CN101160523A

CN101160523A - 用于处置及处理孔片的装置及方法

Info

Publication number: CN101160523A
Application number: CNA2006800117023A
Authority: CN
Inventors: 纳温·帕蒂拉纳; 斯特万·保罗·托尔托雷拉
Original assignee: Whatman Inc
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2008-04-09
Also published as: WO2006086771A2; US20060182657A1; WO2006086771A3; EP1851534A2; EP1851534A4; AU2006213609A1; CA2597650A1; JP2008530563A

Abstract

本发明提供用于处置及处理包含所研究样品的过滤材料或其他基质的孔片的装置和方法，以防止孔片损失并提高处置简易性。一方面，本发明提供一种装置，其包含一第一元件，所述第一元件可保持孔片，并耦联至一第二元件，其有助于将所述孔片保持在所述第一元件中，在孔片上方和下方有储液管。所述装置和方法可手动用于单通道及多通道格式中或可用于自动化处理器(例如机器人处理器)中。本发明也提供试剂盒。

Description

用于处置及处理孔片的装置及方法

相关申请案交叉参考

本专利申请案主张优先于在2005年2月11日提出申请的美国临时专利申请案第60/652,234号，所述临时专利申请案的名称为″DEVICES AND METHODS FORHANDLING AND PROCESSING PUNCHES(用于处置及处理孔片的装置及方法)″，其全部内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明提供用于处置及处理包含所研究样品的过滤材料或其他基质孔片以防止孔片损失并提高处置简易性的装置和方法。所述装置和方法可手动用于单通道及多通道格式中或可用于自动化处理器，例如机器人处理器中。本发明也提供试剂盒。

背景技术

业内已习知保存核酸或蛋白质的方法，例如通过在过滤材料上、卡片上及其他类型的基质上储存样品。实例包括下述专利中所描述的那些：WO 90/03959(PCT/AU89/00430；于1989年10月3日申请)、WO 96/39813(PCT/AU96/00344；于1996年6月7日申请)、WO 00/21973(PCT/GB99/03337；于1999年10月8日申请)、WO 01/501601(PCT/US01/00640；于2001年1月10日申请)、WO 03/020924(PCT/GB02/04048；于2002年9月5日申请)、PCT/US01/25709(于2001年8月17日申请)、PCT/US03/31483(于2003年10月3日申请)、美国专利第5,496,562号(于1996年3月5日颁予)、美国专利第5,756,126号(于1998年5月26日颁予)、美国专利第5,939,259号(于1999年8月17日颁予)、美国专利第5,972,386号(于1999年10月28日颁予)、美国专利第6,168,922号(于2001年1月2日颁予)、美国专利第6,291,179号(于2001年9月18日颁予)、美国专利第6,645,717号(于2003年11月11日颁予)、美国专利第6,670,128号(于2003年12月30日颁予)、U.S.S.N.09/724,060(于2000年11月28日申请)、U.S.S.N.09/993,736(于2001年11月14日申请)、U.S.S.N.10/326,216(于2002年12月20日申请)、欧洲专利第1119576号(2003年6月11日)、欧洲专利第0849992号(2004年8月25日)和欧洲专利申请案第04076551.3号(于2004年5月20日申请)。

基质可由多种材料制成，包括纤维素、玻璃及其他氧化硅基物质、以及塑胶材料，且可视需要用例如化学组合物处理。在某些情况下，可在保存样品的同时将基质于室温下储存数月。可通过物理、化学或其他相互作用直接或间接地将样品结合或吸附在基质上。然而，过一段时间之后需要对样品加以分析。通常，在含有待分析样品的基质上制造一孔或微孔，同时继续储存基质上样品的其余部分。对某些分析而言，可能不需要分开洗脱或释放(参见例如美国专利第6,750,059号(于2004年6月15日颁予)、美国专利第6,746,841号(于2004年6月8日颁予)、U.S.S.N.10/298,255(于2002年11月15日申请))，但对另外一些分析而言，最好是或必须将核酸或蛋白质分离出来。分离方法包括使用洗脱分离(例如通过加热、通过改变pH或盐浓度)；酶法；光分解；这些方法的组合；或通过其他方法(参见例如WO 01/501601(PCT/US01/00640；于2001年1月10日申请)、PCT/US01/25709(于2001年8月17日申请)、PCT/US02/36483(于2002年11月13日申请)、WO 03/020924(PCT/GB02/04048；于2002年9月5日申请)、美国专利第6,645,717号(于2003年11月11日颁予)、美国专利第6,670,128号(于2003年12月30日颁予))。然而无论是否分离样品，孔片均需要处理。

举例而言，目前用于处理孔片(例如FTA^孔片)的一般方法(其中需要洗脱)如下：

a)自相关样品(例如FTA^CLONESAVER^卡片)上取得一孔片；

b)将孔片置于一管(例如微离心管)中；

c)添加洗涤缓冲液并冲洗孔片；

d)去除洗涤缓冲液(视需要重复步骤(c)及(d))；

e)添加洗脱缓冲液并培养(在室温或更高温度下)；

f)移出洗脱液并丢弃孔片。

步骤(f)中分离的洗脱液将含有所研究材料。所述材料可为核酸(例如基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、总RNA、siRNA、mRNA等)、蛋白质或任何其他所研究材料(例如肽、寡核苷酸等)。

这种处置孔片的方法的缺点包括在液体移出阶段会损失孔片。在湿孔片可能会粘附到移液管尖端的自动化系统中情况尤其如此，特别在没有检测到的情况下。小孔片也可由于静电积累被从管中移开。

过去人们一直在尝试解决处置孔片的问题。也尝试过替代方法。举例而言，Millipore有一个称为ZIPTIP^基于移液管尖端来纯化生物分子的系统。ZIPTIPs^具有通过使用聚合物支架固定在移液管尖端内的色谱介质(氧化硅基)(例如C₁₈、C₄或螯合型树脂)。ZIPTIP^的优势是通过尖端连接到一10μl移液器使得易于用尖端实施处置和处理。将样品抽吸及分配数次以结合所研究物质。然后用洗涤溶液洗涤尖端以去除任何杂质，最终使用适宜的溶剂将所研究物质自尖端洗脱下来。可使用单通道移液器处理一个尖端。可使用八通道移液器同时处理八个尖端。也可使用自动化液体处置系统。然而，ZIPTIPs^的使用仅限于由制造商提供的色谱介质。使用者不能向尖端添加任何固体。这种尖端并非意欲供孔片使用，但其使用移液器来处理尖端。

因此，人们期望有一种装置及方法可有助于孔片的处置及处理。

发明内容

一方面，本发明提供用于处理来自含有所研究样品的基质的孔片的装置，其中所述装置包含：

a.包括一分配尖端的第一元件，所述分配尖端包含：

i.一具有外部开口的中空内轴；及

ii.一第一外壳总成，其经构造及布置以界定与所述分配尖端的内轴相通的一第一内储液管，其中所述第一内储液管的尺寸经选择以使插入其中的孔片可将所述第一内储液管分为两个室，其中：

-第一室与所述分配尖端的内轴相通；而

-第二室包含一耦联开口；及

b.包含一第二外壳总成的第二元件，所述第二外壳总成经构造及布置以界定：

i.一中空内部；

ii.一用于将所述第二元件啮合至所述第一元件的耦联部份。

iii.一用于通过所述第一元件的所述第一耦联开口使所述第二元件的中空内部与所述第一内储液管之间相通的第二耦联开口，其中所述第二外壳总成的尺寸经选择以使当将一孔片置于所述第一元件的第一内储液管中时，界定所述第二耦联开口的凸缘有助于将所述孔片的位置维持在所述第一内储液管中并在所述第二元件的中空内部中形成一第二内储液管。

另一方面，本发明提供用于处理来自含有所研究样品的基质的孔片的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

a.所述装置；和

b.一处理试剂。

再一方面，本发明提供用于处理来自含有所研究样品的基质的孔片的方法，其中所述方法包括：

a.在基质上打孔以获得含有所研究样品的孔片；

b.提供前述权利要求中任一项所述的装置；

c.将所述基质插入所述装置第一元件的第一外壳总成中；

d.将第一元件与第二元件耦联；

e.使用处理试剂处理孔片。

附图说明

图1是本发明一实施例下部的示意图。

图2是本发明一实施例上部的示意图。

图3是参照一移液器尖端的图1和图2中的下部及上部组合的示意图。

图4是参照一缓冲站的图3中组合的示意图。

图5A和图5B是使用注射器的两个本发明实施例的示意图。

具体实施方式

a.包括一分配尖端的一第一元件，所述分配尖端包含：

i.一具有外部开口的中空内轴；及

ii.一第一外壳总成，其经构造及布置以界定与所述分配尖端的内轴相通的一第一内储液管，其中所述第一内储液管的尺寸经选择以使插入其中的孔片将所述第一内储液管分为两个室，其中：

-第一室与所述分配尖端的内轴相通；而

-第二室包含一耦联开口；及

b.包含一第二外壳总成的一第二元件，所述第二外壳总成经构造及布置以界定：

i.一中空内部；

ii.一用于将所述第二元件啮合至所述第一元件的耦联部份；及

iii.一用于通过所述第一元件的第一耦联开口使所述第二元件的中空内部与第一内储液管之间相通的第二耦联开口，其中所述第二外壳总成的尺寸经选择以使当将一孔片置于所述第一元件的第一内储液管中时，界定所述第二耦联开口的凸缘有助于将孔片的位置维持在所述第一内储液管中并在所述第二元件的中空内部中形成一第二内储液管。

在一实施例中，所述第一内储液管另外包含一孔片支撑件，其中所述孔片支撑件的尺寸经选择以使在一孔片置于所述孔片支撑件上且所述第一室充满液体时，位于所述孔片支撑件上的孔片大部分表面区域可接触所述第一室中的液体。优选地，所述孔片支撑件包括O形圈或具有一系列供液体流动的通道之肋形支撑件。

在另一实施例中，所述耦联部分通过压力锁或通过机械锁闭机构将所述第二元件啮合至所述第一元件。优选地，机械锁闭机构包括扣接配合件或Luer锁。

在另一实施例中，在第一外壳总成内所述第一内储液管与所述中空内轴邻接。

在又一实施例中，所述第一元件的分配尖端包括一微分配移液管尖端。优选地，所述微分配移液管尖端包括一毛细管微分配移液管尖端。

在另一实施例中，所述第二元件包括一微分配移液管尖端。

在另一实施例中，所述装置适合用于一选自由下述组成的群组的微分配移液管：

a.单通道微分配移液管；

b.多通道微分配移液管；及

c.自动化微分配移液器或机器人。

或者，所述第二元件包括一选自由下述组成的群组的注射器：

a.手动注射器；及

b.机器人注射器。

优选地，所述第一元件适合于安装至一注射器上，其中所述中空内轴收纳于注射器针头中，或者所述第一外壳总成适合于安装在注射器与注射器针头之间。

在又一实施例中，所述装置另外包含：

c.一加热元件。

a.所述装置；和

b.一处理试剂。

在一实施例中，所述处理试剂包括洗脱缓冲液。优选地，洗脱缓冲液选自由下述组成的群组：NaOH、乙酸钠、10mM 2-[N-吗啉基]-乙磺酸(MES)、10mM 3-[环己基胺基]-1-丙磺酸(CAPS)、TE、TE^-1、十二烷基硫酸钠(SDS)、山梨醇酐单-9-十八烯酸酯聚(氧-1，1-乙二基)、硫酸月桂基酯十二烷基酯(LDS)、或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的水溶液、10mM Tris、磷酸盐缓冲盐水(PBS)及水。

在另一实施例中，处理试剂包括指示剂。

在另一实施例中，处理试剂包括酶或光解试剂。

在又一实施例中，所述试剂盒另外包含：

c.一加热元件。

在又一实施例中，所述试剂盒另外包含：

c.含有所研究样品的孔片。

优选地，所述所研究样品包括：

a.核酸；或

b.蛋白质或肽。

更优选地，其中所研究样品包括选自由下述组成的群组的核酸：基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、cDNA、寡核苷酸、病毒DNA或RNA、BAC、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA及总RNA。

a.在基质上打孔以产生含有所研究样品的孔片；

b.提供前述权利要求中任一项所述的装置；

c.将所述基质插入所述装置第一元件的第一外壳总成中；

d.将所述第一元件与所述第二元件耦联；

e.使用处理试剂处理孔片。

在一实施例中，处理步骤包括：

i.将处理试剂吸至所述第一元件中以使处理试剂接触孔片；

ii.自所述第一元件中移出处理试剂。

在另一实施例中，所述处理步骤包括：

i.将处理试剂吸至所述第一元件中以使处理试剂接触到孔片并通过孔片移入所述第二室；

ii.将处理试剂通过孔片推入所述第一室；

iii.自所述第一元件中移出处理试剂。

优选地，步骤i另外包括孔片的培养。

在一优选实施例中，耦联步骤包括通过压力或通过机械锁锁定

在另一实施例中，处理试剂包括一洗脱缓冲液。优选地，洗脱缓冲液选自由下述组成的群：NaOH、乙酸钠、10mM 2-[N-吗啉基]-乙磺酸(MES)、10mM 3-[环己基胺基]-1-丙磺酸(CAPS)、TE、TE^-1、十二烷基硫酸钠(SDS)、单-9-十八烯酸聚(氧-1，1-乙二基)山梨醇酐、硫酸月桂基酯十二烷基酯(LDS)，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的水溶液、10mM Tris、磷酸盐缓冲盐水(PBS)及水。

优选地，将洗脱缓冲液加热至40℃至125℃之间的温度，其中：

a.洗脱缓冲液加热后再与孔片接触；或

b.在第一外壳总成中与孔片接触时加热洗脱缓冲液。

更优选地，将洗脱缓冲液加热至65℃至95℃之间的温度。

在另一实施例中，处理试剂包括指示剂。

在又一实施例中，处理试剂包括酶或光解试剂。

在另一实施例中，所研究样品包括核酸。优选地，核酸选自由下述组成的群组：基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、cDNA、寡核苷酸、病毒DNA或RNA、BAC、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA及总RNA。

在又一实施例中，所研究样品包括蛋白质或肽。

在另一实施例中，基质包括：

a.纤维素基基质；

b.氧化硅基基质；或

c.塑胶基基质。

一方面，提供可用于根据上述方法提取诸如血液等样品的装置。此一装置绘示于图1-4中。

在一实施例中，所述装置主要由两个元件或部分组成，图1-3中展示其通过一支座支撑。第一元件(10)，在这里为下部，展示于图1中。在此实施例中，第一元件(10)绘示为一具有中空内轴(22)及第一外壳总成(12)的分配移液管尖端，内轴(22)具有一外部开口(24)。第一外壳总成(12)经设计以收纳第一内储液管(14)。

通过打孔及置放装置将孔片(20)(例如来自FTA^CLONESAVER^保存卡片的孔片)置于装置的此部分中。在此实施例中，孔片搁置在诸如O形圈等孔片支撑件(50)上。

在一替代形式中，孔片支撑件包括具有一系列供液体流动的通道的肋形支撑件。后者一实例主要是一具有肋状物(形状为同心环或星状)的圆盘。过滤材料放置于肋状物的顶端，在过滤材料下方形成一间隙。液体流入这些间隙中并从圆盘中央的孔洞中流出。类似的装置在注射式过滤器(Whatman EASYDISC^TM、GD/X^TM、GD/XP^TM)中使用，但采用其作为支撑件用于本发明。

在另一替代形式中，因为半径减小，孔片仅仅搁置在中空内轴(22)的内壁上。一旦将孔片(20)置于第一内储液管(14)中，其就将第一内储液管(14)分为与中空内轴(22)相通的第一室(16)和具有耦联开口(32)的第二室(18)。在此实施例中，耦联开口(32)由边缘或凸缘(30)界定。

在图1所绘示的实施例中，使下部(10)的顶部边缘(30)与孔片支撑件(50)之间保持较浅的距离以使孔片(20)易于置放。在此实施例中，下部(10)的尖端(40)显示为一毛细管尖端(例如凝胶加样尖端)，其使尖端的滞留体积最小化。

尖端的滞留体积越小，回收的所研究材料越多。当洗脱体积小(例如25μl)时情况尤其如此。在这些情况下，例如10μl的滞留体积就占洗脱体积的一大部分。

图1中显示下部(10)保持在支座(60)中。在一实施例中，支座为(例如)96孔型(即作为标准96孔板在同一占用面积内可保持96个尖端)。一旦将孔片置于下部上，就可手动使用(例如在单通道或多通道移液器中)这些部分(仍在支座中)或将其转移至一液体处置机器人中。在使用机器人的实施例中，也可将所述装置的上部载入机器人中。

所述装置的此实施例的第二元件或上部(100)绘示于图2中，此处绘示为在支座(160)中。在图2中，上部(100)绘示为一分配移液管尖端，其具有界定中空内部(120)的第二外壳总成(110)。在此实施例中，此第二分配移液管尖端大于用作下部(10)的第一尖端。

第二外壳总成(110)经构造及布置以界定耦联部分(130)，其用于通过下部(10)的第一耦联开口(32)使上部(100)的中空内部(120)与第一内储液管(14)的第二室(18)之间相通。在此实施例中，耦联部分(130)末端为界定第二耦联开口(140)的凸缘或边缘(150)，其与下部(10)相通(参见图2和图3)。而且，孔片驻留部分(通常标记为(114))可于开口(140)内位于或实质上毗邻于包含凸缘或边缘(150)的上部(100)的末端。可采用各种替代构型作为孔片驻留部分，而在优选实施例中孔片驻留部分(114)是条形或十字形的挠性元件，其在包含凸缘或边缘(150)的平面中或在实质上平行于包含凸缘或边缘(150)平面的平面中横跨开口(140)。此外，以开口(140)为基准来确定孔片驻留部分(114)的尺寸，以使其不显著阻碍液流通过开口(140)，并仍然能用于在下文详细说明的孔片处理步骤中保留孔片使其不被转移和/或被吸入上部(100)的中空内部(120)中。

在一实施例中，这部分经设计为由使用者或标准液体处置机器人直接或间接拿起，并将其以类似于图3所示的方式推入下部中。

图3绘示了经连接的两个元件或部分。如图2所示，第二外壳总成(110)的尺寸经选择以使当将孔片(20)置于下部(10)的第一内储液管(14)中时，界定第二耦联开口(140)的凸缘或边缘(150)有助于使孔片(20)的位置维持在第一内储液管(14)中并形成收纳于第二外壳总成(110)的中空内部(120)中的第二内储液管(200)，其位于下部(10)的第二室(18)的内侧。

优选地，一旦将两个部分推到一起，两个部分锁定到一起(例如通过压力或通过锁闭机构或元件，例如扣接配合件或Luer锁)，装置可作为一个物件来移动。所述上部可执行三个功能：i)在处理步骤中使孔片保持原位，ii)在处理步骤中当通过孔片抽吸液体时作为储液管储存液体，以及iii)使得可由使用者或液体吸量机器人(见图4)处置整个装置，例如使用移液器(220)，其可使力通过上部(100)中的开口(170)通入中空内部(120)中(通过第二内储液管(200))。

如图4所示，一旦上部和下部锁定到一起，使用者或液体处置机器人就拿起所述装置并将所述装置放入缓冲站中。(机器人可同时处置多个装置。或者，非机器人使用者可使用多通道移液器处置多个装置。)可通过将液体(例如热或冷的缓冲水溶液、醇、有机溶剂等)抽吸入装置中并使液体通过孔片上下脉动或通过自装置中抽吸及分配液体来洗涤孔片(20)(如果需要)。洗涤后，将洗脱缓冲液抽吸入装置中并进行培养。将缓冲液吸收入尖端中并通过孔片上下移动以洗涤及洗脱。在洗脱阶段如果需要加热，将尖端整体置入加热器中。培养后，将液体自装置中分配至收集容器中并丢弃装置。所述设计使得可在洗涤阶段使用相对大(例如200μl)的缓冲液体积而在洗脱阶段使用小缓冲液体积。

对客户打孔并置放孔片的替代方案是由装置制造者提供预装载有孔片的装置(例如提供一预装载有FTA^孔片的下部)。然后客户将所述下部载入液体处置机器人中并用机器人将所研究样品点样至孔片上。然后将上部推放就位(即将上部和下部组装到一起)。可将样品点干燥然后将所述装置储存备用。在需要时，根据上述方法处理所述装置以获得所研究材料(例如DNA、RNA、蛋白质等)。

作为图1-4中装置的替代装置，可使用经修改的注射器装置，其安装至类似于上述下部的第一元件中(例如图5A所示)，或安装至经修改针头。所述针头的尺寸经选择以防止孔片的损失。或者，孔片的尺寸经选择以防止其在使用特殊尺寸针头时损失。另外，参考分离的所研究样品选择针头的长度及孔径。举例而言，在所研究样品包含长链DNA时使用宽孔针头，因为窄孔针头内的剪切力可使链断裂。

图5A中显示，与图1-4中类似的第一元件(下部)连接至注射器(300)，其外壳总成(310)经构造及布置以界定注射器(300)的中空内部(320)。注射器(300)的耦联部分(330)将注射器(300)耦联至所述第一元件的耦联开口上，以使注射器(300)的开口(340)与所述第一内储液管相通。开口的凸缘或边缘(350)有助于维持孔片(440)的位置，孔片(440)优选地位于一孔片支撑件(450)上。所述两个部分锁定在一起(例如通过压力或通过锁闭机构或元件，例如扣接配合件或Luer锁)。使用注射器柱塞(380)将液体吸入和排出。

在图5B中，第一元件(下部)(400)具有一与注射器或其他针头(420)相连的外壳总成(410)。其开口的凸缘或边缘(350)有助于维持孔片(460)的位置，孔片(460)优选地位于孔片支撑件(470)上。

作为图5A和5B所展示装置的替代装置，注射器针头经修改以具有一超长连接区域，其将针头的上部末端连接至注射器的底部末端。所述连接区域具有一孔片支撑件，在连至注射器之前将孔片置于所述孔片支撑件上。

作为图5A和5B所展示装置的另一替代装置，所述连接区域的内径减小，以使孔片可搁置在内壁上，但其下仍有间隔以在孔片下侧与针头顶部末端之间为缓冲液或其他液体保留空间。在连接注射器时孔片的上侧由注射器的喷嘴压住。或者，在连至注射器前将一上方O形圈插入至孔片的顶部。

作为图5B所示装置的又一替代装置，提供一转接件并将其置于注射器针头与注射器之间。转接件之上部末端可紧固至注射器喷嘴并且其下部末端可紧固至针头的连接区域，优选地使用标准方法以使得能够使用市售注射器和针头。视需要转接件具有一孔片支撑件，在连接注射器前将孔片置于所述孔片支撑件上。在连接注射器时孔片的上侧由注射器的喷嘴压住。或者，在连接注射器前将一上方O形圈插入至孔片的顶部。在一实施例中，所述转接件已提供有一孔片，所述孔片具有或不具有所研究样品。

适宜的材料包括玻璃纤维或任何氧化硅基或衍生的过滤材料、纤维素基过滤材料和塑胶基过滤材料，例如聚酯和聚丙烯基过滤材料。实例包括下述专利所描述的那些：WO 90/03959(PCT/AU89/00430；于1989年10月3日申请)、WO 96/39813(PCT/AU96/00344；于1996年6月7日申请)、WO 00/21973(PCT/GB99/03337；于1999年10月8日申请)、WO 01/501601(PCT/US01/00640；于2001年1月10日申请)、WO03/020924(PCT/GB02/04048；于2002年9月5日申请)、PCT/US01/25709(于2001年8月17日申请)、PCT/US03/31483(于2003年10月3日申请)、美国专利第5,496,562号(于1996年3月5日颁予)、美国专利第5,756,126号(1998年5月26日)、美国专利第5,939,259号(于1999年8月17日颁予)、美国专利第5,972,386号(于1999年10月28日颁予)、美国专利第6,168,922号(于2001年1月2日颁予)、美国专利第6,291,179号(于2001年9月18日颁予)、美国专利第6,645,717号(于2003年11月11日颁予)、美国专利第6,670,128号(于2003年12月30日颁予)、U.S.S.N.09/724,060(于2000年11月28日申请)、U.S.S.N.09/993,736(于2001年11月14日申请)、U.S.S.N.10/326,216(于2002年12月20日申请)、欧洲专利第1119576号(2003年6月11日)、欧洲专利第0849992号(2004年8月25日)和欧洲专利申请案第04076551.3号(于2004年5月20日申请)，所有上述专利所揭示内容均以引用方式并入本文。

如果需要洗涤核酸样品，可在各种类型的缓冲液中执行各种洗涤，缓冲液包括(但不限于)热或冷的缓冲水溶液、醇及有机溶剂。优选地，所述洗涤缓冲液可选自包括下述的群组：Tris/EDTA；70％乙醇；STET(0.1M NaCl；10mM Tris/HCl，pH 8.0；1mMEDTA，pH 8.0；5％Triton X-100)；SSC(20X SSC＝3M NaCl；0.3M柠檬酸钠；用NaOH调至pH 7.0)；SSPE(20X SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH₂PO₄-H₂O；0.02M EDTA；pH 7.4)，及诸如此类。

洗脱缓冲液及方案取决于所洗脱的物质(例如质粒DNA、基因组DNA、mRNA、蛋白质等)和所使用的过滤材料的类型(例如纤维素基、玻璃或氧化硅基、塑胶基等)。

同样优选地，过滤材料的成分及尺寸经选择以使得洗脱时可在pH5至11之间或优选地在pH5.8至10之间洗脱核酸。在本发明方法中这是有利的，因为在碱性更高的介质中洗脱产物核酸可能会使产物降解。因此，用于洗脱的pH优选在7到9之间。

可以若干种方式达成核酸的洗脱，换句话说使核酸自过滤材料上释放。通过在洗脱前在培养步骤中将能量注入系统以释放核酸可改良洗脱效率。这可以是呈物理能量的形式(例如通过振荡)或呈热能的形式。可通过增加注入系统中的能量数量来缩短培养或释放时间。

优选地，在洗脱前核酸保留在过滤材料上时，通过将核酸在预定时间内加热至一较高温度向系统中注入热能，但温度并不高至或加热时间并不长至能破坏核酸。(然而，在洗脱前如果未将核酸加热至较高温度或甚至保持在更低温度(低至4℃)，仍可实施洗脱。)更优选地，将核酸加热至40℃至125℃的较高温度，甚至更优选地在80℃至95℃之间。最优选地，将核酸加热至约90℃的较高温度，对于一直径6mm的过滤材料加热约10分钟较为有利。在任一给定加热温度下增加过滤材料的直径可增加DNA的产率。基因组DNA可能需要加热，但对RNA和质粒而言，无需加热。

对DNA分离而言，双链与单链DNA的比取决于实验条件，并可由其调控。使用时间和温度参数修改培养方案可改变这个比，其中在更低温度下培养更长时间可产生高比例的双链DNA。在更高温度下培养更短时间也可产生高比例的双链DNA。也可使用蛋白质来抑制DNA的变性(参见例如WO 01/96351(PCT/GB01/02564；于2001年6月11日申请)和WO 03/050278(PCT/GB02/05617；于2002年12月11日申请))。

如果在核酸保留在过滤材料上时将其加热至较高温度，则洗脱期间就不需要将核酸维持在较高温度。洗脱本身可在任一温度下进行。为便于处理，如果在核酸保留在过滤材料上时将其加热至较高温度，则优选地在低于所述较高温度的温度下进行洗脱。这是因为当加热停止时核酸的温度会随时间下降，而且对过滤材料施加任一周围温度的洗脱溶液也会导致核酸温度下降。或者，所述步骤可在一加热元件中例如在一加热器(例如在自动化装置或在机器人中)中实施。

适合于自本发明过滤材料上洗脱核酸的任一pH的任一溶液均可使用。优选的洗脱溶液包括NaOH(1mM至1M)、乙酸钠(1mM至1M)、10mM 2-[N-吗啉基]-乙磺酸(MES)(pH 5.6)、10mM 3-[环己基胺基]-1-丙磺酸(CAPS)(pH 10.4)、TE(10mMTris HCL(pH8)+1mM EDTA)、TE^-1(10mM Tris；0.1mM EDTA；pH 8)、十二烷基硫酸钠(SDS)(尤其0.5％SDS)、TWEEN^TM 20(尤其1％TWEEN^TM 20)、LDS(尤其1％硫酸月桂基酯十二烷基酯(LDS))或TRITON^TM或TRITON^TM-X-100(尤其1％TRITON^TM)、水和10mM Tris。(TWEEN^TM 20称为山梨醇酐单-9-十八烯酸酯聚(氧-1，1-乙二基)、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。所述化学品的CAS号是9005-64-5。TRITON^TM-X-100称为叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的CAS号是9002-93-1。)洗脱方案的实例参见PCT/US01/25709(于2001年8月17日申请)、PCT/US02/36483(于2002年11月13日申请)、美国专利第6,645,717号(于2003年11月11日颁予)、和美国专利第6,670,128号(于2003年12月30日颁予)，所有上述专利所揭示内容均以引用方式并入本文。

所述装置并非意欲限于DNA的洗脱或限于FTA^孔片。所述装置适用于沉积于任何类型孔片(例如纸或其他纤维素基基质、玻璃及其他氧化硅基基质、塑胶基质、其他膜等)上并可自孔片上洗脱的任何所研究材料。这些材料的实例包括(但不限于)核酸(例如基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、cDNA、BAC、寡核苷酸、病毒DNA或RNA、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA和总RNA等)、蛋白质或任何其他所研究材料(例如肽、寡核苷酸等)。

在FTA^孔片处理中，已发现，与基因组DNA不同，在使用TE^-1(10mm Tris-HClpH 8.0，和0.1mM EDTA)于室温下作2×5min的洗涤处理时，RNA不能保持在FTA^纸上。实际上所有的RNA都会洗脱入最初的洗剂中，而且此经洗脱的细胞RNA可在分析前直接置入第一链RT反应中或可自洗涤溶液中经乙醇沉淀并重新悬浮于无菌水或TE中。WO 01/501601(PCT/US01/00640；于2001年1月10日申请)，其所揭示内容以引用的方式并入本文中。用于处理RNA的材料和试剂必须是不含RNAse的(Sambrook等人，1989)。

可使用类似的条件洗脱蛋白质或肽样品。举例而言，可用任何适宜的蛋白质缓冲液洗脱蛋白质或肽样品。在一实施例中，通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(10X PBS：137mM NaCl；2.7mM KCl；5.4mM Na₂HPO₄；1.8mM KH₂PO₄；pH 7.4)培养例如30-45mins来洗脱蛋白质。WO 03/020924(PCT/GB02/04048)。或者，可使用高盐缓冲液(例如含2.0M NaCl的0.1M Tris-乙酸盐，(pH 7.7))、低盐缓冲液(例如0.01M Tris-HCl缓冲液pH 8.0))、高pH缓冲液(例如0.1M甘氨酸-NaOH(pH 10.0))或低pH缓冲液(例如0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.3))。

如所揭示内容均以引用方式并入本文中的PCT/US02/36978(于2002年11月15日申请)、美国专利第6,746,841号(于2004年6月8日颁予)及U.S.S.N.10/298,255(于2002年11月15日申请)中所述，如果所研究样品未经洗脱，则可使用本发明的装置在原位对其实施处理来进行分析(例如检测)。举例而言，检测方法可包括使用指示剂。由本发明指示剂产生的信号提供关于基材上给定核酸或蛋白质的存在的阳性标识。举例而言，可通过使用特异性或非特异性核酸探针或其他信号产生剂以及免疫测定法的一个版本来检测核酸(优选地定量检测)。可通过使用免疫测定法检测蛋白质(优选地定量检测)。优选地，指示剂包括荧光指示剂、颜色指示剂或光度指示剂。或者，如业内所熟知，可使用与生物素及聚抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗体，或可使用一利用与DNA相互作用的聚乙烯亚胺-过氧化物酶结合物(PEI-PO)的分析。所属领域的技术人员可想到其他检测方法。

在某些实施例中，尤其在光敏实施例中，可能需要提供外壳来阻止与光的一般接触和/或尤其与特定波长光的接触。如果所述指示剂并非已存在于过滤材料上，则可进行添加，且如果需要则可在外壳中与过滤材料共同培养。所述指示剂可容易地自过滤材料中提取出来并丢弃。同样可使封阻剂及洗剂通过过滤材料循环，但在优选实施例中不需要进行封阻。当制备步骤完成时，在无光(或无可使指示剂反应的波长的光)条件下打开外壳，然后使过滤材料暴露于所需波长的光下来触发光度反应。

其他分析方法可包括核酸或蛋白质与所研究样品的杂交、样品的检测、样品的定量、样品的鉴定或其他测试，以及所属领域的技术人员能想到的其他方法。

另外，重要的是当样品通过各处理步骤时记录下经处理的材料、所使用的设备和处理结果。在那些手动处理孔片的情况下，通常手工记录保持及追踪可满足要求。然而在自动化处理时，所有经处理材料(孔片及其各自的源卡片)、在用于各样品的不同处理步骤中所使用的设备元件和每个样品处理结果的追踪方法变得很麻烦，但仍非常重要。作为具有自动化处理能力的适用追踪方法的一个实例，本发明的发明人发现将条码阅读器和条码识别器与至少(i)不同孔片的源卡片，(ii)在用来处理各自孔片的各孔片处理中所使用的设备元件，及(iii)各孔片的处理结果联合使用使追踪及记录保持功能更容易实现。然而应理解，也可在不背离本发明的情况下使用其他自动化追踪及记录保持方法来达成上述目的。

所述系统的优点包括：

(a)孔片的处置简易且安全。

(b)孔片支撑部分设计得浅使得孔片容易置放。

(c)可有效处置洗涤阶段需要的大缓冲液体积以及洗脱时需要的小缓冲液体积。

(d)可使用标准液体处置机器人进行洗涤及洗脱。

(e)可依比例缩放以适应不同的孔片尺寸。

(f)对孔片的处理更温和，消除了处理期间孔片的剥离且使纤维脱落降至最低。

(g)可用于自动化或手动处置。

定义

为书面说明中使用的特定术语提供以下附加定义。

除非上下文另有明确说明，否则说明书及权利要求中使用的单数形式“一(a，an)”及“所述的(the)”包括复数意义。举例而言，术语“一分子”也可指复数个分子。

本文所用的术语“滤膜”或“基质”意指多孔材料或过滤材料介质。如本文所用，“过滤介质”、“过滤材料介质”或“多孔介质”可具有均一或不均一的孔。或者，举例而言，其可包含具有更小适宜尺寸的材料可穿过的纤维基质或纤维网络。其可为具有不规则结构的松散材料，或其可具有更均一或更不连续的结构。其包括(但不限于)本文所用的“过滤材料”、“滤膜”和“基质”，其意指成形的多孔材料或过滤材料介质。其包括(但不限于)“固体介质”，例如“干燥固体介质”。“过滤介质”、“过滤材料介质”或“多孔介质”可完全或部分地由玻璃、氧化硅、硅胶、硅氧化物或石英(包括其纤维或其衍生物)来形成，但并不限于这些材料。其他材料包括(但不限于)尼龙、纤维素基材料(例如纤维素、硝基纤维素、羧甲纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素)、包括合成亲水性聚合物的亲水性聚合物(例如聚酯、聚酰胺、糖类聚合物)、聚四氟乙烯、PET、聚碳酸酯、多孔陶瓷，以及本文中所揭示的其他材料。也包括诸如氧化铝膜(WhatmanANOPORE^TM)等基于金属氧化物的过滤材料。过滤介质可包含一种或多种过滤材料。

本文所用“亲水性”物质指可吸收或吸附水的物质，而“疏水性”物质指不吸收或吸附水的物质。

本文所用“可湿性”涉及膜的整个表面可润湿而无疏水性斑点。

用于本发明滤膜的介质包括任何不抑制添加至其的样品材料的储存、洗脱及后续分析的材料。其包括平坦干燥基质或与粘合剂组合的基质。一方面，本发明的支撑件使得可在允许后续分析的状态下从所述支撑件上洗脱遗传物质。

介质可与一“粘合剂”组合，粘合剂可将纤维结合在一起。所属技术领域习知的某些粘合剂实例为聚乙烯丙烯酰胺、聚乙烯丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以及明胶。

本文中所用的术语“完整性维持器”或“完整性维持构件”意指用来防止基质降解和/或损失的可密封构件。优选地，本发明的完整性维持器可形成气密密封，由此防止空气、细菌或其他污染物与基质及经纯化的核酸接触。所述完整性维持器可呈其具有或不具有密封的塑胶袋、赛璐玢、可密封容器、石蜡膜及诸如此类之形式。

本文所用的“储存”涉及在一个或数个相关温度下将支撑件/核酸维持一段时间。储存温度及时间取决于膜的类型和样品性质。举例而言，对于储存在FTA^膜上的DNA，优选地在约20至30℃(优选地在室温，如25℃下)下达成储存，但可视需要在更高或更低温度下达成。更低的储存温度范围可在约0至20℃之间、-20至0℃之间和-80至-20℃之间。根据本发明长期储存时间可超过一年，优选超过2年，仍然更优选超过3年，仍然更优选超过5年，仍然更优选超过10年，且最优选超过15年。

本文所用“分析物”是待检测或待分离样品的成分。在某些实施例中，分析物特异性结合一粘合剂。在某些实施例中，分析物的存在与否可用来判断获取样品的源生物体的生理状态。或者，所述分析物的存在与否可用来检测(例如)样品的污染。所属领域的技术人员可想到多种其他用途。

本文所用“特异性”涉及抗体辨别抗原决定簇的能力。其也涉及通过一特定受体或抗体识别的精确决定簇。其也涉及受体辨别底物(例如药物)的能力。对于核酸，其涉及分别作为竞争或识别/结合功能的一致性或互补性。识别或结合的“特异性”可受到识别或结合发生条件(例如pH、温度、盐浓度及所属领域习知的其他因素)的影响。

本文所用“配体”是指可由另一分子或分子复合物结合的分子或分子复合物。配体可为(但不限于)由受体结合的分子或分子复合物，或可为核酸的互补片段。

本文所用“嵌合DNA”是指至少两个可识别的DNA区段，所述区段间的联系在自然界中不存在。等位基因变异或自然发生的突变事件不能产生本发明所定义的嵌合DNA。

本文所用的“核苷酸”指碱基-糖-磷酸复合物。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的单体单元。术语核苷酸包括三磷酸核糖核苷酸ATP、UTP、CTP、GTP以及三磷酸脱氧核糖核苷酸例如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。

这些衍生物包括(例如)[αS]dATP、7-脱氮-dGTP、7-脱氮-dATP以及生物素化或半抗原化核苷酸。本文所用的术语核苷酸也指三磷酸双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)及其衍生物。三磷酸双脱氧核糖核苷酸的说明性实例包括(但不限于)ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。根据本发明，“核苷酸”可未经标记或通过习知技术进行可检测标记。可检测标记包括(例如)放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。

本文所用术语“聚核苷酸”及“核酸分子”可互换使用，其均指任何长度的核苷酸聚合形式，其可具有任何三维结构，且可执行任一习知或未知的功能。所述聚核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)，和/或其类似物，包括(但不限于)单-、双链及三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核酶、反义分子、互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)、重组聚核苷酸、支链聚核苷酸、适配子、质粒、载体、任一序列的分离DNA、任一序列的分离RNA、核酸探针、肽核酸(PNA)及引物。核酸分子也可包括经修饰核酸分子(例如，包含经修饰碱基、糖和/或核苷酸间连接体)。

本文中所用的“文库”涉及一组代表一生物体DNA内容物(“基因组文库”)的全部或一部分或大部分的核酸分子(环形或线形)，或一组代表在一细胞、组织、器官或生物体中表达的基因(“cDNA文库”)的全部或一部分或大部分的核酸分子。这些文库可包含于或不包含于一或多个载体中。

本文所用的“载体”指质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体DNA或另外的DNA分子，其可在寄主细胞内自主复制，且其特征在于具有一个或少量限制性内切酶识别位点，可在这些位点上以一可确定方式切割这些DNA序列而不损失载体的主要生物学功能，且可将DNA插入这些位点以引起其复制及克隆。所述载体另外可包含一或多个适合用于确定经载体转化细胞的标记。举例而言，标记包括(但不限于)四环素抗性和氨苄西林抗性。这些载体也可包含一或多个重组位点、一或多个终止位点、一或多个复制起点及诸如此类。

“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其可与另一DNA区段连接以引起所连接区段的复制。“复制子”是作为活体内DNA复制的自主单元发挥作用即可在其自身控制下复制的任一遗传成分(例如质粒、染色体、病毒)。

“载体”的实例包括质粒、自主复制序列(ARS)、着丝粒、粘粒及噬菌粒。载体另外可提供引物位点(例如为PCR)、转录和/或转译起始和/或调节位点、重组信号、复制子等。载体另外可包含一或多个适合用于确定经载体转化或转染细胞的可选择标记，例如卡那霉素、四环素、氨苄西林等。

本文所用的“引物”指在DNA分子扩增或聚合时由核苷酸单体通过共价键延长的单链寡核苷酸。用于本发明的优选引物包括寡(dT)引物或其衍生物或变异体。

本文所用的“寡核苷酸”涉及包含核苷酸的共价连接序列的一合成或天然分子，所述核苷酸是通过在一核苷酸的脱氧核糖或核糖的3′位及相邻核苷酸的脱氧核糖或核糖的5′位之间的磷酸二酯键连接的。

本文所用的“模板”指待扩增、合成或测序的双链或单链核酸分子。如果是双链分子，优选地先使其链变性以形成第一和第二链，再对这些分子实施扩增、合成或测序，或可直接使用所述双链分子作为模板。对单链模板而言，在适宜条件下使一与模板的一部分互补的引物杂交或退火，然后一或多种聚合酶或逆转录酶可合成一与所述模板的全部或部分互补的核酸分子。根据本发明，新合成的分子长度上可等于或短于源模板。

“氨基酸”涉及天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸及D或L旋光异构体二者以及氨基酸类似物和拟肽物质。“氨基酸”也包括亚氨基酸。“肽”是指两个或更多亚单位氨基酸、氨基酸类似物或拟肽物质的复合物。亚单位可通过肽键或通过其他键(例如酯、醚及类似键)连接。“寡肽”涉及具有三个或更多氨基酸的短肽链。如果肽链较长(例如大于约10个氨基酸)，则肽为“多肽”或“蛋白质”。

虽然术语“蛋白质”涵盖术语“多肽”，但“多肽”可为小于全长的蛋白质。在其他方面，术语“多肽”及“蛋白质”可互换使用且指通过肽键或经修饰肽键连接的氨基酸的任一聚合物(二肽或更大)。因此，术语“多肽”及“蛋白质”包括寡肽、蛋白质片段、融合蛋白及诸如此类。应了解，本文所用术语“多肽”及“蛋白质”包括诸如脂蛋白及糖蛋白等部分。

本文所用“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指具有至少两个可识别区段的蛋白质，区段间的联系在自然界中不存在。在一实施例中，一嵌合蛋白可由(例如)一嵌合DNA的表达产生，所述嵌合DNA可表达为蛋白质且具有至少两个DNA区段，这两个DNA区段以可行方式连接而使得每一区段的至少一部分能作为一单独蛋白质表达。所属领域的技术人员可想到其他实施例。

“朊病毒”为可复制的蛋白质或蛋白质片段。

“标记肽序列”为具有3个或更多氨基酸的短肽或多肽链，其连接至所研究蛋白质。在一优选实施例中，多肽、蛋白质或嵌合蛋白包含一标记肽序列，其用于纯化、检测或其他功能，例如通过特异性地结合至一抗体。抗体可在溶液中或结合在表面(例如，珠粒、过滤材料或其他材料)上。标记肽序列不应干扰多肽、蛋白质或嵌合蛋白其余部分的功能。可用于本发明的标记肽序列的一实例为在羧基端融合有6个His残基的短c-Myc标记。其他实例将被所属领域的技术人员所熟知。

在本发明的范围内也可提供结构域序列的“保守修饰的变异体”。对于特定的核酸序列，保守修饰的变异体指那些编码完全相同的或基本上完全相同的氨基酸序列的核酸，或在所述核酸不编码氨基酸序列的情况下指基本上完全相同的序列。具体而言，通过产生其中一或多个所选(或全部)密码子的第三位由混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤核苷残基取代的序列可达成简并密码子取代。或者，一或多个氨基酸可由具有类似结构、活性、电荷或其他性质的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本技术领域中已为人们所熟知(参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919(1992))。

核酸或蛋白质的来源可为含有全细胞的生物样品。全细胞可为(但不限于)血液、细菌培养物、细菌菌落、酵母细胞、组织培养细胞、唾液、尿液、饮用水、血浆、粪便样品、精液、阴道样品、痰、植物细胞样品或在科学、医学、法医及其他领域习知的各种其他细胞来源。样品可通过业内熟知的各种方法收集，输送至过滤材料，然后施加到其上。

“宿主生物体”指一生物体或活的实体，其可为原核生物或真核生物、单分子生物或多分子生物，且可期望其是或已经是外源核酸分子、聚核苷酸和/或蛋白质的受体。优选地，“宿主生物体”为细菌、酵母或一真核多细胞的活实体(优选地为动物，更优选地为哺乳动物，仍然更优选地为人类)。

“抗体”(Ab)是指可与称为“抗原”(Ag)(下文中所述)的特定物质特异性结合的蛋白质。“抗体”为任一可结合特异性表位的免疫球蛋白，包括抗体及其片段。所述术语涵盖多克隆、单克隆及嵌合抗体(例如多特异性抗体)。

“抗原”(Ag)是指任何可与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的物质。“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子可特异性结合抗原的部分。

“生物样品”包括组织、细胞、血液、体液或自生物有机体获得的其他材料的样品。其也包括一生物有机体、细胞、病毒或其他复制实体。也包括固体培养物(例如细菌或组织培养物)。也包括含有生物有机体、细胞、病毒或其他复制实体的固体样品，包括(但不限于)食品、粉末以及其他固体(包括非生物固体)。也包括固体样品的洗涤、匀质化、超声波处理及类似的处理。同样，所述术语包括非固体生物样品。

“弱碱”具有在8.0至9.5之间的碱性pH或可产生在8.0至9.5之间的碱性pH。

本文所用的“非离子相互作用”包括任何不存在离子相互作用的相互作用。“非离子相互作用”包括(但不限于)偶极-偶极相互作用、偶极-诱导偶极相互作用、分散力或氢键。

如果无另外说明，则“实质上”指“大体上但非完全是规定的情况”。

现在将以举例方式更详细地描述本发明的各个方面及实施例。应理解，在不背离本发明范围的情况下可对细节加以修改。

实例

实例1-3：

所述装置主要由两个元件或部分(10、100)组成，在图1-3中显示为由支座(60、160)支撑。第一元件(10)，在本文中指下部，显示于图1中。第一元件(10)绘示为一具有中空内轴(22)及第一外壳总成(12)的分配移液管尖端，所述内轴具有一外部开口(24)。第一外壳总成(12)收纳第一内储液管(14)。

通过打孔及置放装置将孔片(20)(例如来自FTA^CLONESAVER^保存卡片的孔片)置于所述装置的此部分中。在此实施例中，孔片搁置在孔片支撑件(50)上。一旦将孔片(20)置于第一内储液管(14)中，其就将第一内储液管(14)分为与中空内轴(22)相通的第一室(16)和具有耦联开口(32)的第二室(18)。耦联开口(32)由边缘或凸缘(30)界定。

所述装置的此实施例的第二元件或上部(100)绘示于图2中。在图2中，上部(100)绘示为一分配移液管尖端，其具有界定中空内部(120)的第二外壳总成(110)。

在此实施例中，此第二分配移液管尖端大于用作下部(10)的第一尖端。第二外壳总成(110)经构造及布置以界定耦联部分(130)，用于通过下部(10)的第一耦联开口(32)使上部(100)的中空内部(120)与第一内储液管(14)的第二室(18)相通。在此实施例中，耦联部分(130)以凸缘或边缘(150)为末端，此末端界定第二耦联开口(140)，第二耦联开口(140)与下部(10)相通(见图2和图3)。这部分由使用者或标准液体处置机器人直接或间接拿起，并将其以类似于图3所展示的方式推入下部中。

图3绘示了经连接的两个元件或部分。如图2所示，第二外壳总成(110)的尺寸经选择以使当将孔片(20)置于下部(10)的第一内储液管(14)中时，界定第二耦联开口(140)的凸缘或边缘(150)有助于使孔片(20)的位置维持在第一内储液管(14)中并形成收纳于第二外壳总成(110)的中空内部(120)中的第二内储液管(200)，其位于下部10)第二室(18)的内部。当连接至移液器(220)时，力通过上部(100)的开口(170)自移液器(220)通入中空内部(120)中(通过第二内储液管(200))。一旦总成锁定就位，使用移液器将总成移出支座并移入缓冲站等等。

一旦将两部分推到一起，两部分锁定到一起(例如通过压力或通过锁闭机构或元件)，所述装置即可作为一个部件来移动。如图4所示，一旦上部和下部锁定到一起，使用者或液体处置机器人就拿起所述装置并将所述装置放入缓冲站中。通过将液体(例如热或冷的缓冲水溶液、醇、有机溶剂等)抽吸入装置中并使液体通过孔片上下脉动或通过自装置中抽吸及分配液体来洗涤孔片(20)上的样品。

洗涤后，将洗脱缓冲液抽吸入装置中并进行培养。将缓冲液吸收入尖端中并通过孔片上下移动以洗涤并洗脱。在洗脱阶段如果需要加热，将尖端整体置入加热器中。培养后，将液体自装置中分配至收集容器中并弃掉装置。装置的设计使得可在洗涤阶段使用相对大(例如200μl)的缓冲液体积而在洗脱阶段使用小缓冲液体积。

在实例1中，上述装置用于一单通道移液器中。在实例2中，所述装置用于一多通道移液器中。在实例3中，所述装置用于一如上所述的机器人移液器中。

实例4-6：

对使用者将样品基质打孔并将孔片置放于装置(例如实例1或实例2中的装置)中而言，替代方案是由装置制造者提供预装载有孔片的装置(例如提供预装载有FTA^孔片的下部)。然后使用者将一个上部(实例4)或若干上部(实例5)推到位(即将上部与下部组装到一起)。可将样品点干燥然后将所述装置储存备用。若需要，可根据上述方法处理装置(实例4)或若干装置(实例5)以获得所研究材料(例如DNA、RNA、蛋白质等)。

类似地，对使用者将样品基质打孔并将孔片置放于装置(例如实例3中的装置)中而言，替代方案是由装置制造者提供预装载有孔片的装置(例如提供预装载有FTA^孔片的下部)。在实例6中，使用者然后将下部载入液体处置机器人并用机器人将所研究样品点样至孔片上。

然后将上部推到位(即将上部和下部组装到一起)。可将样品点干燥然后将所述装置储存备用。若需要，根据上述方法处理所述装置以获得所研究材料(例如DNA、RNA、蛋白质等)。

实例7和8：

作为实例1中装置的替代装置，可使用经修改的注射器装置(例如，如图5A或图5B所示)，将其安装至类似于上述下部的第一元件中，或安装至经修改针头中。针头的尺寸经选择以防止孔片的损失。或者，孔片的尺寸经选择以防止其在使用特殊尺寸针头时损失。另外，参照正在分离的所研究样品选择针头的长度及孔径。举例而言，在所研究样品包含长链DNA时使用宽孔针头，因为窄孔针头内的剪切力会使链断裂。

图5A中显示，与图1-4中类似的第一元件(下部)连接至一注射器(300)上，注射器(300)的外壳总成(310)经构造及布置以界定注射器(300)的中空内部(320)。注射器(300)的耦联部分(330)将注射器(300)耦联至第一元件的耦联开口上，以使注射器(300)的开口(340)与第一内储液管相通。开口的凸缘或边缘(350)有助于维持孔片(440)的位置，孔片(440)位于孔片支撑件(450)上。所述两个部分锁定在一起(例如通过压力或通过锁闭机构或元件，例如扣接配合件或Luer锁)。使用注射器柱塞(380)将液体吸入和排出。

在图5B中，第一元件(下部)(400)具有一外壳总成(410)，其与注射器或其他针头(420)相连。开口的凸缘或边缘(350)有助于维持孔片(460)的位置，孔片(460)位于孔片支撑件(470)上。

在实例7中，将注射器针头修改为具有一超长连接区域，其连接针头的上部末端与注射器的底部末端。所述连接区域具有孔片支撑件，在连至注射器之前将孔片置于所述孔片支撑件上。或者，减小连接区域的内径以使孔片可搁置在内壁上，但其下仍有间隔以在孔片下侧与针头顶部末端之间为缓冲液或其他液体保留空间。在连接注射器时孔片的上侧由注射器的喷嘴压住。或者，在连接注射器前插入一O形圈。

在实例8中，提供一转接件并将其置于注射器针头与注射器之间。所述转接件的上部末端紧固至注射器喷嘴并且其下部末端紧固至针头的连接区域，优选地使用标准方法以使得可使用市售注射器和针头。视需要所述转接件具有一孔片支撑件，在连至注射器前将孔片置于所述孔片支撑件上。在连接注射器时孔片的上侧由注射器的喷嘴压住。或者，在连接注射器前插入一O形圈。

实例9：

作为实例1中装置的替代装置，可使用经修改的注射器装置。在此实施例中，如实例1中所述提供下部，但将其修改以使其可连接至注射器或修改注射器使其可连接至所述下部。在连接注射器时孔片的上侧由注射器的喷嘴压住。或者，在连接注射器前插入一O形圈。

实例10-12：

实例10-12类似于实例4，但使用实例7-9中的装置。

在实例10中，作为实例7的替代装置，实例7中装置的制造者提供一预装载有孔片的装置(例如提供一经修改的注射器针头，其具有预装载有FTA^孔片的超长连接件)。然后使用者将所研究样品点样至孔片上并连接注射器。可将样品点干燥然后将所述装置储存备用。若需要，根据上述方法处理所述装置以获得所研究材料(例如DNA、RNA、蛋白质等)。

在实例11中，作为实例8的替代装置，实例8中装置的制造者提供一预装载有孔片的装置(例如提供一经修改的注射器针头，其具有预装载有FTA^孔片的超长连接件)。然后使用者将所研究样品点样至孔片上并连接注射器。可将样品点干燥然后将所述装置储存备用。若需要，根据上述方法处理所述装置以获得所研究材料(例如DNA、RNA、蛋白质等)。

在实例12中，作为实例9的替代装置，实例9中装置的制造者提供一预装载有孔片的装置(例如提供一预装载有FTA^孔片的下部)。然后使用者将所研究样品点样至孔片上并连接注射器。可将样品点干燥然后将所述装置储存备用。若需要，根据上述方法处理所述装置以获得所研究材料(例如DNA、RNA、蛋白质等)。

实例13：

使用实例1中的装置自孔片分离RNA。然而在处理RNA样品孔片时，根据业内习知的方法(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))，所使用的材料及溶液不含RNAse。

实例14：

使用实例1中的装置处理蛋白质孔片。在此实例中，通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBS：137mM NaCl；2.7mM KCl；6.3mM Na₂HPO₄；1.47raM KH₂P₄；pH 7.4)培养例如30-45mins来洗脱蛋白质。

实例15：

实施一实验以显示可使用与上述装置及方法类似的装置及方法将质粒DNA自一指示FTA^(Whatman)孔片上洗脱。用一200μl移液管作为装置的下部和一1000μl移液管尖端作为装置的上部来构造一装置。

将一预先点样有质粒DNA(pGEM-luc)的7mm FTA^孔片插入200μl移液管尖端中。将1000μl移液管尖端插入200μl尖端中直至其搁置在孔片顶部。(所述1000μl尖端的尖端末端已经缩短以形成所需长度来将孔片的位置保持在200μl尖端内。)

将质粒DNA如下所述自孔片洗脱：

a)将所述二尖端的总成连接至一1000μl移液器；

b)将100μl TF^-1(10mM Tris HCl(pH 8)及100μM EDTA(乙二胺四乙酸))吸收入尖端，且所述液体可接触孔片；

c)用TE^-1培养(室温下)一段时间后，用移液器使液体经过孔片上下移动三次；及

d)然后将液体收集至一微离心管中。将此洗脱液的一小等份(2μl)用于转化反应中。

如下所述通过电穿孔法实施转化：

1)将含有质粒DNA(或pUC 19 DNA作为标准品或TE^-1作为阴性对照)的2μl洗脱液添加至一冷冻微离心管(1.8ml管)中。

2)将20μl感受态细胞(ElectroMAX-DH5^α，Invitrogen)添加至上述离心管中。

3)将样品非常温和地混合。

4)将所获得混合物在冰上培养10min。

5)将全部数量的混合物转移至一冷冻电穿孔比色杯中(间隙0.1cm)。

6)将比色杯置于Bio-Rad微脉冲发生器中并施用一脉冲(Ecl程序)。使用间隙为0.1cm的比色杯时，Ecl程序施加1.8kV的电压。

7)紧接着，添加980μl S.O.C.介质(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂(pH 7.0)(含20mM葡萄糖))。

8)将液体自比色杯中转移至一14ml圆形Falcon底管中(BD产品代码2059)。

9)将样品在37℃下培养1hr同时以225rpm混合。

10)使样品在S.O.C.介质中稀释至1∶20而pUC标准品稀释至1∶100。

11)将100μl的各稀释液涂布于一LB/氨苄西林板上(Luria Broth(LB)：1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl(pH 7.0))(含100μg/ml氨苄西林(amp)及12.5g/L细菌培养用琼脂)。为每个经稀释样品制备两块板。

12)将板在37℃下培养过夜，并计算菌落数(结果参见表1)。

表1：使用电穿孔转化

样品#	说明	菌落数	菌落数	平均菌落数	转化	转化率(CFU/μg)
		菌落数	菌落数				A板	B板
		1	FTA^孔片(培养5min.)				A板	B板	4656	4896	4776	955,200	n/a
2	FTA^孔片(培养10min.)	1	FTA^孔片(培养5min.)	2920	2848	2884	576,800	n/a	4656	4896	4776	955,200	n/a
2	FTA^孔片(培养10min.)	3	FTA^孔片(培养10min.)	2920	2848	2884	576,800	n/a	3760	2992	3376	675,200	n/a
4	空白	3	FTA^孔片(培养10min.)	0	0	0	0	n/a	3760	2992	3376	675,200	n/a
4	空白	5	pUC对照	0	0	0	0	n/a	288	258	273	273,000	1.37E+10

上述结果显示，可使用上文所述装置所采用的原理将质粒DNA自FTA^孔片洗脱。

参考文献

Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版.)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989).

本申请案通篇以作者及年份及专利号引用包括美国专利在内的各种公开案。这些公开案及专利的全部揭示内容均以引用方式并入本申请案中，以更完整地说明本发明所涉及领域的状态。

已以说明的方式阐述本发明，而且应了解所使用的术语意指具有词语或说明的性质，而非具有限制性。

显然，根据上文所教示内容，可对本发明作出许多修改及改变。因此应了解，在本发明的范围内可以不同于具体描述内容的方式实施本发明。

Claims

1.一种用于处理来自含有所研究样品的基质的孔片的装置，其中所述装置包含：

a.包括一分配尖端的一第一元件，所述尖端包含：

i.具有一外部开口的一中空内轴；及

-所述第一室与所述分配尖端的内轴相通；而

-所述第二室包含一耦联开口；及

i.一中空内部；

iii.用于通过所述第一元件的所述第一耦联开口使所述第二元件的所述中空内部与所述第一内储液管之间相通的一第二耦联开口，其中所述第二外壳总成的尺寸经选择以使得当将一孔片置于所述第一元件的所述第一内储液管中时，界定所述第二耦联开口的凸缘有助于将所述孔片的位置维持在所述第一内储液管中并在所述第二元件的所述中空内部中形成一第二内储液管。

2.如权利要求1所述的装置，其中所述第一内储液管另外包含一孔片支撑件，其中所述孔片支撑件的尺寸经选择以使在一孔片置于所述孔片支撑件上且所述第一室充满液体时，置于所述孔片支撑件上的所述孔片大部分表面区域可接触所述第一室中的液体。

3.如权利要求2所述的装置，其中所述孔片支撑件包括一O形圈。

4.如权利要求2所述的装置，其中所述孔片支撑件包括具有一系列供液体流动的通道的肋形支撑件。

5.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述耦联部分通过一压力锁将所述第二元件啮合至所述第一元件上。

6.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述耦联部分通过机械锁闭机构将所述第二元件啮合至所述第一元件上。

7.如权利要求6所述的装置，其中所述机械锁闭机构包括扣接配合件或Luer锁。

8.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中在所述第一外壳总成中所述第一内储液管与所述中空内轴邻接。

9.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述第一元件的分配尖端包括微分配移液管尖端。

10.如权利要求9所述的装置，其中所述微分配移液管尖端包括毛细管微分配移液管尖端。

11.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述第二元件包括微分配移液管尖端。

12.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述装置适用于选自由下述组成的群组的微分配移液管：

d.单通道微分配移液管；

e.多通道微分配移液管；及

f.自动化微分配移液器或机器人。

13.如权利要求1所述的装置，其中所述第二元件包括一注射器，其选自由下述组成的群组：

a.手动注射器；及

b.机器人注射器。

14.如权利要求13所述的装置，其中所述第一元件适合于安装至注射器上，其中所述中空内轴收纳于注射器针头中。

15.如权利要求14所述的装置，其中所述第一外壳总成适合于安装在注射器与注射器针头之间。

16.如前述权利要求中任一项所述的装置，其另外包含：

c.一加热元件。

17.一种用于处理来自含有所研究样品的基质的孔片的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

b.如前述权利要求中任一项所述的装置；及

b.处理试剂。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述处理试剂包括洗脱缓冲液。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述洗脱缓冲液选自由下述组成的群：NaOH、乙酸钠、10mM 2-[N-吗啉基]-乙磺酸(MES)、10mM 3-[环己基胺基]-1-丙磺酸(CAPS)、TE、TE^-1、十二烷基硫酸钠(SDS)、山梨醇酐单-9-十八烯酸酯聚(氧-1，1-乙二基)、硫酸月桂基酯十二烷基酯(LDS)、或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的水溶液、10mMTris磷酸盐缓冲盐水(PBS)及水。

20.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述处理试剂包括指示剂。

21.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述处理试剂包括酶或光解试剂。

22.如权利要求17所述的试剂盒，其另外包含

c.一加热元件。

23.如权利要求17所述的试剂盒，其另外包含：

c.包含所研究样品的孔片。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述所研究样品包括：

iv.核酸；或

v.蛋白质或肽。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述所研究样品包括选自由下述组成的群组的核酸：基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、cDNA、寡核苷酸、病毒DNA或RNA、BAC、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA及总RNA。

26.一种用于处理来自含有所研究样品的基质的孔片的方法，其中所述方法包括：

vi.在基质上打孔以产生含有所研究样品的孔片；

vii.提供如前述权利要求任一项所述的装置；

viii.将所述基质插入所述装置第一元件的第一外壳总成中；

ix.将所述第一元件与所述第二元件耦联；

x.用处理试剂处理所述孔片。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述处理步骤包括：

xi.将所述处理试剂吸入所述第一元件中以使所述处理试剂接触到所述孔片；

xii.自所述第一元件中移出所述处理试剂。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述处理步骤包括：

a.将所述处理试剂吸入所述第一元件中以使所述处理试剂接触到所述孔片并将其经过孔片移入所述第二室中；

b.将所述处理试剂经过孔片推入所述第一室中；

c.自所述第一元件中移出所述处理试剂。

29.如权利要求27或权利要求28所述的方法，其中步骤i.另外包括所述孔片的培养。

30.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述耦联步骤包括通过压力或通过机械锁锁定。

31.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述处理试剂包括洗脱缓冲液。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述洗脱缓冲液选自由下述组成的群组：NaOH、乙酸钠、10mM 2-[N-吗啉基]-乙磺酸(MES)、10mM 3-[环己基胺基]-1-丙磺酸(CAPS)、TE、TE^-1、十二烷基硫酸钠(SDS)、山梨醇酐单-9-十八烯酸酯聚(氧-1，1-乙二基)、硫酸月桂基酯十二烷基酯(LDS)、或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的水溶液、10mMTris磷酸盐缓冲盐水(PBS)及水。

33.如权利要求31所述的方法，其中将所述洗脱缓冲液加热至40℃至125℃之间的温度，其中：

a.在与所述孔片接触之前将所述洗脱缓冲液加热；或

b.在所述第一外壳总成中在与所述孔片接触期间加热所述洗脱缓冲液。

34.如权利要求31所述的方法，其中将所述洗脱缓冲液加热至65℃与95℃之间的温度。

35.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述处理试剂包括指示剂。

36.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述处理试剂包括酶或光解试剂。

37.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述所研究样品包括核酸。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述核酸选自由下述组成的群组：基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、cDNA、寡核苷酸、BAC、病毒DNA或RNA、BAC、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA及总RNA。

39.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述研究样品包括蛋白质或肽。

40.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述基质包括：

a.纤维素基基质；

b.氧化硅基基质；或

xiii.塑胶基基质。