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CN101489383A - 传递方法 - Google Patents

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CN101489383A
CN101489383A CNA2007800274902A CN200780027490A CN101489383A CN 101489383 A CN101489383 A CN 101489383A CN A2007800274902 A CNA2007800274902 A CN A2007800274902A CN 200780027490 A CN200780027490 A CN 200780027490A CN 101489383 A CN101489383 A CN 101489383A
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布鲁斯·A·撒兰格
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Duke University
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Abstract

总的来说，本发明涉及siRNA，特别是涉及一种有效的定向传递siRNAs的方法，以及适用于该方法的化合物。

Description

传递方法
本申请要求2006年6月1日提交的美国第60/809,842号临时申请的优先权，其全部内容籍引用并入本申请。
本发明受美国国立卫生研究院所颁发的第R01 HL079051号基金的政府资助。政府在本发明中具有一定权利。
技术领域
总的来说，本发明涉及干扰RNA(RNAi)(例如siRNA)，特别是涉及一种有效的定向传递RNAi′s的方法，以及适于该方法的化合物。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是一种首先由Fire等人于1998年描述的发生在线虫中的细胞机理，它是由21-23nt的双链RNA引起的同源mRNAs的降解过程(Fire等，自然(Nature)391(6669)：806-811(1998))。自从有人首先证明了外源的短干扰RNAs(siRNAs)可以在哺乳动物细胞中通过此途径使得基因表达沉默(Elbashir等，自然411(6836)：494-8(2001))以来，RNAi的治疗性应用已经显现出来。RNAi在治疗方面有吸引力的性质包括1)严格的目的基因特异性，2)siRNAs相对低的免疫原性，以及3)siRNAs设计和检验的简单性。
基于RNAi的临床应用的一个决定性的技术障碍是使siRNAs在体内通过细胞质膜进行传递。已经有许多种针对此问题的解决办法，包括阳离子脂质体(Yano等，ClinCancer Res.10(22)：7721-6(2004))，病毒载体(Fountaine等，Curr Gene Ther.5(4)：399-410(2005)，Devroe和Silver，Expert Opin Biol Ther.4(3)：319-27(2004)，Anderson等，艾滋病Res Hum Retroviruses.19(8)：699-706(2003))，高压注射(Lewis and Wolff，MethodsEnzymol.392：336-50(2005))，以及siRNAs修饰(如化学修饰，脂质体修饰，甾体修饰，以及蛋白修饰)(Schiffelers等，Nucleic Acids Res.32(19)：e149(2004)，Urban-Klein等，Gene Ther.12(5)：461-6(2005)，Soutschek等，自然432(7014)：173-8(2004)，Lorenz等，Bioorg Med Chem Lett.14(19)：4975-7(2004)，分钟akuchi等，Nucleic Acids Res.32(13)：e109(2004)，Takeshita等，Proc Natl Acad Sci USA.102(34)：12177-82(2005))。但是，至今所描述的大部分方法都具有不考虑细胞类型而使siRNAs传递到非特异性细胞中的缺点。
对于体内应用来说，将治疗性siRNA试剂定位于特定的细胞类型(例如癌细胞)是非常重要的，由此可以减少由非特异性传递所引起的副作用，同时也可以减少出于成本原因所要重点考虑的治疗所必需的siRNA数量。一项最近的研究揭示了一种有希望将siRNAs定向传递的方法，其中，结合特异细胞表面受体的抗体与精蛋白融合，用于通过内吞作用而将siRNAs传递到细胞内(Song等，Nat.Biotechnol.23(6)：709-17(2005))。
本发明涉及一种非常简单的特异性传递siRNAs的方法，其中至少在一个实施例中，只用到了RNA的性质。利用SELEX(指数富集配基的系统进化技术)，我们已经证明了结构性RNAs能够以高亲和性结合各种蛋白质，而且其特异性也已经被证实。本发明的传递方法利用核酸(例如RNA)的结构潜势使siRNAs定位于特定的细胞表面受体上，并由此定位于特定的细胞类型上。因此，本发明提供了一种特异性传递核酸的方法，该核酸包括一个定位部分(例如，一种适体)，和一个RNA沉默部分(例如，一种siRNA)，该部分被Dicer酶所识别，并以类似于加工微小RNAs(microRNAs)的方式发生作用。
发明内容
发明概要
本发明涉及干扰RNA(RNAi)，并涉及一种传递干扰RNA的方法。更准确地说本发明涉及一种有效的定向传递siRNA的方法，包括利用含有要传递的siRNA的和一个定位部分的核酸，其中该定位部分是一种适体。
本发明的目的和优点将在下面的说明中予以阐明。
附图说明
图1A-1D：已提出的适体-siRNA嵌合体作用机理的图解。(图1A)结合在细胞表面受体(浅绿色矩形)上的适体-siRNA嵌合体被内吞，然后从胞饮体(endosome)中释放进入到RNAi通路。细胞内的沉默通路也表现出来用于对比。微小RNA前体(pre-miRNA)在Drosha酶的裂解作用下离开细胞核，并被核酸内切酶Dicer所识别，被其从微小RNA前体加工为21nt成熟miRNA。成熟的miRNA接着被结合进沉默复合物(RISC)中，在那里它介导目标mRNA降解。(图1B)预测的PSMA特异性适体A10和A10适体-siRNA嵌合体衍生物的RNA结构。A10适体中起结合PSMA作用的区域以深红色框住。该区域在突变的A10适体、mutA10-Plk1中有突变(突变的碱基以蓝色表示)。(图中显示了适体A10的二级结构。)(图1C)A10适体-siRNA嵌合体对于细胞类型的特异性结合。利用流式细胞术评价荧光标记的适体-siRNA嵌合体(以绿色表示)与细胞表面的结合，发现该结合限于LNCaP细胞表达的PSMA。未染色的细胞以紫色表示。(图1D)适体-siRNA嵌合体与细胞表面的结合需要A10中负责结合PSMA表面受体的完整区域。
图2A-2C：A10适体-siRNA嵌合体与细胞表面抗原PSMA特异地结合。(图2A)荧光标记的A10适体-siRNA嵌合体的结合可与过量的A10适体活跃地竞争。结合率以G1计数的百分比表示。(图2B)利用人PSMA特异性抗体使细胞表面A10适体和A10适体-siRNA嵌合体与LNCaP细胞的结合断开。荧光标记的A10适体和A10适体-siRNA嵌合体与细胞表面的结合以流式细胞术进行评价，并且以平均荧光强度(MFI)进行表示。+或-竞争剂MFI值用来计算竞争百分比。(图2C)A10适体和A10适体-siRNA嵌合体与LNCaP细胞在细胞表面的结合在5-α-二氢睾酮(2nM DHT)处理时减低，引起PSMA在细胞表面表达的减少。结合率以G1(gate1)中计数百分比表示。
图3A-3C：适体-siRNA嵌合体引起的细胞类型特异性的基因沉默。(图3A)A10-Plk1适体-siRNA嵌合体使LNCaP细胞中Plk1的表达沉默，但不能使PC-3细胞中Plk1的表达沉默(上图)。经流式细胞术确定，沉默与带有FITC-标记的A10-Plk1的LNCaP细胞中的有效标记相关(下图)。(图3B)A10-Bcl-2适体-siRNA嵌合体使LNCaP中表达的Bcl-2沉默，但不能使PC-3细胞中表达的Bcl-2沉默(上图)。沉默与LNCaP细胞中FITC-标记的A10-Bcl-2的标记有关(下图)。(图3C)A10-Plk1介导的Plk1沉默在用5-α-二氢睾酮(2nM DHT)处理LNCaP细胞时降低。
图4A-4C：适体-siRNA嵌合体介导的Plk1和Bcl-2基因沉默对于增殖和凋亡产生细胞类型特异性作用。(图4A)转染了(+阳离子脂质体)和Plk1或对照siRNA，或以(-阳离子脂质体)与A10适体、或者A10适体-siRNA嵌合体(A10-CON和A10-Plk1)进行处理的PC-3细胞和LNCaP细胞的增殖，增殖情况由3H-胸苷的参入确定。(图4B)以顺铂、A10适体，或A10适体-siRNA嵌合体(A10-CON和A10-Plk1)处理的PC-3和LNCaP细胞，或者以Plk1或对照siRNA转染的PC-3和LNCaP细胞的凋亡情况利用PE-缀合的半胱氨酸蛋白酶3特异性抗体通过流式细胞术进行评价。(图4C)以顺铂、A10适体，或A10适体-siRNA嵌合体(A10-CON和A10-Bcl2)处理的PC-3和LNCaP细胞或者用Bcl2或者对照siRNA转染的PC-3和LNCaP细胞的凋亡情况按如上所述的方法进行评价。
图5A-5C：通过RNAi通路发生的适体-siRNA嵌合体介导的基因沉默。(图5A)用siRNAs、A10适体、或A10适体-siRNA嵌合体(A10-CON和A10-Plk1)在针对Dicer酶的siRNA存在或不存在的情况下转染LNCaP细胞。(图5B)体外Dicer酶试验。被Dicer酶处理过的或者没有用Dicer酶处理过的RNAs在非变性聚丙烯酰胺凝胶中分开，并用溴化乙锭染色。单链嵌合体、ssA10-Plk1和ssA10-CON(没有反义siRNA)。(图5C)体外Dicer酶试验。适体-siRNA嵌合体与互补的以32P标记的反义siRNA链退火，在有或者没有Dicer酶的情况下保温，然后将裂解产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分开。反义siRNAs与A10不是互补的，因此也不能与之退火。
图6A和6B：A10-Plk1适体-siRNA嵌合体在患有前列腺癌的老鼠模型中的抗癌活性。(图6A)嵌合的RNAs施药于小鼠模型的肿瘤中，该小鼠模型产生PSMA阴性前列腺癌细胞PC-3(左图)或者PSMA阳性前列腺癌细胞LNCaP(右图)双向注入裸鼠的后肋。平均肿瘤体积用单因素方差分析法进行分析。***，P<0.0001；**，P<0.001；*，P<0.01。(n＝6-8个肿瘤)。(图6B)单个LNCaP细胞衍生的肿瘤的肿瘤曲线显示，肿瘤生长的衰退与A10-Plk1处理有关，但与DPBS、A10-CON、或mutA10-Plk1的处理无关。
图7A和7B：PSMA的细胞类型特异性表达。PSMA的表达用(图7A)流式细胞术和(图7B)对人PSMA特异性抗体的免疫印迹进行评价。PSMA在LNCaP前列腺癌细胞的表面表达，但不在PC-3前列腺癌细胞、HeLa细胞、非前列腺衍生的癌细胞系上表达。
图8A和8B：A10和A10适体-siRNA嵌合体衍生物的相对亲合力测量。(图8A)荧光标记的RNAs(A10、A10-CON、和A10-Plk1)的细胞表面结合亲合力用流式细胞术评价。(图8B)图8A里的数据中G1％MFI(平均荧光强度)分布图。A10和适体-siRNA嵌合体与LNCaP细胞表面的相对亲合力由荧光标记的A10、A10-CON或A10-Plk1 RNAs与LNCaP细胞保温后增加的量确定。细胞荧光利用流式细胞术进行测量。我们发现，适体-siRNA嵌合体和A10对于LNCaP细胞表面的亲合力接近。
图9A和9B：功能性抗Polo样激酶1(Plk1)和Bcl2的siRNAs介导的基因沉默。基因沉默是利用阳离子脂质体将对于人Plk1(图9A)或者人bcl-2(图9B)特异的siRNA传递到PC-3和LNCaP细胞中。沉默利用流式细胞术(上图)和免疫印迹(下图)进行评价。
图10A和10B：siRNA-介导的Dicer酶沉默。Dicer酶基因表达的沉默用(图10A)流式细胞术和(图10B)对于人Dicer特异性抗体的酶联免疫吸附(ELISA)进行评价。HeLa细胞分别以对照的非沉默siRNA或者抗人Dicer酶的siRNA进行转染。Dicer酶siRNA引起的沉默是特异性的，并且导致>80％的Dicer酶基因表达的减少。
图11A和11B：适体-siRNA嵌合体不会引起干扰素反应。对于以siRNAs(con、Plk1或Bcl-2)、A10适体、或适体-siRNA嵌合体(A10-CON、A10-Plk1、或A10-Bcl2)处理的(图11A)PC-3和(图11B)LNCaP细胞，利用对于INF-β特异性的抗体进行酶联免疫吸附试验(ELISA)评价其干扰素-β(INF-B)的产量。以干扰素诱导剂Poly(I:C)处理的细胞用于该试验的阳性对照。
具体实施方式
发明详述
本发明涉及一种有效的定向传递RNAi′s(例如，siRNAs和短的发夹RNAs(shRNA))的方法。例如，该方法可用于将siRNAs定向传递到特异的细胞类型(例如，含有特定蛋白碳水化合物或脂类(例如，某种细胞表面受体)的细胞)中。与迄今为止所描述的绝大多数方法相比，本发明所公开的方法可以用一种只含有RNA的化合物完成。所用到的分子是一种嵌合分子，包括一个核酸定向部分(例如，一种适体)，连接有一个RNA沉默部分(例如，一种siRNA(包括修饰的或未修饰的RNA))。(依照本发明，定向部分(例如，适体)可以包括RNA、DNA或任何基于低聚核苷酸修饰的核酸。)
本发明关于适体-siRNA嵌合的RNAs进行如下说明其：i)特异地结合前列腺癌细胞(和绝大多数表达细胞表面受体PSMA的实体瘤的血管内皮(由于要利用RNA适体对于人PSMA(A10)的选择性(Lupold等，Cancer Res.62(14)：4029-33(2002))，并且ii)传递定向于polo样激酶1(Plk1)(Reagan-Shaw和Ahmad，FASEB J.19(6)：611-3(2005))和Bcl2(Yang等，Clin Cancer Res.10(22)：7721-6(2004))(在许多人肿瘤上过表达的两个残存基因(Takai等，Oncogene 24(2)：287-291(2005)，Eckerdt等，Oncogene 24(2)：267-76(2005)，Cory和Adans，癌细胞8(1)：5-6(2005))的治疗性siRNAs。这些嵌合的RNAs作为Dicer酶的底物，引导siRNAs进入RNAi通路并且使它们同源的mRNAs沉默(图1A)。(因此实际上嵌合的适体-siRNAs可以视为引起Dicer酶裂解反应的适体-presiRNAs。)可以预料，下面的例子中所描述的特异试剂可以应用于治疗前列腺癌及其他癌症。
但是，本发明并不限于对PSMA特异的嵌合体。更准确地说，除了癌症之外，本发明的方法还可以适合于治疗多种疾病。本方法适用于特定疾病的两个必要条件是在某一规定的细胞数量中使特定的基因沉默，由此产生治疗效果，以及所关心的细胞集群上特异性表达表面受体，使得RNA配体可以传递到细胞内。许多疾病满足这两个必要条件(例如抑制HIV的CD4+T细胞、胰岛素受体和糖尿病、肝受体细胞和肝炎基因等等)。
适当的定向和沉默部分可以基于被定向的分子和要被沉默的基因(们)的性质，利用本领域公知的方法进行设计/选择(参见Nimjee等，Annu.Rev.Med.56：555-83(2005)和美国公开申请号20060105975)。嵌合体可以利用本领域公知的RNA合成法进行合成(例如，通过化学合成法或通过RNA聚合酶合成)。以高亲合力与多种目标结合的短的RNA适体(25-35碱基)已经有所记载(Pestourie等，Biochimie(2005)，Nimjee等，Annu.Rev.Med.56：555-83(2005))。所设计的带有这种短适体的嵌合体的长度大约45-55个碱基。用化学合成的RNA可以有多种修饰，例如，聚乙二醇化，这可以改变其在体内的半衰期和生物有效率。(例如，参见美国申请第20020086356、20020177570、20060105975和20020055162号，以及美国专利号第6,197,944、6,590,093、6,399,307、6,057,134、5,939,262和5,256,555号)；另外，参见Manoharan，Biochem.Biophys.Acta 1489：117(1999)Herdewijn，反义核酸药物发展10：297(2000)；Maier等，Organic Letters 2：1819(2000)，以及它们所引用的文献。)
本发明的嵌合体可以配制成药物组合物，该组合物除嵌合体之外，还可以包括药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。组合物的准确特征至少部分取决于嵌合体的性质和给药途径。最佳的剂量配置很容易由本领域技术人员建立，并且可以随嵌合体、患者以及要获得的效果而变化。通常，嵌合体可以通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下给药，言而总之，视情况而定。
实际上，本发明的定向传递方法可以避免与siRNAs传递入非靶细胞相关的有害的副作用。例如，众所周知siRNAs可以活化浆细胞树状细胞内的toll样受体，引起干扰素分泌，这可以导致多种有害症状(Sledz等，Nat.Cell Biol.5(9)：834-9(2003)，Kariko等，J.Immunol.172(11)：6545-9(2004))。至于传递引起凋亡的siRNAs，利用本发明的方法所能避免的另一个危险是杀死健康细胞。可以预料，利用本发明的嵌合体进行全身性治疗，由于减少了被非靶细胞的吸收，只需要(与非定向试剂相比)较少量定向试剂(例如，siRNA)。因此，本发明的方法实质上可以降低治疗成本。
由于RNA被认为相比蛋白质具有较小的免疫原性，因此可以预料，本发明的嵌合RNAs所产生的免疫系统的非特异性活化比起蛋白质介导的传递方式要弱。这可能是一个重要的区别，因为众所周知，当前用来治疗的很多蛋白质有时候会导致危险的变态反应，尤其是在重复给药时(Park，Int.Anesthesiol.Cl9in.42(3)：135-45(2004)，Shepherd，Mt.Sinai J.Med.70(2)：113-25(2003))。
Kim等曾经提出，Dicer酶介导的RNAs加工可以导致其产生的siRNAs加入RISC复合物的效率更高(Kim等，Nat.Biotechnol.23(2)：222-6(2005))。该意见是基于以下观测到的现象，即被Dicer酶加工的长链RNAs(～29bps)与不被Dicer酶加工的siRNAs(19-21bps)相比，可以在更低的浓度下消耗其相应的mRNAs。因此，在不希望被理论所束缚的情形下，可以推测，由于本发明的嵌合体被Dicer酶所加工，它们与不被Dicer酶加工的19-21bps的dsRNA相比，可能在使基因沉默的能力方面更加有效。
本发明的嵌合体的优势：
i)识别一种细胞表面受体，
ii)内化到表达该受体的细胞中，并且
iii)被miRNA或siRNA加工机器(例如Dicer酶)所识别。另外，裂解的siRNA产物可以进入一种RNAi或miRNA沉默复合物(例如RISC)。因此，至少在一个优选的方案中，本发明的嵌合体的加工模拟细胞对miRNAs的识别和加工(例如，嵌合RNAs可以是Dicer酶的底物)。(参见McNamara等，自然生物工艺学24：1005-1015(2006)。)
本发明的某些方面在下面的非限制性实施例中作进更详细的描述。
实施例
实验细节
除非另作说明，所有的化学制剂购买自Sigma-Aldrich公司，所有的限制酶购自新英格兰BioLabs公司(NEB)，所有的细胞培养产品购买自Gibco BRL/生活工艺公司，它是Invitrogen公司的分公司。
siRNAs
con siRNA定向序列：AATTCTCCGAACGTGTCACGT
Plk1 siRNA定向序列：AAGGGCGGCTTTGCCAAGTGC
Bcl-2 siRNA定向序列：NNGTGAAGTCAACATGCCTGC
Dicer siRNA定向序列NNCCTCACCAATGGGTCCTTT
(其中“N”是A，T，G或C中的任意一种)
以FITC在反义链的5’末端进行荧光标记的siRNAs购自Dharmacon公司。
适体-siRNA嵌合体
A10：
5′GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAU
CGGCAGACGACUCGCCCGA3′
A10-CON有义链：
5′GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAU
CGGCAGACGACUCGCCCGAAAUUCUCCGAACGUGUCACGU3′
A10-CON反义siRNA：5′ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT3′
A10-Plk1有义链：
5′GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAU
CGGCAGACGACUCGCCCGAAAGGGCGGCUUUGCCAAGUGC3′
A10-Plk1反义siRNA：5′GCACUUGGCAAAGCCGCCCdTdT3′
A10-Bcl-2有义链：
5′GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAU
CGGCAGACGACUCGCCCGAAAGUGAAGUCAACAUGCCUGC3′
A10-Bcl-2反义siRNA：5′GCAGGCAUGUUGACUUCACUU-3′
mutA10-Plk1有义链：
5’GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUCCUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAU
CGGCAGACGACUCGCCCGAAAGGGCGGCUUUGCCAAGUGC3′
A10-Plk1反义siRNA：5′GCACUUGGCAAAGCCGCCCdTdT3′
A105′-引物：5′TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG3′
A103′-引物：5′TCGGGCGAGTCGTCTG3′
A10模板引物：
5′GGGAGGACGATGCGGATCAGCCATGTTTACGTCACTCCTTGTCAATCCTCATCG
GCAGACGACTCGCCCGA3′
对照siRNA 3′-引物：5′ACGTGACACGTTCGGAGAATTTCGGGCGAGTCGTCTG3′
Plk1 siRNA 3′-引物：5′GCACTTGGCAAAGCCGCCCTTTCGGGCGAGTCGTCTG3′
Bcl-2 siRNA 3′-引物：5′GCAGGCATGTTGACTTCACTTTCGGGCGAGTCGTCTG3′
A10突变体引物：5′AGGACGATGCGGATCAGCCATCCTTACGTCA3′
双链DNA模板按下述的PCR方法产生。A10模板引物用作PCRs的模板，并且利用A105′-引物和下列之一的3′-引物：A103′-引物(用于A10适体)，对照siRNA3′-引物(用于A10-CON嵌合体)，Plk1siRNA3′-引物(用于A10-Plk1嵌合体)或者Bcl-2siRNA3′-引物(用于A10-Bcl-2嵌合体)。用于转录的模板以上述方式产生，或者将上述PCR产物转染到T-A克隆载体(pGem-t-easy，Promega(Madison，WI))中，并且利用克隆作为与适当的引物进行PCR的模板。
利用连续PCRs制备编码mutA10-Plk1的DNA。在第一轮反应中，A10模板引物用作A10突变体引物的模板，其中用到5′-引物，并且Plk1siRNA 3′-引物用作3′-引物。该反应的产物经纯化，用作第二轮与A10 5′-引物和Plk1siRNA 3′-引物反应的模板。得到的PCR产物克隆到pGem-t-easy中并测序。该克隆被用作与A10 5′-引物和Plk-1 3′-引物进行PCR的模板，并产生转录的模板。在体外对荧光标记的适体和适体-siRNA嵌合体在5’-(FAM)(间隔区9)-G-3’(FAM-标记的G)(TriLink公司)存在的情况下进行如下所述的转录。
体外转录
转录在有或没有4mM FAM-标记G的存在下进行。对于250μL转录反应体系包括：50μL优化的用于2’F转录反应的5X T7 RNAP缓冲液(20％ w/v PEG 8000，200mMTris-HCl pH 8.0，60mM MgCl2，5mM盐酸亚精胺，0.01％ w/v triton X-100，25mM DTT)，25μL 10X 2’F-dNTPs(30mM 2’F-CTP，30mM 2’F-UTP，10mM 2’OH-ATP，10mM 2’OH-GTP)，2μL IPPI(Roche公司)，300皮摩尔适体-siRNA嵌合体PCR模板，3μLT7(Y639F)聚合酶(Padilla和Sousa，Nucleic Acids Res.27(6)：1561-3(1999))，用超纯水补足至250μL。
RNA二级结构预测
RNA结构程序4.1译本(rna.chem.rochester.edu/RNAstructure)A10适体、A10-3以及A10适体-siRNA嵌合体衍生物的二级结构。比较对于每种低聚RNA具有最低自由能的最稳定的结构。
细胞培养
将HeLa细胞培养在37℃，含有5％ CO2，并且补充有10％小牛血清的DMEM中。前列腺癌细胞系LNCaP(ATCC# CRL-1740)和PC-3(ATCC# CRL-1435)分别培养补充有10％小牛血清在RPMI 1640和Ham’s F12-K培养基中(FBS)。
PSMA细胞表面表达
PSMA细胞表面表达是利用流式细胞术和/或人PSMA特异性抗体免疫印迹进行测定。流式细胞术：将HeLa细胞、PC-3细胞和LNCaP细胞用胰蛋白酶处理，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次，用血细胞计数器计数。将200,000个细胞1 X 106细胞/mL重悬浮于500μl PBS+4％小牛血清(FBS)中，室温下保温20分钟。然后将细胞沉淀，重悬浮于100μL的PBS+4％ FBS中，其中含有20μg/mL的初级抗PSMA抗体(抗-PSMA 3C6：西北Biotherapeutics公司)或者20μg/mL的同种型特异性对照抗体。室温下保温40分钟后，将细胞用500μL的PBS+4％ FBS洗三次，并与用PBS+4％ FBS进行1:500稀释的次级抗体(抗小鼠IgG APC)稀释液于室温下一起保温30分钟。细胞按上述方法洗涤，用400μL PBS+1％甲醛固定，利用流式细胞术进行分析。免疫印迹：将HeLa细胞、PC-3细胞和LNCaP细胞按上述方法收集。细胞沉淀重悬浮于包含1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma)的1X RIPA(150mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0，1mMEDTA，1％ NP-40)缓冲液中，并在冰上放置20分钟。然后使细胞沉淀，上清中25μg的总蛋白溶解于7.5％ SDS-PAGE凝胶中。利用人PSMA特异性的抗体(抗-PSMA 1D11；西北Biotherapeutics公司)对PSMA进行检测。
适体-siRNA嵌合体的细胞表面结合
PC-3或LNCaP细胞用胰蛋白酶处理，用500μL PBS洗两次，并用400μL的固定溶液(PBS+1％甲醛)于室温下固定20分钟。洗涤细胞除去所有剩余的甲醛痕迹后，将细胞沉淀重悬浮于1X结合缓冲液(1XBB)(20mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，2mMCaCl2，0.01％ BSA)中，并于37℃保温20分钟。然后使细胞沉淀，并重悬浮于50μL的1XBB(在37℃下预保温)，其中含有400nM FAM-G标记的A10适体或者400nMFAM-G标记的适体-siRNA嵌合体。由于在转录反应中FAM-G的参入效率低，为了比较A10-Plk1和mutA10-Plk1与细胞表面的结合，最高可加入10μM FAM-G标记的适体嵌合体。用于测量相对亲合力的FAM-G标记的适体和适体-siRNA嵌合体的浓度范围是0至4μM。细胞在37℃下与RNA保温40分钟，用预先在37℃保温的500μL 1XBB洗三次，最后重悬浮于预先在37℃保温的400μL固定溶液中。然后利用流式细胞术对细胞按照上述方法进行分析，确定A10适体和A10适体-siRNA嵌合体衍生物与细胞表面结合的相对亲合力。
细胞表面结合竞争试验
按以上所述制备LNCaP细胞，用于细胞表面结合试验。4μM的FAM-G标记的A10适体或A10适体-siRNA嵌合体衍生物与预先在37℃保温的1XBB中的未标记的A10适体(浓度变化范围0至4μM)或者2μg溶于PBS+4％ FBS中的抗-PSMA3C6抗体进行竞争。细胞按上面所述洗三遍，固定于400μL固定溶液(PBS+1％甲醛)中，并用流式细胞术分析。
5-α-二氢睾酮(DHT)处理
将LNCaP细胞培养在含5％碳吸附血清的RPMI 1640培养基中24小时，然后向含有5％碳吸附胎牛血清的RPMI 1640培养基加入2nM 5-α-二氢睾酮(DHT)(Sigma公司)，将细胞培养48小时。利用前面所详细描述的免疫印迹法评价PSMA的表达。利用如上所述的流式细胞术对PSMA在细胞表面的表达进行分析。FAM-G标记的A10适体和FAM-G标记的A10-CON、A10-Plk1、以及mutA10-Plk1适体嵌合体与细胞表面的结合也利用40μM的FAM-G标记的RNA按照前面的描述进行分析。
基因沉默试验
siRNA：(第一天)将PC-3和LNCaP细胞以60％的融合率接种在6孔板中。在第2天和第4天，利用Superfect试剂(Qiagen公司)按照厂家的介绍以200nM或者400nM的siRNA转染细胞。在第5天收集细胞讲行分析。A10适体和A10适体-siRNA嵌合体：(第一天)将PC-3和LNCaP细胞以60％的融合率接种在6孔板中。在第2天和第4天用400nM A10适体或A10适体-siRNA嵌合体对细胞进行处理。在第5天收集细胞进行分析。
利用流式细胞术或利用人Plk1(Zymed公司)和人Bcl-2(Zymed公司)特异性抗体的免疫印迹法分别对基因沉默进行评价。流式细胞术：用胰蛋白酶处理PC-3和LNCaP细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗三遍，并用血细胞计数器进行计数。将200,000个细胞(5 X 105细胞/mL)重悬浮在400μl PERM/固定缓冲液(Phar分钟gen公司)中，并在室温(RT)下保温20分钟。然后使细胞沉淀，并用1XPERM/清洗缓冲液(Pharmingen公司)洗三遍。然后将细胞重悬浮在50μL的1XPERM/清洗缓冲液中，该缓冲液含有20μg/mL抗人Plk1或人Bcl-2初级抗体，或者20μg/mL的同种型特异性对照抗体。在室温下孵育40分钟后，用500μL1XPERM/清洗缓冲液将细胞洗三遍，与次级抗体(抗小鼠IgG-APC)的1:5001XPERM/清洗稀释液在室温下保温30分钟。然后对细胞进行如上所述的流式细胞术分析。免疫印迹：用对照siRNA、或者针对Plk1或Bcl-2的siRNAs，按照前面所述的方法转染LNCaP细胞。用胰蛋白酶处理细胞，在PBS中清洗，然后将细胞沉淀重悬浮于1X RIPA缓冲液中，并在冰上放置20分钟。然后使细胞沉淀，从上清中取50μg总蛋白，对于Plk1，使其溶解在8.5％ SDS-PAGE凝胶中；对于Bcl-2，使其溶解在15％ SDS-PAGE凝胶中。利用对人Plk1特异性抗体(Zymed公司)检测Plk1。利用对人Bcl-2特异性抗体(Dykocytomation公司)检测Bcl-2。
扩增(DNA合成)试验
首先将PC-3和LNCaP细胞按前面所述用siRNAs或适体-siRNA嵌合体进行处理，然后将细胞用胰蛋白酶处理并以～20,000细胞/孔接种在12孔板中。然后通过添加0.5μM羟基脲(HU)使细胞进入G1/S阻断。21小时后，通过添加不含HU的培养基使细胞的HU阻断解除，并在含有3H-胸苷的培养基(1μCi/mL培养基)中保温以监测DNA合成。在含有3H-胸苷的培养基孵育24小时后，将细胞用PBS清洗两次，用5％ w/v三氯乙酸(TCA)(VWR)洗一次，收集在0.5mL的0.5N NaOH(VWR)中，并放置在闪烁管中测量3H-胸苷的参入。
活性半胱氨酸蛋白酶3试验
按照前面所述的方法，用针对Plk1或Bcl-2的siRNAs转染PC-3或LNCaP细胞，或者用A10适体-siRNA嵌合体处理细胞。细胞也同样用含有100μM(1X)或200μM(2X)顺铂的培养基处理30小时作为凋亡的阳性对照。然后将细胞固定，并按照厂商Pharmingen公司)的方案，用PE-缀合的对于解离的半胱氨酸蛋白酶3特异的抗体对活化的半胱氨酸蛋白酶进行染色。利用流式细胞术测定PE阳性细胞的百分比作为凋亡的度量。
Dicer酶siRNA
将HeLa细胞接种在6孔板中，每孔接种200,000细胞。24小时后，按照前面所述的方法，利用Superfect试剂使400nM的对照siRNA或者针对人Dicer酶的siRNA转染到细胞中。然后收集细胞，并按照前面所述的方法，利用对人Dicer酶特异性的抗体(IMX-5162；IMGENEX公司)，通过流式细胞术对Plk1和Bcl-2进行分析。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
将HeLa细胞接种在6孔板中，每孔接种200,000细胞。24小时后，按照前面所述的方法，利用Superfect试剂使400nM的对照、非沉默siRNA或者针对人Dicer酶的siRNA转染到细胞中。收集细胞，用含有1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma公司)的1XRIPA缓冲液裂解细胞，并在冰上放置20分钟。然后在ELISA 96孔板的每个孔中加入100μL的细胞溶解产物，并在室温下保温24小时。用300μL的1XRIPA将孔清洗三遍，与100μL的人Dicer酶初级抗体在1XRIPA中的1:200的稀释液保温2小时。如上所述清洗孔，然后与100μL的抗兔IgG-HRP次级抗体在1XRIPA中的1:200稀释液保温1小时。将孔进行如上所述的清洗，然后加入100μL的TMB底物溶液(PBL生物医学实验室)。20分钟后，向各孔中加入50μL的1M H2SO4(终止溶液)，用孔板读数器测量各孔的OD450-OD540值。
体内Dicer酶试验
将LNCaP细胞接种在6孔板中，每孔接种200,000细胞。24小时后，按照前面所述的方法利用Superfect转染试剂，用400nM的对照siRNA、400nM的Plk1siRNA、400nM A10适体、或400nM的A10适体-siRNA嵌合体单独地、或者与针对人Dicer酶的siRNA共转染细胞。然后收集细胞，并利用人Plk1特异性抗体按照前面所述的方法对细胞进行流式细胞术分析。
体外Dicer酶试验
利用重组Dicer酶，按照厂商的要求(重组人Turbo Dicer酶试剂盒；GTS公司)(Myers等，Nat.Biotechnol.21(3)：324-8(2003))对1-2μg的A10适体或A10适体-siRNA嵌合体进行消化。ssA10-CON和ssA10-Plk1对应于没有互补反义siRNA链的适体-siRNA嵌合体。然后使消化产物在15％非变性PAGE凝胶上分散开，并用溴化乙锭染色，然后利用GEL.DOCXR(BioRad公司)凝胶成像系统进行观察。或者，将1-2μg的A10适体或A10适体-siRNA嵌合体有义链与32P-末端标记的互被反义siRNAs(探针)退火。利用T4多核苷酸激酶β(NEB公司)，按照厂商的要求对siRNAs进行末端标记。反义siRNA与A10适体不互补。A10或退火后的嵌合体(A10-CON或A10-Plk1)在有或者没有Dicer酶的情况下保温，然后按照前面所述的方法使其在15％非变性PAGE凝胶上分散开。使凝胶干燥，在BioMAX MR胶片(柯达公司)上曝光5分钟。
干扰素试验
利用人干扰素βELISA试剂盒，按照厂商的要求(PBL生物医学实验室)检测处理或未处理过的PC-3和LNCaP细胞分泌的IFN-β。简单来说，先将细胞接种在6孔板中，每孔接种200,000细胞。24小时后，利用Superfect转染试剂(Qiagen公司)和不同量的聚(I:C)(2.5，5，10，15μg/ml)的混合物共转染细胞作为干扰素β的阳性对照，或者利用Superfect转染试剂和con siRNAs或Plk1或Bcl2的siRNAs(200nm或者400nm)的混合物共转染细胞。另外，按照前面所述的方法分别用400nM的A10适体和A10适体-siRNA嵌合体处理细胞。经各种处理48小时后，从每个处理组中取100μL的上清液加入96孔板中，并在室温下保温24小时。按照厂商的要求，利用人INF-β特异性抗体检测上清中INF-β的存在。
活体试验
裸鼠(nu/nu)获自杜克大学的癌症中心隔离设备公司(CCIF)，并按照美国农业部和美国实验动物照护评鉴协会(AAALAC)建立的准则喂养在无菌的环境中。该计划经过杜克大学的中央研究院动物使用及管理委员会(IAUCUC)批准。给每只小鼠在其肋部皮下注射在体外增殖的5 X 106个PC-3或者LNCaP细胞(悬浮在100μl的50％基质胶中)。大约三十二个直径超过1cm的非坏死性肿瘤随机分为四个处理组，每组八只小鼠，进行如下处理：第1组，不进行处理(DPBS)；第2组，用A10-CON嵌合体进行处理(200pmols/注射X10)；第3组，用A10-Plk1嵌合体处理(200pmols/注射X10)；第4组，用mut-A10-Plk1嵌合体处理(200pmols/注射X10)。75μL的化合物隔日注射到肿瘤内，共20天。第一次注射记为第0天。注射的体积小到足以排除化合物，由于非特异性高压注射而进入细胞内。用卡钳每隔三天测量一次肿瘤的三维大小。下列公式用于计算肿瘤体积：VT＝(WXLXH)X0.5236(W，最短尺寸；L，最长尺寸)。绘制平均肿瘤体积±SEM的成长曲线。最后一次处理后3天用安乐死终止实验，这时将肿瘤切除，并用福尔马林固定，用于免疫组织化学分析。
统计分析
利用单因素方差分析进行统计分析。AP值小于或等于0.05被认为代表显著差异。除单因素方差分析外，利用双尾非成对t检验比较每个处理组与其它每个的处理组。对于肿瘤表达的PSMA，第3组在第12、15、18和21天(A10-Plk1)与第1组(DPBS)、第2组(A10-CON)和第4组(mutA10-Plk1)显著不同，P<0.01。第2组(A10-CON)与第4组(mutA10-Plk1)和DPBS对照组在整个处理期间没有明显差别，P>0.05。对于PSMA阴性的肿瘤，各组间没有显著差异。
结果
A10适体-siRNA嵌合体
产生适体-siRNA嵌合RNAs是为了使siRNAs特异性地定向到表达细胞表面受体PSMA的细胞上。嵌合体的适体部分(A10)介导与PSMA的结合。siRNA部分的目标是抗凋亡基因，例如Plk1(A10-Plk1)和Bcl2(A10-Bcl2)。非沉默siRNA被用作对照(A10-CON)。RNA结构程序(4.1版)被用来预测A10和A10适体-siRNA嵌合体衍生物的二级结构(图1B)。为了预测A10中与PSMA有关的区域，比较了所预测的A10和截断的A10适体、A10-3的二级结构(数据未显示)(Lupold等，Cancer Res.62(14)：4029-33(2002))。由于A10-3也结合PSMA，A10-3内保留的结构元件很可能是结合PSMA所必需的(图1B中深红色框住部分)。适体-siRNAs的预测结构保留了该预测的PSMA结合元件，我们认为它们也保留了PSMA结合功能(图1B，显示A10-Plk1)。作为对照，在该区域内发生了两个点突变(mutA10-Plk1)，推测其破坏了推定的A10适体的PSMA结合部分(图1B，显示为蓝色)。
A10适体-siRNA嵌合体特异地结合表达PSMA的细胞
首先，检测A10适体-siRNA嵌合体结合表达PSMA的细胞表面的能力。以前，PSMA已经被证明在LNCaP细胞表面表达，但不在PC-3细胞(一种不同的前列腺癌细胞)表面表达，该发现利用流式细胞术和免疫印迹进行检验(图7)。为了确定A10适体-siRNA嵌合体是否能够结合细胞表面表达的PSMA，用荧光标记的A10、A10-CON、或A10-Plk1与LNCaP或者PC-3细胞进行保温(图1C)。A10和A10适体-siRNA嵌合体与LNCaP细胞的特异性结合依赖于预测的A10适体中与PSMA结合的区域，因为mutA10-Plk1不能与之结合(图1D)。此外，我们发现适体-siRNA嵌合体和A10适体结合LNCaP细胞表面的亲合力接近(图8)。
为了检验A10适体-siRNA嵌合体与PSMA的实际结合，使LNCaP细胞与1μM的荧光标记的A10、A10-CON、或A10-Plk1RNA保温，并与逐渐增加(从0μM到4μM)的未标记的A10适体竞争(图2A)，或者与对人PSMA特异性抗体进行竞争(图2B)。在逐渐增加的竞争剂存在的情况下结合的荧光标记的RNAs用流式细胞术进行评价。标记的A10适体和A10适体-siRNA嵌合体(A10-CON和A10-Plk1)和LNCaP细胞的结合与未标记的A10或者抗PSMA抗体同样发生竞争，说明这些RNAs结合LNCaP细胞表面的PSMA。为了进一步证实适体-siRNA嵌合体的靶标确实是PSMA，测试嵌合体与用5-α-二氢睾酮(DHT)预先处理的LNCaP细胞的结合，因为已经发现DHT能降低PSMA的表达(Israeli等，Cancer Res.54(7)：1807-11(1994))。DHT介导的PSMA基因表达抑制用流式细胞术和免疫印迹进行评价(图2C，上图)。用2nM DHT处理LNCaP细胞48小时大大减低了PSMA的表达。用流式细胞术测得PSMA在细胞表面表达从73.2％降低到13.4％，并与A10和A10适体-siRNA嵌合体(A10-CON和A10-Plk1)与LNCaP细胞的结合相关(图2C)。正如所料，mutA10-Plk1不与DHT处理后的LNCaP细胞表面结合(图2C)。
适体-siRNA嵌合体特异性沉默基因表达
为了确定适体-siRNA嵌合体是否能够使目标基因的表达沉默，用A10适体-siRNA嵌合体将针对Plk1的siRNAs(Reagan-Shaw and Ahmad，FASEB J.19(6)：611-3(2005))或Bcl2的siRNAs(Yano等，Clin.Cancer Res.10(22)：7721-6(2004))传递到表达PSMA的细胞(图3)。在没有转染试剂的情况下，用适体-siRNA嵌合体A10-Plk1处理PC-3和LNCaP细胞(图3A)，或者用A10-Bcl-2处理细胞(图3B)。Plk1和Bcl-2基因的沉默用流式细胞术和/或免疫印迹进行评价。与非定向siRNAs的转染(图9)不同的是，A10-Plk1和A10-Bcl-2的沉默作用对于LNCaP细胞表达的PSMA是特异性的，并与LNCaP细胞吸收的荧光标记的适体-siRNA嵌合体相关(图3A和3B)。Plk1和Bcl-2蛋白的细胞类型特异性减少表明siRNAs借助于嵌合体的适体部分特异地传递到表达PSMA的细胞中。为了进一步检验A10适体-siRNA嵌合体的沉默作用确实依赖于PSMA，使LNCaP细胞在加入A10-Plk1前与或者不与2nM DHT共同保温48小时(图3C)。在DHT的细胞中，被细胞吸收的A10-Plk1以及使Plk1基因表达的沉默明显地下降。这些数据，与细胞表面结合数据一起，共同说明了细胞类型特异的沉默依赖于细胞表面表达的PSMA。
适体-siRNA嵌合体抑制表达PSMA的细胞增殖并诱导凋亡
为了确定定位致癌基因和抗凋亡基因的适体-siRNA嵌合体是否能够达到减低细胞增殖和诱导凋亡的目的，这些细胞用嵌合体处理后测定其细胞代谢过程。用A10-CON或A10-Plk1适体-siRNA嵌合体处理PC-3和LNCaP细胞(图4A)，并用3H-胸苷的参入来度量细胞增殖。在LNCaP细胞中，细胞的增殖被A10-Plk1有效地降低，但不被A10-CON嵌合体所抑制。该效果对于表达PSMA的细胞是特异性的，因为在PC-3细胞中没有发现这种现象。殖增的降低程度与利用阳离子脂质体来转染Plk1siRNA的时候观察到的几乎是相同的，即使不使用转染试剂来传递适体-siRNA(图4A)。.
另外，还评价了A10-Plk1和A10-Bcl-2嵌合体诱导表达PSMA的前列腺癌细胞凋亡的能力(图4B和4C)。通过添加A10、A10-CON、A10-Plk1、或A10-Bcl2到培养基中，或者用阳离子脂质体转染针对Plk1或者Bcl2的siRNAs来处理PC-3和LNCaP细胞。通过流式细胞术测量产生的活化的半胱氨酸蛋白酶3(Casp3)来评价凋亡。转染针对Plk1和Bcl-2的siRNAs诱导PC-3和LNCaP细胞凋亡，但是适体-siRNA嵌合体只特异性地诱导LNCaP细胞的凋亡，并且不需要转染试剂。用顺铂处理的PC-3和LNCaP细胞被用作凋亡的阳性对照。
通过RNAi通路发生的适体-siRNA介导的基因沉默
接下来，确定适体-siRNA嵌合体沉默基因表达的机制是否依赖于Dicer酶活力。为此，利用针对人Dicer酶的siRNA来降低Dicer酶蛋白水平(Doi等，Curr.Biol.13(1)：41-6(2003))(图10)。然后，检验A10-Plk1嵌合体介导的基因沉默是否信赖Dicer酶表达。用A10适体或适体-siRNA嵌合体(A10-CON或A10-Plk1)单独或共同与Dicer酶siRNA共同转染LNCaP细胞(图5A)。A10-Plk1嵌合体导致的Plk1基因表达的沉默被共同转染的Dicer酶siRNA所抑制(图5A，上图)，这说明适体-siRNA嵌合体介导的基因沉默依赖于Dicer酶，并且经由RNAi通路发生。相反，象期望的那样，Dicer酶的抑制对于Plk1siRNA介导的沉默无效(图5A，下图)，因为长度为21-23nt的siRNAs已被证实是绕过了Dicer酶步骤(Murchison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(34)：12135-40(2005)，Kim等，Nat.Biotechnol.23(2)：222-6(2005))。
为了检验适体-siRNA嵌合体是否直接被Dicer酶解离，产生对应于嵌合结构中的siRNA序列的21-23nt的siRNA片段，将RNAs用重组Dicer酶在体外进行消化，将产生的片段用非变性PAGE分散开(图5B和5C)。如图5B所示，适体-siRNA嵌合体(A10-CON或A10-Plk1)，而不是A10或更长的适体-siRNA嵌合体(ssA10-CON或ssA10-Plk1)单链有义链能被Dicer酶消化，释放出长度为21-23nt的片段。为了验证这些长度为21-23nt的Dicer酶片段相当于对照和Plk1siRNAs，将A10适体-siRNA嵌合体与互补的32P-末端标记的siRNAs的反义链一起退火进行标记，并且与或者不与重组Dicer酶共同保温(图5C)。用重组Dicer酶对标记的A10-CON或A10-Plk1进行消化导致长度为21-23nt的片段释放，其保持着32P-末端标记反义链，这说明这些片段实际上是适体-siRNA嵌合体的siRNA部分。
适体-siRNA嵌合体不会触发干扰素应答
多个研究小组已经报道说，传递siRNAs有可能活化非特异性的炎性应答，产生细胞毒性(Sledz等，Nat.Cell Biol.5(9)：834-9(2003)，Kariko等，J.Immunol.172(11)：6545-9(2004))。为此，我们利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对PC-3和LNCaP细胞产生的INF-β进行了定量，这些细胞未经处理，用针对Plk1或Bcl-2的siRNAs转染，或者用适体-siRNA嵌合体处理(图11)。在这些实验条件下用siRNAs或者适体-siRNA嵌合体处理没有诱导产生INF-β，说明向细胞传递适体-siRNA嵌合体不会触发实质上的干扰素反应。
A10-Plk1介导小鼠模型中前列腺癌症的肿瘤退化
接下来，我们对A10-Plk1嵌合体在产生PSMA阳性的人前列腺癌细胞(LNCaP)或者PSMA阴性的人前列腺癌细胞(PC-3)肿瘤的裸鼠中的效率和特异性进行了研究(图6)。向裸鼠注射LNCaP或者PC-3细胞，使肿瘤生长，在最大的维度上直径达到1cm。然后(在第0天)将肿瘤与DPBS单独或者与嵌合的RNAs(A10-CON、A10-Plk1、或者mutA10-Plk1)每隔一天进行注射，共注射10次。每隔三天测量一次肿瘤大小。PC-3肿瘤的体积在任何一次处理时都没有差异，说明嵌合的RNAs对其没有任何特异性细胞杀伤效果。相反，可以观察到用A10-Plk1嵌合体处理过的LNCaP肿瘤的体积有显著减小。实际上，从第6天至第21天，各种对照处理的肿瘤体积增加了3.63倍(n＝22)，而A10-Plk1处理的肿瘤体积减小了2.21倍(n＝8)。LNCaP肿瘤体积的缩小对于A10-Plk1具有特异性，而DPBS处理或者A10-CON或mutA10-Plk1嵌合体RNAs处理的肿瘤都没有观察到该现象。重要的是，在用嵌合的RNAs处理20天后没有发现动物发病或者死亡，这说明在这些实验条件下，这些化合物对于动物是无毒的。
总的来说，我们已经开发出了适体-siRNA嵌合体，并且发现了它的特性，即定向于特定的细胞类型并作为Dicer酶的底物从而引起细胞类型特异性的基因沉默。在上面描述的研究中，表达细胞表面受体PSMA的癌细胞中的抗凋亡基因被RNAi特异地定向。消耗所定向的基因产物导致培养的靶细胞的扩增减少，以及凋亡增加(图4)。嵌合RNAs的细胞定向是由嵌合体的适体部分与细胞表面的PSMA的交互作用介导的。重要的是，一种在适体中与结合PSMA相关的区域内部产生两个点突变的突变体嵌合RNA导致结合活力降低(图1D)。结合特异性进一步被不表达PSMA的PC-3细胞，以及用5-α-二氢睾酮处理后PSMA被耗尽的LNCaP细胞不能被嵌合体定向所证实，而未处理的表达PSMA的LNCaP细胞能够被定向(图2C)。另外，PSMA特异性抗体竞争嵌合体与LNCaP细胞表面的结合(图2B)。
我们已经证实嵌合的RNAs产生的基因沉默依赖于RNAi通路，因为其需要Dicer酶，该酶是核酸内切酶，在RISC复合物装配前加工dsRNAs(图5A)。Dicer酶也能使双链的，嵌合体的基因定向部分从适体部分解离下来，预期该步骤发生在这些试剂的短链参入RISC复合物之前(图5B和5C)。
重要的是，该siRNA传递方法能够有效地介导小鼠模型中前列腺癌症的肿瘤退缩(图6)。因此，RNA嵌合体适合于在小鼠体内的肿瘤已经产生的情况下定向，在将来，其有可能被证明可用于治疗人前列腺癌症。这些试剂在体内和体外对于PSMA的表达表现出同样的特异性，而PSMA阴性的PC-3肿瘤在经过处理后没有退缩。值得注意的是用于制备嵌合体的RNA的适体有义链嘧啶经2′-氟代修饰，以免被细胞外的RNA酶快速降解，这可能对于它们在体内(和体外在有血清存在时)的表现是必不可少的(Allerson等，J.Med.Chem.48(4)：901-4(2005)，Layzer等，RNA 10(5)：766-71(2004)，Cui等，J.Membr.Biol.202(3)：137-49(2004))。
虽然已经有过多种向细胞传递siRNAs的方法的记载，但是绝大部分方法完成的传递都是非特异性的(Yano等，Clin Cancer Res.10(22)：7721-6(2004)，Fountaine等，CurrGene Ther.5(4)：399-410(2005)，Devroe和Silver，Expert Opin Biol Ther.4(3)：319-27(2004)，Anderson等，AIDS Res Hum Retroviruses.19(8)：699-706(2003)，Lewis和Wolff，MethodsEnzymol.392：336-50(2005)，Schiffelers等Nucleic Acids Res.32(19)：e149(2004)，Urban-Klein等，Gene Ther.12(5)：461-6(2005)，Soutschek等，Nature 432(7014)：173-8(2004)，Lorenz等，Bioorg Med Chem Lett.14(19)：4975-7(2004)，Minakuchi等，NucleicAcids Res.32(13)：e109(2004)，Takeshita等，Proc Natl Acad Sci USA.102(34)：12177-82(2005))。因此，特定类型的细胞传递siRNAs是一个决定性的目标，因为该技术在治疗中出于安全性和成本的考虑具有广泛的适用性。
上面所引用的所有的文件及其它信息源籍引用全部纳入本发明。

Claims (12)

1、一种嵌合分子，其包括一个核酸定向部分和一个RNA沉默部分，其中所述分子是Dicer酶的底物。
2、根据权利要求1所述的分子，其中所述定向部分是一种适体。
3、根据权利要求1所述的分子，其中所述定向部分定向于细胞表面受体。
4、根据权利要求1所述的分子，其中的定向部分定向于PSMA、Plk1或Bcl2。
5、根据权利要求1所述的分子，其中所述分子是一种RNA分子。
6、根据权利要求1所述的分子，其中所述分子包括一种适体和一种pre-siRNA，一种适体和一种shRNA，一种适体和一种pre-miRNA，或者一种适体和一种pri-miRNA。
7、一种组合物，其包括权利要求1的分子和一种载体。
8、一种往细胞定向传递RNA沉默部分的有效方法，包括使一种含有被定向部分所识别的靶分子的细胞与权利要求1的嵌合分子在一定条件下接触，所述条件使得所述细胞内化所述分子，并且细胞中存在的Dicer酶加工所述分子，从而使得所述沉默部分有效。
9、根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞是体内细胞。
10、根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
11、根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
12、根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞是前列腺癌细胞。
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