CN109536585A - 细胞一步法实时定量pcr的方法、配套试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法、配套试剂及应用还有试剂盒。本发明提供的细胞一步法实时定量PCR的方法，方法步骤如下：步骤a、提取目标细胞加入裂解Buffer，混匀后室温放置后，离心除去细胞碎片得到上清液；步骤b、对上述目标细胞内参基因进行跨内含子设计，并检测特异性；步骤c、取步骤a的上清液加入反应体系液进行一步RT‑qPCR检测。将反转录和qPCR试剂和程序合为一步RT‑qPCR。本发明其中一方面开发了一种裂解细胞且裂解上清可直接用于RT‑qPCR的裂解buffer。此裂解方法相较传统提RNA法具有省时省力、操作难度低、安全隐患小、成本低等优点。此方法可适用于多种实验检测，如单克隆表达差异比较，蛋白或抗体对细胞的生物活性作用等。
Description
技术领域
本发明属于分子和细胞生物学领域，特别涉及PCR检测。
背景技术
RT-PCR(Real time-polymerase chain reaction，实时PCR)是一种体基于PCR技术基础上，发展出来的可以实时检测基因表达水平的方法，现在广泛应用于药物功能鉴定、信号通路研究和体外诊断等多个领域，是检测细胞中基因转录水平的最重要工具。随着生物技术在诊断和医药行业的广泛应用，对于多个病人细胞中的有限基因表达差异的检测、同种靶点多种候选药物对某几个基因表达影响的检测以及生产大分子药物的高转录活跃位点高表达的稳定细胞株都对相对大规模的基因转录水平检测提出了更高的要求。
常规的细胞中基因转录水平检测的RT-PCR方法，主要分为三步：第一，RNA抽提；第二，RNA反转录成cDNA；第三，通过荧光染料或探针法进行定量PCR扩增。其中RNA抽提一般是Trizol处理细胞，氯仿抽提，还需要异丙醇和乙醇等多种有机试剂，每次抽提都要耗时几个小时，且所用试剂具有毒性，由于RNA比较容易降解，实验存在不稳定性。综上所述，环境不友好、耗时长、所需试剂多成本高、对操作人员要求较高和操作繁琐等，对于多样本实验可执行性不强。同时RNA抽提需要细胞数量较多，对于样本珍贵的情况更是无法处理。
市场上也存在单细胞PCR或测序技术，这些技术难度高、成本高。二代测序可以分析更多的基因，但对于一般候选药物筛选或转录活跃位点筛选，需要检测的基因单一或者较少，但是样本量巨大，二代测序即使成本在下降，也不适用于大样本少量基因表达变化的检测。
发明内容
为了解决上述现有各种方法的不足，本发明其中一方面开发了一种裂解细胞且裂解上清可直接用于RT-qPCR的裂解buffer、细胞一步法实时定量PCR的方法、配套试剂及应用还有试剂盒。此裂解方法相较传统提RNA法具有省时省力(仅需10～20min)、操作难度低、安全隐患小、成本低等优点。此方法裂解的细胞上清不仅可用于检测正常数量细胞(1000～2000)目的基因表达，而且还适用于检测少量甚至微量细胞(10～100)样本。此方法可适用于多种实验检测，如单克隆表达差异比较，蛋白或抗体对细胞的生物活性作用等。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，该方法步骤如下：
步骤a、提取目标细胞加入裂解Buffer，混匀后室温放置后，离心除去细胞碎片得到上清液；
步骤b、取步骤a的上清液加入反应体系液进行一步RT-qPCR检测。将反转录和qPCR试剂和程序合为一步RT-qPCR。
在一些实施例中还包括对上述目标细胞内参基因进行跨内含子设计，并检测特异性的步骤。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、Triton X-100、RNase Inhibitor和DTT。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，裂解Buffer由水配制，包含5mM Tris-Hcl(pH 8.0)、1～20mM EDTA、0.1％～2％Triton X-100、0.2～2U RNase Inhibitor和0.1M DTT。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，步骤a的步骤如下：提取目标细胞并细胞计数后取细胞至EP管中，离心后弃去上清加入所述一步法裂解Buffer，混匀后室温放置5～10min，离心去除细胞碎片得到上清液。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，反应体系液包含1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(可以从吴江近岸蛋白质科技有限公司购买)、SYBR qPCR SuperMix Plus(可以从吴江近岸蛋白质科技有限公司购买)、对应引物和DEPC水。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，步骤c还可以包含如下步骤，取所述上清液1ul于8连管中加入所述反应体系液，反应体系液为2ul1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、5ul SYBR qPCR SuperMix Plus、对应引物包含正向和反向引物各0.5ul和11ul DEPC水，终体积20ul，进行一步RT-qPCR检测。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，目标细胞为CHO-DG44细胞，对应引物如下：
CHOGAPDH180-F如SEQ No.1：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA；
CHOGAPDH180-R如SEQ No.2：GGGTGGGCTTCTTACTCCT；
为5’到3’，以下序列未特别说明皆为5’到3’。
在目标细胞为Jurkat细胞时对应引物如下：
hGAPDH207-F如SEQ No.3；
hGAPDH207-R如SEQ No.4；
还包含：
hIL2-F如SEQ No.5；
hIL2-R如SEQ No.6。
在目标细胞为
产IL-6单克隆抗体的CHO DG44细胞(筛选产IL-6抗体的CHO DG44的稳定细胞株)，对应引物如下：
hIL6A-F如SEQ No.7；
hIL6A-R如SEQ No.8。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种用于细胞一步法实时定量PCR的裂解Buffer，包含水、Tris-Hcl、EDTA、Triton X-100、RNase Inhibitor和DTT。
根据本发明的一方面，本发明提供了细胞一步法实时定量PCR的方法的应用，上述任意一种细胞一步法实时定量PCR的方法用于细胞中基因转录水平的检测、细胞的目的基因表达水平的测检、蛋白或抗体对细胞的生物活性作用的检测、单克隆间表达差异的检测。
根据本发明的一方面，本发明提供了细胞一步法实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含裂解Buffer和反应体系液，裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、Triton X-100、RNase Inhibitor和DTT，反应体系液包含1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、SYBRqPCR SuperMix Plus、对应引物和DEPC水。
本发明的细胞一步法实时定量PCR的方法为细胞直接裂解qPCR检测法，简称细胞直接裂解法。
本发明克服了常规方法的繁琐的RNA抽提步骤，并且将RNA抽提、反转录和定量PCR结合在一起，提高了效率，同时结果与常规方法有较强的一致性。
附图说明
图1、为本发明其一个实施例中为提取RNA后RT-qPCR和本发明的细胞直接裂解qPCR检测法结果-扩增曲线和熔解曲线比较图；
图2、为本发明其中一个实施例中本发明的细胞直接裂解法标准曲线图；
图3、为本发明其中一个实施例中细胞直接裂解法检测blinatumomab抗体对Jurkat细胞激活作用；
图4、ELSIA法检测blinatumomab抗体对Jurkat细胞激活作用；
图5、本发明的直接裂解法的RT-qPCR结果图；
图6、为本发明其中一个实施例中单克隆细胞培养5天后，15％SDS-PAGE凝胶比较蛋白表达差异图。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1本发明的细胞直接裂解法与传统RNA抽提方法的比较
1.1细胞直接裂解qPCR检测
使用DEPC水配制1×裂解Buffer：5mM Tris-Hcl(pH 8.0)+1～20mM EDTA+0.1％～2％Triton X-100+0.2～2U RNase Inhibitor(可购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)+0.1M DTT。复苏CHO-DG44细胞，传代培养3次。细胞计数后取细胞至EP管中，离心后弃去上清。加入1×裂解Buffer(细胞终密度为300个/ul)；混匀后室温放置5～10min，离心去除细胞碎片。使用Primer 5.0软件对CHO-DG44细胞内参基因gapdh进行跨内含子引物设计，并使用Blast检测其特异性。取1ul上清于8连管中，加入2ul 1st Strand cDNASynthesis SuperMix(可购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)、5ul SYBR qPCRSuperMix Plus(可购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)、对应引物(正向和反向引物各0.5ul，引物序列详见表1)和11ul DEPC水，终体积20ul。进行一步RT-qPCR检测，每个样3个平行。反应温度及时间如表2。
表1.细胞裂解法与传统RNA抽提法比较使用的引物
1.2传统RNA抽提方法检测
使用酚氯仿抽提法抽提1.0×106个CHO细胞RNA后，40ul的DEPC水重悬RNA沉淀。使用2％琼脂糖胶鉴定无误后测定其浓度。取0.1ul RNA溶液用于一步RT-qPCR检测。(修改备注：将反转录和qPCR合为一步RT-qPCR法，调整数字以匹配后续计算)反应时间及温度同上。
表2.qPCR具体反应温度及时间
如图1所示提取RNA后RT-qPCR和直接裂解法qPCR结果-扩增曲线和熔解曲线，其中图1-A为扩增曲线，图1-B为熔解曲线。传统提取RNA为①号曲线，直接裂解法为②号曲线。
图1-B显示传统提取RNA法和直接裂解法熔解曲线峰值单一，说明两者扩增产物特异且相同。图1-A扩增曲线展示了传统RNA抽提法(Ct＝17.6±0.51，1250个细胞)和直接裂解法(Ct＝20.3±0.16，300个细胞)间的差异，实验结果表明细胞数量相差约8倍的条件下(2500/300≈8.3)，目的基因的表达水平相差(2ΔCt＝2^(Ct直接裂解法-CtRNA抽提法)约为6.7倍，说明两种方法检测相同数量细胞时，结果相似。证明了本发明的细胞直接裂解qPCR检测法与传统RNA抽提法存在较强的一致性。
实施例2直接裂解法细胞数目检测范围及标准曲线的建立
取密度为2000个/ul的细胞并用1×PBS进行对数稀释，稀释密度如下：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625个/ul。加入10×裂解buffer室温裂解5min，高速离心后上清用于一步RT-qCPR检测，RT-qPCR程序详见表2。引物序列详见表1。
如图2所示的细胞直接裂解法标准曲线，其中横坐标为log10(细胞数)，纵坐标为Ct值。
本实验结果表明15～2000个细胞裂解上清均可用于RT-qPCR检测且log10(细胞数)与Ct值呈线性关系。证明直接裂解法可检测数量范围较广细胞的目的基因表达水平，同时此方法还可检测少量甚至微量细胞，相较传统RNA抽提法具有更大的优势。
实施例3直接裂解法检测blinatumomab对Jurkat细胞的激活作用
3.1细胞铺板及抗体激活
Jurkat细胞计数，细胞离心重悬后以0.3×106个/ml密度铺96孔板；Raji细胞吹打均匀后计数，以0.3×105个/ml密度铺入预先铺有Jurkat的孔中。铺板过夜，加入不同浓度的blinatumomab(购自安进公司)抗体，孵育过夜。
3.2直接裂解法检测blinatumomab抗体的激活作用
细胞吹打均匀后吸取悬液至EP管中，加入1/10体积的10×裂解buffer。室温裂解5min，高速离心后取上清进行一步RT-qPCR检测。使用Primer 5.0软件设计il-2及内参基因gapdh，使用Blast进行特异性检测。具体引物序列详见表3。
表3.抗体激活Jurkat细胞实验所用引物
如图3所示的细胞直接裂解法检测blinatumomab抗体对Jurkat细胞激活作用，图为直接裂解法检测未激活及激活后Jurkat细胞内IL-2的表达水平。横坐标为blinatumomab使用浓度，纵坐标为样本组相较Control组的倍数。
3.3ELISA法检测blinatumomab抗体的激活作用
检测Jurkat细胞IL-2的分泌。抗体孵育过夜后，吸取细胞上清至酶标板中，37℃孵育1h后1×PBST清洗3次，使用2％BSA封闭1h。清洗3次后，加入Anti IL-2(购自R&D)，37℃孵育1h。清洗3次后，加入酶标二抗37℃孵育1h，清洗3次后，加入TMB，37℃显色20min。使用1MHCl终止反应后在450nm波长下读吸光值。
如图4所示ELSIA法检测blinatumomab抗体对Jurkat细胞激活作用；ELSIA法检测未激活及激活后Jurkat细胞上清中IL-2的分泌含量。横坐标为使用的blinatumomab浓度，纵坐标为OD450读数。
使用直接裂解法检测blinatumomab对Jurkat细胞的激活作用，结果发现2ng/ml的blinatumomab在Raji细胞存在的条件下可大程度激活Jurkat细胞并提高IL-2的表达。同时，ELISA检测证实了此结果的正确性。本实验证明了细胞直接裂解法可用于检测蛋白或抗体对细胞的生物活性作用。
实施例4直接裂解法检测单克隆目的蛋白表达的差异
4.1单克隆铺板及取样
取产人IL-6抗体的CHO DG44稳定株，计数，离心清洗两次。调整细胞密度至3-5个/孔，使用排枪将细胞悬液铺于96孔板，共两板。培养一周后，观察细胞状态并补液，两周后再次补液。约20天后，每孔取细胞悬液于8连管中，加入10×裂解buffer，震荡混匀。室温裂解5min。
4.2RT-qPCR检测
高速离心后取1ul上清至8连管中，加入0.5ul～2ul gDNA Purge(可购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)+0.1～1ul Rnase Inhibitor，DEPC水补至5ul，每孔两个平行。瞬时离心后37℃反应30min以去除基因组。加入2ul1st Strand cDNA SynthesisSuperMix、4ul DEPC水、5ul SYBR qPCR SuperMix Plus和1ul引物(正向和反向引物各0.5ul，具体引物序列详见表4)，瞬时离心后进行一步RT-qPCR检测。
如图5所示的直接裂解法的RT-qPCR结果，直接裂解法检测单克隆间表达水平的差异。图5中5-A为扩增曲线，5-B为熔解曲线。①号曲线1-D6，②号曲线为2-C2，③号曲线为2-C11。
经直接裂解法检测发现1-D6、2-C2以及2-C11单克隆表达水平远高于其它组，其中1-D6表达水平高。实验结果证明直接裂解法可用于检测单克隆间表达差异，且灵敏度较高。
表4.直接裂解法及传统RNA抽提法验证实验所用引物
4.4SDS跑胶检测单克隆目的蛋白表达差异
将上述单克隆细胞留样放大培养后，用相同密度(0.3×106个/ml)铺于6孔板，37℃培养箱静置培养5天，取细胞悬液，3500rpm离心15min收集细胞上清。配制15％SDS-PAGE凝胶，取20ul上清与5ul 5×Loading Buffer(可购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，混匀后沸水反应5min，取20ul混合液或5ul Marker(可购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)上样，检测目的蛋白表达。
如图6所示，单克隆细胞培养5天后，15％SDS-PAGE凝胶比较蛋白表达差异。从结果发现1-D6单克隆表达明显高于其它样本。蛋白表达实验结果与直接裂解法结果一致，这表明可以使用直接裂解法比较多个单克隆目的基因的mRNA表达水平，从而挑选出蛋白表达最高的单克隆。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 吴江近岸蛋白质科技有限公司
<120> 细胞一步法实时定量PCR的方法、配套试剂盒及应用
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Claims (10)
1.一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述方法步骤如下：
步骤a、提取目标细胞加入裂解Buffer，混匀后室温放置后，离心除去细胞碎片得到上清液；
步骤b、取所述上清液加入反应体系液进行一步RT-qPCR检测。
2.根据权利要求1所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、Triton X-100、RNase Inhibitor和DTT。
3.根据权利要求2所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述裂解Buffer由水配制，包含5mM Tris-Hcl(pH 8.0)、1～20mM EDTA、0.1％～2％Triton X-100、0.2～2U RNase Inhibitor和0.1M DTT。
4.根据权利要求3所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述步骤a还可以包含如下步骤：所述提取目标细胞并细胞计数后取细胞至EP管中，离心后弃去上清加入所述一步法裂解Buffer，混匀后室温放置5～10min，离心去除细胞碎片得到上清液。
5.根据权利要求1所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述反应体系液包含1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、SYBR qPCR SuperMix Plus、对应引物和DEPC水。
6.根据权利要求5所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述步骤b还可以包含如下步骤，取所述上清液1ul于8连管中加入所述反应体系液，所述反应体系液为2ul 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、5ul SYBR qPCR SuperMix Plus、对应引物包含正向和反向引物各0.5ul和11ul DEPC水，终体积20ul，进行一步RT-qPCR检测。
7.根据权利要求6所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于，所述目标细胞为CHO-DG44细胞，则所述对应引物如下：
CHOGAPDH180-F如SEQ No.1，
CHOGAPDH180-R如SEQ No.2；
或者所述目标细胞为Jurkat细胞，则所述对应引物如下：
hGAPDH207-F如SEQ No.3，
hGAPDH207-R如SEQ No.4，
还包含：
hIL2-F如SEQ No.5，
hIL2-R如SEQ No.6；
或者所述目标细胞为产IL-6单克隆抗体的CHO DG44细胞，则所述对应引物如下：
hIL6A-F如SEQ No.7，
hIL6A-R如SEQ No.8。
8.一种用于细胞一步法实时定量PCR的裂解Buffer，其特征在于，所述裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、Triton X-100、RNase Inhibitor和DTT。
9.细胞一步法实时定量PCR的方法的应用，其特征在于，权利要求1～7所述的任意一种细胞一步法实时定量PCR的方法用于细胞中基因转录水平的检测、细胞的目的基因表达水平的测检、蛋白或抗体对细胞的生物活性作用的检测、单克隆间表达差异的检测。
10.一种细胞一步法实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含裂解Buffer和反应体系液，所述裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、Triton X-100、RNaseInhibitor和DTT，所述反应体系液包含1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、SYBR qPCRSuperMix Plus、对应引物和DEPC水。
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