CN101273271A - 前列腺癌相关基因和多肽 - Google Patents

Abstract

本申请提供了新的人类基因ELOVL7，其表达在前列腺癌中显著升高。该基因及由该基因编码的多肽可用于例如前列腺癌的诊断、作为研发针对该病的药物的靶分子、及用于削弱前列腺癌的细胞生长。

Description

前列腺癌相关基因和多肽

相关申请

本申请要求2005年7月27日提交的、流水号为60/703,107的美国临时申请的权益，将其内容完整收入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及生物学领域，更具体的说就是癌症治疗和诊断领域。具体而言，本发明涉及由新基因ELOVL7编码的新多肽及ELOVL7与前列腺癌(PRC)之间的相关性。此外，本发明涉及ELOVL7基因。本发明的基因和多肽可用于例如PRC的诊断、作为研发针对该病的药物的靶分子、及用于削弱PRC的细胞生长。

发明背景

PRC是男性中最常见的恶性肿瘤，而且是美国和欧洲癌症相关死亡第二位原因(Gronberg H，Lancet 361：859-64(2003))。PRC的发病率在大多数发达国家显著日益增长，大概是由于流行的西方饮食和老龄人口的爆发(GronbergH，Lancet 361：859-64(2003)；Hsing AW and Devesa SS，Epidemiol Rev 23：3-13(2001))。手术和放疗对局部疾病有效，但几乎30％接受治疗的PRC患者仍然受到疾病复发的困扰(Feldman BJ and Feldman D，Nat Rev Cancer 1：34-45(2001)；Han M et al.，J Urol 166：416-9(2001)；Isaacs W et al.，Cancer Cell 2：113-6(2002))。大多数患有复发或晚期疾病的患者对雄激素消融疗法响应良好，因为PRC在较早阶段通常是雄激素依赖性的。然而，他们常常获得雄激素不依赖性表型且显示出对雄激素消融疗法没有响应或响应很差。目前没有有效的抗癌药物或疗法可用于晚期或复发的雄激素不依赖性PRC。因此，急切且迫切需要根据前列腺癌发生或激素不应性的分子机制来开发新疗法。

我们先前通过LMM(激光微光束显微切割)对纯化自临床癌组织的PRC细胞进行了全基因组范围cDNA微阵列分析，鉴定出其表达水平在PRC细胞和/或其前体PIN中与正常前列腺上皮细胞相比明显升高的数十种基因(Ashida S et a1.，Cancer Res 64：5963-72(2004))。在反式激活的基因中，我们在此报导新基因ELOVL7(Genebank编号NM_024930，SEQ ID NO：14，编码SEQ ID NO：15)的表征，它很有可能在长链脂肪酸合成中发挥重要作用。ELOVL(很长链脂肪酸的延长)家族是酵母ELO的人类同系物，催化长链脂肪酸的延长反应(Leonard AE et a1.，Prog Lipid Res 43：36-54(2004)；Wang Y eta1.，J Lipid Res 46：706-15(2005))。负责向脂肪酸链的羧基末端添加两个碳单元的延长系统由四种酶构成：缩合酶(延长酶、β-酮酰基CoA合酶)、β-酮酰基CoA还原酶、β-羟酰基CoA脱水酶、和反式-2,3-烯酰基-CoA还原酶(LeonardAE et a1.，Prog Lipid Res 43：36-54(2004))，而且脂肪酸延长速率由延长酶的活性决定(Wang Y et a1.，J Lipid Res 46：706-15(2005))。迄今为止报导了哺乳动物中的六种不同脂肪酸延长酶亚型(ELOVL1-6)，而且认为这些延长酶特异性的作用于不同链长度的饱和或不饱和脂肪酸(Leonard AE et a1.，Prog LipidRes 43：36-54(2004)；Wang Y et a1.，J Lipid Res 46：706-15(2005)；Suneja SK eta1.，Biochim Biophys Acta 1042：81-5(1990))。长链脂肪酸的代谢途径在维持膜脂组成和生成某些细胞信号分子前体诸如类花生酸(eicosanoid)方面发挥重要作用(Leonard AE et a1.，Prog Lipid Res 43：36-54(2004)；Wang Y et a1.，JLipid Res 46：706-15(2005))。如此，预计这些代谢途径牵涉癌细胞的有些基本活性。

cDNA微阵列技术提供了正常细胞和恶性细胞中基因表达的全面序型(comprehensive profile)，及比较恶性细胞与相应正常细胞中的基因表达的能力(Okabe et a1.，Cancer Res 61：2129-37(2001)；Kitahara et a1.，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin et a1.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et a1.，CancerRes 62：7012-7(2002))。这种方法促进了对癌细胞复杂性质的理解，有助于阐明癌发生的机理。鉴定出肿瘤中下调的基因能够更加精确和准确的诊断个体癌症，并可开发新的治疗靶(Bienz and Clevers，Cell 103：311-20(2000))。为了从整个基因组的角度揭示肿瘤的机理，并且找出用于诊断和开发新治疗性药物的靶分子，本发明人使用23,040个基因的cDNA微阵列分析了肿瘤细胞的表达序型(Okabe et a1.，Cancer Res 6l：2129-37(2001)；Kitahara et a1.，CancerRes 6l：3544-9(2001)；Lin et a1.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et a1.，Cancsr Res 62：7012-7(2002))。

设计用于揭示癌发生机制的研究促进了抗肿瘤剂的分子靶的鉴定。例如，起初被开发用于抑制与Ras有关的生长-信号传导途径、其活化依赖于翻译后法尼基化的法尼基转移酶抑制剂(FTI)能在动物模型中有效治疗Ras依赖性肿瘤(Sun J et al.，Oncogene 16：1467-73(1998))。使用抗癌药物与抗HER2单克隆抗体trastuzumab的组合对人进行的、以拮抗原癌基因受体HER2/neu为目的的临床试验对乳腺癌患者获得了改善的临床响应和整体存活(MolinaMA et al.，Cancer Res 61：4744-4749(2001))。最终，已开发出能选择性灭活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571来治疗慢性髓性白血病，在该病中，bcr-abl酪氨酸激酶的组成性活化在白细胞转化中发挥至关重要的作用。此类药剂被设计用于抑制特定基因产物的致癌活性(O’Dwyer ME and DrukerBJ，Curr Opin Oncol 12：594-7(2000))。因此，在癌性细胞中一般上调的基因产物可充当潜在的靶，用于开发新的抗癌药。事实上，靶向引起肿瘤生长和进展的异常表达分子的新药物已经证明对某些类型的癌症有效。此类药物包括用于乳腺癌的Herceptin、用于CML的Glivec(STI571)和用于非小细胞性肺癌的Iressa(ZD1839)。

已知数种分子在PRC中过表达，并被鉴定为PRC的治疗靶或标志物(Xuet al.，Cancer Res 60：6568-72(2000)；Luo et al.，Cancer Res 62：2220-6(2002))。然而，它们中的大多数在其它主要器官中也高度表达。如此，靶向这些分子的药剂可能对癌细胞有毒，但对其它器官的正常生长细胞可能也有不利影响。

已证明CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别MHC I类分子上呈递的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽并裂解肿瘤细胞。第一例TAA是MAGE家族，由于这一发现，使用免疫学方法已发现了许多其它TAA(Boon，Int J Cancer 54：177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；vander Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994))。有些已发现的TAA现在处在免疫疗法靶的临床开发阶段。迄今为止所发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991))、gp100(Kawakamiet al.，J Exp Med 180：347-52(1994))、SART(Shichijo et al.，J Exp Med 187：277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997))。另一方面，已证明在肿瘤细胞中特异性过表达的基因产物已显示出作为诱导细胞免疫应答的靶受到识别。此类基因产物包括p53(Umano et al.，Brit J Cancer 84：1052-7(2001))、HER2/neu(Tanaka et al.，Brit J Cancer 84：94-9(2001))、CEA(Nukaya et al.，Int J Cancer 80：92-7(1999))等。

尽管已在与TAA有关的基础和临床研究中取得了显著进步(Rosenberg etal.，Nature Med 4：321-7(1998)；Mukherji et al.，Proc Natl Acad Sci USA 92：8078-82(1995)；Hu et al.，Cancer Res 56：2479-83(1996))，目前可用于治疗腺癌，包括结肠直肠癌的候选TAA的数目仍然很有限。在癌细胞中丰富表达且同时该表达局限于癌细胞的TAA可能是免疫疗法靶的理想候选物。此外，能诱导有力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定预计会促进肽接种策略在多种类型癌症中的临床使用(Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994)；Shichijo et al.，J Exp Med 187：277-88(1998)；Chen et al.，Proc Natl Acad SciUSA 94：1914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 88：1442-5(1996)；Butterfieldet al.，Cancer Res 59：3134-42(1999)；Vissers et al.，Cancer Res 59：5554-9(1999)；van der Burg et al.，J Immunol 156：3308-14(1996)；Tanaka et al.，Cancer Res 57：4465-8(1997)；Fujie et al.，Int J Cancer 80：169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int J Cancer 81：459-66(1999)；Oiso et al.，Int J Cancer 81：387-94(1999))。

据反复报道，来自某些健康供体的经肽刺激的外周血单个核细胞(PBMC)应答肽而产生显著水平的IFN-α或γ，但在⁵¹Cr-释放测定法中很少以局限于HLA-A24或-A0201的方式对肿瘤细胞发挥细胞毒性(Kawano et al.，CancerRes 60：3550-8(2000)；Nishizaka et al.，Cancer Res 60：4830-7(2000)；Tamuraet al.，Jpn J Cancer Res 92：762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201二者是日本人和高加索人中常见HLA等位基因之一(Date et al.，Tissue Antigens 47：93-101(1996)；Kondo et al.，J Immunol 155：4307-12(1995)；Kubo et al.，JImmunol 152：3913-24(1994)；Imanishi et al.，Proceeding of the eleventhInternational Histocompatibility Workshop and Conference Oxford UniversityPress，Oxford，1065(1992)；Williams et al.，Tissue Antigen 49：129(1997))。如此，由这些HLA呈递的癌症抗原性肽对于治疗日本人和高加索人中的癌症可能是特别有用的。另外，已知使用高浓度的肽通常在体外诱导低亲和力的CTL，在抗原呈递细胞(APC)上产生高水平的特定肽/MHC复合物，该复合物会有效激活这些CTL(Alexander-Miller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7(1996))。

发明概述

为了披露PRC的机制及鉴定用于治疗这些肿瘤的新诊断标志物和/或药物靶，本发明人使用全基因组范围cDNA微阵列(genome-wide cDNAmicroarray)联合激光微光束显微切割(laser microbeam microdissection)，分析了PRC中的基因表达序型。在先前的研究中，通过联合激光微光束与全基因组范围cDNA微阵列进行了PRC细胞(PRC)和非侵入性前体细胞(PIN)的精确表达序型分析。通过比较侵入性PRC与正常前列腺上皮或非侵入性前体PIN的表达序型，本发明人鉴定出在侵入性PRC和前体PIN二者中都找到了的88种上调的基因和207种下调的基因。在本发明中，本发明人聚焦于在PRC细胞中过表达的新基因，ELOVL7。

使用多克隆抗ELOVL7抗体进行的免疫组织化学分析证实了PRC细胞中与正常前列腺上皮相比升高的ELOVL7表达，ELOVL7是有可能牵涉长链脂肪酸延长的281个氨基酸的蛋白质。

脂肪酸延长酶(elongase)的新成员ELOVL7鉴定为在PRC细胞中特异性过表达的基因。本发明人显示了siRNA对ELOVL7表达的抑制导致PRC细胞生长的显著削弱，从而证明了ELOVL7表达对于PRC细胞的细胞生长或生存力是至关重要的。许多流行病学或实验室研究涉及相关长链脂肪酸代谢有可能在前列腺癌发生和PRC发展中发挥一些重要作用。通过体内脂肪酸分析和体外脂肪酸延长测定法，我们验证了ELOVL7具有作为脂肪酸延长酶的实际活性，而且优先参与动物肉类膳食中非常丰富的饱和长链脂肪酸(SLFA)的延长。这些发现说明，ELOVL7大概是通过长链脂肪酸及其衍生物的代谢而牵涉PRC细胞的生长和存活，而且该分子是研发PRC的治疗或预防新策略的有用靶物。

ELOVL7编码281个氨基酸的蛋白质。根据Northern印迹分析，ELOVL7的表达显示出局限于前列腺、肾和其它数种组织。

本发明提供了由该基因编码的多肽，及其生产和使用。更具体的说，本发明提供了在PRC细胞中表达升高的新的人类多肽ELOVL7或其功能性等同物。

在一个优选的实施方案中，ELOVL7多肽包括由可读框SEQ ID NO：14编码的281个氨基酸的蛋白质。ELOVL7多肽优选包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列(Genebank编号NM_024930即SEQ ID NO：14编码SEQ ID NO：15)。本申请还提供了由ELOVL7多核苷酸序列的至少一部分或者与SEQ ID NO：14所示序列至少80％且更优选至少90％相同的多核苷酸序列所编码的分离的蛋白质。

本发明进一步提供了在大多数PRC中与相应非癌性前列腺导管上皮相比表达显著升高的新的人类基因ELOVL7。分离的ELOVL7基因包含SEQ IDNO：14所示多核苷酸序列。具体而言，ELOVL7cDNA包含3815个核苷酸，其中包含846个核苷酸的可读框(SEQ ID NO：14)。本发明进一步涵盖能与SEQ ID NO：14所示多核苷酸序列发生杂交并且与SEQ ID NO：14所示多核苷酸序列至少15％且更优选至少25％互补的多核苷酸，其程度使得它们编码ELOVL7蛋白或其功能性等同物。此类多核苷酸的例子有序列SEQ ID NO：14所编码的ELOVL7的简并物和等位基因突变体。

在用于本文时，分离的基因指结构与任何天然存在多核苷酸或与跨越超过三个不同基因的天然存在基因组多核苷酸的任何片段不同的多核苷酸。该术语因此包括例如(a)具有生物体基因组中天然存在基因组DNA分子的部分序列的DNA；(b)以使得所得分子与任何天然存在载体或基因组DNA不同的方式被掺入载体或者原核或真核基因组DNA的多核苷酸；(c)不同分子诸如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、或限制性片段；和(d)作为杂合基因即编码融合多肽的基因一部分的重组核苷酸序列。

从而，一方面，本发明提供了编码本文所述多肽或其片段的分离的多核苷酸。优选的是，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO：14所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更优选的是，分离的核酸分子与SEQ ID NO：14所示核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大程度相同。在分离的多核苷酸的长度比参比序列例如SEQ ID NO：14长或相当(equivalent)的情况中，比较是对参比序列的全长进行的。若分离的多核苷酸比参比序列例如SEQ ID NO：14短，则比较是对相同长度的参考序列区段进行的(排除同源性计算所需要的任何环)。

本发明还提供了通过用编码ELOVL7蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞并表达该多核苷酸序列来生产蛋白质的方法。另外，本发明提供了包含编码ELOVL7蛋白的核苷酸序列的载体，及包含编码ELOVL7蛋白的多核苷酸的宿主细胞。此类载体和宿主细胞可用于生产ELOVL7蛋白。

本申请还提供了特异性识别ELOVL7蛋白的结合剂。例如，结合剂可以是针对ELOVL7蛋白生成的抗体。或者，结合剂可以是对该蛋白质特异的配体或特异性结合该蛋白质的合成多肽(参见例如WO2004044011)。还提供了ELOVL7基因的反义多核苷酸(例如反义DNA)、核酶和siRNA(小干扰RNA)。

本发明进一步提供了用于诊断PRC的方法，其包括测定该基因在来自受试者的生物学样品中的表达水平、将ELOVL7基因的表达水平与正常样品进行比较、并规定样品中ELOVL7基因的高表达水平表明受试者患有或有风险发生PRC的步骤。

本发明进一步提供了筛选用于治疗或预防PRC的化合物的方法。该方法包括使ELOVL7多肽接触测试化合物，并选择能结合ELOVL7多肽或改变ELOVL7多肽生物学活性的测试化合物。在有些实施方案中，该筛选方法可通过检测ELOVL7的脂肪酸延长活性来进行。在这些实施方案中，脂肪酸延长活性可使用本文所述体外脂肪酸延长测定法来测定。

本发明进一步提供了筛选用于治疗或预防PRC的化合物的方法，该方法包括使测试化合物接触表达ELOVL7多肽或导入了在报导基因上游包含ELOVL7转录调控区的载体的细胞，并选择能抑制ELOVL7多肽表达水平的测试化合物。

本发明还提供了用于治疗或预防PRC的药物组合物。药物组合物可以是例如抗癌剂。药物组合物可以分别包含针对SEQ ID NO：14所示ELOVL7多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸、siRNA分子或核酶的至少一部分。合适的siRNA靶向序列SEQ ID NO：7。如此，本发明的siRNA包含来自SEQ ID NO：7的核苷酸序列。它可以优选被选择作为依照本发明治疗或预防PRC的靶物。药物组合物还可以是那些包含通过本发明筛选用于治疗或预防细胞增殖性疾病诸如PRC的化合物的方法选择出的化合物的药物组合物。

希望药物组合物的作用过程(course of action)抑制癌细胞诸如PRC细胞的生长。药物组合物可应用于哺乳动物，包括人类和驯养的哺乳动物。

本发明进一步提供了使用本发明所提供的药物组合物来治疗或预防PRC的方法。

另外，本发明提供了用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括施用ELOVL7多肽的步骤。预期通过施用ELOVL7多肽诱导了抗肿瘤免疫力。如此，本发明还提供了用于诱导抗肿瘤免疫力的方法，该方法包括施用ELOVL7多肽，以及药物组合物来治疗或预防包含ELOVL7多肽的癌症的步骤。

应当了解，前述发明概述和后述发明详述二者都是优选的实施方案，而非对本发明或本发明其它备选实施方案的限制。

附图简述

图1显示了PRC细胞中的ELOVL7 mRNA表达水平和ELOVL7 mRNA的组织分布。图1(A)的照片显示了从12份前列腺癌组织显微解剖得到的癌细胞(T)和正常上皮细胞(N)中的ELOVL7半定量RT-PCR分析。12条水平线表示临床N/T成对案例。使用β2-MG来对每一份的cDNA含量进行定量。图1(B)的照片显示了多种组织Northern印迹分析，证明了ELOVL7在前列腺、胰腺和肾中表达，而且主要ELOVL7转录物的长度为大约4.0kb。P.B.白细胞表示外周血白细胞。图1(C)的照片显示了通过RT-PCR进行的、PRC细胞与正常肾和前列腺中ELOVL7表达的比较，证明了PRC细胞中的ELOVL7表达明显高于正常肾或前列腺。使用β2-MG来对每一份的cDNA含量进行定量。

图2显示了用抗ELOVL7抗体进行的PRC组织免疫组织化学分析。在所检查的PRC组织中观察到与抗ELOVL7抗体的免疫反应性，PRC细胞(A)的细胞质中展现出强烈的阳性免疫染色，而在PRC的PIN前体(B)和非癌性前列腺上皮(C)中观察到非常微弱的细胞质免疫阳性。显示了来自12份PRC标本的免疫组织化学研究的代表性数据。

图3显示了LNCaP和22Rv1细胞中由siRNA引起的ELOVL7表达敲减引起了PRC细胞生长和细胞活力的削弱。图3(A)的照片显示了siRNA对LNCaP前列腺细胞系中ELOVL7的敲减效应。使用经过针对ELOVL7的siRNA表达载体(si#5)以及阴性对照载体(siEGFP)转染的细胞进行了半定量RT-PCR。使用β2-MG来对RNA进行定量。图3(B)的照片显示了经过所示针对ELOVL7的siRNA表达载体(si#5)和阴性对照载体(siEGFP)转染的LNCaP细胞的集落形成测定结果。与遗传霉素一起温育14天后通过0.1％结晶紫染色来显现细胞。图3(C)的条形图显示了经过所示针对ELOVL7的siRNA表达载体(si#5)和阴性对照载体(siEGFP)转染的LNCaP细胞的MTT测定结果。绘制了与遗传霉素一起温育14天后的平均值及表示SD(标准偏差)的误差范围线。Y轴上的ABS表示用微量板读数仪测量得到的490nm吸光度，以630nm为参比。这些实验以一式三份进行。^**表示p值小于0.01(Students氏t检验)。图3(D)的照片显示了siRNA对22Rv1前列腺细胞系中ELOVL7的敲减效应。使用经过针对ELOVL7的siRNA表达载体(si#5)以及阴性对照载体(siEGFP)转染的细胞进行了半定量RT-PCR。使用β2-MG来对RNA进行定量。图3(E)的照片显示了经过所示针对ELOVL7的siRNA表达载体(si#5)和阴性对照载体(siEGFP)转染的22Rv1细胞的集落形成测定结果。与遗传霉素一起温育14天后通过0.1％结晶紫染色来显现细胞。图3(F)的条形图显示了经过所示针对ELOVL7的siRNA表达载体(si#5)和阴性对照载体(siEGFP)转染的22Rv1细胞的MTT测定结果。绘制了与遗传霉素一起温育14天后的平均值及表示SD(标准偏差)的误差范围线。Y轴上的ABS(吸收值)表示用微量板读数仪测量得到的490nm吸光度，以630nm为参比。这些实验以一式三份进行。^**表示p值小于0.01(Students氏t检验)。

图4显示了由ELOVL7敲减引起的脂肪酸级分变化。将ELOVL7-si5或对照siRNA转染入LNCaP细胞后第7天，从所述细胞提取脂质并通过气相层析进行脂肪酸级分分析。ELOVL7-si5转染显示出长链饱和脂肪酸水平(C20:0p＝0.002，C22:0 p＝0.008，C24:0 p＝0.003)与siEGFP转染相比的显著降低(20-30％)，而ELOVL7-si5转染对PC细胞中的单不饱和脂肪酸(n-9)和多不饱和脂肪酸(n-6和n-3)的水平没有影响。

图5显示了人重组ELOVL7蛋白的表达及其体外脂肪酸延长酶活性。(A)将30μg来自受感染或未感染的昆虫细胞的微粒体蛋白加载到15％SDS-PAGE凝胶上，使用1∶1000稀释的抗His抗体进行的Western印迹分析在受感染昆虫细胞的微粒体中检测出30kDa重组人ELOVL7。(B)使用50μg来自受感染昆虫细胞的微粒体测得的体外脂肪酸延长活性。显示了每种脂肪酸水平在5分钟反应前后的增量，来自受感染细胞的微粒体显著生成C22:0和C24:0，而对照微粒体生成C20:0但根本不生成C22:0和C24:0。对照微粒体的C20:0生成很可能是由于Sf21昆虫细胞的内源脂肪酸延长活性，而且在包含人ELOVL7蛋白的微粒体中，C20:0变成C22:0、C24:0或更长脂肪酸的延长反应可活跃进行，导致C20:0的产量更低。(C)脂肪酸链延长活性依赖于作为酶来源的受感染细胞微粒体的量。反应混合物在0.45ml反应总体积中包含10-200μg微粒体。反应成分为0.1M Tris-Cl(pH7.4)、3mM花生四烯酰基(Arachidoyl)-CoA、7.5mM丙二酸单酰基(Malonyl)-CoA、20mM NADPH、和0.6mM不含脂肪酸的BSA。三个独立实验得到同样的结果。

发明详述

词语“一个”、“一种”、“所述”和“该”在用于本文时指“至少一个/种”，除非另有明确说明。

为了披露PRC的机制及鉴定用于治疗和/或预防这些肿瘤的新诊断标志和/或药物靶，本发明人使用全基因组范围cDNA微阵列联合激光微光束显微切割，分析了PRC中的基因表达序型。结果是，鉴定出在PRC细胞中特异性过表达的ELOVL7。此外，用小干扰RNA(siRNA)抑制ELOVL7基因的表达导致对癌性细胞的显著生长抑制。这些发现说明，ELOVL7给予癌细胞以致癌活性，而且抑制这些蛋白质的活性可能是治疗和预防增殖性疾病诸如PRC的理想策略。

ELOVL7

本申请鉴定了新的人类基因ELOVL7，其在PRC细胞中的表达与正常前列腺上皮相比显著升高。ELOVL7cDNA由3815个核苷酸组成，包含SEQ IDNO：14所示846个核苷酸的可读框。该可读框编码推定的281个氨基酸的蛋白质。

如此，本发明提供了由此基因编码的基本上纯的多肽，包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽及其功能性等同物，其程度使得它们编码ELOVL7蛋白。与SEQ ID NO：15在功能上等同的多肽的例子包括例如与人ELOVL7蛋白对应的、其它生物体的同源蛋白，以及人ELOVL7蛋白的突变体。

在本发明中，术语“功能上等同的”指受试多肽具有脂肪酸延长活性，或者具有像ELOVL7蛋白一样促进细胞增殖和赋予癌细胞以致癌活性的活性。受试多肽是否具有细胞增殖活性可以如下判断，将编码受试多肽的DNA导入细胞，表达相应多肽并检测对细胞增殖的促进作用或集落形成活性的提高。此类细胞包括例如NIH3T3、COS7和HEK293。

用于检测功能上等同的多肽的便利手段是测量多肽的脂肪酸延长活性。如此，例如，可以测试变异多肽(例如与SEQ ID NO：15具有至少约80％序列同一性的多肽或由能在严格条件下与SEQ ID NO：14发生杂交的多核苷酸编码的多肽)以测定脂肪酸延长活性。用于检测脂肪酸延长活性的方法披露于下文。典型的，这些方法牵涉使测试多肽接触用于实施测定的适宜试剂。此类试剂可以包括例如脂肪酸底物(例如花生四烯酰基-CoA)、丙二酸单酰基-CoA、NADPH、及用于检测延长产物的试剂。这些方法进一步包括检测脂肪酸底物的脂肪酸延长水平并通过将脂肪酸延长水平与脂肪酸延长活性联系起来来测量脂肪酸延长活性。

用于制备与给定蛋白质在功能上等同的多肽的方法是本领域技术人员众所周知的，包括将突变导入蛋白质的已知方法。例如，通过定点诱变将适宜突变导入这些蛋白质的氨基酸序列，本领域技术人员可以制备与人ELOVL7蛋白在功能上等同的多肽(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152：271-5(1995)；Zoller and Smith，Methods Enzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al.，Nucleic Acids Res 12：9441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol154：350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82：488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol 85：2763-6(1988))。氨基酸突变也可以天然存在。本发明的多肽包括那些具有人ELOVL7蛋白的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸突变的蛋白质，只要所得突变多肽与人ELOVL7蛋白在功能上等同。这样的突变体中突变氨基酸的数目一般是10个氨基酸或更少，优选6个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少。

经过突变或修饰的蛋白质，即具有通过在某个氨基酸序列中替代、删除、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的氨基酸序列的蛋白质，已知保留了原始的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarlandet al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。

待突变的氨基酸残基优选突变成氨基酸侧链特性保守的不同氨基酸(称为保守氨基酸替代的过程)。氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、和具有如下共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基侧链(S、T、Y)；含硫原子侧链(C、M)；含羧酸和酰胺侧链(D、N、E、Q)；含碱侧链(R、K、H)；和含芳香族侧链(H、F、Y、W)。注意，括号中的字母表示氨基酸单字母代码。

在人ELOVL7蛋白的氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基的多肽的例子有包含人ELOVL7蛋白的融合蛋白。本发明包括融合蛋白，即人ELOVL7蛋白与其它肽或蛋白质的融合物。融合蛋白可通过本领域技术人员众所周知的技术来生成，诸如通过连接编码本发明人ELOVL7蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA并使得读码框匹配，将融合DNA插入表达载体并在宿主中进行表达。对与本发明蛋白质融合的肽或蛋白质没有限制。

可用作与本发明蛋白质融合的肽的已知肽包括例如FLAG(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204-10(1988))、含六个His(组氨酸)残基的6xHis、10xHis、流感凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7标签、HSV标签、E标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B标签、蛋白C片段、等等。可以与本发明蛋白质融合的蛋白质的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)、等等。

通过将编码上述融合肽或蛋白质的市售DNA与编码本发明多肽的DNA融合，并表达所制备的融合DNA，即可制备出融合蛋白。

本领域已知的、用于分离功能性等同多肽的一种备选方法是例如使用杂交技术的方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，ColdSpring Harbor Lab.Press(1989))。本领域技术人员能够容易的分离与编码人ELOVL7蛋白的DNA序列(即SEQ ID NO：14)的整个或部分具有高度同源性的DNA，并由分离的DNA分离与人ELOVL7蛋白在功能上等同的多肽。本发明的多肽包括那些由能与编码人ELOVL7蛋白的DNA序列的整个或部分发生杂交的DNA编码且与人ELOVL7蛋白在功能上等同的多肽。这些多肽包括对应于衍生自人的蛋白质的哺乳动物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的多肽)。在从动物中分离与编码人ELOVL7蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用来自前列腺的组织。

本领域技术人员可以常规选择用于分离编码与人ELOVL7蛋白在功能上等同的多肽的DNA的杂交条件。例如，杂交可如下进行：使用快速杂交缓冲液(“Rapid-hyb buffer”，Amersham LIFE SCIENCE)于68℃预杂交30分钟或更长时间，加入经过标记的探针，并于68℃温育1小时或更长时间。其后的洗涤步骤可以在例如低严格条件下进行。低严格条件为例如42℃、2X SSC、0.1％SDS，或优选50℃、2X SSC、0.1％SDS。更优选使用高严格条件。高严格条件为例如于室温用2X SSC、0.01％SDS洗涤3次、每次20分钟，然后于37℃用1X SSC、0.1％SDS洗涤3次、每次20分钟，再于50℃用1X SSC、0.1％SDS洗涤2次、每次20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度会影响杂交的严格性，而且本领域技术人员可适当选择这些因素以获得所需严格性。

使用基于编码蛋白质的DNA的序列信息(SEQ ID NO：14)合成的引物，可以利用基因扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)法代替杂交来分离编码与人ELOVL7蛋白在功能上等同的多肽的DNA。

由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离出的DNA所编码的、与人ELOVL7蛋白在功能上等同的多肽一般与人ELOVL7蛋白的氨基酸序列具有高度同源性。“高度同源性”通常指多肽序列或多核苷酸序列与其参照序列之间的同源性为40％或更高，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至更优选85％、90％、93％、95％、98％、99％或更高。百分比同源性(也称为百分比同一性)通常在两个最佳比对的序列之间测定。为了比较而比对序列的方法是本技术领域众所周知的。序列的最佳比对和比较可例如使用Wilburand Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)中的算法进行。

本发明的多肽在氨基酸序列、分子量、等电点、存在或不存在糖链、或形式方面可以有差异，这取决于用于生产所述多肽的细胞或宿主或者所采用的纯化方法。无论如何，只要多肽具有与本发明的人ELOVL7蛋白等同的功能，它就在本发明的范围内。

通过本领域技术人员众所周知的方法，可以以重组蛋白或天然蛋白的形式来制备本发明的多肽。重组蛋白可以如下制备：将编码本发明多肽的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ ID NO：14的DNA)插入适宜的表达载体，将该载体导入适宜的宿主细胞，获取提取物，并对提取物进行层析以纯化多肽，所述层析例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤或利用固定有针对本发明蛋白质的抗体的柱子的亲和层析，或者多于一种上述柱子的组合。

同样，在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中以与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的融合蛋白的形式或者以添加了多个组氨酸的重组蛋白的形式表达本发明的多肽时，可以使用谷胱甘肽柱或镍柱来纯化所表达的重组蛋白。或者，在以用c-myc、多个组氨酸或FLAG标记的蛋白质的形式表达本发明的多肽时，可以分别使用针对c-myc、His或FLAG的抗体来检测和纯化。

纯化融合蛋白之后，还可能根据需要用凝血酶或Xa因子进行切割来除去目的多肽之外的区域。

可以通过本领域技术人员已知的方法来分离天然蛋白，例如使结合有下文所述能与ELOVL7蛋白结合的抗体的亲和柱与表达本发明多肽的组织或细胞的提取物接触。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明还涵盖本发明多肽的部分肽。部分肽具有本发明多肽所特有的氨基酸序列，而且由至少7个氨基酸、优选8个氨基酸或更多、更优选9个氨基酸或更多组成。部分肽可用于例如制备针对本发明多肽的抗体、筛选能与本发明多肽结合的化合物、及筛选本发明多肽的抑制剂。

通过遗传工程、已知的肽合成法或用适当的肽酶消化本发明的多肽，均可以生产本发明的部分肽。对于肽合成，可以使用例如固相合成或液相合成。

本发明进一步提供了编码上文所述此类ELOVL7多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于在体内或在体外生成上文所述本发明多肽，或者可用于由编码本发明蛋白质的基因的基因异常所致疾病的基因疗法。可以使用本发明多核苷酸的任何形式，只要它编码本发明的多肽，包括mRNA、RNA、cDNA、基因组DNA和化学合成的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括包含给定核苷酸序列或其简并序列的DNA，只要所得DNA编码本发明的多肽。

可以通过本领域技术人员已知的方法制备本发明的多核苷酸。例如，可以如下制备本发明的多核苷酸：由表达本发明多肽的细胞制备cDNA文库，并使用本发明DNA(例如SEQ ID NO：14)的部分序列作为探针来进行杂交。可以通过Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)中记载的方法来制备cDNA文库；或者，可以使用市售cDNA文库。也可以如下制备cDNA文库：从表达本发明多肽的细胞中提取RNA，基于本发明DNA的序列(例如SEQ ID NO：14)合成寡聚DNA，使用该寡聚DNA作为引物来进行PCR，并扩增编码本发明蛋白质的cDNA。

另外，通过对所得cDNA的核苷酸进行测序，可以常规确定由该cDNA编码的翻译区，并且可以容易的获得本发明多肽的氨基酸序列。而且，通过使用所得cDNA或其部分作为探针来筛选基因组DNA文库，可以分离出基因组DNA。

更具体的说，可以首先从表达本发明对象多肽的细胞、组织、器官(例如前列腺)中制备mRNA。可以使用已知方法来分离mRNA；例如，可以通过胍超速离心(Chirgwin et al.，Biochemistry 18：5294-9(1979))或AGPC法(Chomczynski and Sacchi，Anal Biochem 162：156-9(1987))来制备总RNA。另外，可以使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等从总RNA中纯化出mRNA。或者，可以使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。

将所得mRNA用于使用逆转录酶合成cDNA。可以使用市售试剂盒诸如AMV逆转录酶cDNA第一链合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)来合成cDNA。或者，可以使用本文所述引物等、5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和聚合酶链式反应(PCR)，遵循5’-RACE法(Frohman et al.，Proc Natl Acad SciUSA 85：8998-9002(1988)；Belyavsky et al.，Nucleic Acids Res 17：2919-32(1989))来合成和扩增cDNA。

由PCR产物制备所需DNA片段，并与载体DNA连接。使用重组载体转化大肠杆菌等，并由选出的菌落制备所需重组载体。可以通过常规方法诸如双脱氧核苷酸链终止法来验证所需DNA的核苷酸序列。

考虑到待用于表达的宿主中密码子使用的频率，本发明多核苷酸的核苷酸序列可以设计成能更高效的表达(Grantham et al.，Nucleic Acids Res 9：43-74(1981))。可以使用市售试剂盒或常规方法来改变本发明多核苷酸的序列。例如，可以通过限制酶消化、插入合成寡核苷酸或适当的多核苷酸片段、添加接头、或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA、TGA或TAG)来改变序列。

具体的说，本发明的多核苷酸涵盖包含核苷酸序列SEQ ID NO：14的DNA。

此外，本发明提供了能在严格条件下与具有核苷酸序列SEQ ID NO：14的多核苷酸发生杂交且编码与上文所述本发明ELOVL7蛋白在功能上等同的多肽的多核苷酸。本领域技术人员可以恰当的选择严格条件。例如，可以使用低严格条件。更优选的是，可以使用高严格条件。这些条件与上文所述相同。上文杂交DNA优选为cDNA或染色体DNA。

本发明还提供了与编码人ELOVL7蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：14)或其互补链互补且包含至少15个核苷酸的多核苷酸。本发明的多核苷酸优选是能与编码本发明ELOVL7多肽的DNA发生特异性杂交的多核苷酸。术语“特异性杂交”在用于本文时指在常用的杂交条件下、优选在严格杂交条件下不会与编码其它蛋白质的DNA发生显著的交叉杂交。此类多核苷酸包括能与编码本发明多肽的DNA或其互补链发生特异性杂交的探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如反义寡核苷酸和核酶)。此外，此类多核苷酸可用于制备DNA芯片。

载体和宿主细胞

本发明还提供了导入有本发明多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明的载体可用于在宿主细胞中维持本发明的多核苷酸、尤其是DNA，用于表达本发明的多肽，或者用于施用本发明的多核苷酸以用于基因疗法。

当宿主细胞为大肠杆菌且在大肠杆菌(例如JM109、DH5α、HB 101或XL1Blue)中大量扩增和生成载体时，载体应具有能在大肠杆菌中扩增的“(复制)起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，与上述载体相同，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用于亚克隆和提取cDNA。当使用载体来生成本发明的蛋白质时，表达载体是特别有用的。例如，在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5α、HB101或XL1Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward et al.，Nature 341：544-546(1989)；FASEB J 6：2422-2427(1992))、araB启动子(Better et al.，Science 240：1041-1043(1988))、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(此时，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体还可以包含用于多肽分泌的信号序列。指导多肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol 169：4379(1987))。用于将载体导入靶宿主细胞的方法包括例如氯化钙法和电穿孔法。

在大肠杆菌外，可以使用例如衍生自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Mizushima and Nagata，Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。

为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.，Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima et al.，Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP 13。

多肽的生成

另外，本发明提供了用于生成本发明多肽的方法。可通过培养携带表达载体的宿主细胞来制备多肽，其中所述表达载体包含编码所述多肽的基因。根据需要，可以采用方法来稳定的表达基因，同时，扩增基因在细胞中的拷贝数。例如，可以将包含补偿性(complementary)DHFR基因的载体(例如pCHOI)导入核酸合成途径被删除的CHO细胞，然后利用甲氨蝶呤(MTX)进行扩增。另外，在瞬时表达基因时，可以使用如下方法：将包含SV40复制起点的载体(pcD等)转化入染色体上包含SV40T抗原表达基因的COS细胞。

如上所述获得的本发明多肽可以从宿主细胞的内部或外部(诸如培养基)分离，并纯化成基本上纯的同质多肽。术语“基本上纯的”在本文中用于给定多肽时指多肽基本上不含其它生物学大分子。基本上纯的多肽指以干重计时至少75％(例如至少80％、85％、95％或99％)的纯度。可通过任何适宜的标准方法来测量纯度，例如通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。用于分离和纯化多肽的方法并不局限于任何特定方法，实际上可以使用任何标准方法。

例如，可以适当选择和组合柱层析、过滤、超滤、盐沉淀、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶方法来分离和纯化多肽。

层析的例子包括例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。这些层析可通过液相层析来进行，诸如HPLC和FPLC。如此，本发明提供了通过上述方法制备的高度纯化的多肽。

在纯化前或纯化后，通过用适宜的蛋白质修饰酶进行处理，可以对本发明的多肽进行任意修饰或部分删除。有用的蛋白质修饰酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶、等等。

抗体

本发明提供了能与本发明的多肽结合的抗体。本发明的抗体可以以任何形式使用，诸如单克隆或多克隆抗体，而且包括通过用本发明的多肽免疫动物诸如兔而获得的抗血清、所有种类的多克隆和单克隆抗体、及通过遗传重组生成的人抗体和人源化抗体。

作为抗原用于获得抗体的本发明多肽可衍生自任何动物物种，但优选衍生自哺乳动物，诸如人、小鼠或大鼠，更优选衍生自人。人衍生的多肽可以由本文所公开的核苷酸或氨基酸序列获得。

根据本发明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白质或蛋白质的部分肽。部分肽可以包含例如本发明多肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。

在本文中，抗体定义为能与本发明多肽的全长或片段起反应的蛋白质。

可以将编码本发明多肽或其片段的基因插入已知的表达载体，然后用该载体转化本文所述宿主细胞。可以通过任何标准方法从宿主细胞外部或内部回收所需多肽或其片段，然后可将其用作抗原。或者，表达多肽的完整细胞或其裂解物或者化学合成的多肽也可用作抗原。

可以用抗原免疫任何哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如家兔。灵长目动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。

用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。优选的是，其后每4-21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。还可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。

可以如下制备针对本发明多肽的多克隆抗体：从经过免疫的哺乳动物(该哺乳动物经检验其血清中所需抗体增加)收集血液，并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，并且可以从所述血清中分离含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明多肽的亲和柱从仅识别本发明多肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。

为了制备单克隆抗体，从经过抗原免疫并如上所述检查出血清中所需抗体水平升高的哺乳动物收集免疫细胞，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾。其它待与上述免疫细胞融合的优选亲本细胞包括例如哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选具有为了用药物选择融合细胞而获得的特性的骨髓瘤细胞。

根据已知的方法，例如Milstein等(Galfre and Milstein，Methods Enzymol73：3-46(1981))的方法，可与将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。

通过在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中进行培养，可以选择出由细胞融合得到的杂交瘤。通常，细胞培养在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以使除了所需杂交瘤之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，进行标准有限稀释(standardlimiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。

在上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用多肽、表达多肽的细胞或其裂解物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人淋巴细胞。然后，使经过免疫的淋巴细胞与能够无限分裂的人衍生骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生生成所需人抗体(它能够与所述多肽结合)的杂交瘤(已公开但未审查的日本专利申请(JP-A)特开昭63-17688)。

随后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明多肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可用于纯化和检测本发明的多肽，还可以用作本发明多肽的拮抗剂的候选物。此外，该抗体可用于与本发明多肽有关的疾病的抗体治疗。在将所得抗体施用于人体时(抗体治疗)，优选使用人抗体或人源化抗体以降低免疫原性。

例如，可以用选自多肽、表达多肽的细胞或其裂解物的抗原免疫具有人抗体基因库(repertory)的转基因动物。然后，从该动物收集生成抗体的细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从该杂交瘤可制备针对所述多肽的人抗体(参见WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735和WO96-34096)。

或者，可以通过癌基因使生成抗体的免疫细胞，诸如经过免疫的淋巴细胞永生化，并用于制备单克隆抗体。

如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in theUnited Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可以从免疫细胞，诸如生成抗体的杂交瘤或经过免疫的淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供了如上所述制备的重组抗体。

此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它能结合一种或多种本发明的多肽。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)₂、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston etal.，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co et al.，J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz，MethodsEnzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux etal.，Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。

抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)偶联来修饰。本发明提供了经过这样修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。

或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用啮齿类的CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于整个人可变域已被来自非人物种的相应序列所替换。

也可以使用在人框架区和恒定区外还包含人可变区的完全人的抗体。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法牵涉使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227：381(1992))。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利Nos.6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。

可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分离抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow andDavid Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如HyperD、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。

除亲和层析外的例示性层析包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析规程，诸如HPLC和FPLC。

例如，可以通过吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在板上，将本发明的多肽施加到该板上，再施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。可以使用多肽的片段，诸如C-末端或N-末端片段作为抗原来评估抗体的结合活性。可以使用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。

通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明多肽的样品，并检测或测量由抗体与多肽形成的免疫复合物，上述方法允许检测或测量本发明的多肽。

因为本发明多肽的检测或测量方法可特异性的检测或测量多肽，所以该方法可用于使用多肽的各种实验。

反义多核苷酸、小干扰RNA和核酶

本发明包括能与核苷酸序列SEQ ID NO：14内的任何位点发生杂交的反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸优选针对核苷酸序列SEQ ID NO：14的至少约15个连续核苷酸。上述反义寡核苷酸更优选在上述至少15个连续核苷酸中包含起始密码子。

反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可用作反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括低级烷基膦酸酯(lower alkyl phosphonate)修饰(诸如甲基膦酸酯型(methyl-phosphonate type)或乙基膦酸酯型(ethyl-phosphonate-type))、硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰和磷酰胺(phosphoroamidate)修饰。

术语“反义寡核苷酸”在用于本文时不仅指那些核苷酸与构成DNA或mRNA特定区域的相应核苷酸完全互补的寡核苷酸，还指那些具有一个或多个核苷酸错配的寡核苷酸，只要DNA或mRNA和反义寡核苷酸能与核苷酸序列SEQ ID NO：14发生杂交。

本发明包括下述多核苷酸，它们在“至少约15个连续核苷酸的序列区域”内具有至少70％或更高、优选至少约80％或更高、更优选约90％或更高、甚至更优选约95％或更高同源性。可使用本文所述算法来确定同源性。可使用本领域已知算法来确定同源性。此外，反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可用作本发明中的反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括低级烷基膦酸酯修饰诸如甲基膦酸酯型或乙基膦酸酯型、硫代磷酸酯修饰和磷酰胺修饰。

此类反义多核苷酸可作为探针用于分离或检测编码本发明多肽的DNA，或者作为用于扩增的引物。

本发明的反义寡核苷酸衍生物如下作用于生成本发明多肽的细胞：与编码所述多肽的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促进mRNA降解并抑制本发明多肽的表达，由此导致对多肽功能的抑制。

本发明还包括包含核苷酸序列SEQ ID NO：14有义链核酸与反义链核酸之组合的小干扰RNA(siRNA)。更具体的说，用于抑制ELOVL7表达的此类siRNA包括那些靶向核苷酸序列SEQ ID NO：7的siRNA。

术语“siRNA”指能阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用标准技术将siRNA导入细胞，包括那些其中使用DNA作为转录RNA的模板的。siRNA包含编码人ELOVL7蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：14)的有义核酸序列及反义核酸序列。构建siRNA使其单一转录物(双链RNA)具有来自靶基因的互补的有义序列及反义序列二者，例如为发夹结构。

siRNA与靶细胞中ELOVL7所对应的转录物的结合导致细胞的蛋白质产量降低。寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸，而且可以与天然存在的转录物等长。优选的是，寡核苷酸的长度小于约75个、约50个、约25个核苷酸。最优选的是，寡核苷酸的长度为约19-约25个核苷酸。能抑制癌细胞生长的ELOVL7siRNA寡核苷酸的例子包括包含SEQ ID NO：7的靶序列。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到靶序列反义链的3’端。待添加的“u”的数目为至少约2个，一般为约2个-约10个，优选为约2个-约5个。所添加的“u”在siRNA反义链的3’端形成单链。

将ELOVL7siRNA以能够与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。在这些实施方案中，本发明的siRNA分子通常如上文关于反义分子所述进行修饰。其它修饰也是可能的，例如偶联有胆固醇的siRNA显示出改善的药理学特性(Song et al.Nature Med 9：347-51(2003))。或者，编码ELOVL7siRNA的DNA位于载体中。

如下生成载体，例如通过将ELOVL7靶序列克隆入表达载体，其中所述表达载体具有可操作连接的、以两条链均能表达(通过DNA分子的转录)的方式位于该ELOVL7序列侧翼的调控序列(Lee，N.S.，et al.，(2002)NatureBiotechnology 20：500-505)。其为ELOVL7mRNA的反义链的RNA分子由第一启动子(例如所克隆DNA 3’端的启动子序列)转录，其为ELOVL7mRNA的有义链的RNA分子由第二启动子(例如所克隆DNA 5’端的启动子序列)转录。所述有义链与反义链在体内杂交，从而产生用于沉默ELOVL7基因的siRNA构建物。或者，利用两个构建物来制备siRNA构建物的有义链和反义链。所克隆的ELOVL7可编码具有二级结构例如发夹的构建物，其中单一转录物具有来自靶基因的互补的有义序列及反义序列二者。

另外，为了形成发夹环结构，可以在有义序列与反义序列之间放置由任意核苷酸序列组成的环序列。如此，本发明还提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]为核糖核苷酸序列，其对应于能与来自ELOVL7基因的mRNA或cDNA发生特异性杂交的序列。在优选的实施方案中，[A]为对应于SEQ ID NO：14的核苷酸3531-3549的序列(SEQ ID NO：7)的核糖核苷酸序列，

[B]为由约3个-约23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，且

[A’]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。环序列可以由长度优选为3-23个核苷酸的任意序列组成。环序列可以选自例如如下序列(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。在本发明的siRNA中，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到[A’]的3’端。待添加的“u”的数目为至少约2个，一般为约2个-约10个，优选为约2个-约5个。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al.，Nature 418：435-438(2002))。

CCC、CCACC或CCACACC：Jacque，J.-M.，et al.，Nature 418：435-438(2002)；

UUCG：Lee，N.S.，et al.，Nature Biotechnology 20：500-505(2002)；Fruscoloni，P.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 100(4)：1639-1644(2003)；和

UUCAAGAGA：Dykxhoorn，D.M.et al.，Nature ReViews Molecular CellBiology 4：457-467(2002)。

例如，具有本发明发夹结构的优选siRNA如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环结构是UUCAAGAGA(DNA中为“ttcaagaga”)。

caagcaacaacaacaacaa-[B]-uuguuguuguuguugcuug(SEQ ID NO：7的靶序列)

ELOVL7序列侧翼的调控序列可以是相同的或不同的，使得可以独立的、或者以时间性或空间性方式调控它们的表达。如下在细胞外转录siRNA，通过将ELOVL7基因模板克隆入包含例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单元或人H1RNA启动子的载体。为了将载体导入细胞，可以使用转染增强剂。FuGENE(Rochediagnostices)、Lipofectamin 2000(InVitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(Wako pure Chemical)可以用作转染增强剂。

siRNA的核苷酸序列可使用从Ambion网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)可得到的siRNA设计计算机程序来设计。所述计算机程序基于如下方案选择siRNA的核苷酸序列：

siRNA靶位点的选择：

1.从对象转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描，寻找AA二核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl et al.，Genes Dev 13(24)：3191-7(1999)不推荐针对5’和3’非翻译区(UTR)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。

2.将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列有显著同源性的任何靶序列。可使用可在NCBI服务器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上找到的BLAST(Altschul SF，et al，NucleicAcids Res 25(17)：3389-402(1997)；Altschul SF，et al，J Mol Biol 215(3)：403-10(1990))来进行同源性搜索。

3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，可优选沿待评估基因的长度选择数个靶序列。

依照标准方法，在体外对ELOVL7 mRNA多个部分的寡核苷酸和与这些部分互补的寡核苷酸测试它们降低肿瘤细胞中(例如使用PC3、LNCaP、22Rv1或DU145PRC细胞系)ELOVL7产量的能力。使用ELOVL7特异性抗体或其它检测策略来检测与不存在候选组合物的条件下培养的细胞相比，与候选siRNA组合物接触的细胞中ELOVL7基因产物的减少。然后对在体外基于细胞的测定法或无细胞测定法中降低ELOVL7产量的序列测试其对细胞生长的抑制作用。对在体外基于细胞的测定法或无细胞测定法中抑制细胞生长的序列在大鼠或小鼠中进行体内测试，以验证携带恶性赘生物的动物中ELOVL7产量的降低和肿瘤细胞生长的降低。

本发明还包括包含靶序列的核酸序列的双链分子，所述靶序列例如SEQID NO：14的核苷酸3531-3549(SEQ ID NO：7)。在本发明中，双链分子包含有义链及反义链，其中所述有义链包含对应于SEQ ID NO：7的核糖核苷酸序列，而所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链与所述反义链相互杂交而形成所述双链分子，所述双链分子在导入表达ELOVL7基因的细胞后能抑制所述基因的表达。在本发明中，当分离的核酸为RNA或其衍生物时，核苷酸序列中的碱基“t”应替换为“u”。在用于本文时，术语“互补的”指核酸分子的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”指两个核酸或化合物、或者相关核酸或化合物、或者其组合之间的物理或化学相互作用。

互补的核酸序列能在适宜条件下发生杂交而形成几乎不含或不含错配的稳定双链体。此外，本发明的分离的核苷酸的有义链和反义链可以通过杂交而形成双链核苷酸或发夹环结构。在一个优选的实施方案中，此类双链体的每10个配对中出现的错配不超过1个。在一个特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，即此类双链体不含错配。核酸分子的长度少于3815个核苷酸(对于SEQ ID NO：14)。例如，核酸分子的长度少于500个、200个、75个核苷酸。本发明还包括包含一个或多个本文所述核酸的载体，以及包含该载体的细胞。本发明的分离的核酸可用于针对ELOVL7的siRNA或编码这些siRNA的DNA。在将这些核酸用于siRNA或编码siRNA的DNA时，有义链优选长于约19个核苷酸，更优选长于约21个核苷酸。

本发明的反义寡核苷酸或siRNA能抑制本发明多肽的表达，因而可用于抑制本发明多肽的生物学活性。同样，包含本发明反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂是有用的，因为它们能抑制本发明多肽的生物学活性。因此，包含本发明反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗PRC。能抑制哺乳动物细胞中表达的ELOVL7 siRNA寡核苷酸的例子包括包含SEQ ID NO：7的靶序列。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到靶序列反义链的3’端。要添加的“u”的数目为至少约2个，一般为约2个-约10个，优选为约2个-约5个。所添加的“u”在siRNA反义链的3’端形成单链。

同样，包含本发明反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂是有用的，因为它们能抑制本发明多肽的生物活性。因此，包含本发明反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增殖性疾病，诸如PRC。

此外，本发明提供了能抑制本发明ELOVL7多肽表达的核酶。

通常，核酶分为大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯键的酶。在与大核酶反应后，反应位点由5’-磷酸根和3’-羟基组成。大核酶进一步分为(1)催化鸟苷在5’-剪接位点的酯基转移作用(transesterification)的I组内含子RNA；(2)催化经由套索(lariat)结构经过两步反应自我剪接的II组内含子RNA；和(3)通过水解在5’位点切割tRNA前体的核糖核酸酶P的RNA组件。另一方面，小核酶与大核酶相比更小(约40bp)，并且小核酶切割RNA产生5’-羟基和2’-3’环状磷酸酯。锤头型核酶(Koizumi et al.，FEBS Lett 228：225(1988))和发夹型核酶(Buzayan，Nature 323：349-53(1986)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res 19：6751(1992))都包括在小核酶中。用于设计和构建核酶的方法是本领域已知的(参见Koizumi et al.，FEBS Lett 228：225(1988)；Koizumi et al.，Nucleic Acids Res 17：7059(1989)；Kikuchi and Sasaki，NucleicAcids Res 19：6751(1992))。如此，能抑制本发明多肽表达的核酶也可以根据其序列信息(SEQ ID NO：14)和这些常规方法来构建。

针对ELOVL7基因的核酶能抑制过表达的ELOVL7蛋白的表达，因而可用于抑制该蛋白质的生物学活性。因此，核酶可用于治疗或预防PRC。

前列腺癌的诊断

而且，本发明提供了使用本发明基因的表达水平或本发明多肽的活性水平为诊断标志，诊断细胞增殖性疾病诸如PRC的方法。

在有些实施方案中，该诊断方法包括如下步骤：(a)检测本发明ELOVL7基因的表达水平；并(b)将表达水平的升高与PRC联系起来。

通过对对应于ELOVL7基因的mRNA或由ELOVL7基因编码的蛋白质定量，可以评估生物学样品中ELOVL7基因的表达水平。mRNA的定量方法是本领域技术人员已知的。例如，可以通过Northern印迹或RT-PCR来评估对应于ELOVL7基因的mRNA的水平。既然ELOVL7基因的全长核苷酸序列示于SEQ ID NO：14，任何本领域技术人员都可设计出用于对ELOVL7基因定量的探针或引物的核苷酸序列。

还可以基于由ELOVL7基因编码的蛋白质的数量来分析该基因的表达水平。用于测定ELOVL7蛋白的数量的方法显示如下。例如，免疫测定法可用于测定生物学材料中的蛋白质。只要标志基因(ELOVL7基因)在PRC患者的样品中表达，可以将任何生物学材料用作测定蛋白质或其活性的生物学样品。例如，前列腺导管上皮可作为这样的生物学样品。然而，体液，诸如血液和尿液也可用于分析。

对生物学样品中ELOVL7基因的表达水平或ELOVL7多肽的蛋白质水平进行评估，并与正常样品(例如衍生自非患病受试者的样品)中的水平进行比较。当这样的比较显示靶基因的表达水平或蛋白质水平比正常样品中的水平高时，则判定该受试者患有PRC。可以同时测定来自正常受试者和待诊断受试者的生物学样品中ELOVL7基因的表达水平。或者，可以通过统计学方法，基于通过分析从对照组预先采集的样品中基因表达水平获得的结果，确定出表达水平或蛋白质水平的正常范围。将受试者样品获得的结果与正常范围进行比较，当该结果未落入正常范围时，则判定受试者患有或有风险发生PRC。

在本发明中，还提供了用于诊断细胞增殖性疾病，诸如PRC的诊断剂。本发明的诊断剂包括能与本发明的多核苷酸或多肽结合的化合物。优选的是，使用能与本发明的多核苷酸发生杂交的寡核苷酸或能与本发明的多肽结合的抗体作为这样的化合物。

诊断PRC的本发明本方法可用于评估受试者中PRC治疗的功效。根据该方法，由接受PRC治疗的受试者获得生物学样品，诸如测试细胞群。用于评估的方法可以依照诊断PRC的常规方法进行。

必要时，在治疗前、治疗中或治疗后的多个时间点由受试者获取生物学样品。然后测定生物学样品中ELOVL7基因的表达水平，并与对照水平进行比较，所述对照水平衍生自例如已知包含PRC状态(即癌性细胞或非癌性细胞)的细胞的参照细胞群。所述对照水平是在未接受所述治疗的生物学样品中测定的。

若对照水平衍生自不含癌性细胞的生物学样品，则衍生自受试者的生物学样品中的表达水平与对照水平之间的相似性表明治疗是有效的。衍生自受试者的生物学样品中ELOVL7基因的表达水平与对照水平之间的差异表明临床效果或预后较不理想。

术语“有效的”指治疗引起受试者中病理性上调的基因(ELOVL7基因)的表达降低，或者PRC细胞的大小、流行性或增殖潜力降低。当预防性施用治疗时，术语“有效的”表示治疗可延迟或防止PRC的发生。PRC的评估可以使用标准临床规程进行。此外，可以采用用于诊断或治疗PRC的任何已知方法来确定治疗的有效性。

此外，通过将衍生自患者的生物学样品，诸如测试细胞群中ELOVL7基因的表达水平与对照水平进行比较，诊断PRC的本方法还可用于评估PRC受试者的预后。或者，可以在一系列疾病阶段(a spectrum of disease stage)中测量衍生自患者的生物学样品中ELOVL7基因的表达水平，以评估患者的预后。

ELOVL7基因的表达水平与正常对照水平相比的升高表明预后较不理想。ELOVL7基因的表达水平的降低表明患者的预后更为理想。

化合物的筛选

利用ELOVL7基因、由该基因编码的蛋白质、或该基因的转录调控区，可以筛选能改变该基因的表达或由该基因编码的多肽的生物学活性的化合物。此类化合物可作为药物用于治疗或预防PRC。

因此，本发明提供了使用本发明的多肽筛选用于治疗或预防PRC的化合物的方法。该筛选方法的一个实施方案包括以下步骤：a)使测试化合物与本发明的多肽接触；b)检测本发明多肽与测试化合物之间的结合活性；并c)选择能与本发明多肽结合的测试化合物。

用于筛选的本发明多肽可以是重组多肽或者衍生自天然的蛋白质或其部分肽。与测试化合物接触的本发明多肽可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式、或与其它多肽融合的融合蛋白。

作为例如使用本发明的多肽筛选能与本发明多肽结合的蛋白质的方法，可以使用本领域技术人员众所周知的许多方法。这样的筛选可以通过例如免疫沉淀法来进行，具体以下述方式。通过将编码本发明多肽的基因插入外来基因表达载体，诸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，使该基因在宿主(例如动物)细胞等中表达。用于表达的启动子可以是常用的任何启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，GeneticEngineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))、EF-α启动子(Kimetal.，Gene 91：217-23(1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193-200(1991))、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SRα启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466(1988))、CMV立即早期启动子(Seed and Aruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946-58(1989))、HSV TK启动子等。可以依照任何方法将基因导入欲表达外来基因的宿主细胞，例如电穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、磷酸钙法(Chen andOkayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAE右旋糖苷法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 4：1641-3(1984))、脂转染法(Derijard B et al.，Cell 76：1025-37(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 5：22-30(1993)；Rabindran et al.，Science 259：230-4(1993))等。通过将特异性已知的单克隆抗体的表位导入本发明多肽的N末端或C末端，可以以包含单克隆抗体识别位点(表位)的融合蛋白的形式表达本发明的多肽。可以使用市售的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。利用其多克隆位点来表达含例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的融合蛋白的载体是可以通过商业途径得到的。

还报道了通过仅导入由几个到十几个氨基酸组成的小表位而制备的融合蛋白，使得本发明多肽的特性不会因融合而改变。表位，诸如聚组氨酸(His标签)、流感聚集体HA、人c-myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV标签)、E标签(单克隆噬菌体上的表位)等，及识别它们的单克隆抗体都可以作为表位-抗体系统用于筛选能与本发明多肽结合的蛋白质(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。

在免疫沉淀中，通过向使用合适的洗涤剂制备的细胞裂解物中添加这些抗体，形成了免疫复合物。免疫复合物由本发明的多肽、具有与该多肽结合能力的多肽和抗体组成。在使用针对上述表位的抗体外，还可以使用针对本发明多肽的抗体来进行免疫沉淀，所述抗体可以如上所述制备。

当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过例如蛋白A sepharose或蛋白Gsepharose来沉淀免疫复合物。如果将本发明多肽制备成带有表位诸如GST的融合蛋白，那么可使用与这些表位特异性结合的物质，诸如谷胱甘肽-Sepharose 4B，按照与使用针对本发明多肽的抗体相同的方式形成免疫复合物。

免疫沉淀可以遵循或依照例如文献(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))中的方法进行。

通常使用SDS-PAGE对免疫沉淀的蛋白质进行分析，可以使用合适浓度的凝胶通过蛋白质的分子量来分析所结合的蛋白质。由于与本发明多肽结合的蛋白质难以通过常规染色法诸如考马斯染色或银染色来检测，因而可以如下改进蛋白质检测灵敏度：在含有放射性同位素³⁵S-甲硫氨酸或³⁵S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白质，并检测该蛋白质。在蛋白质的分子量已知时，可以从SDS-聚丙烯酰胺凝胶直接纯化靶蛋白并测定其序列。

作为使用多肽来筛选能与本发明多肽结合的蛋白质的方法，可以使用例如West-Western印迹分析(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。具体的说。可以如下获得能与本发明多肽结合的蛋白质：使用噬菌体载体(例如ZAP)由预计表达能与本发明多肽结合的蛋白质的细胞、组织、器官(例如组织诸如睾丸)或培养的细胞(例如PC3、DU145、LNCaP、22Rv11)制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达该蛋白质，将所表达的蛋白质固定在滤膜上，使经过纯化和标记的本发明多肽与上述滤膜反应，并根据标记物来检测表达能与本发明多肽结合的蛋白质的噬菌斑。可以利用生物素与亲合素之间的结合，或者利用能与本发明多肽或本发明多肽所融合的肽或多肽(例如GST)特异性结合的抗体，来标记本发明的多肽。也可以采用使用放射性同位素或荧光等的方法。

或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER双杂交系统”、“MATCHMAKER哺乳动物双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参见Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)；Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994))。

在双杂交系统中，将本发明的多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。由预计表达能与本发明多肽结合的蛋白质的细胞制备cDNA文库，使得该文库在表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后将该cDNA文库导入上述酵母细胞，并从检测为阳性的克隆分离衍生自该文库的cDNA(当在酵母细胞中表达能与本发明多肽结合的蛋白质时，两者的结合激活报告基因，使得阳性克隆可检测出)。通过将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白质，可以制备由该cDNA编码的蛋白质。

作为报告基因，在HIS3基因外，可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。

还可以使用亲和层析来筛选能与本发明多肽结合的化合物。例如，可以将本发明的多肽固定在亲和柱的载体上，并将测试化合物施加至该柱，所述测试化合物包含能与本发明多肽结合的蛋白质。此处的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试化合物后，对柱进行洗涤，并可制备出已与本发明多肽结合的化合物。

当测试化合物是蛋白质时，分析所得蛋白质的氨基酸序列，基于该序列合成寡聚DNA，并使用该寡聚DNA作为探针来筛选cDNA文库以获得编码该蛋白质的DNA。

在本发明中，可以将使用表面等离子体共振现象的生物传感器用作对所结合的化合物进行检测或定量的手段(mean)。在使用此类生物传感器(例如BIAcore，Pharmacia)时，只使用极少量的多肽且不需标记，可实时观察表面等离子体共振信号作为本发明多肽与测试化合物之间的相互作用。因此，可使用BIAcore等生物传感器来评估本发明多肽与测试化合物之间的结合。

将固定化的本发明多肽暴露于合成化学化合物、天然物质库或随机噬菌体肽展示文库后筛选与之结合的分子的方法，及基于组合化学技术使用高通量来分离能与本发明蛋白质结合的蛋白质和化学化合物(包括激动剂和拮抗剂)的筛选方法(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))是本领域技术人员众所周知的。

或者，本发明提供了使用本发明多肽筛选用于治疗或预防PRC的化合物的方法，其包括以下步骤：

(a)使测试化合物与本发明多肽接触；

(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；并

(c)选择与不存在测试化合物的条件下检测到的生物学活性相比抑制该多肽生物学活性的测试化合物。

既然本发明的ELOVL7蛋白具有促进PRC细胞的细胞增殖的活性，因而可以使用该活性为指标，筛选能抑制本发明该蛋白质的该活性的化合物。

只要具有ELOVL7蛋白的生物学活性，任何多肽均可用于筛选。此类生物学活性包括人ELOVL7蛋白的细胞增殖活性。例如，可以使用人ELOVL7蛋白，也可以使用与这些蛋白质在功能上等同的多肽。此类多肽可以是细胞内源性或外源性表达的。

或者，可以通过在存在测试化合物的条件下直接检测ELOVL7蛋白的脂肪酸延长活性来进行测定。在这些实施方案中，使用本领域已知方法检测ELOVL7的体外活性。例如，可以通过差速离心从表达本发明ELOVL7多肽的细胞分离微粒体，一般使用Moon等人描述的规程(Moon YA，et al.，J BiolChem 276：45358-45366(2001))。用于制备微粒体的优选方法描述于下。通常，反应混合物将包含含有本发明ELOVL7多肽(例如SEQ ID NO：15或与SEQ IDNO：15至少约80％相同的多肽)的微粒体及用于实施测定的适宜试剂。此类试剂可以包括例如脂肪酸底物(例如花生四烯酰基-CoA)、丙二酸单酰基-CoA、NADPH、和用于检测延长产物的试剂。样品中的每种脂肪酸水平可以使用例如下文所述气相层析质谱来分析。还可以制备包含可用于实施本发明脂肪酸延长活性测定法的上述试剂的试剂盒。

通过这种筛选而分离的化合物是本发明多肽的激动剂或拮抗剂的候选物。术语“激动剂”指通过与本发明多肽结合而活化其功能的分子。同样，术语“拮抗剂”指通过与本发明多肽结合而抑制其功能的分子。而且，通过这种筛选作为“拮抗剂”而分离的化合物是抑制本发明多肽与分子(包括DNA和蛋白质)在体内相互作用的候选化合物。

当本发明方法中所检测的生物学活性为细胞增殖时，可以如实施例所述如下进行检测：制备表达本发明多肽的细胞，在存在测试化合物的条件下培养该细胞，并测定细胞增殖速度、测量细胞周期等、以及测量集落形成活性。

在另一个实施方案中，本发明提供了筛选用于治疗或预防PRC的化合物的方法。如上详细描述，通过控制ELOVL7的表达水平，可以控制PRC的发作和进展。因而，通过以ELOVL7的表达水平为指标进行筛选，可以鉴定可用于治疗或预防PRC的化合物。在本发明的上下文中，这样的筛选可包括例如以下步骤：

(a)使测试化合物与表达ELOVL7的细胞接触；并

(b)选择与不存在测试化合物时检测到的表达水平相比降低ELOVL7表达水平的测试化合物。

表达至少一种ELOVL7的细胞包括例如由PRC建立的细胞系；这样的细胞可以用于本发明的上述筛选(例如PC3、DU145、LNCaP、22Rv1)。表达水平可以通过本领域技术人员众所周知的方法来评估。在筛选方法中，可选择降低ELOVL7表达水平的化合物作为用于治疗或预防PRC的候选药剂。

或者，本发明的筛选方法可包括以下步骤：

a)使测试化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体包含标志基因的转录调控区及在该转录调控区的控制下表达的报告基因，其中所述标志基因为ELOVL7；

b)测量所述报告基因的表达水平或活性；并

c)选择与对照相比降低所述报告基因表达水平或活性的测试化合物。

合适的报告基因和宿主细胞是本领域众所周知的。使用标志基因的转录调控区，可以制备筛选所需的报告子构建体。当本领域技术人员已知标志基因的转录调控区时，可以使用先前的序列信息来制备报告子构建体。当标志基因的转录调控区仍未鉴定时，可以基于标志基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离包含转录调控区的核苷酸区段。

可用于结合蛋白质的支持物的实例包括不溶性多糖，诸如琼脂糖、纤维素和右旋糖苷；及合成树脂，诸如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；优选由上述材料制备的市售的珠和板(例如多孔板、生物传感器芯片等)。使用珠子时，可以将其填入柱子。

蛋白质与支持物的结合可依照常规方法进行，诸如化学键合和物理吸附。或者，蛋白质可通过特异性识别它的抗体而与支持物结合。此外，还可以利用亲合素与生物素来进行蛋白质与支持物的结合。

蛋白质之间的结合在缓冲液中进行，例如但不限于磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，只要缓冲液不抑制蛋白之间的结合即可。

在本发明中，利用表面等离子体共振现象的生物传感器可用作对所结合蛋白质检测或定量的手段。使用这样的生物传感器(例如BIAcore，Pharmacia)时，仅使用极少量的多肽且无需标记，即可将蛋白质之间的相互作用实时观察为表面等离子体共振信号。

或者，可以标记ELOVL7多肽，所结合蛋白质的标记物可用于检测或测量所结合的蛋白质。具体的说，对一种蛋白质进行预标记之后，在存在测试化合物的条件下使经过标记的蛋白质与另一种蛋白质接触，然后在洗涤之后根据标记物来检测或测量所结合的蛋白质。

在本发明的方法中，可以使用标记物质来标记蛋白质，诸如放射性同位素(例如³H、¹⁴C、³²p、³³p、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶)、荧光物质(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明)、和生物素/亲合素。在用放射性同位素标记蛋白质时，可通过液体闪烁法进行检测或测量。或者，通过加入酶的底物，用吸收光度计(absorptiometer)检测底物的酶促变化诸如颜色的产生，可以检测或测量用酶标记的蛋白质。此外，在将荧光物质用作标记物的情况中，可使用荧光光度计来检测或测量所结合的蛋白质。

在本发明的筛选中使用抗体的情况中，抗体优选用上述标记物质之一进行标记，并基于标记物质进行检测或测量。或者，也可以将针对ELOVL7多肽或肌动蛋白的抗体用作第一抗体，使用以标记物质标记的第二抗体对其进行检测。此外，本发明的筛选中与蛋白质结合的抗体可使用蛋白G或蛋白A柱进行检测或测量。

在本发明的筛选方法中可以使用任何测试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、微生物发酵产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制的蛋白质、肽、非肽化合物、合成小分子化合物和天然化合物。本发明的测试化合物还可以使用本领域已知的组合文库法的多种方法的任一种获得，包括(1)生物学文库，(2)空间定位平行固相或溶液相文库(spatiallyaddressable parallel solid phase or solution phase libraries)，(3)需要重叠合法(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物”(one bead one compound)文库法，和(5)使用亲和层析选择的合成文库法。使用亲和层析选择的生物学文库法限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam，Anticancer Drug Des 12：145(1997))。合成分子文库的方法的例子可在本领域找到(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 90：6909(1993)；Erb etal.，Proc Natl Acad Sci USA 91：11422(1994)；Zuckermann et al.，J Med Chem37：2678(1994)；Cho et al.，Science 261：1303(1993)；Carell et al.，Angew ChemInt Ed Engl 33：2059(1994)；Carell et al.，Angew.Chem Int Ed Engl 33：2061(1994)；Gallop et al.，J Med Chem 37：1233(1994))。化合物文库可存在于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques 13：412(1992))、珠子上(Lam，Nature 354：82(1991))、芯片上(Fodor，Nature 364：555(1993))、细菌上(美国专利5,223,409)、孢子上(美国专利5,571,698；5,403,484和5,223,409)、质粒上(Cull et al.，ProcNatl Acad Sci USA 89：1865(1992))或噬菌体上(Scott and Smith，Science 249：386(1990)；Delvin，Science 249：404(1990)；Cwirla et al.，Proc Natl Acad SciUSA 87：6378(1990)；Felici，J Mol Biol 222：301(1991)；美国专利申请20020103360)。

通过本发明筛选方法分离的化合物是抑制本发明多肽的活性、用于治疗或预防可归于例如细胞增殖性疾病的疾病、诸如PRC的药物候选物。通过本发明筛选方法获得的化合物的部分结构通过添加、删除和/或取代而发生转变的化合物包括在通过本发明筛选方法获得的化合物内。

用于治疗或预防前列腺癌的药物组合物

本发明提供了用于治疗或预防前列腺癌的组合物，其包含通过本发明的筛选方法选择出的任何化合物。

在为治疗细胞增殖性疾病(例如PRC)而将通过本发明筛选方法分离出的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以使用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据需要，药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊剂口服施用；或者用水或任何其它制药学可接受液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射的形式非口服施用。例如，可以将化合物以普遍接受的药物实施(implementation)所需的单位剂型与药理学可接受载体或介质混合，具体为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中有效成分的量是可获得的指定范围内的合适剂量。

可以混合到片剂和胶囊中的添加剂的例子包括但不限于粘合剂，诸如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂，诸如结晶纤维素；溶胀剂，诸如玉米淀粉、明胶和褐藻酸；润滑剂，诸如硬脂酸镁；增甜剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精；和芳香剂，诸如薄荷、Gaultheria adenothrix油和樱桃。若单位剂量形式为胶囊剂，则上述成分中还可以包括液体载体，诸如油。注射用无菌组合物可以使用媒介物诸如注射用蒸馏水，遵循正规药物实施进行配制。

生理盐水，葡萄糖，及其它等渗液体，包括佐剂，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，可用作注射用水溶液。这些可以与合适的增溶剂组合使用，诸如醇，特别是乙醇；多元醇，诸如丙二醇和聚乙二醇；及非离子表面活性剂，诸如Polysorbate 80^TM和HCO-50。

芝麻油或大豆油可用作油质液体，它们可以与苯甲酸苯甲酯或苯甲醇组合使用作为增溶剂，而且可以与缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液；止痛药，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇和酚；及抗氧化剂配制在一起。所制备的注射剂可以装入合适的安瓿。

可以使用本领域技术人员众所周知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如动脉内、静脉内或经皮注射及鼻内、经支气管、肌肉内或口服施用。施用的剂量和方法根据患者的体重和年龄及施用方法而变化；然而，本领域技术人员可以常规选择它们。如果所述化合物可以由DNA编码，那么可以将该DNA插入基因疗法的载体，并施用该载体以进行治疗。施用的剂量和方法根据患者的体重、年龄和症状而变化，但是本领域技术人员可以合适的选择它们。

举例来说，在给正常体重成人(60kg)口服施用时，虽然根据症状存在一些差异，能与本发明多肽结合并调节其活性的化合物的剂量为约0.1mg到约100mg每天，优选为约1.0mg到约50mg每天，更优选为约1.0mg到约20mg每天。

在以注射形式给正常体重成人(体重60kg)肠胃外施用时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法存在一些差异，静脉内注射约0.01mg到约30mg每天，优选约0.1mg到约20mg每天，更优选约0.1mg到约10mg每天的剂量是合适的。而且，在其它动物的情况中，有可能按换算为60kg体重的量施用。

此外，本发明提供了用于治疗或预防PRC的药物组合物，其包含能抑制ELOVL7基因表达的活性成分。此类活性成分包括针对ELOVL7基因的反义多核苷酸、siRNA或核酶或者所述反义多核苷酸、siRNA或核酶的衍生物，诸如表达载体。

通过与对衍生物无活性的合适基质混合，可以将这些活性成分制成外用制剂，诸如搽剂(liniment)或罨剂(poultice)。而且，根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、止痛药等，可以将这些活性成分配制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、滴鼻剂和冷冻干燥剂。这些剂型可以依照常规方法来制备。

通过直接施加到患处上或通过注射到血管中使其到达患处，将活性成分给予患者。也可以使用封固剂(mounting medium)来提高持久性和膜通透性。封固剂的例子包括脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂转染剂、或它们的衍生物。

本发明的此类组合物的剂量可以根据患者的状况而适当调整，并以所需量使用。例如，可以施用的剂量范围为0.1-100mg/kg，优选0.1-50mg/kg。

本发明的另一个实施方案是用于治疗或预防PRC的组合物，其包含针对由ELOVL7基因所编码的多肽的抗体或该抗体的、能与该多肽结合的片段。

在给正常体重成人(60kg)口服施用时，虽然根据症状存在一些差异，抗体或其片段用于治疗或预防PRC的剂量为约0.1mg到约100mg每天，优选为约1.0mg到约50mg每天，更优选为约1.0mg到约20mg每天。

在以注射形式给正常体重成人(体重60kg)肠胃外施用时，虽然因患者状况、疾病症状和施用方法而有差异，但静脉内注射约0.01mg到约30mg每天，优选约0.1mg到约20mg每天，更优选约0.1mg到约10mg每天的剂量是合适的。而且，在其它动物的情况中，有可能按换算为60kg体重的量施用。

用于治疗或预防前列腺癌的方法

本发明提供了用于治疗或预防受试者中的PRC的方法。将治疗性化合物预防性或治疗性的施用于患有或有风险发生(或易感)PRC的受试者。使用标准临床方法或通过检测ELOVL7的异常表达水平或活性来鉴定此类受试者。预防性施用在出现疾病的明显临床症状之前进行，从而阻止疾病或病症的出现或者延迟其进程。

治疗方法包括降低ELOVL7基因的表达或功能。在这些方法中，用有效量的化合物来治疗受试者，所述有效量的化合物能降低受试者中过表达的基因(ELOVL7基因)。施用可以是全身的或局部的。治疗性化合物包括能降低PRC细胞中内源存在的此类基因表达水平的化合物(即能下调过表达的基因的表达的化合物)。施用此类治疗性化合物能抵消受试者细胞中异常过表达的基因的效果。此类化合物可通过上文所述本发明筛选方法来获得。

ELOVL7基因的表达还可以以本领域已知的数种方法中的任何一种来抑制，包括给受试者施用能抑制或拮抗基因表达的核酸。可以将破坏基因表达的反义寡核苷酸、siRNA或核酶用于抑制基因的表达。

如上所述，可以用对应于ELOVL7基因的核苷酸序列的反义寡核苷酸来降低ELOVL7基因的表达水平。具体的说，本发明的反义寡核苷酸可以如下发挥作用，即与由ELOVL7基因所编码的多肽或与之对应的mRNA结合，从而抑制基因的转录或翻译，促进mRNA的降解和/或抑制基因所编码的蛋白质的表达，并最终抑制ELOVL7蛋白的功能。

通过与对衍生物无活性的合适基质混合，可以将反义寡核苷酸及其衍生物制成外用制剂，诸如搽剂或罨剂，并用于本发明治疗或预防PRC的方法。

能抑制一种或多种过表达基因的基因产物的核酸还包括小干扰RNA(siRNA)，其包含编码ELOVL7基因的核苷酸序列的有义链核酸与反义链核酸的组合。将siRNA导入细胞的标准技术可用于本发明的治疗或预防，其包括以DNA为模板转录RNA的技术。构建siRNA使得单一转录物具有来自靶基因的互补的有义序列及反义序列二者，例如为发夹结构。

本发明的方法可用于抑制ELOVL7基因表达上调的细胞中的基因表达。siRNA与靶细胞中ELOVL7基因转录物的结合导致细胞产生的ELOVL7蛋白减少。

能抑制过表达基因的基因产物的核酸还包括针对过表达基因(ELOVL7基因)的核酶。

此外，本发明提供了使用针对本发明多肽的抗体来治疗或预防细胞增殖性疾病，诸如PRC的方法。依照该方法，施用药学有效量的针对本发明多肽的抗体。由于ELOVL7蛋白的表达在PRC细胞中上调且这些蛋白质的表达抑制导致细胞增殖活性的降低，预计细胞增殖性疾病可通过抗体与这些蛋白质的结合来治疗或预防。如此，以足以降低本发明蛋白质活性的剂量施用针对本发明多肽的抗体，其范围为0.1到约250mg/kg每天。成人的剂量范围一般为约5mg到约17.5g/天，优选约5mg到约10g/天，最优选约100mg到约3g/天。

或者，可使用能与肿瘤细胞所特有的细胞表面标志物结合的抗体作为药物投递工具。例如，以足以破坏肿瘤细胞的剂量施用偶联有细胞毒剂的抗体。

本发明还涉及诱导抗肿瘤免疫力的方法，包括施用ELOVL7蛋白或其免疫学活性片段、或者编码该蛋白质或其片段的多核苷酸。ELOVL7蛋白或其免疫学活性片段可用作针对细胞增殖性疾病诸如PRC的疫苗。在有些情况中，可以以结合于T细胞受体(TCR)或由抗原呈递细胞(APC)诸如巨噬细胞、树突细胞(DC)或B细胞呈递的形式施用蛋白质或其片段。由于DC具有强抗原呈递能力，在APC中使用DC是最优选的。

在本发明中，针对细胞增殖性疾病的疫苗指能够在接种后的动物中诱导抗肿瘤免疫力的物质。一般而言，抗肿瘤免疫力包括诸如以下的免疫应答：

-诱导针对肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，

-诱导识别肿瘤的抗体，和

-诱导抗肿瘤细胞因子的产生。

因此，若某种蛋白质在接种后的动物中诱导任一种上述免疫应答，则确定该蛋白质具有抗肿瘤免疫力诱导效果。蛋白质对抗肿瘤免疫力的诱导可以通过在体内或在体外观察宿主中的免疫系统针对蛋白质的应答来检测。

例如，用于检测细胞毒性T淋巴细胞诱导的方法是众所周知的。进入活体的外来物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用被呈递给T细胞和B细胞。以抗原特异性方式应答APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激而分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这称为T细胞活化)。因此，某种肽的CTL诱导可以通过将该肽经由APC呈递给T细胞并检测CTL的诱导来评估。此外，APC具有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞和NK细胞的效果。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫力中也是重要的，可使用这些细胞的活化效果作为指标来评估肽的抗肿瘤免疫力诱导作用。

使用树突细胞(DC)作为APC来评估CTL诱导作用的方法是本领域众所周知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在该方法中，首先使测试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。在与DC接触后检测到具有针对目的细胞的细胞毒性效果的T细胞，则表示该测试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。针对肿瘤的CTL活性可以使用例如⁵¹Cr标记的肿瘤细胞的溶解作为指标来检测。或者，使用³H-胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评估肿瘤细胞破坏程度的方法也是众所周知的。

在DC外，外周血单个核细胞(PBMC)也可用作APC。已报道可通过在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养PBMC来增强CTL的诱导。相似的，已显示通过在存在钥孔

血蓝蛋白(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC来诱导CTL。

通过这些方法证实为具有CTL诱导活性的测试多肽就是具有DC活化效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作针对肿瘤的疫苗。此外，通过与多肽接触而获得诱导针对肿瘤的CTL的能力的APC也可用作针对肿瘤的疫苗。此外，通过APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作针对肿瘤的疫苗。利用由APC和CTL引起的抗肿瘤免疫力的这些肿瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。

一般来说，在将多肽用于细胞免疫疗法时，已知通过组合多种具有不同结构的多肽并使它们与DC接触来增加CTL诱导的效率。因此，在用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。

或者，多肽对抗肿瘤免疫力的诱导可通过观察针对肿瘤的抗体的产生的诱导来证实。例如，在用多肽免疫的实验动物中诱导了针对该多肽的抗体时及在这些抗体抑制肿瘤细胞的生长时，可确定该多肽具有诱导抗肿瘤免疫力的能力。

通过施用本发明的疫苗来诱导抗肿瘤免疫力，而且该抗肿瘤免疫力的诱导能够治疗和预防细胞增殖性疾病，诸如PRC。针对癌症的治疗或对癌症发作的预防包括任何下述步骤，诸如癌性细胞生长的抑制，癌症的退化(involution)及癌发生的抑制。癌症的治疗或预防效果还包括患有癌症的个体的死亡率降低、血液中肿瘤标记物的减少、癌症伴发的可检测症状的缓解等。此类治疗和预防效果优选是统计学上显著的。例如，在显著性水平为5％或更低的观察结果中，其中将疫苗针对细胞增殖性疾病的治疗或预防效果与未施用疫苗的对照进行比较。例如，可以将Student氏t检验、Mann-Whitney U检验或ANOVA用于统计学分析。

上述具有免疫学活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可以与佐剂组合。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或相继)施用后能增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。佐剂的例子包括但不限于霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等。此外，本发明的疫苗可适当的与可药用载体组合。此类载体的例子有无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。此外，疫苗可以在必要时包含稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。疫苗可全身或局部施用。疫苗施用可以通过单次施用进行，或者通过多次施用来强化。

在使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以通过例如离体方法来治疗或预防肿瘤。更具体的说，收集接受治疗或预防疗法的受试者的PBMC，使该细胞与多肽在离体条件下接触，并在诱导APC或CTL后将该细胞施用于受试者。也可通过将编码多肽的载体在离体条件下导入PBMC来诱导APC。可以在施用前克隆经过体外诱导的APC或CTL。通过克隆和培养具有破坏靶细胞高活性的细胞，可以更有效的实施细胞免疫疗法。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可用于针对提供细胞的受试者进行细胞免疫疗法，还可以用于针对来自其他个体的相似类型肿瘤进行细胞免疫疗法。

此外，本发明提供了用于治疗或预防细胞增殖性疾病诸如PRC的药物组合物，其包含药学有效量的ELOVL7多肽。该药物组合物可用于引发抗肿瘤免疫力。ELOVL7的正常表达限于前列腺。因此，对该基因的抑制不会对其它器官造成不良影响。如此，ELOVL7多肽优选用于治疗细胞增殖性疾病，尤其是PRC。而且，由于在癌性细胞中特异性表达的蛋白质的肽片段揭示出诱导针对癌症的免疫应答，因此也可以在用于治疗或预防细胞增殖性疾病诸如PRC的药物组合物中使用ELOVL7的肽片段。在本发明中，以足以诱导抗肿瘤免疫力的剂量施用多肽或其片段，其范围为0.1mg-10mg，优选0.3mg-5mg，更优选0.8mg-1.5mg。反复进行施用。例如，为了诱导抗肿瘤免疫力，可以每2周4次施用1mg肽或其片段。

此外，可以用编码ELOVL7或其片段的多核苷酸来引发抗肿瘤免疫力。可以将此类多核苷酸掺入表达载体以在待治疗的受试者中表达ELOVL7或其片段。如此，本发明涵盖用于诱导抗肿瘤免疫力的方法，其中给患有或有风险发生细胞增殖性疾病诸如PRC的受试者施用编码ELOVL7或其片段的多核苷酸。

呈现以下实施例以例示本发明并帮助本领域普通技术人员制备和使用本发明。实施例并非意欲以任何方式限制本发明的范围。

除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员普遍理解的含义相同。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可用于实施或检验本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文中所引用的任何专利、专利申请和出版物均收入作为参考。

用于实施本发明的最佳方式

本发明通过以下实施例详细例示，但不限于这些实施例。

细胞系和组织

人PRC细胞系LNCaP、DU-145、22Rv1和PC-3得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD)。将所有细胞在补充10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma-Aldrich)的以下培养基中培养成单层：RPMI 1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)用于LNCaP和22Rv1；DMEM(Sigma-Aldrich)用于DU-145；而F-12(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于PC-3。在培养箱中在含5％CO₂的潮湿空气中于37℃维持细胞。冷冻的或石蜡包埋的PRC组织得自知情同意的、接受根治性前列腺切除术的PRC患者，如前所述(Ashida S et al.，Cancer Res 64：5963-72(2004))。

半定量RT-PCR

使用TRIzol试剂(Invitrogen)依照制造商的说明书自细胞系、显微解剖的PRC细胞和大块PRC组织提取总RNA。用DNA酶I(Roche Diagnostic，Mannheim，Germany)处理所提取的总RNA，并用寡聚d(T)12-18引物及Superscript逆转录酶II(Invitrogen)逆转录成单链cDNA。我们配制了适宜稀释度的每份单链cDNA，接着使用β2-MG作为定量对照，对cDNA含量进行标准化，使用单链cDNA作为PCR模板进行PCR反应。引物序列如下：β2-MG(正向：5’-CACCCCCACTGAAAAAGAGA-3’(SEQ ID NO.1)，反向：5’-TACCTGTGGAGCAAGGTGC-3’(SEQ ID NO.2))和ELOVL7(正向：5’-TCTATGAATCCTTGAGGGCCTA-3’(SEQ  ID  NO.3)，反向：5’-TGACAACATCCACAGAATGTTCC-3’(SEQ ID NO.4))。PCR条件如下：初始变性，95℃5min；β2-MG的20个循环和ELOVL7的30个循环，每个循环为：变性95℃30sec、退火55℃30sec、及延长72℃30sec，在GeneAmp PCR系统9700(PE Applied Biosystems，Foster，CA)上进行。

Northern印迹分析

将人多种组织印迹(BD Bioscience，Palo Alto，CA)与³²P标记的ELOVL7cDNA杂交20小时，其中ELOVL7 cDNA是使用Mega标记试剂盒(Amersham，Piscataway，NJ)标记的。ELOVL7的探针cDNA使用以下引物制备成785bp的PCR产物：ELOVL7(正向：5’-AGAGCACAGCTAAATGAAACTGC-3’(SEQID NO.5)，反向：5’-TGACAACATCCACAGAATGTTCC-3’(SEQ ID NO.6))。预杂交、杂交、和洗涤依照制造商的说明书进行。将印迹于-80℃放射自显影7天。

ELOVL7抗体的生成和免疫组织化学分析

由MBL(Nagoya，Japan)生成ELOVL7的N末端肽(SDLTSRTVHLYDNWIKDA)(SEQ ID NO.16)和C末端肽(CHFWYRAYTKGQRLPKTVK)(SEQ ID NO.17)并给兔免疫。自经过这些肽免疫的兔纯化血清。将石蜡包埋组织切片脱石蜡，在高pH抗原修补液(DAKO，Carpinteria，CA)中用微波以600W处理4次，每次1分钟，然后用过氧化物酶封闭剂(DAKO)处理，接着用蛋白质封闭剂(DAKO)处理。将组织切片与针对ELOVL7的多克隆抗体一起温育，接着与偶联有辣根过氧化物酶的二抗(DAKO)一起温育。通过二氨基联苯胺(diaminobensidine)(DAKO)染色来显现抗原，并用苏木精对切片进行复染。

siRNA表达载体的构建和细胞活力测定法

为了调查ELOVL7在PRC细胞中的生物学功能，我们使用psiU6BX3.0载体来表达针对靶基因的短发夹RNA，如前所述(Anazawa Y et al.，Cancer Res65：4578-86(2005))。设计用于表达siRNA的质粒通过将双链寡核苷酸克隆入psiU6BX载体来制备。ELOVL7的靶序列的寡核苷酸序列如下：si#5的有义链序列：5’-CAAGCAACAACAACAACAA-3’(SEQ ID NO.7)和作为阴性对照的siEGFP的有义链序列：5’-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3’(SEQ ID NO.11)。在10cm培养皿上培养高水平表达ELOVL7的PRC细胞系LNCaP和22Rv1细胞(2×106个)，使用FuGene6试剂(Roche)依照供应商的方案用psiU6-ELOVL7(si#5)或psiU6-siEGFP转染，然后在含800μg/ml遗传霉素的适宜培养基中培养2周。将细胞用100％甲醇固定，用0.1％结晶紫-H₂O染色，供集落形成测定法之用。在MTT测定法中，在转染后第10天使用细胞计数试剂盒-8(DOJINDO，Kumamoto，Japan)测量细胞活力。使用微量板读数仪550(Bio-Rad)测量490nm的吸光度，以630nm为参比。初步的，这些siRNA表达载体对内源ELOVL7表达的敲减效应在转染后第7天通过使用前述引物的RT-PCR得到了证实。

针对ELOVL7的小干扰RNA的寡核苷酸序列显示于下。

表1

ELOVL7敲减的细胞中的脂肪酸分析

LNCaP细胞用siRNA表达载体(si5或对照siEGFP)转染，与遗传霉素一起温育7天。初步的，我们证实了对ELOVL7表达的敲减效应，而且第7天的细胞活力或活细胞数不受影响。在第7天，用Folch液(体积比为1∶2的甲醇∶氯仿)自细胞提取脂质，并在氮气下蒸发。用0.5M HCl水合后，用氯仿提取游离脂肪酸，并用0.4K甲醇盐/甲醇和14％三氟化硼和甲醇而甲酯化。对细胞中的每种脂肪酸水平进行气相层析质谱(GC-17A，Shimazu，Kyoto，Japan)。

重组蛋白在昆虫细胞中的表达

使用BacPAK杆状病毒表达系统(Clontech)依照制造商的说明书生成表达ELOVL7的重组杆状病毒。使用设计成在氨基末端包含6xHis标签序列的以下引物PCR扩增全长ELOVL7cDNA(Genbank编号NM_024930)，并克隆入pBacPAK9载体。用于ELOVL7的正向引物为5’-CCCCTGGGATCCACCATGGGTCATCATCATCACCATCACGAATTCGCCTTCAGTGATCTTACATCG-3’(SEQ ID NO：18)，而用于ELOVL7的反向引物为5’-CCGCTCGAGTCAATTATCTTTGTTTTTGCAAGTTCC-3’(SEQ IDNO：19)。在补充有10％胎牛血清和50μg/ml庆大霉素(Sigma-Aldrich)的Grace氏昆虫培养基(GIBCO)中于27℃培养草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf21)细胞，并用规定的重组杯状病毒感染。感染后72小时，收集细胞，并用PBS洗涤一次。使用经过修改的Moon等人记载的规程(Moon YA et al.，J Biol Chem276：45358-45366(2001))，通过差速离心分离微粒体。简言之，将细胞悬浮于0.25M蔗糖、10mM Tris-Cl(pH7.4)、1mM EDTA、和0.1％蛋白酶抑制剂混合物III(Calbiochem，San Diego，CA)，并用Microson超声细胞破碎仪破碎。将细胞匀浆液于4℃以5,000rpm离心10分钟，收集上清液并于4℃以15,000rpm离心20分钟。然后将所得上清液在Beckman TLA 100.2转子中于4℃以55,000rpm离心30分钟，并将沉淀物重悬于含50mM Tris-Cl(pH7.4)、1mM EDTA、20％甘油和上文所述蛋白酶抑制剂混合物III的缓冲液。将微粒体的等分试样在液氮中快速冷冻后，保存于-80℃，并用于western印迹分析和体外脂肪酸延长测定法。

Western印迹分析

将微粒体蛋白质在SDS样品缓冲液中于4℃变性过夜以预防蛋白质聚集。将30μg每种SDS样品加载到15％SDS-PAGE凝胶上，并印到硝酸纤维素膜上。通过化学发光检测系统(ECL，Amersham)来显现蛋白质条带。

体外脂肪酸延长测定法

在自上文所述受到杆状病毒感染的Sf21细胞制备的微粒体中测量脂肪酸延长活性。反应混合物在0.45ml总反应体积中含10-200μg微粒体。反应组分为0.1M Tris-Cl(pH 7.4)、3mM花生四烯酰基-CoA、7.5mM丙二酸单酰基-CoA、20mM NADPH、和0.6mM不含脂肪酸的BSA(Sigma-Aldrich)。将玻璃试管中反应混合物的气相用氮气取代，在冰上维持5分钟，然后使用注射器将微粒体注射到玻璃试管中。将反应体系于37℃温育5分钟，并用Folch液(体积比为1∶2的甲醇∶氯仿)终止反应。使用上文所述气相层析质谱分析反应样品中的每一种脂肪酸水平。

结果

新基因ELOVL7的鉴定及其表达样式

我们先前报导了，通过呈现27,000种基因的cDNA微阵列分析联合LMM系统，对PRC细胞和纯化自临床PRC组织的PIN的全基因组范围表达序型(Ashida S et al.，Cancer Res 64：5963-72(2004))。在显示出在PRC细胞和/或PIN细胞中与正常前列腺上皮细胞相比反式激活的许多基因中，我们在这份报告中聚焦于ELOVL7。半定量RT-PCR证实了与正常前列腺上皮相比，12份临床PRC样品中有8份的PRC细胞中ELOVL7表达升高，如图1A所示。用于调查ELOVL7组织分布的Northern印迹分析在前列腺、肾和其它数种器官中鉴定出大约3.8kb的ELOVL7转录物(图1B)，但RT-PCR分析(图1C)证明了PRC细胞中的ELOVL7表达明显高于正常肾或前列腺，暗示它在PRC细胞中的独特表达。为了进一步调查PRC细胞中的ELOVL7蛋白表达，我们用ELOVL7N末端或C末端肽免疫，生成了抗ELOVL7的多克隆抗体，并进行了免疫组织化学分析。如图2A所示，在所检查的所有12份PRC案例中，主要在PRC细胞的细胞质中检测到ELOVL7的强免疫化学信号，在非癌性前列腺上皮细胞和PIN中观察到弱信号(图2B、C)，与多种组织northern印迹分析的结果一致。我们所检查的所有12份PRC显示出针对抗ELOVL7抗体的强免疫反应性。

ELOVL7表达的敲减削弱了前列腺癌细胞的生长

为了检验ELOVL7表达在PRC细胞生长中的作用，我们构建了数种设计用于表达对ELOVL7特异性的siRNA的表达载体，并将它们转染入内源表达ELOVL7的PRC细胞系LNCaP和22Rv1。在我们在LNCaP细胞中所测试的5种质粒中，ELOVL7-si#5显示出对内源ELOVL7转录物的显著敲减效应(图3A)，而且此转染导致集落数的减少(图3B)，以及通过LNCaP细胞MTT测定法测量的活细胞数的减少(图3C)，而阴性对照(siEGFP)显示出对ELOVL7表达的敲减效应很小，而且不影响LNCaP的细胞活力。在另一种PRC细胞系22Rv1细胞上得到了同样的结果，如图3D、E和F所示。

ELOVL7敲减引起的脂肪酸级分变化

接着，我们检查了ELOVL7表达敲减对脂肪酸合成的影响。我们给LNCaP细胞转染了ELOVL7-si5来证实其对ELOVL7的显著敲减效应，或者转染了siEGFP作为阴性对照。在转染后第7天，在与siEGFP转染细胞相比siELOVL7转染细胞的ELOVL7表达明显敲减但细胞活力没有受到显著影响时，我们收获了细胞并通过气相层析分析了它们的脂肪酸级分。ELOVL7-si5转染显示出与siEGFP转染相比长链和极长链饱和脂肪酸水平(C20:0 p＝0.02，C22:0p＝0.008，C24:0 p＝0.003)的显著降低(20-30％)(图4)，而ELOVL7-si5转染显示出对单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸水平没有影响。这些发现表明，ELOVL7可优先参与单不饱和长链脂肪酸的延长活性。

体外脂肪酸延长测定法

为了更加详细的检查ELOVL7作为脂肪酸延长酶的实际活性，使用BacPAK杆状病毒表达系统生成了重组ELOVL7蛋白。此重组杆状病毒生成大约30kDa的蛋白质，而使用抗His单克隆抗体的western印迹分析揭示了所表达的ELOVL7蛋白存在于细胞的微粒体中(图5A)。我们使用经过ELOVL7表达病毒转染的昆虫细胞或未经转染的细胞的微粒体级分作为体外脂肪酸延长测定法的酶源。测量了5分钟反应前后每一种脂肪酸水平的增量，将其作为延长活性。最初，根据上文所述siRNA实验的结果，凭经验选择硬脂酰基-CoA(C18:0)作为该延长测定法的底物。然而，发现微粒体中半数的脂肪酸包含硬脂酸(C18:0)，这掩盖了脂肪酸级分的差异。因此，使用花生四烯酰基-CoA(C20:0)作为底物。图5B显示了5分钟反应前后每一种脂肪酸水平的增量，来自受感染细胞的微粒体产生一些C22:0和C24:0，而对照微粒体产生C20:0但根本不产生C22:0和C24:0。对照微粒体的C20:0生成很有可能是由于Sf21昆虫细胞的内源脂肪酸延长活性所致，而在包含人ELOVL7蛋白的微粒体中，C20:0变成C22:0、C24:0或更长脂肪酸的延长反应可活跃进行，导致C20:0产量较少(图5B)。此外，此脂肪酸链延长活性依赖于酶源即受感染细胞微粒体的量(图5C)。这些数据说明，微粒体中的ELOVL7显示出脂肪酸延长酶的实际活性，生成C22:0和C24:0。

讨论

在本发明中，我们聚焦于作为在PRC细胞中反式激活的基因之一的新基因，ELOVL7。Northern印迹分析显示出，ELOVL7在前列腺和肾中表达，但RT-PCR分析揭示了PRC细胞的ELOVL7表达明显高于正常肾和其它重要器官。考虑到分子靶向ELOVL7的新治疗方法对重要器官具有最小的副作用，关于ELOVL7表达的发现暗示了它在PRC细胞中的独特表达及其作为有利的分子靶的可能性。我们使用ELOVL7多克隆抗体进行的免疫组织化学研究也清楚指出了ELOVL7表达在PRC细胞中的上调。

迄今为止报导了哺乳动物中的六个ELOVL家族成员(ELOVL1-6)，其中有些显示出组织特异性表达或使用特定脂肪酸底物。根据我们的PRC和其它器官全基因组范围基因表达数据(Ashida S et al.，Cancer Res 64：5963-72(2004))，在7个ELOVL家族成员(ELOVL1-7)中，ELOVL7在前列腺和PRC细胞中以最高水平表达。关于ELOVL表达样式的这些发现可使人想到，ELOVL7很有可能在前列腺和PRC中特异性发挥功能、且牵涉前列腺中长链脂肪酸多种代谢途径中的有些特定途径。如此，应当进一步调查以鉴定前列腺或PRC中牵涉ELOVL7的特定底物或途径。

在许多流行病学研究中，显然摄取高脂肪饮食与前列腺癌发生强烈关联(Kolonel LN et al.，J Natl Cancer Inst 91：414-28(1999)；Schulman CC et al.，Urology 58：318-34(2001))。在我们先前的微阵列研究中，与脂质或胆固醇代谢有关的数种基因在前列腺癌及其前体PIN中上调(Ashida S et al.，CancerRes 64：5963-72(2004))，而且有许多证据表明脂质或胆固醇代谢及脂质代谢相关基因有可能通过其代谢途径或抗凋亡效应而在PRC发生和发展中发挥一些重要作用(De Schrijver E et al.，Cancer Res 63：3799-804(2003)；Baron Aet al.，J Cell Biochem 91：47-53(2004))。其中，脂肪酸合酶(FAS)，即负责合成长链非必需脂肪酸的前体棕榈酸(盐/酯)的酶，据报导在广泛多种癌中上调，且已经建议用作相关药物靶(De Schrijver E et al.，Cancer Res 63：3799-804(2003)；Baron A et al.，J Cell Biochem 91：47-53(2004))。此外，胆固醇升高本身可促进PRC细胞增殖，而且有些胆固醇合成抑制剂现在预计会是用于预防或治疗癌症的理想药物(Zhuang L et al.，J Clin Invest 115：959-68(2005))。与胆固醇类似，高脂肪饮食中丰富的长链脂肪酸可通过膜的稳定、细胞信号传导途径和其它未知功能而牵涉PRC增殖。我们使用针对ELOVL7的siRNA进行的功能分析证明了ELOVL7表达对于PRC增殖或前列腺肿瘤发生是至关重要的，而且认为直接靶向PRC中的ELOVL7酶功能或ELOVL7所牵涉的长链脂肪酸途径是针对PRC的治疗或预防新策略的理想方法。

我们的体内和体外脂肪酸分析说明，在多种脂质代谢中，ELOVL7牵涉长链或极长链饱和脂肪酸(SLFA)的延长或合成，而非已知对癌发生具有促进或抑制效应的多不饱和脂肪酸(De Schrijver E et al.，Cancer Res 63：3799-804(2003)；Baron A et al.，J Cell Biochem 91：47-53(2004)；Diggle CP，Prog LipidRes 41：240-53(2002))。SLFA在动物肉中像胆固醇一样含量丰富，而且根据流行病学或营养研究，还认为它们与发生前列腺癌的风险强烈相关(KolonelLN et al.，J Natl Cancer Inst 91：414-28(1999)；Schulman CC et al.，Urology 58：318-34(2001))。事实上，SLFA在侵入性前列腺癌组织中更加丰富(FreemanVL et al.，J Urol 164：2168-72(2000))。然而，仍然不清楚SLFA如何牵涉癌发生或癌发展。SLFA像胆固醇一样构成质膜的脂筏，多种信号转导蛋白可在那里分布和活跃地发挥功能(Zhuang L et al.，J Clin Invest 115：959-68(2005)；Pike LJ，J Lipid Res 44：655-67(2003))，而且PRC细胞中由ELOVL7产生的SLFA可提高用于生长或抗凋亡信号传导的脂筏平台的质和量。我们使用针对ELOVL7的siRNA进行的功能分析证明了ELOVL7表达对于前列腺癌增殖或前列腺肿瘤发生是至关重要的，而且认为直接靶向前列腺癌中的ELOVL7酶功能或ELOVL7所牵涉的SLFA途径是针对前列腺癌的治疗或预防新策略的理想方法。

总之，由ELOVL7引起的长链饱和脂肪酸代谢在PRC生长或发生中可以是至关重要的，只不过ELOVL7所牵涉的详细途径或底物仍然未知，而且对ELOVL7的抑制为我们提供了在分子水平治疗或预防PRC的新的理想方法。

工业应用

人类基因ELOVL7的表达在PRC中与非癌性前列腺上皮相比显著升高。因此，该基因可用作PRC的诊断标志物，它们所编码的蛋白质可用于PRC的诊断测定法。

本发明人还显示了，新蛋白ELOVL7的表达促进细胞生长，而与ELOVL7基因对应的小干扰RNA抑制细胞生长。这些发现显示了，ELOVL7蛋白刺激致癌活性。如此，这种新的癌蛋白可用作开发抗癌药的靶物。例如，阻断ELOVL7表达或阻止其活性的药剂具有抗癌药，特别是用于治疗PRC的抗癌药的治疗效用。此类药剂的例子包括针对ELOVL7基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA和核酶，及识别ELOVL7的抗体。

尽管本发明已经参考具体实施方案进行了详细描述，对本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行多种改变和修饰。

序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)

<120>前列腺癌相关基因和多肽

<130>ONC-A0504P

<150>US 60/703,107

<151>2005-07-27

<160>19

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>1

cacccccact gaaaaagaga                                           20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>2

tacctgtgga gcaaggtgc                                            19

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>3

tctatgaatc cttgagggcc ta                                        22

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>4

tgacaacatc cacagaatgt tcc                                       23

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>5

agagcacagc taaatgaaac tgc                                       23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>6

tgacaacatc cacagaatgt tcc                                       23

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>7

caagcaacaa caacaacaa                                            19

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>8

cacccaagca acaacaacaa caattcaaga gattgttgtt gttgttgctt g        51

<210>9

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>9

aaaacaagca acaacaacaa caatctcttg aattgttgtt gttgttgctt g        51

<210>10

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA发夹设计

<400>10

caagcaacaa caacaacaat tcaagagatt gttgttgttg ttgcttg             47

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>11

gaagcagcac gacttcttc                                            19

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>12

caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c        51

<210>13

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>13

aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c        51

<210>14

<211>3815

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(142)..(987)

<400>14

cagtcgccgc cctctctccc gcgcgcgccc ggcgcttcgg ctccgctccc tgtgcggcat     60

ttaaacttcc ctcttagaac tgcttttgtg gcatcccata agttttgaac ccattaaaag    120

agccagtaaa tcctgtggaa a atg gcc ttc agt gat ctt aca tcg agg act      171

                        Met Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Arg Thr

                        1               5                   10

gtg cat ctt tat gat aat tgg atc aaa gat gct gat cca aga gtt gaa      219

Val His Leu Tyr Asp Asn Trp Ile Lys Asp Ala Asp Pro Arg Val Glu

                15                  20                  25

gat tgg ctc ctc atg tcc tcg cct ctg cca caa acc atc ctc cta gga      267

Asp Trp Leu Leu Met Ser Ser Pro Leu Pro Gln Thr Ile Leu Leu Gly

             30                  35                  40

ttc tat gtc tat ttt gtc act tcc ttg gga cca aag ctc atg gaa aat      315

Phe Tyr Val Tyr Phe Val Thr Ser Leu Gly Pro Lys Leu Met Glu Asn

         45                  50                  55

cgc aag ccc ttt gaa ctc aag aaa gca atg ata acg tac aat ttt ttc      363

Arg Lys Pro Phe Glu Leu Lys Lys Ala Met Ile Thr Tyr Asn Phe Phe

     60                  65                  70

ata gta ctc ttt tct gtg tat atg tgt tat gag ttt gtg atg tct ggc      411

Ile Val Leu Phe Ser Val Tyr Met Cys Tyr Glu Phe Val Met Ser Gly

 75                  80                  85                  90

tgg ggt ata ggt tat tca ttt cga tgt gac att gtt gac tat tca cgg      459

Trp Gly Ile Gly Tyr Ser Phe Arg Cys Asp Ile Val Asp Tyr Ser Arg

                 95                 100                 105

tca ccc aca gct ttg agg atg gca cgt acc tgc tgg ctt tat tac ttc      507

Ser Pro Thr Ala Leu Arg Met Ala Arg Thr Cys Trp Leu Tyr Tyr Phe

            110                 115                 120

tcc aaa ttt att gag cta tta gat acg atc ttt ttt gtt ctg cgc aag      555

Ser Lys Phe Ile Glu Leu Leu Asp Thr Ile Phe Phe Val Leu Arg Lys

        125                 130                 135

aaa aat agc caa gtg act ttc ctt cat gta ttc cat cat acc atc atg      603

Lys Asn Ser Gln Val Thr Phe Leu His Val Phe His His Thr Ile Met

    140                 145                 150

ccg tgg acc tgg tgg ttt gga gtc aaa ttt gct gca ggt ggt ttg gga      651

Pro Trp Thr Trp Trp Phe Gly Val Lys Phe Ala Ala Gly Gly Leu Gly

155                 160                 165                 170

aca ttc cat gcc ctt cta aat aca gct gta cat gta gtc atg tat tcc      699

Thr Phe His Ala Leu Leu Asn Thr Ala Val His Val Val Met Tyr Ser

                175                 180                 185

tac tat gga ctt tct gca ttg ggg cca gcc tac cag aag tat ttg tgg      747

Tyr Tyr Gly Leu Ser Ala Leu Gly Pro Ala Tyr Gln Lys Tyr Leu Trp

            190                 195                 200

tgg aaa aaa tat ttg aca tca tta cag ctt gtc cag ttt gtt att gtc       795

Trp Lys Lys Tyr Leu Thr Ser Leu Gln Leu Val Gln Phe Val Ile Val

        205                 210                 215

gcc atc cac ata agc cag ttc ttt ttc atg gag gat tgc aag tat cag       843

Ala Ile His Ile Ser Gln Phe Phe Phe Met Glu Asp Cys Lys Tyr Gln

    220                 225                 230

ttt cca gtc ttt gcg tgc atc att atg agt tac agt ttc atg ttt ccg       891

Phe Pro Val Phe Ala Cys Ile Ile Met Ser Tyr Ser Phe Met Phe Pro

235                 240                 245                 250

ctg ctc ttt ctc cat ttt tgg tac cgt gct tac acc aaa ggt cag agg       939

Leu Leu Phe Leu His Phe Trp Tyr Arg Ala Tyr Thr Lys Gly Gln Arg

                255                 260                 265

ttg ccc aaa act gtg aaa aat gga act tgc aaa aac aaa gat aat tga       987

Leu Pro Lys Thr Val Lys Asn Gly Thr Cys Lys Asn Lys Asp Asn

            270                 275                 280

agcccaacat aagtctatga tcgaaactga tacattgtct tccttgacaa tcaagagata    1047

tttacctatg cagtgcattt tgtatatttt tcaaaactaa gagcttgtat ttttatggta    1107

agttattggg atgtctgata tttgagagcc cgaagcttcc agataacagt cttctgataa    1167

ttagagccta cagcagccag aatttgtttt tgtttttgtt tttgtttttt tagctgcttt    1227

taaacctaat ccaaaggttt tgtttaaaac attttgttgc agtgaaaaaa agatatgaag    1287

caatacagta ctcttcaaag aagtccaata aagatgaaaa atatcattag gtattttgag    1347

cacagacgga gatccatgtg ataaaataga ttccttctgc tgggtctgga aagtctggaa    1407

accacctgta ggccctggct ttgtcattta ttgactgtat tcagaagata ctatatttgc    1467

tctagagtta actcccattt tagcaagcta gcacaggtga aaattgagtg agtttttgat    1527

aacttgtcat ttaaaatcat taatgataat tttcaatgga tcttttcagt agccatcacc    1587

agttttgctg ataagacttc ctcacaaccc atttgttgta caaactgttt caaagtagca    1647

atcctttggg ttagtacact tgataccaag tttcattcag ttgattattt tcaaaacaag    1707

gtgatttgtt ttaatgggtt aatgaatact ttgctattac tgttttacaa ttaactttgt    1767

atatctctgg aaagaggtga atttgtcaat gaaaaaagta ttgtgtagtt cagtgggaaa    1827

aacctgttgt ctgttatagt atcacatcac tttcttacat tgtcatggtt taaattatta    1887

tcttggtgaa atatataggt tagatactta aatgttcata ttattagcac actacaggta    1947

ctacccttaa atcataaata atattaccca ttgtacacag tttccagata tgagttagag    2007

tggctgtgaa gcaactagag gcaaattgtg gcacagagaa tatccagggg aaaattgatt    2067

atgtaagcaa gggctgttct actttgagag agagacagac agactacata atagtaatat    2127

attatataat taatgttata gatacactga acaataaaac attttctgga attatgaatt    2187

aattaacaac ctggatttct gtttccagac ctataaacca tgtaatgaag gactgaaatt    2247

cgtttggcat acactttgtt tctttaaaat tgctagtttc tttctgttat ttttacattt    2307

tcttgtcaga gaatcaaaac tattagtcag tagagttttg tccatgaaat aatatttgga    2367

catttgtgaa tttttcccta ttttttttct tcttttattt atactcaatt ttgaagcact    2427

gtttatgttt gtaggacttt aaacaattag tacttaaagc cccagttaat tttgaacaca    2487

cagagatact tattgtactc tgtgtacagt aagtattttt atgtttacac ttaccagatt    2547

cataaggtta tttgccttta agtgatcttt tgtgatttta cttgattaca gcatgagaag    2607

gtaaaggttg ataaatggga gtaattacat atatatatat aatttattat ttttttttct    2667

gaagcagagt tttactcttg ttgcccaggc tagagtgcaa tggcacaatc tcggttcact    2727

gcaacctctg cctcccaggt tcaagtgatt ctcctgtctc agcctcccaa gtagctggga    2787

ttacaggtgc ccgccaccat gctcagctaa tttttgtatt tttagtagag acagggttgg    2847

ccaggctggt ctcgagctcc tgacctcagg tgatcctccc acctcggcct cccaaagttc    2907

tgggattaca ggggtgagcc actgtgcccg gccataattt tatattttta gaaaataaag    2967

aatgaaggac aaaagagcac agctaaatga aactgctgct ctaatttatt ccactggaaa    3027

ggtctcagga ctccttaact gttttccagg tttggctctt catatctaac ctgtgctaaa    3087

atgagaaggt atgctaggtg ctgttagaaa tcacaccatt tccaaagaac ccaagtagta    3147

tagagaccaa aatgaggcaa aaataaaaga gatgaaacag gagagtttat ttcttgcata    3207

ctttccgacc ttcatcatac aacctctcct aacctccctg tagtctttaa aatgtttaac    3267

ttgcctataa gctaacatgt aataaaacac atactcaatt atatgaatag aagtggagag    3327

ccagaatgct acaaaagaaa tcacagctgc tagaagtatc ctccatagaa acatcaacat    3387

gattgtggat caaaatgatt ttcactggat atggaatttg tatgggccat atttattaaa    3447

agagttctgt gtggtcacat agagttcctt tgggatttca tcccactttt caggacttaa    3507

tttgtttggg tttgcttacc taacaagcaa caacaacaac aaaataaata gttccaaaat    3567

ctagtttatt acataaatct ctatgaatcc ttgagggcct atatctatat tataaataaa    3627

tacaaatata gatttttaaa tatctatggg actttgccat ttacagcctt aagtataaaa    3687

ttacgagatt atattctttc cattaccctt tatttctgct aactttttaa agactggaac    3747

attctgtgga tgttgtcaaa gtttgagttt gtttttccct gtgtattata ataaatttgt    3807

ggtattgc                                                             3815

<210>15

<211>281

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

Met Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Arg Thr Val His Leu Tyr Asp Asn

1               5                   10                  15

Trp Ile Lys Asp Ala Asp Pro Arg Val Glu Asp Trp Leu Leu Met Ser

             20                  25                  30

Ser Pro Leu Pro Gln Thr Ile Leu Leu Gly Phe Tyr Val Tyr Phe Val

         35                  40                  45

Thr Ser Leu Gly Pro Lys Leu Met Glu Asn Arg Lys Pro Phe Glu Leu

     50                  55                  60

Lys Lys Ala Met Ile Thr Tyr Asn Phe Phe Ile Val Leu Phe Ser Val

 65                  70                  75                  80

Tyr Met Cys Tyr Glu Phe Val Met Ser Gly Trp Gly Ile Gly Tyr Ser

                 85                  90                  95

Phe Arg Cys Asp Ile Val Asp Tyr Ser Arg Ser Pro Thr Ala Leu Arg

            100                 105                 110

Met Ala Arg Thr Cys Trp Leu Tyr Tyr Phe Ser Lys Phe Ile Glu Leu

        115                 120                 125

Leu Asp Thr Ile Phe Phe Val Leu Arg Lys Lys Asn Ser Gln Val Thr

    130                 135                 140

Phe Leu His Val Phe His His Thr Ile Met Pro Trp Thr Trp Trp Phe

145                 150                 155                 160

Gly Val Lys Phe Ala Ala Gly Gly Leu Gly Thr Phe His Ala Leu Leu

                165                 170                 175

Asn Thr Ala Val His Val Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser Ala

            180                 185                 190

Leu Gly Pro Ala Tyr Gln Lys Tyr Leu Trp Trp Lys Lys Tyr Leu Thr

        195                 200                 205

Ser Leu Gln Leu Val Gln Phe Val Ile Val Ala Ile His Ile Ser Gln

    210                 215                 220

Phe Phe Phe Met Glu Asp Cys Lys Tyr Gln Phe Pro Val Phe Ala Cys

225                 230                 235                 240

Ile Ile Met Ser Tyr Ser Phe Met Phe Pro Leu Leu Phe Leu His Phe

                245                 250                 255

Trp Tyr Arg Ala Tyr Thr Lys Gly Gln Arg Leu Pro Lys Thr Val Lys

            260                 265                 270

Asn Gly Thr Cys Lys Asn Lys Asp Asn

        275                 280

<210>16

<211>18

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

Ser Asp Leu Thr Ser Arg Thr Val His Leu Tyr Asp Asn Trp Ile Lys

1               5                   10                  15

Asp Ala

<210>17

<211>19

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>17

Cys His Phe Trp Tyr Arg Ala Tyr Thr Lys Gly Gln Arg Leu Pro Lys

1               5                   10                  15

Thr Val Lys

<210>18

<211>66

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物

<400>18

cccctgggat ccaccatggg tcatcatcat caccatcacg aattcgcctt cagtgatctt    60

acatcg                                                               66

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物

<400>19

ccgctcgagt caattatctt tgtttttgca agttcc                             36

Claims (38)

1. 用于诊断前列腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)检测编码氨基酸序列SEQ ID NO：15的基因在生物学样品中的表达水平；并

(b)将所述表达水平的升高与所述疾病联系起来。

2. 权利要求1的方法，其中所述表达水平是通过选自下组的任一种方法来检测的：

(a)检测编码氨基酸序列SEQ ID NO：15的mRNA；

(b)检测包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的蛋白质；和

(c)检测包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的蛋白质的生物学活性。

3. 筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物接触选自下组的多肽：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％同源性的序列的多肽；和

(3)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性；

(b)检测所述多肽与测试化合物之间的结合活性；并

(c)选择能与所述多肽结合的测试化合物。

4. 筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物接触选自下组的多肽：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％同源性的序列的多肽；和

(3)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性；

(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；并

(c)选择与不存在测试化合物时检测到的所述多肽的生物学活性相比能抑制所述多肽的生物学活性的测试化合物。

5. 权利要求4的方法，其中所述生物学活性是细胞增殖活性。

6. 权利要求4的方法，其中所述生物学活性是脂肪酸延长活性。

7. 筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物接触细胞，所述细胞表达包含核苷酸序列SEQ ID NO：14的多核苷酸；并

(b)选择与不存在测试化合物时检测到的结果相比能降低包含核苷酸序列SEQ ID NO：14的多核苷酸的表达水平或由其编码的蛋白质的生物学活性的测试化合物。

8. 权利要求7的方法，其中所述生物学活性是脂肪酸延长活性。

9. 权利要求7的方法，其中所述细胞是前列腺癌细胞。

10. 筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物接触细胞，所述细胞导入了载体，所述载体包含标志基因的转录调控区及在该转录调控区控制下表达的报导基因，所述标志基因包含由SEQ ID NO：14组成的核苷酸序列；

(b)测量所述报导基因的表达水平或活性；并

(c)选择与不存在测试化合物时检测到的结果相比能降低所述报导基因的表达水平或由其编码的蛋白质的生物学活性的测试化合物。

11. 权利要求10的方法，其中所述生物学活性是脂肪酸延长活性。

12. 用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的针对多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA作为活性成分、并包含可药用载体，其中所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15并在其中替代、删除和/或添加了一个或多个氨基酸的多肽，所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的蛋白质相当的生物学活性；和

(c)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性。

13. 权利要求12的组合物，其中所述小干扰RNA包含核苷酸序列SEQ ID NO：7作为靶序列。

14. 权利要求13的组合物，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是对应于核苷酸序列SEQ ID NO：7的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。

15. 权利要求12的组合物，其中所述组合物包含转染增强剂。

16. 用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的针对选自下组的多肽的抗体作为活性成分、并包含可药用载体：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15并在其中替代、删除和/或添加了一个或多个氨基酸的多肽，所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的蛋白质相当的生物学活性；和

(c)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性。

17. 用于治疗或预防前列腺癌的组合物，包含药学有效量的通过权利要求3-11任一项方法选出的化合物作为活性成分，并包含可药用载体。

18. 用于治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括施用药学有效量的反义多核苷酸或小干扰RNA的步骤，其中所述反义多核苷酸或小干扰RNA针对编码选自下组的多肽的多核苷酸：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15并在其中替代、删除和/或添加了一个或多个氨基酸的多肽，所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的蛋白质相当的生物学活性；和

(c)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性。

19. 权利要求18的方法，其中所述siRNA包含核苷酸序列SEQ ID NO：7作为靶序列。

20. 权利要求19的方法，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是对应于核苷酸序列SEQ ID NO：7的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。

21. 权利要求18的方法，其中所述组合物包含转染增强剂。

22. 用于治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括施用药学有效量的抗体的步骤，其中所述抗体针对选自下组的多肽：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15并在其中替代、删除和/或添加了一个或多个氨基酸的多肽，所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的蛋白质相当的生物学活性；和

(c)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性。

23. 用于治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括施用药学有效量的通过权利要求3-11任一项方法选出的化合物的步骤。

24. 用于治疗或预防前列腺癌的方法，所述方法包括施用药学有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码该多肽的多核苷酸的步骤：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽或其片段；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15并在其中替代、删除和/或添加了一个或多个氨基酸的多肽或其片段，其具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的蛋白质相当的生物学活性；和

(c)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽或其片段，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性。

25. 用于诱导抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括使选自(a)-(c)的多肽与抗原呈递细胞接触或者将编码该多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体导入抗原呈递细胞的步骤：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽或其片段；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15并在其中替代、删除和/或添加了一个或多个氨基酸的多肽或其片段，其具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的蛋白质相当的生物学活性；和

(c)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽或其片段，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性。

26. 权利要求25的方法，其中所述方法进一步包含对受试者施用所述抗原呈递细胞的步骤。

27. 用于治疗或预防前列腺癌的药物组合物，所述组合物包含药学有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码该多肽的多核苷酸作为活性成分、并包含可药用载体：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽或其片段；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15、并在其中替代、删除和/或添加了一个或多个氨基酸的多肽或其片段，其具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的蛋白质相当的生物学活性；和

(c)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽或其片段，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性。

28. 权利要求27的药物组合物，其中所述多核苷酸被掺入在表达载体中。

29. 诊断剂，其包含能与编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽的多核苷酸发生杂交的寡核苷酸，或包含能与包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽结合的抗体。

30. 包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含对应于SEQ IDNO：7的核糖核苷酸序列，且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链能彼此发生杂交以形成所述双链分子，且其中所述双链分子在导入表达ELOVL7基因的细胞后能抑制所述基因的表达。

31. 权利要求30的双链分子，其中所述有义链包含SEQ ID No：14的大约19个至大约25个连续核苷酸。

32. 权利要求30的双链分子，其中所述有义链由对应于SEQ ID NO：7的核糖核苷酸序列组成。

33. 权利要求30的双链分子，其中单一核糖核苷酸转录物包含所述有义链和所述反义链，所述双链分子进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。

34. 编码权利要求30的双链分子的载体。

35. 权利要求34的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录物，其中所述转录物包含所述有义链和所述反义链。

36. 权利要求34的载体，其中所述转录物进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。

37. 用于检测测试化合物调控脂肪酸延长活性的活性的试剂盒，所述试剂盒包含以下成分：

(a)选自下组的多肽：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％同源性的序列的多肽；和

(3)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性；

(b)作为底物的脂肪酸；

(c)能够检测(b)的延长产物的试剂；

(d)丙二酸单酰基CoA；和

(e)NADPH。

38. 用于测量多肽的脂肪酸延长活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使选自下组的多肽在能够进行脂肪酸延长的条件下接触脂肪酸：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的多肽；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％同源性的序列的多肽；和

(3)由能在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：14组成的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：15组成的多肽相当的生物学活性；

(b)检测(a)的脂肪酸的脂肪酸延长水平；并

(c)通过将步骤(b)的脂肪酸延长水平与脂肪酸延长活性联系起来来测量脂肪酸延长活性。

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