CN101407837B - 用于血液致病菌检测的基因芯片和检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于血液致病菌检测的基因芯片和检测用试剂盒，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述的寡聚核苷酸探针包括从一类或几类血液致病菌的16S rRNA基因序列和nuc基因序列中选取的DNA片段。本发明的试剂盒包括所述的基因芯片。用所述的基因芯片进行杂交，根据杂交信号，可检测出血液中的致病菌。利用本发明的基因芯片可达到检测血液致病菌的目的，操作简便，准确性高，重复性强，在24小时内能给出检测结果，对于临床医生的用药有一定的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片和试剂盒，尤其涉及一种用于血液致病菌检测的基因芯片和试剂盒。
背景技术
健康人的血液是无菌的，当人体局部感染向全身播散并出现全身感染症状时，血液中出现细菌，按程度不同可分为菌血症、败血症和毒血症。其中以败血症的临床症状最为严重。菌血症从病源微生物在感染部位的增殖开始，随后在原位增殖或随血液传播，导致菌血症，同时释放大量微生物的结构成分脂多糖(或内毒素)、肽糖脂、脂磷壁酸、细胞外酶等，进而诱导内源性感染性介质的释放。导致炎性介质如细胞因子、花生四烯酸代谢产物、凝集素、补体、一氧化氮、内啡肽、细胞激动素的释放增加，以及诱导其他重要的生理效应，甚至导致多器官功能衰竭(MOF)死亡。败血症是指致病菌侵入血液循环，持续存在，迅速繁殖，产生大量毒素，引起严重的全身症状。一般在病人全身情况差和致病菌毒力大、数量多的情况下发生，是一种严重情况。败血症通常由一种病原菌引起，但也有由两种或更多种类的病原菌所引起，称为复数菌败血症，在全部的败血症中，其发病率超过10％。败血症的预后较症，死亡率一般为30～50％；复数菌败血症的死亡率更高，可达70％～80％。
中国常见的10类血液致病菌，包括金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌属、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌/肠杆菌(肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌；阴沟肠杆菌、产气肠杆菌)、大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌。
现有较先进的临床菌血症检验系统有两类：“自动血培养检测和分析系统”和“微生物数码分类鉴定系统(API)”。这两种被医院广泛采用的系统均对被测标本进行增菌培养之后需要生化鉴定或血清学反应，通常需要3到5天。最大弊端是所需时间较长，在这之前广谱抗生素的滥用造成临床诊断复杂化，不能满足临床需要，这往往使临床医生错过了最佳的治疗时机。而生物芯片由于具有高通量的特点，可以通过一次试验确定芯片上涵盖的多种细菌种类，因而避免了时间的浪费，缩短了菌血症检验的时间，对临床医生有效施治具有重要的指导意义。
从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的分析检测技术建立了起来，并随着人类基因组计划的开展逐步发展起来。该技术综合运用了分子生物学技术、集成电路制造技术、计算机技术、半导体技术、共聚焦激光扫描技术、荧光标记技术使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，受到科研人员的青睐。目前生物芯片技术已广泛应用到了分子生物学、疾病的预防、诊断和治疗、新药研发、环境污染监测等诸多领域。
众所周知，原核生物细胞中的16S rRNA基因的序列十分保守，不受微生物所处环境条件的变化、营养物质的丰缺的影响而有所变化，可以看作为生物进化的时间标尺，记录着生物进化的真实痕迹。细菌的16S rRNA基因具有相当的变异性，从而在序列上表现多型性，已经被广泛用于细菌进化关系分析和种的鉴定。因此，分析原核生物细胞中的16S rRNA基因的碱基序列，比较所分析的微生物与其他微生物种之间16S rRNA基因序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关系的距离和系统发育地位。根据16SrRNA基因建立的生命树认为，生命由细菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)和真核生物域(Eucarya)构成。三域生物间序列相似性＜60％，域内相似性＞70％，同种序列相似性＞97％。16S rRNA基因序列变化缓慢，跨越整个生命进化过程，分子中含有进化速度不同区域，可以作为分类的基础。
综上所述，有必要发明出一种利用基因芯片技术来快速、准确、可靠的对血液致病菌检测的产品及其方法。
发明内容
鉴于上述情况，本发明的一个目的是提供一种用于血液致病菌检测的基因芯片，以弥补传统血液致病菌检测技术存在的不足，实现血液致病菌检测的快速、准确和可靠。
本发明的另一目的是提供一种至少包括上述基因芯片的用于检测血液致病菌的试剂盒。
本发明的再一目的是提供利用所述的基因芯片和试剂盒来快速、准确、灵敏地检测血液致病菌的方法。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种用于血液致病菌检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述的寡聚核苷酸探针包括从一类或几类血液致病菌的16S rRNA基因序列和nuc基因序列中选取的DNA片段。
所述的DNA片段为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：28的至少一种。
本发明的较佳实施例中，所述的寡聚核苷酸探针还包括阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。
本发明的较佳实施例中，所述的荧光探针具有SEQ ID NO：29的核苷酸序列；阴性对照探针具有SEQ ID NO：30的核苷酸序列；阳性对照探针具有SEQ ID NO：31的核苷酸序列。
本发明中所述的一类或几类血液致病菌选自金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌属、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌/肠杆菌、大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌。
其中所述的克雷伯氏菌/肠杆菌包括肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌。
本发明中所述的基因芯片可用于金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌属、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌/肠杆菌、大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌血液致病菌的至少一种的检测，其中所述的克雷伯氏菌/肠杆菌包括肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌。
其中应用的检测探针为SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：37中的至少一种。
本发明还提供一种用于血液致病菌检测的试剂盒，该该试剂盒包括本发明所述的基因芯片。
本发明所述的试剂盒，还包括SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：37的检测探针的至少一种。
本发明所述的试剂盒，还可以包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及说明书。
本发明所述的试剂盒可用于金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌属、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌/肠杆菌、大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌血液致病菌的至少一种的检测，其中所述的克雷伯氏菌/肠杆菌包括肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌。
本发明还提出应用所述的基因芯片和试剂盒检测血液致病菌的方法，包括以下步骤：
(1)根据16S rRNA基因序列两侧适宜和高度保守的区域设计用于扩增16S rRNA基因序列的通用引物；
(2)按常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化扩增得到的靶序列；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与上述基因芯片杂交；
(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
在本发明的较佳实施例中，上述步骤(1)中根据16S rRNA基因序列两侧适宜和高度保守的区域设计的上游引物序列为SEQ ID NO：32-33，下游引物序列为SEQ ID NO：34-SEQ ID NO：37。
在本发明的较佳实施例中，上述步骤(5)中使用判读软件BactarrayAnalyzer分析鉴定杂交结果。
由上述的技术方案可见，利用本发明的基因芯片可以达到检测并确定血液感染患者所感染细菌种类的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，在24小时内能给出检测结果，对于临床医生的用药有一定的指导意义。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明一个实施例的基因芯片的外形示意图。
图2为本发明基因芯片的一个实施例上探针的排布示意图。
图3A-图3J为用本发明基因芯片的一个实施例进行样品检测的杂交扫描结果。
图4A-图4B为将本发明基因芯片的一个实施例进行样品检测的杂交扫描结果储存为.gpr文件的过程示意图。
图5为利用本发明基因芯片的一个实施例进行检测的分析结果报告。
图6为64种细菌16S rRNA基因系统的进化树。
具体实施方式
为进一步说明本发明的用于血液致病菌检测的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例进行说明，这些实施例是为了说明而不是以任何方式限制本发明。
实施例一：探针的设计和制备
1.序列获得
从GenBank中下载得到上述10类血液致病菌的16S rRNA基因序列。
2.探针设计
用Clustal X软件比对所有下载序列，根据比对结果，在16S rRNA基因序列的变异区设计针对每一类细菌的探针，共设计上述10类血液致病菌的寡核苷酸探针75条。
3.探针筛选
通过766次杂交实验进行探针筛选，最终得到31条适用探针，包括28条针对血液致病菌的特异探针、1条阳性对照探针、1条阴性对照探针和荧光探针，其碱基序列如下表1、表2所示。
其中，编号为NO.1-NO.28的28条探针(SEQ ID NO：1-NO：28)分别选自血液常见致病菌中的金黄色葡萄球菌、链球菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌/肠杆菌、大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、弗氏柠檬酸杆菌的16S rRNA基因序列，这些探针可从检测样品中分别检测出相应的来源菌。用带有荧光标记Cy3的多聚T序列对玻璃片基的质量进行监控以及对扫描结果图上的探针位置进行定位。用含有多个T的探针作为阴性对照探针，用于对非特异杂交情况进行监控。编号为NO.31的探针用作阳性对照探针，用于检测样品中是否含有细菌。
表1.本发明基因芯片一实施例中所选用的探针序列及相应的检测菌
| SEQID | 探针编号 | 来源(分别选自金黄色葡萄球菌的nuc基因序列) | 探针序列(5’-3’) | 检测菌 |
| NO：1 | NO.1 | 金黄色葡萄球菌 | AACGGACGAGAAGCTTGCTTCTCT | 金黄色葡萄球菌 |
| NO：2 | NO.2 | 金黄色葡萄球菌 | GATACACCTGAAACAAAGCATCC | 金黄色葡萄球菌 |
| NO：3 | NO.3 | 金黄色葡萄球菌 | GTGTAGAGAAATATGGTCCTGA | 金黄色葡萄球菌 |
表2.本发明基因芯片一实施例中所选用的探针序列及相应的检测菌(续)
| SEQID | 探针编号 | 来源(分别选自下列细菌的16SrRNA基因序列) | 探针序列(5’-3’) | 检测菌 |
| NO：4 | NO.4 | 金黄色葡萄球菌 | GACAAAGGTCAAAGAACTGAT | 金黄色葡萄球菌 |
| NO：5 | NO.5 | 肺炎链球菌 | GTTAGACCCTTTCCGGGGTTTA | 肺炎链球菌 |
| NO：6 | NO.6 | 肺炎链球菌 | AAGAGTAGATGTTGCATGACATTT | 肺炎链球菌 |
| NO：7 | NO.7 | 肺炎链球菌 | GTGAGAGTGGAAAGTTCACACTG | 肺炎链球菌 |
| NO：8 | NO.8 | 凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌 | CCTACCTATAAGACTGGGATAA | 凝固酶阴性葡萄球菌 |
| NO：9 | NO.9 | 凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌 | AACTTCGGGAAACCGGAGCT | 凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌 |
| NO：10 | NO.10 | 凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌 | GTCACTTATAGATGGACCCG | 凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌 |
| NO：11 | NO.11 | 铜绿假单胞菌 | CATACGTCCTGAGGGAGAAAGTG | 铜绿假单胞菌 |
| NO：12 | NO.12 | 铜绿假单胞菌 | GGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGT | 铜绿假单胞菌 |
| NO：13 | NO.13 | 铜绿假单胞菌 | ATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGAT | 铜绿假单胞菌 |
| NO：14 | NO.14 | 铜绿假单胞菌 | CCGTTGGGATCCTTGAGATC | 铜绿假单胞菌 |
| NO：15 | NO.15 | 粘质沙雷氏菌 | ACGCTCATCAATTGACGTTACT | 粘质沙雷氏菌 |
| NO：16 | NO.16 | 粘质沙雷氏菌/弗氏柠檬酸杆菌 | GCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGG | 粘质沙雷氏菌/弗氏柠檬酸杆菌 |
| NO：17 | NO.17 | 粘质沙雷氏菌 | GGTGGTGAACTTAATACGTTCATCA | 粘质沙雷氏菌 |
| NO：18 | NO.18 | 克雷伯氏菌/肠杆菌 | GGCGATAAGGTTAATAACCTTGTCG | 克雷伯氏菌/肠杆菌 |
| NO：19 | NO.19 | 克雷伯氏菌/肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌 | AGCACAGAGAGCTTGCTCTCGG | 克雷伯氏菌/肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌 |
| NO：20 | NO.20 | 克雷伯氏菌/肠杆菌/粘质沙雷氏菌/大肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌 | CAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTC | 克雷伯氏菌/肠杆菌/粘质沙雷氏菌/大肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌 |
| NO：21 | NO.21 | 大肠杆菌/粘质沙雷氏菌/克雷伯/肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌 | GCCATCGGATGTGCCCA | 大肠杆菌/粘质沙雷氏菌/克雷伯/肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌 |
| NO：22 | NO.22 | 大肠杆菌 | AGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTC | 大肠杆菌 |
| NO：23 | NO.23 | 大肠杆菌 | CAGGAAACAGCTTGCTG | 大肠杆菌 |
| TTTCGC | ||||
| NO：24 | NO.24 | 大肠杆菌 | CAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGC | 大肠杆菌 |
| NO：25 | NO.25 | 屎肠球菌 | ATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTG | 屎肠球菌 |
| NO：26 | NO.26 | 屎肠球菌 | CAAAACCGCATGGTTTTGATTTG | 屎肠球菌 |
| NO：27 | NO.27 | 粪肠球菌 | ACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTG | 粪肠球菌 |
| NO：28 | NO.28 | 粪肠球菌 | ATGCCGCATGGCATAAGAGTG | 粪肠球菌 |
| NO：29 | NO.29 | 荧光探针 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy3 | 作为荧光对照 |
| NO：30 | NO.30 | 阴性对照探针 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT | 作为阴性对照 |
| NO：31 | NO.31 | 阳性对照探针 | ACTCCTACGGGAGGCAGC | 作为阳性对照 |
4.探针合成
按照表1中的序列合成探针，在5’端进行poly(T)和氨基修饰。
实施例二：引物的设计和制备
利用Primer 5.0等生物信息学软件分析GenBank等公共数据库内的序列资源，在16S rRNA基因序列两侧适宜和高度保守的区域设计了用于扩增16S rRNA基因序列的通用引物2条，该引物序列及其用途如下表2所示。
表3.16S rRNA基因扩增通用引物及用途
| 引物编号 | 引物序列(5’-3’) | 引物用途 |
| 1 | 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO：32)和5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO：33) | 16S上游引物 |
| 2 | 5’-CCGTCAATTCATTTAAGTTT-3’(SEQ ID NO：34)、5’-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’(SEQ ID NO：35)、5’-CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3’(SEQ ID NO：36)和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’(SEQ ID NO：37) | 16S下游引物 |
实施例三：基因芯片的制备
1.溶解探针
将实施例一中合成的探针溶解于50％DMSO溶液中，使探针的终浓度达到1μg/μl。
2.点样
利用自动生物芯片点样仪(Spotarray 72)将探针点到玻片上，形成设计好的微阵列。如图1所示，本实施例中使用的芯片是以57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的经过醛基化的玻片为固相载体，将实施例一中合成的31条寡核苷酸探针点在玻片上3mm×3mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点样区内阵列排布规律相同。如图2所示，详细给出了每个点样区的探针排布，每个点样区内为9(行)×12(列)个探针点，每条探针重复点样3次，括号中的编号为表1中的探针标号，对照表1即可详细了解每条探针的位置。
将点样后的玻片干燥、紫外交联，即获得根据本发明较佳实施例的用于检测血液重要致病菌的基因芯片。
实施例四：利用上述制备好的基因芯片快速检测血液中的致病菌
在利用上述制备好的基因芯片检测血液致病菌的方法中，本发明对检测步骤、检测条件等因素均作了一系列的实验摸索，如PCR反应混合物中各成分比例，PCR循环条件，杂交温度，杂交时间等及主要试剂配方，如杂交液，洗液等(配方详见以下实施例)，均为经过梯度实验后得到的优良比例。PCR循环条件，尤其是退火时间及延伸时间亦为梯度实验后选出的优良条件。血液重要致病菌检测基因芯片的实验流程亦为优化后结果。
另外，本发明使用的从临床样品(阳性或阴性，即是全自动血液培养仪报警后的阳性或阴性血培养物)提取细菌基因组的方法为碱洗/热裂解的方法(详见以下实施例所述)，该方法能有效地从血培养物中提取细菌基因组，适用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。该方法还能够消除血培养物中对后续反应(主要是PCR)的抑制剂，并且具有较高的灵敏度。
本发明的检测方法为：提取待测样品基因组后，经过PCR双链扩增，纯化双链PCR产物，利用下游引物PCR单链标记，纯化单链PCR产物，得到标记产物，将标记产物与杂交液1∶1混合加于基因芯片上的探针阵列固定区域，50℃水浴杂交1.5小时，杂交完成后，用配制好的洗液按离子强度由高到低的顺序对基因芯片进行洗涤，风干后，在635nm、532nm波长下扫描芯片，得到靶序列与芯片杂交的图谱和数据信息，通过计算机软件分析，判断出感染细菌的种类。
以下为利用上述制备好的基因芯片检测血液致病菌的较佳实施例，详细说明如下：
1.芯片的预杂交
(1)将上述紫外交联的芯片放入500ml 42℃预热的预杂交液中，42℃静置1小时。
预杂交液配方：1％BSA(牛血清蛋白)(W/V)
5×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)
0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)(W/V)
(2)在ddH2O中提洗1分钟两次，95％乙醇脱水2分钟，冷风吹干，备用。
2.样品来源
阳性样品：临床采集患者静脉血5ml注入血培养瓶中，35℃培养一定时间至全自动血液培养仪报警后的阳性血培养物。(注：研究中的阳性样品来自美国BD和法国梅里埃血培养仪)
阴性样品：全自动血液培养仪报警为阴性的血培养物。
3.样品提取
(1)取450μl临床样品加入到1.5ml螺口离心管中。
(2)加入900μl样品提取液I(0.5M氢氧化钠，0.05M柠檬酸钠)，反复颠倒混匀10分钟。
(3)13,000×g离心5分钟，立刻倾倒上清。
(4)沉淀用500μl样品提取液II(0.5MTris-HCl pH8.0)重悬。
(5)13,000×g离心5分钟，立刻倾倒上清。
(6)沉淀用500μl样品提取液II重悬。
(7)13,000×g离心5分钟，弃上清。
(8)沉淀用100μl样品提取液III(10mMTris-HCl pH8.0，1mM EDTA)重悬，100℃煮沸10分钟。
(9)13,000×g离心15分钟，取上清60μl转移到一个新的1.5ml灭菌离心管中，进行后续PCR反应或-20℃储存。
4.扩增和标记
(1)PCR双链扩增
取上述步骤3得到的提取物3μl加入到双链扩增PCR反应混合液中，双链扩增PCR反应混合液的配方如下表3所示。
表4双链扩增PCR反应混合液配方
| 成分 | 来源 | 浓度 | 加样量(μl) |
| PCR缓冲液 | 大连宝生物rTaq自带 | 10× | 3 |
| dATP | 大连宝生物 | 100mM | 0.024 |
| dCTP | 大连宝生物 | 100mM | 0.024 |
| dGTP | 大连宝生物 | 100mM | 0.024 |
| dTTP | 大连宝生物 | 100mM | 0.016 |
| dUTP | 上海生工 | 100mM | 0.008 |
| Taq酶 | 宝生物 | 5U/μl | 0.4 |
| DNase I | 大连宝生物 | 70U/μl | 0.07 |
| 引物1 | 上海生工 | 100μM | 0.08 |
| 引物2 | 上海生工 | 100μM | 0.08 |
| UNG酶 | 上海生工 | 1U/μl | 0.1 |
| ddH2O | Millipore | - | 23.174 |
注：上表中引物1和引物2为表2中所列的引物。将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
37℃15分钟
94℃10分钟
72℃5分钟
4℃20小时
(2)双链PCR产物的纯化
将上述步骤(1)中扩增得到的双链PCR产物，加入纯化柱(MILLIPORE公司)内，补水至400μl，1,000×g，离心15分钟，弃液，在纯化柱膜上加30μl ddH2O，37℃静置5分钟，将纯化柱倒扣在一新的1.5ml离心管上，1,000×g，离心2分钟，离心所得的溶液即为双链PCR的纯化产物。
(3)PCR单链标记
取上述步骤(2)中得到的双链PCR纯化产物10μl加入到单链标记PCR反应混合液中，单链标记PCR反应混合液的配方如下表4所示。
表5：单链标记PCR反应混合液配方
| 成分 | 浓度 | 加样量(μl) |
| PCR缓冲液 | 10× | 3 |
| dATP | 100mM | 0.024 |
| dCTP | 100mM | 0.024 |
| dGTP | 100mM | 0.024 |
| dTTP | 100mM | 0.016 |
| dUTP | 100mM | 0.008 |
| Taq酶 | 5U/μl | 0.4 |
| DNase I | 70U/μl | 0.07 |
| 引物2 | 100μM | 0.08 |
| Cy5-dCTP | 1nmol/μl | 0.3 |
| ddH2O | - | 16.054 |
注：上表中引物2为表2中所列的引物。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃10分钟
72℃5分钟
4℃20小时
(4)获得单链PCR产物
5.杂交
杂交反应液的制备：上述步骤4获得的单链PCR产物8μl，50℃预热的2×杂交液8μl，混合均匀，离心消泡备用。
取上述实施例三中制备好的基因芯片置于杂交盒(博奥公司)内，盖上定制的盖片(博奥公司)，将制备好的杂交反应液点在该芯片的探针阵列区域，注意盖片和芯片之间不能有气泡，盖紧杂交盒，放入50℃水浴锅中1.5h。杂交结束后，取出杂交盒，去除盖片，分别依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤1.5分钟，并在空气中风干。
杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS；6×SSPE
洗液A：1×SSC，0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6.扫描
使用GenePixTM Personal 4100A生物芯片扫描仪，运行Gene Pix Pro4.1程序，选择635nm和532nm双通道，PMT值调至600，扫描结果存为JPG，TIF格式的文件。
用上述制备好的基因芯片分别检测样品为上述10类细菌时的杂交扫描结果如图3A-图3J所示。其中图3A-图3J分别表示的样品为：A、粘质沙雷氏菌，B、粪肠球菌，C、大肠杆菌，D、金黄色葡萄球菌，E、克雷伯氏氏菌/肠杆菌，F、铜绿假单胞菌，G、屎肠球菌，H、凝固酶阴性葡萄球菌，I、肺炎链球菌，J、弗氏柠檬酸杆菌。
调用套圈文件，获取每一个探针位点的荧光强度值，并将结果储存为.gpr文件，如图4A和图4B所示。
7.结果判读
1.安装与使用结果判读软件Bactarray Analyzer(由天津生物芯片技术有限责任公司开发)。
2.运行Bactarray Analyzer程序，并输入用户名、密码。
3.点击工具栏上的“新建项目”按钮新建一个项目，然后按“导入文件”导入待分析的.gpr文件。按下Ctrl键，可同时选择并打开多个文件。
4.点击“处理数据”按钮，软件将会自动生成一个处理过程的记录文件。在“文件列表”页面点击文件名，报告页面会自动切换到该文件的分析结果报告。分析结果报告已被自动保存在本项目所在目录之下。
5.结果判读：如图5所示，报告给出送检文件名称、样品编号、结果、微生物名、可信度、分值、特异探针杂交率、荧光强度、软件判读日期、软件操作人等信息。其中，“微生物”项即为菌血症中检测到的细菌名。
实施例五：对基因芯片进行特异性鉴定
选取了64种较为常见的血液致病菌，利用它们的16S rRNA序列构建系统进化树。系统进化树可以清晰地显示各种菌株之间的进化关系，以及该芯片所检测的10类细菌所处的进化位置。利用得到的这一分析结果，我们选用与靶标细菌进化关系非常接近的一些细菌进行特异性实验。如能准确区分这些近缘细菌，则说明探针有较高的特异性，也就必然可以区分其它进化关系更远的远缘细菌。
本实施例选用的构建进化树的64种细菌包括：1 Acinetobactercalcoaceticus subsp.anitratus醋酸钙不动杆菌硝酸盐阴性亚种；2Acinetobacter baumannii鲍氏不动杆菌；3 Acinetobacter calcoaceticus醋酸钙不动杆菌；4 Aerococcus viridans绿色气球菌；5 Alcaligenes faecalis subsp.faecalis粪产硷杆菌粪亚种；6 Achromobacter xylosoxidans subsp.xylosoxidans氧化木糖无色杆菌氧化木糖亚种；7 Bacillus cereus蜡样芽胞杆菌；8 Bacillus subtilis subsp.subtilis枯草杆菌枯草亚种；9 Bacteroidesfragilis脆弱拟杆菌；10 Brucella melitensis biovar abortus马尔他布鲁氏杆菌流产生物型；11 Brucella melitensis马尔他布鲁氏杆菌；12 Brucellamelitensis biovar neotomae马尔他布鲁氏杆菌木鼠生物型；13 Brucellamelitensis biovar Ovis马尔他布鲁氏杆菌羊生物型；14 Corynebacteriumdiphtheriae白喉棒杆菌；15 Citrobacter freundii弗氏柠檬酸杆菌；16Clostridium perfringens产气荚膜梭状芽胞杆菌；17 Enterobacter aerogenes产气肠杆菌；18 Pantoea agglomerans成团泛菌；19 Enterobacter cloacaesubsp.cloacae阴沟肠杆菌阴沟亚种；20 Enterobacter hormaechei霍氏肠杆菌；21 Enterococcus faecalis粪肠球菌；22 Enterococcus faecium屎肠球菌；23 Enterococcus gallinarum鹑鸡肠球菌；24 Escherichia coli大肠杆菌；25 Haemophilus influenzae流感嗜血杆菌；26 Hafnia alvei蜂房哈夫尼亚菌；27 Klebsiella oxytoca产酸克雷伯氏菌；28 Klebsiella pneumoniae肺炎克雷伯氏菌；29 Listeria monocytogenes单核增生李斯特氏菌；30 Micrococcusluteus藤黄微球菌；31 Mycobacterium tuberculosis结核分枝杆菌；32Neisseria gonorrhoeae淋病奈瑟菌；33 Propionibacterium acnes短小棒状杆菌；34 Proteus mirabilis奇异变形杆菌；35 Pseudomonas aeruginosa铜绿假单胞菌；36 Pseudomonas fluorescens荧光假单胞菌；37 Pseudomonasfluorescens荧光假单胞菌；38 Pseudomonas putida恶臭假单胞菌；39Pseudomonas stutzeri施氏假单胞菌；40 Streptococcus agalactiae无乳链球菌；41 Streptococcus salivarius唾液链球菌；42 Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi伤寒沙门氏菌；43 Salmonella enterica subsp.enterica肠道沙门氏菌沙门亚种；44 Serratia marcescens subsp.marcescens粘质沙雷氏菌粘质亚种；45 Sphingobacterium multivorum多食鞘氨醇杆菌；46Staphylococcus aureus subsp.aureus金黄色葡萄球菌金黄色亚种；47Staphylococcus cohnii subsp.cohnii科氏葡萄球菌科氏亚种；48Staphylococcus epidermidis表皮葡萄球菌；49 Staphylococcus haemolyticus溶血性葡萄球菌；50 Staphylococcus hominis subsp.hominis人葡萄球菌人亚种；51 Staphylococcus intermedius中间葡萄球菌；52 Staphylococcussaprophyticus subsp.saprophyticus腐生葡萄球菌腐生亚种；53Staphylococcus sciuri subsp.sciuri松鼠葡萄球菌松鼠亚种；54Staphylococcus simulans模仿葡萄球菌；55 Staphylococcus xylosus木糖葡萄球菌；56 Stenotrophomonas maltophilia嗜麦芽窄食单胞菌；57Streptococcus oralis口腔链球菌；58 Streptococcus pneumoniae肺炎链球菌；59 Streptococcus pyogenes化脓性链球菌；60 Tetragenococcus doogicus；61 Tetragenococcus koreensis；62 Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila嗜水气单胞菌嗜水亚种；63 Moraxella(Branhamella)catarrhalis卡他莫拉菌感；64 Lactobaci llus acidophilus嗜酸乳杆菌，具体参见图6。
通过449次杂交实验，证明该芯片可以准确区分：同源性在95％至95.5％之间的粪肠球菌、屎肠球菌和鹑鸡肠球菌(进化树中位置：23，24，25)；同源性为97.4％的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(进化树中位置：52和54)；同源性为92.1％的肺炎链球菌和唾液链球菌(进化树中位置：47和64)；同源性为93.0％的铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌(进化树中位置：41和42)；同源性94％至97.1％之间的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌和沙门氏菌(进化树中位置：26、31、50、48和49)。另外，本实施例还利用一些较远缘的细菌，如嗜麦芽寡养单胞菌、不动杆菌、腐生葡萄球菌和蜂窝哈夫尼亚氏菌进行了特异性实验，均取得很好的结果。
本检测芯片可以在24小时内完成检测中国常见的9类致病菌。
从2005年3月到2006年1月共完成647例本芯片检测范围内细菌感染患者的临床标本，具体情况见下表：
| 完成例数 | 传统检测和芯片检测结果符合率 | 芯片检测正确率 |
| 647 | 74.65％ | 98.6％ |
传统检测和芯片检测结果符合率：是指传统检测和芯片检测符合的例数占整个病例数的比例。对于不符合的病例，将进行16S测序验证。
芯片检测正确率：经16SrDNA测序验证后，证明芯片检测结果正确的例数占整个病例数的比例。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，但并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当以权利要求所界定者为准。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>用于血液致病菌检测的基因芯片和检测用试剂盒
<130>5P13002-CN
<160>37
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>49
<212>DNA
<213>选自金黄色葡萄球菌的nuc基因序列
<400>1
tttttttttt tttttttttt tttttaacgg acgagaagct tgcttctct 49
<210>2
<211>49
<212>DNA
<213>选自金黄色葡萄球菌的nuc基因序列
<400>2
tttttttttt tttttttttt ttttttgata cacctgaaac aaagcatcc 49
<210>3
<211>49
<212>DNA
<213>选自金黄色葡萄球菌的nuc基因序列
<400>3
tttttttttt tttttttttt tttttttgtg tagagaaata tggtcctga 49
<210>4
<211>49
<212>DNA
<213>选自金黄色葡萄球菌的16SrRNA基因序列
<400>4
tttttttttt tttttttttt ttttttttga caaaggtcaa agaactgat 49
<210>5
<211>49
<212>DNA
<213>选自肺炎链球菌的16SrRNA基因序列
<400>5
tttttttttt tttttttttt tttttttgtt agaccctttc cggggttta 49
<210>6
<211>49
<212>DNA
<213>选自肺炎链球菌的16SrRNA基因序列
<400>6
tttttttttt tttttttttt tttttaagag tagatgttgc atgacattt 49
<210>7
<211>49
<212>DNA
<213>选自肺炎链球菌的16SrRNA基因序列
<400>7
tttttttttt tttttttttt ttttttgtga gagtggaaag ttcacactg 49
<210>8
<211>49
<212>DNA
<213>选自凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌的16SrRNA基因序列
<400>8
tttttttttt tttttttttt tttttttcct acctataaga ctgggataa 49
<210>9
<211>49
<212>DNA
<213>选自凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌的16SrRNA基因序列
<400>9
tttttttttt tttttttttt ttttttttta acttcgggaa accggagct 49
<210>10
<211>49
<212>DNA
<213>选自凝固酶阴性葡萄球菌/金黄色葡萄球菌的16SrRNA基因序列
<400>10
tttttttttt tttttttttt tttttttttg tcacttatag atggacccg 49
<210>11
<211>49
<212>DNA
<213>选自铜绿假单胞菌的16SrRNA基因序列
<400>11
tttttttttt tttttttttt ttttttcata cgtcctgagg gagaaagtg 49
<210>12
<211>49
<212>DNA
<213>选自铜绿假单胞菌的16SrRNA基因序列
<400>12
tttttttttt tttttttttt ttttgggcag taagttaata ccttgctgt 49
<210>13
<211>49
<212>DNA
<213>选自铜绿假单胞菌的16SrRNA基因序列
<400>13
tttttttttt tttttttttt ttttttatga agggagcttg ctcctggat 49
<210>14
<211>49
<212>DNA
<213>选自铜绿假单胞菌的16SrRNA基因序列
<400>14
tttttttttt tttttttttt tttttttttc cgttgggatc cttgagatc 49
<210>15
<211>49
<212>DNA
<213>选自粘质沙雷氏菌的16SrRNA基因序列
<400>15
tttttttttt tttttttttt tttttttacg ctcatcaatt gacgttact 49
<210>16
<211>49
<212>DNA
<213>选自粘质沙雷氏菌/弗氏柠檬酸杆菌的16SrRNA基因序列
<400>16
tttttttttt tttttttttt ttttttgcac aggggagctt gctccctgg 49
<210>17
<211>49
<212>DNA
<213>选自粘质沙雷氏菌的16SrRNA基因序列
<400>17
tttttttttt tttttttttt ttttggtggt gaacttaata cgttcatca 49
<210>18
<211>49
<212>DNA
<213>选自克雷伯氏菌/肠杆菌的16SrRNA基因序列
<400>18
tttttttttt tttttttttt ttttggcgat aaggttaata accttgtcg 49
<210>19
<211>49
<212>DNA
<213>选自克雷伯氏菌/肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌的16SrRNA基因序列
<400>19
Tttttttttt tttttttttt tttttttagc acagagagct tgctctcgg 49
<210>20
<211>49
<212>DNA
<213>选自克雷伯氏菌/肠杆菌/粘质沙雷氏菌/大肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌的16SrRNA基因序列
<400>20
tttttttttt tttttttttt tttttcaaag tgggggacct tcgggcctc 49
<210>21
<211>49
<212>DNA
<213>选自大肠杆菌/粘质沙雷氏菌/克雷伯/肠杆菌/弗氏柠檬酸杆菌的16SrRNA基因序列
<400>21
tttttttttt tttttttttt tttttttttc ttgccatcgg atgtgccca 49
<210>22
<211>49
<212>DNA
<213>选自大肠杆菌的16SrRNA基因序列
<400>22
tttttttttt tttttttttt tttagggagt aaagttaata cctttgctc 49
<210>23
<211>49
<212>DNA
<213>选自大肠杆菌的16SrRNA基因序列
<400>23
tttttttttt ttttttttttttttttcagg aaacagcttg ctgtttcgc 49
<210>24
<211>49
<212>DNA
<213>选自大肠杆菌的16SrRNA基因序列
<400>24
tttttttttt tttttttttt ttttttcagg aagaagcttg cttctttgc 49
<210>25
<211>49
<212>DNA
<213>选自屎肠球菌的16SrRNA基因序列
<400>25
tttttttttt tttttttttt tttttatgag agtaactgtt catcccttg 49
<210>26
<211>49
<212>DNA
<213>选自屎肠球菌的16SrRNA基因序列
<400>26
tttttttttt tttttttttt ttttttcaaa accgcatggt tttgatttg 49
<210>27
<211>49
<212>DNA
<213>选自粪肠球菌的16SrRNA基因序列
<400>27
tttttttttt tttttttttt tttttacgtt agtaactgaa cgtcccctg 49
<210>28
<211>49
<212>DNA
<213>选自粪肠球菌的16SrRNA基因序列
<400>28
tttttttttt tttttttttt ttttttttat gccgcatggc ataagagtg 49
<210>29
<211>49
<212>DNA
<213>荧光探针序列
<400>29
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttt 49
<210>30
<211>49
<212>DNA
<213>阴性对照探针序列
<400>30
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttt 49
<210>31
<211>49
<212>DNA
<213>阳性对照探针序列
<400>31
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tactcctacg ggaggcagc 49
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>检测探针上游引物序列
<400>32
agagtttgat catggctcag 20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>检测探针上游引物序列
<400>33
agagtttgat cctggctcag 20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>检测探针下游引物序列
<400>34
ccgtcaattc atttaagttt 20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>检测探针下游引物序列
<400>35
ccgtcaattc atttgagttt 20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>检测探针下游引物序列
<400>36
ccgtcaattc ctttaagttt 20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>检测探针下游引物序列
<400>37
ccgtcaattc ctttgagttt 20
Claims (9)
1.一种用于血液致病菌检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述的寡聚核苷酸探针包括从血液致病菌的16S rRNA基因序列和nuc基因序列中选取的DNA片段，所述DNA片段如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：28所示。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探针还包括阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。
3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述的荧光探针如SEQ ID NO：29所示。
4.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述的阴性对照探针如SEQ ID NO：30所示。
5.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述的阳性对照探针如SEQ ID NO：31所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的基因芯片，其特征在于所述的血液致病菌选自金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌属、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌/肠杆菌、大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌和弗氏柠檬酸杆菌。
7.一种用于血液致病菌检测的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括权利要求1所述的基因芯片。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：37所示的引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及说明书。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Small J,et al.《Direct detection of 16S rRNA in soil extracts by using olygonucleotide microarrays》.《Appl Environ Microbiol》.2001,第67卷(第10期),4708-16. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101407837A (zh) | 2009-04-15 |
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