CN101273051B

CN101273051B - 聚合寡核苷酸前体药物

Info

Publication number: CN101273051B
Application number: CN2004800099149A
Authority: CN
Inventors: 赵洪; 理查德·B·格林沃尔德
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2003-04-13
Filing date: 2004-04-09
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2024-04-09
Also published as: CN101273051A; WO2004092191A8; SG170618A1; EP1620450A4; KR20060015505A; AU2004230927B9; US7595304B2; FI20051017A7; US20040235773A1; WO2004092191A2; AU2004230927B2; RU2394041C2; US8168605B2; AU2004230927A1; NZ542687A; FI20051017L; JP2007524608A; EP1620450A2; MXPA05011022A; RU2005135128A

Abstract

本发明公开了含有核苷酸和/或寡核苷酸的聚合物共轭物。

Description

聚合寡核苷酸前体药物

相关申请的交叉参考

本申请要求2003年4月13日提交的美国临时专利申请No.60/462,070的优先权，其内容在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及用作治疗药物的聚合寡核苷酸前体药物。同样也提供了此种前体药物的成分和用法。

背景技术

众所周知大多数多细胞生物的身体状态，包括大部分的疾病状态，受蛋白质的影响。这种蛋白质，直接作用或通过它们的酶或者其它功能进行作用，决定动物和人的大部分的疾病和调节功能。对于疾病病症，经典治疗通常集中在与这些蛋白质相互作用上来努力调节它们的发病或疾病增强功能。在较新的治疗方法中，目的为调节这些蛋白质的实际产量。通过干涉蛋白质的产量，可获得最大的治疗作用和最小的副作用。因此这些治疗方法通常的目标是干涉或调节基因表达，而其将导致产生不希望的蛋白质。

一种抑制特异基因表达的方法是利用寡核苷酸，特别是与特异性靶信使RNA(mRNA)序列互补的寡核苷酸。通常，互补于基因转录产物的核酸序列(例如mRNA)称为“反义的”，且与转录本具有相同的序列或成为转录本的核酸序列称为“正义的”。参见，例如，Crooke，1992，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol，32：329-376。反义寡核苷酸可选择杂交于全部的或基因的一部分，从而以这样的方式调节基因表达。转录因子与双链DNA在转录调控过程中相互作用。寡核苷酸可用作转录因子的竞争性抑制剂来调节它们的作用。一些最近的报告描述了这些相互作用(参见Bielinska，A.，等，1990，Science，250：997-1000；和Wu，H.，等.，1990，Gene 89：203-209)。

正在发展分子策略来下调不需要的基因表达。最近，通过利用修饰的寡核苷酸化合物已经发展成有前途的针对这些疾病如病毒感染、炎性的和遗传性紊乱以及重要肿瘤的治疗方法。反义DNAs是第一个被考虑作为直接针对天然存在的核酸的烷化互补寡脱氧核苷酸(Belikova等，Tetrahedron Lett.37：3557-3562，1967)。Zamecnik和Stephenson最先建议将合成的反义寡核苷酸用于治疗的目的。(Zamecnik&Stephenson，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：285-289；Zamecnik&Stephenson，1978，Proc.Natl.Acatl.Sci.U.S.A.，75：280-284)。他们报道说利用互补于Rous肉瘤病毒的RNA的寡核苷酸13-聚体抑制细胞培养物中病毒的生长。其后，许多的其它研究已被公开显示反义寡核苷酸抑制病毒生长的体外效果，例如，水疱性口腔炎病毒(Leonetti等.，1988，Gene，72：323)，单纯疱疹病毒(Smith等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：2787)，以及流感病毒(Seroa；等，1987，Nucleic Acids Res.15：9909)。

寡核苷酸也已被用于尤其是诊断试验，研究药物中例如在PCR技术及其它实验方法中的引物。寡核苷酸可常规合成包括适于目的应用的特性。因此许多的化学修饰已被引入到寡聚化合物中来提高它们作为研究药物以及作为治疗实体在诊断学中的用途。

尽管寡核苷酸，特别是反义寡核苷酸具有作为治疗药物的前景，它们对核酶非常敏感且可在它们进入目的细胞之前或之后被快速地降解，使得未修饰的反义寡核苷酸不适用于体内系统。因为负责降解的酶位于大多数组织中，对寡核苷酸的修饰已被进行以试图稳定化合物以及解决这些问题。最广泛的测试修饰已在寡核苷酸化合物的主链部分进行。通常参见Uhlmann和Peymann，1990，Chemical Reviews 90，第545-561页且参考文献在此引入。在进行的许多不同的主链中，仅仅硫代磷酸酯显示显著的反义活性。参见例如，Padmapriya和Agrawal，1993，Bioorg.&Med.Chenu.Lett.3 761。虽然向导入主链硫原子减缓了酶降解速率，其同样同时增加了毒性。添加硫原子的另一个缺点是其将主链由非手性转变为手性并且产生2ⁿ非对映体。此可能引起进一步的副作用。该反义寡核苷酸的更进一步的缺点是它们可能在磷酸基上携带负电荷，从而抑制其穿过主要亲脂性细胞膜的能力。化合物保持在细胞外面越久，其降解越多，进而导致较少的活性化合物达到目标。该反义化合物进一步的缺点是寡核苷酸倾向于形成次级和高阶的溶液结构。一旦这些结构形成，它们成为各种酶、蛋白质、RNA和DNA结合的靶。此导致非特异性的副作用并且降低活性物质结合于mRNA的量。其它改善寡核苷酸疗法的尝试包括添加连接部分和聚乙二醇。参见例如，Kawaguchi，等，Stability，Specific Binding Activity，and Plasma Concentration in Mice of an Oligodeoxynucleotide Modified at5′-Terminal with Poly(ethylene glycol)，Biol.Pharm.Bull.，18(3)474-476(1995)，以及US专利No.4,904,582。在这两个实例中，修饰涉及利用本质上稳定的连接部分来稳定化寡核苷酸抵抗降解以及增加细胞渗透性。然而，这两种努力未能提供任何的效果。

由于现有方法的不足，人们需要改善对核酶降解的稳定性和抗性以及减少毒性和增加对寡核苷酸化合物的mRNA的结合亲合性。

目前的寡核苷酸疗法是昂贵的。这主要地取决于降解问题。因此，确实需要保护反义寡核苷酸化合物抵抗降解，预防高阶结构的形成并且同时输送充分量的活性反义寡核苷酸化合物到达目标。本发明提供了这些改进。

发明概述

在本发明的一个方面，提供了式(I)的寡核苷酸前体药物：

其中：

R₁和R₂独立地为H或聚合物残基；

L₁和L₄独立地为选择的可释放的连接部分；

L₂和L₃独立地为选择的间隔基团；

X₁为核苷酸残基或寡核苷酸残基；

m，n，o和p独立地为零或正整数，条件是(o+n)或(p+m)≥2。

本发明的另一方面包括当R₁和/或R₂为聚合物残基时形成的双功能化合物，包括如在这里描述的α和ω末端连接基团使得两个寡核苷酸连接于所提供的聚合物递送系统。此实施方案的实例包括通过各自的3′-，5′-末端基团连接于聚合物系统的寡核苷酸，例如3′-双寡核苷酸共轭物或5’-双寡核苷酸共轭物，或通过第一寡核苷酸的3′-末端连接于第二寡核苷酸的5′末端形成的共轭物。此种聚合物共轭物的实例图示在下式(i)，(ii)，(iii)和(iv)中：

双-3’-寡核苷酸，

双-5’-寡核苷酸，

双-5’，3’-寡核苷酸，和

双-3’，5’-寡核苷酸

其中所有的变化如上所述。

对本发明而言，术语“残基”应理解为生物学活性化合物的部分即寡核苷酸，更具体地为反义寡核苷酸，其经历取代反应后仍保持的部分，其中前体药物载体已经连接。

对本发明来说，术语“聚合物残基”或“PEG残基”应理解为经历与修饰的寡核苷酸化合物反应后仍保持的聚合物或PEG的部分。

对本发明来说，术语“烷基”应理解为包括直链的，支链的，取代的，例如卤素-，烷氧基-，硝基-，C_1-12烷基，C_3-8环烷基或取代的环烷基，等等。

对本发明来说，术语“取代的”应理解为包括添加或替换一或多个包含在功能团或具有一或多个不同原子的化合物内的原子。

对本发明来说，取代的烷基包括羧基烷基，氨基烷基，二烷基氨基，羟烷基和硫代烷基；取代的烯基包括羧基烯基，氨基烯基，二烯基氨基，羟基烯基和硫代烯基；取代的炔基包括羧基炔基，氨基炔基，二炔基氨基，羟基炔基和硫代炔基；取代的环烷基包括诸如4-氯环己基部分；芳基包括萘基部分；取代的芳基包括诸如3-溴-苯基部分；芳烷基包括诸如甲苯酰基部分；杂烷基包括诸如乙基噻吩部分；取代的杂烷基包括部分诸如3-甲氧基-噻吩部分；烷氧基包括诸如甲氧基部分；以及苯氧基包括诸如3-硝基苯氧基部分。卤代-应理解为包括氟代，氯代，碘代和溴代。

术语“充分量”或“有效量”在本发明中是指达到本领域普通技术人员所理解的治疗效果的量。

本发明的一些主要优点包括已证明具有增加的对核酸酶降解的稳定性和抗性，增加的可溶性，增加的细胞透性以及减少的毒性的新的聚合寡核苷酸前体药物。

本发明化合物的另一个优点是多种的聚合物前体药物平台可释放地连接于修饰的寡核苷酸化合物。此优点可以使技术人员设计药物共轭物，其可以被处理来包括聚合物残基之间的不同部分以及可影响前体药物水解速率的连接的寡核苷酸。技术人员因此能够来包括允许调节前体药物水解速率的取代基。

本发明也提供了化合物的制备以及诸如在治疗癌或恶性肿瘤方法中使用方法，以及在这里描述的共轭物。本发明的聚合物寡核苷酸前体药物可考虑与任何其它适当的抗癌药物一起(同时和/或依次)施用。

附图说明

图1图解了制备化合物3和5的PEGylated寡核苷酸的方法。

图2图解了制备化合物7和9的PEGylated寡核苷酸的方法。

图3图解了制备化合物11，12(SEQ ID NO：1)和14(SEQ ID NO：1)的PEGylated寡核苷酸的方法。

图4图解了制备化合物16(SEQ ID NO：1)的PEGylated寡核苷酸的方法。

图5图解了由AS1(SEQ ID NO：2)，AS2(SEQ ID NO：3)和AS3(SEQ ID NO：4)制备化合物17(SEQ ID NO：2)，18(SEQ ID NO：3)和19(SEQ ID NO：4)的PEGylated寡核苷酸的方法。

图6图解了制备化合物21(SEQ ID NO：1)和22(SEQ ID NO：2)的PEGylated寡核苷酸的方法。

图7图解了制备化合物24(SEQ ID NO：1)和26(SEQ ID NO：1)的PEGylated寡核苷酸的方法。

图8图解了由AS1(SEQ ID NO：2)，AS2(SEQ ID NO：3)和AS3(SEQ ID NO：4)制备化合物28(SEQ ID NO：1)，29(SEQ ID NO：2)，30(SEQ ID NO：3)和31(SEQ ID NO：4)的PEGylated寡核苷酸的方法。

图9图解了制备化合物33(SEQ ID NO：1)和35(SEQ ID NO：1)的PEGylated寡核苷酸的方法。

图10图解了化合物14和化合物28对PC3细胞生长的抑制作用。将0.4×10⁴个细胞接种在96-孔平皿中，在Opti-MEM中用化合物14或化合物28(400nM)和Lipofectin(15μg/ml)的复合物处理24小时然后在无复合物的完全培养基中处理。每天测定细胞活力，以及测定570nm处的吸光率。数据表示为平均数±标准偏差；n＝4。曲线如下：

对照用◆和点曲线标记；

400nM处的化合物28用和实线曲线标记；

400nM处的化合物14用▲和虚曲线标记；

400nM处的化合物28用

和虚曲线标记；

200nM处的化合物14用■和点曲线标记。

附图11A提供了通过化合物14和化合物28寡核苷酸产生的ROS产量的概要(由流细胞计数法分析)，通过检测细胞-渗透性2′，7′-二氢二氯荧光素双乙酸盐氧化为荧光2′，7′-二氯荧光素(DCF)。PC3细胞用寡核苷酸(400nM)/Lipofectin(15μg/ml)复合物处理24小时，并且3天后如所描述的进行测定。平均荧光信道的增加倍数用未处理的细胞进行校正。实验并行重复三次且数据表示为平均值±标准偏差(n＝3)。

附图11B提供了由化合物14和化合物28寡核苷酸产生的ROS产量(由流细胞计数法分析)的概要，通过检测氢化溴乙非啶(HE)氧化为溴乙非啶(E)，其随后插入到具有可通过流式细胞术检测荧光的DNA中进行。用寡核苷酸(400nM)/Lipofectin(15μg/ml)复合物处理PC3细胞24小时，3天后如所描述的进行测定。平均荧光信道的增加倍数用未处理的细胞进行校正。实验并行重复三次且数据表示为平均值±标准偏差(n＝3)。

图12是证明在Lipofectin存在下化合物14抑制bcl-2蛋白质表达的Western印迹结果。PC3细胞用化合物14寡核苷酸(200，400和800nM)在Lipofectin存在下(+Lipo)和缺乏(-Lipo)时在Opti-MEM中处理24小时，然后在完全培养基中进一步处理67小时。通过物质和方法部分中描述的Western印迹法分析蛋白质样品(30-40μg的蛋白质/泳道)，用微管蛋白用作对照蛋白质种类。“C”表示对照。

发明详述

相应地，本发明提供了具有许多实际用途包括，用作诊断和分析试剂，作为体外和体内的分析和研究手段，以及作为治疗药物的聚合物-连接的寡核苷酸前体药物。为了更充分地理解本发明的范围，下列对术语进行定义。技术人员将理解术语“核酸”或“核苷酸”是指脱氧核糖核酸(“DNA”)，核糖核酸(“RNA”)，无论单链或双链，除非另作说明，及其任意的化学修饰。“寡核苷酸”通常是相对短的多核苷酸，例如，从约2到约200个核苷酸的大小，或更优选地由约10到约30个核苷酸的长度。本发明的寡核苷酸通常是合成的核酸，且是单链的，除非另作说明。术语“多核苷酸”和“多核酸”在这里可用作同义词。

本发明对寡核苷酸的修饰任选地包括，例如，用官能团或部分添加或取代所选择的核苷酸，使寡核苷酸共价连接于理想的聚合物，和/或添加或取代功能性部分，使寡核苷酸加入额外的电荷，极化性，氢键，静电作用和功能性。这些修饰包括，但不限于，2′-位置糖修饰，5-位置嘧啶修饰，8-位置嘌呤修饰，环外胺的修饰，4-硫尿苷取代，5-溴或5-碘尿嘧啶取代，主链修饰，甲基化，碱基对组合诸如异碱基异胞嘧啶和异胍，及其类似的组合。寡核苷酸修饰还可以包括3′和5′修饰诸如封端。

在这里使用的术语“反义”，是指核苷酸序列互补于编码基因产物或编码对照序列的特异性DNA或RNA序列。术语“反义链”是指互补于“正义”链的核酸链。在正常的细胞代谢中，DNA分子的正义链是编码多肽和/或其它基因产物的链。正义链用作模板用于信使RNA(“mRNA”)转录本(反义链)的合成，其随后直接合成所有的编码基因产物。反义核酸分子可通过任意本领域已知的方法产生，包括通过在反方向连接目的基因到允许互补链合成的病毒启动子进行的合成。一旦导入到细胞中，此转录链与由细胞产生的天然序列结合来形成双链体。此双链体然后阻断进一步转录或翻译。在此方式中，可产生突变的表型。“负″或(-)同样是本领域公知的是指反义链，且“正的”或(+)同样是本领域公知的指正义链。

例如，如果打算下调细胞中mRNA转录本的表达，则将反义寡核苷酸导入到细胞中。一旦导入到细胞中，反义寡核苷酸与相应的mRNA序列通过Watson-Crick结合进行杂交形成异双倍体。一旦形成双链，由结合mRNA的序列编码的蛋白质的翻译被抑制。因此，反义寡核苷酸在本领域中也用作通常连接标签或标记的探针，例如，杂交探针，以及用来提供特异性细胞产物或遗传调控元件表达的精确下调从而用于研究和治疗两种目的。

对本发明而言，单数或复数的应用并非是对参考术语或目标数值的限制。因此，细胞，聚合物或药物的单数的应用不意味仅仅治疗一个细胞，仅仅一个分子被制备或使用，和/或仅仅一种药物被使用，且复数的应用不排除应用于单个参考术语，除非明确地说明。

对本发明而言，术语“残基”应理解为是指生物学活性物质的部分，诸如寡核苷酸，其已经进行反应后仍保持，其中前体药物载体部分已通过修饰例如，有效的羟基或氨基进行连接，来分别形成例如酯或酰胺基。

A.寡核苷酸的描述

本发明的一个特征是提供改进的核苷酸或寡核苷酸聚合共轭物。在这里描述的聚合物运输系统不限于单个种类的寡核苷酸但，反而，是指与多种的此类部分一起作用，可以理解聚合物运输系统可连接于一或多种3′-或5′-末端，通常核苷酸的PO₄或SO₄基团。核苷酸序列在这里使用常规的命名法进行描述，其中序列从左至右阅读，由5′-末端到3′-末端(5′-→3′-)。

X_1-3表示相同的或不同的核苷酸或寡核苷酸残基，其对本发明来说包括寡脱氧核苷酸残基。更优选地，X_1-3是独立选择的反义寡核苷酸残基或反义寡脱氧核苷酸残基。

可单独或作为寡核苷酸(10-1,000个核苷酸)的一部分使用的潜在核苷酸的非-限制性实例包括：

其中

M是O或S；

B₁和B₂独立地选自A(腺嘌呤)，G(鸟嘌呤)，C(胞嘧啶)，T(胸腺嘧啶)，U(尿嘧啶)和修饰的碱基，包括下面显示的和普通技术人员所公知的；

R₁₀₀和R₁₀₁独立地选自H，OR′其中R’是H，C_1-6烷基，取代的烷基，硝基，卤素，芳基等等。

用于本发明方法的一些寡核苷酸和寡脱氧核苷酸包括，但不限于，下列：

具有天然磷酸二酯主链或硫代磷酸酯主链或任意其它修饰主链类似物的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸；

LNA(锁核酸)；

PNA(具有肽主链的核酸)；

三环-DNA；

decoy ODN(双链寡核苷酸)；

RNA(催化的RNA序列)；

核酶；

spiegelmers(L-构象的寡核苷酸)；

CpG寡聚物，等等，诸如公开在：

Tides 2002，Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences，May 6-8，2002，Las Vegas，NV以及

Oligonucleotide&Peptide Technologies，18th&19th November2003，Hamburg，Germany，其内容在此引入作为参考。

本发明的寡核苷酸可任选地包括任意适当的本领域已知的核苷酸类似物和衍生物，包括下面表1所列举的。

优选地，反义寡核苷酸下调参与肿瘤细胞针对抗癌治疗抗性的蛋白质。例如，蛋白质BCL-2抑制细胞色素-C和细胞凋亡激发因子从线粒体的释放并且因此预防细胞凋亡的发生。具有高水平BCL-2的癌细胞因此对化疗或放射治疗非常有抗性。US专利No.6,414,134，引入作为参考，描述了下调节与大量肿瘤细胞对抗癌治疗的抗性有关的蛋白Bcl-2的反义寡核苷酸，例如，包括前列腺癌细胞，骨髓瘤细胞及其它肿瘤细胞。根据上述US专利，bcl-2基因被认为主要是通过延长肿瘤细胞存活而不是通过促进细胞分裂有助于癌的发病。美国专利No.6,414,134描述了17到35个碱基长的反义寡核苷酸，其互补于bcl-2mRNA，并且包括具有序列TACCGCGTGC GACCCTC(SEQIDNO：5)的核酸分子。这些优选地包括至少一个硫代磷酸酯键。

其它本领域已知的各公司作为通过反义寡核苷酸下调节用于癌治疗目标的细胞蛋白，概括在下表中。

表2

适于下调节与癌细胞存活相关的蛋白质的表达诸如bcl-2表达的反义寡核苷酸，包括从约2到两百个核苷酸密码子的寡核苷酸；更优选地十个到四十个密码子；以及最优选地约17到20个密码子。寡核苷酸优选地选自互补于沿着bcl-2的前mRNA的关键位点的那些寡核苷酸，诸如翻译起始位点，供体和剪接位点，或转运或降解位点。

在这些关键的位点阻断翻译阻止功能性bcl-2基因产物的形成。然而，应能理解，包括互补或基本上互补于抑制细胞增殖的bcl-2前mRNA或mRNA的寡核苷酸的反密码寡聚物的任意组合或亚组合适于用在本发明中。例如，互补于bcl-2RNA的连续或非-连续延伸的序列部分的寡脱氧核苷酸可抑制细胞增殖，并且将因此适用于本发明方法中。

适用于下调节bcl-2表达的寡核苷酸同样包括互补或基本上互补于侧接关键的或其它沿着bcl-2mRNA的位点的序列部分的寡核苷酸。侧接序列部分优选地约两个到约一百个碱基，在沿着bcl-2mRNA的上述位点的上游或下游。这些位点优选地约五个到约二十个密码子长。优选的寡核苷酸互补于通常在其它基因的前mRNA或mRNA中不常发现的前mRNA或mRNA的序列部分，以最小化寡核苷酸与编码其它基因的前mRNA或mRNA链的同源性。

大量优选的反义或互补的，下调节bcl-2的寡核苷酸列举在下表3中。

应能理解可使用的反义寡核苷酸含有更或较少的取代的核苷酸，和/或沿着bcl-2mRNA链在相对于上述表3中所列举的3′或5′方向进一步延伸。

优选地，用于本发明前体药物的反义寡核苷酸与Genasense(a/k/a奥利默森钠(oblimersen sodium)，Genta Inc.生产的，Berkeley Heights，NJ)具有相同的或基本上类似的核苷酸序列。Genasense是18-聚体的硫代磷酸酯反义寡核苷酸，TCTCCCAGCGTGCGCCAT(SEQ ID NO：1)，也即互补于人bcl-2mRNA的起始序列的最初的六个密码子(人bcl-2mRNA是本领域已知的，并且在美国专利6,414,134中描述为SEQ IDNO：19，在这里引入作为参考)。美国食品与药品管理局(FDA)已经在2000年8月授予Genasense孤儿药资格，并且已经接受Genasense在癌症治疗中的新药申请(NDA)。NDA主张Genasense与氮烯唑胺结合用于以前没有接收化疗的黑色素瘤患者的治疗。此外，FDA授予了该申请的优先审核，其在2004年6月8号当天或之前提出了上市申请。参见Chi等，2001，Clinical Cancer Research Vol.7，3920-3927，引入作为参考，证明了Genasense在前列腺癌早期临床试验中联合治疗的活性。本发明的前体药物具有与天然的(未修饰的)18-聚体所认识的相同应用。

Genasense已被表明下调节Bcl-2蛋白质的产量以及增强肿瘤细胞对治疗的敏感性并且最终导致细胞死亡。大量研究报道在用Genasense与抗癌药物结合治疗中产生希望的结果。Genasense与氮烯唑胺组合对黑色素瘤患者的I/II阶段试验显示出希望的活性并且正在进行阶段III多信道试验。此外，Genasense，与米托蒽醌结合用于激素抗性前列腺癌患者显示出期望的结果。Kim等，2001，Id。

反义寡核苷酸诸如Genasense与聚合物的偶联作为本发明优选实施方案的例子。

在一个任选的实施方案中，其它适当的反义寡核苷酸包括：

T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T；(化合物13-SEQ IDNO：1)

T-C-T-C-C-C-A-G-C-A-T-G-T-G-C-C-A-T；(化合物36-SEQ IDNO：2)

A-T-C-C-T-A-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-T-T；(化合物37-SEQ IDNO：3)和

T-C-T-C-C-C-A-G-X-G-T-G-X-G-C-C-A-T，(化合物38-SEQ IDNO：4)

以及在实施例中的那些反义寡核苷酸。

B.式(I)

在本发明一个优选的实施方案中，提供了式(I)寡核苷酸前体药物：

其中：

R₁和R₂独立地为H或聚合物残基；

L₁和L₄独立地为选择的可释放连接部分；

L₂和L₃独立地为选择的间隔基团；

X₁为核苷酸残基或寡核苷酸残基；m，n，o和p独立地为零或正整数，条件是(o+n)或(p+m)≥2。

本发明的聚合物运输系统在某种程度上基于R₁和R₂的最少一个，优选地为聚合物残基，任选地具有在这里命名为A的封端基团。合适的封端基团包括，例如，OH，NH₂，SH，CO₂H，C_1-6烷基，以及含有诸如如下基团的寡核苷酸：

其中X₂和X₃与X₁相同或为另一种核苷酸或寡核苷酸残基。

优选的封端基团(II)和(III)允许下式(i)，(ii)，(iii)和(iv)的组合物形成：

双-3’-寡核苷酸，

双-5’-寡核苷酸，

双-5’，3’-寡核苷酸，和

双-3’，5’-寡核苷酸，

其中所有的变化如上面描述。

在本发明另一个优选的实施方案中，L₄为选自下式的可释放连接部分：

其中：

Y_1-25独立地选自O，S或NR₉；

R_6-7，R_9-13，R_16-25和R_27-41独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；

Ar为形成多-取代芬香烃或多-取代杂环基团的部分；

L_5-12独立地为双功能的间隔基；

Z选自主动运输到靶细胞中的部分，疏水性部分，双功能的连接部分及其组合；

c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′，和h′独立地为选择的正整数；

a，e，g，j，t，z，a′，z′，e′和g′独立地为零或正整数；和

b，d，f，i，u，q，b′，d′和f独立地为零或一。

在另一个优选的实施方案中，L₁为选自下式的可释放连接部分：

其中

Y_1’-Y_25’独立地选自O，S或NR₉；

R_6′-7′，R_9′-13′，R_16′-25′，和R₂7_′-41′独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；和

L_5′-12’独立地为双功能的间隔基。

在本发明一些优选的实施方案中，L_5-12独立地为双功能的间隔基，选自：

-(CH₂)₃-，

-C(O)NH(CH₂)₃-，

-NH(CH₂)₃-，

-(CR₅₅R₅₆)_sO(CR₅₇R₅₈)_tC(O)-

-NR₅₉(CH₂)_′(OCH₂CH₂)_′NH-

-(CH₂CH₂)_sNH-

-O(CR₅₅R₅₆)_sNH-

-NR₅₉(CR₅₇R₅₈)_tC(O)NH(CR₅₅R₅₆)_sC(O)-

-O(CH₂)_sOC(O)-

-NR₅₉(CR₅₅R₅₆)_sC(O)-

-NR₅₉(CH₂)_t(OCH₂CH₂)_sNHC(O)-

-NR₅₉(OCH₂CH₂)_sOC(O)-

-O(CR₅₅R₅₆)_sNHC(O)-

-O(CR₅₅R₅₆)_sOC(O)-

(OCH₂CH₂)_sNHC(O)-

且L_5′-12’独立地为双功能的间隔基，选自：

-(CH₂)₃-，

-(CH₂)₃NH-C(O)，

-(CH₂)₃NH-，

-C(O)(CR_57′R_58′)_s′O(CR_55′R_56′)_t′

-NH(CH₂CH₂O)_S’(CH₂)_t′NR_59′-，

-NH(CH₂CH₂O)_s′-，

-NH(CR_55′R_56′)_s′O-，

-C(O)(CR_55′R_56′)_s′NHC(O)(CR_57′R_58′)_t′NR_59′-，

-(O)O(CH₂)_s′O-，

-C(O)(CR_55′R_56′)_s′NR_59′-，

-C(O)NH(CH₂CH₂O)_s′(CH₂)_t′NR_59′-，

-C(O)O-(CH₂CH₂O)_s′NR_59′-，

-C(O)NH(CR_55′R_56′)_s′O-，

-C(O)O(CR_55′R_56′)_s′O-，

-C(O)NH(CH₂CH₂O)_s′-，

其中

R_55-R59且R_55′-59′独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；和

R₆₀和R_60′选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基，NO₂，卤烷基和卤素；和

s′和t′各自为正整数。

在本发明另一个优选的实施方案中，L₂和L₃独立地为具有大约1到大约60个碳原子和约1到约10个杂原子的间隔基。优选地，L₂和L₃独立地为具有约2到约10个碳原子和约1到约6个杂原子的间隔基。最优选的，L₃选自下式：

-Q(CR₅₀R₅₁)_q′-，

-Q(CR₅₀R₅₁)_q′O(CR₅₂R₅₃)_r′

-Q(CH₂CH₂O)_q′(CR₅₂R₅₃)_r′-，

-QCR₅₀R₅₁)_q′NHC(O)(CR₅₂R₅₃)_r′-，

和

-Q(CH₂)_q′-S-S-(CH₂)r_′-；和

最优选地，L₂选自：

-(CR_50′R_51′)_q′Q′-，

-(CR_52′R_53′)_r′O(CR_50′R_51′)_q′Q′-

-(CR_52′R_53′)_r′(OCH₂CH₂)Q′-，

-(CR_52′R_53′)_r′C(O)NH(CR_50′R_51′)_q′Q′-

和

-(CH₂)-S-S-(CH2)_q’Q-

其中

Q和Q′独立地选自O，S或NH；

R_50-53和R_50′-53′独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；

R₅₄和R_54′选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基，C_1-6杂烷氧基，NO₂，卤烷基和卤素；和

q′和r′各自为正整数。

包括本发明通式的其它变化，以下为优选的：

Y_1-25和Y_1′-25′独立地选自基团O，S或NR₉；

R_6-7，R_9-13，R_16-25，R_27-41，和R_6′-7′，R_9′-13′，R_16′-25′，和R_27′-41′独立地选自基团氢，C_1-6烷基，C_3-8环烷基，芳基，芳烷基，和C_1-6杂烷基；

c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′，和h′为一；

a，e，g，j，t，z，a′，z′，e′和g′独立地为零或一；和

b，d，f，i，u，q，b′，d′和f独立地为零或一。

在本发明又一优选的实施方案中，提供了式(Ia)的化合物：

其中：

L₂为间隔基；

X₁为核苷酸或寡核苷酸残基；

u’为正整数；和

T为分支聚合物，其优选地选自在PCT公开号W002/065988和W002/066066中描述的那些化合物，其内容在此引入作为参考。这些通式中，下列的为优选的：

其中：

D’是一个

其中R₆₁为聚合物残基诸如R₁所定义的，当R₆₁显示在两个末端上具有取代时该聚合物可以是双功能的；所有的其它变化如上所述。

为进行说明，非-限定的式(Ia)化合物为：

其中所有的变化如上所述。

式(Ia)的另一方面包括双功能的化合物，其在当聚合物残基(R₆₁)包括两个α和ω末端连接基使得至少四个寡核苷酸被递送时形成的。

这些聚合共轭物的实例如式(vi)和(vii)所说明的：

其中所有的变化如上所述。

-Q(CR₅₀R₅₁)_q′-，

-Q(CR₅₀R₅₁)_q′O(CR₅₂R₅₃)_r′

-Q(CH₂CH₂O)_q′(CR₅₂R₅₃)_r′-，

-Q(CR₅₀R₅₁)_q′NHC(O)(CR₅₂R₅₃)_r′-，

和

-Q(CH₂)_q′-S-S-(CH₂)_r′-；和

最优选地，L₂选自：

-(CR_50′R_51′)_q′Q′-，

-(CR_52′R_53′)_r′O(CR_50′R_51′)_q′Q′-

-(CR_52′R_53′)_r′(OCH₂CH₂)Q′-，

-(CR_52′R_53′)_r′C(O)NH(CR_50′R_51′)_q′Q′-

和

-(CH₂)-S-S-(CH₂)_q’Q-

其中

Q和Q′独立地选自O，S或NH；

R₅₄和R_54′独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基，C_1-6杂烷氧基，NO₂，卤烷基和卤素；和

q′和r′各自为正整数。

关于包括本发明通式的变化，以下的为优选的：

Y_1-25和Y_1′-25′独立地选自基团O，S或NR₉；

R_6-7，R_9-13，R_16-25，R_27-41，和R_6′-7′，R_9′-13′，R_16′-25′，和R_27′-41′独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-8环烷基，芳基，芳烷基，和C_1-6杂烷基；

c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′，和h′为一；

a，e，g，j，t，z，a′，z′，e′和g′独立地为零或一；和

b，d，f，i，u，q，b′，d′和f独立地为零或一。

C.Ar部分的描述

在本发明的特定方面，能够看出Ar部分是其当包含在式(I)内时形成多-取代芳香烃或多-取代杂环基团的部分。主要特征是Ar部分本质上是芳香族的。通常，对芳香烃而言，π电子必须共享在环状分子平面的上或下方的“电子云”内。此外，π电子的数目必须满足休克尔规则(4n+2)。普通技术人员能够理解无数的部分将满足式(I)部分的芳香烃的要求且因此适于在这里使用。

一些尤其优选的芳香基包括：

其中R_62-67独立地选自与定义的R₆相同的基团。

其它优选的芳香烃部分包括，但不限于

其中E和E’独立地为CR₆₈或NR₆₉；且J为O，S或NR₇₀，其中R_68-70选自与定义R₆相同的基团或氰基，硝基，羧基，酰基，取代的酰基或羧基烷基。五和六元环的异构体也被考虑以及苯并-和二苯并-系统及其相关的同源物也被考虑在内。普通技术人员能够理解芳香环可任选地用杂原子诸如O，S，NR₉等取代。只要其符合休克尔规则。

此外，芳香族的或杂环结构可任选地用卤素和/或如本领域通常理解的侧链取代。

D.聚醚

关于式(I)能够看出其中的R₁和R₂为聚合部分诸如聚醚。这些聚合物的合适实例包括聚乙二醇，其基本上是非-抗原性的。同样有用的为聚丙二醇，诸如通常在USNo.5,643,575,5,919,455和6,113,906描述的。其它对本发明方法有用的PEG描述在Shearwater Polymers，Inc.catalog″Polyethylene Glycol and Derivatives 2001″中。每一内容引入作为参考。R₁和R₂优选地为PEG衍生物，例如-O-(CH₂CH₂O)_x-。在此方面，R_1-2独立地选自：

J-O-(CH₂CH₂O)_n，

-J-O-(CH₂CH₂O)_n，-CH₂C(O)-O-，

J-O-(CH₂CH₂O)_n′-CH₂CH₂NR₄₈-，

J-O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂SH，

-O-C(O)CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n’-CH₂C(O)-O-，

-NR₄₈CH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n’-CH₂CH₂NR₄₈-，

-SHCH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n′-CH₂CH₂SH-，

其中

n’为选择的聚合度，使得加权平均分子量为至少约2,000Da到约136,000Da；

R₄₈选自氢，C_1-6烷基，C_3-12分支的烷基，C_3-8环烷基，C_1-6取代的烷基，C_3-8取代的环烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C_1-6杂烷基，取代的C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；和

J为封端基团诸如甲基或互补连接基团其可以提供双功能的聚合物。

尽管PAO’s和PEG’s在加权平均分子量上基本上可以改变，优选地，在本发明的大多数方面，R₁和R₂独立地具有约2,000Da到约136,000Da的加权平均分子量。更优选地，R₁和R₂独立地具有约3,000Da到约100,000Da的加权平均分子量，最优选具有约5,000Da到约40,000Da加权平均分子量。

在这里包括的聚合物优选地室温下是水溶性的。此种聚合物非-限制性的例子包括聚醚同聚物诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙烯乙二醇，聚氧乙烯化多元醇，其共聚物及其嵌段共聚物，只要保持嵌段共聚物的水溶性。

E寡核苷酸聚合物共轭物的合成

通常制备前体药物是通过如下步骤制备的：

a)将式：

R₂-L₄-离去基团

的化合物

与式：

H-L₃-X₁的化合物

在足以形成下式前体药物的条件下反应：

R₂-L₄-L₃-X₁，

其中：

R₂是聚合物残基；

L₄是可释放的连接部分；

L₂为间隔基；

X₁为核苷酸或寡核苷酸残基。

在本发明的这个方面，优选使用激活的聚合物其已含有所连接的可释放接头。合适组合的非限制性的例子包括在美国专利Nos.6,624,142，6,303,569，5,965,119，6,566,506，5,965,119，6,303,569，6,624,142，和6,180,095描述的基于可释放PEG的运输系统。每一内容在这里引入作为参考。

特定的实例包括但不限于，

可以理解聚合物部分的分子量可以根据技术人员的需要进行变化。

然后上面所示的聚合物的可释放接头与修饰的寡聚物在足以允许共轭物形成的条件下反应。

如上所述的任意核苷酸或寡核苷酸可在5′-或3′-末端磷酸酯或硫代磷酸酯中的一个利用常规技术功能化，诸如利用亚磷酰胺法连接目的烷基-氨基或其它基团到末端磷酸上。例如，连接被保护的(Fmoc)氨基烷基，生成的化合物被氧化、去保护和纯化。

特异性寡核苷酸聚合共轭物或前体药物的合成描述在实施例中。任选地，可通过下述来制备：

1)将激活的PEG聚合物与保护的双功能可释放的连接基团在合适的偶联条件下反应来形成第一中间体，

2)用合适的活化基团诸如NHS酯去保护和激活步骤1)的中间体，和

3)将步骤2)的激活中间体与在PBS缓冲系统中的修饰寡核苷酸反应来获得目的寡核苷酸聚合物前体药物。

活化聚合物的非-限制性实例包括二-琥珀酰碳酸酯活化的PEG(SC-PEG)，二-四氢噻唑-2-硫酮激活的PEG(T-PEG)，N-羟基邻苯二酰胺基碳酸酯激活的PEG(BSC-PEG)，(通常参见USSN 09/823,296，其内容在这里引入作为参考)，琥珀酰琥珀酸酯激活的PEG(SS-PEG)和单-激活的PEG，诸如例如参见上述的2001Shearwater目录。

激活的PEG聚合物与保护的双功能可释放连接基团的偶联可在偶联剂的存在下进行。合适偶联剂的非-限制性列举包括1，3-二异丙基碳二亚胺(DIPC)，任意合适的二烷基碳二亚胺，2-卤素-1-烷基-吡啶卤化物(Mukaiyama试剂)，1-(3二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，丙烷膦酸环酸酐(PPACA)和苯基二氯磷酸酯等等。其可获自，例如商业来源诸如Sigma-Aldrich Chemical，或利用已知技术进行合成。

优选地取代基在惰性溶剂诸如四氢呋喃(THF)，乙腈(CH3CN)，二氯甲烷(DCM)，氯仿(CHCl3)，二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中以及在0℃至22℃(室温)下反应。

修饰的寡核苷酸与PEG-可释放接头的偶联可在约7.4-8.5pH的PBS缓冲系统中进行。技术人员能够理解在这里描述的前体药物的合成，同样包括使用通常的实验室条件，即，诸如在实施例中描述的溶剂，温度，偶联剂等等。

与选择的合成无关，由在这里描述的合成技术产生的一些优选化合物包括：

其中

表示寡核苷酸和末端磷酸酯修饰的点且mPEG为CH₃-O-(CH₂-CH₂-O)_X-；其中x是选自约10到约2300的正整数。

本发明更优选的化合物包括：

G.处理方法

本发明的另一方面提供了哺乳动物中使用不同药物的治疗方法。方法包括对需要此种治疗的哺乳动物进行施用有效量的寡核苷酸前体药物，其已通过在这里的描述进行制备。组合物用于，尤其是，治疗肿瘤疾病，降低肿瘤重量，预防肿瘤转移和预防肿瘤/肿瘤发展、肝脏疾病、病毒病诸如哺乳动物中HIV的复发。本发明的前体药物无论是天然的寡核苷酸或反义寡核苷酸可用于，即肿瘤治疗等等。简单举例来说，本发明的前体药物可用于治疗多发性骨髓瘤，慢性淋巴细胞性白血病，非-小细胞肺癌，小细胞肺癌，前列腺肿瘤及其它肿瘤或大量提及的常见肿瘤。

前体药物施用的量取决于母体分子包括待治疗的病症。通常，治疗方法中使用的前体药物量为有效地实现哺乳动物目的治疗的量。自然地，不同前体药物化合物的剂量将根据母体化合物，体内水解的速率，聚合物的分子量等等进行变化。上面阐述的范围是说明性的且本领域技术人员将基于临床经验和治疗效果确定前体药物的最佳剂量。无需过多试验实际的剂量对于实验技术人员而言是显而易见的。

本发明的前体药物可包含在一或多个合适的药物组合物中来施用于哺乳动物。药物组合物可以是根据本领域公知的方法进行制备的溶液，悬浮液，片剂，胶囊等剂型。考虑到这些组合物的施用可以取决于技术人员需要通过口服和/或非肠道途径来进行。组合物的溶液和/或悬浮液可用于，例如，作为运输载体来通过任意本领域已知的方法注射或渗透组合物，例如，通过静脉内，肌内，皮下注射等等进行。

施用也可通过注入到身体间隔或腔中，以及通过吸入和/或鼻内途径进行。然而，在本发明的优选方面，前体药物通过非肠胃方式施用于需要的哺乳动物。

本发明的前体药物可以与其它本领域已知的抗癌剂组合施用(例如，同时和/或连续地)。合适的抗癌药物包括，例如：(紫杉醇；BristolMyers Squibb)；

(伊立替康(Irinotecan)；Pfizer.)；

(Imatiinib Mesylate；Novartis)；

(美罗华(Rituximab)；Genentech/IDEC)；

(氟达拉滨(Fludarabine)；BeRlex Labs)；

(环磷酰胺；Bristol Myers Squibb)；(多烯紫衫醇；Aventis Phannaceuticals)；

(吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumabozogamicin)；Wyeth-Ayerst)；阿糖胞苷和/或地塞米松，略举几个这些药物。

实施例

下列实施例用来提供对本发明进一步的理解，但并非以任何方式限制本发明的有效范围。实施例中加下划线和黑体的数字对应于附图中所示。在每一附图中，糖部分和磷酸酯主链表示为：

碱基＝A₁G₁C₁或T

或简单表示为-。

mPEG应被理解表示

常规方法。PEG接头和寡核苷酸之间的所有偶联反应在PBS缓冲系统中在室温下进行。通常用有机溶剂提取除去未反应的寡核苷酸，进一步用阴离子交换层析由未反应的过量PEG接头分离PEG-寡共轭物来产生纯的产物。

HPLC方法通过使用具有多微波UV检测器的

300SBC-8反相柱(150×4.6mm)或Phenomenex

300A C18反相柱(150×4.6mm)的Beckman Coulter System

HPLC装置，利用在0.5％三氟乙酸(TFA)中的30-90％的乙腈和在50mM TEAA缓冲液中的25-35％乙腈的梯度以及4mM TBAC1的1mL/分钟的流速，监控反应混合物和中间体和终产物的纯度。在购自Applied Biosystems的Bio-Cad700E Perfusion Chromatography Workstation上，利用购自AppliedBiosystems的Poros 50HQ强阴离子交换树脂或购自AmershamBiosciences的包装在获自Waters的AP-Empty玻璃柱中的DEAESepharose速流弱阴离子交换树脂进行阴离子交换色谱层析。通过利用购自Amersham Biosciences的HiPrep 26/10或PD-10脱盐柱实现脱盐。

实施例1

化合物3.化合物1(440mg，0.036mmol)和2(5mg，3.6nmol)的PBS缓冲液(10mL，pH 7.4)溶液在室温下搅拌12小时。用二氯甲烷(DCM，3×10mL)提取反应溶液并且干燥(MgS04)，过滤混合的有机层，以及减压蒸发溶剂。残余物溶于重蒸水(1.5mL，每100mg)并且上样在HQ/10Poros强阴离子交换柱(10mm×60mm，柱床体积～6mL)上。用水(3～4柱体积)洗脱未反应的PEG接头，然后用0.2M NH₄HCO₃溶液(～2柱体积)洗脱产物。收集含有纯产物的组分并且冷冻干燥产生纯化的3(19mg，1.44mmol，40％)。

实施例2-6

以类似于3的方式制备和纯化化合物5，7，9，11，和12，产率由30％到50％。

实施例7

化合物14.向化合物13(10mg，1.7μmol)的PBS缓冲液(5mL，pH 7.4)溶液中每一小时添加被分成五个相等部分的化合物10(175mg，85μmol)中并且在室温下搅拌12小时。用DCM(3×10mL)和盐水(10mL)提取反应溶液，并且干燥(MgSO₄)、过滤混合的有机层，以及减压蒸发溶剂。残余物溶于重蒸水(1.5mL)并且上样到DEAE速流弱阴离子交换柱(10mm×60mm，柱床体积～6mL)上，阴离子交换柱用20mM tris-HCl缓冲液，pH 7.4预平衡。未反应的PEG接头用水(3到4柱体积)洗脱并且用在20mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中的0到100％的1M NaCl的梯度洗脱10分钟，然后用100％1M NaCl以3mL/分钟的流速洗脱10分钟。收集含有纯产物的组分并且用0.2MNH₄HCO₃溶液(～2柱体积)在PD-10脱盐柱上脱盐，冷冻干燥产生的溶液来产生纯的14(25mg，0.95μmol，57％)。

实施例8

用与化合物14相同的方法制备和纯化化合物16，产率为60％。

实施例9

化合物17.两个小时内向AS 1(5mg，0.85μmol)的磷酸缓冲液溶液添加到被分成五个相等部分的化合物10(175mg，0.085mmol)中，并且在室温下搅拌生成的溶液另外两个小时。用DCM(3×6mL)和盐水(5mL)提取反应溶液，并且干燥(MgS04)、过滤混合的有机层，以及减压蒸发溶剂。残余物溶于重蒸水(5mL)并且上样到DEAE速流弱阴离子交换柱(10mm×60mm，柱床体积～6mL)上，阴离子交换柱用20mM tris-HCl缓冲液，pH 7.4预平衡。未反应的的PEG接头用水(3到4柱体积)洗脱并且用0到100％的1M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4溶液的梯度洗脱10分钟，然后用100％1M NaCl以3mL/分钟的流速洗脱10分钟。收集含有纯产物的组分并且通过PD-10脱盐柱脱盐，冷冻干燥产生的溶液来产生纯的化合物17(15mg，0.57μmol，67％)。

实施例10-11

通过与17相同的方法制备和纯化化合物18和19，终产物产率67％，利用AS2和AS3代替AS 1。

实施例12-15

通过和14相同的方式制备和纯化化合物21，用20取代12，具有90％的产率。

通过和14相同的方式制备和纯化化合物22，通过用20取代12，具有90％的产率。

通过与14相同的方法制备和纯化化合物24，通过用23取代12，而且对于脱盐而言，用水(～2柱体积)而不是0.2M NH₄HCO₃溶液来洗脱产物。终产率30％。

通过与24相同的方法制备和纯化化合物26，用25取代23。产率为30％。

实施例16

化合物27.向化合物13(10mg，1.7μmol)的磷酸盐缓冲液(5mL，pH 8.5)溶液添加分成十等分的27(180mg，0.084mmol)中，并且产生的溶液在室温下搅拌4天时间。用DCM(3×10mL)和盐水(10mL)提取反应溶液，并且干燥(MgS04)、过滤混合的有机层，以及减压蒸发溶剂。残余物溶于重蒸水(1.5mL)并且上样到DEAE速流弱阴离子交换柱(10mm×60mm，柱床体积～6mL)上，阴离子交换柱用20mMtris-HCl缓冲液，pH 7.4预平衡。未反应的PEG接头用水(3到4柱体积)洗脱并且用在20mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中的0到100％的1MNaCl的梯度洗脱10分钟，然后用100％1M NaCl以3mL/分钟的流速洗脱10分钟。收集含有纯产物的组分并且通过PD-10脱盐柱脱盐，冷冻干燥产生的溶液来产生纯的化合物14(105mg，0.0102mmol，60％)。通过HPLC测定产物的纯度。

实施例17-21

通过与28相同的方法制备和纯化化合物29，30和31，除了用AS1，AS2和AS3分别替代13。每一终产物获得65％的产率。

通过和14相同的方式制备和纯化化合物33，用32取代12，具有76％的产率。

通过与14相同的方法制备和纯化化合物35，除了用活化的PEG 34代替10。最终产率为30％。

生物学数据

PEG-寡共轭物的一些体外特性列举如下：

表4.PEG-寡共轭物的体外特性

化合物	t_1/2(缓冲液)	t_1/2大鼠质粒	t_1/2(PEI)	t_1/2(PEII)	t_1/2(核酶P1)
						3	＞＞24h	0.7h	＜5min	＞24h	＜5min
7	＞＞24h	0.5h	＜5min	＞24h	＜5min
						5	＞＞24h	0.5h	＜5min	＞24h	＜5min
9	＞＞24h	3.7h	＜5min	36	0.3h
						11	＞＞24h	2.3h	＜5min	63	0.3h
12	＞＞24h	10.6h	＜5min	1.7	＜5min
						14	＞＞24h	14.7h	＜5min	38.9	0.3h
16	＞＞24h	13.8h	＜5min	42.7	0.3h
						21	＞＞24h	6.5h	＞24h	＞24h	＜5min
24	＞＞24h	11.h	18.7h	36.8h	＜5min
						28	＞＞24h	＞48h	＞24h	＞48h	＜5min
33	＞＞24h	＞48h	＞24h	＞48h	＜5min
						35	＞＞24h	4.1h	5.6h	＞48h	＜5min

PEI＝磷酸二酯酶I，5’-核酸外切酶，在37℃，pH8.8TEAA缓冲液中有动力学特性；PEII＝磷酸二酯酶II，3’-核酸外切酶，在37℃，pH6.5TEAA缓冲液中有动力学特性，核酸酶P1＝核酸内切酶，在37℃。pH5.3TEAA缓冲液中有动力学特性；所有的酶1单元释放1μmol的寡核苷酸。

PEG-寡共轭物在ICR小鼠中的药物动力学。

基本方法

1)动物饲养：在饲养箱的每一笼中饲养6个小鼠。根据国家研究委员会的“实验动物资源研究所的实验动物管理和使用指南”，确定笼的大小。

2)饮食：小鼠饮用自来水并且无限制喂养的市售实验室食物。

3)化合物制备：化合物13溶于4.0mL盐水中且化合物14溶于4.1mL盐水中。

4)施用位点：化合物13和14通过尾部静脉单剂量(第1天)施用。

试验设计

根据下列设计，60个小鼠被分配，施用和取血，通过下表5显示。

表5

^*寡核苷酸等价物

三个未处理的小鼠通过心脏穿刺取血到含有EDTA的管中来收集未处理的对照血浆。

每一小鼠静脉注射100μL的天然化合物13和14。然后用0.09％Avertin镇静，最后小鼠通过心脏穿刺取血～1000μl。将血液收集到含有EDTA的管瓶中。离心血液后收集血浆并且立即在干冰上-80℃冷冻。

临床检查：

注入试验制品后每天目测小鼠一次，测定死亡率和对处理的反应信号。记录任何死亡和临床信号。仅仅在注射当天之前测定体重。

以类似的方式进行化合物28和33的药物动力学研究。

试验结果

药物动力学结果概括在下表6中。

表6.PEG-寡共轭物的体内特性

化合物	Cmax(μg/mL)	血浆半衰期(hr)	AUC(hr μg/mL)
				13	14.9	0.19	4.1
14	54.8	0.66	51.8
				28	491.2	1.05	730.6
33	556.7	0.25	191.0

实施例22-25

反义PEG共轭物体外活性的证实

Bcl-2蛋白已被表明在前列腺癌细胞中具有显著的抗-细胞凋亡活性。bcl-2蛋白质在前列腺癌细胞中的下调通过细胞死亡被证实，且通过bcl-2反义PEG共轭物诱导细胞死亡被用于证实反义寡核苷酸细胞内的成功递送。

用于实施例22-25的材料和方法

试验化合物列举在下表7中。

表7

这些通过上面所述进行制备。

细胞培养

将获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，MD)的无支原体的PC3细胞培养在Roswell ParkMemorial Institute培养基(″RPMI″)(Invitrogen，Grand Island，NY)中，该培养基添加了10％胎儿牛血清(“FBS”)，含有10％(v/v)加热灭活(56℃)的FBS，补充有1％非必需氨基酸，1％丙酮酸盐，25mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸)缓冲液，100U/ml的青霉素G钠和100μg/ml的链霉素硫酸盐。母种培养物保持在37℃，湿度5％的CO₂恒温箱中。

试剂

FBS和Lipofectin(阳离子脂N-[1-(2，3-二油酰基氧化)丙基]-n，n，n-三甲基氯化铵的脂质体制剂)购自Invitrogen(Grand Island，NY)。抗-bcl-2单克隆抗体购自Dako(Carpinteria，CA)。抗-α-微管蛋白单克隆抗体和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(“MTT”)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。通过标准方法合成和纯化硫代磷酸寡核苷酸。

寡核苷酸转染

在实验之前一天将细胞以25×10⁴细胞/孔的密度接种在6-孔平板中，使得实验当天铺满60-70％。所有转染按照生产商的说明在无FBS存在下在Opti-MEM培养基中进行。将合适量的试剂稀释在100μl的Opti-MEM培养基中来产生Lipofectin和寡核苷酸的最终浓度。轻轻混合溶液并且在室温下预温育30分钟来形成复合物。然后，添加800μl的Opti-MEM，混合溶液，并且覆盖在已经预先用Opti-MEM冲洗的细胞上。寡核苷酸/Lipofectin复合物在Opti-MEM中的温育时间为24小时，然后在含有10％FBS的完全培养基中温育。在37℃细胞溶解和蛋白质分离之前的总温育时间通常为72小时。

Western印迹分析

用寡核苷酸-脂类复合物处理的细胞在PBS中冲洗，然后在裂解缓冲液[50mM Tris-HCl pH 7.4，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mMNaCl，1mM EGTA，50μg/ml Pefabloc SC，15μg/ml抑肽酶，亮抑酶肽，胰凝乳蛋白酶抑制剂，抑胃酶肽A，1mM Na3VO4，1mM NaF]中4℃下提取1小时。通过14000g，4℃下离心20分钟除去细胞碎片。利用Bio-Rad蛋白质分析系统(Bio-Rad实验室，Richmond，CA)测定蛋白质浓度。细胞提取物的等分试样，含有25-40μg的蛋白质，通过SDS-PAGE溶解，然后转到Hybond ECL滤纸(Amersham，AR₁ingtonHeights，IL)，并且室温下在含有0.5％Tween-20的5％BSA的PBS溶液中温育滤纸1-2小时。然后用抗bcl-2抗体在含有0.5％Tween-20的5％BSA的PBS溶液的1∶500稀释液于4℃过夜探针标记滤纸。在含有0.5％Tween-20的PBS中冲洗后，室温下在5％牛奶的含有0.5％Tween的PBS溶液中与过氧化物酶-共轭物次级抗体(Amersham)的1∶3,000稀释液一起温育滤纸1小时。冲洗后(3×10分钟)，根据生产商的说明进行电化学发光检测(“ECL″)。

细胞增殖速率的测定

通过MTT试验测定对PEG共轭物的细胞活性的影响。简要地，将15-20×10⁴细胞接种在6-孔平皿中并且允许附着过夜。然后在37℃用合适的浓度的寡核苷酸-Lipofectin复合体处理细胞24小时，然后在含有10％FBS的完全培养基(100μl)中温育。每天测定细胞活性。将10μl的5mg/ml MTT的PBS溶液添加至每一孔中，然后37℃温育4小时。然后，将100μl的10％SDS的0.04MHC1添加于每一孔中，继之以37℃温育过夜来溶解甲臜晶体。用Benchmark加微板分光光度计(Bio Rad，Hercules，CA)在570nm处测定吸光率。并行进行6个实验，并且数据表示为平均值+/-S.D。

胞内ROS水平的定量测定

2′，7′-二氯二氢荧光素双乙酸盐(H₂DCF-DA)和二氢溴乙非啶(HE)用于测定活性氧的种类(“ROS”)和过氧化物水平。两个色素是非荧光的并且可自由扩散到细胞中。当HE氧化为溴乙非啶(E)时，其插入到细胞DNA中并且发荧光。H₂DCF-DA的氧化产生2’-7’二氯荧光素(DCF)，其也发荧光，并且两种可通过流细胞计数法检测。通过胰酶消化收集细胞，用PBS冲洗以及用50μM H₂DCF-DA或50μM HE的无酚红DMEM溶液在37℃染色2小时。通过流细胞计数法分别在FL-1和FL-2信道中分析DCF和E的平均荧光信道数。由每一样品获得最少10000个细胞并且利用CELLQuest软件(Becton Dickinson)分析数据。直方图以对数刻度绘制。

实施例22

Bel-2蛋白质表达的抑制

三个靶向bcl-2表达的PEG寡核苷酸(化合物14，28和33)转染到PC3细胞中并通过Western印迹法评价它们抑制bcl-2蛋白质表达的能力。

Lipofectin的作用

最初，在Lipofectin存在和缺乏的条件下测定由化合物14诱导的PC3细胞中bcl-2蛋白质表达的抑制程度。在Lipofectin存在或缺少的条件下用化合物14(在200，400和800nM)在Opti-MEM中处理PC3细胞24小时，然后进一步在完全培养基中处理67小时。通过在物质和方法部分描述的Western印迹法分析蛋白质样品(30-40μg蛋白质/泳道)，用微管蛋白用作对照蛋白质种类。通过激光扫描密度测定法测定与对照，未处理细胞的％抑制率的对比。Western印迹结果显示在附图12中。

α-微管蛋白和PKC-α的表达无变化，证明Lipofectin有助于实现化合物14渗透到PC-3细胞中，并且证明仅仅bcl-2蛋白质表达通过化合物14下调节。

进一步研究显示化合物14和28在400nM处最有活性。PC3细胞用400，800和1000nM的化合物14，化合物28和化合物23以及Lipofectin的复合物在Opti-MEM中处理24小时，然后进一步在完全培养基中处理67小时。通过在物质和方法部分描述的Western印迹法分析蛋白质样品(30-40μg的蛋白质/泳道)，用微管蛋白用作对照蛋白质种类。通过激光扫描密度测定法测定与对照，未处理细胞的％抑制率的对比。

化合物14产生86％的下调节且化合物28产生78％的下调节。

实施例23

通过PEG寡核苷酸进行bcl-2蛋白质表达的剂量依赖的分析

为进一步证明化合物14和28对bcl-2蛋白质表达的抑制作用，用增加浓度(25，50，100，200和400nM)的化合物14，化合物28，和作为阳性对照的化合物13，与Lipofectin的复合体在Opti-MEM中处理PC3细胞24小时，然后在完全培养基中进一步处理67小时。通过在上述物质和方法部分描述的Western印迹法分析蛋白质样品(30-40μg的蛋白质/泳道)。

通过Western印迹观察化合物14和28相对于对照对于bcl-2蛋白质表达的浓度-依赖的抑制。在50nM处观察到约1-2％的抑制，并且400nM的浓度时增加到99％和75％。对于化合物24而言，在50nM处基本上没有观察抑制，但在400nM的浓度时抑制增加到77％。用化合物13的转染用作阳性对照。α-微管蛋白的表达不受任何寡核苷酸的抑制。

用化合物24作为对照重复上述实验。在Opti-MEM中用增加浓度的化合物35和24(25，50，100，200和400nM)以及与Lipofectin的复合体处理PC3细胞24小时，然后进一步在完全培养基中处理67小时。通过在上述物质和方法部分描述的Western印迹法分析蛋白质样品(30-40μg的蛋白质/泳道)，用α-微管蛋白用作对照蛋白质。通过激光扫描密度测定法测定与对照，未处理细胞的％抑制率的对比。

实施例24

PEG寡核苷酸对PC3细胞生长的作用

也测定化合物14和化合物28对PC3前列腺癌细胞体外生长的作用，。用寡核苷酸/Lipofectin复合物处理PC3细胞。如图10所示，400和200nM的反义寡核苷酸化合物14的转染强烈地抑制细胞生长，而化合物28仅仅稍微影响增殖速率。

实施例25

PEG寡核苷酸对PC3细胞中活性氧的影响

通过两种流动血细胞计数方法评价PC3细胞中活性氧或ROS的产生。第一种基于氢化溴乙非啶(HE)向溴乙非啶(E)的氧化，其随后插入到具有通过流细胞计数法可检测荧光的DNA中。第二种方法利用细胞-可渗透的2′，7′-二氢二氯荧光素双乙酸盐氧化为发荧光的2′，7-二氯荧光素(DCF)。在PC3细胞中，用化合物14/Lipofectin(400nM/15μg/ml)复合物在Opti-MEM中处理24小时，三天后通过两种E(比对照未处理的细胞增加1.9倍)和DCF(比对照未处理的细胞增加2)的荧光进行流量细胞计数评价产生的ROS。如图概括在图11中的数据所证实的，化合物28对对照，未处理的细胞不产生任何ROS产生的增加。此外，ROS的产生与细胞增殖的速率非常相关；细胞用400nM的化合物14处理后停止生长，且这些寡核苷酸也引起ROS(DCF和HE)产生的增加。

序列表

<110>安龙制药公司(ENZON PHARMACEUTICALS，INC.)

<120>聚合寡核苷酸前体药物(POLYMERIC OLIGONUCLEOTIDE PRODRUGS)

<130>SCT054248-66

<140>

<141>

<150>60/462,070

<151>2003-04-13

<160>11

<170>PatentIn Ver.3.2

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>phosphorothioate backbone

<220>

<223>see specification as filed for detailed description of

linkages and preferred embodiments

<400>1

tctcccagcg tgcgccat 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>phosphorothioate backbone

<220>

<223>see specification as filed for detailed description of

linkages and preferred embodiments

<400>2

tctcccagcg tgtgccat 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

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<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>phosphorothioate backbone

<220>

<223>see specification as filed for detailed description of

linkages and preferred embodiments

<400>3

atcctaagcg tgcgcctt 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

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<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>phosphorothioate backbone

<220>

<221>modified_base

<222>(9)

<223>5-Me-dC

<220>

<221>modified_base

<222>(13)

<223>5-Me-dC

<220>

<223>see specification as filed for detailed description of

linkages and preferred embodiments

<400>4

tctcccagng tgngccat 18

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<400>5

taccgcgtgc gaccctc 17

<210>6

<211>20

<212>DNA

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<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<400>6

cagcgtgcgc catccttccc 20

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<400>7

cttttcctct gggaaggatg gcgcacgctg ggaga 35

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<400>8

gatgcaccta cccagcctcc 20

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<400>9

acggggtacg gaggctgggt aggtgcatct ggt 33

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<400>10

acaaaggcat cctgcagttg 20

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic

oligonucleotide

<400>11

cccccaactg caggatgcct ttgtggaact gtacgg 36

Claims

1.下式的寡核苷酸前体药物：

其中：

R₁是聚醚

R₂是氢；

L₁是可释放的连接部分；

L₂是包含从2到10个碳原子的选择的双功能间隔基；

X₁是单链或双链寡核苷酸残基，其中的寡核苷酸的大小为从10到1,000个核苷酸；

p和m是0；

n和o独立地为正整数；以及

条件是(o+n)≥2，

其中

L₂选自：

-(CR_50’R_51’)_q’Q’-，

-(CR_52’R_53’)_r’O(CR_50’R_51’)_q’Q’-，

-(CR_52’R_53’)_r’(OCH₂CH₂)Q’-，

和

-(CH₂)_r’S-S-(CH₂)_q’Q’-，

其中

Q’是O，S或NH；

R_50’-53’独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12支链烷基，C_3-8环烷基，芳基C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；

以及

q’和r’各自为正整数。

2.权利要求1的前体药物，其中的寡核苷酸包括选自如下的核苷酸：

其中

M为O或S；

B₁和B₂独立地选自A(腺嘌呤)，G(鸟嘌呤)，C(胞嘧啶)，T(胸腺嘧啶)，U(尿嘧啶)以及修饰的碱基；

R₁₀₀和R₁₀₁独立地选自H，R′为H的OR′，C_1-6烷基，烷基，硝基，卤素和芳基。

3.权利要求2的前体药物，其中M为S。

4.权利要求1的前体药物，其中寡核苷酸残基是硫代磷酸酯寡核苷酸残基。

5.权利要求1的前体药物，其中所述寡核苷酸残基是反义寡核苷酸残基或寡脱氧核苷酸残基。

6.权利要求5的前体药物，其中所述反义寡核苷酸残基或寡脱氧核苷酸残基选自具有磷酸二酯主链或硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸，LNA，PNA，三环-DNA，诱饵寡脱氧核苷酸，核酶，镜像适配体和CpG寡聚物。

7.权利要求5的前体药物，其中所述反义寡核苷酸具有选自如下的序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其中SEQ ID NO：4的n是任一核苷酸。

8.权利要求1的前体药物，其中R₁是具有封端基团A的聚醚，所述封端基团A选自OH，NH₂，SH，CO₂H，C_1-6烷基和

其中X₂是单链或者双链寡核苷酸残基，其中寡核苷酸的大小为从10到1,000个核苷酸。

9.权利要求8的前体药物，选自：

其中X₂是3’寡核苷酸或5’寡核苷酸。

10.权利要求1的前体药物，其中L₁选自：

其中，

Y_1’-Y_25’独立地选自O，S或NR₉；

R_6’-7’，R_9’-13’，R_16’-25’，R₉和R_27’-41’独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12支链烷基，C_3-8环烷基，芳基，C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；

L_5’-12’独立地为选择的双功能间隔基；

Ar为形成多-取代芬香烃或多-取代杂环基团的部分；

c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′和h′独立地为选择的正整数；

b，d，f，i，u，b′，d′和f′独立地为零或一。

11.权利要求1的前体药物，其中R₁为聚乙二醇。

12.权利要求1的前体药物，其中R₁选自：

J-O-(CH2CH2O)_n’-

J-O-(CH2CH2O)_n’-CH₂C(O)-O-，

J-O-(CH2CH2O)_n’-CH₂CH₂NR₄₈-，

J-O-(CH2CH2O)_n’-CH₂CH₂SH，

-O-C(O)CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n′-CH₂C(O)-O-，

-NR₄₈CH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n′-CH₂CH₂NR₄₈-，

-SHCH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n′-CH₂CH₂SH-，

其中

n’为聚合度；

R₄₈选自氢，C_1-6烷基，C_3-12支链烷基，C_3-8环烷基，芳基，C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；和

J为封端基团。

13.权利要求1的前体药物，其中R₁包含：

-O-(CH₂CH₂O)_x-

其中x为选择的正整数使得加权平均分子量至少为2,000Da到136,000Da。

14.权利要求1的前体药物，其中R₁具有从3,000Da到100,000Da的加权平均分子量。

15.权利要求1的前体药物，其中R₁具有从5,000Da到40,000Da的加权平均分子量。

16.权利要求7的前体药物，其中所述反义寡核苷酸为SEQ IDNO：1。

17.权利要求1的前体药物，选自：

其中所有的都包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸。

18.前体药物的制备方法，包括：

将下式的化合物：

R₁-L₁-离去基团

与下式的化合物：

H-L₂-X₁

在足以形成下式前体药物的条件下反应：

X₁-L₂-L₁-R₁

其中：

R₁是聚醚；

L₁是可释放的连接部分；

L₂为包含2到10个碳原子的双功能的间隔基；以及

X₁为单链或双链寡核苷酸残基，其中寡核苷酸的大小为从10到1,000个核苷酸，

其中L₂选自

-(CR_50’R_51’)_q’Q’-，

-(CR_52’R_53’)_r’O(CR_50’R_51’)_q’Q’-，

-(CR_52’R_53’)_r’(OCH₂CH₂)Q’-，和

-(CH₂)_r’-S-S-(CH₂)_q’Q’-，

其中

Q’为O，S或NH；

R_50’-53’独立地选自氢，C_1-6烷基，C_3-12支链烷基，C_3-8环烷基，芳基，C_1-6杂烷基，C_1-6烷氧基，苯氧基和C_1-6杂烷氧基；以及

q’和r’各自是正整数。

19.通过包括下列步骤的方法制备的寡核苷酸前体药物：

将下式的化合物：

R₁-L₁-离去基团

与下式的化合物：

H-L₂-X₁

在足以形成下式前体药物的条件下反应：

X₁-L₂-L₁-R₁

其中：

R₁是聚醚；

L₁是可释放的连接部分；

L₂为包含2到10个碳原子的双功能的间隔基；以及

其中L₂选自：

-(CR_50’R_51’)_q’Q’-，

-(CR_52’R_53’)_r’O(CR_50’R_51’)_q’Q’-，

-(CR_52’R_53’)_r’(OCH₂CH₂)Q’-，和

-(CH₂)_r’S-S-(CH₂)_q’Q’-，

其中

Q’为O，S或NH；

q’和r’各自是正整数。

20.权利要求19的前体药物，其中X₁包括选自如下的核苷酸：

其中

M为O或S；

B₁和B₂独立地选自A(腺嘌呤)，G(鸟嘌呤)，C(胞嘧啶)，T(胸腺嘧啶)，U(尿嘧啶)及其修饰碱基；

21.权利要求19的前体药物，其中X₁选自具有磷酸二酯主链或硫代磷酸酯主链的寡核苷酸，LNA，PNA，三环-DNA，诱饵寡脱氧核苷酸，核酶，镜像适配体和CpG寡聚物。

22.权利要求19的前体药物，其中X₁包括硫代磷酸酯骨架。

23.权利要求19的前体药物，其中X₁是反义寡核苷酸。

24.权利要求23的前体药物，其中所述反义寡核苷酸具有选自如下的序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4，其中SEQ ID NO：4的n是任一核苷酸。

25.权利要求19的前体药物，其中R₁为聚乙二醇

26.权利要求19的前体药物，其中R₁具有从3,000Da到100,000Da的加权平均分子量。

27.权利要求25的前体药物，其中R₁具有从5,000Da到40,000Da的加权平均分子量。

28.权利要求19的前体药物，选自：

其中

代表寡核苷酸和末端磷酸酯修饰的点，以及X′₁是单链或双链寡核苷酸残基，其中的寡核苷酸的大小为从10到1,000个核苷酸；且

mPEG为CH₃-O-(CH₂-CH₂-O)x-；其中x是选自10到2300的正整数。

29.有效量的权利要求1的化合物在制备用于需要治疗的哺乳动物的药物中的应用。

30.权利要求29的应用，其中哺乳动物被进行肿瘤治疗。

31.权利要求29的应用，其中X₁为反义寡核苷酸。