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CN100519754C - 编码冠状病毒样颗粒之表达载体 - Google Patents

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CN100519754C CNB2004800444149A CN200480044414A CN100519754C CN 100519754 C CN100519754 C CN 100519754C CN B2004800444149 A CNB2004800444149 A CN B2004800444149A CN 200480044414 A CN200480044414 A CN 200480044414A CN 100519754 C CN100519754 C CN 100519754C
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Abstract

本发明提供了一种编码冠状病毒样颗粒的表达载体，其包括两个独立的转录单元，第一转录单元包括编码冠状病毒膜蛋白M和包膜蛋白E蛋白的基因，第二转录单元包括编码冠状病毒刺突蛋白羧基端区域(CarboxylTerminal Region of Spike Protein)的基因(以下说明书简称为SpikeCT基因)。所述表达载体可用于克隆I型病毒膜融合机制病毒的蛋白基因，并用作DNA疫苗候选物。

Description

编码冠状病毒样颗粒之表达载体
技术领域
本发明涉及重组DNA技术之领域，更具体地说，涉及DNA疫苗之领域。特别是，本发明涉及一种新颖之编码冠状病毒样颗粒之表达载体，该载体用于克隆第I类病毒融合蛋白基因及作为DNA疫苗候选物。
背景技术
疫苗接种在过去三十年期间在病毒性疾病的控制上扮演着重要的角色。疫苗接种基于简单的免疫原理：曾经暴露于一种感染物质后，动物会发动保护对抗该相同物质感染的免疫性防御。疫苗接种的目标是诱发动物在感染之前发动防御。传统上，这是通过利用活的减毒或死的病毒型式作为免疫原而达到的。在过去这些方式的成功已部份达到，因为与生俱来的抗原及减毒病毒的能力，可引发自然感染，引起全面性之免疫反应。然而，传统疫苗方法总有许多潜在的限制。减毒病毒株可能产生突变而变成更具致命性或无免疫原性；不适当的失活化疫苗可能引起原本欲预防的疾病。
重组DNA技术提供了去除传统疫苗限制的潜能，该技术通过基于利用限定抗原而非完整的感染物质作为抗原，使得疫苗的发展变成可行。其中包括胜肽疫苗，由化学合成具免疫反应性之抗原决定部位所构成；亚单元疫苗，由在重组异源细胞中表达病毒蛋白质而制得；及利用活的病毒载体以展现一个或多个限定抗原。而胜肽疫苗及亚单元疫苗皆具有许多潜在的限制，主要的问题在于确保经由模仿天然环境中的抗原所得的工程化蛋白质之构形，具有困难度。而适当的佐剂及载体蛋白质在为胜肽的情况下，一定会激发免疫反应。此外，这些疫苗会诱发主要的体液反应，因此在诱发有效的免疫性上可能会失败。
已有许多不同的方法开发将新的遗传物信息导入目标细胞中。目前，将DNA导入至目标细胞中最有效率的方法，是使用经改良的病毒，即所谓的重组病毒载体。最常用的病毒载体系统以反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或腺相关病毒为基础。所有的系统均具有其特别的优点及缺点。一些载体系统拥有容量可整合其DNA至宿主细胞基因体中，其它者则无。一些载体系统上的病毒基因可完全地自载体上移除，然而其它的系统则尚不可行。一些载体系统具有非常好的活体内传递特性，然而其它则无。一些载体种类非常易于大量制备，而其它则非常难于制备。
冠状病毒在其外套膜上带有三或四种蛋白质。M蛋白为最丰富的成份；小型的E蛋白为最少但为基本的病毒蛋白。S蛋白在致病机制上的重要性，与其在病毒入侵及散播二者之生物功能一致(Collins，A.R.，et al.，1982，Virology 119：358-371；Williams，R.K.，et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5533-5536)。当表达在病毒体外膜时，S蛋白结合在细胞受体并在病毒入侵时诱发病毒及细胞膜的融合。在感染后，表达在受感染细胞的胞浆膜之S蛋白可诱发细胞-细胞融合。S蛋白亦扮演在对病毒感染的免疫反应之角色，作为抗体中和之目标(Collins，A.R.，et al.，1982，Virology119∶358-371)及作为细胞性免疫之诱发物(Bergmann，C.C.，et al.，1996，J.Gen.Virol.77：315-325；Castro，R.F.，and S.Perlman，1995，J.Virol.69∶8127-8131)。M及E蛋白是病毒组装之最小蛋白单元(Baudoux，P，et al.，1998，J.Virol.72：8636-8643；Bos，E.C.，1996，Virology 218：52-60；de Haan，C.A.M.，et al.，1998，J.Virol.72：6838-6850；Godeke，G.-J.，et al.，2000，J.Virol.74：1566-1571；Vennema，H.，et al.，1996，EMBO J.15：2020-2028)。两者均为贯穿性膜蛋白。M及E蛋白之共同表达足以引发病毒样颗粒(VLP)的形成。当S蛋白质与M及E蛋白共同表达时，S蛋白会以推测可信的构形嵌入VLP，此已从老鼠肝炎病毒(MHV)(Bos，E.C.，1996，Virology218：52-60；de Haan，C.A.M.，et al.，1998，J.Virol.72：6838-6850；Vennema，H.，et al.，1996，EMBO J.15：2020-2028)，可传染的肠胃炎病毒(Baudoux，P.，et al.，1998，J.Virol.72：8636-8643)及猫的传染性腹膜炎病毒(Godeke，G.-J.，et al.，2000，J.Virol.74：1566-1571)得到证实。有一假设为冠状病毒膜基本上由侧边与M蛋白交互反应之浓密基质所组成，某些情况下其需要E蛋白才能发芽，若可以的话，通过与M的羰基端及刺突蛋白穿膜区之特定交互反应，将S及HE醣蛋白嵌入于其中(de Haan，C.A.M.，1999，J.Virol.73：7441-7452；Nguyen，V.-P，and B.G.Hogue.1997，J.Virol.71：9278-9284；Opstelten，D.-J.E.，et al.，1995，J.Cell Biol.131：339-349；Vennema，H.，et al.，1996，EMBO J.15：2020-2028)。此种含刺突蛋白的VLP可感染细胞，其与真实病毒具有相同的感染性(Bos，E.C.，1996，Virology 218：52-60)。然而，尚无有效的DNA载体可发展作为DNA疫苗。
因此，亟需要发展有效的编码病毒样颗粒DNA载体，其可在VLPs表面呈现功能性病毒融合蛋白，且此等VLPs将可成为抗病毒感染疾病之潜在疫苗之优异的候选物。
发明内容
编码能自行组装成有缺陷且无法自行复制之病毒颗粒之病毒胜肽的基因，可自DNA病毒之染色体DNA或RAN病毒之cDNA得到，或从含有此等基因之次染色体克隆株得到。此等基因包括编码病毒壳蛋白(即包括病毒蛋白外壳之蛋白质)之基因，及若为外膜封包的病毒(如反转录病毒)，则为编码病毒外膜醣蛋白之基因。此等病毒样颗粒可经分离且作为免疫原，用以对抗致病性病毒之疫苗接种，或用于医疗目的，例如在经感染的个体内增强其免疫反应，或将医疗物质(如细胞毒性药物)有目标地传递至特定的细胞形式。
本发明提供一种用于克隆第I类病毒融合蛋白基因及作为DNA疫苗候选物之表达载体，该表达载体包括：
i)一个第一转录单元，包括冠状病毒之膜蛋白基因(M蛋白基因)，冠状病毒之外膜蛋白基因(E蛋白基因)，及内部核糖体进入(IRES)序列，其中该IRES插入至膜蛋白基因及外膜蛋白基因的接合处；
ii)一个第一真核启动子，可操作地连结至膜蛋白基因，其中该第一启动子位于M蛋白基因之上游且驱动第一转录单元之表达；
iii)一个第二转录单元，包括冠状病毒之SpikeCT基因及用于第I类病毒融合蛋白基因之克隆或框内插入之多重克隆位点(MCS)，其中该MCS位于SpikeCT基因之起始处且具有限制酶剪切位点；及
iv)一个第二真核启动子，可操作地连结至SpikeCT基因，其中该第二启动子位于SpikeCT基因之上游且驱动第二转录单元之表达；
其中该第一真核启动子之转录活性比第二真核启动子为强。
根据本发明，该表达载体包括一个第一转录单元，其包括冠状病毒之膜蛋白基因(M蛋白基因)，冠状病毒之外膜蛋白基因(E蛋白基因)，及内部核糖体进入(IRES)序列，其中该IRES插入至膜蛋白基因及外膜蛋白基因的接合处。
根据本发明，该外膜蛋白基因编码冠状病毒之外膜蛋白(E蛋白)。E蛋白为小型的外膜相关蛋白。E蛋白为最少但为基本的病毒成份。在细胞中，其累积并诱发媒介物间隔(IC)的膜之接合，产生典型的结构。蛋白的一部份在未知特性的膜结构之细胞外显现。较佳地，本发明之冠状病毒为猪、人类或鸟类冠状病毒。更佳地，该冠状病毒为猪TGEV冠状病毒、人类229E冠状病毒或人类SARS病毒。更佳地，本发明之E蛋白基因具有如SEQ ID NO：1所述之序列。
SARS E基因之编码序列(SEQ ID NO：1)
ATGGCATACT CTTTTGTGTC TGAGGAAACT GGCACTCTGA
TCGTGAACTC TGTACTGCTG
TTTCTCGCTT TTGTGGTATT CCTGCTGGTC ACTCTCGCTA
TCCTCACTGC TCTTCGTCTG
TGTGCCTACT GTTGTAATAT CGTGAACGTG TCTCTGGTTA
AGCCTACTGT GTATGTGTAT
TCTCGTGTGA AAAATCTCAA TTCTTCTGAA GGAGTTCCCG
ATCTGCTGGT CTAG
根据本发明，该膜蛋白基因编码冠状病毒之膜蛋白(M蛋白)。M蛋白为最丰富的成份；其为一种第III型醣蛋白，由短胺基端外区(ectodomain)，三个连续的穿膜区，及一病毒内(或细胞质内)的长羰端区所构成。较佳地，本发明之冠状病毒为猪、人类或鸟类冠状病毒。更佳地，该冠状病毒为猪TGEV冠状病毒、人类229E冠状病毒或人类SARS病毒。更佳地，本发明之M蛋白基因具有如SEQ ID NO：2所述之序列。
SARS M基因之编码序列(SEQ ID NO：2)
ATGGCAGATA ACGGCACTAT TACTGTGGAG GAACTGAAAC
AACTGCTGGA ACAATGGAAC
CTCGTAATCG GCTTTCTCTT TCTGGCTTGG ATTATGTTGT
TACAGTTTGC GTATTCTAAT
CGTAACCGTT TCCTCTACAT TATTAAGCTC GTTTTCCTGT
GGTTGTTGTG GCCTGTAACT
CTTGCTTGCT TTGTGCTTGC TGCTGTCTAT CGTATCAACT
GGGTTACTGG TGGTATTGCT
ATCGCTATGG CTTGTATTGT AGGCTTGATG TGGCTGTCTT
ATTTCGTTGC TTCTTTCCGT
CTGTTTGCTC GTACTCGCTC TATGTGGTCC TTTAATCCTG
AGACTAATAT CCTGCTGAAT
GTTCCGCTCC GTGGTACTAT CGTTACTAGA CCGCTGATGG
AATCTGAACT GGTTATTGGT
GCCGTCATTA TCCGTGGTCA TTTGCGTATG GCTGGTCACT
CTCTGGGTCG TTGCGATATT
AAGGATCTGC CAAAGGAAAT CACTGTAGCC ACTTCTCGTA
CTCTGTCTTA CTATAAACTC
GGTGCATCGC AACGTGTGGG AACTGATTCG GGCTTCGCTG
CGTATAATCG TTATCGTATT
GGCAACT ATA AACT GAACACCGACCACGCA GGCTCTAATG
ACAACATCGC TCTCCTCGTT
CAGTGA
根据本发明，组装冠状病毒外膜仅需要M蛋白及E蛋白(Cornelis A.M.de Haan et al.，Journal of Virology，June 2000，p.4967-4978)。编码此等蛋白质之基因在细胞内之表达，可导致大小及形状与真实病毒颗粒类似之病毒样颗粒(VLPs)之形成及释出。
根据本发明，该第一转录单元包括内部核糖体进入(IRES)序列，其插入至M基因及E基因的接合处。IRES可使两种或多种蛋白质自二-或多顺反子(di-or polycistronic)mRNA进行转译。IRES单元融合至一个或多个额外编码序列之5’端，然后在起始编码序列的末端插入至载体上，因而该编码序列被IRES所隔开。根据本发明，任何IRES衍生物亦可用于本发明之质体构建体中。该IRES序列可使核糖体设备，在转录子内自第二位点发起转译。
根据本发明，该表达载体包括一个第一真核启动子，可操作地连结至膜蛋白基因，其中该第一启动子位于M蛋白基因之上游且驱动第一转录单元之表达。较佳地，该第一真核启动子衍生自病毒之启动子，如CMV、SV40、RSV、HIV-1、LTR，及杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子，及肌肉特异肌间线蛋白、肌酸激酶、β肌动蛋白启动子及其它泛素表达启动子，如EF1α及泛素(ubiquitin)启动子。最佳地，该第一真核启动子为pCMV、杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子及β肌动蛋白启动子。
根据本发明，该第二转录单元包括冠状病毒之SpikeCT基因及具有限制酶剪切位点之多重克隆位点(MCS)，其中该MCS位于SpikeCT基因之起始处。该SpikeCT基因与M蛋白反应区交互反应，其编码与冠状病毒刺突蛋白之穿膜片段并列之富含芳族残基区域之上游之C端七个重复单元。该多重克隆位点具有数个限制酶剪切位点。该限制酶剪切位点包括但不限于Sma I、BsaB I、EcoR V及BspE I。MCS位于SpikeCT基因之起始处，且可用于第I类病毒融合蛋白基因之克隆或框内插入。第I类病毒融合蛋白基因包括但不限于HIV的gp160、流感病毒的HA及SARS病毒的Spike。第I类病毒融合蛋白基因衍生自适合第I类病毒融合机制之病毒，包括冠状病毒、HIV及流感病毒之病毒，用以插入或克隆本发明之克隆/表达载体，并作为DNA疫苗候选物。较佳地，该SpikeCT基因具有如SEQID NO：3所述之序列。
SpikeCT基因之编码序列(SEQ ID NO：3)
GATATCTCCGGA ATCAATGCGA GCGTAGTGAA CATCCAGAAA
GAGATTGACC GTTTGAATGA AGTTGCTAAA AATCTGAATG
AACCTCTGAT TGACCTCCAA
GAACTCGGCA AATATGAGCA ATACATTAAA TGGCCTTGGT
ATGTCTGGTT GGGTTTCATC
GCAGGTCTCA TCGCTATCGT TATGGTGACT ATTCTGCTGT
GTTGTATGAC TTCTTGTTGC
TCTTGTCTGA AAGGTGCGTG TTCTTGTGGT TCTTGTTGTA
AGTTTGATGA GGATGATTCT
GAGCCAGTTC TGAAGGGTGT GAAGCTGCAT TATACCTAGT TCGAA
根据本发明，该表达载体可产生病毒样颗粒及表达在病毒样颗粒之表面表达第I类病毒之功能性融合基因。因此，在SpikeCT基因的起始处有数个限制酶剪切位点(多重克隆位点，MCS)，包括但不限于SmaI、BsaB I、EcoR V及BspE I，这些位点之至少一者可用于插入或克隆第I类病毒融合蛋白基因至本发明之克隆/表达载体，并作DNA疫苗候选物。适合第I类病毒融合机制之病毒包括但不限于冠状病毒，HIV及流感病毒等等。
根据本发明，该第二真核启动子，位于SpikeCT基因之上游且驱动第二转录单元之表达。较佳地，该第二真核启动子衍生自病毒之启动子，如CMV、SV40、RSV、HIV-1、LTR，及杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子，及肌肉特异肌间线蛋白、肌酸激酶、β肌动蛋白启动子及其它泛素表达启动子，如EF1α及泛素(ubiquitin)启动子。最佳地，该第一真核启动子为pCMV、SV40、β肌动蛋白及EF1α启动子。
根据本发明，该转录单元包括polyA信号。发明所属技术领域的普通专业人员可认知任何转录单元皆具有polyA信号。较佳地，该转录单元包括BGHpolyA信号。
根据本发明，该表达载体进一步包括在宿主细胞中质体DNA复制始点。复制始点的决定视宿主细胞的种类而定。
根据本发明，该表达载体进一步包括作为选择性标志之抗抗生素基因。
根据本发明，该表达载体可自动地形成病毒样颗粒。该病毒样颗粒可作为抗病毒感染之疫苗候选物。由于病毒样颗粒缺乏病毒的遗传原料，因此此种颗粒不具有感染力。本发明之表达载体可投予至动物并转染宿主细胞而产生病毒样颗粒。
大部份的病毒由仅与结构限定之少数蛋白质所构成。事实上，利用这些少数蛋白质，病毒被强迫产生似结晶的高重复表面。此种高重复抗原有效地交联B细胞受体，此方式在B细胞中产生强烈的活化信号。相反地，自体抗原通常并未高度地组织，特别是对B细胞之抗原。因此，B细胞利用抗原组织作为非自我感染之标志。以病毒样颗粒(VLPs)为基底的疫苗，利用此种基本现象，乃是由于VLPs具有如病毒重复且组织化之表面。结果，与病毒类似地，VLPs在缺乏佐剂的情况下，能激发强烈的B细胞反应。基于上述原则，通过本发明之表达载体所表达之病毒样颗粒，可作为抗病毒之疫苗候选物。
附图说明
图1是本发明之表达载体之一较佳实际形态之质体图谱。
具体实施方式
由PCR合成E基因
利用聚合酶链锁反应(PCR)合成SARS病毒之E基因。SARS E基因之PCR模板(0.1微微摩尔)为下列引物之混合物，且PCR反应使用如Innis etal.(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，AcademicPress)中所述之标准PCR方法及使用KOD Taq聚合酶(Novagene.com)进行。PCR引物如下所示：
E1L
5′-ACC ATG GCA TAC TCT TTT GTG TCT GAG GAA ACT G-3′*(SEQ
ID NO：4)
E2L
5′-ACA GCA GTA CAG AGT TCA CGA TCA GAG TGC CAG TTT CCT
CAG ACA CAA AAG-3′(SEQ ID NO：5)
E3L
5′-TGA CCA GCA GGA ATA CCA CAA AAG CGA GAA ACA GCA GTA
CAG AGT TCA CGA-3′(SEQ ID NO：6)
E4L
5′-GCA CAC AGA CGA AGA GCA GTG AGG ATA GCG AGA GTG ACC
AGC AGG AAT ACC ACA-3′(SEQ ID NO：7)
E5L
5′-ACC AGA GAC ACG TTC ACG ATA TTA CAA CAG TAG GCA CAC
AGA CGAAGA GCA G-3′(SEQ ID NO：8)
E6L
5′-GAT TTT TCA CAC GAG AAT ACA CAT ACA CAG TAG GCT TAA
CCA GAG ACA CGT TCA CGAT-3′(SEQ ID NO：9)
E7L
5′-TCT AGA CCA GCA GAT CGG GAA CTC CTT CAG AAG AAT TGA
GAT TTT TCA CAC GAG AAT ACA CA-3′(SEQ ID NO：10)
E8L
5′-TCT AGA CCA GCA GAT CGG GA-3′(SEQ ID NO：11)
DNA模板最初在95℃下变性3分钟。PCR反应条件如下所列：
进行三步骤十次循环之第一PCR反应
1.退火：58℃下20秒
2.延伸：72℃下40秒
3.变性：95℃下1分钟
进行三步骤二十次循环之第二PCR反应
1.变性：95℃下1分钟
2.退火：62℃下20秒
3.延伸：72℃下40秒
所得的双股全长E基因产物在1.2％琼脂糖凝胶上分析，并以QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化，随后以pGEM-T载体(Promega Co.)接合，得到pGEM(T)/EA+克隆物。E基因之序列如SEQ ID NO：1所述。由接合PCR合成M基因
SARS病毒M基因之合成类似上述的PCR方法，而PCR模板(0.1微微摩尔)为下列引物之混合物，并使用KOD Taq聚合酶(Novagene.com)。PCR引物如下所示：
M1-1U
5′-TGA TCA TGG CAG ATAACG GCA C-3′(SEQ ID NO：12)
M1U
5′-TGA TCA TGG CAG ATA ACG GCA CTA TTA CTG TGG
    AGG A-3′(SEQ ID NO：13)
M1L
5′-GTT CCA TTG TTC CAG CAG TTG TTT CAG TTC CTC
    CAC AGT AAT AGT GCC G-3′(SEQ ID NO：14)
M2L
5′-AAG CCA GAA AGA GAA AGC CGA TTA CGA GGT TCC
    ATT GTT CCA GCA GTT G-3′(SEQ ID NO：15)
M3L
5′-AGA ATA CGC AAA CTG TAA CAA CAT AAT CCA AGC
    CAG AAA GAG AAA GCC GA-3′(SEQ ID NO：16)
M4L
5′-CGA GCT TAA TAA TGT AGA GGA AAC GGT TAC GAT
    TAG AAT ACG CAAACT GTAACAACA-3′(SEQ ID NO：17)
M5L
5′-CAA GAG TTA CAG GCC ACA ACA ACC ACA GGA AAA
    CGA GCT TAATAATGTAGA GGAAA-3′(SEQ ID NO：18)
M6L
5′-TTG ATA CGA TAG ACA GCA GCA AGC ACA AAG CAA
    GCA AGA GTT ACA GGC CAC AAC A-3′(SEQ ID NO：19)
M7L
5′-CAA GCC ATA GCG ATA GCA ATA CCA CCA GTA ACC
    CAG TTG ATA CGA TAG ACA GCA GCA A-3′(SEQ ID NO：20)
M8L
5′-AAC GAA ATA AGA CAG CCA CAT CAA GCC TAC AAT
    ACA AGC CAT AGC GAT AGC AAT AC-3′(SEQ ID NO：21)
M9L
5′-ACA TAG AGC GAG TAC GAG CAA ACA GAC GGA AAG
    AAG CAA CGA AAT AAG ACA GCC ACA TC-3′(SEQ ID NO：22)
M10U
5′-TCC TGC TGA ATG TTC CGC TC-3′(SEQ ID NO：23)
M10L
5′-GAG CGG AAC ATT CAG CAG GAT ATT AGT CTC AGG
    ATT AAA GGA CCA CAT AGA GCG AGT ACG AGC AA-3′(SEQ IDNO：24)
M11L
5′-CAT CAG CGG TCT AGT AAC GAT AGT ACC ACG GAG
CGG AAC ATT CAG CAG GA-3′(SEQ ID NO：25)
M12L
5′-ACC ACG GAT AAT GAC GGC ACC AAT AAC CAG TTC
    AGA TTC CAT CAG CGG TCT AGT AAC GAT-3′(SEQ ID NO：26)
M13L
5′-ATA CGC AAA TGA CCA CGG ATA ATG ACG GCA C-3′(SEQ ID NO：
27)
M14L
5′-AAC GAC CCA GAG AGT GAC CAG CCA TAC GCA AAT
     GAC CAC GGA TAA-3′(SEQ ID NO：28)
M15L
5′-TAC AGT GAT TTC CTT TGG CAG ATC CTT AAT ATC
     GCA ACG ACC CAG AGA GTG-3′(SEQ ID NO：29)
M16L
5′-CCG AGT TTA TAG TAA GAC AGA GTA CGA GAA GTG
     GCT ACA GTG ATT TCC TTT GGC AGA-3′(SEQ ID NO：30)
M17L
5′-CGA AGC CCG AAT CAG TTC CCA CAC GTT GCG ATG
     CAC CGA GTT TAT AGT AAG ACA GAGT-3′(SEQ ID NO：31)
M18L
5′-CAG TTT ATA GTT GCC AAT ACG ATAACG ATT ATA
     CGC AGC GAA GCC CGA ATC AGT TCC C-3′(SEQ ID NO：32)
M19L5′-GAG AGC GAT GTT GTC ATT AGA GCC TGC GTG GTC
   GGT GTT CAG TTT ATA GTT GCC AAT ACG AT-3′(SEQ ID NO：33)
M20L
5′-TCA CTG AAC GAG GAG AGC GAT GTT GTC ATT AGA
     G-3′(SEQ ID NO：34)
PCR条件基本上如前所述。所得的双股全长M基因产物在1.0％琼脂糖凝胶上分析，并以QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化，随后以pGEM-T载体(Promega Co.)接合，得到pGEM(T)/M克隆物。M基因之序列如SEQ ID NO：2所述。
编码SARS病毒刺突蛋白基因之七个区域2及穿膜片段之SpikeCT基因，亦使用PCR合成。
PCR方法及条件，及PCR产物的纯化及克隆如上所述。SpikeCT基因的DNA模板(0.1微微摩尔)为下列引物之混合物。PCR引物如下所示：
SpikeCTup-EcoRV
5’-GATATC TCC GGAATC AAT GCG AGC GT-3′(SEQ ID NO：35)
DI-1U/BspE I
5′-5′-TCC GGA ATC AAT GCG AGC GTA GTG AAC ATC CAG
AA-3′(SEQ ID NO：36)
DI-1L
5′-GCA ACT TCA TTC AAA CGG TCA ATC TCT TTC TGG ATG TTC
     ACT ACG CTC-3′(SEQ ID NO：37)
DI-2L
5′-ATC AGA GAT TCA TTC AGA TTT TTA GCA ACT TCA TTC AAA
    CGG TCA-3′(SEQ ID NO：38)
DI-3L
5′-TCA TAT TTG CCG AGT TCT TGG AGG TCA ATC AGA GAT TCA
     TTC AGA TTT TTA-3′(SEQ ID NO：39)
DI-4L
5′-CAA GGC CAT TTA ATG TAT TGC TCA TAT TTG CCG AGT TCT
     TGG A-3′(SEQ ID NO：40)
DI-5L
5′-ACC TGC GAT GAA ACC CAA CCA GAC ATA CCA AGG CCA TTT
AAT GTA TTG CT-3′(SEQ ID NO：41)
DI-6L
5′-CAG AAT AGT CAC CAT AAC GAT AGC GAT GAG ACC TGC GAT
GAAACC CAA CC-3′(SEQ ID NO：42)
DI-7L
5′-AGA GCA ACA AGA AGT CAT ACA ACA CAG CAG AAT AGT CAC
CAT AAC GAT AG-3′(SEQ ID NO：43)
DI-8L
5′-ACC ACA AGA ACA CGC ACC TTT CAG ACA AGA GCA ACA AGA
AGT CAT ACA AC-3′(SEQ ID NO：44)
DI-9L
5′-GAA TCA TCC TCA TCA AAC TTA CAA CAA GAA CCA CAA GAA
CAC GCA CCT TT-3′(SEQ ID NO：45)
DI-10L
5′-GCT TCA CAC CCT TCA GAA CTG GCT CAG AAT CAT CCT CAT
    CAA ACT TAC A-3′(SEQ ID NO：46)
DI-11L
5′-CCT AGG TAT AAT GCA GCT TCA CAC CCT TCA GAA CT-3′(SEQ IDNO：47)
SpikeCTdn-BstB I
5′-TTC GAACT AGG TAT AAT GCA GCT TCA C-3′(SEQ ID NO：48)
PCR条件如上所述。所得的双股SCT320基因产物以QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化，随后以pGEM-T载体(Promega Co.)克隆，得到pGEM(T)/SpikeCT(EcoRV/BstBI)。pGEM(T)/SpikeCT(EcoRV/BstBI)质体含有编码与冠状病毒刺突蛋白之穿膜片段并列之富含芳族残基区域之上游之C端七个重复单元之基因。SCT320基因之编码序列如SEQ ID NO：3所述。
本发明表达载体之构建
DNA的操作由Russell et al「Molecular cloning third edition」，ColdSpring Harbor Laboratory Express一书中所教导。限制酶、T4DNA接合酶、Klenow酶购自新英格兰Biolab.com，根据制造商的推荐进行。
I.pCMV启动子驱动之SARS M基因质体之构建
使用pGEM(T)/M克隆株作为PCR的DNA模板，并以T7及SP6启动子引物，PCR的条件与上述相同，除了退火温度设定在50℃下20秒。所得的M基因PCR产物以QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化，并以BclI及Not I消化，得到含有SARS M基因之DNA插入物。pEGFP-N1质体(Clontech Co.)以Bgl II及Not I消化后，使用所得的BglII及Not I消化的pEGFP-N1质体作为DNA载体，与Bcl I，Not I消化之SARS M基因DNA插入物接合，得到pN1/M DNA质体。pN1/M DNA质体以Nhe I及Not I消化，得到含有SARS M基因之DNA插入物。pACT质体(PromegaCo.)以Nhe I及NotI消化，将所得的Nhe I及Not I消化的pACT DNA载体，与NheI及Not I消化的SARS M基因DNA插入物接合，得到pACT/MDNA质体。pACT/M DNA质体再以Bgl II及Asp718消化，得到含有CMV启动子及SARS M基因之DNA插入物。pCDNA3.1(+)质体(Invitrogen Co.)以Bgl II及Asp718消化，所得的Bgl II及Asp718消化的pCDNA3.1(+)DNA质体，与Bgl II及Asp 718消化之含CMV启动子及SARS M基因插入物之DNA接合，得到pCDNA3.1+M DNA质体。
II.IRES-SARS E基因质体之构建
pIRES2-EGFP(Clontech Co.)以Xho I及Nco I消化后，得到“IRES”插入物。pGL3basic载体(Promega Co.)以Xho I及Nco I消化。将Xho I及Nco I消化的pGL 3basic DNA载体，与Xho I及Nco I消化的IRES DNA插入物，以T4DNA接合酶接合(NEB Co.)。接合混合物经转形至大肠杆菌DH5α胜任细胞中，得到pGL3B/IRES-荧光酶DNA质体。T/EA+克隆株(含有SARS E基因并在第二丙胺酸插入的突变株)，经Nco I及Xba I消化后，得到SARS E基因DNA插入物。pGL3B/IRES-荧光酶DNA质体以Nco I及Xba I消化。将Nco I及Xba I消化的pGL3B/IRES-荧光酶DNA载体与Nco I及Xba I消化的SARS EA+基因DNA插入物接合，得到pGL3B/IRES-EA+DNA质体。
IIT.pCMV-驱动M+E基因表达质体(冠状病毒样颗粒(CoVLP)表达载体)
pGL3B/IRES-EA+DNA质体以BamH I及Xba I消化，得到含有IRES及SARS EA+基因的DNA插入物。pCDNA3.1+M DNA质体以BamH I及Xba I消化。将所得的BamH I及Xba I消化的pCDNA3.1+M DNA载体，与BamH I及Xba I消化之含有IRES及SARS EA+融合基因之DNA插入物，得到pCDNA3.1+M/IRES-EA+质体。
IV.构建本发明之DNA载体
pGEM(T)/SpikeCT(EcoR V/BstB I)质体，其含有编码与冠状病毒刺突蛋白之穿膜片段并列之富含芳族残基区域之上游之C端七个重复单元之基因，以Spe I消化后，并以Klenow酶及dNTPs填平。在1.2％琼脂糖凝胶上分离后，将DNA片段以QIAquick胶萃取试剂盒(Qiagen Inc.)纯化，并进一步以BstB I消化。使用所得的SpikeCT基因片段作为DNA插入物，并与经BsaB I及BstB I消化、经胶纯化的pCDNA3.1+M/IRES-EA+DNA载体质体接合。在转形至大肠杆菌DH5α细胞后，得到本发明DNA载体，即CoVLP-克隆载体。在SpikeCT基因起始处有数种限制酶剪切位点(多重克隆位点，MCS)，包括SmaI、BsaB I、EcoR V及BspE I，这些位点可用于克隆或框内融合第I类病毒融合蛋白基因与本发明载体中之SpikeCT基因，而所得的DNA质体可作为DNA疫苗候选物。CoVLP-克隆载体之图谱如图1所示。CoVLP-克隆载体之序列如SEQ ID NO：49所述：CoVLP-克隆载体之DNA序列(pCDNA3.1+M+IRES-E+SpikeCT)(SEQ IDNO：49)
GACGGATCGGGAGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCAT
TGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGT
TGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATA
TGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATC
AATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTA
CATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCC
CCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCA
ATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAA
CTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCC
CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCC
CAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT
ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCA
ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCA
CCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGG
GACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGAC
GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAG
AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTA
GTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAAC
AGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAG
AAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGA
CAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGA
AGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCA
CTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCT
CTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCGCTAC
CGGACTCAGATCATGGCAGATAACGGCACTATTACTGTGGAGGAAC
TGAAACAACTGCTGGAACAATGGAACCTCGTAATCGGCTTTCTCTTT
CTGGCTTGGATTATGTTGTTACAGTTTGCGTATTCTAATCGTAACCG
TTTCCTCTACATTATTAAGCTCGTTTTCCTGTGGTTGTTGTGGCCTGT
AACTCTTGCTTGCTTTGTGCTTGCTGCTGTCTATCGTATCAACTGGG
TTACTGGTGGTATTGCTATCGCTATGGCTTGTATTGTAGGCTTGATG
TGGCTGTCTTATTTCGTTGCTTCTTTCCGTCTGTTTGCTCGTACTCGC
TCTATGTGGTCCTTTAATCCTGAGACTAATATCCTGCTGAATGTTCC
GCTCCGTGGTACTATCGTTACTAGACCGCTGATGGAATCTGAACTG
GTTATTGGTGCCGTCATTATCCGTGGTCATTTGCGTATGGCTGGTCA
CTCTCTGGGTCGTTGCGATATTAAGGATCTGCCAAAGGAAATCACT
GTAGCCACTTCTCGTACTCTGTCTTACTATAAACTCGGTGCATCGCA
ACGTGTGGGAACTGATTCGGGCTTCGCTGCGTATAATCGTTATCGTA
TTGGCAACTATAAACTGAACACCGACCACGCAGGCTCTAATGACAA
CATCGCTCTCCTCGTTCAGTGAAATCACTAGTGCGGCCGCAGGTAC
CGAGCTCGGATCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGG
CCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTAT
TTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCT
GGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGC
CAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCT
CTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCA
GGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAA
GCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGC
CACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCT
CAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCC
ATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGT
GTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGG
ACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCA
TGGCATACTCTTTTGTGTCTGAGGAAACTGGCACTCTGATCGTGAAC
TCTGTACTGCTGTTTCTCGCTTTTGTGGTATTCCTGCTGGTCACTCTC
GCTATCCTCACTGCTCTTCGTCTGTGTGCCTACTGTTGTAATATCGT
GAACGTGTCTCTGGTTAAGCCTACTGTGTATGTGTATTCTCGTGTGA
AAAATCTCAATTCTTCTGAAGGAGTTCCCGATCTGCTGGTCTAGAG
GGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGC
CAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGA
AGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCA
TCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGG
GGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATG
CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAG
CTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTA
AGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTG
CCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCG
CCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCT
TTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACT
TGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCT
GATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAAT
AGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGG
TCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGT
TAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTG
TGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAG
CAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAG
GTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAG
CATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGC
CCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCAT
GGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGC
CTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTA
GGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATC
TGATCAAGAGACAGGATGACTAGTGATTGATATCTCCGGAATCAAT
GCGAGCGTAGTGAACATCCAGAAAGAGATTGACCGTTTGAATGAA
GTTGCTAAAAATCTGAATGAACCTCTGATTGACCTCCAAGAACTCG
GCAAATATGAGCAATACATTAAATGGCCTTGGTATGTCTGGTTGGG
TTTCATCGCAGGTCTCATCGCTATCGTTATGGTGACTATTCTGCTGT
GTTGTATGACTTCTTGTTGCTCTTGTCTGAAAGGTGCGTGTTCTTGT
GGTTCTTGTTGTAAGTTTGATGAGGATGATTCTGAGCCAGTTCTGAA
GGGTGTGAAGCTGCATTATACCTAGTTCGAAATGACCGACCAAGCG
ACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTA
TGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATG
ATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCA
ACTTGTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATC
ACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG
TTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGA
CCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTG
TGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAA
GCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCAC
ATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGT
CGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCG
GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTG
CGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGG
CGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGA
ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA
SEQUENCELISTING
<110>DNASHUTTLE Biopharm Co.，Ltd.
<120>AN EXPRESSION VECTORENCODING CORONAVIRUS-LIKE PARTICLE
<130>NONE
<140>US10/855,490
<141>2004-05-28
<160>49
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>234
<212>DNA
<213>SARS Egene
<400>1
Figure C200480044414D00241
<210>2
<211>666
<212>DNA
<213>SARS M gene
<400>2
Figure C200480044414D00242
Figure C200480044414D00251
<210>3
<211>327
<212>DNA
<213>SpikeCTgene
<400>3
Figure C200480044414D00252
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>E1Lprimer
<400>4
Figure C200480044414D00253
<210>5
<211>51
<212>DNA
<213>E2L primer
<400>5
Figure C200480044414D00261
<210>6
<211>51
<212>DNA
<213>E3L primer
<400>6
Figure C200480044414D00262
<210>7
<211>54
<212>DNA
<213>E4L primer
<400>7
Figure C200480044414D00263
<210>8
<211>52
<212>DNA
<213>E5Lprimer
<400>8
<210>9
<211>58
<212>DNA
<213>E6L primer
<400>9
Figure C200480044414D00265
<210>10
<211>62
<212>DNA
<213>E7L primer
<400>10
Figure C200480044414D00271
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>E8Lprimer
<400>11
Figure C200480044414D00272
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>M1-1U primer
<400>12
Figure C200480044414D00273
<210>13
<211>37
<212>DNA
<213>M1U primer
<400>13
Figure C200480044414D00274
<210>14
<211>49
<212>DNA
<213>M1L primer
<400>14
Figure C200480044414D00281
<210>15
<211>49
<212>DNA
<213>M2L primer
<400>15
<210>16
<211>50
<212>DNA
<213>M3L primer
<400>16
Figure C200480044414D00283
<210>17
<211>57
<212>DNA
<213>M4L primer
<400>17
Figure C200480044414D00284
<210>18
<211>56
<212>DNA
<213>M5L primer
<400>18
Figure C200480044414D00285
<210>19
<211>55
<212>DNA
<213>M6L primer
<400>19
Figure C200480044414D00291
<210>20
<211>58
<212>DNA
<213>M7L primer
<400>20
<210>21
<211>56
<212>DNA
<213>M8L primer
<400>21
Figure C200480044414D00293
<210>22
<211>59
<212>DNA
<213>M9Lprimer
<400>22
Figure C200480044414D00294
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>M10U primer
<400>23
Figure C200480044414D00295
<210>24
<211>65
<212>DNA
<213>M10L primer
<400>24
Figure C200480044414D00301
<210>25
<211>50
<212>DNA
<213>M11L primer
<400>25
<210>26
<211>60
<212>DNA
<213>M12L prirmer
<400>26
Figure C200480044414D00303
<210>27
<211>31
<212>DNA
<213>M13L primer
<400>27
Figure C200480044414D00304
<210>28
<211>45
<212>DNA
<213>M14Lprimer
<400>28
Figure C200480044414D00305
<210>29
<211>51
<212>DNA
<213>M15L primer
<400>29
<210>30
<211>57
<212>DNA
<213>M16L prirmer
<400>30
Figure C200480044414D00312
<210>31
<211>58
<212>DNA
<213>M17L primer
<400>31
Figure C200480044414D00313
<210>32
<211>58
<212>DNA
<213>M18Lprimer
<400>32
Figure C200480044414D00314
<210>33
<211>62
<212>DNA
<213>M19L primer
<400>33
Figure C200480044414D00315
Figure C200480044414D00321
<210>34
<211>34
<212>DNA
<213>M20L primer
<400>34
Figure C200480044414D00322
<210>35
<211>26
<212>DNA
<213>SpikeCTup-EcoRV primer
<400>35
<210>36
<211>35
<212>DNA
<213>D1-1U/BspEI primer
<400>36
Figure C200480044414D00324
<210>37
<211>48
<212>DNA
<213>DI-1L primer
<400>37
Figure C200480044414D00325
<210>38
<211>45
<212>DNA
<213>DI-2L primer
<400>38
Figure C200480044414D00331
<210>39
<211>51
<212>DNA
<213>DI-3L primer
<400>39
Figure C200480044414D00332
<210>40
<211>43
<212>DNA
<213>DI-4L primer
<400>40
Figure C200480044414D00333
<210>41
<211>50
<212>DNA
<213>DI-5L primer
<400>41
Figure C200480044414D00334
<210>42
<211>50
<212>DNA
<213>DI-6L primer
<400>42
Figure C200480044414D00335
<210>43
<211>50
<212>DNA
<213>DI-7L primer
<400>43
Figure C200480044414D00341
<210>44
<211>50
<212>DNA
<213>DI-8L primer
<400>44
Figure C200480044414D00342
<210>45
<211>50
<212>DNA
<213>DI-9L primer
<400>45
Figure C200480044414D00343
<210>46
<211>49
<212>DNA
<213>DI-10L primer
<400>46
Figure C200480044414D00344
<210>47
<211>35
<212>DNA
<213>DI-11L primer
<400>47
<210>48
<211>27
<212>DNA
<213>SpikeCTdn-BstB I primer
<400>48
Figure C200480044414D00351
<210>49
<211>4800
<212>DNA
<213>CoVLP cloning vector
<400>49
Figure C200480044414D00352
Figure C200480044414D00361
Figure C200480044414D00381

Claims (17)

1.一种用于克隆第I类病毒融合蛋白基因及作为DNA疫苗候选物之表达载体，其特征是该表达载体包括：
i)一个第一转录单元，包括冠状病毒之膜蛋白基因，冠状病毒之外膜蛋白基因，及内部核糖体进入序列，其中该内部核糖体进入序列插入至膜蛋白基因及外膜蛋白基因的接合处；
ii)一个第一真核启动子，可操作地连结至膜蛋白基因，其中该第一启动子位于膜蛋白基因之上游且驱动第一转录单元之表达；
iii)一个第二转录单元，包括冠状病毒之刺突蛋白羧基端区域的基因及用于第I类病毒融合蛋白基因之克隆或框内插入之多重克隆位点，其中该多重克隆位点位于刺突蛋白羧基端区域的基因之起始处且具有限制酶剪切位点；及
iv)一个第二真核启动子，可操作地连结至刺突蛋白羧基端区域的基因，其中该第二启动子位于刺突蛋白羧基端区域的基因之上游且驱动第二转录单元之表达；
其中该第一真核启动子之转录活性比第二真核启动子为强。
2.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该冠状病毒为猪、人类或鸟类冠状病毒。
3.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该冠状病毒为猪TGEV冠状病毒、人类229E冠状病毒或人类SARS病毒。
4.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该外膜蛋白基因为如SEQ ID NO：1所述之序列。
5.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该膜蛋白基因为如SEQID NO：2所述之序列。
6.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该刺突蛋白羧基端区域的基因为如SEQ ID NO：3所述之序列。
7.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是进一步包括在宿主细胞中质粒DNA复制始点。
8.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是进一步包括作为选择性标志之抗抗生素基因。
9.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第一及第二转录单元具有polyA信号。
10.根据权利要求9所述之表达载体，其特征是该polyA信号是BGHpolyA信号。
11.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是有如SEQ ID NO：49所述之序列。
12.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该多重克隆位点包括Sma I、BsaB I、EcoR V及BspE I所构成群组之至少一者的限制酶位点。
13.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第I类病毒融合蛋白基因选自由HIV的gp160、流感病毒的HA及SARS病毒的Spike所构成的群组。
14.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第一真核启动子选自由CMV、SV40、RSV、HIV-1、LTR、杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子、肌肉特异肌间线蛋白、肌酸激酶、β肌动蛋白启动子、EF1α及泛素(ubiquitin)启动子所构成的群组。
15.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第一真核启动子选自由pCMV、杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子及β肌动蛋白启动子所构成的群组。
16.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第二真核启动子选自由CMV、SV40、RSV、HIV-1、LTR、杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子、肌肉特异肌间线蛋白、肌酸激酶、β肌动蛋白启动子、EF1α及泛素启动子所构成的群组。
17.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第二真核启动子选自由pCMV、SV40、β肌动蛋白启动子及EF1α所构成的群组。
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