CN109715171A - 基因组编辑增强子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗、预防或缓解多种疾病、障碍和病症的基因疗法组合物的经改进的组合物。

Description

基因组编辑增强子

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年8月19日提交的美国临时申请号62/377,357的权益，所述申请通过引用以其全文结合在此。

关于序列表的陈述

与本申请相关联的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用结合到本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_074_01WO_ST25.txt。所述文本文件为4KB，于2017年8月18日创建并且在提交本说明书的同时通过EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

本发明总体上部分涉及经改进的基因疗法组合物及其制作方法。更具体地，本发明涉及经改进的基因组编辑组合物和基因疗法及其制作方法。

相关技术说明

3000个人类基因突变与疾病表型相关联(www.omim.org/statistics/geneMap)，并且正以令人震惊的快速步伐揭示出更多疾病相关的遗传变异。然而，虽然在药物开发方面存在有效治疗假设和大量努力，但是仅在使用小分子治疗疾病方面存在极少数具有强大遗传贡献的成功案例。尚待实现基于如大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子等可编程核酸酶-像用于治疗单基因、高渗透疾病的效应核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸酶Cas9产生基因组编辑策略的巨大潜力。实施基于核酸酶的基因组编辑策略的具体障碍包含但不限于较低的基因组编辑效率、核酸酶特异性和递送挑战。大多数基因组编辑策略的现有技术达不到这些标准中的一些或全部。

发明内容

本发明总体上部分涉及经改进的基因组编辑组合物和使用其开发更安全且更有效的基因疗法的方法。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括细胞群、基因组编辑增强子和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括细胞群、基因组编辑增强子、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在具体实施例中，所述细胞群包括干细胞。

在一些实施例中，所述细胞群包括造血细胞。

在某些实施例中，所述细胞群包括CD34⁺细胞、CD133⁺细胞、CD34⁺CD133⁺细胞或CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^-细胞。

在具体实施例中，所述细胞群包括免疫效应细胞。

在附加实施例中，所述细胞群包括CD3⁺细胞、CD4⁺细胞、CD8⁺细胞或其组合。

在某些实施例中，所述细胞群包括T细胞。

在另外的实施例中，所述细胞群包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助性T细胞。

在一些实施例中，所述细胞的来源为外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括基因组编辑增强子和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括基因组编辑增强子、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在附加实施例中，所述基因组编辑增强子为DNA嵌入剂。

在具体实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：单功能DNA嵌入剂、双功能DNA嵌入剂或多功能DNA嵌入剂。

在附加实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：吖啶、蒽环霉素、生物碱、香豆素和啡啶。

在具体实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：1,8-萘二甲酰亚胺、4'6-二脒基-α-苯基吲哚、吖啶、吖啶橙、吖啶黄素、山油柑碱、黄肉楠碱(actinodaphnidine)、氨吖啶、安吖啶、蒽环霉素、氨茴霉素、蒽吡唑类(anthrapyrazole)、苯并啡啶类生物碱、小檗胺、黄连素、小檗红碱、博莱霉素、BOBO-1、BOBO-3、波尔定碱、BO-PRO-1、BO-PRO-3、空褐鳞碱、喜树碱、无根藤碱、教酒菌素、氯喹、色霉素、辛可尼丁、辛可宁、黄连碱、甲氧檗因、香豆素、白叶藤碱、更生霉素、DAPI、柔红霉素、荷包牡丹碱、白鲜碱、偏端霉素、阿霉素、玫瑰树碱、吐根碱、依沙吖啶、乙啡啶、吴茱萸春、崖椒碱、花椒宁碱、氟香豆素、GelStar、庆大霉素、海罂粟碱、骆驼蓬碱、哈尔碱、赫达霉素、己锭、Hoechst 33258、Hoechst 33342、乙菲啶、海恩酮、咪唑并吖啶酮、吲唑类似物、碘化物、异紫堇定碱、异喹啉生物碱、药根碱、JOJO-1、JO-PRO-1、激动素核苷、kokusainine、山梗烷醇酮、LOLO-1、LO-PRO-1、硫蒽酮、masculine、马塔啶、米帕林、金属嵌入剂、光神霉素、米托蒽醌、新白叶藤碱、纺锤菌素、两面针碱、二胺硝吖啶、诺加霉素、去甲哈尔满、OliGreen、非洲防己碱、啡啶、PicoGreen、吡柔比星、多吡啶、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、原黄素、普罗匹定、补骨脂素、奎纳克林、奎尼定、奎宁、喹喔啉、RiboGreen、铑基嵌入剂、钌基嵌入剂、血根碱、蛇根碱、茵芋碱、链霉素、SYBR DX、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYTO-11、SYTO-12、SYTO-13、SYTO-14、SYTO-15、SYTO-16、SYTO-17、SYTO-20、SYTO-21、SYTO-22、SYTO-23、SYTO-24、SYTO-25、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45、SYTO-59、SYTO-60、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-63、SYTO-64、SYTO-80、SYTO-81、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、他克林、萨力多胺、噻唑橙、替洛隆、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、乌桑巴拉碱、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3及其类似物和衍生物。

在某些实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)、哈尔碱、海恩酮、柔红霉素、血根碱硫酸盐、激动素核苷、乳酸依沙吖啶和环十二碳三烯。

在另外的实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)和哈尔碱。

在具体实施例中，所述基因组编辑增强子为吖啶或二吖啶。

在一些实施例中，所述基因组编辑增强子为氨吖啶(9-氨基吖啶)。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括细胞、吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在具体实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括细胞、吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在附加实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括细胞、9-氨基吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在某些实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括细胞、9-氨基吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在一些实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在另外的实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在具体实施例中，本发明部分地设想了一种组合物，其包括9-氨基吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在各个实施例中，本发明部分地涵盖一种组合物，其包括9-氨基吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

在具体实施例中，所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。

在具体实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

在附加实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

在某些实施例中，所述大范围核酸酶由I-OnuI LHE工程化。

在一些实施例中，所述megaTAL包括TALE DNA结合结构域和工程化大范围核酸酶。

在具体实施例中，所述TALE结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

在一些实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

在某些实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

在具体实施例中，所述大范围核酸酶由I-OnuI LHE工程化。

在另外的实施例中，所述TALEN包括TALE DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

在具体实施例中，所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

在附加实施例中，所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

在具体实施例中，所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

在另外的实施例中，所述ZFN包括锌指DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

在一些实施例中，所述锌指DNA结合结构域包括2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个锌指基序。

在附加实施例中，所述ZFN包括TALE结合结构域。

在具体实施例中，所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

在一些实施例中，所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

在某些实施例中，所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

在另外的实施例中，所述工程化核酸酶包括CRISPR/Cas核酸酶。

在具体实施例中，所述Cas核酸酶是Cas9或Cpf1。

在附加实施例中，所述Cas核酸酶进一步包括一个或多个TALE DNA结合结构域。

在一些实施例中，所述组合物进一步包括tracrRNA和靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个crRNA。

在具体实施例中，所述组合物进一步包括靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个sgRNA。

在附加实施例中，所述工程化核酸酶包括末端加工酶活性。

在具体实施例中，所述末端加工酶活性为5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

在另外的实施例中，所述末端加工酶活性为Trex2或其生物活性片段的3-5'核酸外切酶活性。

在某些实施例中，所述组合物进一步包括末端加工酶或对所述末端加工酶进行编码的mRNA。

在附加实施例中，所述末端加工酶展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

在一些实施例中，所述末端加工酶包括Trex2或其生物活性片段。

在具体实施例中，所述组合物包括对以下进行编码的供体修复模板：β球蛋白、δ球蛋白、γ球蛋白、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、白蛋白、因子VIII、因子IX、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA-4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag-1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS或其片段。

在某些实施例中，所述组合物包括对以下进行编码的供体修复模板：双特异性T细胞衔接子(BiTE)分子；激素；细胞因子(例如，IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15和TNF-α)、趋化因子(例如，MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3和RANTES)、细胞毒素(例如，穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)、细胞因子受体(例如，IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体)或工程化抗原受体。

在附加实施例中，所述组合物包括对以下进行编码的供体修复模板：工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种增加细胞群中基因组编辑的方法，其包括：将工程化核酸酶引入到细胞群中；以及使所述细胞群与基因组编辑增强子接触，其中在存在所述基因组编辑增强子的情况下，所述工程化核酸酶的表达增加了所述细胞群中基因组编辑的频率。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种增加细胞群中同源定向修复(HDR)的方法，其包括：使所述细胞群与基因组编辑增强子接触；引入工程化核酸酶以在靶位点处产生双链断裂(DSB)；以及将供体修复模板引入到所述细胞群中；其中在存在所述基因组编辑增强子和所述供体修复模板的情况下，所述工程化核酸酶的表达增加了通过同源定向修复(HDR)在所述靶位点处并入所述供体修复模板的频率。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种增加细胞群中非同源末端接合(NHEJ)的方法，其包括：使所述细胞群与基因组编辑增强子接触；引入工程化核酸酶以在靶位点处产生双链断裂(DSB)；将工程化核酸酶引入到细胞群中；并且其中在存在所述基因组编辑增强子的情况下，所述工程化核酸酶的表达增加了所述靶位点处NHEJ的频率。

在另外的实施例中，所述细胞是造血细胞。

在附加实施例中，所述细胞是免疫效应细胞。

在一些实施例中，所述细胞为CD3⁺细胞、CD4⁺、CD8⁺细胞或其组合。

在具体实施例中，所述细胞是T细胞。

在附加实施例中，所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助性T细胞。

在另外的实施例中，所述细胞的来源为外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。

在某些实施例中，所述细胞是造血干细胞或造血祖细胞。

在另外的实施例中，所述细胞是CD34⁺细胞。

在具体实施例中，所述细胞是CD133⁺细胞。

在一些实施例中，所述细胞是CD34⁺CD38LoCD90⁺CD45RA^-细胞。

在具体实施例中，所述基因组编辑增强子为DNA嵌入剂。

在附加实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：单功能DNA嵌入剂、双功能DNA嵌入剂或多功能DNA嵌入剂。

在某些实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：吖啶、蒽环霉素、生物碱、香豆素和啡啶。

在另外的实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：1,8-萘二甲酰亚胺、4'6-二脒基-α-苯基吲哚、吖啶、吖啶橙、吖啶黄素、山油柑碱、黄肉楠碱(actinodaphnidine)、氨吖啶、安吖啶、蒽环霉素、氨茴霉素、蒽吡唑类(anthrapyrazole)、苯并啡啶类生物碱、小檗胺、黄连素、小檗红碱、博莱霉素、BOBO-1、BOBO-3、波尔定碱、BO-PRO-1、BO-PRO-3、空褐鳞碱、喜树碱、无根藤碱、教酒菌素、氯喹、色霉素、辛可尼丁、辛可宁、黄连碱、甲氧檗因、香豆素、白叶藤碱、更生霉素、DAPI、柔红霉素、荷包牡丹碱、白鲜碱、偏端霉素、阿霉素、玫瑰树碱、吐根碱、依沙吖啶、乙啡啶、吴茱萸春、崖椒碱、花椒宁碱、氟香豆素、GelStar、庆大霉素、海罂粟碱、骆驼蓬碱、哈尔碱、赫达霉素、己锭、Hoechst 33258、Hoechst 33342、乙菲啶、海恩酮、咪唑并吖啶酮、吲唑类似物、碘化物、异紫堇定碱、异喹啉生物碱、药根碱、JOJO-1、JO-PRO-1、激动素核苷、kokusainine、山梗烷醇酮、LOLO-1、LO-PRO-1、硫蒽酮、masculine、马塔啶、米帕林、金属嵌入剂、光神霉素、米托蒽醌、新白叶藤碱、纺锤菌素、两面针碱、二胺硝吖啶、诺加霉素、去甲哈尔满、OliGreen、非洲防己碱、啡啶、PicoGreen、吡柔比星、多吡啶、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、原黄素、普罗匹定、补骨脂素、奎纳克林、奎尼定、奎宁、喹喔啉、RiboGreen、铑基嵌入剂、钌基嵌入剂、血根碱、蛇根碱、茵芋碱、链霉素、SYBR DX、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYTO-11、SYTO-12、SYTO-13、SYTO-14、SYTO-15、SYTO-16、SYTO-17、SYTO-20、SYTO-21、SYTO-22、SYTO-23、SYTO-24、SYTO-25、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45、SYTO-59、SYTO-60、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-63、SYTO-64、SYTO-80、SYTO-81、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、他克林、萨力多胺、噻唑橙、替洛隆、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、乌桑巴拉碱、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3及其类似物和衍生物。

在某些实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)、哈尔碱、海恩酮、柔红霉素、血根碱硫酸盐、激动素核苷、乳酸依沙吖啶和环十二碳三烯。

在附加实施例中，所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)和哈尔碱。

在具体实施例中，所述基因组编辑增强子为吖啶或二吖啶。

在具体实施例中，所述基因组编辑增强子为氨吖啶(9-氨基吖啶)。

在另外的实施例中，所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。

在附加实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

在某些实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

在一些实施例中，所述大范围核酸酶由I-OnuI LHE工程化。

在另外的实施例中，所述megaTAL包括TALE DNA结合结构域和工程化大范围核酸酶。

在具体实施例中，所述TALE结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

在附加实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

在某些实施例中，所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

在具体实施例中，所述大范围核酸酶由I-OnuI LHE工程化。

在一些实施例中，所述TALEN包括TALE DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

在附加实施例中，所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

在具体实施例中，所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

在另外的实施例中，所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

在某些实施例中，所述ZFN包括锌指DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

在一些实施例中，所述锌指DNA结合结构域包括2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个锌指基序。

在某些实施例中，所述ZFN包括TALE结合结构域。

在附加实施例中，所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

在另外的实施例中，所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

在具体实施例中，所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

在附加实施例中，所述工程化核酸酶包括CRISPR/Cas核酸酶。

在一些实施例中，所述Cas核酸酶是Cas9或Cpf1。

在某些实施例中，所述Cas核酸酶进一步包括一个或多个TALE DNA结合结构域。

在具体实施例中，所述组合物进一步包括tracrRNA和靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个crRNA。

在附加实施例中，所述组合物进一步包括靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个sgRNA。

在另外的实施例中，所述工程化核酸酶包括末端加工酶活性。

在一些实施例中，所述末端加工酶活性为5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

在具体实施例中，所述末端加工酶活性为Trex2或其生物活性片段的3-5'核酸外切酶活性。

在具体实施例中，所述组合物进一步包括末端加工酶或对所述末端加工酶进行编码的mRNA。

在具体实施例中，所述末端加工酶展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

在附加实施例中，所述末端加工酶包括Trex2或其具有生物活性的片段。

在某些实施例中，所述方法包括对以下进行编码的供体修复模板：β球蛋白、δ球蛋白、γ球蛋白、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、白蛋白、因子VIII、因子IX、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA-4、HLAA、HLA B、HLA C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag-1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS或其片段。

在另外的实施例中，所述方法包括对以下进行编码的供体修复模板：双特异性T细胞衔接子(BiTE)分子；激素；细胞因子(例如，IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15和TNF-α)、趋化因子(例如，MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3和RANTES)、细胞毒素(例如，穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)、细胞因子受体(例如，IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体)或工程化抗原受体。

在具体实施例中，所述方法包括对以下进行编码的供体修复模板：工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种通过本文中所考虑的方法产生的细胞。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种包括本文中所考虑的细胞的组合物。

在各个实施例中，本发明部分地设想了一种药物组合物，其包括药学上可接受的载剂和本文中所考虑的细胞。

附图说明

图1示出了流式细胞术数据的分析工作流。

图2A示出了根据对细胞产率的影响的按等级次序的化合物的曲线图。

图2B示出了根据CD3阴性细胞频率的按等级次序的化合物的曲线图。

图2C示出了根据作为细胞产率的函数的CD3阴性细胞频率的化合物的曲线图。

图3A示出了在用于测量在37℃下原代T细胞中非同源末端接合编辑效率的测定中化合物的剂量反应曲线。

图3B示出了在用于测量在30℃下原代T细胞中非同源末端接合编辑效率的测定中化合物的剂量反应曲线。

图3C示出了在用于测量在37℃下原代T细胞产率的测定中化合物的剂量反应曲线。

图3D示出了在用于测量在30℃下原代T细胞产率的测定中化合物的剂量反应曲线。

图4示出了在megaTAL后来自用氨吖啶培养的多个供体的T细胞中的HDR事件(％GFP+细胞)的频率的浓度依赖性增加。

图5示出氨吖啶在靶向BCL11A基因座处而不是在非靶CCR5基因座处诱导CD34+细胞中HDR频率的浓度依赖性增加。

图6示出了在具有或不具有氨吖啶的情况下用单独的megaTAL、具有rAAV的megaTAL处理的甲基纤维素培养的CD34+细胞的谱系分析结果。

图7示出了衍生自在具有或不具有氨吖啶的情况下用单独的megaTAL、具有rAAV的megaTAL处理的原代CD34+细胞的甲基纤维素菌落中升高的HDR比率。

图8示出与未用氨吖啶处理的细胞相比，氨吖啶增加用靶向megaTAL的BCL11A电穿孔并且用AAV供体修复模板转导的大量人CD34⁺细胞中的HDR。

序列标识简要说明

SEQ ID NO:1到11阐述了各种连接子的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12到14阐述了蛋白酶切割位点和自切割多肽切割位点的氨基酸序列。

具体实施方式

A.概述

基因疗法可以部分地依赖于基因组编辑以获得足够的治疗基因表达和/或消除负面影响或降低基因疗法的功效的基因的表达。实施基因组编辑策略的主要限制之一是基因组编辑效率低。本文所设想的基因组编辑策略以及制作和使用其来生成经改进的基因疗法的方法解决了困扰本领域的这些和其它问题。

本文所设想的各个实施例总体上部分涉及经改进的基因组编辑组合物。基因组编辑组合物表示在生成用于治疗单基因障碍、疾病和病症例如血红蛋白病、癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷的基因疗法方面的量子改进。与现有基因疗法相比，使用本文所设想的基因组编辑组合物和方法制造的基因疗法提供了许多优点，包含但不限于降低了生成治疗剂的商品的成本、以在历史上低基因组编辑效率扩大了基因疗法到细胞的范围以及增加了基因疗法组合物的效力。

在具体实施例中所设想的基因组编辑组合物和方法包括基因组编辑增强子，所述基因组编辑增强子增加了在用于制造基因疗法的基于核酸酶的基因编辑策略中同源定向修复(HDR)与非同源末端接合(NHEJ)的比率。

各个实施例设想了包括基因组编辑增强子和工程化核酸酶的基因组编辑组合物。在具体实施例中，基因组编辑增强子优选地是核酸嵌入剂，更优选地基因组编辑增强子是DNA嵌入剂，甚至更优选地基因组编辑增强子是吖啶，并且甚至更优选基因组编辑增强子是9-氨基吖啶。

各种其它实施例设想了提高基因组编辑效率的方法，其包括将工程化核酸酶和核酸嵌入剂引入到细胞群中，与尚未引入核酸嵌入剂的细胞相比，其引入量和时间足以增加细胞中基因组编辑的频率。

除非特别相反地指示，否则具体实施例的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，出于说明的目的，以下描述所述方法中的许多方法。这些技术在文献中有充分说明。参见例如Sambrook等人，《分子克隆(Molecular Cloning)》：《实验室手册(ALaboratory Manual)》(第3版，2001年)；Sambrook等人，《分子克隆(Molecular Cloning)》：《实验室手册(A Laboratory Manual)》(第2版，1989年)；Maniatis等人，《分子克隆》：《实验室手册》(1982)；Ausubel等人，《分子生物学现代方法(Current Protocols in MolecularBiology)》(John Wiley和Sons，2008年7月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology》，格林尼出版公司和威利国际科学(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)；Glover，《DNA克隆(DNACloning)》：《实用方法(A Practical Approach)》，第I卷和第II卷(IRL出版社，牛津，1985年)；Anand，《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of ComplexGenomes)》，(学术出版社，纽约，1992年)；转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames&S.Higgins编辑，1984年)；Perbal，《分子克隆实用指南(A Practical Guide toMolecular Cloning)》(1984年)；Harlow和Lane，《抗体(Antibodies)》，(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港，1998年)《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober编辑，1991年)；《免疫学年度评论(Annual Review ofImmunology)》；以及如《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著。

B.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于实践或测试具体实施例，但本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用的冠词“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种，或一个/种或多个/种)所述冠词的语法宾语。举例来说，“元件”意味着一个元件或一个或多个元件。

替代方案(例如，“或”)的使用应该理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。

术语“和/或”应该理解为意指替代方案中的一种或两种。

如本文所使用的，术语“约(about或approximately)”是指与参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比，变化幅度高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”是指参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的约±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

在一个实施例中，范围例如1到5、约1到5、或约1到约5是指所述范围所涵盖的每个数值。例如，在一个非限制性且仅仅是说明性的实施例中，范围“1到5”相当于表达1、2、3、4、5；或1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。

如本文所用，术语“基本上”是指与参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，“基本上相同”是指产生与参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同的效应例如生理效应的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件组。“由……组成”意指包含并且限于无论在短语“由……组成”之后是什么。因此，短语“由……组成”指示所列出的元件是必需的或强制性的并且可以不存在其它元件。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后所列出的任何元件，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列元件指定的活动或行为的其它元件。因此，短语“基本上由……组成”指示所列元件是必需的或强制性的，但不存在实质上影响所列元件的活动或动作的其它元件。

贯穿本说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“具体实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“附加实施例”或“另外的实施例”或其组合的引用意味着结合所述实施例所描述的特定特征、结构或特性包含在至少一个实施例中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不必全部指代同一个实施例。此外，在一个或多个实施例中，可以以任何适合的方式组合特定特征、结构或特性。还应理解的是，在一个实施例中对特征的肯定叙述用作在具体实施例中排除所述特征的基础。

术语“离体”通常是指在生物体外部发生的活动，如在生物体外部的人工环境中的活组织中或上进行的实验或测量，优选地具有最小的自然条件改变。在具体实施例中，“离体”程序涉及从生物体取得并在实验室设备中通常在无菌条件下并且通常在几小时或高达约24小时但包含高达48小时或72小时(视情况而定)内培养或调节的活细胞或活组织。在某些实施例中，可以收集和冷冻这种组织或细胞并且随后解冻以进行离体治疗。使用活细胞或活组织进行的持续时间超过几天的组织培养实验或程序通常被认为是“体外”，但在某些实施例中，此术语可以与离体可互换地使用。

术语“体内”通常是指在生物体内发生的活动，如细胞自我更新和细胞增殖或扩增。在一个实施例中，术语“体内扩增”是指细胞群增加体内数目的能力。在一个实施例中，细胞在体内被工程化或修饰。

如本文所用，术语“量”是指足以实现期望结果例如细胞群中期望的基因组编辑速率的化合物、组合物或治疗的“有效量(an amount effective)”或“有效量(an effectiveamount)”。

“增强”或“促进”或“增加”或“扩展”或“加强”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的反应相比本文所设想的产生、引发或引起更大反应(即，生理反应)的组合物的能力。可测量的反应可以包含HR或HDR效率的提高。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)于由媒剂或对照组合物产生的反应的增加。

“减少(decrease或lower或lessen或reduce)”或“减轻(abate)”或“消除(ablate)”或“抑制(inhibit或dampen)”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的反应相比，本文所设想的组合物产生、引发或引起更小的反应(即，生理反应)的能力。可测量的反应可以包含内源基因表达或功能的减少、与免疫效应细胞衰竭相关的生物标志物的表达等。“减少的(decrease或reduced)”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)于由媒剂、对照组合物产生的反应(参考反应)或特定细胞谱系中的反应的减少。

“维持(maintain或maintenance)”或“保持”或“无变化”或“无实质变化”或“无实质减少”通常是指与由媒剂、对照分子/组合物或特定细胞谱系中的反应所引起的反应相比，本文所设想的组合物在细胞中产生、引发或引起基本上类似或相当的生理反应(即，下游作用)的能力。相当的反应是与参考反应没有显著差异或可测量差异的反应。

“小分子”、“小型有机分子”或“小分子化合物”是指分子量小于约5kD、小于约4kD、小于约3kD、小于约2kD、小于约1kD或小于约5kD的低分子量化合物。在具体实施例中，小分子可以包含核酸、肽、肽模拟物、类肽、其它小有机化合物或药物等。化学和/或生物混合物如真菌、细菌或藻类提取物的文库是本领域已知的并且可以用本发明的测定方法中的任何一个进行筛选。可以在以下中找到合成分子文库的方法的实例：(Carell等人，1994a；(Carell等人，1994b；Cho等人，1993；DeWitt等人，1993；Gallop等人，1994；Zuckermann等人，1994)。

“重组”是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程，包含但不限于通过非同源末端接合(NHEJ)和同源重组进行的供体捕获。出于本公开的目的，“同源重组(HR)”是指在例如通过同源定向修复(HDR)机制修复细胞中的双链断裂期间发生的这种交换的专门形式。此过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体分子”或“供体修复模板”作为模板来修复“靶”分子(即经历双链断裂的分子)，并且以各种方式被称为“非交叉基因转换”或“短链基因转换”，因为其导致遗传信息从供体转移到靶。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，这种转移可以涉及对断裂的靶与供体之间形成的异源双链DNA的失配校正和/或“合成依赖性链退火”，其中供体用于重新合成将成为靶的一部分的遗传信息和/或相关过程。这种专门的HR通常导致靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸的序列的部分或全部并入靶多核苷酸中。

“NHEJ”或“非同源末端接合”是指在不存在供体修复模板或同源序列的情况下双链断裂的解决方案。NHEJ可以在断裂位点处导致插入和缺失。NHEJ由几种子途径介导，这些途径中的每种途径都有不同的突变后果。经典的NHEJ途径(cNHEJ)需要KU/DNA-PKcs/Lig4/XRCC4复合物，以最少的处理将末端连接回一起并且经常导致断裂的精确修复。替代性NHEJ途径(altNHEJ)还在解决dsDNA断裂方面具有活性，但这些途径具有相当大的诱变性并且通常导致对通过插入和缺失标记的断裂的不精确修复。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但所设想的是通过末端加工酶如例如核酸外切酶例如Trex2对dsDNA断裂进行的修饰可能偏向针对altNHEJ途径的修复。

“切割”是指DNA分子的共价骨架的断裂。切割可以通过多种方法引发，包含但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链切割和双链切割两者均是可能的。由于两个不同的单链切割事件，可能发生双链切割。DNA切割可以导致平末端或交错末端的产生。在某些实施例中，本文所设想的多肽用于靶向双链DNA切割。

“靶位点”或“靶序列”是染色体或染色体外核酸序列，其限定核酸的结合分子将与其结合和/或将切割的一部分，条件是存在充分的结合和/或切割条件。

“外源”分子是通常不存在于细胞中但通过一种或多种遗传、生物化学或其它方法引入到细胞中的分子。示例性外源分子包含但不限于小型有机分子例如DNA嵌入剂、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物、或包括上述分子中的一个或多个的任何复合物。将外源分子引入到细胞的中说明性方法是本领域技术人员已知的，并且包含但不限于：脂质介导的转移(即脂质体，包含中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、生物聚合物纳米颗粒、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。

“内源”分子是在特定环境条件下在特定发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。例如，内源核酸可以包括染色体、线粒体的基因组或其它细胞器、或天然存在的附加型核酸。

“基因”是指编码基因产物的DNA区，以及调控基因产物的产生的所有DNA区，无论这种调控序列是否与编码和/或经转录序列相邻。基因包含但不限于：启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点以及基因座控制区。

“基因表达”是指基因中含有的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA转译产生的蛋白质。基因产物还包含通过如封端、多腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化修饰的蛋白质。

如本文所用，术语“基因组编辑”是指在细胞基因组中的靶位点处对遗传材料进行的取代、缺失和/或引入，其恢复、校正和/或修饰基因的表达，和/或为了表达一个或多个免疫效价增强子、免疫抑制信号阻尼剂和工程化抗原受体。在具体实施例中所设想的基因组编辑包括将基因组编辑增强子和一个或多个工程化核酸酶(或对其进行编码mRNA)引入到细胞中以在细胞的基因组中的靶位点处产生DNA病变，任选地在存在供体修复模板的情况下。

如本文所用，术语“基因工程化的”或“基因修饰的”是指以DNA或RNA的形式将额外遗传材料的染色体或染色体外添加到细胞中的总遗传材料中。基因修饰可以靶向或不靶向细胞的基因组中的特定位点。在一个实施例中，基因修饰是位点特异性的。在一个实施例中，转基因不是位点特异性的。

C.基因组编辑增强子

使用基因组编辑策略的一个限制是效率低。在具体实施例中所设想的基因组编辑组合物和方法通过使用基因组编辑增强子解决了低效编辑的问题。如本文所用，术语“基因组编辑增强子”是指提高同源定向修复(HDR)和/或易错非同源末端接合(NHEJ)的小分子或化合物。适用于具体实施例中所设想的组合物和方法的基因组编辑增强子包含但不限于核酸嵌入剂。

如本文所用，术语“嵌入剂(intercalating agent或intercalator)”是本领域已知的用于指代那些能够非共价插入核酸双链体的碱基对之间的化合物，并且在这方面仅对核酸结构的双链(ds)部分具有特异性，所述核酸结构包含已如在“发夹环”中形成碱基对的单链核酸的那些部分。核酸结构可以是dsDNA、dsRNA或DNA-RNA杂交体。术语“嵌入剂”还用于描述平面芳族或杂芳族化合物在双链DNA(dsDNA)或在一些情况下dsRNA的相邻碱基对之间的插入。在具体实施例中，优选地使用基因组编辑增强子、更优选地使用核酸嵌入剂、更优选地使用DNA嵌入剂、甚至更优选地使用吖啶、并且甚至更优选地使用9-氨基吖啶来提高基因组编辑的效率。

适用于本文所设想的特定组合物和方法的基因组编辑增强子的说明性实例包含但不限于单功能嵌入剂、双功能嵌入剂和多功能嵌入剂。

适用于本文所设想的特定组合物和方法的基因组编辑增强子的附加说明性实例包含但不限于吖啶、蒽环霉素、生物碱、香豆素、啡啶和萘二甲酰亚胺。

在特定的说明性实施例中，基因组编辑增强子选自由以下组成的组：1,8-萘二甲酰亚胺、4'6-二脒基-α-苯基吲哚、吖啶、吖啶橙、吖啶黄素、山油柑碱、黄肉楠碱(actinodaphnidine)、氨吖啶、安吖啶、蒽环霉素、氨茴霉素、蒽吡唑类(anthrapyrazole)、苯并啡啶类生物碱、小檗胺、黄连素、小檗红碱、博莱霉素、BOBO-1、BOBO-3、波尔定碱、BO-PRO-1、BO-PRO-3、空褐鳞碱、喜树碱、无根藤碱、教酒菌素、氯喹、色霉素、辛可尼丁、辛可宁、黄连碱、甲氧檗因、香豆素、白叶藤碱、更生霉素、DAPI、柔红霉素、荷包牡丹碱、白鲜碱、偏端霉素、阿霉素、玫瑰树碱、吐根碱、依沙吖啶、乙啡啶、吴茱萸春、崖椒碱、花椒宁碱、氟香豆素、GelStar、庆大霉素、海罂粟碱、骆驼蓬碱、哈尔碱、赫达霉素、己锭、Hoechst 33258、Hoechst 33342、乙菲啶、海恩酮、咪唑并吖啶酮、吲唑类似物、碘化物、异紫堇定碱、异喹啉生物碱、药根碱、JOJO-1、JO-PRO-1、激动素核苷、kokusainine、山梗烷醇酮、LOLO-1、LO-PRO-1、硫蒽酮、masculine、马塔啶、米帕林、金属嵌入剂、光神霉素、米托蒽醌、新白叶藤碱、纺锤菌素、两面针碱、二胺硝吖啶、诺加霉素、去甲哈尔满、OliGreen、非洲防己碱、啡啶、PicoGreen、吡柔比星、多吡啶、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、原黄素、普罗匹定、补骨脂素、奎纳克林、奎尼定、奎宁、喹喔啉、RiboGreen、铑基嵌入剂、钌基嵌入剂、血根碱、蛇根碱、茵芋碱、链霉素、SYBR DX、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYTO-11、SYTO-12、SYTO-13、SYTO-14、SYTO-15、SYTO-16、SYTO-17、SYTO-20、SYTO-21、SYTO-22、SYTO-23、SYTO-24、SYTO-25、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45、SYTO-59、SYTO-60、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-63、SYTO-64、SYTO-80、SYTO-81、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、他克林、萨力多胺、噻唑橙、替洛隆、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、乌桑巴拉碱、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3及其类似物和衍生物。

在具体实施例中，基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)、哈尔碱、海恩酮、柔红霉素、血根碱硫酸盐、激动素核苷、乳酸依沙吖啶和环十二碳三烯。

在具体实施例中，基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)和哈尔碱。

在优选的实施例中，基因组编辑增强子为吖啶或二吖啶。

在另一个优选的实施例中，基因组编辑增强子是氨吖啶(9-氨基吖啶)。

D.核酸酶

靶向细胞中一个或多个靶位点的工程化核酸酶用于本文所设想的基因组编辑组合物和方法中。“工程化核酸酶”是指包括一个或多个DNA结合结构域和一个或多个DNA切割结构域的核酸酶，其中所述核酸酶已经被设计和/或修饰成结合与DNA切割靶序列相邻的DNA结合靶序列。工程化核酸酶可以是由天然存在的核酸酶或由之前工程化的核酸酶设计和/或修饰而来。在具体实施例中所设想的工程化核酸酶可以进一步包括一个或多个附加功能结构域，例如，展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。

在具体实施例中所设想的工程化核酸酶在靶序列中生成单链DNA切口或双链DNA断裂(DSB)。此外，通过使用生成单链切口(切口酶)的两种核酸酶，可以在靶DNA中实现DSB。每个切口酶切割DNA的一条链，并且使用两种或更多种切口酶可以在靶DNA序列中产生双链断裂(例如，交错的双链断裂)。在具体实施例中，核酸酶与供体修复模板组合使用，所述供体修复模板通过DSB处的同源重组引入到DNA断裂位点处的靶序列中。

可以被工程化成结合和切割靶序列的核酸酶的说明性实例包含但不限于：归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)、megaTAL、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、ARCUS核酸酶、以及成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas核酸酶系统。

在各个实施例中，归巢核酸内切酶或大范围核酸酶被工程化成结合到细胞中的一个或多个靶位点并且在所述一个或多个靶位点中引入单链切口或双链断裂(DSB)。“归巢核酸内切酶”和“大范围核酸酶”可互换使用并且指识别12个到45个碱基对切割位点并且通常基于序列和结构基序分组为以下五个家族的天然存在的核酸酶或工程化的大范围核酸酶：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒和PD-(D/E)XK。

“参考归巢核酸内切酶”或“参考大范围核酸酶”是指在自然界中所发现的野生型归巢核酸内切酶或归巢核酸内切酶。在一个实施例中，“参考归巢核酸内切酶”是指经修饰以提高基础活性的野生型归巢核酸内切酶。

“工程化归巢核酸内切酶”、“重编程的归巢核酸内切酶”、“归巢核酸内切酶变体”、“工程化大范围核酸酶”、“重编程的大范围核酸酶”或“大范围核酸酶变体”是指包括一个或多个DNA结合结构域和一个或多个DNA切割结构域的归巢核酸内切酶，其中归巢核酸内切酶已经从亲本或天然存在的归巢核酸内切酶设计和/或修饰以结合和切割DNA靶序列。归巢核酸内切酶变体可以由天然存在的归巢核酸内切酶或由另一归巢核酸内切酶变体设计和/或修饰而来。在具体实施例中所设想的归巢核酸内切酶变体可以进一步包括一个或多个附加功能结构域，例如，展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。

归巢核酸内切酶(HE)变体在自然界中不存在并且可以通过重组DNA技术或通过随机诱变获得。HE变体可以通过在天然存在的HE或HE变体中进行一个或多个氨基酸改变例如突变、取代、添加或缺失一个或多个氨基酸来获得。在具体实施例中，HE变体包括DNA识别界面的一个或多个氨基酸改变。

在具体实施例中所设想的HE变体可以进一步包括一个或多个连接子和/或附加功能结构域，例如，展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，使用展现出5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶、不依赖模板的DNA聚合酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶将HE变体引入到T细胞中。HE变体和3'加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。

可以由其设计而来的重编程的LHE或LHE变体的LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)的说明性实例包含但不限于：I-CreI和I-SceI。

可以由其设计而来的重编程的LHE或LHE变体的LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)的附加说明性实例包含但不限于：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

在一个实施例中，重编程的LHE或LHE变体选自由以下组成的组：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

在一个实施例中，重编程的LHE或LHE变体是I-OnuI。

在一个实施例中，重编程的LHE或LHE变体由天然I-OnuI生成。在优选的实施例中，重编程的LHE或LHE变体由先前工程化的I-OnuI生成。

在具体实施例中，重编程的LHE或LHE变体在DNA识别界面中包括一个或多个氨基酸取代。在具体实施例中，I-OnuI LHE包括与I-OnuI的DNA识别界面或I-OnuI的工程化变体至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(Taekuchi等人，2011年，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》2011年8月9日；108(32):13077-13082)。

在一个实施例中，重编程的LHE或LHE变体包括与I-OnuI的DNA识别界面或I-OnuI的工程化变体至少70％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少95％、更优选地至少97％、更优选地至少99％的序列同一性(Taekuchi等人，2011年，《美国国家科学院院刊》2011年8月9日；108(32):13077-13082)。

各种示例性实施例设想了结合到并且切割一个或多个靶位点的靶区的megaTAL核酸酶。“megaTAL”是指包括工程化TALE DNA结合结构域和工程化大范围核酸酶的工程化核酸酶，并且任选地包括一个或多个连接子和/或附加功能结构域，例如展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，可以使用展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶将megaTAL引入到T细胞中。megaTAL和3'加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。

“TALE DNA结合结构域”是转录激活子样效应子(TALE或TAL效应子)的DNA结合部分，其模拟植物转录激活子以操纵植物转录组(参见例如Kay等人，2007年，《科学(Science)》318:648-651)。在具体实施例中所设想的TALE DNA结合结构域是重新被工程化的或来自天然存在的TALE，例如来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonascampestris pv.vesicatoria)、加德纳黄单胞菌(Xanthomonas gardneri)、雀麦褐条病菌(Xanthomonas translucens)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、番茄黄单胞菌(Xanthomonas perforans)、苜蓿黄单胞杆菌(Xanthomonas alfalfa)、柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri)、番茄细菌性斑点致病黄单胞菌(Xanthomonas euvesicatoria)和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)的AvrBs3以及来自青枯雷尔氏菌(Rantstoniasolanacearum)的brg11和hpx17。在美国专利号9,017,967和其中引用的参考文献中公开了用于衍生和设计DNA结合结构域的TALE蛋白的说明性实例，所有所述文献都通过引用以其全部内容并入本文。

在具体实施例中，megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括参与TALE DNA结合结构域结合到其对应靶DNA序列的一个或多个重复单元。单个“重复单元”(也被称为“重复”)的长度通常为33个到35个氨基酸。每个TALE DNA结合结构域重复单元包含构成重复可变二残基(RVD)的1或2个DNA结合残基，通常在重复的位置12和/或13处。已经确定了用于DNA识别这些TALE DNA结合结构域的天然(规范)代码，使得位置12和13处的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合、NG与T结合、NI与A结合、NN与G或A结合并且NG与T结合。在某些实施例中，设想了非规范(非典型)RVD。

适用于具体实施例中所设想的特定megaTAL的非规范RVD的说明性实例包含但不限于：用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN；用于识别腺嘌呤(A)的NI、KI、RI、HI、SI；用于识别胸腺嘧啶(T)的NG、HG、KG、RG；用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD、HD、ND、KD、YG；用于识别A或G的NV、HN；以及用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意指在位置13处的氨基酸不存在。适用于具体实施例中所设想的特定megaTAL的RVD的附加说明性实例进一步包含美国专利号8,614,092中所公开的那些，所述美国专利通过引用以其全部内容并入本文。

在具体实施例中，本文所设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括3个到30个重复单元。在某些实施例中，megaTAL包括3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个TALE DNA结合结构域重复单元。在优选的实施例中，本文所设想的megaTAL包括TALE DNA结构域，其包括5个到13个重复单元、更优选地7个到12个重复单元、更优选地9个到11个重复单元、并且更优选地9个、10个或11个重复单元。

在具体实施例中，本文所设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括3个到30个重复单元和额外的单个截短的TALE重复单元，所述单个截短的TALE重复单元包括位于一组TALE重复单元的C末端处的20个氨基酸，即额外的C-末端半TALEDNA结合结构域重复单元(本文下文其它地方公开的C-帽的氨基酸-20到-1)。因此，在具体实施例中，本文所设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括3.5个到30.5个重复单元。在某些实施例中，megaTAL包括3.5个、4.5个、5.5个、6.5个、7.5个、8.5个、9.5个、10.5个、11.5个、12.5个、13.5个、14.5个、15.5个、16.5个、17.5个、18.5个、19.5个、20.5个、21.5个、22.5个、23.5个、24.5个、25.5个、26.5个、27.5个、28.5个、29.5个或30.5个TALE DNA结合结构域重复单元。在优选的实施例中，本文所设想的megaTAL包括TALE DNA结构域，其包括5.5个到13.5个重复单元、更优选地7.5个到12.5个重复单元、更优选地9.5个到11.5个重复单元、并且更优选地9.5个、10.5个或11.5个重复单元。

在具体实施例中，megaTAL包括“N-末端结构域(NTD)”多肽、一个或多个TALE重复结构域/单元、“C-末端结构域(CTD)”多肽、工程化大范围核酸酶和一个或多个接合结构域的连接子肽。如本文所用，术语“N-末端结构域(NTD)”多肽是指天然存在的TALE DNA结合结构域的N-末端部分或片段侧翼的序列。如本文所用，术语“C-末端结构域(CTD)”多肽是指天然存在的TALE DNA结合结构域的C-末端部分或片段侧翼的序列。

在具体实施例中，本文所设想的megaTAL包括约122个氨基酸到137个氨基酸的NTD；约9.5个、约10.5个或约11.5个结合重复单元；约20个氨基酸到约85个氨基酸的CTD；以及选自由以下组成的组工程化I-OnuI LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I、或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI、或更优选地I-OnuI。

在具体实施例中，工程化核酸酶是TALEN。“TALEN”是指包括工程化TALE DNA结构域和核酸内切酶结构域(或其核酸内切酶半结构域)的工程化核酸酶，并且任选地包括一个或多个连接子和/或附加功能结构域，例如展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，可以使用展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶将TALEN引入到T细胞中。TALEN和3'加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。

在具体实施例中所设想的TALEN包括NTD；包括约3.5个到30.5个重复单元例如约3.5个、4.5个、5.5个、6.5个、7.5个、8.5个、9.5个、10.5个、11.5个、12.5个、13.5个、14.5个、15.5个、16.5个、17.5个、18.5个、19.5个、20.5个、21.5个、22.5个、23.5个、24.5个、25.5个、26.5个、27.5个、28.5个、29.5个或30.5个重复单元的TALE DNA结合结构域；CTD；以及核酸内切酶结构域或半结构域。

在一个实施例中，本文所设想的TALEN包括IIS型限制性核酸内切酶的核酸内切酶结构域。在一个实施例中，IIS型限制性核酸内切酶是Fok I。

TALEN及其制作方法的说明性实例被公开于美国专利号：8,586,526；8,912,138；以及9,315,788，这些专利各自通过引用以其整体结合在此。

在具体实施例中，工程化核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。“ZFN”是指包括一个或多个锌指DNA结合结构域和核酸内切酶结构域(或其核酸内切酶半结构域)的工程化核酸酶，并且任选地包括一个或多个连接子和/或附加功能结构域，例如展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，可以使用展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶(例如，Trex2)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性的末端加工酶将ZFN引入到T细胞中。ZFN和3'加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。

在具体实施例中，ZFN包括具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个锌指基序和核酸内切酶结构域(或核酸内切酶半结构域)的锌指基序DNA结合结构域。典型地，单个锌指基序的长度为约30个氨基酸。锌指基序包含规范的C₂H₂锌指和如例如C₃H锌指和C₄锌指等非规范的锌指。

锌指结合结构域可以被工程化成结合任何DNA序列。单个锌指基序结合到三个或四个核苷酸序列。已经识别了给定3bp DNA靶序列的候选锌指DNA结合结构域，并且已经设计了用于将多个结构域连接成靶向对应复合DNA靶序列的多指肽的模块化装配策略。本领域已知的其它适合的方法还可以用于设计和构建对锌指DNA结合结构域进行编码的核酸，例如噬菌体显示、随机诱变、组合库、计算机/合理设计、亲和力选择、PCR、从cDNA或基因组库克隆、合成构造等。(参见，例如，美国专利号5,786,538；Wu等人，《美国国家科学院院刊》92:344-348(1995)；Jamieson等人，《生物化学(Biochemistry)》33:5689-5695(1994)；Rebar和Pabo，《科学》263:671-673(1994)；Choo和Klug，《美国国家科学院院刊》91:11163-11167(1994)；Choo和Klug，《美国国家科学院院刊》91:11168-11172(1994)；Desjarlais和Berg，《美国国家科学院院刊》90:2256-2260(1993)；Desjarlais和Berg，《美国国家科学院院刊》89:7345-7349(1992)；Pomerantz等人，《科学》267:93-96(1995)；Pomerantz等人，《美国国家科学院院刊》92:9752-9756(1995)；Liu等人，《美国国家科学院院刊》94:5525-5530(1997)；Griesman和Pabo，《科学》275:657-661(1997)；Desjarlais和Berg，《美国国家科学院院刊》91:11-99-11103(1994)。

在具体实施例中，本文所设想的ZNF包括：锌指DNA结构域，其包括两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个锌指基序；以及来自至少一个IIS型限制性酶的核酸内切酶结构域或半结构域。在一个实施例中，核酸内切酶结构域或半结构域来自Fok I-IIS型限制性核酸内切酶。

ZNF及其制作方法的说明性实例被公开于美国专利公开号：20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231中，所述美国专利中的每一个通过引用以其全部内容结合在本文中。

在各个实施例中，CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)核酸酶系统被工程化成结合到一个或多个靶位点并且在所述一个或多个靶位点中引入单链切口或双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas核酸酶系统是一种基于可以用于哺乳动物基因组工程的细菌系统的最近工程化的核酸酶系统。参见，例如，Jinek等人，(2012)《科学》337:816-821；Cong等人，(2013)《科学》339:819-823；Mali等人，(2013)《科学》339:823-826；Qi等人，(2013)《细胞(Cell)》152:1173-1183；Jinek等人，(2013)，《e生命(eLife)》2:e00471；DavidSegal(2013)《e生命》2:e00563；Ran等人，(2013)《自然实验手册(Nature Protocols)8(11):2281-2308；Zetsche等人，(2015)《细胞》163(3):759–771，所述文献中的每一个通过引用以其全部内容并入本文。

在一个实施例中，CRISPR/Cas核酸酶系统包括Cas核酸酶和将Cas核酸酶募集到靶位点的一个或多个RNA，例如，反式活化cRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)或单向导RNA(sgRNA)。crRNA和tracrRNA可以被工程化成在本文中被称为“单向导RNA”或“sgRNA”的一个多核苷酸序列。

在一个实施例中，将Cas核酸酶工程化成双链DNA核酸核酸内切酶或切口酶或催化死亡的Cas，并且与crRNA和tracrRNA或sgRNA形成靶复合物以便对位于靶位点内的原型间隔子靶序列进行位点特异性DNA识别和位点特异性切割。原型间隔子基序邻接短的原型间隔子相邻基序(PAM)，所述PAM在募集Cas/RNA复合物中发挥作用。Cas多肽识别对Cas多肽具有特异性的PAM基序。因此，CRISPR/Cas系统可以用于靶向和切割侧翼为对特定Cas多肽具有特异性的特定3'PAM序列的双链多核苷酸序列的任一条链或两条链。可以使用生物信息学或使用实验方法识别PAM。Esvelt等人，2013，《自然方法(Nature Methods)》，10(11):1116-1121，所述文献通过引用以其全部内容并入本文。

在各个实施例中，Cas核酸酶是Cas9或Cpf1。

适用于在于具体实施例中所设想的具体实施例中使用的Cas9多肽的说明性实例可以从包括但不限于以下的细菌物种获得：屎肠球菌、肠球菌、无害李斯特菌、单核细胞增生李斯特氏菌、斯氏利斯特菌、伊氏利斯特菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、马肠链球菌、解没食子酸链球菌、猕猴链环菌、变异链球菌、假链球菌、酿脓链球菌、嗜热链球菌、格氏链球菌、婴儿链球菌、马链球菌、缓症链球菌、巴氏链球菌、猪链球菌、前庭链球菌、血链球菌、道恩链球菌、杆状奈瑟菌、灰色奈瑟菌、浅黄色奈瑟菌、乳糖奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、浅黄奈瑟菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瘤胃乳酸杆菌、唾液乳杆菌、旧金山乳杆菌、拥挤棒杆菌、白喉杆菌、马氏棒状杆菌、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、文氏密螺旋体、蚀疮溃疡密螺旋体以及齿垢密螺旋体。

适用于在于具体实施例中所设想的具体实施例中使用的Cpf1多肽的说明性实例可以从包括但不限于以下的细菌物种获得：弗朗西斯菌属、氨基酸球菌属、普鲁氏杆菌属、毛螺科菌属等。

Cas9直系同源物的保守区包含中心HNH核酸内切酶结构域和分裂的RuvC/RNase H结构域。Cpf1直系同源物具有RuvC/RNase H结构域但没有可辨别的HNH结构域。HNH和RuvC样结构域各自负责切割双链DNA靶序列的一条链。Cas9核酸酶多肽的HNH结构域切割与tracrRNA:crRNA或sgRNA互补的DNA链。Cas9核酸酶的RuvC样结构域切割不与tracrRNA:crRNA或sgRNA互补的DNA链。预测Cpf1充当二聚体，其中Cpf1的每个RuvC样结构域切割靶位点的互补链或非互补链。在具体实施例中，设想了Cas9核酸酶变体(例如，Cas9切口酶)，其在HNH或RuvC样核酸内切酶结构域中包括降低或消除变体结构域的核酸酶活性的一个或多个氨基酸添加、缺失、突变或取代。

降低或消除结构域中的核酸酶活性的Cas9HNH突变的说明性实例包含但不限于：酿脓链球菌(D10A)；嗜热链球菌(D9A)；齿垢密螺旋体(D13A)；以及脑膜炎双球菌(D16A)。

降低或消除结构域中的核酸酶活性的Cas9RuvC样结构域突变的说明性实例包含但不限于：酿脓链球菌(D839A、H840A或N863A)；嗜热链球菌(D598A、H599或N622A)；齿垢密螺旋体(D878A、H879A或N902A)；以及脑膜炎双球菌(D587A、H588A或N611A)。

E.靶位点

与天然存在的核酸酶相比，在具体实施例中所设想的工程化核酸酶可以工程化成与任何合适的靶序列结合并且可以具有新颖的结合特异性。在具体实施例中，靶位点是基因的调控区，所述调控区包含但不限于启动子、增强子、阻遏子元件等。在具体实施例中，靶位点是基因或剪接位点的编码区。在某些实施例中，工程化核酸酶被设计成下调或降低基因的表达。工程化核酸酶和供体修复模板可以被设计成缺失所期望的靶序列。在一些实施例中，工程化核酸酶和供体修复模板被设计成校正基因或调控区的编码序列中的突变和/或恢复由基因或其调控区编码的多肽的正常功能。

适合的靶序列的说明性实例包含以下基因：β球蛋白、δ球蛋白、γ球蛋白、B细胞淋巴瘤/白血病11(BCL11A)、Kruppel样因子1(KLF1)、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、白蛋白、因子VIII、因子IX、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)、Hungtingin(Htt)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、C9orf72、TARDBP、FUS、视紫红质(RHO)、囊性纤维化跨膜传导调控剂(CFTR)、表面活性剂蛋白B(SFTPB)、T细胞受体α(TRAC)、T细胞受体β(TRBC)、程序性细胞死亡1(PD1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、人白细胞抗原(HLA)A、HLA B、HLA C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、LMP7、与抗原加工相关的转运蛋白(TAP)1、TAP2、TAP相关蛋白(TAPBP)、II类主要组织相容性复合物反式激活因子(CIITA)、肌营养不良蛋白(DMD)、糖皮质激素受体(GR)、IL2RG、Rag-1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH和EPSPS。

用于插入编码疗法性转基因的供体模板的适合靶位点的附加说明性实例包含但不限于如AAVS1、HPRT、白蛋白和CCR5基因等“安全港”基因座。

F.供体修复模板

在具体实施例中所设想的基于细胞的组合物通过用工程化核酸酶、基因组编辑增强子进行基因组编辑并且引入一个或多个供体修复模板而生成。不希望受任何特定理论的束缚，所设想的是，细胞中一个或多个工程化核酸酶的表达在靶位点处生成单链或双链DNA断裂；并且在存在基因组编辑增强子和供体修复模板的情况下，核酸酶表达和断裂生成导致通过同源重组将模板插入或整合到靶位点处，从而修复断裂。

在具体实施例中，供体修复模板包括一个或多个同源臂。

在具体实施例中，供体修复模板包括位于DSB位点侧翼的一个或多个同源臂。

如本文所用，术语“同源臂”是指供体修复模板中与通过核酸酶在靶位点处引入的DNA断裂侧翼的DNA序列完全相同或几乎完全相同的核酸序列。在一个实施例中，供体修复模板包括5'同源臂，所述5'同源臂包括与DNA断裂位点的5'的DNA序列完全相同或几乎相同的核酸序列。在一个实施例中，供体修复模板包括3'同源臂，所述3'同源臂包括与DNA断裂位点的3'的DNA序列完全相同或几乎相同的核酸序列。在优选的实施例中，供体修复模板包括5'同源臂和3'同源臂。供体修复模板可以包括与DSB位点紧邻的基因组序列的同源性或与来自DSB位点的任何数目的碱基对内的基因组序列的同源性。在一个实施例中，供体修复模板包括与基因组序列同源约5bp、约10bp、约25bp、约50bp、约100bp、约250bp、约500bp、约1000bp、约2500bp、约5000bp、约10000bp或更多的核酸序列，包含任何中间长度的同源序列。

在具体实施例中所设想的合适长度的同源臂的说明性实例可以独立选择并且包含但不限于：约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp、约1500bp、约1600bp、约1700bp、约1800bp、约1900bp、约2000bp、约2100bp、约2200bp、约2300bp、约2400bp、约2500bp、约2600bp、约2700bp、约2800bp、约2900bp、或约3000bp、或更长的同源臂，包含所有中间长度的同源臂。

合适的同源臂长度的附加说明性实例包含但不限于：约100bp到约3000bp、约200bp到约3000bp、约300bp到约3000bp、约400bp到约3000bp、约500bp到约3000bp、约500bp到约2500bp、约500bp到约2000bp、约750bp到约2000bp、约750bp到约1500bp、或约1000bp到约1500bp，包含所有中间长度的同源臂。

在具体实施例中，5'同源臂和3'同源臂的长度独立地选自约500bp到约1500bp。在一个实施例中，5'同源臂为约1500bp，并且3'同源臂为约1000bp。在一个实施例中，5'同源臂为约600bp，并且3'同源臂为约600bp。

供体修复模板可以进一步包括一个或多个多核苷酸如启动子和/或增强子、非转译区(UTR)、Kozak序列、多腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及本文中其它地方设想的对自切割多肽、表位标记进行编码的多核苷酸。

在各个实施例中，供体修复模板包括5'同源臂、RNA聚合酶II启动子、对治疗基因或其片段进行编码的一个或多个多核苷酸、转基因或可选择标记物以及3'同源臂。

在各个实施例中，用供体修复模板修饰靶位点，所述供体修复模板包括5'同源臂、对治疗基因或其片段进行编码的一个或多个多核苷酸、转基因或可选择标记物以及3'同源臂。

在各个实施例中，供体修复模板包括对治疗基因或其片段进行编码的一个或多个多核苷酸、转基因或可选择标记物。

在各个实施例中，供体修复模板包括对治疗基因或其片段进行编码的一个或多个多核苷酸、转基因或可选择标记物，其包含但不限于：β球蛋白、δ球蛋白、γ球蛋白、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、白蛋白、因子VIII、因子IX、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA-4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag-1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH和EPSPS。

在各个实施例中，供体修复模板包括对选自由以下组成的组的治疗基因或其片段进行编码的一个或多个多核苷酸：细胞因子、淋巴因子、单核因子、趋化因子、激素、人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、前列腺素、卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、苗勒抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(TPO)、如NGF-β等神经生长因子、血小板生长因子、如TGF-α和TGF-β等转化生长因子(TGF)；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ等干扰素、如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)等集落刺激因子(CSF)、如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等白细胞介素(IL)；IL-15、如TNF-α或TNF-β等肿瘤坏死因子以及包含LIF和试剂盒配体(KL)的其它多肽因子。

在各个实施例中，供体修复模板包括对选自由以下组成的组的基因或转基因进行编码的一个或多个多核苷酸：双特异性T细胞衔接子(BiTE)分子；细胞因子(例如，IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15和TNF-α)、趋化因子(例如，MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3和RANTES)、细胞毒素(例如，穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)、细胞因子受体(例如，IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体)、以及工程化抗原受体(例如，工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体)。

如本文所用，术语“工程化TCR”是指T细胞受体，例如，对靶抗原具有高亲合力和反应性的αβTCR。可以选择、克隆并随后将工程化TCR引入到用于过继免疫疗法的T细胞群中。工程化TCR是外源性TCR，因为其被引入到通常不表达特定TCR的T细胞中。工程化TCR的基本方面是它对由主要组织相容性复合物(MHC)或类似免疫组分呈递的肿瘤抗原具有高亲合力。与工程化TCR相比，CAR被工程化成以MHC独立性方式结合靶抗原。

如本文所用，术语“CAR”是指嵌合抗原受体。CAR的说明性实例公开于PCT公开号：WO 2015164759、WO 2015188119和WO 2016014789中，所述专利中的每一个通过引用以其全文并入本文中。

如本文所用，术语“Daric受体”是指多链工程化抗原受体。Daric架构及其组分的说明性实例在PCT公开号WO2015/017214和美国专利公开号20150266973中公开，所述公开中的每一个通过引用以其全文并入本文中。

如本文所用，术语“嵌合细胞因子受体”或“zetakine”是指包括胞外结构域的嵌合跨膜免疫受体，所述胞外结构域包括与能够将胞外结构域拴到细胞表面的支持区、跨膜区和胞内信号传导结构域连接的可溶性受体配体。zetakine的说明性实例公开于美国专利号：7,514,537；8,324,353；8,497,118；以及9,217,025，这些专利各自通过引用以其整体结合在此。

G.经基因组编辑的细胞

通过具体实施例中所设想的方法制造的经基因组编辑的细胞提供经改进的基因疗法组合物。不希望受任何特定理论的束缚，据信由于使用基因组编辑增强子所实现的基因组编辑效率提高，本文所设想的组合物和方法提供了更有效的经基因组编辑的细胞组合物。

在具体实施例中所设想的经基因组编辑的细胞可以是自体/自身的(“自我”)或非自体的(“非自我的”，例如，同种异体的、同基因的或异种的)。如本文所用，“自体的”是指来自同一受试者的细胞。如本文所用，“同种异体的”是指同一物种的在基因上与比较细胞不同的细胞。如本文所用，“同基因的”是指不同受试者的在基因上与比较细胞完全相同的细胞。如本文所用，“异种的”是指与比较细胞属于不同物种的细胞。在优选的实施例中，细胞从哺乳动物受试者中获得。在更优选的实施例中，细胞从灵长类动物受试者中获得。在最优选的实施例中，细胞从人类受试者中获得。

“分离的细胞”是指从体内组织或器官获得并且基本上不含细胞外基质的非天然存在的细胞，例如，自然界中不存在的细胞、经修饰的细胞、工程化细胞等。

可以使用本文所设想的组合物和方法编辑其基因组的细胞类型的说明性实例包含但不限于细胞系、原代细胞、干细胞、祖细胞和分化细胞。

术语“干细胞”是指一种细胞，其是一种能够执行以下的未分化细胞：(1)长期自我更新、或能够生成原始细胞的至少一个相同拷贝，(2)在单细胞水平上分化为多个，并且在某些情况下只有一种特化细胞类型和(3)进行组织的体内功能性再生。根据干细胞的发育潜力将其细分为全能、多潜能、多能和寡能/单能。“自我更新”是指具有产生未改变的子细胞并且生成特化细胞类型(效力)的独特能力的细胞。自我更新可以通过两种方式实现。不对称细胞分裂产生一个与亲本细胞完全相同的子细胞和一个与亲本细胞不同并且是祖细胞或分化细胞的子细胞。对称细胞分裂产生两个完全相同的子细胞。细胞的“增殖”或“扩增”是指对称分裂的细胞。

如本文所用，术语“祖先”或“祖细胞”是指细胞具有自我更新和分化成更成熟细胞的能力。许多祖细胞沿着单个谱系分化，但可能具有相当广泛的增殖能力。

在一个实施例中，经基因组编辑的细胞是胚胎干细胞。

在一个实施例中，经基因组编辑的细胞是成体干细胞或祖细胞。

在具体实施例中，经基因组编辑的细胞是选自由以下组成的组的干细胞或祖细胞：中胚层干细胞或祖细胞、内胚层干细胞或祖细胞以及外胚层干细胞或祖细胞。

在相关实施例中，经基因组编辑的细胞是中胚层干细胞或祖细胞。中胚层干细胞或祖细胞的说明性实例包含但不限于骨髓干细胞或祖细胞、脐带干细胞或祖细胞、脂肪组织衍生的干细胞或祖细胞、造血干细胞或祖细胞(HSPC)、间充质干细胞或祖细胞、肌肉干细胞或祖细胞、肾干细胞或祖细胞、成骨细胞干细胞或祖细胞、软骨细胞干细胞或祖细胞等。

在其它相关实施例中，经基因组编辑的细胞是外胚层干细胞或祖细胞。外胚层干细胞或祖细胞的说明性实例包含但不限于神经干细胞或祖细胞、视网膜干细胞或祖细胞、皮肤干细胞或祖细胞等。

在其它相关实施例中，经基因组编辑的细胞是内胚层干细胞或祖细胞。内胚层干细胞或祖细胞的说明性实例包含但不限于肝干细胞或祖细胞、胰腺干细胞或祖细胞、上皮干细胞或祖细胞等。

在一个实施例中，经基因组编辑的细胞是骨细胞(bone cell)、骨细胞(osteocyte)、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、成肌细胞、肌细胞、平滑肌细胞、膀胱细胞、骨髓细胞、中枢神经系统(CNS)细胞、周围神经系统(PNS)细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、色素细胞、上皮细胞、皮肤细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、乳腺细胞、结肠细胞、食道细胞、胃肠细胞、胃细胞、结肠细胞、头细胞、颈细胞、牙龈细胞、舌细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、鼻咽细胞、卵巢细胞、滤泡细胞、宫颈细胞、阴道细胞、子宫细胞、胰腺细胞、胰腺实质细胞、胰管细胞、胰岛细胞、前列腺细胞、阴茎细胞、性腺细胞、睾丸细胞、造血细胞、淋巴细胞或骨髓细胞。

在优选的实施例中，经基因组编辑组合物和方法用于编辑造血细胞，例如造血干细胞、造血祖细胞、免疫效应细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞等。

获得造血细胞的说明性来源包含但不限于：脐带血、骨髓或动员的外周血。

造血干细胞(HSC)产生定向造血祖细胞(HPC)，其能够在生物体的整个生命期间生成整个成熟血细胞库。术语“造血干细胞”或“HSC”是指多能干细胞，所述多能干细胞产生生物体的所有血细胞类型，包含骨髓谱系(例如，单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴谱系(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)以及本领域已知的其它谱系(参见Fei,R.等人，美国专利号5,635,387；McGlave等人，美国专利号5,460,964；Simmons,P等人，美国专利号5,677,136；Tsukamoto等人，美国专利号5,750,397；Schwartz等人，美国专利号5,759,793；DiGuisto等人，美国专利号5,681,599；Tsukamoto等人，美国专利号5,716,827)。当移植到致命辐射的动物或人类中时，造血干细胞和祖细胞可以重新填充红细胞、中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞库。

适用于与本文所设想的方法和组合物一起使用的造血干细胞或祖细胞的附加说明性实例包含：CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45^RA-造血细胞；CD34⁺、CD59⁺、Thy1/CD90⁺、CD38^Lo/-、C-试剂盒/CD117⁺和Lin^(-)造血细胞；以及CD133⁺造血细胞。

在一个实施例中，造血细胞是CD34⁺CD133⁺细胞。

存在用于表征造血层级的各种方法。一种表征方法是SLAM代码。SLAM(信号传导淋巴细胞活化分子)家族是＞10个分子的组，这些分子的基因大部分串联定位在染色体1(小鼠)上的单个基因座中，全部都属于免疫球蛋白基因超家族的子集，并且最初被认为参与了T细胞刺激。这个家族包含CD48、CD150、CD244等，CD150是创始成员，并且因此也被称为slamF1，即，SLAM家族成员1。造血层级的签名SLAM代码是造血干细胞(HSC)-CD150⁺CD48^-CD244^-；多能祖细胞(MPP)-CD150^-CD48^-CD244⁺；谱系限制性祖细胞(LRP)-CD150^-CD48⁺CD244⁺；普通髓系祖细胞(CMP)-lin-SCA-1-c-试剂盒⁺CD34⁺CD16/32^mid；粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)-lin^-SCA-1-c-试剂盒⁺CD34⁺CD16/32^hi；以及巨核细胞-红系祖细胞(MEP)-lin^-SCA-1-c-试剂盒⁺CD34^-CD16/32^low。

在一个实施例中，造血细胞是CD150⁺CD48^-CD244^-细胞。

在一个实施例中，造血细胞是CD34+造血细胞。

在各个实施例中，造血细胞是免疫效应细胞。“免疫效应细胞”是免疫系统的任何细胞，所述细胞具有一个或多个效应功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、ADCC和/或CDC的诱导)。在具体实施例中所设想的说明性免疫效应细胞是T淋巴细胞，具体地细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、TIL和辅助T细胞(HTL；CD4⁺T细胞)。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤(NK)细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤T(NKT)细胞。

术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包含胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)细胞或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4⁺T细胞)、CD4⁺T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8⁺T细胞)、CD4⁺CD8⁺T细胞、CD4^-CD8^-T细胞或T细胞的任何其它子集。在一个实施例中，T细胞是NKT细胞。适用于在具体实施例中使用的其它说明性T细胞群包含初始T细胞和记忆T细胞。

“潜能T细胞”和“年轻T细胞”在具体实施例中可互换使用并且指T细胞表型，其中T细胞能够增殖并实现伴随的分化减少。在具体实施例中，年轻T细胞具有“初始T细胞”的表型。在具体实施例中，年轻T细胞包括以下生物标记物中的一个或多个或全部：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197和CD38。在一个实施例中，年轻T细胞包括以下生物标记物中的一个或多个或全部：CD62L、CD127、CD197和CD38。在一个实施例中，年轻T细胞缺乏CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3的表达。

T细胞可以从许多来源获得，包含但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织以及肿瘤。

H.多肽

本文设想了各种多肽，包含但不限于大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、工程化抗原受体、治疗性多肽、融合多肽和表达多肽的载体。除非相反地指出，否则“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义，即作为氨基酸序列。在一个实施例中，“多肽”包含融合多肽和其它变体。可以使用多种熟知的重组和/或合成技术中的任何一种制备多肽。多肽不限于特定长度，例如，它们可以包括全长蛋白质序列、全长蛋白质片段或融合蛋白质，并且可以包含多肽的转译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等以及本领域已知的其它修饰，无论其是天然存在的还是非天然存在的。

如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境中并且根据与细胞的其它组分的关联进行体外分离和/或纯化而来的肽或多肽分子，即，它与体内物质没有显著关联。

在具体实施例中所设想的多肽的说明性实例包含但不限于大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、工程化TCR、CAR、Daric、治疗性多肽以及融合多肽及其变体。

多肽包含“多肽变体。”多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的或可以通过合成生成，例如通过修饰上述多肽序列的一个或多个氨基酸。例如，在具体实施例中，可能期望通过将一个或多个取代、缺失、添加和/或插入引入到多肽中来改善工程化核酸酶、工程化TCR、CAR、Daric等的生物学特性。在具体实施例中，多肽包含与本文所设想的任何参考序列具有至少约65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的多肽，通常其中变体保持参考序列的至少一种生物学活性。

多肽变体包含具有生物活性的“多肽片段”。如本文所用，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”是指保留天然存在的多肽活性的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的多肽片段。多肽片段是指多肽，所述多肽可以是具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或天然存在的或重组产生的多肽的一个或多个氨基酸的内部缺失或取代的单体或多聚体。在某些实施例中，多肽片段可以包括长度为至少5个到约1700个氨基酸的氨基酸链。应当理解的是，在某些实施例中，片段长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个或更多个氨基酸。

具体实施例中所设想的多肽包含融合多肽。

在具体实施例中所设想的融合蛋白的说明性实例，多肽包含具有至少约的多肽，包含但不限于：megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、工程化抗原受体和其它多肽。

融合多肽可以任选地包括可以用于连接多肽内的一个或多个多肽或结构域的连接子。肽连接子序列可以用于将任何两种或更多种多肽组分分离足够的距离，以确保每种多肽折叠成其合适的次级结构和三级结构，从而允许多肽结构域发挥其所期望功能。

示例性连接子包含但不限于以下氨基酸序列：甘氨酸聚合物(G)_n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G_1-5S_1-5)_n，其中n是至少一、二、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；GGG(SEQ ID NO:1)；DGGGS(SEQ ID NO:2)；TGEKP(SEQ ID NO:3)(参见例如Liu等人，《美国国家科学院院刊》5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO:4)(Pomerantz等人，1995，同上)；(GGGGS)_n其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO:5)(Kim等人，《美国国家科学院院刊》93,1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:6)(Chaudhary等人，1990，《美国国家科学院院刊》87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:7)(Bird等人，1988，《科学》242:423-426)，GGRRGGGS(SEQ ID NO:8)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:9)；LRQKDGGGSERP(SEQID NO:10)；LRQKD(GGGS)₂ERP(SEQ ID NO:11)。可替代地，可以使用能够对DNA结合位点和肽本身两者进行建模的计算机程序(Desjarlais和Berg，《美国国家科学院院刊》90:2256-2260(1993)、《美国国家科学院院刊》91:11099-11103(1994)或通过噬菌体展示方法合理地设计柔性连接子。

融合多肽可以进一步包括在本文所述的多肽结构域中的每一个之间或在内源性开放阅读框与供体修复模板编码的多肽之间的多肽切割信号。另外，多肽切割位点可以置于任何连接子肽序列中。示例性多肽切割信号包含多肽切割识别位点，如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，稀有限制性酶识别位点、自切割核酶识别位点)和自切割病毒寡肽(参见deFelipe和Ryan，2004，《转运(Traffic)》，5(8)；616-26)。

合适的蛋白酶切割位点和自切割肽是本领域技术人员已知的(参见例如，Ryan等人，1997，《普通病毒学期刊(J.Gener.Virol.)》，78,699-722；Scymczak等人，(2004)《自然生物技术(Nature Biotech)》5,589-594)。示例性蛋白酶切割位点包含但不限于马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如，烟草蚀刻病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、副病毒NIa蛋白酶、副病毒RNA-2编码蛋白酶、口疮病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、核糖酸3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球形病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧洲防风草黄斑病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa以及肠激酶的切割位点。由于其高切割严格性，在一个实施例中优选的是TEV(烟草蚀刻病毒)蛋白酶切割位点，例如EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO:12)，例如ENLYFQG(SEQ IDNO:13)和ENLYFQS(SEQ ID NO:14)，其中X代表任何氨基酸(通过TEV进行的切割发生在Q与G或Q与S之间)。

在某些实施例中，自切割多肽位点包括2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人，2001，《普通病毒学期刊》82:1027-1041)。在具体实施例中，病毒2A肽是口疮病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心脏病毒2A肽。

I.多核苷酸

在具体实施例中，提供了本文所设想的对一个或多个大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、工程化TCR、CAR、Daric、治疗性多肽、融合多肽进行编码的多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂合体。多核苷酸可以是单链或双链的并且可以是重组的、合成的或分离的。多核苷酸包含但不限于：前信使RNA(前-mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、合成RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、tracrRNA、crRNA、单向导RNA(sgRNA)、合成RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。多核苷酸是指长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个、或至少15000个或更多个核苷酸的核苷酸的聚合形式，或者是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者是任一类型核苷酸的修饰形式以及所有中间长度。容易理解的是，在此上下文中，“中间长度”是指引用值之间的任何长度，如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在具体实施例中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在具体实施例中，多核苷酸可以是密码子优化的。如本文所用，术语“密码子优化的”是指取代编码多肽的多核苷酸中的密码子以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。

如本文所用，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列或在严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸具有实质序列同一性的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失、取代或修饰至少一个核苷酸而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包含其中已添加或缺失、或修饰或用不同核苷酸替换一个或多个核苷酸的多核苷酸。在此方面，本领域中充分理解的是，可以对参考多核苷酸作出包括突变、添加、缺失以及取代在内的某些改变，由此所改变的多核苷酸保留所述参考多核苷酸的生物功能或活性。

如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已经从其侧翼的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如已经从通常与片段相邻的序列中移除的DNA片段。在具体实施例中，“分离的多核苷酸”是指互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、合成多核苷酸或自然中不存在并且通过人工制备的其它多核苷酸。

如本文所用的术语“核酸盒”或“表达盒”是指在载体内可以表达RNA和随后多肽的基因序列。在一个实施例中，核酸盒含有所关注的一个或多个基因，例如，所关注的一个或多个多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子、增强子、poly(A)序列和所关注的一个或多个基因，例如，所关注的一个或多个多核苷酸。在具体实施例中，供体修复模板包括一个或多个核酸盒。

如本文所用，术语“所关注的一个或多个多核苷酸”是指插入到表达载体中的一个或多个多核苷酸，例如，编码多肽(即，所关注的多肽)的多核苷酸。

在某些实施例中，所关注的多核苷酸包括抑制性多核苷酸，包含但不限于crRNA、tracrRNA、单向导RNA(sgRNA)、siRNA、miRNA、shRNA、核酶或另一种抑制性RNA。

如本文其它地方所公开的或如本领域已知的，无论编码序列本身的长度如何，多核苷酸可以与其它DNA序列组合如启动子和/或增强子、非转译区(UTR)、Kozak序列、多腺苷酸化信号、额外限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP位点、FRT位点和Att位点)、终止密码子、转录终止信号、转录后反应元件以及对自切割多肽、表位标记进行编码的多核苷酸，使得所述多核苷酸的总长度可以显著变化。因此设想可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，其总长度优选地受制备的容易性和在预期的重组DNA方案中的使用的限制。

可以使用本领域已知和可获得的各种成熟技术中的任何一种来制备、操纵、表达和/或递送多核苷酸。为了表达所期望的多肽，可以将对多肽进行编码的核苷酸序列插入到适当的载体中。

在具体实施例中，载体整合到细胞的基因组中。

在具体实施例中，载体是附加型载体或在染色体外维持的载体。如本文所用，术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中而不会从分裂的宿主细胞中逐渐丧失的载体，这还意味着所述载体在染色体外或附加地复制。

载体的说明性实例包含但不限于质粒、自主复制序列和转座子元件，例如睡美人(Sleeping Beauty)、PiggyBac。

载体的附加的说明性实例包含但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、如λ(lambda)噬菌体或M13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。

表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调控序列”是载体—复制起点—的那些非转译区、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、多腺苷酸化序列、5'和3'非转译区—其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和转译。此类元件的强度和特异性可能不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和转译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。

术语“可操作地连接”是指并置，其中所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中。在一个实施例中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列例如所关注的多核苷酸之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。

术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入到所述载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中自主复制的序列，或者可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。在具体实施例中，非病毒载体用于将本文所设想的一个或多个多核苷酸递送到细胞。

在具体实施例中所设想的递送多核苷酸的说明性方法包含但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、纳米颗粒、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-葡聚糖介导的转移、基因枪和热休克。

适用于在于具体实施例中所设想的具体实施例中使用的多核苷酸递送系统的说明性实例包含但不限于由Amaxa Biosystems、Maxcyte,Inc.、BTX Molecular DeliverySystems和Copernicus Therapeutics Inc.提供的系统。脂质转染试剂是商业销售的(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质已在文献中进行了描述。参见例如Liu等人，(2003)《基因疗法(Gene Therapy)》，10:180-187；以及Balazs等人，(2011)《药物递送期刊(Journal of Drug Delivery)》。2011:1-12。在具体实施例中还设想了抗体靶向的、细菌衍生的、非生物的基于纳米细胞的递送。

可以通过病毒方法将对一个或多个治疗性多肽或融合多肽进行编码的多核苷酸引入到靶细胞中。

J.病毒载体

在具体实施例中，使用载体、优选地病毒载体、更优选地逆转录病毒载体、并且甚至更优选地慢病毒载体将多核苷酸引入到靶细胞中。

如对于本领域技术人员显而易见的是，术语“病毒载体”广泛用于指代包含通常促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组或介导核酸转移的病毒或病毒颗粒中的病毒衍生的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)。病毒颗粒通常将包含各种病毒组分并且有时还包含除了一个或多个核酸之外的宿主细胞组分。

如下文所描述的，包括在具体实施例中设想的多核苷酸的病毒载体可以通过施用给个体患者进行体内递送，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用。可替代地，可以将载体离体递送到细胞，如从个体患者(例如，移动的外周血、淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检等)或通用供体造血干细胞移出的细胞，然后将细胞再植入患者体内。

在一个实施例中，将包括工程化的核酸酶和/或供体修复模板的病毒载体直接施用给生物体以在体内转导细胞。可替代地，可以施用裸DNA。通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径施用，包含但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用这种核酸的适当方法对于本领域的技术人员来说是可获得的并且是公知的，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。

适合于在本文中设想的具体实施例中使用的病毒载体系统的说明性实例包含但不限于腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、用于基因转移的痘苗病毒载体。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)转导细胞，将对工程化的核酸酶和/或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到细胞中。AAV是一种小型(约26nm)复制缺陷型、主要是附加型无包膜病毒。AAV可以感染分裂和非分裂细胞，并且可以将其基因组并入到宿主细胞的基因组中。重组AAV(rAAV)通常至少由转基因及其调节序列和5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)构成。ITR序列长约145bp。在具体实施例中，rAAV包括从AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10分离的ITR和衣壳序列。在一些实施例中，使用嵌合rAAV，从一种AAV血清型分离ITR序列，并且从不同的AAV血清型分离衣壳序列。例如，具有衍生自AAV2的ITR序列和衍生自AAV6的衣壳序列的rAAV被称为AAV2/AAV6。在具体实施例中，rAAV载体可以包括来自AAV2的ITR和来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中任一种的衣壳蛋白。在优选实施例中，rAAV包括衍生自AAV2的ITR序列和衍生自AAV6的衣壳序列。在一些实施例中，可以将工程化和选择方法应用于AAV衣壳以使其更有可能转导兴趣细胞。rAAV载体的构造、其生产和纯化已经公开于例如美国专利号9,169,494；9,169,492；9,012,224；8,889,641；8,809,058；以及8,784,799中，所述美国专利中的每一个通过引用以其全文并入本文中。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的逆转录病毒例如慢病毒转导细胞，将对工程化的核酸酶和/或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到细胞中。

如本文所使用的，术语“逆转录病毒”是指RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为直线型双链DNA拷贝，并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适合于在具体实施例中使用的说明性逆转录病毒包含但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德小鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。

如本文所使用的，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯那-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎/脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，优选基于HIV的载体骨架(即，HIV顺式作用序列元件)。

在各个实施例中，本文设想的慢病毒载体包括一个或多个LTR，以及以下辅助元件中的一个或多个或全部：cPPT/FLAP、Psi(Ψ)包装信号、输出元件、poly(A)序列，并且可以任选地包括WPRE或HPRE、绝缘子元件、选择性标记物和细胞自杀基因，如本文其它地方所讨论的。

在具体实施例中，本文设想的慢病毒载体可以是整合的或非整合的或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用的，术语“整合缺陷型慢病毒”是指具有整合酶的慢病毒，所述整合酶缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的能力。在专利申请WO 2006/010834中已经描述了不具整合潜能的病毒载体，所述专利申请通过引用以其全部内容并入本文。

适合于降低整合酶活性的HIV-1pol基因中的说明性突变包含但不限于：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A以及K264H。

术语“长末端重复序列(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对的结构域，其在其天然序列环境中是直接重复并且含有U3区、R区和U5区。

如本文所使用的，术语“FLAP元件”或“cPPT/FLAP”是指其序列包含逆转录病毒的中央多嘌呤管道和中枢终止序列(cPPT和CTS)例如HIV-1或HIV-2的核酸。适当的FLAP元件描述于美国专利号6,682,907中和Zennou等人，2000年，《细胞(Cell)》，101:173中。

如本文所使用的，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的psi[Ψ]序列，所述序列是将病毒RNA插入病毒衣壳或颗粒中所需的，参见例如，Clever等人，1995年，《病毒学期刊(J.of Virology)》，第69卷，第4期；第2101到2109页。

术语“输出元件”是指顺式作用的转录后调控元件，其调控RNA转录物从细胞核到细胞质的转运。RNA输出元件的实例包含但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如，Culle等人，1991年，《病毒学期刊》，65:1053；和Cullen等人，1991年，《细胞》，58:423)，以及乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。

在具体实施例中，通过将转录后调控元件、有效的多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号结合到载体中来增加病毒载体中异源序列的表达。各种转录后调控元件可以增加异源核酸在蛋白质上的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等人，1999年，《病毒学期刊》，73:2886)；乙型肝炎病毒(HPRE)中存在的转录后调控元件(Huang等人，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》，5:3864)；等等(Liu等人，1995年，《基因与发育(Genes Dev.)》，9:1766)。

由于修饰LTR，慢病毒载体优选地含有几种安全性增强作用。“自失活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如，其中被称为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。通过用异源启动子替换5'LTR的U3区来提供额外的安全性增强以在病毒颗粒的产生过程中驱动病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包含，例如，病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。

本文所使用的术语“假型”或“假型分型”是指其病毒包膜蛋白已经被具有优选特征的另一种病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可以用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白假型化，这允许HIV感染更广泛的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向CD4⁺呈递细胞。

在某些实施例中，根据已知方法产生慢病毒载体。参见例如，Kutner等人，《BMC生物技术(BMC Biotechnol)》，2009年；9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人，《自然实验手册(Nat.Protoc.)》，2009年；4(4):495–505.doi:10.1038/nprot.2009.22。

根据本文设想的某些具体实施例，大多数或所有病毒载体骨架序列衍生自慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解的是，可以使用或组合许多不同的逆转录病毒和/或慢病毒序列来源，并且可以适应某些慢病毒序列中的许多取代和更改而不损害用于执行本文所描述功能的转移载体的能力。此外，本领域已知多种慢病毒载体，参见，Naldini等人，(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998年，美国专利号6,013,516；和美国专利号5,994,136，其中许多可以适用于产生本文设想的病毒载体或转移质粒。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的腺病毒转导细胞，将对工程化的核酸酶和/或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到细胞中。

基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率并且并不要求细胞分裂。使用这种载体，已经获得了高滴度和高水平的表达。此载体可以在相对简单的系统中大量产生。大多数腺病毒载体被工程化为使得转基因取代Ad E1a基因、E1b基因和/或E3基因；随后，复制缺陷型载体在人类293细胞中繁殖，所述细胞反式提供缺失的基因功能。Ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包含如存在于肝、肾和肌肉中的非分裂的分化细胞。常规Ad载体具有大的承载能力。

复制缺陷的当前腺病毒载体的产生和繁殖可以利用命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系通过Ad5DNA片段从人类胚肾细胞转化并且组成性地表达E1蛋白(Graham等人，1977)。由于E3区可以从腺病毒基因组中分配出来(Jones和Shenk，1978)，所以目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1区、D3区或两个区中携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。将重组腺病毒施用于不同组织的研究包含气管滴注(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard，1993)以及立体定向脑内接种(Le GalLa Salle等人，1993)。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及用于肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等人，《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》，7:1083-9(1998))。

在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的单纯疱疹病毒例如HSV-1、HSV-2转导细胞，将对工程化的核酸酶和/或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到细胞中。

成熟的HSV病毒粒子由包膜的二十面体衣壳组成，而病毒基因组由152kb的线性双链DNA分子组成。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体缺乏一个或多个必需或非必需的HSV基因。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体是复制缺陷型。大多数复制缺陷型HSV载体含有用于去除一个或多个中早期HSV基因、早期HSV基因或晚期HSV基因的缺失以防止复制。例如，HSV载体可能缺乏选自由以下组成的组的立即早期基因：ICP4、ICP22、ICP27、ICP47及其组合。HSV载体的优点是其进入潜伏期的能力，所述潜伏期可以导致长期DNA表达以及其大的病毒DNA基因组，所述病毒DNA基因组可以容纳高达25kb的外源DNA插入物。基于HSV的载体描述于例如美国专利号5,837,532、5,846,782和5,804,413，以及国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583中，所述专利中的每一个通过引用以其全部内容并入本文中。

K.组合物和配制品

具体实施例中设想的组合物可以包括如本文所设想的一个或多个多肽、多核苷酸、包括其的载体以及基因组编辑组合物和经基因组编辑的细胞组合物。

具体实施例中设想的基因组编辑组合物和方法用于编辑细胞群。如本文所使用的，术语“细胞群”是指可以由如本文其它地方所述的同质或异质细胞类型的任何数量和/或组合构成的多个细胞。例如，细胞群可以包括约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的待转导的靶细胞类型。

在各个实施例中，本文中设想的组合物包括基因组编辑增强子和工程化核酸酶。工程化核酸酶可以采用mRNA的形式，所述mRNA通过在前公开的多核苷酸递送方法例如电穿孔、脂质纳米颗粒等引入到细胞中。与缺乏基因组编辑增强子的组合物相比，所述组合物可以用于产生增强的经基因组编辑的细胞群，所述细胞群具有通过易错NHEJ增加或增强的基因组编辑速率。

在各个实施例中，本文中设想的组合物包括基因组编辑增强子、供体修复模板和工程化核酸酶。工程化核酸酶可以采用mRNA的形式，所述mRNA通过在前公开的多核苷酸递送方法例如电穿孔、脂质纳米颗粒等引入到细胞中。与缺乏基因组编辑增强子的组合物相比，所述组合物可以用于产生增强的经基因组编辑的细胞群，所述细胞群具有通过HDR增加或增强的基因组编辑速率。

在具体实施例中，本文中设想的组合物包括细胞群、基因组编辑增强子、工程化核酸酶以及任选地供体修复模板。工程化核酸酶可以采用mRNA的形式，所述mRNA通过在前公开的多核苷酸递送方法引入到细胞中。

在具体实施例中，细胞群包括造血细胞，所述造血细胞包含但不限于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞。

在具体实施例中，基因组编辑增强子优选地为核酸嵌入剂，更优选地DNA嵌入剂，甚至更优选地吖啶，并且甚至更优选地9-氨吖啶。

组合物包含但不限于药物组合物。“药物组合物”是指在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制的组合物，其单独或与一种或多种其它治疗方式组合施用于细胞或动物。还应理解的是，如果需要，组合物也可以与其它药剂组合施用，如例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药物活性剂。对组合物中也可以包含的其它组分实际上不存在限制，条件是额外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所使用的，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包含但不限于任何已经被美国食品和药品管理局批准为可用于人类或家畜的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性药学上可接受的载体包含但不限于糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石粉；可可脂、蜡、动植物油脂、石蜡、有机硅、膨润土、硅酸、氧化锌；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、以及聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及在药物配制品中采用的任何其它相容物质。

在具体实施例中，组合物包括通过本文设想的包括基因组编辑增强子的方法制造的量的经基因组编辑的细胞。在优选的实施例中，药物细胞组合物包括细胞群，与未使用基因组编辑增强子编辑的细胞群相比，所述细胞群包括增加的经基因组编辑的细胞比例。

在某些实施例中，使用基因组编辑增强子制造的药物细胞组合物包括细胞群，所述细胞群包括约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约96％、97％、98％或99％的经基因组编辑的细胞。

通常可以说，包括通过具体实施例中设想的方法制造的经基因组编辑的细胞的药物组合物可以以约10²到约10¹⁰细胞/kg体重、约10⁵到约10⁹细胞/kg体重、约10⁵到约10⁸细胞/kg体重、约10⁵到约10⁷细胞/kg体重、约10⁷到约10⁹细胞/kg体重或约10⁷到约10⁸细胞/kg体重的剂量施用，包含这些范围内的所有整数值。细胞的数量将取决于组合物中经基因组编辑的细胞的百分比、组合物的最终用途以及其中包含的细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以为500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。因此，期望细胞的密度通常大于约10⁶个细胞/mL，并且通常大于约10⁷个细胞/mL，通常约10⁸个细胞/mL或更大。临床相关数目的细胞可以分配到累积等于或超过约10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个或10¹²个细胞的多次输注中。

在一些实施例中，特别是因为细胞群中存在高比例的经基因组编辑的细胞，所以可以以在这些范围内的剂量多次施用范围在10⁶/千克(每患者10⁶到10¹¹)的较低数目的细胞。对于经受疗法的患者，细胞可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。

在具体实施例中，本文设想的药物组合物包括与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的一定量的经基因组编辑的T细胞。

包括在具体实施例中设想的经基因组编辑的细胞的药物组合物可以进一步包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或如甘氨酸等氨基酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。具体实施例中设想的组合物优选地被配制用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内施用。

液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液或其它类似形式，可以包含以下中的一种或多种：如注射用水等无菌稀释剂、盐水溶液、优选地生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、如可以用作溶剂或悬浮培养基的合成甘油单酯或甘油二酯等固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选地是无菌的。

在一个实施例中，在药学上可接受的细胞培养基中配制本文中设想的经基因组编辑的细胞组合物。这种组合物适合于施用给人类受试者。在具体实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。

与含有血清的培养基相比，无血清培养基具有几个优点：包含简化和更明确的组合物、降低的污染程度、消除潜在的传染剂来源和更低的成本。在各个实施例中，无血清培养基是无动物的，并且可以任选地不含蛋白质。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白质。“无动物”培养基是指其中组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白质在无动物培养基中代替天然动物蛋白质，并且营养物质来自合成、植物或微生物来源。相反，“无蛋白”培养基被定义为基本上不含蛋白质。

用于特定组合物的无血清培养基的说明性实例包含但不限于QBSF-60(QualityBiological,Inc.)、StemPro-34(Life Technologies)和X-VIVO 10。

在一个优选实施例中，在包括PlasmaLyte A的溶液中配制包括本文设想的经基因组编辑的细胞的组合物。

在另一个优选实施例中，在包括冷冻保存培养基的溶液中配制包括本文设想的经基因组编辑的细胞的组合物。例如，具有冷冻保存剂的冷冻保存培养基可以用于在解冻后维持高细胞活力结果。用于特定组合物的冷冻保存培养基的说明性实例包含但不限于CryoStor CS10、CryoStor CS5和CryoStor CS2。

在更优选的实施例中，在包括50:50PlasmaLyte A:CryoStor CS10的溶液中配制包括本文设想的经基因组编辑的细胞的组合物。

在具体实施例中，本文设想的组合物包括单独的或与一种或多种治疗剂组合的有效量的经基因组编辑的细胞组合物。因此，组合物可以单独施用或与其它已知的治疗组合施用，如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。组合物还可以与抗生素组合施用。本领域可接受这种治疗剂作为如本文所描述的如特定癌症等特定疾病状态的标准治疗。在具体实施例中设想的示例性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其它活性剂和辅助剂。

L.基因组编辑方法

在各个实施例中，设想了编辑细胞群的基因组的方法。基因组编辑组合物和使用其来编辑细胞的基因组的方法提供提高的基因组编辑效率。不希望受任何特定理论的约束，设想在本文中设想的基因组编辑组合物中使用基因组编辑增强子，这显著增加了群体中经基因组编辑的细胞的数量。

在具体实施例中，与不使用基因组编辑增强子制造的群体中的经基因组编辑的细胞的数量相比，基因组编辑增强子使群体中经基因组编辑的细胞的比例增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约200％或更多。在具体实施例中，与不使用基因组编辑增强子制造的群体中的经基因组编辑的细胞的数量相比，基因组编辑增强子使群体中经基因组编辑的细胞的比例增加约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍或更多。

在具体实施例中设想的基因组编辑方法包括：将一个或多个工程化核酸酶和本文中设想的基因组编辑增强子引入到细胞群中以在靶位点处产生DSB；以及任选地将末端加工酶如3'-5'核酸外切酶及其生物活性片段例如Trex2引入到所述细胞中以增加通过易错NHEJ修复断裂的速率或频率。

在具体实施例中设想的基因组编辑方法包括：将一个或多个工程化核酸酶和本文中设想的基因组编辑增强子引入到细胞群中以在靶位点处产生DSB；以及随后将一个或多个供体修复模板引入到所述细胞群中，所述供体修复模板将通过同源重组并入DSB位点处的细胞基因组中。

在一个实施例中，增加细胞群中基因组编辑的方法包括：将工程化核酸酶引入到细胞中；使所述细胞与基因组编辑增强子接触以增加所述细胞群中基因组编辑的频率。

在一个实施例中，增加细胞群中同源定向修复(HDR)的方法包括：将工程化核酸酶和供体修复模板引入到细胞中；以及使所述细胞与基因组编辑增强子接触以增加所述细胞群中HDR的频率。

在一个实施例中，增加细胞群中非同源末端接合(NHEJ)的方法包括：将工程化核酸酶以及任选地末端加工酶例如3'-5'核酸外切酶(Trex2、Exo1、TdT等)引入到细胞中；以及使所述细胞与基因组编辑增强子接触以增加所述细胞群中NHEJ的频率。

基因组编辑增强子可以以任何适合的浓度用于具体实施例中，只要基因组编辑的速率或效率增加。在具体实施例中，基因组编辑增强子用于在约0.1μM到约200μM、约0.1μM到约100μM、约0.1μM到约10μM、约0.1μM到约1.0μM、约0.1μM到约200μM、约0.1μM到约100μM、约0.1μM到约10μM、约0.1μM到约1.0μM、约1.0μM到约200μM、约1.0μM到约100μM、约1.0μM到约10μM、或约0.01μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约1.0μM、约2.0μM、约3.0μM、约4.0μM、约5.0μM、约6.0μM、约7.0μM、约8.0μM、约9.0μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM、或约100μM或更高及其任何中间浓度的浓度下增加基因组编辑。

在具体实施例中，使用载体将一个或多个核酸酶引入到细胞中。在其它实施例中，优选地将一个或多个核酸酶作为mRNA引入到细胞中。可以通过显微注射、转染、脂质转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转移等将核酸酶引入到细胞中。

在具体实施例中，一个或多个供体模板包括对治疗基因或其片段、转基因或选择性标记物进行编码的多核苷酸。

在各个实施例中，所述供体修复模板包括对基因或其片段进行编码的一个或多个多核苷酸，所述基因或其片段包含但不限于：β球蛋白、δ球蛋白、γ球蛋白、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、白蛋白、因子VIII、因子IX、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA-4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、LMP7、TAP1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag-1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH和EPSPS；双特异性T细胞衔接子(BiTE)分子；激素；细胞因子(例如，IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15和TNF-α)、趋化因子(例如，MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3和RANTES)、细胞毒素(例如，穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)、细胞因子受体(例如，IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体)、以及工程化抗原受体(例如，工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体)。

可以通过显微注射、转染、脂质转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转移等将供体模板引入到细胞中。

在优选实施例中，通过mRNA电穿孔将所述一个或多个核酸酶引入到细胞中，并通过病毒转导将所述一个或多个供体修复模板引入到细胞中。

在另一优选实施例中，通过mRNA电穿孔将所述一个或多个核酸酶引入到细胞中，并通过AAV转导将所述一个或多个供体修复模板引入到细胞中。AAV载体可以包括来自AAV2的ITR以及来自以下中的任何一个的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10。在优选实施例中，AAV载体可以包括来自AAV2的ITR和来自AAV2或AAV6的血清型。

在另一优选实施例中，通过mRNA电穿孔将所述一个或多个核酸酶引入到细胞中，并通过慢病毒转导将所述一个或多个供体修复模板引入到细胞中。慢病毒载体骨架可以衍生自HIV-1、HIV-2、维斯那-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

可以在将一个或多个工程化核酸酶和供体修复模板引入到细胞中之前或期间或之后使细胞群与基因组编辑增强子接触。可以在将所述一个或多个工程化的核酸酶和基因组编辑增强子引入到细胞中之前、同时或之后递送所述一个或多个供体修复模板。在某些实施例中，所述一个或多个供体修复模板与所述一个或多个工程化的核酸酶和基因组编辑增强子同时递送。在其它实施例中，在所述一个或多个工程化的核酸酶和基因组编辑增强子之前递送所述一个或多个供体修复模板，例如，在所述一个或多个供体修复模板之前数秒到数小时到数天，包含但不限于在所述一个或多个工程化的核酸酶之前约1分钟到约30分钟、约1分钟到约60分钟、约1分钟到约90分钟、约1小时到约24小时，或在所述一个或多个工程化的核酸酶之前超过24小时。在某些实施例中，所述一个或多个供体修复模板在核酸酶和基因组编辑增强子之后优选地在约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时内；更优选地在约1小时、2小时、3小时或4小时内；或更优选地在约4小时内递送。

可以使用与所述一个或多个工程化的核酸酶相同的递送系统递送所述一个或多个供体修复模板。通过非限制性实例，当同时递送时，供体修复模板和工程化的核酸酶可以通过同一载体例如IDLV慢病毒载体或AAV载体(例如，AAV6)编码。在特定优选实施例中，通过mRNA电穿孔递送一种个或多个工程化的核酸酶，并使用AAV载体通过转导递送供体修复模板。

在具体实施例中，在CRISPR/Cas核酸酶系统用于修饰细胞中的靶位点的情况下，通过mRNA电穿孔和对靠近待在基因组中编辑的位点结合的tracrRNA:crRNA或sgRNA进行编码的表达盒来将Cas核酸酶引入到细胞中，并且通过与IDLV慢病毒载体或AAV载体转导来递送供体修复模板。

在具体实施例中，在CRISPR/Cas核酸酶系统用于修饰细胞中的靶位点的情况下，通过mRNA电穿孔来将Cas核酸酶和靠近待在基因组中编辑的位点结合的tracrRNA:crRNA或sgRNA引入到细胞中，并且通过与IDLV慢病毒载体或AAV载体转导来递送供体修复模板。

在一个实施例中，tracrRNA:crRNA或sgRNA是具有化学上受保护的5和3'末端的化学合成的RNA。

在另一个实施例中，Cas9作为与化学合成的tracrRNA:crRNA或sgRNA复合的蛋白质递送。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请和授权专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或授权专利被具体地和单独地指示通过引用并入本文。

尽管以上实施例已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细的描述，但是对于本领域的普通技术人员而言根据本文预期的教导应该容易清楚的是，在不偏离随附权利要求书的精神或范围下可以对其进行某些改变和变更。通过说明的方式而不是通过限制的方式提供以下实例。本领域的技术人员将易于认识到多种可以改变或修饰以产生本质上相似结果的非关键参数。

实例

实例1

小分子筛选识别基因编辑增强子

执行小分子筛选(图1)以识别可以调节原代人T细胞中TCR基因座处基因组编辑的效率的候选可溶性因子。

简而言之，用CD3/CD28磁珠活化经纯化的CD3+原代人T细胞并且在移除磁珠之前将其在IL-2补充的完全RPMI培养基中培养48小时。在移除磁珠之后，洗涤T细胞并用对靶向megaTAL-Trex2融合mRNA的T细胞受体α(TCRα)进行编码的体外转录的mRNA对其进行电穿孔。然后，将细胞分配到384孔格式中并使其与约2000种已知药物、天然产物和其它生物活性组分的文库(Microsource Discovery System的Spectrum Collection)接触，每种药物的最终浓度为10μM。在37℃下用化合物培养细胞24小时，并且然后洗涤且额外培养三天。然后，针对CD3、CD4和CD8表面标记物对细胞进行染色，并且进行高通量体积流式细胞术分析。通过丧失CD3细胞表面染色来检测TCRα基因的MegaTAL介导的破坏。

MegaTAL编辑效率在每种化合物存在的情况下被量化为对CD3呈染色阴性的CD4/CD8+细胞的比例。FSC/SSC曲线的“活”门中的流式细胞术事件的数量被用作细胞产量的度量。通过根据对细胞产率(图2A)的影响、根据在流式细胞术分析时CD3阴性细胞(图2B)的频率以等级次序绘制化合物并且通过根据全部2000种化合物的细胞产率(图2C)绘制CD3阴性细胞的频率来分析每种化合物对基因组编辑的影响。表1中示出了十种最具活性的化合物的产率和megaTAL活性。

表1.增强基因组编辑的化合物

化合物	[化合物]	细胞产率	％CD3阴性
				替洛隆	10μM	310	86.8
氨吖啶	10μM	13621	82.8
				胡米溴铵	10μM	1023	80.3
哈尔碱	10μM	9581	75.1
				海恩酮	10μM	10012	74.1
柔红霉素	10μM	35	73.3
				血根碱硫酸盐	10μM	2346	71.1
激动素核苷	10μM	1668	70.8
				乳酸依沙吖啶	10μM	14179	70.4
环十二碳三烯	10μM	4166	68.7

实例2

替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)和哈尔碱增强原代T细胞中MEGATAL介导的基因破坏

用如实例1中描述的对靶向megaTAL-Trex2融合的TCRα进行编码的mRNA纯化、活化和电穿孔T细胞。在30℃或37℃下用替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)和哈尔碱培养经电穿孔的细胞24小时。然后洗涤细胞以去除残留化合物并且将其培养额外三天。培养三天之后，如实例1中所描述的，用CD4、CD8和CD3对细胞进行染色并且通过流式细胞术对其进行分析。

如通过CD3阴性细胞的比例所确定的，在每种化合物的浓度与TCRα破坏的效率之间观察到正相关。图3A和图3B.除了基因破坏的浓度依赖性增加之外，每种化合物表现出对T细胞活力和产率的浓度依赖性影响。图3C和图3D.氨吖啶对细胞活力具有最小的影响，并且基本上增强基因破坏。

实例3

氨吖啶增强对进入T细胞受体Α(TCRΑ)基因座的荧光蛋白进行编码的转基因的同源

重组

设计并构造了含有包括启动子、编码荧光蛋白的转基因和多腺苷酸化信号的转基因盒的腺相关病毒(AAV)质粒。用XmaI消化物确认AAV ITR元件的完整性。将转基因表达盒置于TCRα基因的外显子1内的两个同源区之间以使用TCRα靶向megaTAL通过同源重组(AAV靶向载体)实现靶向。5'同源区和3'同源区的长度分别为约1500bp和约1000bp，并且两个同源区都不含完整megaTAL靶位点。转基因表达盒含有骨髓增生性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失的可操作地连接到编码荧光多肽的多核苷酸的d1587rev引物结合位点取代的(MND)启动子，例如绿色荧光蛋白(GFP)。表达盒还含有SV40晚期聚腺苷酸化信号。

通过使用提供必要的复制、衣壳和腺病毒辅助元件的一个或多个质粒瞬时共转染HEK 293T细胞来制备重组AAV-6(rAAV)。在基于碘克沙醇的梯度中使用超速离心从经共转染的HEK 293T细胞培养物中纯化rAAV。

在用CD3和CD28活化并且在补充有IL-2的完整培养基中培养的原代人T细胞中评估MegaTAL诱导的同源定向修复(HDR)。3天之后，洗涤T细胞并用对靶向megaTAL的TCRα进行编码的体外转录的mRNA进行电穿孔，并且随后用对MND-GFP转基因盒进行编码的经纯化的重组AAV进行转导。对照物包含含有单独靶向载体的megaTAL或rAAV的T细胞。在存在或不存在两个不同剂量的氨吖啶的情况下，将细胞在30℃下培养过夜。电穿孔五天后，通过流式细胞术测量GFP+T细胞的频率。通过丧失CD3染色来检测TCRα基因的MegaTAL介导的破坏。

当在megaTAL转染之后T细胞补充有氨吖啶(18％相对于36％GFP+10μM氨吖啶)时，观察到HDR事件的频率的浓度依赖性增加(％GFP+细胞)，而仅在单独用AAV处理的样品中观察到最小GFP表达。图4和表2.

表2.氨吖啶提升原代T细胞中的HDR水平

百分比示出％GFP阳性细胞。(+)意指存在组分，(-)意指缺乏组分。

实例4

氨吖啶增强对进入BCL11A类红细胞增强子区的荧光蛋白进行编码的转基因的同源重组

设计、构造并验证了含有启动子、GFP或BFP报道转基因和多腺苷酸化信号的腺相关病毒(AAV)质粒。转基因的侧翼为1.3kb和1.0kb同源臂到在DHS58处的BCL11A类红细胞增强子基因座(Bauer等人，《科学(Science)》342(6155):253-7(2013))。如实例3中所描述的，rAAV是通过瞬时转染HEK293T细胞而产生的。

在细胞因子补充的培养基中培养原代人外周血衍生的CD34+细胞72小时。洗涤细胞并用编码对人BCL11A类红细胞增强子区具有特异性的megaTAL或靶向人CCR5基因座的megaTAL的mRNA进行电穿孔。然后，在具有或不具有在0μM、0.3μM、1.0μM和3.0μM浓度下的氨吖啶的情况下，用AAV载体孵育细胞24小时，洗涤并在细胞因子补充的培养基中进行培养。通过流式细胞术在定期时间点上分析HDR以确定BFP荧光。

氨吖啶在BCL11A基因座(％BFP+细胞)处诱导CD34+细胞中HDR频率的浓度依赖性增加。图5.氨吖啶不增强通过CD34+细胞中非同源驱动的NHEJ途径的模板捕获。当CCR5特异性megaTAL不与靶向AAV模板的BCL11A组合时，氨吖啶添加不显著增加BFP+细胞的比例。同上。

实例5

氨吖啶治疗不会不利地影响造血干细胞和造血祖细胞存活

使用小分子增强基因修复的潜在说明对造血干细胞和造血祖细胞存活具有影响。形成测定的甲基纤维素菌落用于确定氨吖啶治疗对体外造血干细胞和造血祖细胞存活的影响。如实例4中所描述的，在细胞因子补充的培养基中培养人外周血CD34+细胞，用对BCL11A特异性megaTAL进行编码的mRNA对其进行电穿孔，并且用BCL11A-HDR AAV载体对其进行转导。

在存在或不存在氨吖啶的情况下，在电穿孔后第一个24小时期间培养细胞。在这个电穿孔后修复步骤之后，对细胞进行计数并且将其铺板到甲基纤维素培养基中。

在甲基纤维素培养物中培养14天后，基于频率和形态学对爆发集落形成单位红细胞(BFU)和造血菌落形成单位(CFU)进行评分。在具有或不具有氨吖啶的情况下，用单独的megaTAL、具有rAAV的megaTAL处理CD34+细胞，这产生相当的谱系输出并且示出相对于对照物电穿孔的细胞的不明显的谱系偏移。图6。

为了确定用氨吖啶治疗是否可以在衍生自原代人造血干细胞和造血祖细胞的甲基纤维素菌落中产生提升的HDR比率，收获菌落并通过流式细胞术进行分析。如在用megaTAL和rAAV载体治疗的样品中通过流式细胞术所确定的，氨吖啶治疗增加经受HDR的细胞的比例。图7。

实例6

氨吖啶增加庞大HSC群中的HDR

在细胞因子补充的培养基中培养原代人外周血衍生的CD34+细胞48小时。洗涤细胞并用编码对人BCL11A类红细胞增强子区具有特异性的megaTAL的mRNA进行电穿孔。然后，在具有或不具有浓度为1.0μM的氨吖啶的情况下，用AAV载体孵育细胞24小时，洗涤并在细胞因子补充的培养基中进行培养。通过流式细胞术在定期时间点上分析HDR以确定BFP荧光。

氨吖啶增加BCL11A基因座(％BFP+细胞)处CD34+细胞中的HDR频率。图8。

总之，在以下权利要求书中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的特定实施例，而是应当被解释为包含所有可能的实施例、连同这种权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求书不受本公开限制。

序列表

<110> 蓝鸟生物公司 （bluebird bio, Inc.）

阿斯特拉罕，萨沙 （Astrakhan, Sasha）

赫夫纳，加勒特 （Heffner, Garrett）

<120> 基因组编辑增强子

<130> BLBD-074/01WO

<150> US 62/377,357

<151> 2016-08-19

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

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<223> 示范性链接序列

<400> 1

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1

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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

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<223> 示范性链接序列

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1 5 10

<210> 7

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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

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<223> 示范性链接序列

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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

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<221>

<222>

<223> 通过TEV蛋白酶裂解序列

<220>

<221> SITE

<222> (2)..(3)

<223> Xaa是任何氨基酸

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<221> SITE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = Gly或Ser

<400> 12

Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 通过TEV蛋白酶裂解序列

<400> 13

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 通过TEV蛋白酶裂解序列

<400> 14

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

Claims (118)

1.一种组合物，其包括细胞群、基因组编辑增强子和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

2.一种组合物，其包括细胞群、基因组编辑增强子、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述细胞群包括干细胞。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的组合物，其中所述细胞群包括造血细胞。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的组合物，其中所述细胞群包括CD34⁺细胞、CD133⁺细胞、CD34⁺CD133⁺细胞或CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^-细胞。

6.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述细胞群包括免疫效应细胞。

7.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述细胞群包括CD3⁺细胞、CD4⁺细胞、CD8⁺细胞或其组合。

8.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述细胞群包括T细胞。

9.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述细胞群包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助性T细胞。

10.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述细胞的来源为外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。

11.一种组合物，其包括基因组编辑增强子和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

12.一种组合物，其包括基因组编辑增强子、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子为DNA嵌入剂。

14.根据权利要求1到13中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：单功能DNA嵌入剂、双功能DNA嵌入剂或多功能DNA嵌入剂。

15.根据权利要求1到14中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：吖啶、蒽环霉素、生物碱、香豆素和啡啶。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：1,8-萘二甲酰亚胺、4'6-二脒基-α-苯基吲哚、吖啶、吖啶橙、吖啶黄素、山油柑碱、黄肉楠碱(actinodaphnidine)、氨吖啶、安吖啶、蒽环霉素、氨茴霉素、蒽吡唑类(anthrapyrazole)、苯并啡啶类生物碱、小檗胺、黄连素、小檗红碱、博莱霉素、BOBO-1、BOBO-3、波尔定碱、BO-PRO-1、BO-PRO-3、空褐鳞碱(bublocapnine)、喜树碱、无根藤碱、教酒菌素、氯喹、色霉素、辛可尼丁、辛可宁、黄连碱、甲氧檗因、香豆素、白叶藤碱、更生霉素、DAPI、柔红霉素、荷包牡丹碱、白鲜碱、偏端霉素、阿霉素、玫瑰树碱、吐根碱、依沙吖啶、乙啡啶、吴茱萸春、崖椒碱、花椒宁碱、氟香豆素、GelStar、庆大霉素、海罂粟碱、骆驼蓬碱、哈尔碱、赫达霉素、己锭(hexidium)、Hoechst 33258、Hoechst 33342、乙菲啶、海恩酮、咪唑并吖啶酮、吲唑类似物、碘化物、异紫堇定碱、异喹啉生物碱、药根碱、JOJO-1、JO-PRO-1、激动素核苷、kokusainine、山梗烷醇酮、LOLO-1、LO-PRO-1、硫蒽酮、masculine、马塔啶(matadine)、米帕林、金属嵌入剂、光神霉素、米托蒽醌、新白叶藤碱、纺锤菌素、两面针碱、二胺硝吖啶、诺加霉素、去甲哈尔满、OliGreen、非洲防己碱、啡啶、PicoGreen、吡柔比星、多吡啶、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、原黄素、普罗匹定、补骨脂素、奎纳克林、奎尼定、奎宁、喹喔啉、RiboGreen、铑基嵌入剂、钌基嵌入剂、血根碱、蛇根碱、茵芋碱、链霉素、SYBR DX、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYTO-11、SYTO-12、SYTO-13、SYTO-14、SYTO-15、SYTO-16、SYTO-17、SYTO-20、SYTO-21、SYTO-22、SYTO-23、SYTO-24、SYTO-25、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45、SYTO-59、SYTO-60、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-63、SYTO-64、SYTO-80、SYTO-81、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、他克林、萨力多胺、噻唑橙、替洛隆、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、乌桑巴拉碱(usambarensine)、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3及其类似物和衍生物。

17.根据权利要求1到16中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)、哈尔碱、海恩酮、柔红霉素、血根碱硫酸盐、激动素核苷、乳酸依沙吖啶和环十二碳三烯。

18.根据权利要求1到17中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)和哈尔碱。

19.根据权利要求1到18中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子为吖啶或二吖啶。

20.根据权利要求1到19中任一项所述的组合物，其中所述基因组编辑增强子为氨吖啶(9-氨基吖啶)。

21.一种组合物，其包括细胞、吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

22.一种组合物，其包括细胞、吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

23.一种组合物，其包括细胞、9-氨基吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

24.一种组合物，其包括细胞、9-氨基吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

25.一种组合物，其包括吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

26.一种组合物，其包括吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

27.一种组合物，其包括9-氨基吖啶和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

28.一种组合物，其包括9-氨基吖啶、供体修复模板和工程化核酸酶和/或任选地对所述工程化核酸酶进行编码的mRNA。

29.根据权利要求1到28中任一项所述的组合物，其中所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

31.根据权利要求29或权利要求30所述的组合物，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

32.根据权利要求29到31中任一项所述的组合物，其中所述大范围核酸酶由I-OnuILHE工程化。

33.根据权利要求29所述的组合物，其中所述megaTAL包括TALE DNA结合结构域和工程化大范围核酸酶。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述TALE结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

35.根据权利要求33或权利要求34所述的组合物，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

36.根据权利要求33到35中任一项所述的组合物，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

37.根据权利要求33到36中任一项所述的组合物，其中所述大范围核酸酶由I-OnuILHE工程化。

38.根据权利要求29所述的组合物，其中所述TALEN包括TALE DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

40.根据权利要求38或权利要求39所述的组合物，其中所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

41.根据权利要求38到40中任一项所述的组合物，其中所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

42.根据权利要求39所述的组合物，其中所述ZFN包括锌指DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述锌指DNA结合结构域包括2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个锌指基序。

44.根据权利要求42或权利要求43所述的组合物，其中所述ZFN包括TALE结合结构域。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

46.根据权利要求42到45中任一项所述的组合物，其中所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

47.根据权利要求42到46中任一项所述的组合物，其中所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

48.根据权利要求39所述的组合物，其中所述工程化核酸酶包括CRISPR/Cas核酸酶。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为Cas9或Cpf1。

50.根据权利要求48或权利要求49所述的组合物，其中所述Cas核酸酶进一步包括一个或多个TALE DNA结合结构域。

51.根据权利要求48到50中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括tracrRNA和靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个crRNA。

52.根据权利要求48到50中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个sgRNA。

53.根据权利要求1到52中任一项所述的组合物，其中所述工程化核酸酶包括末端加工酶活性。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述末端加工酶活性为5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述末端加工酶活性为Trex2或其生物活性片段的3-5'核酸外切酶活性。

56.根据权利要求1到52中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括末端加工酶或对所述末端加工酶进行编码的mRNA。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述末端加工酶展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

58.根据权利要求56或权利要求57所述的组合物，其中所述末端加工酶包括Trex2或其生物活性片段。

59.根据权利要求1到58中任一项所述的组合物，其包括对以下进行编码的供体修复模板：β球蛋白、δ球蛋白、γ球蛋白、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、白蛋白、因子VIII、因子IX、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA-4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag-1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS或其片段。

60.根据权利要求1到58中任一项所述的组合物，其包括对以下进行编码的供体修复模板：双特异性T细胞衔接子(BiTE)分子；激素；细胞因子(例如，IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15和TNF-α)、趋化因子(例如，MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3和RANTES)、细胞毒素(例如，穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)、细胞因子受体(例如，IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体)或工程化抗原受体。

61.根据权利要求1到58中任一项所述的组合物，其包括对以下进行编码的供体修复模板：工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体。

62.一种增加细胞群中基因组编辑的方法，其包括：

(a)将工程化核酸酶引入到细胞群中；以及

(b)使所述细胞群与基因组编辑增强子接触，

其中在存在所述基因组编辑增强子的情况下，所述工程化核酸酶的表达增加了所述细胞群中基因组编辑的频率。

63.一种增加细胞群中同源定向修复(HDR)的方法，其包括：

(a)使所述细胞群与基因组编辑增强子接触；

(b)引入工程化核酸酶以在靶位点处产生双链断裂(DSB)；以及

(b)将供体修复模板引入到所述细胞群中；

其中在存在所述基因组编辑增强子和所述供体修复模板的情况下，所述工程化核酸酶的表达增加了通过同源定向修复(HDR)在所述靶位点处并入所述供体修复模板的频率。

64.一种增加细胞群中非同源末端接合(NHEJ)的方法，其包括：

(a)使所述细胞群与基因组编辑增强子接触；

(b)引入工程化核酸酶以在靶位点处产生双链断裂(DSB)；

(a)将工程化核酸酶引入到细胞群中；并且

其中在存在所述基因组编辑增强子的情况下，所述工程化核酸酶的表达增加了所述靶位点处NHEJ的频率。

65.根据权利要求62到64中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血细胞。

66.根据权利要求62到65中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫效应细胞。

67.根据权利要求62到66中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺或其组合。

68.根据权利要求62到67中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞。

69.根据权利要求62到68中任一项所述的方法，其中所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助性T细胞。

70.根据权利要求62到69中任一项所述的方法，其中所述细胞的来源为外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。

71.根据权利要求62到65中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞或造血祖细胞。

72.根据权利要求62到65中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34⁺细胞。

73.根据权利要求62到65中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD133⁺细胞。

74.根据权利要求62到65中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34⁺CD38^LoCD90⁺CD45RA^-细胞。

75.根据权利要求62到74中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子为DNA嵌入剂。

76.根据权利要求62到75中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：单功能DNA嵌入剂、双功能DNA嵌入剂或多功能DNA嵌入剂。

77.根据权利要求62到76中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：吖啶、蒽环霉素、生物碱、香豆素和啡啶。

78.根据权利要求62到77中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：1,8-萘二甲酰亚胺、4'6-二脒基-α-苯基吲哚、吖啶、吖啶橙、吖啶黄素、山油柑碱、黄肉楠碱(actinodaphnidine)、氨吖啶、安吖啶、蒽环霉素、氨茴霉素、蒽吡唑类(anthrapyrazole)、苯并啡啶类生物碱、小檗胺、黄连素、小檗红碱、博莱霉素、BOBO-1、BOBO-3、波尔定碱、BO-PRO-1、BO-PRO-3、空褐鳞碱、喜树碱、无根藤碱、教酒菌素、氯喹、色霉素、辛可尼丁、辛可宁、黄连碱、甲氧檗因、香豆素、白叶藤碱、更生霉素、DAPI、柔红霉素、荷包牡丹碱、白鲜碱、偏端霉素、阿霉素、玫瑰树碱、吐根碱、依沙吖啶、乙啡啶、吴茱萸春、崖椒碱、花椒宁碱、氟香豆素、GelStar、庆大霉素、海罂粟碱、骆驼蓬碱、哈尔碱、赫达霉素、己锭、Hoechst 33258、Hoechst 33342、乙菲啶、海恩酮、咪唑并吖啶酮、吲唑类似物、碘化物、异紫堇定碱、异喹啉生物碱、药根碱、JOJO-1、JO-PRO-1、激动素核苷、kokusainine、山梗烷醇酮、LOLO-1、LO-PRO-1、硫蒽酮、masculine、马塔啶、米帕林、金属嵌入剂、光神霉素、米托蒽醌、新白叶藤碱、纺锤菌素、两面针碱、二胺硝吖啶、诺加霉素、去甲哈尔满、OliGreen、非洲防己碱、啡啶、PicoGreen、吡柔比星、多吡啶、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、原黄素、普罗匹定、补骨脂素、奎纳克林、奎尼定、奎宁、喹喔啉、RiboGreen、铑基嵌入剂、钌基嵌入剂、血根碱、蛇根碱、茵芋碱、链霉素、SYBR DX、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYTO-11、SYTO-12、SYTO-13、SYTO-14、SYTO-15、SYTO-16、SYTO-17、SYTO-20、SYTO-21、SYTO-22、SYTO-23、SYTO-24、SYTO-25、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45、SYTO-59、SYTO-60、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-63、SYTO-64、SYTO-80、SYTO-81、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、他克林、萨力多胺、噻唑橙、替洛隆、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、乌桑巴拉碱、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3及其类似物和衍生物。

79.根据权利要求62到78中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)、哈尔碱、海恩酮、柔红霉素、血根碱硫酸盐、激动素核苷、乳酸依沙吖啶和环十二碳三烯。

80.根据权利要求62到79中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子选自由以下组成的组：替洛隆、氨吖啶、胡米溴铵(溴化乙锭)和哈尔碱。

81.根据权利要求62到80中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子为吖啶或二吖啶。

82.根据权利要求62到81中任一项所述的方法，其中所述基因组编辑增强子为氨吖啶(9-氨基吖啶)。

83.根据权利要求62到82中任一项所述的方法，其中所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

85.根据权利要求83或权利要求84所述的方法，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

86.根据权利要求84到85中任一项所述的方法，其中所述大范围核酸酶由I-OnuI LHE工程化。

87.根据权利要求83所述的方法，其中所述megaTAL包括TALE DNA结合结构域和工程化大范围核酸酶。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述TALE结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

89.根据权利要求87或权利要求88所述的方法，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。

90.根据权利要求87到89中任一项所述的方法，其中所述大范围核酸酶由选自由以下组成的组的LHE工程化：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。

91.根据权利要求87到90中任一项所述的方法，其中所述大范围核酸酶由I-OnuI LHE工程化。

92.根据权利要求83所述的方法，其中所述TALEN包括TALE DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

93.根据权利要求92所述的方法，其中所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

94.根据权利要求92到93所述的方法，其中所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

95.根据权利要求92到94中任一项所述的方法，其中所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

96.根据权利要求83所述的方法，其中所述ZFN包括锌指DNA结合结构域和核酸内切酶结构域或半结构域。

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述锌指DNA结合结构域包括2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个锌指基序。

98.根据权利要求96或权利要求97所述的方法，其中所述ZFN包括TALE结合结构域。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述TALE DNA结合结构域包括约9.5个TALE重复单元到约11.5个TALE重复单元。

100.根据权利要求96到99中任一项所述的方法，其中所述核酸内切酶结构域从II型限制性核酸内切酶分离。

101.根据权利要求96到100中任一项所述的方法，其中所述核酸内切酶结构域从FokI分离。

102.根据权利要求83所述的方法，其中所述工程化核酸酶包括CRISPR/Cas核酸酶。

103.根据权利要求102所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9或Cpf1。

104.根据权利要求102或权利要求103所述的方法，其中所述Cas核酸酶进一步包括一个或多个TALE DNA结合结构域。

105.根据权利要求102到104中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括tracrRNA和靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个crRNA。

106.根据权利要求102到104中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括靶向所述细胞的基因组中的原型间隔序列的一个或多个sgRNA。

107.根据权利要求62到106中任一项所述的方法，其中所述工程化核酸酶包括末端加工酶活性。

108.根据权利要求107所述的方法，其中所述末端加工酶活性为5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

109.根据权利要求108所述的方法，其中所述末端加工酶活性为Trex2或其生物活性片段的3-5'核酸外切酶活性。

110.根据权利要求62到106中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括末端加工酶或对所述末端加工酶进行编码的mRNA。

111.根据权利要求110所述的方法，其中所述末端加工酶展现出5-3'核酸外切酶、5-3'碱性核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或不依赖模板的DNA聚合酶活性。

112.根据权利要求110或权利要求111所述的方法，其中所述末端加工酶包括Trex2或其生物活性片段。

113.根据权利要求62到112中任一项所述的方法，其包括对以下进行编码的供体修复模板：β球蛋白、δ球蛋白、γ球蛋白、BCL11A、KLF1、CCR5、CXCR4、PPP1R12C(AAVS1)、HPRT、白蛋白、因子VIII、因子IX、LRRK2、Htt、SOD1、C9orf72、TARDBP、FUS、RHO、CFTR、SFTPB、TRAC、TRBC、PD1、CTLA-4、HLA A、HLA B、HLA C、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、LMP7、TAP 1、TAP2、TAPBP、CIITA、DMD、GR、IL2RG、Rag-1、RFX5、FAD2、FAD3、ZP15、KASII、MDH、EPSPS或其片段。

114.根据权利要求62到112中任一项所述的方法，其包括对以下进行编码的供体修复模板：双特异性T细胞衔接子(BiTE)分子；激素；细胞因子(例如，IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-7、IL-21、IL-10、IL-12、IL-15和TNF-α)、趋化因子(例如，MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-3和RANTES)、细胞毒素(例如，穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)、细胞因子受体(例如，IL-2受体、IL-7受体、IL-12受体、IL-15受体和IL-21受体)或工程化抗原受体。

115.根据权利要求62到112中任一项所述的方法，其包括对以下进行编码的供体修复模板：工程化T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、Daric受体或其组分、或嵌合细胞因子受体。

116.一种细胞，其通过权利要求62到115中任一项所述的方法产生。

117.一种组合物，其包括根据权利要求116所述的细胞。

118.一种药物组合物，其包括药学上可接受的载剂和根据权利要求116所述的细胞。