagctt ctggattcag tttgagtaac tatgtcatgt cttgggttcg ccagactcca 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtaggtatat ctactataca 240
gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agggacaatg ccaggaacac cctgtacctg 300
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt attgtgcaag agacggtagt 360
accttgtact actttgacta ttggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414
<210> 92
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 92
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Asn Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的6xHis标签
<400> 93
His His His His His His
1 5
<210> 94
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的共有序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Ile or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> Leu, Ala, Val 或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Ala, Thr, Pro, Leu, Val 或 Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (46)..(46)
<223> His, Arg, Asp 或 Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (48)..(48)
<223> Pro或Ala
<400> 94
Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Xaa Asn Ala Thr Ala
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly Pro Glu Glu Asn
20 25 30
His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro Xaa Xaa Xaa Pro Xaa
35 40 45
Asn Lys Arg Thr His
50
<210> 95
<211> 53
<212> PRT
<213> 人
<400> 95
Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn
20 25 30
His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro
35 40 45
Asn Glu Arg Thr His
50
<210> 96
<211> 53
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 96
Gly Met Leu Leu Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala
1 5 10 15
Asn Asp Val Phe Tyr Cys Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn
20 25 30
His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro
35 40 45
Gln Asn Arg Thr His
50
<210> 97
<211> 53
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 97
Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr Ser Val Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala
1 5 10 15
Asn Asp Val Phe His Cys Thr Phe Trp Arg Val His Ser Gly Glu Asn
20 25 30
His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro Glu Leu Pro Val Pro Arg Leu Pro
35 40 45
His Asn Arg Thr His
50
<210> 98
<211> 52
<212> PRT
<213> 牛
<400> 98
Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala
1 5 10 15
Asp Lys Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly His Glu Glu Asn
20 25 30
Asn Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Pro Ala Lys
35 40 45
Lys Arg Asn His
50
<210> 99
<211> 52
<212> PRT
<213> 野猪
<400> 99
Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Val Asn Ala Thr Thr
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly Pro Glu Glu Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Val Leu Val Ile Pro Glu Pro Tyr Val Asp Pro Ala Arg
35 40 45
Lys Arg Thr His
50
<210> 100
<211> 52
<212> PRT
<213> 马
<400> 100
Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Ala Thr Ala
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Ser Gly Leu Glu Glu Asn
20 25 30
Ser Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Pro Leu Ile Val Pro Ala Asn
35 40 45
Lys Arg Thr His
50

Claims (51)

1.一种分离的抗PD-L1抗体，其中所述抗体包含VH结构域和VL结构域，其中：
所述VH结构域含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述VL结构域含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述VH结构域含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述VL结构域含有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统；或者
所述VH结构域含有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述VL结构域含有SEQ IDNO:28所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述VH结构域含有SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的CDR H3；并且所述VL结构域含有SEQ IDNO:29所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统。
2.权利要求1的分离的抗体，其为嵌合的或人源化的。
3.权利要求1的分离的抗体，其与糖基化PD-L1结合的Kd小于由所述抗体与未糖基化的PD-L1结合所展示的Kd的一半。
4.权利要求3的分离的抗体，其与糖基化PD-L1结合的Kd为由所述抗体与未糖基化的PD-L1结合所展示的Kd的至多1/10。
5.权利要求1的分离的抗体，其以5-20nM的亲和力结合糖基化PD-L1。
6.权利要求1的分离的抗体，其中可通过荧光标记直接或间接检测的所述抗体，优先与表达糖基化PD-L1的细胞结合，其中在细胞流式细胞术测定中，其测量的荧光强度(MFI)为由所述抗体与表达未糖基化的PD-L1的细胞结合所展示的MFI的2倍至10倍。
7.权利要求6的分离的抗体，其中所述抗体优先与表达糖基化PD-L1的细胞结合的MFI为由所述抗体与表达未糖基化的PD-L1的细胞结合所展示的MFI的3倍至5倍或更多。
8.权利要求1的分离的抗体，其具有人抗体框架区。
9.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域(VH)的氨基酸序列是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:19所示。
10.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体的VL结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:27所示。
11.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体的VH结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示，并且所述抗体的VL的氨基酸序列是SEQ ID NO:11所示。
12.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体的VH结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:19所示，并且所述抗体的VL结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:27所示。
13.权利要求10-12中任一项的分离的抗体，其包含人恒定结构域。
14.权利要求1的分离的抗体，其中:
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的CDR L2和SEQID NO:16所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的CDR H3的VH结构域；并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的CDRL2和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统。
15.权利要求1的分离的抗体，其中：
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统。
16.权利要求14的分离的抗体，其包含由与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码的VH结构域，和由与SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸编码的VL结构域。
17.权利要求15的分离的抗体，其包含由与SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列编码的VH结构域，和由与SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸编码的VL结构域。
18.一种分离的抗体，其包含由SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码的VH结构域，和由SEQ IDNO:10的核苷酸序列编码的VL结构域。
19.一种分离的抗体，其包含由SEQ ID NO:18的核苷酸序列编码的VH结构域，和由SEQID NO:26的核苷酸序列编码的VL结构域。
20.权利要求14的分离的抗体，其具有人抗体框架区。
21.权利要求15的分离的抗体，其具有人抗体框架区。
22.权利要求14或15的分离的抗体，其具有人抗体恒定结构域。
23.权利要求1和18-19中任一项的分离的抗体，其中所述抗体为IgG、IgM、IgA抗体或其抗原结合片段。
24.权利要求1和18-19中任一项的分离的抗体，其中所述抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv或二价scFv。
25.权利要求1和18-19中任一项的分离的抗体，其中所述抗体与成像剂、化学治疗剂、细胞毒性剂、抗肿瘤剂或放射性核素缀合。
26.一种分离的核酸分子，其中包含编码抗体的VH结构域的SEQ ID NO:2所示核苷酸序列和编码所述抗体的VL结构域的SEQ ID NO:10所示核苷酸序列。
27.一种分离的核酸分子，其中包含编码抗体的VH结构域的SEQ ID NO:18所示核苷酸序列和编码所述抗体的VL结构域的SEQ ID NO:26所示核苷酸序列。
28.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1至21中任一项的抗体的VH结构域和VL结构域的核苷酸序列。
29.一种组合物，其在药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物中包含权利要求1至21中任一项的抗体。
30.权利要求1-21中任一项的分离的抗体在制备用于治疗患有PD-L1阳性癌症的受试者中的PD-L1阳性癌症的药物中的用途，其中所述PD-L1阳性癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
31.权利要求30的用途，其中所述药物为药学上可接受的组合物。
32.权利要求31的用途，其中所述药物用于全身性、静脉内或瘤内施用。
33.权利要求25的分离的抗体，其中将所述抗体与抗肿瘤剂缀合以产生抗体-药物缀合物(ADC)。
34.权利要求33的分离的抗体，其中所述抗肿瘤剂是抑制微管蛋白聚合的药剂。
35.权利要求33的分离的抗体，其中所述抗肿瘤剂是美登木素生物碱或奥瑞斯他汀。
36.权利要求33的分离的抗体，其中所述抗肿瘤剂是DM1(N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛)或DM4(N2'-脱乙酰基-n2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-6-甲基美坦辛)。
37.权利要求33的分离的抗体，其中所述抗肿瘤剂是单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)或单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)。
38.权利要求33的分离的抗体，其中所述抗肿瘤剂是MMAE。
39.权利要求38的分离的抗体，其中所述抗体与马来酰亚胺和己酸(MC)附接基团化学缀合，所述附接基团与组织蛋白酶可切割的接头化学缀合，所述接头与对氨基苯甲酸(PAB)间隔子化学缀合，所述对氨基苯甲酸间隔子与MMAE化学缀合，从而形成所述ADC。
40.权利要求39的分离的抗体，其中所述组织蛋白酶可切割的接头是缬氨酸-瓜氨酸(vc)。
41.一种包含权利要求1所述的抗PD-L1抗体与细胞毒性药物化学偶联的ADC。
42.权利要求41的ADC，其中所述细胞毒性药物是抑制微管蛋白聚合的药剂。
43.权利要求42的ADC，其中所述药剂是美登木素生物碱或奥瑞斯他汀。
44.权利要求42的ADC，其中所述药剂是DM1或DM4。
45.权利要求42的ADC，其中所述药剂是MMAE或MMAF。
46.权利要求42的ADC，其中所述药剂是MMAE。
47.权利要求46的ADC，其中所述抗体与MC附接基团化学缀合，所述MC附接基团与组织蛋白酶可切割的接头化学缀合，所述接头与PAB间隔子化学缀合，所述PAB间隔子与MMAE化学缀合，从而形成所述ADC。
48.权利要求47的ADC，其中所述组织蛋白酶可切割的接头是缬氨酸-瓜氨酸(vc)。
49.权利要求41-48中任一项的ADC，其中：
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统。
50.权利要求41-48中任一项的ADC，其中：
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的CDR L2和SEQID NO:16所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的CDR L2和SEQID NO:17所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统。
51.一种包含通过可切割的接头与MMAE化学偶联的抗PD-L1抗体的ADC，其中所述抗体包含VH结构域和VL结构域，其中:
所述VH结构域含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述VL结构域含有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述VH结构域含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述VL结构域含有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统；或者
所述VH结构域含有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述VL结构域含有SEQ IDNO:28所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的CDR L3，根据Cothia编号系统；或者
所述VH结构域含有SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的CDR H1、SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的CDR H2和SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的CDR H3，并且所述VL结构域含有SEQ IDNO:29所示氨基酸序列的CDR L1、SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的CDR L2和SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的CDR L3，根据Kabat编号系统。
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