CN100591763C - 枯草杆菌酶 - Google Patents

Abstract

公开了显示出低的被存在于卵中的物质如胰蛋白酶抑制剂类IV-0抑制的枯草杆菌酶(subtilase)。这些枯草杆菌酶用于清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中时，表现出优良的或改进的卵污渍洗涤性能。在公开包含该枯草杆菌酶的清洁和洗涤剂组合物以及公开它们除去卵污渍的用途的同时，也一同公开了编码该枯草杆菌酶的分离的核酸序列、核酸构建体、重组表达载体、包含核酸构建体的宿主细胞以及产生和使用这些枯草杆菌酶的方法。

Description

枯草杆菌酶

技术领域

本发明涉及对存在于卵中的物质如胰蛋白酶抑制剂类IV-0的抑制具有降低趋势的新枯草杆菌酶(subtilase)。当这些枯草杆菌酶用于如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物中，包括自动洗盘组合物中时，对卵污渍表现出优良的或改进的洗涤性能。

本发明也涉及编码该枯草杆菌酶的分离的核酸序列、核酸构建体、重组表达载体、包含该核酸构建体的宿主细胞，以及生产和使用本发明的枯草杆菌酶的方法。而且，本发明涉及包含本发明枯草杆菌酶的清洁和洗涤剂组合物，以及这些酶在洗涤剂组合物中的用途和用于除去卵污渍。

发明背景

在洗涤剂工业，酶已在洗涤配方中使用了30年以上。用于这些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和其它酶或它们的混合物。商业上最为重要的酶是蛋白酶。

数量不断增长的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，如DURAZYM

(Novozymes A/S)、RELASE

(NovozymesA/S)、MAXAPEM

(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT

(GenencorInternational，Inc.)。

虽然已描述了大量有用的蛋白酶和蛋白酶变体，但是对于许多工业应用而言，仍需要新的改进的蛋白酶或蛋白酶变体。

具体而言，由于卵清中存在的物质抑制许多种丝氨酸蛋白酶，因而提出从如衣物或硬表面除去卵污渍的问题。此类物质的实例包括胰蛋白酶抑制剂类IV-0(卵抑制蛋白)和胰蛋白酶抑制剂类III-0(类卵粘蛋白)。

因此，本发明的一个目的在于提供改进的枯草杆菌酶，它不被或仅有限地被此类物质抑制。本发明的又一目的是提供适于从如衣物和/或硬表面除去卵污渍的改进枯草杆菌酶。

发明概述

因此，在第一方面，本发明涉及选自以下的枯草杆菌酶：

a)氨基酸序列与SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的枯草杆菌酶；

b)由在低严格条件下与以下序列杂交的核酸序列编码的枯草杆菌酶：

(i)如SEQ ID NO：1的第334至1140位核苷酸所示的核酸序列的互补链，或

(ii)(i)的至少100个核苷酸的子序列。

在第二方面，本发明涉及这样的分离核酸序列，其包含编码本发明的枯草杆菌酶的核酸序列。

在第三方面，本发明涉及编码枯草杆菌酶的分离的核酸序列，其选自

(a)与SEQ ID NO：1的第334至1140位核苷酸所示的核酸序列具至少85％同一性的核酸序列；和

(b)在低严格条件下与以下序列杂交的核酸序列

(i)如SEQ ID NO：1的第334至1140位核苷酸所示的核酸序列的互补链，或

(ii)(i)的至少100个核苷酸的子序列。

在第四方面，本发明涉及这样的核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个调控序列的本发明的核酸序列，其中所述调控序列可指导枯草杆菌酶在合适宿主中表达。

在第五方面，本发明涉及包含本发明的核酸构建体、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。

在第六方面，本发明涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

在第七方面，本发明涉及用于产生本发明枯草杆菌酶的方法，所述方法包括：

(a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和

(b)回收枯草杆菌酶。

在第八方面，本发明涉及用于产生本发明枯草杆菌酶的方法，所述方法包括：

(a)培养来自芽胞杆菌属，优选地培养来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)种的菌株如克劳氏芽孢杆菌DSM 13585，以产生含有枯草杆菌酶的上清；和

(b)回收枯草杆菌酶。

在第九方面，本发明涉及包含本发明的枯草杆菌酶的清洁或洗涤剂组合物，优选地为洗衣或洗盘组合物。

本发明进一步的方面涉及本发明的枯草杆菌酶在清洁或洗涤剂组合物中的用途；本发明的枯草杆菌酶或组合物用于除去卵污渍的用途；一种用于清洁或洗涤的方法，包括从硬表面或衣物上除去卵污渍的方法，所述方法包括使硬表面或衣物与本发明的组合物接触。

关于序列对比和编号参见图1，该图表示在枯草杆菌蛋白酶BPN′(a)(BASBPN)和本发明的新枯草杆菌酶(b)之间的序列对比。

本专利申请中的该序列对比用作对残基进行编号的参照。

定义

在更详细地讨论本发明之前，首先定义以下的术语和惯用语。

氨基酸命名法

A＝Ala＝丙氨酸

V＝Val＝缬氨酸

L＝Leu＝亮氨酸

I＝Ile＝异亮氨酸

P＝Pro＝脯氨酸

F＝Phe＝苯丙氨酸

W＝Trp＝色氨酸

M＝Met＝甲硫氨酸

G＝Gly＝甘氨酸

S＝Ser＝丝氨酸

T＝Thr＝苏氨酸

C＝Cys＝半胱氨酸

Y＝Tyr＝酪氨酸

N＝Asn＝天冬酰胺

Q＝Gln＝谷氨酰胺

D＝Asp＝天冬氨酸

E＝Glu＝谷氨酸

K＝Lys＝赖氨酸

R＝Arg＝精氨酸

H＝His＝组氨酸

X＝Xaa＝任意氨基酸

核酸命名法

A＝腺嘌呤

G＝鸟嘌呤

C＝胞嘧啶

T＝胸腺嘧啶(仅在DNA中)

U＝尿嘧啶(仅在RNA中)

变体命名的命名法和惯用语

在描述本发明的产生的或期待的多种枯草杆菌酶变体时，采用以下的命名法和惯用语以易于参照：

首先通过将分离的或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)对比来定义参考框。

可以由GCG程序包9.1版的GAP程序获得序列对比，用于对枯草杆菌酶进行编号，使用了以下参数：间隔创建罚分＝8，间隔扩展罚分＝8，且所有的其它参数保持为它们的默认值。

另一种方法是使用已知的枯草杆菌酶之间的对比，如在WO91/00345中所示的序列对比。在大部分情况下，差异并不重要。

枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)和本发明的新枯草杆菌酶之间的序列对比如图1所示。

因此，将定义许多与BASBPN相关的缺失和插入。在图1中，本发明的新枯草杆菌酶与BASBPN相比，在36、58、159、162、163和164位有6处缺失。这些缺失在图1中由星号(*)表示。

一般采用以下的三个成分来表示对亲本酶所进行的多种修饰：

原始氨基酸位置替换的氨基酸

因此，符号G195E意指195位的甘氨酸被谷氨酸替换。

在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以用简略表达方式仅表示位置和替换的氨基酸：

位置替换的氨基酸

这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。

类似地，当替换氨基酸残基的种类不重要时：

原始氨基酸位置

当原始氨基酸和替换氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则只指出位置，如：170。

当原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸时，所选择的氨基酸表示在括号内：

原始氨基酸位置{替换的氨基酸 ₁ ，...，替换的氨基酸 _n }

对于特定的变体，使用特定的三个或一个字母代码，包括代码Xaa和X用来表示任何氨基酸残基。

替换：

用谷氨酸替换195位的甘氨酸表示为：

Gly195Glu或G195E

或者用任意氨基酸残基酸替换195位的甘氨酸表示为：

Gly195Xaa或G195X

或

Gly195或G195

因此用丝氨酸替换170位的任意氨基酸残基表示为：

Xaa170Ser或X170S

或

170Ser或170S

这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。因此170Ser意指包含BASBPN中的Lys170Ser修饰和本发明枯草杆菌酶的Arg170Ser的修饰(参见图1)。

对于其中的原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸的修饰而言，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸替换170位的精氨酸表示为

Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}

以表示变体

R170G、R170A、R170S和R170T。

缺失：

195位甘氨酸的缺失表示为：

Gly195^*或G195^*

相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示为

Gly195^*+Leu196^*或G195^*+L196^*

插入：

额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸表示为：

Gly195GlyLys或G195GK；

或者，当插入一个以上的氨基酸残基，如在G195后插入Lys和Ala时，这种插入表示为：

Gly195GlyLysAla或G195GKA

在这些情况下，通过将小写字母加到插入氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号来对插入氨基酸残基进行编号。在以上的实施例中，序列194-196因此为：

          194 195 196

BLSAVI    A-G-L

          194 195 195a 195b 196

变体      A-G-K  -A  -L

当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上的实施例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG。对从

         194 195 196

BLSAVI   A-G-L

         194 195 195a 196

至变体   A-G-G-L

         194 194a 195 196

的同一现行变化还可以表示为A194AG。

这些例子对本领域技术人员来说是显而易见的，且表示法G195GG和这种类型插入的相应表示法因此是指包含此类等同的简并表示法。

填补间隔：

当与用于编号的枯草杆菌蛋白酶BPN′序列进行比较，在参照的酶中存在缺失时，则对于在36位天冬氨酸的插入而言，这种位置处的插入表示为：

*³6Asp或^*36D

多重修饰：

用加号分隔含多重修饰的变体，如：

Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E代表在170和195位分别用酪氨酸和谷氨酸替换精氨酸和甘氨酸的修饰。

因此，Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示以下变体：

Tyr167Gly+Arg170Gly，Tyr167Gly+Arg170Ala，

Tyr167Gly+Arg170Ser，Tyr167Gly+Arg170Thr，

Tyr167Ala+Arg170Gly，Tyr167Ala+Arg170Ala，

Tyr167Ala+Arg170Ser，Tyr167Ala+Arg170Thr，

Tyr167Ser+Arg170Gly，Tyr167Ser+Arg170Ala，

Tyr167Ser+Arg170Ser，Tyr167Ser+Arg170Thr，

Tyr167Thr+Arg170Gly，Tyr167Thr+Arg170Ala，

Tyr167Thr+Arg170Ser    和Tyr167Thr+Arg170Thr。

这种命名法与针对替换、取代、插入或缺失具有特定共同性质的氨基酸残基，如带正电荷(K、R、H)、带负电荷(D、E)的残基的修饰，或用一种小氨基酸替换另一种小氨基酸的诸如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}的保守氨基酸的修饰特别相关。进一步的详细描述参见“发明详述”部分。

蛋白酶

分解蛋白质底物中的酰胺键的酶归类为蛋白酶，或(可互换地)肽酶(见Walsh，1979，酶反应机理(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。

氨基酸位置/残基的编号

如果没有另外指出，本文所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN′(BASBPN)序列的氨基酸编号。对BPN′序列的详细描述，参见图1或Siezen等人，蛋白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性部位存在必需的丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973“生物化学原理(Principles of Biochemistry)，”第五版，McGraw-Hill Book公司，纽约，第271-272页)。

细菌丝氨酸蛋白酶的分子量在20,000-45,000道尔顿的范围内。它们被二异丙基氟代磷酸酯抑制。它们水解简单末端脂类，且其活性与真核生物糜蛋白酶(也是一种丝氨酸蛋白酶)相似。一个更为狭义的术语：包括在一个亚组的碱性蛋白酶反映某些丝氨酸蛋白酶的高pH最佳值，为pH 9.0-11.0(综述参见Priest(1977)细菌学评论(BacteriologicalRev.)41：711-753)。

枯草杆菌酶

Siezen等人提出丝氨酸蛋白酶的一个亚组，其暂称为枯草杆菌酶(subtilase)，见蛋白质工程，4(1991)719-737和Siezen等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523。它们是通过对170多个先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了大量的枯草杆菌酶，并已测定了一些枯草杆菌酶的氨基酸序列。对此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述参见Siezen等人(1997)。

枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或″真″枯草杆菌蛋白酶，包含“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE

，Novozymes A/S)和枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。

Siezen等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶并包括：枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL

，Gist-BrocadesNV)、枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)(SAVINASE

，Novozymes A/S)、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE

，Novozymes A/S)和碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。

亲本枯草杆菌酶

术语“亲本枯草杆菌酶”描述一种根据Siezen等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。关于进一步的细节，参见上述对“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从天然来源分离的枯草杆菌酶，其中，在保持枯草杆菌酶特性的情况下经过进一步修饰。而且，亲本枯草杆菌酶还可以是通过如以下文献所述的DNA改组技术制备的枯草杆菌酶：J.E.Ness等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999)。

术语“亲本枯草杆菌酶”可另外称为“野生型枯草杆菌酶”。

枯草杆菌酶的修饰

本文所用的术语“修饰”定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及对编码枯草杆菌酶的DNA所进行的遗传操作。修饰可以是氨基酸侧链的取代、目标氨基酸处的替换、缺失和/或插入。

枯草杆菌酶变体

在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变体或突变的枯草杆菌酶指由表达突变基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该突变基因来源于含原始或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物，所述亲本基因已发生突变以产生突变基因，这种突变基因在适宜的宿主中表达时产生所述的突变枯草杆菌酶。类似地，所述突变基因还可以来自通过DNA改组技术产生的亲本基因。

同源枯草杆菌酶序列

在本上下文中，两种氨基酸序列之间的同源性用参数“同一性”描述。

为了确定两种枯草杆菌酶之间的同一性程度，可以使用相同的设置应用(下文)GCG程序包9.1版的GAP方法。此方法的计算结果除了氨基酸序列对比外，还有两个序列之间的“同一性百分率”的计算结果。

根据此说明，本领域技术人员可常规地鉴定适宜的同源性枯草杆菌酶和相应的同源活性部位环区，它们可以根据本发明进行修饰。

分离的核酸序列

本文所用的术语“分离的核酸序列”指经分离和纯化并因此为适用于遗传工程化的蛋白质产生体系的形式的核酸序列。这些分离的分子可以从其自然环境中分离，并包括cDNA和基因组克隆以及来自DNA改组实验或定点突变实验的核酸序列。本发明的分离的核酸序列不含其它通常与之相关的基因，但可包括5′和3′非翻译区如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域技术人员来说是显而易见的(例如，参见Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。术语“分离的核酸序列”另外可称为“分离的DNA序列”、“克隆的核酸序列”或“克隆的DNA序列”。

分离的蛋白质

术语“分离的”在应用于蛋白质时指此蛋白质已从其自然环境中分离出。

在优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参见以下))。

通过SDS-PAGE测定分离的蛋白质的纯度大于10％，优选大于20％，更优选大于30％。还优选提供通过SDS-PAGE测定纯度大于40％，大于60％，大于80％，更优选大于95％，并最优选大于99％的高度纯化形式的蛋白质。

术语“分离的蛋白质”可另称为“纯化的蛋白质”。

同源杂质

术语“同源杂质”意指任何来源于最初获得本发明枯草杆菌酶的同源细胞的杂质(如除了本发明枯草杆菌酶之外的另一多肽)。

自……获得

本文所用与特定的微生物源相关的术语“自……获得”意指该多核苷酸和/或枯草杆菌酶是由特定来源或由细胞产生，其中所述的特定来源或细胞中已插入来自于其中的基因。

底物

本文所用的与蛋白酶的底物相关的术语“底物”应以其最广义的形式解释为包括含有至少一种易于被枯草杆菌蛋白酶水解的肽键的化合物。

产物

本文所用的与来自蛋白酶酶促反应的产物有关的术语“产物”在本发明的上下文中应解释为包括涉及蛋白酶枯草杆菌酶的水解反应的产物。产物可以是在随后的水解反应中的底物。

洗涤性能

在本发明上下文中，术语“洗涤性能”用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于目标上的卵污渍至清洁的能力。还参见本文实施例2中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。

性能因子

用下式定义术语“性能因子”：

P＝R_{枯草杆菌酶}-R_洒维奈斯

其中，P为性能因子，R_{枯草杆菌酶}为如在“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述采用枯草杆菌酶处理之后的试验材料的反射能力(reflectance)，而R_洒维奈斯为如在“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述采用Savinase

处理之后的试验材料的反射能力，进一步的详情参见本文实施例2中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。

剩余活度

术语“剩余活度”的定义如本文在“卵抑制测定”中所述(见实施例3)。

附图简述

图1表示使用上述的GAP法进行枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列(a)和本发明的新枯草杆菌酶的氨基酸序列(b)之间的序列对比。

发明详述

在本发明的第一个令人感兴趣的方面，该枯草杆菌酶是分离的与SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列(即成熟的枯草杆菌酶)具有至少95％同一性的枯草杆菌酶。在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，该枯草杆菌酶与SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少96％，优选地至少97％，更优选地至少98％，尤其是至少99％的同一性(下文称为“同源枯草杆菌酶”)。在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，该分离的枯草杆菌酶包含或由如SEQID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列组成。

可使用之前提及的GAP法(及相同的设置)进行序列对比和同一性分值计算。

通过进行此类序列对比，发现具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的枯草杆菌酶和多种已知的枯草杆菌酶的氨基酸序列之间的下列同一性(以百分率表示)：

                BLSAVI BLAP BASBPN BLSCAR SEQ ID NO：2

                                                             

BLSAVI          100

BLAP¹⁾          98     100

BASBPN          58     58   100

BLSCAR          60     60   68     100

SEQ ID NO：2    93     94   57     58     100

                                                   

¹⁾BLAP(迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶)已在US5,352,604中描述。

在本发明的另一令人感兴趣的实施方案中，分离的枯草杆菌酶由这样的核酸序列编码，此核酸序列在低严格条件下，优选地在中等严格条件下，更优选地在高度严格条件下与以下序列杂交：(i)如SEQ ID NO：1的第334至1140位核苷酸所示的核酸序列的互补链，或(ii)(i)的至少100个核苷酸的子序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，分子克隆，实验室手册，第二版(Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2d edition)，冷泉港，纽约)。

如SEQ ID NO：1中第334至1140位核苷酸所示的核酸序列的互补链的子序列可为至少100个核苷酸，或优选地至少200个核苷酸。而且，此子序列应编码具有蛋白水解活性的枯草杆菌酶片段。此枯草杆菌酶也可以是具有蛋白水解活性的枯草杆菌酶的等位基因变体或片段。

根据本领域已知的方法，可以将SEQ ID NO：1的核酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的菌株的、编码具有蛋白水解活性的枯草杆菌酶的DNA。具体来说，此类探针可以根据标准的Southern印迹法，用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以大大短于整个序列，但应该至少为15，优选至少25，更优选至少35个核苷酸长。也可以使用较长的探针。DNA和RNA探针均可使用。一般对探针进行标记(如用³²P、³H、³⁵S、生物素或亲和素标记)以检测相应的基因。此类探针包含在本发明中。

因此，可以从制备自其它此类生物体的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述的探针杂交并编码本发明枯草杆菌酶的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳法，或本领域技术人员已知的其它分离技术分离来自其它此类生物体的基因组DNA或其它DNA。可以将来自这些文库的DNA或分离的DNA转移或者固定到硝酸纤维素或其它适宜的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其子序列同源的克隆或DNA，将此载体材料用于Southern印迹法。为本发明目的，杂交表明核酸序列在低至高严格条件下与相应于SEQ ID NO：1中所示的核酸序列、其互补链或其子序列的标记核酸探针杂交。采用X射线薄膜检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

对于长度至少为100个核苷酸的长探针，低至高严格条件定义为：根据标准的Southern印迹法，在42℃下于5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精DNA，以及含用于低严格条件的25％甲酰胺、含用于中等严格条件的35％甲酰胺或含用于高严格条件的50％甲酰胺中进行预杂交和杂交。

对于长度至少为100个核苷酸的长探针，最终用2×SSC，0.2％SDS优选至少于50℃(低严格条件)，更优选至少于55℃(中等严格条件)，进一步更优选至少于65℃(高严格条件)将载体材料各洗三次，每次15分钟。

对于长度在大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，严格条件定义为：根据标准Southern印迹法，在以下条件下进行预杂交、杂交和洗涤后杂交：在采用Bolton和McCarthy(1962，美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)48：1390)计算法计算的T_m之下5℃-10℃，于0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠，1mM一碱价磷酸钠，0.1mM ATP和每毫升0.2mg酵母RNA。

对于长度在大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短核苷酸，在添加了0.1％SDS的6×SCC中洗涤15分钟，洗涤一次；并使用6×SSC，在计算的T_m之下5℃-10℃洗涤两次，每次15分钟。

现有技术中已知所谓用类似的氨基酸残基对某氨基酸残基的保守取代预期仅产生酶特征的小变化。

下列表I列出了保守氨基酸替换的组

表I

保守氨基酸替换

因此，在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的新枯草杆菌酶被一个或多个氨基酸残基的替换、缺失和/或插入而修饰。

因此，在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，枯草杆菌酶为具有如SEQ ID NO：2的第1至269位氨基酸所示氨基酸序列的枯草杆菌酶的变体，所述变体与如SEQ ID NO：2的第1至269位氨基酸所示的氨基酸序列相比，前者包含至少一处修饰，即替换、缺失和/或插入。优选地，修饰数最多为18，如最多为17，如最多为16或最多为15。在一个更优选的实施方案中，修饰数最多为14，如最多为13，最多为12，最多为11，最多为10，最多为9，最多为8，最多为7，最多为6，或最多为5。在本发明的尤其令人感兴趣的实施方案中，修饰数最多为4，优选地最多为3，如最多为2。

本发明的修饰的枯草杆菌酶优选地与SEQ ID.NO：2的氨基酸序列具有95％或更大的同一性。

特别地，研究了与本领域公知的其它修饰进行组合，以提供改良的酶特性。当前技术描述了一些具有不同改良特性的枯草杆菌酶变体，并且它们中的一些杆菌酶变体在此处的“发明背景”部分提及(见上)。

因此，对SEQ ID NO：2的氨基酸序列在下列一个或多个位置处进行的修饰认为尤其适用(按BASBPN编号)：27、36、56、76、87、96、97、98、99、100、101、103、104、120、123、129、131、132、133、143、159、167、170、192、194、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274。

具体来说，认为本发明的枯草杆菌酶的以下变体适于组合(按BASBPN编号)：K27R、^*36D、T56P、N76D、N87S、A97N、A98AT、A98AS、N99ND、N99NR、N99A、N99T、R101G、P103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、D120H、N123S、P129K、P131H、A133P、A133D、A133E、T143K、^*159D、^*159E、Y167X、Y167A、R170X、R170S、A194P、Q206E、F217R、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K和T274A。

更让人特别感兴趣的为这样的本发明的枯草杆菌酶变体，其中的修饰包含以下任一种修饰：V104N+R101G、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+V104A或R101G+P103A+V104I+*159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K；或这些修饰(K27R、N76D、R101G、P103A、V104I、V104N、V104A、V104Y、N123S、^*159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D、N252K、T274A)与任意一种或多种上述或下述修饰组合而成的其它组合。

而且，认为在活性部位(b)环区域插入至少一个附加氨基酸残基，相当于从95位至103位(BASBPN编号)插入至少一个附加氨基酸残基将赋予本发明的枯草杆菌酶附加的洗涤性能。具体而言，优选在以下位置至少插入一个附加氨基酸残基，如插入一个附加氨基酸残基：98位和99位(BASBPN编号)之间，以及99位和100位(BASBPN编号)之间。

如上所述，本发明的枯草杆菌酶只有限地被胰蛋白酶抑制剂类IV-0抑制，结果本发明的枯草杆菌酶呈现出对卵污渍良好的洗涤性能。因此，为了使技术人员在其进行工作的早期阶段可选择有效且优选的枯草杆菌酶，本发明人提供了适当的初步试验，该试验易于被技术人员实施，旨在初步评估所讨论的枯草杆菌酶的性能。

因此，可采用在此处实施例3中所公开的″卵抑制测定″来初步评估所选择的枯草杆菌酶的潜力。换言之，可采用″卵抑制测定″来评估所选择的酶是否被胰蛋白酶抑制剂类IV-0抑制，以及其抑制程度如何。应用这种测试可评估所选择的枯草杆菌酶去除卵污渍的适用性，其原理为：如果所选择的枯草杆菌酶被胰蛋白酶抑制剂类IV-0强烈抑制，则通常无需进行进一步的测试实验。

因此，对于此处描述的目的而言，尤其令人感兴趣的枯草杆菌酶为这样的枯草杆菌酶-其当在此处实施例3中描述的″卵抑制测定″试验中具有至少15％(如至少20％)，优选地至少25％(如至少30％)，更优选地至少35％的剩余活度。

明显地，优选本发明的枯草杆菌酶在所述的最低水平上，更优选在所述的中等水平上，最优选在所述的最高水平上符合上述标准。

另外，或除了上述测试外，所选择的枯草杆菌酶的适用性可用此处实施例2中所公开的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”进行测试。当一种枯草杆菌酶被掺入标准的洗涤剂组合物中时，可与参照体系(此时为Savinase

)进行比较(将Savinase

掺入同样的标准洗涤剂体系并在相同的条件下测试)，用“标准的洗涤剂洗涤性能试验”评价枯草杆菌酶除去标准纺织物上的卵污渍的能力。利用这种试验，可以初步研究所选择的枯草杆菌酶除去卵污渍的适用性，其原理是：如果所选择的枯草杆菌酶在试验中没有表现出相对于Savinase的明显改进，则一般不需要进行进一步的试验。

因此，对于此处描述的目的而言，尤其令人感兴趣的枯草杆菌酶为这样的枯草杆菌酶：如在“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述，当它在包含以下成分的标准洗涤剂中试验时，与在相同条件下试验的Savinase

相比表现出改进的卵污渍洗涤性能，标准的洗涤剂组合物包含：

6.2％        LAS(Nansa 80S)

2％          C₁₆-C₁₈脂肪酸的钠盐

4％          非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

22％         沸石P

10.5％       Na₂CO₃

4％          Na₂Si₂O₅

2％          羧甲基纤维素(CMC)

6.8％        丙烯酸盐液体CP540％

20％         过硼酸钠(经验式NaBO₂.H₂O₂)

0.2％        EDTA

21％         Na₂SO₄

            水(平衡量)

可以采用在本文的实施例2中定义的所谓“性能因子”对洗涤性能的改进进行定量。

在本发明的一个非常令人感兴趣的实施方案中，本发明的枯草杆菌酶在“洗涤性能试验”测试时，其性能因子至少为1，如至少为1.5，例如至少为2，优选至少为2.5，如至少为3，例如至少为3.5，特别是至少为4，如至少为4.5，例如至少为5。

明显地，优选本发明的枯草杆菌酶在所述的最低水平上，更优选在所述的中等水平上，最优选在所述的最高水平上符合上述标准。

本发明的枯草杆菌酶还可以从天然来源中分离，即本发明的枯草杆菌酶可以是例如细菌枯草杆菌酶，例如革兰氏阳性细菌枯草杆菌酶或革兰氏阴性细菌枯草杆菌酶，其中革兰氏阳性细菌枯草杆菌酶例芽孢杆菌属多肽，如克劳氏芽孢杆菌(以前称为迟缓芽孢杆菌)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结牙孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)枯草杆菌酶；或者链霉菌属枯草杆菌酶，如变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)枯草杆菌酶；其中所述革兰氏阴性细菌枯草杆菌酶，如大肠杆菌或假单胞菌(Pseudomonas)sp枯草杆菌酶。

本发明的枯草杆菌酶也可为真菌多肽，更优选酵母枯草杆菌酶如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia枯草杆菌酶；或者更优选的丝状真菌枯草杆菌酶如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉菌属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)枯草杆菌酶。

在一个令人感兴趣的实施方案中，枯草杆菌酶为卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)枯草杆菌酶。

在另一个有用的实施方案中，枯草杆菌酶为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporium)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)枯草杆菌酶。

可以理解，对于上述的种，本发明包含理想和不理想状态和其它分类学等同物，如变形物，而不管它们已知的种名如何。本领域技术人员易于认识到适当等同物的同一性。

这些种的菌株对公众来说是易于在一些培养物保藏中心得到的，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利培养物保藏所，北方地区研究中心(NRRL)。

可从中分离本发明枯草杆菌酶的尤其合适的芽孢杆菌菌株为克劳氏芽孢杆菌HSB10(碱性芽孢杆菌HS433)菌株，其根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于2000年7月5日保藏在德意志微生物保藏中心Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 B，D-38124 Braunschweig，德国，其保藏号为DSM 13585。保藏人为Novo Nordisk A/S，后转让给Novozymes A/S。

而且，可以采用上述的探针从包括自自然界(如土壤、堆肥、水等)分离的微生物的其它来源中鉴定并获得此类枯草杆菌酶。用于从天然栖所分离微生物的技术在本领域中是已知的。这样类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库可获得所述的核酸序列。一旦用探针检测到编码枯草杆菌酶的核酸序列，可以采用本领域技术人员已知的技术分离并克隆该序列(例如，参见Sambrook等人，1989，上文)。

而且，本发明的枯草杆菌酶可以通过标准技术构建，用于人为地产生多样性，如通过不同枯草杆菌酶基因的DNA改组技术(参见WO95/22625和J.E.Ness等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999))。

用于克隆本发明枯草杆菌酶的许多方法和用于将插入物导入基因(如枯草杆菌酶基因)的许多方法在本领域是熟知的，参见在“发明背景”部分引用的参考文献。

通常可以采用用于克隆基因和向该基因引入插入物(随机和/或定点)的标准方法以获得本发明的枯草杆菌酶。为了进一步描述适宜的技术，参照本文的实施例(见下文)和(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等人(编辑)“分子生物学最新方法”(“Current protocols in Molecular Biology”)，JohnWiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)“用于芽孢杆菌的分子生物学方法”(“Molecular Biological Methods forBacillus”)，John Wiley和Sons，1990)；和WO 96/34946。

而且，本发明的枯草杆菌酶可以通过标准技术构建，用于人为地产生多样性，如通过不同枯草杆菌酶基因的DNA改组技术(参见WO95/22625；Stemmer WPC，自然370：389-91(1994))。例如将编码Savinase

的基因与实际上已鉴定的一种或多种部分枯草杆菌酶序列进行DNA改组，在随后筛选改进的洗涤性能后，提供本发明的枯草杆菌酶。

核酸序列

本发明还涉及编码本发明枯草杆菌酶的分离的核酸序列。

在一个令人感兴趣的实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：1的第334-1140位核苷酸所示的核酸序列具有至少85％的同一性。优选地，该核酸序列与SEQ ID NO：1的第334-1140位核苷酸所示的核酸序列具有至少86％，如至少87％，例如至少88％，更优选地具有至少89％，如至少90％，例如至少91％，甚至更优选地具有至少92％，如至少93％，例如至少94％，最优选地具有至少95％，如至少96％，例如至少97％，特别是具有至少98％，如至少99％的同一性。在本发明的另一令人感兴趣的实施方案中，该核酸序列包含如SEQ ID NO：1的第334-1140位核苷酸所示的核酸序列、其能够编码本发明枯草杆菌酶的等位基因变体或其片段。显然，该核酸序列可由如SEQ ID NO：1的第334-1140位核苷酸所示的核酸序列组成。

本发明还包括编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的核酸序列，它由于遗传密码简并性而不同于SEQ ID NO：1。本发明还涉及编码具有蛋白水解活性的SEQ ID NO：2片段的SEQ ID NO：1的子序列。

SEQ ID NO：1的子序列为包含在SEQ ID NO：1的第334-1140位核苷酸内、已去除了5’和/或3’末端的一个或多个核苷酸的核酸序列。

本发明还涉及编码本发明枯草杆菌酶的分离的核酸序列，该核酸序列在低严格条件下，优选地在中等严格条件下，更优选在高度严格条件下，与以下序列杂交：(i)如SEQ ID NO：1的第334至1140位核苷酸所示的核酸序列的互补链，或(ii)(i)的至少100个核苷酸的子序列。本发明还涉及(i)和(ii)的互补链。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术在现有技术中是已知的，它包括从基因组DNA中分离、由cDNA制备、或它们的组合。可以从这些基因组DNA克隆本发明的核酸序列，例如通过使用已知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆的DNA片段。例如，参见Innis等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR：A Guide to Methods and Application)，Academic Press，纽约。可以使用其它的核酸扩增方法如连接酶链反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

分离的核酸序列可以例如通过遗传工程中所用的标准克隆方法获得，以便将该核酸序列从其天然位置重新定位到可使其复制的不同位点处。克隆方法可包括切除和分离含编码枯草杆菌酶的核酸序列的所需核酸片段，将此片段插入到载体分子，并将此重组载体整合到宿主细胞，在宿主细胞中复制出该核酸序列的多个拷贝或克隆。此核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成来源、合成来源或它们的任一组合。

为本发明的目的，两个核酸序列之间的同一性程度如上述测定。

编码本发明的枯草杆菌酶的核酸序列的修饰对于合成与该枯草杆菌酶基本类似的枯草杆菌酶是必需的。术语“基本上类似的”枯草杆菌酶指非天然存在的枯草杆菌酶的形式。这些枯草杆菌酶在某些设计方式上可与从其天然来源分离得到的枯草杆菌酶不同，如在特定的活性、热稳定性、pH最佳值等方面存在不同的变体。可以在呈现为SEQ ID NO：1一部分如其子序列所编码的多肽的核酸序列的基础上构建变体序列，和/或通过引入取代核苷酸来构建变体序列，其中引入的取代核苷酸不产生另一种由该核酸序列编码的枯草杆菌酶的氨基酸序列，但其与欲用于生产这种酶的宿主生物体的密码子使用相匹配；或者通过引入可产生不同氨基酸序列的取代核苷酸。核苷酸取代的一般性描述，参见Ford等人，1991，蛋白质的表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107。

对于本领域技术人员来说，显然这种取代可以在所述分子的关键功能区之外进行并仍产生活性枯草杆菌酶。对本发明的分离的核酸序列编码的多肽的活性至关重要的氨基酸残基，优选其不发生取代，可以根据本领域中已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，参见Cunningham和Wells，1989，科学(Science)244：1081-1085)。在后一技术中，在此分子的每一个带正电荷的残基处引入突变，并试验所得突变分子的蛋白水解活性，以鉴定此分子活性的关键氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过三维结构分析测定，这种三维结构是由诸如核磁共振分析、结晶学或光亲合标记技术而测定的(例如，参见de Vos等人，1992，科学255：306-312；Smith等人，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明核酸序列的核酸核建体，所述核酸可操作地与一种或多种能够指导多肽在适宜的宿主细胞内表达的调控序列相连接。

可以多种方式操作编码本发明枯草杆菌酶的分离核酸序列以提供枯草杆菌酶的表达。在插入载体之前对核酸序列操作的适当性和必需性取决于表达载体。采用重组DNA方法修饰核酸序列的技术在现有技术中是已知的。

所述调控序列包括所有表达本发明枯草杆菌酶所必需或有利的组分。每一种调控序列对于编码枯草杆菌酶的核酸序列来说可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于先导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，所述调控序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。可以为此调控序列提供用于引入特定限制性位点的接头，促进此调控序列与编码枯草杆菌酶的核酸序列编码区连接。

所述调控序列可以是适宜的启动子序列，为被宿主细胞识别用于表达核酸序列的核酸序列。所述的启动子序列含介导枯草杆菌酶表达的转录调控序列。所述的启动子可以是在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的任何核酸序列，包括突变体、截短和杂合启动子，并可以由与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内枯草杆菌酶的基因获得。

用于指导本发明核酸构建体的转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的适宜的启动子的实例为得自以下的启动子：大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院院报75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报80：21-25)。其它的启动子如在以下文献中所述：“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”，科学美国人(Scientific American)，1980，242：74-94；和Sambrook等人，1989，见上文。

用于指导在丝状真菌宿主细胞中本发明的核酸构建体的转录的适宜的启动子的实例为得自以下的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、Rhiomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhiomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)，以及Na₂-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)和它们的突变体、截短和杂合启动子。

在酵母宿主中，有用启动子得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它酵母宿主细胞的有用启动子如Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8：423-488所述。

所述调控序列还可以是一种适宜的转录终止子序列，为由宿主细胞识别用于终止转录的序列。终止子序列可操作地连接到编码枯草杆菌酶的核酸序列的3’末端。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的终止子可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

优选的酵母宿主细胞终止子得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的酵母宿主细胞的终止子。

所述调控序列还可以是适宜的先导序列，为对宿主细胞翻译重要的mRNA非翻译区。所述先导序列可操作地连接到编码多肽的核酸序列的5’末端。任何在所选择的宿主细胞内发挥功能的先导序列可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的先导序列得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

适宜的酵母宿主细胞先导序列得自以下来源的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

所述调控序列还可以是聚腺苷酸化序列，该序列可操作地连接到核酸序列的3’末端且在转录时被宿主细胞识别为一种将聚腺苷残基加至被转录的mRNA的信号的序列。任何在所选择的宿主细胞中发挥功能的聚腺苷酸化序列可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列得自以下来源的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列如由Guo和Sherman，1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990所描述。

所述的调控序列还可以是信号肽编码区，其编码连接到枯草杆菌酶的氨基末端的氨基酸序列并指导所编码的枯草杆菌酶进入细胞分泌途径。所述核酸序列的编码序列的5’端本身可以包含一个天然连接在具有编码所分泌的枯草杆菌酶的编码区节段的翻译读框上的信号肽编码区。可选择地，所述编码序列的5’端可以包含此编码序列的外源信号肽编码区。当所述的编码序列并不天然包含一个信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。可选择地，所述的天然信号肽编码区可用外源信号肽编码区简单替换以促进枯草杆菌酶的分泌。但任何可指导所表达的枯草杆菌酶进入所选择的宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区均可用于本发明。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自以下来源的基因的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。其它的信号肽如在以下文献中所述：Simonen和Palva，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57：109-137。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是得自以下基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。

酵母宿主细胞的有用信号肽得自以下来源的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的信号肽编码区。

所述调控序列还可以是编码位于枯草杆菌酶氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽已知是一种酶原或前多肽(或在某些情况下为酶原)。前多肽一般没有活性，并可以通过催化切割或自身催化切割来自前多肽的前肽而转化为成熟的活性多肽。所述的前肽编码区可以得自以下来源的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)。

当在枯草杆菌酶的氨基末端存在信号肽和前肽区两者时，所述的前肽区与枯草杆菌酶的氨基末端相邻，所述的信号肽区与所述前肽区的氨基末端相邻。

加入对与宿主细胞生长相关的多肽的表达进行调节的调控序列也是有利的。那些调控系统的实例是其对化学或物理刺激物(包括存在的调节化合物)的应答可以使得基因的表达被开启或关闭的系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用作调控序列。调控序列的其它实例为允许基因扩增的调控序列。在真核系统中，它们包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核酸序列可操作地与调控序列连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的核酸构建体、启动子和转录与翻译终止信号的重组表达载体。

包含编码本发明酶的核酸构建体的重组表达载体可以是任何可方便地进行重组DNA操作的载体。

载体的选择一般取决于它将被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体而存在的载体，这种载体的复制独立于染色体的复制，如质粒。

另外，所述载体可以是在导入宿主细胞后，被部分或全部整合入宿主细胞基因组，并与将其整合进去的染色体一起复制。

所述载体优选为这样的表达载体，其中，编码本发明的酶的DNA序列可操作地与其它的DNA转录所需的节段相连接。一般来说，所述表达载体来自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。术语“可操作地连接”指将所述诸节段以使其按它们的预期目的发挥功能的方式排列，如转录是在启动子中引发并通过编码此酶的DNA序列而前行。

所述的启动子可以是任何在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的DNA序列，并可以得自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质编码基因。

用于细菌宿主细胞的适宜的启动子的实例包括以下基因的启动子：嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或噬菌体λ-P_R或P_L启动子或大肠杆菌lac、trp或tac启动子。

如果需要，编码本发明酶的DNA序列还可以可操作地连接到适宜的终止子上。

本发明的重组载体还可包含能够使所述载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。

所述载体还可以包含可选择的标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因，或编码如对抗生素像卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等的抗性，或对重金属或除草剂的抗性的基因。

为了指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也公知为先导序列、前原序列或前序列)。可以将分泌信号序列以正确读框连接到编码酶的DNA序列。分泌信号序列一般位于编码此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信号序列可以是通常与该酶相关的或来自编码另一种分泌蛋白质的基因。

用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列，或通过适宜的PCR扩增方案组配这些序列和将它们插入至含有复制或整合所需信息的适宜的载体的方法对本领域技术人员来说是已知的(参见例如，Sambrook等人，在所引述的文章中)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

导入到宿主细胞中的编码本发明的酶的DNA序列可以与所讨论的宿主同源或异源。如果与所述宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，编码本发明的酶的DNA序列一般可操作地与非天然环境中存在的另一启动子序列相连接，或者在可应用的情况下与另一分泌信号序列和/或终止子序列相连接。所用术语″同源″指包括编码天然存在于所讨论的宿主生物体中的酶的DNA序列。所用术语“异源的”是指包括在所述宿主细胞中本身不表达的酶的DNA序列。因此所述的DNA序列可以来源于另一生物体或者是合成的序列。

导入本发明的DNA构建体或重组载体的宿主细胞包括任何能够产生本发明的酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞，包括植物。

通过培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌菌株，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，特别是克劳氏芽孢杆菌，或链霉菌菌株，如变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。

所述细菌的转化可以通过已知的方式用原生质体转化、电穿孔、接合或使用感受态细胞进行(参见Sambrook等人，见上)。

当在细菌如大肠杆菌中表达所述的酶时，该酶一般以非溶解性颗粒驻留于细胞质中(已知称作包涵体)，或由细菌分泌序列引导到周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收所述颗粒，变性，其后通过稀释变性试剂使酶重新折叠。后一种情况下，该酶通过以下操作回收：如超声或渗透压休克破坏细胞，使所述的周质间隙的内容物释放，再回收该酶。

当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，该酶可以驻留于细胞质中，或由细菌分泌序列引导到胞外培养基中。在后一种情况下，该酶可按下述方法从培养基中回收。

生产本发明的枯草杆菌酶的方法

本发明进一步涉及生产本发明的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

a)在有益于所述枯草杆菌酶生产的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和

b)回收所述的枯草杆菌酶。

当含编码所述酶的DNA序列的表达载体转化入异源宿主细胞中时即可使本发明的该酶异源重组产生。

由此可以生产以不含同源杂质为特征的的高度纯化的枯草杆菌酶组合物。

本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明的酶的同源细胞的任何杂质(例如除本发明的酶之外的其他多肽)。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的枯草杆菌酶可方便地分泌到培养基中，然后可以通过已知的方法回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，再利用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，接下来进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。

本发明也涉及生产本发明的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

(a)培养来自芽胞杆菌属的菌株以产生包含枯草杆菌酶的上清；和

(b)回收该枯草杆菌酶。

优选地，菌株为克劳氏芽孢杆菌种，且更优选地为克劳氏芽孢杆菌DSM 13585。

在本发明的产生方法中，使用本领域公知的方法将细胞培养在适于产生枯草杆菌酶的营养培养基中。如可通过摇瓶培养，在实验室或工业发酵罐中于合适的培养基中并在使得该枯草杆菌酶可表达和/或分离的条件下进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、馈料分批或固态发酵)培养细胞。在包含碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域公知的方法进行培养。合适的培养基可购得或可根据公开的成分制备(如在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果该枯草杆菌酶分泌至营养培养基中，则可直接从培养基中回收该枯草杆菌酶。如果该多肽不分泌，则从细胞裂解物中回收该多肽。

可用本领域公知的、特异用于该多肽的方法检测枯草杆菌酶。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。如可使用酶测试法来确定此处所述多肽的活性。

所得的枯草杆菌酶可用本领域公知的方法回收。如可通过常规方法从营养培养基回收枯草杆菌酶，其中所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的枯草杆菌酶可通过本领域公知的多种方法纯化，这些方法包括但不限于层析法(如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦色谱和尺寸排阻)、电泳法(如制备等电聚焦电泳)、不同的溶解度(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取法(参见如蛋白质纯化(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，纽约，1989)。

本发明的枯草杆菌酶的用途

本发明的枯草杆菌酶可以有多种工业用途，尤其是在洗涤剂工业中。因此本发明还涉及包含本发明枯草杆菌酶的清洁或洗涤剂组合物，优选地为包含本发明枯草杆菌酶的洗衣或洗盘组合物，尤其是自动洗盘组合物。

一般来说，清洁和洗涤剂组合物已在本领域中有所描述，对合适的清洁和洗涤剂组合物的进一步描述可以参见WO 96/34946；WO97/07202；WO 95/30011。

而且此处所述的实例表明本发明的枯草杆菌酶对卵污渍所表现出的优越的洗涤性能。

洗涤剂组合物

本发明的酶可以添加到清洁或洗涤剂组合物中而成为其中的组分。

例如，本发明的洗涤剂组合物可以制成用于手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适用于预处理污染织物的洗涤添加剂组合物和漂洗添加的纤维软化剂组合物，或制成用于清洁普通家具硬表面的洗涤剂组合物，或被制成用于手洗或机洗的洗盘操作。

在一特定的方面，本发明提供一种包含本发明的枯草杆菌酶的洗涤添加剂。所述的洗涤添加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶如另一种蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶、例如漆酶，和/或过氧化物酶。

一般来说，所选择的酶的性能应当与所选择的洗涤剂相适应(即pH-最适宜，与其它酶或非酶组分具相容性等)，且所述的酶应以有效剂量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括来自动物、植物、微生物的蛋白酶。来源于微生物的蛋白酶是优选的。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。所述的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所公开的镰孢霉属的蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生替换的变体：27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。

优选的可商购的蛋白酶包括Alcalase^TM，Savinase^TM，Primase^TM，Duralase^TM，Esperase^TM和Kannase^TM(Novozymes A/S)，Maxatase^TM，Maxacal^TM，Maxapem^TM，Properase^TM，Purafect^TM，Purafect OxP^TM，FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的脂肪酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括如EP258 068和EP 305 216中所公开的来自腐质霉属(Thermomyces与之同物异名)，例如来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶或如WO96/13580中所公开的来自H.Insolens的脂肪酶，假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.Alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.Pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.Cepacia)(EP 331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.Fluorescens)，假单胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)，芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学学报(Biochemica etBiophysica Acta)，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)。

其它的实例为如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所公开的脂肪酶变体。

优选的可商购的脂肪酶包括LipolaseTM和LipolaseUltra^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些来源于细菌或真菌的淀粉酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如来源于芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌的特定菌株，详细内容参见GB 1,296,839。

有用的淀粉酶的实例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的变体，尤其是那些在一个或多个下列位置发生替换的变体：15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM，Termamyl^TM，Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)，Rapidase^TM和Pu rastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。也包括其经化学修饰或蛋白工程突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、草根霉属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如可由在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US5,776,757和WO 89/09259中公开的Humicola insolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的所述真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优势的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例为如EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公开的纤维素酶。其它的实例为如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公开的纤维素酶变体。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(NovozymesA/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些来源于植物、细菌或真菌的过氧化物酶/氧化酶。也包括化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括如WO 93/24618，WO 95/10602和WO 98/15257所述的来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))和其变体的过氧化物酶。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

所述的洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂形式为颗粒状(特别是非粉末化颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或浆。

非粉末化颗粒可依照例如US 4,106,991和4,661,452所述进行生产并可任选地用已知的方法包被。蜡状包被材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜包被材料的实例。液体酶制剂可以依照现成的方法通过例如添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依照EP 238,216中所公开的方法进行制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、粘团或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或不含水的。

所述的洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子表面活性剂，包括半极性的和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。所述的表面活性剂一般占到0.1％到60％的重量。当包含在所述洗涤剂中时，通常包含约1％到约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸酯、α-烯属磺酸酯、硫酸烷基酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲链烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。

当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0.2％到约40％的非离子表面活性剂例如乙氧基化脂肪醇、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

所述的洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂增洁剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。

所述的洗涤剂还可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。

所述的洗涤剂还可以含有可能包含H₂O₂来源的漂白体系，如可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐结合的过硼酸盐或过碳酸盐。可选择地，所述的漂白体系可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定：多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物也可制备为如WO 92/19709和WO 92/19708中所述的组合物。

所述的洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分例如纤维调节剂包括黏土、增泡剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、助溶剂、失泽抑制剂或香料。

目前认为在所述洗涤剂组合物中任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液中具有0.01-100mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，特别优选每升洗涤液中具有0.1-1mg酶蛋白质的量加入。

本发明的酶可以添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂配方中，该文献引入本文作为参考。

通过下述的实例对本发明进行较详细说明，这些实例不作为对本发明请求保护范围的任何限制。

在洗涤剂组合物中，简写成分的意义如下：

LAS：        直链C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS：        牛油烷基硫酸钠

XYAS：       C_1x-C_1y烷基硫酸钠

SS：         式2-丁基辛酸的仲皂化表面活性剂

25EY：       与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₂-C₁₅的

             直链伯醇

45EY：       与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C₁₄-C₁₅

             的直链伯醇

XYEZS：      每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C_1x-C_1y烷基

             硫酸钠

非离子：     平均乙氧基化程度3.8而平均丙氧基化程度为4.5

             的C₁₃-C₁₅混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由

             BASF GmbH售出，商品名为Plurafax LF404

CFAA：       C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺

TFAA：       C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖酰胺

硅酸盐：     无定型硅酸钠(SiO₂∶Na₂O比率＝2.0)

NaSKS-6：    分子式为δ-Na₂Si₂O₅的晶状多层硅酸盐

碳酸盐：     无水碳酸钠

磷酸盐：     三磷酸钠

MA/AA：      1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约为80,000

聚丙烯酸酯： 平均分子量为8,000的聚丙烯酸酯均聚物，由BASF

             GmbH销售，商品名为PA30

沸石A：      基本颗粒大小在1-10微米范围内的分子式为Na₁₂

             (AlO₂SiO₂)₁₂·27H₂O的水合硅铝酸钠

柠檬酸盐：   二水合三柠檬酸钠

Citric：     柠檬酸

过硼酸盐：   无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为

             NaBO₂·H₂O₂

PB4：        无水过硼酸钠四水合物

过碳酸盐：   经验式为2Na₂CO₃·3H₂O₂的无水过碳酸钠漂白剂

TAED：       四乙酰基乙二胺

CMC：        羧甲基纤维素钠

DETPMP：     二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto出售，

             商品名为Dequest 2060

PVP：        聚乙烯吡咯烷酮聚合物

EDDS：       钠盐形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]异构体

抑泡剂：     25％固体石蜡，熔点温度50℃，17％疏水硅石，

             58％石蜡油

粒状抑泡剂： 12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％粒状淀粉

硫酸盐：     无水硫酸钠

HMWPEO：     高分子量聚环氧乙烷

TAE 25：        乙氧基化牛油醇(25)

洗涤剂实例I

本发明的粒状纤维清洁组合物可如下制备：

直链C₁₂烷基苯磺酸钠        6.5

硫酸钠                     15.0

沸石A                      26.0

次氮基三乙酸钠             5.0

酶                         0.1

PVP                        0.5

TAED                       3.0

硼酸                       4.0

过硼酸盐                   18.0

苯酚磺酸盐                 0.1

次要组分                   补充至100％

                                             

洗涤剂实例II

本发明的致密颗粒纤维清洁组合物(密度800g/l)可依照下述制备：

                                         

45AS                         8.0

25E3S                        2.0

25E5                         3.0

25E3                         3.0

TFAA                         2.5

沸石A                        17.0

NaSKS-6                      12.0

柠檬酸                       3.0

碳酸盐                       7.0

MA/AA                        5.0

                                            

                                

CMC                       0.4

酶                        0.1

TAED                      6.0

过碳酸盐                  22.0

EDDS                      0.3

粒状抑泡剂                3.5

水/次要组分               补充至100％

                                          

洗涤剂实例III

本发明的对洗涤彩色织物特别有用的粒状织物清洁组合物可依照下述制备：

                                               

LAS                        10.7          -

TAS                        2.4           -

TFAA                       -             4.0

45AS                       3.1           10.0

45E7                       4.0           -

25E3S                      -             3.0

68E11                      1.8           -

25E5                       -             8.0

柠檬酸                     15.0          7.0

碳酸盐                     -             10.0

柠檬酸                     2.5           3.0

沸石A                      32.1          25.0

Na-SKS-6                   -             9.0

MA/AA                      5.0           5.0

DETPMP                     0.2           0.8

酶                         0.10          0.05

硅酸盐                     2.5           -

硫酸盐                     5.2           3.0

                                                   

                                                           

PVP                                 0.5        -

聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基    -          0.2

咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物

过硼酸盐                            1.0        -

苯酚磺酸盐                          0.2        -

水/次要组分                         补充至100％

                                                     

洗涤剂实例IV

本发明的提供“洗涤过程中的软化处理”能力的粒状织物清洁组合物可依照下述制备：

                                                

45AS                        -            10.0

LAS                         7.6          -

68AS                        1.3          -

45E7                        4.0          -

25E3                        -            5.0

椰油-烷基-二甲基羟          1.4          1.0

基乙基氯化铵

柠檬酸盐                    5.0          3.0

Na-SKS-6                    -            11.0

沸石A                       15.0         15.0

MA/AA                       4.0          4.0

DETPMP                      0.4          0.4

过硼酸盐                    15.0         -

过碳酸盐                    -            15.0

TAED                        5.0          5.0

绿土黏土                    10.0         10.0

HMWPEO                      -            0.1

酶                          0.10         0.05

硅酸盐                      3.0          5.0

                                               

                                           

碳酸盐                 10.0        10.0

粒状抑泡剂             1.0         4.0

CMC                    0.2         0.1

水/次要组分            补充至100％

                                           

洗涤剂实例V

本发明的强力液体织物清洁组合物可依照下述制备：

                                                    

酸式LAS                          -          25.0

柠檬酸                           5.0        2.0

酸式25AS                         8.0        -

酸式25AE2S                       3.0        -

25AE7                            8.0        -

CFAA                             5          -

DETPMP                           1.0        1.0

脂肪酸                           8          -

油酸                             -          1.0

乙醇                             4.0        6.0

丙二醇                           2.0        6.0

酶                               0.10       0.05

椰油-烷基二甲基羟基乙基氯化铵    -          3.0

绿土黏土                         -          5.0

PVP                              2.0        -

水/次要组分                      补充至100％

                                                  

粉末自动洗盘组合物I

非离子表面活性剂	0.4-2.5％
		硅酸钠	0-20％
二硅酸钠	3-20％

三磷酸钠	20-40％
		碳酸钠	0-20％
过硼酸钠	2-9％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	1-4％
硫酸钠	5-33％
		酶	0.0001-0.1％

粉末自动洗盘组合物II

非离子表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	1-2％
		二硅酸钠	2-30％
碳酸钠	10-50％
		磷酸钠	0-5％
柠檬酸三钠二水合物	9-30％
		乙酸次氮基三钠(NTA)	0-20％
过硼酸钠一水合物	5-10％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	1-2％
聚丙烯酸盐聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％
		酶	0.0001-0.1％
香料	0.1-0.5％
		水	5-10

粉末自动洗盘组合物III

非离子表面活性剂	0.5-2.0％
		二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％
		碳酸钠	0-29％
碳酸氢钠	0-20％

一水合过硼酸钠	0-15％
		四乙酰基乙二胺(TAED)	0-6％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
		黏土	1-3％
聚氨基酸	0-20％
		聚丙烯酸钠	0-8％
酶	0.0001-0.1％

粉末自动洗盘组合物IV

非离子表面活性剂	1-2％
		沸石MAP	15-42％
二硅酸钠	30-34％
		柠檬酸钠	0-12％
碳酸钠	0-20％
		过硼酸钠一水合物	7-15％
四乙酰基乙二胺(TAED)	0-3％
		多聚物	0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
		有机磷酸脂	0-4％
黏土	1-2％
		酶	0.0001-0.1％
硫酸钠	平衡

粉末自动洗盘组合物V

非离子表面活性剂	1-7％
		二硅酸钠	18-30％
柠檬酸三钠	10-24％

碳酸钠	12-20％
		单过硫酸盐(2KHSO<sub>5</sub>·KHSO<sub>4</sub>·K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)	15-21％
漂白稳定剂	0.1-2％
		马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％
二亚乙基三胺五乙酸五钠盐	0-2.5％
		酶	0.0001-0.1％
硫酸钠，水	平衡

粉末和液体的具洗涤表面活性剂系统的洗盘组合物VI

非离子表面活性剂	0-1.5％
		十八烷基二甲基胺N-氧化物二水合物	0-5％
十八烷基二甲基胺N-氧化物二水合物和十六烷基二甲基胺N-氧化物二水合物的80∶20wt.C<sub>18</sub>/C<sub>16</sub>混合物	0-4％
		无水十八烷基双(羟乙基)N-氧化物和无水十六烷基双(羟乙基)胺N-氧化物的70∶30wt.C<sub>18</sub>/C<sub>16</sub>混合物	0-5％
平均乙氧基化程度为3的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>烷基乙氧基硫酸酯	0-10％
		平均乙氧基化程度为3的C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub>烷基乙氧基硫酸酯	0-5％
平均乙氧基化程度为12的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基化的醇	0-5％
		平均乙氧基化程度为9的C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基化醇混合物	0-6.5％
平均乙氧基化程度为30的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基化醇混合物	0-4％
		二硅酸钠	0-33％
三磷酸钠	0-46％

柠檬酸钠	0-28％
		柠檬酸	0-29％
碳酸钠	0-20％
		过硼酸钠一水合物	0-11.5％
四乙酰基乙二胺(TAED)	0-4％
		马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％
硫酸钠	0-12.5％
		酶	0.0001-0.1％

非水的液态自动洗盘组合物VII

液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		碱金属硅酸盐	3.0-15.0％
碱金属磷酸盐	20.0-40.0％
		选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液体载体	25.0-45.0％
稳定剂(例如磷酸和C<sub>16</sub>-C<sub>18</sub>链烷醇的不完全酯)	0.5-7.0％
		泡沫抑制剂(例如硅氧烷)	0-1.5％
酶	0.0001-0.1％

非水的液态洗盘组合物VIII

液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
		硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％
		柠檬酸钠	0.0-1.5％
稳定系统(例如细粒硅氧烷和低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)	0.5-7.0％
		低分子量聚丙烯酸酯聚合物	5.0-15.0％

黏土凝胶增稠剂(例如斑脱土)	0.0-10.0％
		羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％
酶	0.0001-0.1％
		选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物和乙二醇醚的液体载体	平衡量

触变性液体自动洗盘组合物IX

C<sub>12</sub>-C<sub>14</sub>脂肪酸	0-0.5％
		嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％
		三磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％
		三硬脂酸铝	0-0.1％
枯烯磺酸钠	0-1.7％
		聚丙烯酸盐增稠剂	1.32-2.5％
聚丙烯酸钠	2.4-6.0％
		硼酸	0-4.0％
甲酸钠	0-0.45％
		甲酸钙	0-0.2％
正癸基二苯基氧化物二磺酸钠	0-4.0％
		一乙醇胺(MEA)	0-1.86％
氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％
		1，2-丙二醇	0-9.4％
酶	0.0001-0.1％
		抑泡剂、染料、香料、水	平衡量

液体自动洗盘组合物X

脂肪醇乙氧基化物

0-20％

脂肪酸酯磺酸酯	0-30％
		十二烷基硫酸钠	0-20％
烷基多苷	0-21％
		油酸	0-10％
二硅酸钠一水合物	18-33％
		柠檬酸钠二水合物	18-33％
硬脂酸钠	0-2.5％
		过硼酸钠一水合物	0-13％
四乙酰基乙二胺(TAED)	0-8％
		马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％
酶	0.0001-0.1％

含被保护的漂白颗粒的液体自动洗盘组合物XI

硅酸钠	5-10％
		焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％
		碳酸钾	4-8％
被保护的漂白颗粒，如氯	5-10％
		聚合增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％
		酶	0.0001-0.1％
水	平衡

XII：如I、II、III、IV、VI和X所述的自动洗盘组合物，其中，由过碳酸盐替代过硼酸盐。

XIII：如I-VI所述的自动洗盘组合物，其还含有锰催化剂。所述的锰催化剂可以是例如，在“用于低温漂白的高效锰催化剂”(“Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching”)，自然，(1994)，369，637-639中所述的化合物中的一种。

材料和方法

蛋白水解活性

在本发明的上下文中蛋白水解活性是用Kilo NOVO蛋白酶单位(KNPU)表示的。所述的活性相对于酶标准品(SAVINASE

)而确定，所述的测定是基于在标准条件下蛋白水解酶对二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化进行的，所述的标准条件为50℃，pH 8.3，反应时间9分钟，测定时间3分钟。需要时可向Novozymes A/S，Denmark索取AF 220/1文件夹，该文件夹包括在此作为参考。

GU是甘氨酸单位，定义为蛋白水解酶活性，在标准条件下，N-乙酰基酪蛋白作为底物在40℃温育15分钟，产生相当于1毫摩尔甘氨酸的NH₂-基团量。

也可以用PNA试验根据与在美国油脂化学家学会会志(Journal ofAmerican Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，L.A.，(1988)中描述的底物琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-对硝基苯酚反应测定酶活性。

实施例1a-芽孢杆菌属菌株的分离和纯化

克劳氏芽孢杆菌菌株(DSM保藏号：DSM 13585)分离自于美国Sedona，AZ采集的土壤样本。将该土壤播撒在具TY-琼脂(见下面)和0.1M碳酸氢三钠的琼脂平板表面，并再次分离37℃培养2天后出现的菌落，将该纯培养物转移至具100ml PS-1培养基(见下面)和0.1M碳酸氢三钠的500ml摇瓶中。

摇瓶在摇床上于300转/分钟30℃培养4天。接下来收获并纯化枯草杆菌酶(见下面的实施例1b)。

TY-琼脂：

胰酶解酪蛋白                20g

酵母提取物                  5g

FeCl₂，4H₂O            1％的溶液(w/v)0.6ml

MnCl₂，4H₂O            1％的溶液(w/v)0.1ml

MgSO₄，4H₂O            1％的溶液(w/v)1.5ml

蒸馏水                 1000ml

Merck琼脂              20g

用4N KOH调节pH至7.3，然后高压灭菌20分钟。

PS-1培养基：

蔗糖                          100g

大豆粉                        40g

Na₂HPO₄，12H₂O                10g

泊洛尼克(Pluronic)PE 6100     0.1ml

自来水                        1000ml

混合成分并搅匀。然后将100ml培养基装入500ml带挡板的摇瓶并高压灭菌。

实施例1b-枯草杆菌酶的分离和纯化

用1升的烧杯于5000转/分钟离心约1.6升发酵肉汤(来自实施例1a)35分钟。用10％醋酸将上清调节至pH 7，并通过Seitz Supra S100过滤板过滤。

室温下将滤液加至100ml杆菌肽琼脂糖亲和柱(UpfrontChromatography A/S)，其中所述亲和柱已使用氢氧化钠调节至pH 7的含0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液(缓冲液A)平衡。用缓冲液A洗涤柱子去除未结合的蛋白质后，使用补充有25％异丙醇和1M氯化钠的缓冲液A将枯草杆菌酶从该杆菌肽柱洗脱。

合并来自杆菌肽纯化步骤的具蛋白酶活性的级分，并加至已用缓冲液A平衡的750ml Sephadex G25柱(Amersham Pharmacia Biotech)。

合并来自Sephadex G25柱的具蛋白水解活性的级分，用10％醋酸将pH调节至pH 6，并加至已使用氢氧化钠调节至pH 6的含0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡过的150ml CMSepharose CL 6B阳离子交换柱(Amersham Pharmacia Biotech)。

在2升同一缓冲液中使用0-0.2M氯化钠的线性梯度洗脱枯草杆菌酶。最后合并来自CM Sepharose柱的含该蛋白酶的级分，并通过0.2μ的滤器过滤。

实施例1c-序列测定

对编码本发明枯草杆菌酶的DNA已进行了扩增，扩增为从分离自克劳氏芽孢杆菌HSB10菌株(DSM保藏号：DSM 13585)的DNA使用与WO89/06279中所述的克劳氏芽孢杆菌NCIB 10309的aprH309基因具同源性的寡核苷酸通过PCR法扩增(进行了25个PCR循环，每一循环为92℃变性60秒，58℃退火30秒并于72℃延伸90秒)。

N端引物(5′-AAT AGA GCT CAC CAG CTT GGA CAA GTT GG-3′)与ATG起始密码子上游的20至40碱基对退火，且C端引物(5′-TTT GGATCC ATA CAC AAA AAA ACG CTG TGC CC-3′)与TAA终止密码子下游的30至50bp退火。

DNA和蛋白质序列(SEQ ID NO.1和2)从PCR片段推导出的。

实施例1d-在克劳氏芽孢杆菌中的表达

优化了本发明枯草杆菌酶的表达，通过将在读码框内与克劳氏芽孢杆菌(以前称为迟缓芽孢杆菌)(WO 89/06279)aprH309基因的信号序列连接的该枯草杆菌酶基因的前序列和成熟部分插入衍生物克劳氏芽孢杆菌NCIB 10309的染色体。整合是这样进行的，将最初apr基因的前序列和成熟部分从克劳氏芽孢杆菌染色体删除，并用编码本发明酶的基因的前序列和成熟部分替换之。

插入至染色体是通过在该新apr基因侧翼加上aprH309基因的DNA片段而进行的。来自aprH309的这两段DNA片段由紧挨着信号切割位点上游的500bp(与本发明酶的前序列在读码框内)和紧挨着TAA终止密码子下游的500bp组成。将侧翼为这两段500bp aprH309序列的枯草杆菌酶片段插入温度敏感型pE194质粒的cat衍生物。该重组质粒通过原生质体转化法转化克劳氏芽孢杆菌(Akamatzu，T等人，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)1984，48卷：651-655页)(HCP 1.5再生板中的pH通过加入0.05M碳酸钠缓冲液调节至pH 9)。克劳氏芽孢杆菌转化子再生后，通过同源重组将质粒插入染色体，于48℃选择对10μg/ml氯霉素的抗性。通过降低温度至30℃且无氯霉素选择时，质粒偶尔会从染色体丢失，留下了枯草杆菌酶插入物。在具有蛋白酶表型且对10μg/ml氯霉素无抗性的菌落中，分离细胞并使用枯草杆菌酶基因的特异性引物通过PCR进行分析和选择。用引物(5′-AAT AGA GCT CAC CAG CTT GGA CAA GTT GG-3′)和引物(5′-TTT GGA TCC ATA CAC AAA AAA ACG CTG TGC CC-3′)进行PCR，得到了覆盖整个编码区的DNA片段，并对其测序。所推导出的氨基酸序列与本发明的成熟枯草杆菌酶相同。

实施例2-“标准的洗涤剂洗涤性能试验”

为评估枯草杆菌酶在标准洗涤剂组合物中的洗涤性能，用下述的实验条件进行了标准洗涤实验：

洗涤剂：              标准洗涤剂

洗涤剂剂量            4.0g/l

pH                    10.1

洗涤时间              20分钟

温度：                30℃

水硬度：              15°dH

酶浓度：              10nm(在洗涤剂溶液中)

测试系统：            10ml烧杯和搅拌棒

织物/体积：           5件织物(

2.5cm)/50ml洗涤剂溶液

测试材料：            WFK10N(卵污渍)

所述的标准洗涤剂的组分如下：

6.2％       LAS(Nansa 80S)

2％         C₁₆-C₁₈脂肪酸钠盐

4％         非离子表面活性剂(Plurafax LF404)

22％        沸石P

10.5％      Na₂CO₃

4％         Na₂Si₂O₅

2％         羧甲基纤维素(CMC)

6.8％       丙烯酸盐液体CP5 40％

20％        过硼酸钠(经验式NaBO₂·H₂O₂)

0.2％       EDTA

21％        Na₂SO₄

            水(平衡量)

通过向测试系统中添加HCl或NaOH将洗涤剂溶液的pH调节到10.1。通过添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺∶Mg²⁺＝4∶1)将水硬度调节到15°dH。洗涤后将织物用自来水冲洗并于空气中干燥。

对试验材料反射能力(R_{枯草杆菌酶})的测定是用Macbeth ColorEye 7000photometer(Macbeth，Division of Kollmorgen InstrumentsCorporation，德国)在460nm下进行的。测定方法依制造商的建议进行。

为确定空白值，进行了不添加酶的类似洗涤实验。接下来如上述进行反射能力(R_空白)的测定。

然后如上所述进行参考实验，其中测定了Savinase

的洗涤性能。接下来，如上所述测定了反射能力(R_savinase)。

所述的洗涤性能是用根据下述公式定义的性能因子(P)进行评估的：

P＝(R_{枯草杆菌酶}-R_空白)-(R_savinase-R_空白)

 ＝R_{枯草杆菌酶}-R_savinase

实施例3-″卵抑制测定″

下列抑制试验基于的原理是待试验的枯草杆菌酶将催化肽-pNA键的水解，因此释放黄色的pNA，其在405nm处可方便地检测。在一段给定的时间后释放的pNA量为对枯草杆菌酶活性的直接测定值。分别在存在或不存在抑制剂时实施此类水解实验，可获得某种枯草杆菌酶被抑制的程度的定量测定值。

反应条件：

酶浓度：                        0.0003mg/ml

胰蛋白酶抑制剂类IV-0的浓度：    0.0015mg/ml

起始底物浓度：                  0.81mM

反应时间：                      11分钟

试验温度：                      25℃

试验pH：                        8.6

吸收的测定波长在：              405nm处

试验溶液：

底物溶液(2mM)：将500mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶于4mlDMSO(200mM)。用下述缓冲液将该溶液稀释100倍。在所得底物溶液中底物浓度为2mM。

抑制剂溶液(0.005mg/ml)：将5mg胰蛋白酶抑制剂类IV-0(SigmaT-1886)溶于10ml水。用下述缓冲液将该溶液稀释100倍。在所得抑制剂溶液中抑制剂浓度为0.005mg/ml。

酶溶液(0.001mg/ml)：将1mg酶溶于10ml水。用下述缓冲液将该溶液稀释100倍。在所得酶溶液中酶浓度为0.001mg/ml。

缓冲液(pH 8.6)：将15.7mg Tris溶于适量水中，并加入0.75ml 30％(w/v)BRIJ(BRIJ 35聚氧乙烯十二烷基醚，30％(w/v)，Sigma目录号430AG-6)。用4M NaOH将pH调节至8.6，并用水稀释该溶液至1升。。

存在抑制剂的试验

将1体积单位(如80μl)抑制剂溶液与1体积单位(如80μl)酶溶液在合适的反应容器(如分光光度计小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分钟。向该反应容器中加入1.375体积单位(如110μl)底物溶液，此后于405nm处测定吸收值11分钟(如每10秒或每30秒测定一次)。用线性回归分析计算吸收曲线的斜率。吸收曲线的斜率表示为α_抑制剂。

不存在抑制剂的试验

将1体积单位(如80μl)缓冲液与1体积单位(如80μl)酶溶液在合适的反应容器(如分光光度计小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分钟。向该反应容器中加入1.375体积单位(如110μl)底物溶液，此后于405nm处测定吸收值11分钟(如每10秒或每30秒测定一次)。用线性回归分析计算吸收曲线的斜率。吸收曲线的斜率表示为α。

空白

将1体积单位(如80μl)抑制剂溶液与1体积单位(如80μl)缓冲液在合适的反应容器(如分光光度计小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分钟。向该反应容器中加入1.375体积单位(如110μl)底物溶液，此后于405nm处测定吸收值15分钟。这些测定值不用于计算，仅用作缓冲液和/或底物溶液中没加入酶的对照。

剩余活度(RA)的计算

根据下列式子计算酶剩余活度(RA)：

RA＝(α_抑制剂/α)x100％

用上述试验获得了下列结果：

枯草杆菌酶                        RA(％)

                                          

SEQ ID NO：1                      38

Savinase＜5

                                                   

如所示的那样，本发明的枯草杆菌酶与结构类似的枯草杆菌酶Savinase

相比，前者的被抑制程度远小于后者。

生物材料的保藏

下述生物材料根据布达佩斯条约的规定保藏在德意志微生物保藏中心Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124 Braunschweig，德国，并获得了下述保藏号：

保藏物                保藏号           保藏日期

                                                   

克劳氏芽孢杆菌HSB10   DSM 13585        2000年7月5日

                                                  

                        序列表

<110>诺和酶股份有限公司

<120>枯草杆菌酶

<130>10065.000

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1143

<212>DNA

<213>克劳氏芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1140)

<220>

<221>mat_肽

<222>(334)..(1140)

<400>1

atg aat aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc act gca cta ctt att  48

Met Asn Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

    -110               -105                -100

tct gtc gct ttt agt tca tcg att gca tcg gct gct gaa gaa gca aaa  96

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys

-95                 -90                 -85                 -80

gaa aaa tac tta att ggc ttt aat gaa cag gaa gct gtc agt gag ttt  144

Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe

                -75                 -70                 -65

gtc gaa caa gta gat gca aat aat gat gtc gcc gtt ctc tct gag gaa  192

Val Glu Gln Val Asp Ala Asn Asn Asp Val Ala Val Leu Ser Glu Glu

            -60                 -55                 -50

gag gaa gtc gaa att gaa ctg ctt cat gag ttc gaa acc att ccc gtt    240

Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val

        -45                 -40                 -35

tta tca gta gag tta agc cca gaa gat gtg gat acg ctt gaa ctc gat    288

Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Thr Leu Glu Leu Asp

    -30                 -25                 -20

cca gcg att tct tac att gag gaa gat gta gaa gta tcg att atg gct    336

Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Val Glu Val Ser Ile Met Ala

-15                 -10                  -5              -1   1

cag tct gtg cca tgg gga att agc cgt gtg caa gca cct gcc gcc cat    384

Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His

              5                  10                  15

aac cgc gga gtg aca ggt tcc ggt gta aaa gtt gct gtt ctt gat aca    432

Asn Arg Gly Val Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr

         20                  25                  30

ggc att tcc gcc cat cca gac tta aat atc cgc ggc ggt gct agc ttt    480

Gly Ile Ser Ala His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe

     35                  40                  45

gtg aca ggc gag cca acg tat caa gat ggc aat gga cac ggc acg cat    528

Val Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His

 50                  55                  60                  65

gtg gca ggg acg att gcc gct tta aac aat tcg att ggc gtc ctt ggc    576

Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly

                 70                  75                  80

gta gcg cct aat gct gaa cta tac gct gtt aaa gta tta gca gcc aac    624

Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Ala Ala Asn

             85                  90                  95

ggc aga ggc cca gtc agc tca att gcc caa ggg ttg gaa tgg gca gga    672

Gly Arg Gly Pro Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly

        100                 105                 110

aac aat ggc atg gac gtt gcc aac ttg agt tta gga agt cca tcg cca    720

Asn Asn Gly Met Asp Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro

    115                 120                 125

agc gca acg ctt gag caa gcg gtt aat agc gct act tct aga ggc gtc  768

Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val

130                 135                 140                 145

ctt gtc gta gca gca act gga aac tca gga aca ggc tcc ctc gac tac  816

Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Ser Gly Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

                150                 155                 160

cca gct cgt tat gcg aac gct atg gca gtc gga gct act gac caa aac  864

Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn

            165                 170                 175

aac aac cgc gcc agc ttt tct cag tac gga gca ggg ctt gac att gtt  912

Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val

        180                 185                 190

gcg cca ggt gta aac gtg cag agc aca tac cca ggt tca act tac gct  960

Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala

    195                 200                 205

agc ttc aac ggt aca tcg atg gcg act cct cac gtt gtc ggt gta gca  1008

Ser Phe Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Val Gly Val Ala

210                 215                 220                 225

gcc ctt gta aaa caa aaa aac cca tct tgg tcc aat gta caa atc cgc  1056

Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg

                230                 235                 240

aat cat cta aag aat aca gcc aca agt ttg ggt agc acg aac ttg tat  1104

Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr

            245                 250                 255

gga agc ggg ctt gtc aat gca gaa gca gca aca cgc taa              1143

Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

        260                 265

<210>2

<211>380

<212>PRT

<213>克劳氏芽孢杆菌

<400>2

Met Asn Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

    -110               -105                -100

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys

-95                 -90                 -85                 -80

Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe

                -75                 -70                 -65

Val Glu Gln Val Asp Ala Asn Asn Asp Val Ala Val Leu Ser Glu Glu

            -60                 -55                 -50

Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val

        -45                 -40                 -35

Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Thr Leu Glu Leu Asp

    -30                 -25                 -20

Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Val Glu Val Ser Ile Met Ala

-15                 -10                  -5              -1   1

Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His

              5                  10                  15

Asn Arg Gly Val Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr

         20                  25                  30

Gly Ile Ser Ala His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe

     35                  40                  45

Val Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His

 50                  55                  60                  65

Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly

                 70                  75                  80

Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Ala Ala Asn

             85                  90                  95

Gly Arg Gly Pro Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly

        100                 105                 110

Asn Asn Gly Met Asp Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro

    115                 120                 125

Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val

130                 135                 140                 145

Leu Val Val Ala Ala Thr Gly Asn Ser Gly Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

                150                 155                 160

Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn

            165                 170                 175

Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val

        180                 185                 190

Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala

    195                 200                 205

Ser Phe Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Val Gly Val Ala

210                 215                 220                 225

Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg

                230                 235                 240

Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr

            245                 250                 255

Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

        260                 265

Claims (32)

1.枯草杆菌酶，其

a)具有SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列或在SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列中经过替换、缺失和/或插入一个或多个氨基酸而由SEQ ID NO：2中第1-269位氨基酸衍生的氨基酸序列；

b)当进行″卵抑制测定″试验时具有至少15％的剩余活度。

2.根据权利要求1的枯草杆菌酶，其中所述的替换、缺失和/或插入一个或多个氨基酸为替换、缺失和/或插入一个或几个氨基酸。

3.根据权利要求2的枯草杆菌酶，其中所述的一个或几个氨基酸为最多10个氨基酸。

4.根据权利要求1的枯草杆菌酶，其包含如SEQ ID NO：2的第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1的枯草杆菌酶，其由如SEQ ID NO：2的第1-269位氨基酸所示的氨基酸序列组成。

6.根据权利要求1的枯草杆菌酶，其包含至少在下列位置之一的一处修饰：27、36、56、76、87、96、97、98、99、100、101、103、104、120、123、129、131、132、133、143、159、167、170、192、194、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(按BASBPN编号)。

7.根据权利要求6的枯草杆菌酶，其中修饰选自：K27R、^*36D、T56P、N76D、N87S、A97N、A98AT、A98AS、N99ND、N99NR、N99A、N99T、R101G、P103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、D120H、N123S、P129K、P131H、A133P、A133D、A133E、T143K、^*159D、^*159E、Y167X、Y167A、R170X、R170S、A194P、Q206E、F217R、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K和T274A(按BASBPN编号)。

8.根据权利要求7的枯草杆菌酶，其中修饰包含以下任一种修饰：V104N+R101G、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+V104A或R101G+P103A+V104I+^*159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K；或包含这些修饰K27R、N76D、R101G、P103A、V104I、V104N、V104A、V104Y、N123S、^*159D、A232V、Q236H、Q245R、N248D、N252K、T274A与任意一种或多种权利要求6或7所指的修饰组合而成的修饰。

9.根据前面的权利要求中任意一项所述的枯草杆菌酶，其中该枯草杆菌酶-当进行″卵抑制测定″试验时-具有至少20％的剩余活度。

10.根据权利要求9所述的枯草杆菌酶，该枯草杆菌酶-当进行″卵抑制测定″试验时-具有至少25％的剩余活度。

11.根据权利要求10所述的枯草杆菌酶，该枯草杆菌酶-当进行″卵抑制测定″试验时-具有至少30％的剩余活度。

12.根据权利要求11所述的枯草杆菌酶，该枯草杆菌酶-当进行″卵抑制测定″试验时-具有至少35％的剩余活度。

13.分离的核酸序列，其包含编码权利要求1-12中任意一项所定义的枯草杆菌酶的核酸序列。

14.核酸构建体，其包含可操作地与一种或多种调控序列连接的权利要求13所述的核酸序列，其中所述调控序列能指导该枯草杆菌酶在合适宿主中的表达。

15.重组表达载体，其包含权利要求14的核酸构建体、启动子以及转录和翻译终止信号。

16.重组宿主细胞，其包含权利要求14的核酸构建体。

17.根据权利要求16的宿主细胞，其为细菌。

18.根据权利要求17的宿主细胞，其中细菌为芽孢杆菌属细菌。

19.根据权利要求18的宿主细胞，其中芽孢杆菌属细菌为克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)。

20.根据权利要求16的宿主细胞，其为真菌或酵母。

21.根据权利要求20的宿主细胞，其为丝状真菌。

22.根据权利要求21的宿主细胞，其为曲霉属真菌。

23.用于产生根据权利要求1-12中任意一项所述的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

(a)在有益于枯草杆菌酶产生的条件下培养如权利要求16-22中任意一项所定义的重组宿主细胞；和

(b)回收该枯草杆菌酶。

24.用于产生根据权利要求1-12中任意一项所述的枯草杆菌酶的方法，该方法包括：

(a)培养来自克劳氏芽孢杆菌DSM 13585的菌株，以产生包含枯草杆菌酶的上清液；和

(b)回收该枯草杆菌酶。

25.一种清洁或洗涤剂组合物，所述组合物包含权利要求1-12中任意一项所述的枯草杆菌酶。

26.根据权利要求25的组合物，其还包含纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。

27.根据权利要求25或26的组合物，其为洗衣或洗盘组合物。

28.如权利要求1-12中任意一项所定义的枯草杆菌酶在清洁或洗涤剂组合物中的用途。

29.如权利要求1-12中任意一项所定义的枯草杆菌酶用于除去卵污渍的用途。

30.如权利要求25-27中任意一项所定义的清洁或洗涤剂组合物用于除去卵污渍的用途。

31.一种清洁或洗涤硬表面或衣物的方法，所述方法包括使硬表面或衣物与权利要求25-27中任意一项所定义的组合物接触。

32.一种除去硬表面或衣物的卵污渍的方法，所述方法包括使含卵污渍的硬表面或含卵污渍的衣物与权利要求25-27中任意一项所定义的组合物接触。

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