CN109415361B

CN109415361B - 丙烯酸类衍生物及其制备方法和其在医药上的用途

Info

Publication number: CN109415361B
Application number: CN201780038512.9A
Authority: CN
Inventors: 关东亮; 盛首一; 白骅
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Aryl Pharmtech Co Ltd
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: TWI651321B; WO2018001232A1; TW201808951A; CN109415361A

Abstract

本发明涉及一种通式(I)所示的丙烯酸类衍生物、其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，它们的制备方法，含有它们的药物组合物，以及它们作为治疗剂，特别是作为选择性雌激素受体下调剂(SERD)的用途，其中通式(I)中的R¹、R²、R³、R⁴的定义如说明书所述。

Description

丙烯酸类衍生物及其制备方法和其在医药上的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种新的丙烯酸类衍生物、其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，它们的制备方法，含有它们的药物组合物，以及它们作为治疗剂、特别是作为雌激素受体拮抗剂或雌激素受体α下调剂的用途。

背景技术

雌激素受体(estrogen receptor，ER)是配体激活的转录调节蛋白，它通过与内源性雌激素的相互作用介导多种生物效应的诱导，内源性雌激素包括17β-雌二醇和雌酮。已发现ER具有两种亚型雌激素受体α(ERα、ESR1和NR3A)和雌激素受体β(ERβ、ESR2和NR3b)。雌激素受体α和雌激素受体β是甾体激素受体的成员，其为细胞核受体家族中的一员。与细胞核受体的机构很相似，ERα是由6个功能结构域(命名为A-F)组成，为配体激活的转录因子，因为在其与特定的配体结合后，包括内源性雌激素17β雌二醇(E2)，与基因组序列结合成复合物，即雌激素受体应答元件和共调节因子结合，来调节靶向基因的转录。ERα基因位于6q25.1，编码595A蛋白，根据剪切位点和转录转录起始点的不同，而得到不同的亚型。除了DNA结合域(域C)和配体结合域(域E)之外，受体还包含N-端(A/B)域，铰链区(D，其连接C和E域)和碳端(F域)。ERα和ERβ的C和E结构域具有一致性，A/B，D和F域中一致性较低。两种受体都与女性生殖道的调节和生长有关系，同时在中枢神经系统、心脑血管系统和骨代谢中也发挥着重要的作用。雌激素与受体结合可以导致多种细胞的变化，其调节机制可以划分为两种途径：基因组和非基因组途径。ER介导的基因组途径包括雌激素受体二聚体的形成，与雌激素调控基因启动子中的ERE的结合，介导其他调节蛋白向启动子的聚集，最后导致该基因mRNA水平的升高或降低。雌激素介导的非基因组途径中，雌激素能过与存在于或邻近ERs的细胞膜，甚至无ERs的细胞膜的雌激素结合蛋白进行反应。雌激素通过非基因组途径导致的细胞反应，可以使细胞内的钙离子和NO水平增加，以及多种细胞内激酶的激活，包括MAPK、PI3K、PKA和PKC，使nER磷酸化而激活。

约70％的乳腺癌患者中表达ER和/或黄体酮受体，表明此肿瘤细胞的生长为激素依赖性的，其他的肿瘤如卵巢癌和子宫内膜癌的生长也对ERα具有依赖性。对于这些疾病的治疗可以通过各种方式来抑制ER信号传导，包括拮抗配体和ER的结合，拮抗或下调ERα，阻断雌激素的合成等。同时在内分泌肿瘤如肾上腺皮质肿瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌，消化道系统肿瘤如结肠癌、食管癌、肝癌和胰腺癌，以及肺癌中都表达ERα和ERβ。虽然上述的治疗方法在ER阳性的肿瘤患者中起了一定的作用，但也会产生耐药性，最近报道，ESR1的突变可能是转移性ER阳性的乳腺癌患者产生耐药性的原因之一(Toy et al.,Nat.Genetic2013,45:1439-1445；Li,S.et al Cell Rep.4,1116-1130(2013))。然而论述的可能的耐药性机制中，肿瘤的生长存在ER依赖性活性，因此通过选择性下调ERα的机制提供了一种较好的方法来阻滞ERα活性介导早期的、转移性和耐药性的癌症。

目前已经公开了多个可作为选择性雌激素受体下调剂(selective estrogenreceptor downregulator(degrader)，SERD)的药物，其中包括基因特克公司的GDC-0810和GDC-0927分别处于临床II期和临床I期；阿斯利康公司的AZD-9496，处于临床I期，同时也公开了一系列的SERD的专利申请，包括WO2011156518、WO2012037410、WO2015082990等。但是，现有技术中的雌激素受体下调剂仍不够令人满意，为了获得更好的效果和避免耐药机制，仍有必要研究和开发新的雌激素受体α下调剂。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与现有技术结构不同的，具有雌激素受体拮抗作用的丙烯酸类衍生物。

因此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种通式(I)所示的化合物、其立体异构体、互变异构体、或者它们的可药用盐：

其中：

R¹和R²各自独立地选自氢原子或卤素，其中所述的卤素优选为F；

R³选自烷基，其中所述的烷基进一步被一个或多个卤素的取代基所取代；

R⁴各自独立地选自卤素、烷基、烷氧基、三氟甲基、氰基、-C(O)NR⁵R⁶、-C(O)R⁷、-SO₂R⁷、-C(O)OR⁷或-NR⁵C(O)R⁶，其中所述的烷基或烷氧基任选进一步被一个或多个选自卤素、-C(O)NR⁵R⁶、-C(O)R⁷、-SO₂R⁷、-C(O)OR⁷或-NR⁵C(O)R⁶的取代基所取代；

R⁵选自氢原子或烷基；

R⁶选自氢原子、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、卤代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-NR⁸R⁹、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)R¹⁰、-SO₂R¹⁰、-C(O)OR¹⁰或-NR⁸C(O)R⁹的取代基所取代；

或者，R⁵、R⁶与其相连接的原子一起形成4～8元杂环基，其中所述的杂环基任选进一步被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氰基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-NR⁸R⁹、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)R¹⁰、-SO₂R¹⁰、-C(O)OR¹⁰或-NR⁸C(O)R⁹的取代基所取代；

R⁷选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、卤代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-NR⁸R⁹、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)R¹⁰、-SO₂R¹⁰、-C(O)OR¹⁰或-NR⁸C(O)R⁹的取代基所取代；

R⁸、R⁹和R¹⁰各自独立地选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、卤代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羧酸或羧酸酯的取代基所取代；且

n为1、2、3或4。

在本发明的另一实施方案中，通式(I)所述的化合物、其立体异构体、互变异构体、或者其的可药用的盐，其为通式(II)所述的化合物、其立体异构体、互变异构体、或者其的可药用的盐：

其中：R¹、R²、R³、R⁴和n的定义如通式(I)中所述。

在本发明的一个优选实施方案中，通式(I)或(II)所述的化合物、或其立体异构体、互变异构体、或者它们的可药用盐，其中：

所述的烷基优选为C₁-C₁₀烷基，更优选为C₁-C₆烷基，最优选为C₁-C₃烷基；

所述的烷氧基优选为C₁-C₁₀烷氧基，更优选为C₁-C₆烷氧基，最优选为C₁-C₃烷氧基；

所述的环烷基优选为C₃-C₁₂环烷基，更优选为C₃-C₈环烷基，最优选为C₃-C₆环烷基；

所述的杂环基优选为C₃-C₁₀杂环基，更优选为C₅-C₇单环杂环基或者C₇-C₁₀双环或三环杂环基；

所述的芳基优选为C₆-C₁₀芳基，更优选为苯基和萘基；

所述的杂芳基优选为5元-10元杂芳基，更优选为5至6元单环杂芳基或9至10元双环杂芳基。

在本发明的一个实施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立体异构体、互变异构体、或者它们的可药用盐，其中R¹和R²各自独立地选自卤素，其中所述卤素优选为F。

在本发明的一个实施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立体异构体、互变异构体、或者它们的可药用盐，其中R³为C₁-C₄烷基，优选为异丙基，其中所述的烷基进一步被一个或多个选自F、Cl、Br或I的取代基所取代，优选为F或Cl，更优选为F。

在本发明的一个实施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立体异构体、互变异构体、或者它们的可药用盐，其中R⁴各自独立地选自C₁-C₄烷基、卤素、烷氧基、三氟甲基或氰基。

在本发明的一个实施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立体异构体、互变异构体、或者它们的可药用盐，其中：

R¹和R²各自独立地选自卤素，其中所述卤素优选为F；

R³选自卤素取代的C₁-C₄烷基，优选为F取代C₁-C₄烷基；更优选为氟代异丙基；

R⁴为C₁-C₄烷基、卤素、烷氧基、三氟甲基或氰基。

本发明的典型化合物包括但不限于如表1所述化合物：

表1：化合物1-4的结构及命名

或其立体异构体、互变异构体、或者它们的可药用盐。

本发明的另一方面提供了通式(I)所述的化合物或其盐的制备方法，包括以下步骤：

通式(Ia)化合物在碱性条件下，在醋酸钯和三邻甲苯基膦存在下，与通式(1b)反应，得到通式(IB)化合物；通式(Ic)化合物与通式(Id)化合物在碱性条件下反应，得到通式(IA)化合物；通式(IA)化合物与通式(IB)化合物在酸性条件下反应，进一步酯水解，得到通式(I)化合物；

其中：X为卤素，优选为溴；R^a为烷基；R^b为离去基团，优选为卤素和磺酸酯基，更优选为Br或甲磺酸酯基；R¹～R⁴和n的定义如通式(I)中所述。

本发明的另一方面提供了通式(II)所述的化合物或其盐的制备方法，包括以下步骤：

通式(IIa)化合物与通式(Id)化合物在碱性条件下反应，得到通式(IIA)化合物；通式(IIA)化合物与通式(IB)化合物在酸性条件下反应，进一步酯水解，得到通式(II)化合物；

其中：R^a为烷基；R^b为离去基团，优选为卤素和磺酸酯基，更优选为Br或甲磺酸酯基；R¹、R²、R³、R⁴和n的定义如通式(I)中所述。

上述制备方法中，提供酸性条件的试剂为无机酸或有机酸，无机酸优选自盐酸、硫酸、磷酸，更优选为盐酸；有机酸优选自甲酸、乙酸，更优选为乙酸。

上述制备方法中，碱性条件由有机碱或无机碱提供，有机碱优选自二异丙基乙胺、二异丙胺、吡啶、三乙胺、哌啶、N-甲基哌嗪、4-二甲氨吡啶，更优选为二异丙胺和三乙胺；无机碱优选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾，更优选为碳酸钠和氢氧化钠。

更近一步，本发明提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含有效剂量的通式(I)或(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。该组合物任选进一步包括抗氧化剂或金属螯合剂。

本发明提供一种通式(I)或(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备在制备用于治疗雌激素受体介导的疾病的药物中的用途，其中所述的疾病优选为癌症，其中所述的癌症优选为乳腺癌和妇科癌症，其中所述的妇科癌症优选为卵巢癌和子宫内膜癌，其中所述的雌激素受体优选为雌激素受体α。

本发明提供一种通式(I)或(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物在制备选择性雌激素受体下调剂中的用途，优选为雌激素受体α下调剂。

本发明提供一种通式(I)或(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物，其可以与一种或多种其他适宜的抗肿瘤药物联合用药治疗雌激素受体介导的疾病，其中所述的疾病为优选为癌症，其中所述的癌症优选为乳腺癌或妇科癌症，其中所述的妇科癌症优选为卵巢癌或子宫内膜癌，其中所述的雌激素受体优选为雌激素受体α，其中所述其他抗肿瘤药物包括烷化剂、抗代谢类药物、具有抗肿瘤活性的天然产物及其衍生物、细胞毒素类药物或阻滞免疫细胞迁移类药物。

适宜的其他抗肿瘤药物包括烷化剂(但不限于氮芥、环乙亚胺(ethylenimine)衍生物、磺酸烷基酯、亚硝基脲和三氮烯)，例如乌拉莫司汀、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、赛替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、达卡巴嗪和替莫唑胺。

适宜的其他抗肿瘤药物也包括例如抗代谢类药物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)，例如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫尿嘧啶、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。

适宜的其他抗肿瘤药物还包括例如某些具有抗肿瘤活性的天然产物及其衍生物(例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子等)，例如长春碱、长春新碱、长春酰胺、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、阿糖胞苷、紫杉醇、普卡霉素、脱氧考福霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、干扰素(尤其IFN-a)、依托泊苷和替尼泊苷。

适宜的其他抗肿瘤药物还包括细胞毒素类药物，所述细胞毒素类药物包括诺维本、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨和屈洛昔芬、拓扑异构酶抑制剂、丙卡巴肼、米托蒽醌、铂配位络合物例如顺铂和卡铂；生物反应调节物；生长抑制剂；抗激素治疗药物；亚叶酸；替加氟和造血生长因子也适用。

此外，适宜的其他抗肿瘤药物还包括抗体治疗药物例如曲妥单抗、共同刺激性分子的抗体例如CTLA-4、4-1BB和PD-1或细胞因子的抗体(IL-10，IGF-β等)；阻滞免疫细胞迁移的药物，例如趋化因子受体拮抗剂，包括CCR2和CCR4；还包括增强免疫系统的药物，例如辅药或过继T细胞转移；抗癌疫苗，包括树突细胞、合成肽、DNA疫苗和重组病毒。

本发明提供一种选择性下调雌激素受体的方法，其中包括将通式(I)或(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或其药物组合物与雌激素受体相接触，所述的雌激素受体优选为雌激素受体α。

本发明进一步提供了一种治疗雌激素受体介导的疾病的方法，包括给有此需要的对象施用通式(I)或(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐或其药物组合物。在所述治疗方法中，所述雌激素受体优选为雌激素受体α；所述雌激素受体介导的疾病优选为癌症，其中所述癌症优选为乳腺癌和妇科癌症，所述妇科癌症优选为卵巢癌和子宫内膜癌。

本发明还涉及通式(I)或(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐、或其药物组合物在治疗雌激素受体介导的疾病中的应用，其中所述的疾病为癌症，其中所述的癌症优选为乳腺癌或妇科癌症，其中所述的妇科癌症优选为卵巢癌或子宫内膜癌，其中所述的雌激素受体优选为雌激素受体α。

本领域技术人员公知的安全有效的给予大多数化疗药物(抗肿瘤药物)的方法。另外，它们的给药标准在标准文献中已有论述，如“physicians desk reference”(PDR,e.g.1996edition,medical Economics Company,Montvale，NJ)中阐述了多种化疗药物的给药方法，其公开内容通过引用结合到本文中。

除非另有说明，否则本发明在说明书和权利要求书中所使用的部分术语定义如下：

“烷基”当作一基团或一基团的一部分时是指包括C₁-C₂₀直链或者带有支链的脂肪烃基团。优选为C₁-C₁₀烷基，更优选为C₁-C₆烷基，最优选为C₁-C₃烷基。烷基基团的实施例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代或未取代的。

“环烷基”是指饱和或部分饱和的单环、稠环、桥环和螺环的碳环，即包括单环环烷基、稠环烷基、桥环烷基和螺环烷基。优选为C₃-C₁₂环烷基，更优选为C₃-C₈环烷基，最优选为C₃-C₆环烷基。单环环烷基的实施例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等，优选环丙基、环己烯基。

“螺环烷基”指5至18元，两个或两个以上环状结构，且单环之间彼此共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，环内含有1个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺、双螺或多螺环烷基，优选为单螺和双螺环烷基，优选为4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元。“螺环烷基”的非限制性实例包括但不限于：螺[4.5]癸基、螺[4.4]壬基、螺[3.5]壬基、螺[2.4]庚基。

“稠环烷基”指5至18元，含有两个或两个以上环状结构彼此公用一对碳原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，优选为6至12元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环烷基。“稠环烷基”的非限制性实例包括但不限于：二环[3.1.0]己基、二环[3.2.0]庚-1-烯基、二环[3.2.0]庚基、十氢化萘基或十四氢菲基。

“桥环烷基”指5至18元，含有两个或两个以上环状结构，彼此共用两个不直接相连接碳原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，优选为6至12元，更优选为7至10元。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。“桥环烷基”的非限制性实例包括但不限于：(1s,4s)-二环[2.2.1]庚基、二环[3.2.1]辛基、(1s,5s)-二环[3.3.1]壬基、二环[2.2.2]辛基、(1r,5r)-二环[3.3.2]癸基。

所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或杂环基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。环烷基可以是任选取代的或未取代的。

“杂环基”、“杂环”或“杂环的”在本申请中可交换使用，都是指非芳香性杂环基，其中一个或多个成环的原子是杂原子，如氧、氮、硫原子等，包括单环、稠环、桥环和螺环，即包含单环杂环基、桥杂环基、稠杂环基和螺杂环基。优选具有5至7元单环或7至10元双-或三环，其可以包含1，2或3个选自氮、氧和/或硫中的原子。“杂环基”的实例包括但不限于吗啉基，硫代吗啉基，四氢吡喃基，1，1-二氧代-硫代吗啉基，哌啶基，2-氧代-哌啶基，吡咯烷基，2-氧代-吡咯烷基，哌嗪-2-酮，8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛基和哌嗪基。杂环基可以是取代或未取代的。

“螺杂环基”指5至18元，两个或两个以上环状结构，且单环之间彼此共用一个原子的多环基团，环内含有1个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)_m(其中m选自0、1或2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。“螺杂环基”的非限制性实例包括但不限于：1,7-二氧杂螺[4.5]癸基、2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬基、7-氧杂螺[3.5]壬基和5-氧杂螺[2.4]庚基。

“稠杂环基”指含有两个或两个以上环状结构彼此公用一对原子的全碳多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。“稠杂环基”的非限制性实例包括但不限于：八氢吡咯并[3,4-c]吡咯基、八氢-1H-异吲哚基，3-氮杂二环[3.1.0]己基，八氢苯并[b][1,4]二噁英(dioxine)。

“桥杂环基”指5至14元，5至18元，含有两个或两个以上环状结构，彼此共用两个不直接相连接的原子的多环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子的芳香系统，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。“稠杂环基”的非限制性实例包括但不限于：2-氮杂二环[2.2.1]庚基，2-氮杂二环[2.2.2]辛基和2-氮杂二环[3.3.2]癸基。

所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基。杂环基可以是任选取代的或未取代的。

“芳基”是指含有一个或者两个环的碳环芳香系统，其中所述环可以以稠合的方式连接在一起。术语“芳基”包括比如苯基、萘基、四氢萘基的芳香基团。优选芳基为C₆-C₁₀芳基，更优选芳基为苯基和萘基，最优选为苯基。芳基可以是取代或未取代的。所述“芳基”可与杂芳基、杂环基或环烷基稠合，其中与母体结构连接在一起的为芳基环，非限制性实例包括但不限于：

“杂芳基”是指芳香族5至6元单环或9至10元双环，其可以包含1至4个选自氮、氧和/或硫中的原子。“杂芳基”的实施例包括但不限于呋喃基，吡啶基，2-氧代-1,2-二氢吡啶基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，噻吩基，异噁唑基，噁唑基，噁二唑基，咪唑基，吡咯基，吡唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，异噻唑基，1,2,3-噻二唑基，苯并间二氧杂环戊烯基，苯并咪唑基，吲哚基，异吲哚基，1,3-二氧代-异吲哚基，喹啉基，吲唑基，苯并异噻唑基，苯并噁唑基和苯并异噁唑基。杂芳基可以是取代或未取代的。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，非限制性实例包括但不限于：

“烷氧基”是指(烷基-O-)的基团。其中，烷基见本文有关定义。C₁-C₆的烷氧基为优先选择。其实例包括，但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。

“羟基”指-OH基团。

“卤素”是指氟、氯、溴和碘，优选氯、溴和碘。

“氨基”指-NH₂。

“氰基”指-CN。

“硝基”指-NO₂。

“苄基”指-CH₂-苯基。

“羧基”指-C(O)OH。

“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基的定义如上所述。

“磺酸酯基”指-S(O)₂O(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基的定义如上所述。

“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。

本说明书所述的“取代”或“取代的”，如无特别指出，均是指可被一个或多个选自以下的基团取代：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、疏基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氨基、卤代烷基、羟烷基、羧基、羧酸酯基、-NR⁵R⁶、-C(O)NR⁵R⁶、-C(O)R⁷、-SO₂R⁷、-C(O)OR⁷或-NR⁵C(O)R⁶，其中，R⁵选自氢原子或烷基；R⁶选自氢原子、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、卤代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-NR⁸R⁹、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)R¹⁰、-SO₂R¹⁰、-C(O)OR¹⁰或-NR⁸C(O)R⁹的取代基所取代；或者，R⁵、R⁶与其相连接的原子一起形成4～8元杂环基，其中所述的杂环基任选进一步被一个或多个选自烷基、卤素、羟基、氰基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-NR⁸R⁹、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)R¹⁰、-SO₂R¹⁰、-C(O)OR¹⁰或-NR⁸C(O)R⁹的取代基所取代；其中，R⁷选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、卤代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-NR⁸R⁹、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)R¹⁰、-SO₂R¹⁰、-C(O)OR¹⁰或-NR⁸C(O)R⁹的取代基所取代；其中，R⁸、R⁹和R¹⁰各自独立地选自氢原子、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自羟基、卤素、卤代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、羧酸或羧酸酯的取代基所取代。

“可药用的盐”是指上述化合物能保持原有生物活性并且适合于医药用途的某些盐类。本发明化合物的可药用的盐可以为金属盐、与合适的酸形成的胺盐，金属盐优选碱金属、碱土金属盐，合适的酸包括无机酸和有机酸，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、甲磺酸、硝酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。特别优选的是盐酸、氢溴酸、磷酸和硫酸，最优选的是盐酸盐。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

附图说明

图1为测试例7中实施例4化合物和AZD-9496对乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长抑制率图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本发明，应当理解的是，这些实施例并不构成对本发明范围的限制。

制备实施例

以下实施例给出了本发明代表性化合物的制备及相关结构鉴定数据。

¹H NMR图谱是用Bruker仪器(400MHz)测定而得，化学位移用ppm表示。使用四甲基硅烷内标准(0.00ppm)。¹H NMR的表示方法：s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝变宽的，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为Hz。

质谱是用LC/MS仪测定得到，离子化方式可为ESI或APCI。

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)

使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。

柱层析使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。

在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度；除非另有指明，各种起始原料和试剂来自市售或者是根据已知的方法合成，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用；除非另有指明，市售厂家包括但不限于Aldrich Chemical Company，ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，广赞化工科技有限公司，景颜化工科技有限公司和上海常丰生物科技有限公司等。

CD₃OD：氘代甲醇。

CDCl₃：氘代氯仿。

DMSO-d₆：氘代二甲基亚砜。

氩气氛由反应瓶连接一个约1L容积的氩气气球提供。

若实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。

实施例1

(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5-二甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸

第一步

(E)-3-(3,5-二氟-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯

将4-溴-2,6-二氟苯甲醛1a(6.5g，75.0mmol，根据WO2014191726公开的方法制备得到)，三乙胺(21.0ml，150.0)，醋酸钯(840mg，3.75mmol)和三邻甲苯基膦(1.96g，7.50mmol)溶于100mL二甲基甲酰胺中，搅拌下加入丙烯酸甲酯1b(10.0mL，112.5mmol)，反应液加热至100℃，反应20小时。将反应液冷却，将体系溶剂浓缩至干，加入水(200mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并的有机相依次用1N盐酸(200mL)，饱和食盐水洗涤(20mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂：环己烷和乙酸乙酯体系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯1c(10.0g，黄色固体)，产率：59％。

MS m/z(ESI):227.2[M+1]

第二步

2-氟-2-甲基丙-1-醇

将2-氟-2-甲基丙酸甲酯1d(24.0g，200.0mmol)溶于500mL乙醚中，冷却至0℃，分批加入氢化铝锂(9.10g，240.0mmol)，持续1.5小时，加完后在0℃反应1.5小时。向反应液中依次加入9mL水、9mL氢氧化钠溶液(15％)和18mL水淬灭反应，搅拌15分钟，加入无水硫酸镁(30.0g)干燥，搅拌15分钟，过滤，滤饼用乙醚洗涤，滤液减压浓缩，得到2-氟-2-甲基丙-1-醇1e(12.6g，无色液体)，产率：68％。

第二步

2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯

将2-氟-2-甲基丙-1-醇1e(12.6g，137.0mmol)溶于295mL二氯甲烷(氢化钙干燥过)中，冷却至-10℃，滴加三氟甲磺酸酐(24.3mL，144.0mmol)和吡啶(13.2mL，164.0mmol)，然后在0℃反应1.5小时。向反应液中依次用2N盐酸溶液(200mL x2)和水(200mL x2)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(18.2g，红色油状物)，产率：59％。

第三步

(Z)-4-甲基-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚

将4-甲基-1H-吲哚-3-甲醛1g(1.0g，6.3mmol)、14.7mL硝基乙烷、乙酸铵(243mg，3.15mmol)溶于6.3mL乙酸中，氩气保护下，110℃反应3小时。反应液减压浓缩，加入20mL碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯(20mL x3)萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到(Z)-4-甲基-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚1h(1.0g，黄色固体)，产率：73.5％。

MS m/z(ESI):217.0[M+1]

第四步

1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-胺

将氢化铝锂(0.70g，18.5mmol)溶于24mL无水四氢呋喃中，冰浴下缓慢加入(Z)-4-甲基-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚1h(1.0g，4.6mmol)6mL溶于四氢呋喃的溶液，然后加热至回流反应6小时。冰浴下，向反应液中依次加入0.7mL水、0.7mL氢氧化钠溶液(15％)和1.4mL水淬灭反应，无水硫酸镁干燥，过滤，过滤，减压浓缩，得到1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-胺1i(728mg，类白色固体)，产率：84％。

MS m/z(ESI):189.0[M+1]

第五步

2-氟-2-甲基-N-(1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-基)丙-1-胺

氩气保护下，将1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-胺1i(258mg,1.37mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(369mg,1.64mmol)溶和二异丙基乙胺(0.34mL,2.05mmol)于3mL1,4二氧六环中，加热至105℃反应10小时，冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，加入用25mL乙酸乙酯，依次用水(15mL)和饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:二氯甲烷：甲醇体系)，得到2-氟-2-甲基-N-(1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-基)丙-1-胺1j(679mg，褐色油状物)，产率：67％。

MS m/z(ESI):263.0[M+1]

第六步

(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯

氩气保护下，将2-氟-2-甲基-N-(1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-基)丙-1-胺1j(527mg,2.0mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯1c(454mg,2.0mmol)和乙酸(0.492mL，4.0mmol)溶于5mL甲苯中，80℃反应10小时，冷却至室温，减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯体系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯1k(773mg，红色油状物)，产率：82％。

MS m/z(ESI):471.0[M+1]

第七步

(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸

将(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯1k(773mg,1.64mmol)溶于15mL四氢呋喃和甲醇(V/V＝2/1)的混合溶液，缓慢加入7.5M氢氧化钠溶液2.2mL，室温反应12小时，用2N盐酸溶液调反应液pH＝7，减压浓缩除去溶剂，用2M盐酸调节溶液pH＝2，分层，水相用乙酸乙酯(20mL)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:二氯甲烷：甲醇体系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸1(260mg，淡黄色固体)，产率：35％。

MS m/z(ESI):455.0[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝1.04-1.13(m,5H)1.17(d,J＝9.03Hz,3H)1.24(s,2H)2.29-2.42(m,1H)2.58(s,3H)2.77-2.92(m,2H)3.15(d,J＝11.29Hz,1H)3.46(d,J＝6.02Hz,1H)5.22(s,1H)6.62-6.70(m,2H)6.84(t,J＝7.65Hz,1H)6.98(d,J＝8.03Hz,1H)7.45(d,J＝10.54Hz,2H)7.53(d,J＝16.06Hz,1H)10.50(s,1H).

实施例2

(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸

第一步

(Z)-6-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚

将6-氟-1H-吲哚-3-甲醛2a(1.0g，6.1mmol)、14.2mL硝基乙烷、乙酸铵(235mg，3.05mmol)溶于6.0mL乙酸中，氩气保护下，110℃反应6小时。反应液减压浓缩，加入20mL乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液(20mL)洗涤，水相用乙酸乙酯(15mL)萃取，合并无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到(Z)-6-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚2b(1.31g，褐色固体)，产率：98％。

第二步

1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺

将氢化铝锂(0.95g，23.6mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中，冰浴下，缓慢加入(Z)-6-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚2b(1.31g，5.9mmol)溶于10mL四氢呋喃的溶液，然后加热至回流反应6小时。向反应液中依次加入0.95mL水、0.95mL氢氧化钠溶液(15％)和1.8mL水淬灭反应，无水硫酸镁(3.0g)搅拌15分钟，过滤，减压浓缩，得到1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺2c(1.20g，褐色油状物)，产率：100％。

MS m/z(ESI):193.0[M+1]

第三步

2-氟-N-(1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺

氩气保护下，将1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺2c(1.20g,6.20mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(1.67g,7.44mmol)溶和二异丙基乙胺(1.50mL,9.30mmol)于12mL1,4二氧六环中，加热至105℃反应10小时，冷却至室温，减压浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:二氯甲烷：甲醇体系)，得到2-氟-N-(1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺2d(1.65g，褐色油状物)，产率：100％。

MS m/z(ESI):267.0[M+1]

第四步

(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯

氩气保护下，将2-氟-N-(1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺2d(1.65g,6.20mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯1c(1.27g,5.63mmol)和乙酸(0.645mL，11.3mmol)溶于10mL甲苯中，80℃反应5小时，冷却至室温，减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯体系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯2e(1.00g，类白色固体)，产率：38.5％。

MS m/z(ESI):474.9[M+1]

第五步

将(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯2e(1.00g,2.10mmol)溶于19.5mL四氢呋喃和甲醇(V/V＝2/1)的混合溶液，缓慢加入7.5M氢氧化钠溶液2.8mL，室温反应3小时，用2N盐酸溶液调反应液pH＝6～7，减压浓缩除去溶剂，加入10mL水和20mL乙酸乙酯，用2M盐酸调节溶液pH＝2，分层，水相用乙酸乙酯(15mL x2)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯体系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸2(180mg，淡黄色固体)，产率：18.6％。

MS m/z(ESI):460.9[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝12.60(br.s.,1H),10.71(s,1H),7.54(d,J＝16.1Hz,1H),7.46(d,J＝10.5Hz,2H),7.39(dd,J＝5.6,8.4Hz,1H),6.95(dd,J＝2.0,10.0Hz,1H),6.85-6.77(m,1H),6.67(d,J＝15.8Hz,1H),5.19(s,1H),3.49(d,J＝5.5Hz,1H),2.93-2.80(m,2H),2.56(dd,J＝4.4,15.4Hz,1H),2.40-2.27(m,1H),1.24-1.16(m,3H),1.16-1.08(m,3H),1.04(d,J＝6.5Hz,3H).

实施例3

(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸

第一步

(Z)-5-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚

将5-氟-1H-吲哚-3-甲醛3a(1.0g，6.1mmol)、14.2mL硝基乙烷、乙酸铵(235mg，3.05mmol)溶于6.0mL乙酸中，氩气保护下，110℃反应6小时。反应液减压浓缩，加入20mL乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液(15mL)洗涤，水相用乙酸乙酯(15mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到(Z)-5-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚3b(1.30g，褐色固体)，产率：97％。

第二步

1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺

将氢化铝锂(0.90g，23.6mmol)溶于30mL无水四氢呋喃中，冰浴下，缓慢加入(Z)-5-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚3b(1.30g，5.9mmol)溶于10mL四氢呋喃的溶液，然后加热至回流反应6小时。向反应液中依次加入0.90mL水、0.90mL氢氧化钠溶液(15％)和1.8mL水淬灭反应，无水硫酸镁(3.0g)搅拌15分钟，过滤，减压浓缩，得到1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺3c(1.18g，褐色油状物)，产率：100％。

MS m/z(ESI):193.0[M+1]

第三步

2-氟-N-(1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺

氩气保护下，将1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺3c(1.18g,6.20mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(1.67g,7.44mmol)溶和二异丙基乙胺(1.50mL,9.30mmol)于12mL1,4二氧六环中，加热至105℃反应10小时，冷却至室温，减压浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:二氯甲烷：甲醇体系)，得到2-氟-N-(1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺3d(1.155g，褐色油状物)，产率：70％。

MS m/z(ESI):267.0[M+1]

第四步

(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯

氩气保护下，将2-氟-N-(1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺3d(1.155g,4.34mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯1c(0.98g,5.63mmol)和乙酸(0.52g，8.68mmol)溶于10mL甲苯中，85℃反应5小时，冷却至室温，减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯体系)，得到

(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯3e(0.95g，黄色泡沫状固体)，产率：47.5％。

MS m/z(ESI):474.9[M+1]

第五步

将(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯3e(0.95g,2.00mmol)溶于19.5mL四氢呋喃和甲醇(V/V＝2/1)的混合溶液，缓慢加入7.5M氢氧化钠溶液2.7mL，室温反应2小时，用2N盐酸溶液调反应液pH＝6～7，减压浓缩除去溶剂，加入10mL水和20mL乙酸乙酯，用2M盐酸调节溶液pH＝2，分层，水相用乙酸乙酯(15mL x2)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯体系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸3(320mg，淡黄色固体)，产率：34.4％。

MS m/z(ESI):460.9[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝12.61(br.s.,1H),10.70(s,1H),7.54(d,J＝16.1Hz,1H),7.47(d,J＝10.5Hz,2H),7.19-7.14(m,2H),6.87-6.80(m,1H),6.67(d,J＝16.1Hz,1H),5.21(s,1H),3.50(d,J＝5.3Hz,1H),2.93-2.81(m,2H),2.57(d,J＝4.3Hz,1H),2.41-2.27(m,1H),1.24-1.16(m,3H),1.16-1.08(m,3H),1.04(d,J＝6.5Hz,3H).

实施例4

(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸

第一步

(Z)-4-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚

将4-氟-1H-吲哚-3-甲醛4a(1.0g，6.1mmol)、14.2mL硝基乙烷、乙酸铵(235mg，3.05mmol)溶于6.0mL乙酸中，氩气保护下，110℃反应6小时。反应液减压浓缩，加入20mL乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液(15mL)洗涤，水相用乙酸乙酯(15mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到(Z)-4-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚4b(1.374g，棕色固体)，产率：100％。

第二步

1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺

将氢化铝锂(0.95g，25.0mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中，冰浴下缓慢加入(Z)-4-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚4b(1.374g，6.20mmol)溶于10mL四氢呋喃的溶液，然后加热至回流反应6小时。向反应液中依次加入0.95mL水、0.95mL氢氧化钠溶液(15％)和19mL水淬灭反应，无水硫酸镁(5.0g)搅拌15分钟，过滤，用四氢呋喃(5mL x3)洗涤滤饼，滤液减压浓缩，得到1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺4c(1.20g，褐色油状物)，产率：100％。

MS m/z(ESI):193.0[M+1]

第三步

2-氟-N-(1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺

氩气保护下，将1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺4c(1.20g,6.20mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(1.67g,7.44mmol)溶和二异丙基乙胺(1.50mL,9.30mmol)于12mL1,4二氧六环中，加热至105℃反应10小时，冷却至室温，减压浓缩，加入20mL乙酸乙酯溶解，依次用水(15mL)和饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:二氯甲烷：甲醇体系)，得到2-氟-N-(1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺4d(1.07g，褐色油状物)，产率：65％。

MS m/z(ESI):267.0[M+1]

第四步

(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯

(E)-3-(3,5-二氟-4-((1S,3S)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯

氩气保护下，将2-氟-N-(1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺4d(1.07g,4.00mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯1c(0.90g,4.00mmol)和乙酸(0.46mL，8.00mmol)溶于9mL甲苯中，85℃反应7小时。冷却至室温，减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯体系)，所得油状物加入10mL二氯甲烷中缓慢搅拌，有大量固体析出，过滤，滤饼用少量冰冷的二氯甲烷洗涤，滤饼干燥，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(0.68g，白色固体)，产率：36％，通过临界流体色谱(SFC)法，用制备设备和手性柱对手性异构体进行拆分(手性柱ChiralCel OJ,250×30mm I.D.50mL/min；流动相A：CO2；B：甲醇)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯4e(325.68mg，白色固体)和(E)-3-(3,5-二氟-4-((1S,3S)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯4f(313.33mg，白色固体)。

MS m/z(ESI):474.9[M+1]

第五步

将(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯4e(325.68mg,0.686mmol)溶于6mL四氢呋喃和甲醇(V/V＝2/1)的混合溶液，缓慢加入7.5M氢氧化钠溶液0.9mL，室温反应1小时，用2N盐酸溶液调反应液pH＝6～7，减压浓缩除去溶剂，加入5mL水和10mL乙酸乙酯，用2M盐酸调节溶液pH＝2，分层，水相用乙酸乙酯(5mL x2)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压下浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析进一步分离纯化(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯体系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡咯并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸4(295mg，淡黄色固体)，产率：93％。

MS m/z(ESI):460.9[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝10.92(br.s.,1H),7.54(d,J＝16.1Hz,1H),7.47(d,J＝10.5Hz,2H),7.05-6.99(m,1H),6.98-6.91(m,1H),6.73-6.64(m,2H),5.22(br.s.,1H),3.47(d,J＝5.0Hz,1H),3.15-2.99(m,1H),2.93-2.81(m,1H),2.71(dd,J＝4.1,15.2Hz,1H),2.41-2.29(m,1H),1.18(br.s.,3H),1.16-1.09(m,3H),1.07(d,J＝6.5Hz,3H).

生物学评价

测试例1雌激素受体ERα配位分析

本发明利用Lantha Screen^TM时控荧光共振能量转移技术(TR-FRET)对化合物和分离得到的雌激素受体ERα配体作用域之间的竞争性配位作用进行评价。在TR-FRET配位评价技术中用的荧光团(Fluormone ES2,产品序号P2645)和重组人雌激素受体ERα配体作用域(产品序号PV4543)是从Invitrogen公司购买。本测试的设计原理如下，雌激素受体ERα-LBD(GST)和含有荧光团的配体形成一个受体/荧光团复合物，然后加入铽(Tb)标记的抗GST抗体(产品序号PV3551)，通过和受体上的GST链接来实现受体的间接荧光标记，通过检测荧光标记ERα上的发色团(Tb-抗GST抗体)和荧光配体(Fluormone ES2)之间的TR-FRET效应的减弱来评价测试化合物和荧光配体同受体之间的竞争性配位能力。采用如下的样品制备和测试方法对合成化合物进行了上述测试。所用的仪器为Beckman Coulter BioPAPTR FRD微流动工作仪。

(1)将120nL测试化合物通过超声分散到黑色小容量384孔分析板。

(2)在ES2的缓冲液中制备1x ERα-LBD/Tb-抗GST抗体复合物并在其中培养20分钟。

(3)测试之前往上述ERα-LBD/Tb-抗GST抗体复合物溶液中再加入1x ES2待用。

(4)将步骤3制备的ERα-LBD/Tb-抗GST抗体复合物溶液12μL加入到分析板孔中。

(5)将分析板避光保存，在室温下培养一个小时。

(6)在337nm的激发光下，用BMG Phera STAR检测490nm和520nm两个波段的发射光。

用Labcyte Echo550将在微板上配制好的各种不同浓度(10mM,0.1mM,1μM和10nM)的测试化合物转移到分析板上。每个测试化合物的120nL的DMSO溶液被加入到分析板孔中，十二个不同浓度被分别测试(100,29.17,10.42,2.083,1,0.292,0.104,0.02083,0.01,0.0029,0.00104,0.001μM)。得到的TR-FRET原始荧光测试数据借助于Origin或是Genedata等数据处理软件得到拟合曲线。采用每个化合物的半抑制浓度IC₅₀来表征测试化合物与雌激素受体ERα的竞争性配位作用。IC₅₀代表荧光团(ES2)与雌激素受体配位作用下降50％时所推算的测试化合物浓度，测定的IC₅₀如表2所示。

测试例2 MCF-7细胞ERα下调降解测试

本发明优选化合物对ERα蛋白水平的下调作用是在人体管乳腺癌细胞株MCF-7中通过免疫荧光分析来评价的。实验所用到的MCF-7细胞是直接从冷冻细胞(约5x10⁶个)复苏过来用的。从Sigma购买的MCF-7冷冻细胞株(Sigma D5921)是保存在2mM L-谷氨酸的DMEM培养液中。在复苏的MCF-7细胞中加入5％(v/v)Charcoal/Dextran处理过的牛血清胚胎细胞，并用Coulter Counter来测定细胞浓度。测试所用的细胞用培养液稀释到3.75x10⁴个/mL,移取40uL/孔上述细胞液到黑色透明底的384孔板上，然后孔板在37℃,5％的CO₂下培养过夜。10mM的测试化合物溶液被用于不同浓度测试液(10mM,0.1mM,1μΜ,0.01μΜ)的配制。往各种不同浓度的测试化合物和MCF-7细胞培养液(40μL)中加入20μL的11.1％(v/v)的甲醛水溶液(磷酸PBS缓冲液)，最后溶液中甲醛的浓度为3.7％(v/v)。细胞在室温下固定20分钟后，用250μL的PBS/Proclin洗两次，再加入40μL的PBS/Proclin后于4℃下冷藏。蛋白的免疫染色分析法是用自动AutoElisa试剂盒完成的。从各个板孔中移取PBS/Proclin液，然后加入40μL含0.5％Tween^TM 20(v/v)的PBS进行细胞透性化处理，一小时后，孔板用250μL的PBS/0.05％Tween 20/Proclin清洗三遍，加入20μL的ERα兔单克隆抗体(Thermofisher)的PBS/Tween^TM 20/3％(w/v)BSA溶液(1:1000)。分析孔板在4℃下培养过夜，用250uL的PBS/Tween^TM 20/Proclin清洗三次，然后每孔中加入20μL的山羊抗兔IgG AlexaFluor 594或是山羊抗兔IgG AlexaFluor 488抗体(含有Hoechst染色剂)的PBS/Tween^TM 20/3％(w/v)BSA溶液(1:5000)，体系在室温下培养一个小时。分析孔板用250μL的PBS/0.05％(v/v)Tween^TM20/Proclin清洗三次，加入20μL的PBS溶液，孔板于4℃下避光保存。通过CellomicsArrayscan检测孔板594nm(24小时时间点)和488nm(5小时时间点)两个发射波段的荧光发射强度来计算MCF-7细胞中雌激素受体ERα的水平。每个细胞的平均荧光发射强度与该细胞的ERα受体水平正相关。得到的原始荧光测试数据借助于Origin或是Genedata等数据处理软件得到拟合曲线。我们用半抑制浓度IC₅₀来表征测试化合物的对雌激素受体ERα的下调作用，IC₅₀是指荧光发射强度降低为平均最大荧光强度的50％时测试化合物的浓度，测定的IC₅₀如表2所示。

表2雌激素受体ERα配位分析测试结果和ERα下调降解试验测试结果

备注：IC₅₀范围0.1nM≤A≤10nM。

结论：本发明优选化合物与雌激素受体能够较好的配位，且对于ERα具有较好的下调作用。

测试例3雌激素受体ERα与本发明优选化合物竞争性结合分析

本发明利用Fluorescece polarization^TM(FP)荧光偏振技术对化合物和纯化得到的雌激素受体ERα配体作用域之间的竞争性结合作用进行评价。

在FP配位评价技术中用的PolarScreen ER Alpha competitor Assay试剂盒是从Invitrogen公司购买(货号A15883)，主要成分有荧光团(Fluormone ES2,货号P2645)和重组人雌激素受体ERα配体作用域(货号A15674)。

本测试的设计原理如下，雌激素受体ERα与含有荧光团的配体Fluormone ES2形成一个受体/荧光团复合物，经激发后会产生高偏振光信号值(ΔmP)，通过检测ΔmP的减弱来评价测试化合物和荧光配体同受体之间的竞争性结合能力。

采用如下的样品制备和测试方法对受试化合物进行了上述测试：

(1)Labcyte 384孔板(货号P-05525)中用DMSO梯度稀释10mM的测试化合物溶液(第一个浓度为33.33μM，3倍稀释，10个浓度)；

(2)用Echo550转移60nL到黑色小容量384孔分析板(购买自Corning，货号3676)；

(3)在ES2 Screening Buffer中稀释ERα和Fluormone^TM ES2，终浓度：ERα＝150nM,Fluormone^TM ES2＝4.5nM，轻轻混匀，Apricot转移20μL到384孔分析板；

(4)封板膜封板，避光25℃孵育60分钟；

(5)Envision读取fluorescence polarization value(mP)；

得到的mP值经Graphpad Prism 6.0处理软件得到拟合曲线。

采用半抑制浓度IC₅₀来表征测试化合物与雌激素受体ERα的竞争性结合作用。IC₅₀代表荧光团(ES2)与雌激素受体结合作用下降50％时所计算的测试化合物浓度，测定的IC₅₀如表3所示。

表3化合物与雌激素受体ERα结合分析测试结果

实施例编号	IC<sub>50</sub>(nM)
		4	25.7

结论：本发明优选化合物与雌激素受体有较好亲和力。

测试例4本发明优选化合物在MCF-7细胞中下调降解ERα蛋白量测试

本发明中优选化合物对ERα蛋白水平的下调作用是在人体管乳腺癌细胞株MCF-7中通过免疫荧光分析来评价的。

实验所用到的MCF-7细胞(购买自ATCC，货号HTB-22)冻存在含有20％的胎牛血清(FBS,购买自GIBCO，货号10099-141)和10％DMSO(购买自Solarbio，货号D8371)的DMEM(购买自GIBCO，货号11995-063)培养液中。冷冻细胞(约2x10⁶个)复苏后在含有10％FBS和1％Pen/Step(购买自Gibco，货号15140-122)的DMEM培养液中培养，传代两次后用于实验。用含有2％Activated charcoal(购买自Sigma，货号C3345)处理过的FBS和1％Pen/Step的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数仪(购买自Invitrogen，型号C10281)测定细胞浓度后用测试培养液稀释到3.75×10⁴个/mL，移取40μL/孔上述细胞悬液到黑色底透的384孔板(购买自BD，货号356663)中，在37℃,5％的CO₂细胞培养箱中培养过夜。在Labcyte384孔板中用DMSO梯度稀释10mM的测试化合物溶液(10mM稀释300倍后得到33.33μM作为第一个浓度，依次做3倍稀释，10个浓度)，再用Echo550(购买自Echo，型号550)转移120nL到40μL细胞培养基中，DMSO终浓度为0.3％，测试化合物第一个浓度为100nM，室温1000rpm离心1min后细胞置于37℃,5％的CO₂细胞培养箱中培养过夜。用Apricot(购买自Apricot Designs，型号PPA-384-E)吸出细胞培养板中的培养基，加入40μL PBS浸洗细胞一次，吸出PBS后加入40μL 3.7％(v/v)的甲醛水溶液(购买自Sigma，货号F1635，用PBS稀释)，细胞在25℃固定20分钟；吸出甲醛水溶液后用40μL PBS浸洗细胞一次，加入40μL终浓度为0.5％的Tween-20(PBS稀释)25℃渗透1h；吸出渗透液后用PBS-T(含有0.05％Tween-20的PBS)浸洗细胞一次，加入25μL ER抗体(购买自CST，货号8644S)稀释液(1:1000，用PBS-T中含有1％的milk稀释)，25℃孵育1.5h；PBS-T浸洗细胞3次，加入二抗(购买自ThermoFisher，货号A-11008)稀释液(1:1000，用PBS中含有1％的milk稀释)2μg/mL的Hochest 33342(购买自Molecular Probe，货号H3570)，25℃避光孵育40min；PBS-T浸洗细胞3次，PBS浸洗细胞2次，最终加入40μL PBS后用Acumen读取ERα蛋白信号值与细胞核信号值的比率(相对荧光强度)，用Graphpad Prism6.0处理软件得到拟合曲线。

采用半抑制浓度IC₅₀来表征测试化合物的对雌激素受体ERα的下调作用，IC₅₀指ERα蛋白相对荧光强度降低为平均最大相对荧光强度的50％时测试化合物的浓度，测定的IC₅₀如表4所示。

表4雌激素受体ERα在MCF-7细胞中下调降解试验测试结果

实施例编号	IC<sub>50</sub>(nM)
		4	0.136

结论：本发明优选化合物对ERα蛋白量有较好的下调作用。

测试例5本发明优选化合物在MCF-7细胞中ERα功能活性下调测试

本发明中优选化合物对ERα蛋白功能活性的下调作用是在人体管乳腺癌细胞株MCF-7中通过免疫荧光分析来评价的。

实验所用到的MCF-7细胞冻存在含有20％的胎牛血清和10％DMSO的DMEM培养液中。冷冻细胞(约2x10⁶个)复苏后在含有10％FBS和1％Pen/Step的DMEM培养液中培养，传代两次后用于实验。用含有10％(v/v)Activated charcoal处理过的FBS和1％Pen/Step的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数仪测定细胞浓度后用测试培养液稀释到3.75×10⁴个/mL，移取40μL/孔上述细胞悬液到黑色底透的384孔板中，在37℃,5％的CO₂细胞培养箱中培养过夜。在Labcyte 384孔板中用DMSO梯度稀释20mM的Estradiol的储液到33.33nM，再用Echo550转移120nL到40μL细胞培养基中，Estradiol终浓度0.1nM，DMSO终浓度为0.3％，在37℃,5％的CO₂细胞培养箱中孵育30min；在Labcyte 384孔板中用DMSO梯度稀释10mM的测试化合物溶液(第一个浓度为33.33μM，3倍稀释，10个浓度)，再用Echo550(购买自Echo，型号550)转移120nL到40μL细胞培养基中，DMSO终浓度为0.6％，测试化合物第一个浓度为100nM，室温1000rpm离心1min后细胞置于37℃,5％的CO₂细胞培养箱中培养过夜。用Apricot吸出细胞培养板中的培养基，加入40μL PBS浸洗细胞一次，吸出PBS后加入40μL3.7％(v/v)的甲醛水溶液，细胞在25℃固定20分钟；吸出甲醛水溶液后用40μL PBS浸洗细胞一次，加入40μL终浓度为0.5％的Tween-20(PBS稀释)25℃渗透1h；吸出渗透液后用PBS-T浸洗细胞一次，加入25μL PR抗体稀释液(1:2500，用PBS-T中含有1％的milk稀释)，25℃孵育1.5h；PBS-T浸洗细胞3次，加入二抗(稀释液(1:1000，用PBS中含有1％的milk稀释)2μg/mL的Hochest 33342，25℃孵育40min；PBS-T浸洗细胞3次，PBS浸洗细胞2次，最终加入40μLPBS后用Acumen读取ERα蛋白信号值与细胞核信号值的比率(相对荧光强度)，用GraphpadPrism 6.0处理软件得到拟合曲线。

采用半抑制浓度IC₅₀来表征测试化合物的对雌激素受体ERα的下调作用，IC₅₀指ERα蛋白相对荧光强度降低为平均最大相对荧光强度的50％时测试化合物的浓度，测定的IC₅₀如表5所示。

表5雌激素受体ERα在MCF-7细胞中功能活性下调试验测试结果

实施例编号	IC<sub>50</sub>(nM)
		4	0.437

结论：本发明优选化合物对雌激素受体ERα的功能活性有较好的下调作用。测试例6本发明实施例化合物对MCF-7细胞抑制IC₅₀值测定

1试剂和耗材

Cell Counting Kit-8(Cat#CK04-13，Dojindo)

96孔培养板(Cat#3599，Corning Costar)

培养基和胎牛血清(GIBCO)

台式酶标仪SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices)

MCF-7人乳腺癌细胞株(购买于中科院上海细胞资源中心)

2试剂配制

培养基的配制：MEM+10％FBS+0.01mg/ml human recombinant insulin

化合物的制备：用DMSO稀释化合物使终浓度为10mM；

3实验步骤

(1)收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μL细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO2培养箱中孵育24小时；

(2)用培养基将待测化合物稀释至所设置的相应作用浓度，按25μL/孔加入细胞。化合物的作用终浓度从1μM开始，4倍梯度稀释，9个浓度点；

(3)细胞置于37℃，100％相对湿度，5％CO₂培养箱中孵育72小时；

(4)吸弃培养基，加入含10％CCK-8的完全培养基置于37℃培养箱中孵育1～5小时；

(5)轻轻震荡后在SpectraMax M5 Microplate Reader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。

4数据处理

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝[(A_c-A_s)/(A_c-A_b)]×100％

A_s:样品的OA(细胞+CCK-8+待测化合物)

A_c:阴性对照的OA(细胞+CCK-8+DMSO)

A_b:阳性对照的OA(培养基+CCK-8+DMSO)

运用软件Graphpad Prism 5并采用计算公式log(inhibitor)vs.response-variable slope进行IC₅₀曲线拟合并计算出本发明优选化合物对MCF-7细胞抑制IC₅₀值，如表6所示。

表6：本发明优选化合物对MCF-7细胞抑制IC₅₀值

实施例编号	IC<sub>50</sub>(nM)
		1	1.35
2	0.63
		3	0.39
4	0.10

结论：本发明优选化合物对MCF-7细胞增殖具有明显的抑制作用。

测试例7本发明优选化合物对MCF-7荷瘤SCID鼠移植瘤的生长抑制作用测试

1.实验目的

本测试用来评价连续21天每天一次口服给予受试物对MCF-7荷瘤SCID鼠移植瘤的生长抑制作用

2.受试物配制

溶剂：20％PEG400，80％去离子水；

受试物的配制：称取适量实施例4化合物和AZD-9496，溶解于PEG400(20％)，溶解后加入80％量灭菌去离子水，震荡均匀。受试药每天于给药前新鲜配制。

3.实验动物

品种和品系：SCID鼠，SPF，雌性，7-9周龄(16～22克)，100只，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，健康状况良好的100只用于实验，适应环境时间5～7天。

4.MCF-7肿瘤细胞培养

MCF-7细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中。培养在37℃，5％CO₂培养箱内。接种前取对数生长期细胞，以0.25％胰蛋白酶消化后PBS洗涤，用不含血清的培养基重新悬浮细胞计数，调整细胞浓度至7.5×10^7cells/mL(1:1Matrigel，ExtracellularMatrix Proteins，356234，BD)。

5动物接种及分组

每个小鼠在无菌状态下，右侧腋下皮下接种0.2mL细胞悬液(1.5×10^7cells/mouse)。接种后皮下给予雌激素。待肿瘤长至体积150～250mm³左右时，选出肿瘤体积相近、形状较好的小鼠(形状尽量为单一圆球形，无不规则的形状或多个肿瘤聚在一起)每组10只。

6动物给药和观察

各组动物按上表每天固定时间根据动物体重给予受试物1天1次(qd)，口服给药(po)，连续21天，并记录每天动物体重。

观察各组动物接种部位肿瘤的形成状况，每周2次用游标卡尺测量肿瘤结节的长径(Y)和短径(X)，并按如下公式计算：

肿瘤结节的体积(V)：V＝(X²Y)/2。

抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率TGI(％)，相对肿瘤增殖率T/C(％)。

肿瘤生长抑制率TGI(％)：TGI(％)＝(V_c-V_t)/V_c×100。其中V_c为模型对照组肿瘤体积，V_t为受试物组肿瘤体积。

相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)：RTV＝V_n/V₀。其中V₀为分组给药时的肿瘤体积，V_n为测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100。其中T_RTV为治疗组RTV，C_RTV为阴性对照组RTV。

7结果

本发明优选化合物对乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长抑制率(TGI％)如表7所示。

表7：发明优选化合物对乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长抑制率(TGI％)

在10mg/kg剂量下，本发明实施例4在21天内对于乳腺癌MCF-7具有明显的抑制作用，其TGI％在29.4～80.4，优于AZD-9496。

实施例4化合物和AZD-9496在10mg/kg剂量下，对乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长抑制率如图1所示，实施例4化合物对于肿瘤体积的抑制率明显优于AZD-9496。

Claims

1.一种通式(I)所示的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：

其中：

R¹和R²各自独立地选自氢原子或卤素；

R³选自C₁-C₁₀烷基，其中所述的C₁-C₁₀烷基进一步被一个或多个卤素所取代；

R⁴选自C₁-C₄烷基或卤素；

n为1。

2.根据权利要求1所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其为通式(II)所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐：

其中：R¹、R²、R³、R⁴和n的定义如权利要求1中所述。

3.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中R¹和R²为F。

4.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中R³为C₁-C₄烷基，其中所述的烷基进一步被一个或多个选自F、Cl、Br或I的取代基所取代。

5.根据权利要求4所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中R³为C₁-C₄烷基，其中所述的烷基进一步被一个或多个选自F或Cl的取代基所取代。

6.根据权利要求4所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中R³为C₁-C₄烷基，其中所述的烷基进一步被一个或多个F所取代。

7.根据权利要求4所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中R³为异丙基，其中所述的异丙基进一步被一个或多个选自F、Cl、Br或I的取代基所取代。

8.根据权利要求4所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中R³为异丙基，其中所述的异丙基进一步被一个或多个选自F或Cl的取代基所取代。

9.根据权利要求4所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中R³为异丙基，其中所述的异丙基进一步被一个或多个F所取代。

10.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：

R¹和R²各自独立地选自卤素；

R³选自卤素取代的C₁-C₄烷基。

11.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：

R¹和R²各自独立地选自F；

R³选自卤素取代的C₁-C₄烷基。

12.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：

R¹和R²各自独立地选自F；

R³选自F取代C₁-C₄烷基。

13.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中：

R¹和R²各自独立地选自F；

R³选自氟代异丙基。

14.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，其中所述的化合物选自：

15.根据权利要求1所述的通式(I)化合物的制备方法，所述方法包括：

通式(IA)和通式(IB)在酸性条件下反应，进一步酯水解，得到通式(I)化合物；

其中：R^a为烷基；

R¹、R²、R³、R⁴和n的定义如权利要求1中所述。

16.根据权利要求2所述的通式(II)化合物的制备方法，所述方法包括：

通式(IIA)和通式(IB)在酸性条件下反应，进一步酯水解，得到通式(II)化合物；

其中：R^a为烷基；

R¹、R²、R³、R⁴和n的定义如权利要求1中所述。

17.一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效剂量的根据权利要求1～14任何一项所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，该药物组合物进一步包括抗氧化剂或金属螯合剂。

19.根据权利要求1～14任何一项所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或根据权利要求17～18任何一项所述的药物组合物在制备用于治疗雌激素受体介导的疾病的药物中的用途，其中所述的疾病为癌症。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述的癌症为乳腺癌或妇科癌症。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述的妇科癌症为卵巢癌或子宫内膜癌。

22.根据权利要求19所述的用途，其中所述的雌激素受体为雌激素受体α。

23.根据权利要求1～14任何一项所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐，或根据权利要求17～18任何一项所述的药物组合物在制备选择性雌激素受体下调剂中的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述的选择性雌激素受体下调剂为雌激素受体α下调剂。

25.根据权利要求1～14任何一项所述的化合物或其立体异构体、互变异构体或其可药用的盐或根据权利要求17～18任何一项所述的药物组合物与一种或多种其他抗肿瘤药物联合用于制备治疗雌激素受体介导的疾病的药物中的用途，其中所述的疾病为癌症。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述的癌症为乳腺癌或妇科癌症。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述的妇科癌症为卵巢癌或子宫内膜癌。

28.根据权利要求25所述的用途，其中所述的雌激素受体为雌激素受体α。

29.根据权利要求25所述的用途，其中所述其他抗肿瘤药物包括烷化剂、抗代谢类药物、具有抗肿瘤活性的天然产物及其衍生物、细胞毒素类药物或阻滞免疫细胞迁移类药物。