CN109897904A - 基于prlr基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于PRLR基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用。所述的分子标记位于猪PRLR基因第10号外显子上，即，在260、362、527、540、584、673、745、765、934bp处，记为g.260C>G、g.362C>T、g.527C>G、g.540A>G、g.584A>G、g.673A>T、g.745A>G、g.765C>T和g.934A>G。本发明还公开了上述的分子标记在猪种选育中的应用。本发明为猪的分子标记辅助选择提供了一种新的标记方法，为猪的分子育种提供了参考。

Description

基于PRLR基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用

技术领域

本发明属于动物分子标记育种技术领域，具体地说，涉及一种基于PRLR基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用。

背景技术

猪肉是当今世界上最主要的肉用经济动物之一，中国作为猪肉消费大国，猪的存栏量居世界第一。为提高生产效益，猪的繁殖性能一直是各大养殖企业关注的重要指标之一，其中猪的总产仔数和活产仔数尤为关键。

分子标记辅助选择作为现代家畜育种工程中的一种重要手段，有效地避免传统中以表型为基础的育种手段的弊端，缩短了遗传间隔期，提高的选择准确性。分子标记辅助选择的前提是确定与所需表型性状相关的候选基因，有目的地对这些基因进行检测从而确定育种方向。

催乳素(Prolactin，PRL)是一种由垂体前叶腺嗜酸细胞分泌的蛋白质激素，与胎盘激素、生长激素同属一个家族。PRL对于动物体具有广泛的生理性功能，主要表现在：维持乳腺导管和腺泡细胞的发育，影响交配行为，为妊娠提供良好的微环境，影响妊娠的维持与胎儿的发育，促使母体产生母性行为，此外对于摄取氨基酸、合成乳汁及免疫系统、血液循环系统等都具有重要的影响。

催乳素受体基因(Prolactin receptor gene，PRLR)是一种由腺垂体分泌的蛋白质类激素，属于细胞因子/生长激素/催乳素受体超家族，由胞内区域、胞外区域和跨膜区域构成，其中胞内域的变异导致了受体结构的多样性。哺乳动物中存在两种类型的受体：长型和短型。研究表明，猪的PRLR基因定位于16号染色体上，包含10个外显子和9个内含子，其中10号外显子区域含有较多突变。

催乳素要行使其功能，必须与其受体相结合，通过受体从而作用于靶细胞。催乳素(PLR)与催乳素受体(PRLR)结合，分为胞外区域活化和胞内区域活化两个过程。胞外活化过程就是二聚化的过程，两个PRLR结合到一个PRL的两个结合位点上去，形成一个三聚复合体；胞内活化过程就是酪氨酸激酶的活化和PRLR的磷酸化过程，最终激活PRLR进入转导途径。磷酸化的酪氨酸残基与信号转导和转录激活因子的SH2区域形成新的聚合物，聚合物进入细胞核，从而激活启动子，调控靶基因的表达，促使PRL发挥生物学功能。例如刺激乳腺发育，促进乳汁的生成与分泌；催乳素还可直接作用于卵巢的颗粒细胞，抑制颗粒细胞的芳香酶活性，减少合成雌二醇，抑制排卵。同时，催乳素还具有溶黄体的作用。诸多资料显示，催乳素还能影响动物繁殖、调节免疫、维持水盐和渗透压的平衡等。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于PRLR基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于PRLR基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记，所述的分子标记位于猪PRLR基因第10号外显子上，即在260、362、527、540、584、673、745、765、934bp处，记为g.260C>G、g.362C>T、g.527C>G、g.540A>G、g.584A>G、g.673A>T、g.745A>G、g.765C>T和g.934A>G。

本发明还公开了一种用于检测上述的分子标记的引物对，包括PRLR-E10-F和PRLR-E10-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明还公开了一种含有上述引物对的试剂或试剂盒。

本发明还公开了一种检测上述的分子标记的方法，所述方法包括：以大白猪基因组DNA为模板利用上述的引物对进行PCR扩增获得PCR产物；对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

可选地，PCR扩增反应体系为：2×Taq Master Mix 15μL，DNA 1.5μL，10μM上游引物1.5μL，10μM下游引物1.5μL，ddH₂O 10.5μL。

可选地，PCR扩增反应程序：94℃预变性1.5min；94℃变性20s,50-60℃退火20s，72℃延伸1Kb/60s，循环30次；最后72℃再延伸5min，4℃保存。

本发明还公开了一种上述的分子标记在猪种选育中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明发现，PRLR基因的第10号外显子上共存在9个突变位点，这9个突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数和活产仔数存在相关性，且容易检测。因此本发明提供了一个基于PRLR基因的与猪的繁殖性状相关的分子标记，并且提供了这种分子标记的检测方法以及其在繁殖性状选择中的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一种新的标记方法，为猪的分子育种提供了参考。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明猪PRLR基因10号外显子区域C260G突变位点测序图；

图2是本发明猪PRLR基因10号外显子区域C362T突变位点测序图；

图3是本发明猪PRLR基因10号外显子区域C527G突变位点测序图；

图4是本发明猪PRLR基因10号外显子区域A540G突变位点测序图；

图5是本发明猪PRLR基因10号外显子区域A584G突变位点测序图；

图6是本发明猪PRLR基因10号外显子区域A673T突变位点测序图；

图7是本发明猪PRLR基因10号外显子区域A745G突变位点测序图；

图8是本发明猪PRLR基因10号外显子区域C765T突变位点测序图；

图9是本发明猪PRLR基因10号外显子区域A934G突变位点测序图；

图10是本发明猪PRLR基因10号外显子PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，第1-8孔以及第10-17孔均为大白猪的PRLR基因10号外显子区域扩增产物，片段大小为1251bp，第9孔为2000DNA marker；

图11是本发明本发明所扩增得到的猪PRLR基因第10外显子核苷酸序列，片段大小为1251bp，图中阴影部分是内含子序列。方框内所显示的是碱基突变，下划线部分是引物序列。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1：猪PRLR基因片段的获得及SNPs检测

本发明所述的作为分子标记应用的与猪繁殖性状相关的PRLR基因第10外显子核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在序列的260bp、362bp、527bp、540bp、584bp、673bp、745bp、765bp、934bp处存在基因突变。以上SNPs与猪的繁殖性状(总产仔数、活产仔数)有一定相关性，且易于检测，可利用以上位点作为与猪繁殖性状相关的分子辅助标记选择。

从四川省乐山市天人农牧养殖场收集201头不同品系(美系、丹系、加系)大白猪的被毛样品及繁殖生产记录(初产和经产的总产仔数以及活产仔数)，并用试剂盒提取201头大白猪的全基因组DNA。

根据GenBank数据库中公布的PRLR基因核苷酸序列(HM209402.1)，在线比对PRLR基因中10号外显子区域，使用Primer5.0软件对以上三个区域进行特异性引物设计(详见表1)，并以基因组DNA为模板进行PCR扩增反应。反应体系为：2×Taq Master Mix 15μL，DNA1.5μL，上游引物(10μM)1.5μL，下游引物(10μM)1.5μL，ddH₂O 10.5μL。反应程序：94℃预变性1.5min；94℃变性20s,50-60℃退火20s，72℃延伸1Kb/60s,循环30次；最后72℃再延伸5min。4℃保存扩增产物。

表1 PRLR基因引物信息表

每管PCR产物中取4μL进行琼脂糖凝胶电泳，照胶后将含有单一条带的PCR产物送至成都擎科生物公司进行测序。测序结果利用BioEdit软件分别进行比对分析，找到目的片段中存在的突变位点，并记录每个个体中存在的相应位点(C260G、C362T、C527G、A540G、A584G、A673T、A745G、C765T、A934G)的突变类型(突变位点对应测序图如图1-9所示)。PRLR基因10号外显子核苷酸序列、对应引物及突变位点等信息分别如图11所示。

被检测的201头大白猪中，PRLR基因9个突变位点基因及基因型频率见表2。

表2 PRLR基因中9个SNPs位点的基因型频率与等位基因频率

由表2可知，PRLR基因的9个突变位点在201头大白猪中分别表现为三种基因型。其中C260G位点及C527G位点在各品系大白猪中的基因型频率均相同，且这两个位点在丹系大白猪中都只表现为CC基因型，在美系及加系大白中则表现为CC>CG>GG的趋势；C362T位点的基因型频率在三种品系大白猪中均表现为CT>TT>CC的趋势；A540G位点在丹系大白猪中仅表现为一种基因型即AA型，在美系及加系大白中表现为两种基因型且AA>AG；A584G位点在丹系及加系大白中表现为AG>AA>GG的趋势，在美系大白中表现为AA>AG>GG；A673T位点在美系及丹系大白中表现为AA>AT>TT，在加系大白中表现为AT>AA>TT；A745G位点在丹系及加系大白中表现为两种基因型且GG>AG，在美系大白中表现为GG>AG>AA；C765T位点的CC、CT、TT基因型频率分别与A934G位点的AA、AG、GG基因型频率，且在美系及加系大白中以CT及AG基因型频率最高，两个位点在丹系大白中均只有两种基因型，且CC>CT/AA>AG。

实施例2：分子标记在大白猪繁殖性状的应用

为建立ESR基因与大白猪繁殖性状间的关系，选取201头在产大白猪(四川乐山天人牧业)作为实验材料，采集201头大白猪生产繁殖记录，并采用实施例1中提到的SNPs检测方式对实验群体进行检测。采用SAS8.0软件中的GLM模型对每头大白猪的PRLR基因中存在的9个SNPs位点及其繁殖性状进行关联性分析，结果均以LSM±标准误表示。

对PRLR基因中存在SNPs位点及繁殖性状(初产和经产的总产仔数和活产仔数)进行关联分析，采用模型为：Y_ij＝μ+G_i+P_j+e_ij，其中Y_ij为繁殖性状记录值，μ为群体均值，G_i为基因型效应，P_j为胎次效应，e_ij为随机残差效应。

表3 PRLR基因不同位点基因型对繁殖性状的影响

由表3可知，在201只大白猪群体中，PRLR基因10号外显子中的C362T位点处，CC基因型在美系个体中的初产活产仔数显著高于TT基因型(p<0.05)，CT基因型在丹系个体中的初产活产仔数显著高于TT基因型(p<0.05)；在A584G位点处，AG基因型在丹系个体中的初产活产仔数显著高于AA基因型(p<0.05)；在C765T位点处，CC基因型在加系个体中的初产总产仔数显著高于CT基因型和TT基因型(p<0.05)；在A934G位点处，AA基因型在加系个体中的初产总产仔数显著高于AG基因型和GG基因型(p<0.05)；在其他性状间差异性不显著(P>0.05)。

实施例3：单倍型分析

对从201个大白猪个体中检测出来的PRLR基因10号外显子中的9个SNP进行单倍型分析，得出以下结果：

表4 PRLR基因10号外显子单倍型类型及频率

由表4可知，检测到的9个突变位点构成了7种单倍型，其中频率最高的三个单倍型为H1、H2以及H3，分别为0.417、0.228以及0.195。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 基于PRLR基因的与大白猪的繁殖性状相关的分子标记及应用

<130> 2019

<141> 2019-04-26

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> 催乳素受体基因(Prolactin receptor gene，PRLR)

<400> 1

taagtagtgg gatgttagga agccgacagc tgtcttgcct tgtgtcttta acagaaaggc 60

aagtccgaag agcttctgag cgccctggga tgccaagact tcccccccac ttccgactgc 120

gaggacctgc tggtggagtt cctggaggtg gatgacagcg aggaccagca gctgatgcca 180

gcccactcca aggaacaccc gagccaaggc cggaagccca cacacctgga tcccgacagc 240

gattccggcc ggggcagctg tgacagccct tcccttttgt ccgaaaagtg cgatgaaccg 300

cgggccaatc cccccaagtt tcacactccc gagggcatcg agaagccagg ggatcctgaa 360

acaaaccttc cccgtcccca ggaccctcag agcacaagcg tggaaagcaa gctgccctat 420

tttcacgcgg atggatccaa gtcttcgact tggcctttgc cgcagccccc gatcctgcac 480

gatccgggat cttcttacca caaccttgcc gacgtgggtc agctggtcct gggcaccgca 540

ggggccaccg ccgctttgct ggaaaaaacg gaccgacatg ctttcaaccc tccgaaaacc 600

accgagactg gcggggaagg aagggcaacc gagcagaagg agtcggagag cttccactcc 660

aagactgacc aaggcacagt gtggctgctg ccccaggaca aggggccctt tgtctcccct 720

aagcccatgg agtacgtgga gatacacaag gtcagcaaag atggagcact ggcgttgctc 780

ccaaaacagc aggagaacgg cgaccggccg gagaaggctg gcgcccctga aaccagcaag 840

gaatacgccc aggtgtcccg ggtgatggat aaccacatcc tggtgttagt gcaggatccg 900

cgagctcgaa acgtggctcc gtttgaagaa ccaaccaagg agaccccgcc atcccggccg 960

cagaatccag ctgcgaaaga cctggccggc ttcaccacgg ccccgggcca ctgcagacac 1020

ccgctgggtg ggctggatta cctcgatccc gcaggcttta tgcactcctt tcagtgagag 1080

cttggttcat gggatgatgg gttacaaggt ggggtttttt tcaggtcgca ctacgtgaaa 1140

tgcactctac cagagaaagc tcgaaaatgg ggttagaatg acactaccca aactcacagt 1200

tcactcctct tcatgctcca ttttcaacca gttgcctctt tctccacaac a 1251

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

taagtagtgg gatgttagga a 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tgttgtggag aaagaggc 18

Claims (7)

1.一种基于PRLR基因鉴定大白猪繁殖性状的分子标记，其特征在于，所述的分子标记位于猪PRLR基因第10号外显子上，即在260、362、527、540、584、673、745、765、934bp处，记为g.260C>G、g.362C>T、g.527C>G、g.540A>G、g.584A>G、g.673A>T、g.745A>G、g.765C>T和g.934A>G。

2.用于检测权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，包括PRLR-E10-F和PRLR-E10-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

3.含有权利要求2所述引物对的试剂或试剂盒。

4.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括：以大白猪基因组DNA为模板利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增获得PCR产物；对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：2×Taq Master Mix15μL，DNA 1.5μL，10μM上游引物1.5μL，10μM下游引物1.5μL，ddH₂O 10.5μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应程序：94℃预变性1.5min；94℃变性20s，50-60℃退火20s，72℃延伸1Kb/60s，循环30次；最后72℃再延伸5min，4℃保存。

7.权利要求1所述的分子标记在猪种选育中的应用。