CN101535483A

CN101535483A - 调节植物氮水平

Info

Publication number: CN101535483A
Application number: CNA2005800469973A
Authority: CN
Inventors: R·施内贝格尔; E·马戈勒斯-克拉克; J·派克; B·詹科沃斯基; S·C·鲍伯齐恩
Original assignee: Ceres Inc
Current assignee: Ceres Inc
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2005-12-02
Publication date: 2009-09-16

Abstract

本发明公开了调节(如提高或降低)植物中氮水平的方法和材料。例如，本发明公开了编码氮调节性多肽的核酸，以及采用这种核酸转化植物细胞的方法。也公开了氮水平升高的植物和植物产品。

Description

调节植物氮水平

相关申请的交叉参考

根据35U.S.C.§119，本申请要求2004年12月16日提交的美国临时申请号60/637,311和2005年8月2日提交的美国临时申请号60/705,119的优先权，将其全部内容纳入本文作参考。

技术领域

本申请提供了涉及调节(如提高或降低)植物中氮水平的方法和材料。例如，本申请提供了氮水平升高的植物以及制备氮水平升高的植物和植物产品的材料和方法。

发明背景

光合自养性生产有机含氮化合物对植物代谢、生长和发育至关重要。在许多农作物种类中，收获的植物物质的蛋白质和氨基酸含量有非常重要的农业经济价值。叶中光驱动的氮(N)同化作用已经进化为与光合作用和呼吸作用同步进行并整合。光合作用中还原碳(C)的产生以及它在呼吸作用中再氧化对于产生将无机N掺入氨基酸所需的能量和C骨架是必需的。相反，需要N同化来维持有机C和N的输出。伴随着光呼吸代谢的进行，此网络变得更加复杂。N同化速率以及C和N同化的协调处于许多信号的多因素控制下，这些信号提供了C和N状态的信息。需要可以在不同的氮条件下提高植物中氮含量的组合物和方法。

发明概述

本申请提供了涉及氮含量受调节(如提高或降低)的植物的方法和材料。例如，本申请提供了氮水平升高的转基因植物和植物细胞，用于产生氮水平升高的转基因植物和植物细胞的核酸，以及制备氮水平升高的植物和植物细胞的方法。可培养这种植物和植物细胞，以产生氮含量升高的种子。这些种子可用于生产营养物(如蛋白质)含量升高的粮食和动物饲料，这有利于粮食生产者和消费者。虽然不受限于任何具体作用方式，本文提供的氮调节性多肽可能具有作为转运蛋白的活性。例如，本文提供的多肽可参与氮(如肽或氨基酸形式的有机氮、或铵或硝酸盐形式的无机氮)的转运。

在一个实施方式中，提供了一种调节植物中氮水平的方法。该方法包括将分离核酸引入植物细胞，所述核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-18和图1所示共有序列，此植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

在另一实施方式中，提供了一种调节植物中氮水平的方法。该方法包括将分离核酸引入植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：16和图1所示共有序列，此植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

在另一实施方式中，提供了一种调节植物中氮水平的方法。该方法包括将分离核酸引入植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：16，此植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

所述序列相同性可以是85％或更高、90％或更高、或者95％或更高。所述核苷酸序列可编码包含对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可编码包含对应于SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽。所述核苷酸序列可编码包含对应于图1所示共有序列的氨基酸序列的多肽。所述差异可以是氮水平升高。

所述分离核酸可操作性连接于调节区。该调节区可以是组织特异性调节区。该组织特异性调节区可以是启动子。所述启动子可选自：YP0092、PT0676、PT0708、油菜籽蛋白启动子、Arcelin-5启动子、菜豆蛋白基因启动子、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子、ACP启动子、硬脂酰-ACP去饱和酶基因、β-伴大豆球蛋白的大豆α1亚基启动子、油质蛋白启动子、15kD玉米醇溶蛋白启动子、16kD玉米醇溶蛋白启动子、19kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-1启动子、β-淀粉酶基因启动子或大麦醇溶蛋白基因启动子。所述启动子可选自：PT0613、PT0672、PT0678、PT0688、PT0837、YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683或PT0758。所述调节区可以是广泛表达的启动子。广泛表达的启动子可选自：p13879、p32449、21876、p326、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848、PT0633、YP0050、YP0144或YP0190。所述调节区可以是诱导型启动子。

该植物可以是双子叶植物。该植物可以是芸苔属(Brassica)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、番茄属(Lycopersicon)、茄属(Solanum)、葡萄属(Vitis)、豌豆属(Pisum)、苜蓿属(Medicago)、红花属(Carthamus)、落花生属(Arachis)、木犀榄属(Olea)、亚麻属(Linum)或三叶草属(Trifolium)的成员。该植物可以是单子叶植物。该植物可以是玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、稻属(Oryza)、小黑麦属(Triticosecale)、燕麦属(Avena)、芭蕉属(Musa)、油棕属(Elaeis)、梯牧草属(Phleum)或高粱属(Sorghum)的成员。所述组织可以是种子组织。

也提供了一种生产植物组织的方法。所述方法包括培养一种含有分离核酸的植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-18和图1所示共有序列，所述组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

在另一实施方式中，提供了一种生产植物组织的方法。所述方法包括培养一种含有分离核酸的植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：16和图1所示共有序列，所述组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

在又一实施方式中，提供了一种生产植物组织的方法。所述方法包括培养一种含有分离核酸的植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：16，所述组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

该植物组织可以是双子叶植物组织。该植物组织可以是芸苔属、大豆属、棉属、向日葵属、莴苣属、番茄属、茄属、葡萄属、豌豆属、苜蓿属、红花属、落花生属、木犀榄属、亚麻属或三叶草属的成员。该植物组织可以是单子叶植物组织。该植物组织可以是玉蜀黍属、小麦属、大麦属、黑麦属、稻属、小黑麦属、燕麦属、芭蕉属、油棕属、梯牧草属或高粱属的成员。所述组织可以是种子组织。

也提供了一种植物细胞。所述植物细胞包含一种分离核酸，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQID NO：2、SEQ ID NO：4-18和图1所示共有序列，此植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

在另一实施方式中，提供了一种植物细胞。所述植物细胞包含一种分离核酸，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：16和图1所示共有序列，此植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

在又一实施方式中，提供了一种植物细胞。所述植物细胞包含一种分离核酸，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：16，此植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含该核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

该植物可以是双子叶植物。该植物可以是芸苔属、大豆属、棉属、向日葵属、莴苣属、番茄属、茄属、葡萄属、豌豆属、苜蓿属、红花属、落花生属、木犀榄属、亚麻属或三叶草属的成员。该植物可以是单子叶植物。该植物可以是玉蜀黍属、小麦属、大麦属、黑麦属、稻属、小黑麦属、燕麦属、芭蕉属、油棕属、梯牧草属或高粱属的成员。所述组织可以是种子组织。

也提供了一种转基因植物。所述转基因植物包含任何上述植物细胞。也提供了所述转基因植物的子代。所述子代的氮水平与不含分离核酸的相应对照植物中的氮水平有差异。也提供了转基因植物的种子和营养组织。此外，提供了包含转基因植物的营养组织的粮食和饲料。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然与本文所述内容相似或等效的方法和材料可用于实施本发明，但下面描述了合适的方法和材料。将本文提及的所有发表物、专利申请、专利和清汤参考文献以全文纳入本文作参考。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性，不会限制本发明。

附图和下面的说明书中阐述了本发明的一个或多个实施方式的详情。从本说明书和附图、以及权利要求书中可以明白本发明的其它特征、目的和优点。

附图说明

图1是SEQ ID NO：4与直向同源氨基酸序列SEQ ID NO：5-7、SEQ ID NO：9-12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16-18的比对。列出了通过比对确定的共有序列。

发明详述

本发明描述了涉及氮水平受调节(如提高或降低)的植物、植物产品、植物组织和植物细胞的方法和材料。例如，本申请提供了氮水平升高的植物和植物细胞，以及生产这种植物和植物细胞的方法。所述方法可包括用编码氮调节性多肽的核酸转化植物细胞，其中所述多肽的表达导致氮水平升高。可培养用这种方法产生的植物和植物细胞，以产生氮水平升高的种子。这些种子可用于生产营养物(如蛋白质)含量升高的粮食和动物饲料，这有利于粮食生产者和消费者。

多肽

本文所用术语“多肽”指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物，不管翻译后修饰(如磷酸化或糖基化)。亚基可通过肽键或其它键，如酯键或醚键连接。术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D/L光学异构体。该定义包括全长蛋白质及其类似物、突变体和片段。

本文描述的是氮调节性多肽。氮调节性多肽在植物或植物细胞中表达时可以有效调节氮水平。氮水平的调节可以是相对于对照植物中的相应水平提高或降低氮水平。氮调节性多肽可以是转运多肽，如寡肽转运多肽。

氮调节性多肽可以是质子依赖性寡肽转运(POT)家族多肽。据报道，POT家族多肽参与了伴随着质子摄取而摄入小肽的过程。SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4列出了了拟南芥(Arabidopsis)克隆的氨基酸序列，本文分别称为Ceres cDNA ID 2998984(SEQ ID NO：1)和Ceres克隆117581(SEQ ID NO：3)，各自具有肽转运多肽的特征性PTR2结构域。

氮调节性多肽可包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所列氨基酸序列。或者，氮调节性多肽可以是具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所列氨基酸序列的多肽的同源物、直向同源物或变体。例如，氮调节性多肽可具有一氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所列氨基酸序列的序列相同性至少为40％，如41％、45％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、56％、57％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、67％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。在一些实施方式中，氮调节性多肽包含与SEQ ID NO：2序列相同性至少为40％的氨基酸序列，该多肽的N末端包含叶绿体靶向信号序列。

在一些情况下，氮调节性多肽可包括与对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ DD NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或图1所示共有序列的氨基酸序列的序列相同性至少为80％(如80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％或99％序列相同)的多肽。

应理解，许多核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域熟知的；即对许多氨基酸而言，有一种以上的核苷酸三联体作为一种氨基酸的密码子。例如，可用具体植物物种中合适的密码子偏倚性表修饰给定氮调节性多肽的编码序列中的密码子，以获得在该植物物种中的最优表达。

重组核酸编码的氮调节性多肽可以是天然氮调节性多肽，即细胞中天然存在的氮调节性多肽编码序列的一个或多个额外拷贝。或者，氮调节性多肽可能与该细胞异源，如，转基因番茄属植物可含有来自大豆属植物的转运多肽的编码序列。

氮调节性多肽可包括不参与氮调节的额外氨基酸，因此可能比不包括额外氨基酸的多肽长。例如，氮调节性多肽可包括用作报道物的氨基酸序列。这种氮调节性多肽可以是绿色荧光蛋白(GFP)多肽与SEQ ID NO：2融合形成的、或黄色荧光蛋白(YFP)多肽与SEQ ID NO：4融合形成的融合蛋白。在一些实施方式中，氮调节性多肽包括加在氨基或羧基末端的纯化标签或前导序列。

可通过核苷酸和多肽序列比对分析来鉴定适用于本发明的氮调节性多肽候选物。例如，对核苷酸或多肽序列数据库进行查询可鉴定氮调节性多肽的直向同源物。序列分析可包括用已知的氮调节性多肽氨基酸序列对非冗余数据库进行BLAST、交互BLAST或PSI-BLAST分析。数据库中序列相同性大于40％的蛋白质可以鉴定为候选物，以进一步评价其作为氮调节性多肽的适用性。如果需要，可手工检查这些候选物，以减少需要进一步评价的候选物的数量。通过选择似乎具有怀疑存在于氮调节性多肽中的结构域(如保守的功能域)的候选物进行手工检查。

在模板或主题多肽中鉴定保守区可有利于产生野生型氮调节性多肽的变体。可通过以下方法鉴定保守区：定位模板多肽的一级氨基酸序列内是重复序列，形成某些二级结构(如螺旋和β折叠)，建立带正电或带负电的结构域或者代表蛋白基序或结构域的区域。参见例如，Pfam网站，如万维网sanger.ac.uk/Pfam/和genome.wustl.edu/Pfam描述了各种蛋白基序和结构域的共有序列。Sonnhammer等，1998，Nucl.Acids Res.26：320-322；Sonnhammer等，1997，Proteins 28：405-420；和Bateman等，1999，Nucl.Acids Res.27：260-262描述了Pfam数据库所含信息的说明。

也可通过比对紧密相关物种的相同或相关多肽的序列确定保守区。紧密相关物种优选为同一科的物种。在一些实施方式中，比对两个不同物种的序列就足够了。例如，来自拟南芥(Arabidopsis)和玉蜀黍(Zea mays)的序列可用于鉴定一个或多个保守区。

一般地，氨基酸序列相同性至少约为40％的多肽可用于鉴定保守区。相关多肽的保守区的氨基酸序列相同性至少为45％(如氨基酸序列相同性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。在一些实施方式中，靶多肽和模板多肽的保守区的氨基酸序列相同性至少为92％、94％、96％、98％或99％。可以从氨基酸或核苷酸序列推导出氨基酸序列相同性。在某些情况下，可以鉴定氮调节性多肽中高度保守的结构域。这些保守区可用于鉴定功能上相似(直向同源性)的氮调节性多肽。

在一些情况下，可根据同源氮调节性多肽中共有功能域和/或保守区合成合适的氮调节性多肽。结构域是可用于表征蛋白质家族和/或蛋白质某部分的多肽中的基本毗连氨基酸组。这种结构域具有“指纹”或“签名”，“指纹”或“签名”可包括保守的(1)一级序列、(2)二级结构和/或(3)三维构象。通常，各结构域与特定的体外和/或体内活性有关。结构域的长度可以是10个氨基酸-400个氨基酸，如10-50个氨基酸，或25-100个氨基酸，或35-65个氨基酸，或35-55个氨基酸，或45-60个氨基酸，或200-300个氨基酸，或300-400个氨基酸。

可通过上述同源性多肽序列分析鉴定共有结构域和保守区。可通过功能互补研究评价多肽用作氮调节性多肽的适用性。

核酸

本文提供了分离核酸。在本文中，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，它们指RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA和含有核酸类似物的DNA(或RNA)。多核苷酸可具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链(即正义链或反义链)。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物、以及核酸类似物。

分离核酸可以是(例如)天然产生的DNA分子，如果在天然产生基因组中通常紧密侧接于该DNA分子的核酸序列之一被去除或不存在。因此，分离核酸包括但不限于：独立于其它序列、以单独分子存在的DNA分子(如化学合成的核酸，或者聚合酶链反应(PCR)或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。分离核酸也指掺入载体的DNA、自主复制质粒、病毒或掺入原核或真核生物的基因组DNA的DNA分子。此外，分离核酸可包括工程改造的核酸，如作为杂交或融合核酸的一部分的DNA分子。存在于(例如)cDNA文库或基因组文库，或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片中的几百个至几百万个其它核酸中的核酸，不被认为是分离核酸。

可用标准技术生产分离核酸分子。例如，可用聚合酶链反应(PCR)技术获得含有本文所述核苷酸序列的分离核酸。PCR指扩增靶核酸的方法或技术。可采用PCR从DNA以及RNA中扩增特定序列，包括总基因组DNA或总细胞RNA中的序列。例如，《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer：A Laboratory Manual)，Dieffenbach和Dveksler编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995中描述了各种PCR方法。通常，用感兴趣区域末端或更远处的序列信息设计与待扩增模板的反义链序列相同或相似的寡核苷酸引物。也可获得可将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸的各种PCR方案。化学合成的分离核酸可以是单核酸分子(如用亚磷酰胺技术在3′-5′方向上进行自动DNA合成)或一系列寡核苷酸。例如，可合成含有所需序列的一对或多对长寡核苷酸(如>100个核苷酸)，各对含有互补性短片段(如约15个核苷酸)，以便在寡核苷酸对退火时形成双链体。用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每对寡核苷酸产生单、双链核酸分子，然后可将其连接入载体。也可通过诱变(例如)天然产生的DNA获得本发明分离核酸。

本文所用术语“序列相同性百分数”指任何给定查询序列和主题序列之间的相同程度。主题序列的长度一般大于查询序列长度的80％，如大于查询序列长度的82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115或120％。用计算机程序ClustalW(1.83版，默认参数)对查询核酸或氨基酸序列和一种或多种主题核酸或氨基酸序列进行比对，在全长上进行核酸或蛋白序列的比对(全局比对)。Chenna等(2003)Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500。

ClustalW计算查询序列和一种或多种主题序列之间的最佳匹配，并通过比对它们测定相同性、相似性和差异。可将一个或多个残基的缺口插入查询序列、主题序列或二者中，以最大程度进行序列比对。在核酸序列的快速成对比对中，采用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：百分数；顶端对角线数量：4；缺口罚分：5。在核酸序列的多重比对中，采用以下参数：缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：5.0；重量转换：是。在蛋白序列的快速成对比对中，采用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：百分数；顶端对角线数量：5；缺口罚分：3。在蛋白序列的多重比对中，采用以下参数：加权矩阵：块和(blosum)；缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.05；亲水性缺口：开；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异性缺口罚分：开。输出是反映序列间关系的序列比对。可以在(例如)贝勒药物研究开拓者学院网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和在欧洲生物信息研究院万维网址(ebi.ac.uk/clustalw)上运行ClustalW。为了确定查询序列和主题序列之间的“相同性百分数”，用比对中匹配的碱基或氨基酸的数量除以匹配和错配的碱基或氨基酸的总数，然后乘以100。应注意，相同性百分数值可四舍五入至小数点后一位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入至78.2。也应注意，长度值总是整数。

提到核酸时，术语“外源性”指该核酸是重组核酸构建物的一部分，或者不是在其天然环境下。例如，外源性核酸可以是从一种物种引入另一物种的序列，即异源核酸。一般地，通过重组核酸构建物将这种外源性核酸引入其它物种。外源性核酸也可以是某种生物体天然具有并再引入该生物体细胞的序列。常常可通过连接于该外源性核酸的非天然序列，如侧接重组核酸构建物中天然序列的非天然调控序列的存在，将包含天然序列的外源性核酸与天然存在的序列区分开来。此外，稳定转化的外源性核酸一般整合到发现天然序列的位置以外的位置上。应理解，可将外源性核酸引入祖细胞，而非所研究的细胞。例如，含有外源性核酸的转基因植物可以是稳定转化植物和非转基因植物之间杂交的子代。认为这种子代含有外源性核酸。

本文也提供了重组构建物，可用重组构建物转化植物或植物细胞，以调节氮水平。重组核酸构建物包含编码本文所述氮调节性多肽的核酸，其操作性连接于适用于在植物或细胞中表达此氮调节性多肽的调节区。因此，核酸可包含编码SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4-18和图1所示共有序列所列的任意氮调节性多肽的核苷酸序列。

也提供了含有如本文所述核酸的载体。“载体”是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，其中可能插入了另一DNA节段，以便复制插入的节段。通常，载体与合适的控制元件相连时能够复制。合适的载体骨架包括例如：本领域常用载体，如质粒、病毒、人工染色体、BAC、YAC或PAC。术语“载体”包括克隆和表达载体，以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调控区的载体。合适的表达载体包括但不限于：质粒和衍生自(例如)噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的病毒载体。许多载体和表达系统可购自诸如Novagen(Madison，WI)，Clontech(Palo Alto，CA)，Stratagene(LaJolla，CA)和Invitrogen/LifeTechnologies(Carlsbad，CA)等公司。

本文提供的载体也可包括例如，复制起点、支架附着区(SAR)和/或标记。标记基因可使植物细胞产生选择性表型。例如，标记可产生生物杀伤剂抗性，如抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)抗性，或除草剂(如氯磺龙(chlorosulfuron)或草胺膦)抗性。此外，表达载体可包括经设计有利于表达多肽的操作或检测(如纯化或定位)的标签序列。标签序列，如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血凝素或Flag^TM标签(Kodak，New Haven，CT)序列一般表达为与编码多肽的融合物。这种标签可插入多肽中的任何位置，包括羧基和氨基末端。

调控区

术语“调控区”指影响转录或翻译起始和速率、以及转录或翻译产物的稳定性和/或流动性的核苷酸序列。调控区包括但不限于：启动子序列、增强子序列、效应元件、蛋白识别位点、可诱导元件、蛋白结合序列、5′和3′非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列和内含子。

本文所用术语“操作性连接”指调控区和待转录序列在核酸中的定位能够允许或有利于此转录序列的转录。例如，为了将编码序列置于启动子控制下，一般使多肽的翻译读框的翻译起始位点位于启动子下游约1-50个核苷酸之间。然而，启动子可以定位于翻译起始位点上游多达约5,000个核苷酸处，或者可以定位于转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子一般包含至少一个核心(基础)启动子。启动子也可包含至少一个控制元件，如增强子序列、上游元件或上游激活区(UAR)。例如，合适的增强子是来自章鱼氨酸合酶(ocs)基因上游区的顺式调控元件(-212至-154)。Fromm等，The Plant Cell 1：977-984(1989)。所包含启动子的选择取决于几项因素，包括但不限于：效率、选择性、诱导性、所需表达水平和细胞或组织-优势表达。本领域技术人员通常能够通过根据编码序列适当地选择和定位启动子和其它调控区来调节编码序列的表达。

一些合适启动子仅仅或主要在某些细胞类型中启动转录。例如，可采用主要在生殖组织(如果实、胚珠、花粉、雌蕊、雌配子体、卵细胞、中央细胞、珠心、胚柄、助细胞、花、胚组织、胚囊、胚、合子、胚乳、珠被或种皮)中有活性的启动子。因此，本文所用细胞类型或组织-优势启动子是在靶组织中优先驱动表达的启动子，但也可在其它细胞类型或组织中产生一些表达。鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区的方法包括例如以下参考文献所述的方法：Jordano等，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos等，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green等，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier等，Plant Cell，3，309-316(1991)；和Zhang等，Plant Physiology 110：1069-1079(1996)。

下面讨论各种类型的启动子的例子。美国专利申请序列号60/505,689；60/518,075；60/544,771；60/558,869；60/583,691；60/619,181；60/637,140；10/950,321；10/957,569；11/058,689；11/172,703；11/208,308；和PCT/US05/23639中更详细地描述了下面所述的一些启动子。应理解，启动子可以根据它在一个植物物种中的活性满足一种分类标准，也可根据它在另一种植物物种中的活性满足另一种分类标准。SEQ ID NO：19-25列出了启动子的核苷酸序列。

广泛表达的启动子

当启动子在许多，但不一定是全部植物组织中促进转录时，称其为“广泛表达的”启动子。例如，广泛表达启动子可启动芽、芽尖(顶端)和叶的一种或多种操作性连接序列的转录，但在诸如根或茎等组织中促进转录的程度弱或根本不促进转录。另一个例子是，广泛表达启动子可促进茎、芽、芽尖(顶端)和叶的一种或多种中操作性连接序列的转录，但在诸如花或发育种子等生殖组织中促进转录的程度弱或根本不促进转录。本文所提供核酸构建物中可包含的广泛表达启动子的非限制性例子包括p326(SEQ ID NO：19)、YP0144(SEQ ID NQ：20)、YP0190(SEQ ID NO：21)、p13879(SEQ ID NO：22)、YP0050(SEQ ID NO：23)、p32449(SEQ ID NO：24)、21876(SEQ ID NO：25)、YP0158、YP0214、YP0380、PT0848和PTO633启动子。其它例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露氨酸合酶(MAS)启动子、获自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′或2′启动子、玄参花叶病毒34S启动子、肌动蛋白启动子如稻米肌动蛋白启动子和泛素启动子如玉米泛素-1启动子。在一些情况下，广泛表达的启动子不包括CaMV35S启动子。

根启动子

根活性启动子在根组织，如根内皮层、根表皮或根维管组织中产生转录。在一些实施方式中，根活性启动子是根-优选启动子，即仅仅或主要在根组织中产生转录。根-优选启动子包括YP0128、YP0275、PT0625、PT0660、PT0683和PT0758启动子。其它根-优选启动子包括PT0613、PT0672、PT0678、PT0688和PT0837启动子，这些启动子主要在根组织中驱动转录，在胚珠和/或种子中的驱动作用较弱。根-优势启动子的其它例子包括CaMV35S启动子的根特异性亚域(Lam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：7890-7894(1989))、Conlding等，Plant Physiol.93：1203-1211(1990)报道的根细胞特异性启动子和烟草RD2基因启动子。

正在成熟的胚乳的启动子

在一些实施方式中，可采用在正在成熟的胚乳中驱动转录的启动子。正在成熟的胚乳的启动子转录一般在授精后开始，主要在种子发育期间的胚乳组织中发生，一般在细胞化阶段中活性最高。最合适的是在正在成熟的胚乳中有优势活性的启动子，但有时也可采用也在其它组织中有优势活性的启动子。本文所提供核酸构建物中可包含的正在成熟的胚乳的启动子的非限制性例子包括：油菜籽蛋白启动子、Arcelin-5启动子、菜豆蛋白基因启动子(Bustos等，Plant Cell 1(9)：839-853(1989))、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子(Riggs等，Plant Cell 1(6)：609-621(1989))、ACP启动子(Baerson等，Plant Mol Biol.22(2)：255-267(1993))、硬脂酰-ACP去饱和酶基因(Slocombe等，Plant Physiol 104(4)：167-176(1994))、β-伴大豆球蛋白的大豆α亚基启动子(Chen等，Proc Natl Acad Sci USA 83：8560-8564(1986))、油质蛋白启动子(Hong等，Plant Mol Biol 34(3)：549-555(1997))以及玉米醇溶蛋白启动子，如15kD玉米醇溶蛋白启动子、16kD玉米醇溶蛋白启动子、19kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子和27kD玉米醇溶蛋白启动子。其它合适的启动子是稻米谷蛋白-1基因的Osgt-1启动子(Zheng等，Mol Cell Biol.13：5829-5842(1993))、β-淀粉酶基因启动子和大麦醇溶蛋白基因启动子。其它正在成熟的胚乳的启动子包括YP0092、PT0676和PT0708启动子。

子房组织启动子

也可采用在子房组织如胚珠壁和中果皮中有活性的启动子，如聚半乳糖醛酸酶启动子、香蕉TRX启动子和甜瓜肌动蛋白启动子。

胚囊/早期胚乳启动子

为了实现在胚囊/早期胚乳中表达，可采用在极核和/或中央细胞中、或在极核前体(precursor)中有活性，但在卵细胞或卵细胞前体中无活性的调节区。大多数合适的启动子是仅仅或主要在极核或其前体和/或中央细胞中驱动表达的启动子。也可在从极核延伸到早期胚乳发育的转录模式中发现胚囊/早期胚乳-优势启动子，但细胞化阶段其间或之后的晚期胚乳发育中转录一般显著降低。合子或正在发育的胚中的表达一般与胚囊/早期胚乳启动子无关。

可能合适的启动子包括衍生自以下基因的启动子：拟南芥viviparous-1(参见GenBank编号U93215)；拟南芥atmycl(参见Urao(1996)Plant Mol.Biol，32：571-57；Conceicao(1994)Plant，5：493-505)；拟南芥FIE(GenBank编号AF129516)；拟南芥MEA；拟南芥FIS2(GenBank编号AF096096)；和FIE 1.1(美国专利6,906,244)。可能合适的其它启动子包括衍生自以下基因的启动子：玉米MAC1(参见Sheridan(1996)Genetics，142：1009-1020)；玉米Cat3(参见GenBank编号L05934；Abler(1993)PlantMol.Biol，22：10131-1038)。其它启动子包括以下拟南芥启动子：YP0039、YP0101、YP0102、YP0110、YP0117、YP0119、YP0137、DME、YP0285和YP0212。可以采用的其它启动子包括以下稻米启动子：p530c10、pOsFIE2-2、pOsMEA、pOsYp102和pOsYp285。

胚启动子

优势驱动受精后合子细胞中的转录的调控区可提供胚优势表达。最合适的启动子是优势驱动心期之前早期胚中转录的启动子，但驱动晚期和正在成熟的胚中的表达的启动子也适用。胚优势启动子包括大麦脂质转移蛋白(Ltp1)启动子(Plant Cell Rep(2001)20：647-654)。

有光合活性的组织启动子

有光合活性的组织启动子在光合活性组织如叶和茎中产生转录。大多数合适的启动子是仅仅或主要在这些组织中驱动表达的启动子。这种启动子的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子如美洲落叶松(Larix laricina)的RbcS启动子，松树cab6启动子(Yamamoto等，Plant Cell Physiol.35：773-778(1994))，小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等，Plant Mol.Biol 15：921-932(1990))，菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等，Plant Physiol.104：997-1006(1994))，水稻的cab1R启动子(Luan等，Plant Cell4：971-981(1992))，玉米的丙酮酸正磷酸盐二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：9586-9590(1993))，烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等，PlantMol.Biol.33：245-255(1997))，拟南芥(Arahidopsis thaliana)SUC2蔗糖-H+协同转运启动子(Truernit等，Planta.196：564-570(1995))和菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。

诱导型启动子

诱导型启动子响应于外界刺激如化学物质或环境刺激产生转录。例如，诱导型启动子可响应于激素如赤霉酸或乙烯、或响应于光照或干旱产生转录。

基础启动子

基础启动子是装配启动转录所需转录复合物所必需的最小序列。基础启动子常包括“TATA框”元件，可定位于转录起始位点上游约15-35个核苷酸之间。基础启动子也可包括“CCAAT框”元件(一般是序列CCAAT)和/或GGGCG序列，它可定位于转录起始位点上游约40-200个核苷酸之间，一般约60-120个核苷酸之间。

其它启动子

其它类型的启动子包括但不限于：叶-优势、茎/芽-优势、愈伤组织-优势和衰老-优势的启动子。也可采用称为YP0086、YP0188、YP0263、PT0758、PT0743、PT0829、YP0119和YP0096的启动子，如上述专利申请中所述。

其它调控区

本文所述的核酸构建物中可包含5′非翻译区(UTR)。5′UTR被转录但不被翻译，该非翻译区位于转录起始位点和翻译起始密码子之间，可包括+1核苷酸。3′UTR可位于翻译终止密码子和转录物末端之间。UTR可具有特别功能，如提高mRNA信使稳定性或弱化翻译。3′UTR的例子包括但不限于聚腺苷酸化信号和转录终止序列，如胭脂氨酸合酶终止序列。

应理解，重组多核苷酸中可存在一种以上调控区，如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导元件。因此，一种以上调控区可操作性连接于编码碳调节性多肽的多核苷酸序列。

转基因植物和植物细胞

本发明也提供了含有本文所述至少一种重组核酸构建物的转基因植物细胞和植物。可通过将构建物整合入基因组转化，即可稳定转化植物或植物细胞。稳定转化的细胞在每次细胞分裂中一般都能保留引入的核酸。也可瞬时转化该植物或植物细胞，以便使构建物不整合入其基因组。瞬时转化的细胞在每次细胞分裂中一般会丢失所引入核酸的全部或一部分，以致于在足够次数的细胞分裂后不能在子细胞中检测到引入的核酸。瞬时转化的和稳定转化的转基因植物和植物细胞都可用于本文所述方法。

本文所述方法所用的转基因植物细胞构成了整个植物的一部分或全部。可用适合于所研究物种的方式，在培养箱、温室或田野中培养所述植物。可根据特定目的，如将重组核酸引入其它品系、将重组核酸转移至其它物种或进一步选择其它所需性状的需要培养转基因植物。或者，对于适应这种技术的转基因植物种类，可进行无性繁殖。子代包括特定植物或植物品系的子代。现有植物的子代包括F₁、F₂、F₃、F₄、F₅、F₆和子代植物，或BC₁、BC₂、BC₃和子代植物形成的种子，或F₁BC₁、F₁BC₂、F₁BC₃和子代植物形成的种子。代号F₁指遗传学上不同的两种亲代的杂交子代。代号F₂、F₃、F₄、F₅和F₆指F₁植株的自花授粉或同胞授粉的子代。可培养转基因植物产生的种子，然后使其自花授粉(或异型杂交并自花授粉)，以获得核酸构建物纯合的种子。

可在悬浮培养物、或者组织或器官培养物中培养转基因植物。出于本发明目的，可采用固体和/或液体组织培养技术。采用固体培养基时，可将转基因植物细胞直接放置在培养基上，或可放置在接触培养基的滤膜上。采用液体培养基时，可将转基因植物细胞放置在漂浮装置，如接触液体培养基的多孔膜上。一般通过加入琼脂由液体培养基制备固体培养基。例如，固体培养基可以是含有琼脂以及合适浓度的生长素如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和合适浓度的细胞分裂素如激动素的Murashige和Skoog(MS)培养基。

采用瞬时转染的植物细胞时，转化方法中可包括编码具有报道物活性的报道多肽的报道序列，可在转化后的适当时机检测报道物活性或表达。进行检测的适当时机一般是转化后约1-21天，如约1-14天、约1-7天或约1-3天。对于在不同物种中进行快速分析，或要验证以前没有在具体受体细胞中验证表达的异源氮调节性多肽的表达而言，采用瞬时测定特别方便。

本领域已知将核酸引入单子叶植物和双子叶植物的技术，包括但不限于：土壤杆菌介导的转化、病毒载体介导的转化、电穿孔和基因枪转化，如美国专利5,538,880；5,204,253；6,329,571和6,013,863所述。如果细胞或培养组织用作转化的受体组织，可用本领域技术人员已知技术由转化的培养物再生植物(如果需要)。

植物种类

本文所述的多核苷酸和载体可用于转化许多单子叶和双子叶植物以及植物细胞系统，包括双子叶植物，如苜蓿、苋菜、苹果、豆类(包括菜豆、利马豆、干豆、青豆)、花椰菜、甘蓝、胡萝卜、蓖麻子、樱桃、鹰嘴豆、菊苣、车轴草、可可、咖啡、棉花、海甘蓝、亚麻、葡萄、柚子、柠檬、小扁豆、莴苣、亚麻籽、芒果、瓜类(如西瓜、哈密瓜)、芥菜、橙、桃、花生、梨、豌豆、胡椒、李子、马铃薯、油菜、油菜籽(高芥酸和菜籽油)、红花、芝麻、大豆、菠菜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、茶、番茄和薯蓣，以及单子叶植物如香蕉、大麦、早熟禾、海枣、羊茅、非甜质玉米、大蒜、粟、燕麦、油椰、洋葱、菠萝、爆裂种玉米、水稻、黑麦、黑麦草、高粱、苏丹草、甘蔗、甜玉米、柳枝稷、梯牧草和小麦。也可采用褐藻、绿藻、红藻和微藻类。

因此，本文所述的方法和组合物可用于(例如)属于以下目的双子叶植物：伞形目(Apiales)、槟榔目(Arecales)、马兜铃目(Aristochiales)、菊目(Asterales)、肉穗果目(Batales)、桔梗目(Campanulales)、白花菜目(Capparales)、石竹目(Caryophyllales)、木麻黄目(Casuarinales)、卫矛目(Celastrales)、山茱萸目(Cornales)、葫芦目(Cucurbitales)、岩梅目(Diapensiales)、五桠果目(Dilleniales)、续断目(Dipsacales)、柿树目(Ebenales)、杜鹃花目(Ericales)、杜仲目(Eucomiales)、大戟目(Euphorbiales)、豆目(Fabales)、山毛榉目(Fagales)、龙胆目(Gentianales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、小二仙草目(Haloragales)、金缕梅目(Hamamelidales)、八角目(Illiciales)、胡桃目(Juglandales)、脣形目(Lamiales)、樟目(Laurales)、玉蕊目(Lecythidales)、银毛木目(Leitneriales)、亚麻目(Linales)、木兰目(Magnoliales)、锦葵目(Malvales)、杨梅目(Myricales)、桃金娘目(Myrtales)、睡莲目(Nymphaeales)、罂粟目(Papeverales)、胡椒目(Piperales)、车前目(Plantaginales)、白花丹目(lumbaginales)、川苔草目(Podostemales)、花葱目(Polemoniales)、远志目(Polygalales)、蓼目(Polygonales)、报春花目(Primulales)、山龙眼目(Proteales)、大花草目(Rafflesiales)、毛茛目(Ranunculales)、鼠李目(Rhamnales)、蔷薇目(Rosales)、茜草目(Rubiales)、杨柳目(Salicales)、檀香目(Santales)、无患子目(Sapindales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、玄参目(Scrophulariales)、茄目(Solanales)、昆栏树目(Trochodendrales)、山茶目(Theales)、伞形目(Umbellales)、荨麻目(Urticales)和堇菜目(Violales)。本文所述的方法和组合物也可用于(例如)属于以下目的单子叶植物：泽泻目(Alismatales)、天南星目(Arales)、棕榈目(Arecales)、天门冬目(Asparagales)、凤梨目(Bromeliales)、鸭跖草目(Commelinales)、环花草目(Cyclanthales)、莎草目(Cyperales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳖目(Hydrocharitales)、灯心草目(Juncales)、百合目(Liliales)、茨藻目(Najadales)、兰目(Orchidales)、露兜树目(Pandanales)、禾本目(Poales)、帚灯草目(Restionales)、霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)、姜目(Zingiberales)和属于裸子植物门，如苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)、买麻藤目(Gnetales)和松杉目(Pinales)的植物。

所述方法和组合物可用于一大类植物物种，包括以下双子叶植物属的物种：苋属(Amaranthus)、花生属、芸苔属、金盏花属(Calendula)、山茶属(Camellia)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、鹰嘴豆属(Cicer)、菊苣属(Chicorium)、樟属(Cinnamomum)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、两节荠属(Crambe)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、薯蓣属(Dioscorea)、草莓属(Fragaria)、大豆属、棉属、向日葵属、莴苣属、兵豆属(Lens)、亚麻属(Linum)、番茄属、苹果属(Malus)、杜果属(Mangifera)、苜蓿属、薄荷属(Mentha)、烟草属(Nicotiana)、罗勒属(Ocimum)、木犀榄属(Olea)、菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistacia)、豌豆属、李属(Prunus)、梨属(Pyrus)、迷迭香属(Rosmarinus)、鼠尾草属(Salvia)、胡麻属(Sesamum)、茄属、菠菜属(Spinacia)、可可属(Theobroma)、百里香属(Thymus)、三叶草属(Trifolium)、越桔属(Vaccinium)、豇豆属(Vigna)和葡萄属；以及以下单子叶植物属的种类：葱属(Allium)、凤梨属(Ananus)、天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、姜黄属(Curcuma)、油棕属(Elaeis)、羊茅属(Festuca)、大麦属(Hordeum)、浮萍属(Lemna)、黑麦草属(Lolium)、芭蕉属(Musa)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、高粱属(Sorghum)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)和玉蜀黍属(Zea)。

本文所述方法和组合物也可用于褐藻，如泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、齿缘墨角藻(Fucus serratus)、延伸海条藻(Himanthalia elongate)和裙带菜(Undaria pinnatifida)；红藻，如皱叶角叉菜(Chondrus crispus)、江蓠(Gracilaria verrucosa)、脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)和掌状红皮藻(Palmariapalmata)；绿藻，如浒苔(Enteromorpha spp.)和石莼(Ulva spp.)；以及微藻，如螺旋藻(Spirulina sp.)(钝顶螺旋藻(S.platensis)和极大螺旋藻(S.maxima))和长耳齿状藻(Odontella aurita)。此外，该方法和组合物还可用于寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、裂壶藻(Schizochytrium spp.)和雨生血球藻(Haematococcus pluvials)。

在一些实施方式中，植物是以下物种之一的成员：凤梨(Ananus comosus)、芸苔(Brassica campestris)、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、大豆(Glycinemax)、棉(Gossypium spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、粉芭蕉(Musa paradisiaca)、稻(Oryza sativa)、马铃薯(Solanum tuberosum)、普通小麦(Triticum aestivum)、葡萄(Vitis vinifera)或玉蜀黍(Zea mays)。

抑制氮调节性多肽表达的方法

本文所述多核苷酸和重组载体可用于在感兴趣的植物物种中表达氮调节性多肽或抑制其表达。术语＂表达＂指将多核苷酸遗传信息通过由RNA聚合酶催化的转录转化为RNA和通过在核糖体上翻译mRNA转化为蛋白质的过程。＂上调＂或＂激活＂指相对于基础或天然状态提高表达产物(mRNA、多肽、或二者)的产量的调控作用，而＂下调＂或＂抑制＂指相对于基础或天然状态降低表达产物(mRNA、多肽、或二者)的产量的调控作用。

可采用许多基于核酸的方法，包括反义RNA、核酶定向的RNA切割和RNA干扰(RNAi)来抑制植物中的蛋白质表达。反义技术是一种熟知的方法。在此方法中，克隆来自内源性基因的核酸节段并操作性连接于启动子，以便转录RNA的反义链。然后，如上所述将重组载体转化到植物中，产生RNA的反义链。核酸节段不需要是待抑制内源性基因的整个序列，但一般与至少一部分待抑制内源性基因基本相同。通常，使用的序列越短，可使用更高的同源性补偿。一般采用至少30个核苷酸的序列(如至少40、50、80、100、200、500个核苷酸或更多)。

因此，例如，本文提供的分离核酸可以是编码氮调节性多肽，如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4-18或图1所示共有序列的一种上述核酸的反义核酸。将能降低氮调节性多肽编码基因的转录或翻译产物水平的核酸转录为与氮调节性多肽的正义编码序列相似或相同的反义核酸。或者，分离核酸的转录产物可能与氮调节性多肽的正义编码序列相似或相同，但它是未聚腺苷酸化的RNA，缺少5′帽结构，或含有不可剪接的内含子。

在另一方法中，核酸可转录为能影响mRNA表达的核酶或催化性RNA。(参见美国专利号6,423,885)。可以设计核酶，使其基本上能与任何靶RNA特异性配对并在特异性位点上切割磷酸二酯键骨架，从而使该靶RNA功能性失活。异源核酸可编码设计用于切割特定mRNA转录物的核酶，从而防止多肽的表达。锤头核酶可用于破坏特定mRNA，尽管可采用在位点特异性识别序列上切割mRNA的各种核酶。锤头核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧接区所示位置上切割mRNA。唯一的要求是靶RNA含有5′-UG-3′核苷酸序列。锤头核酶的构建和产生是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,254,678和WO 02/46449和其中引用的参考文献。锤头核酶序列可嵌入稳定的RNA如转运RNA(tRNA)中，以提高体内切割效率。Perriman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92(13)：6175-6179(1995)；de Feyter和Gaudron，《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第74卷，第43章，“在植物中表达核酶”(ExpressingRibozymes in Plants)，Turner，P.C编，Humana Press Lie.，Totowa，NJ。可采用RNA核糖核酸内切酶如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然存在的RNA核糖核酸内切酶，Cech和同事对其进行详尽描述。参见例如，美国专利号4,987,071。

可采用基于RNA干扰(RNAi)的方法。RNA干扰是调节基因表达和病毒复制的细胞学机制。人们认为此机制由双链小干扰RNA分子介导。细胞对这种双链RNA的反应是破坏与此双链RNA序列相同的内源性RNA。本领域技术人员知道设计和制备干扰RNA的方法；参见例如，WO 99/32619和WO 01/75164。例如，可制备包含能转录成干扰RNA的序列的构建物。这种RNA可以是可与本身退火的RNA，如具有茎环结构的双链RNA。双链RNA的茎部分的一条链包含与感兴趣多肽的正义编码序列相似或相同的序列，该序列的长度约为10-2,500个核苷酸。与正义编码序列相似或相同的序列的长度可以是10-500个核苷酸、15-300个核苷酸、20-100个核苷酸、或者25-100个核苷酸。双链RNA的茎部分的另一条链包含感兴趣氮调节性多肽的反义序列，与对应的正义序列的长度相比，其长度可以较短、相同或较长。双链RNA的环部分的长度可以为10-5,000个核苷酸，如15-1,000个核苷酸、20-500个核苷酸，或者25-200个核苷酸。RNA的环部分可包含内含子。参见例如，WO99/53050。

在一些用于抑制植物基因表达的基于核酸的方法中，合适的核酸可以是核酸类似物。核酸类似物可能是在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上被修饰，以提高(例如)核酸的稳定性、杂交能力或溶解度。碱基部分的修饰包括脱氧尿苷取代脱氧胸苷，和5-甲基-2′-脱氧胞苷和5-溴-2′-脱氧胞苷取代脱氧胞苷。糖部分的修饰包括修饰核糖的2′羟基以形成2′-O-甲基或2′-O-烯丙基糖。可修饰脱氧核糖磷酸骨架产生吗啉代核酸(其中各碱基部分连接于六元吗啉代环)或肽核酸(其中脱氧磷酸骨架被假肽主链取代，并且保留4种碱基)。参见例如，Summerton和Weller，1997，Antisense Nucleic AcidDrugDev.，7：187-195；Hyrup等，1996，Bioorgan.Med.Chem.，4：5-23。此外，脱氧磷酸骨架可被(例如)硫代磷酸或二硫代磷酸骨架、磷酸亚酰胺、或烷基磷酸三酯主链取代。

转基因植物表型

可通过选择或筛选工程改造的植物物质的特定性状或活性，如标记基因或抗生素抗性基因编码的性状或活性，来鉴定和分离转化细胞、愈伤组织、组织或植物。本领域普通技术人员熟知这种筛选和选择方法。此外，可用物理和生化方法鉴定转化子。这些方法包括用于检测多核苷酸的Southern分析或PCR扩增；用于检测RNA转录物的Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或RT-PCR扩增；用于检测多肽或多核苷酸的酶活性或核酶活性的酶学试验；以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫试验。也可采用其它技术如原位杂交、酶染色和免疫染色来检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。进行所有这些技术的方法都是熟知的。

与缺少转基因或不表达转基因的相应对照植物相比，转基因植物可具有改变的表型。多肽在植物(如转基因植物)中在例如合适的时间、合适的组织中或以合适的表达水平表达时，可影响植物的表型。可相对于不表达感兴趣的外源性多核苷酸的对照植物，如对应的野生型植物、未转入感兴趣的外源性多核苷酸但与感兴趣的转基因植物遗传背景相同的对应植物、或降低、抑制或未诱导多肽表达(如表达处于诱导型启动子的控制下)的遗传背景相同的对应植物，来评价表型影响。当植物产生的多肽量或编码该多肽的mRNA量是感兴趣植物所产生量的10％以下，如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％或0.001％以下时，称该植物“不表达”该多肽。可用以下方法评价表达，包括例如：RT-PCR、Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸、Western印迹、蛋白质凝胶电泳、免疫沉淀、酶联免疫试验、芯片试验和质谱。应注意，如果多肽在组织特异性或广泛表达的启动子的控制下表达，可在整个植物或所选组织中评价表达。相似地，如果多肽在特定时间表达，如在发育中或诱导后的特定时间表达，则可在所需时间上选择性评价表达。

在一些实施方式中，氮调节性多肽表达被调节的植物可具有提高的种子氮水平。例如，本文所述氮调节性多肽可在转基因植物中表达，导致种子氮水平升高。与不表达该转基因的相应对照植物的种子氮水平相比，种子氮水平可升高至少5％，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％、或大于100％。在一些实施方式中，氮调节性多肽表达被调节的植物可具有降低的种子氮水平。与不表达该转基因的相应对照植物的种子氮水平相比，种子氮水平可降低至少5％，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50％、或大于50％。

调节种子氮水平可能对其有用的植物包括但不限于：苜蓿、莴苣、胡萝卜、洋葱、花椰菜、番茄、马铃薯、甘蔗、葡萄、棉花、菜籽油(canola)、甜玉米、爆裂种玉米、非甜质玉米、豌豆、豆类、红花、大豆、咖啡、苋菜、油菜籽、花生、向日葵、油椰、小麦、黑麦、大麦、燕麦、水稻、粟、草莓、菠萝、瓜类、桃、梨、苹果、樱桃、橙、柠檬、柚子、李子、芒果、香蕉、羊茅、黑麦草、早熟禾、三叶草、梯牧草、苏丹草、柳枝稷和高粱。这些植物中种子氮增加可提高蛋白质/氨基酸的饮食摄入量常常不足的地区的营养供给量。这些植物中种子氮减少可用于种子不是收获用于人类或动物消耗的主要植物部分的情况。

在一些实施方式中，氮调节性多肽表达受调节的植物的一种或多种非种子组织，如种子以外的叶组织、茎组织、根或球茎组织或果实组织中氮水平可提高或降低。例如，与不表达该转基因的相应对照植物的种子氮水平相比，氮水平可提高至少5％，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％、或大于100％。在一些实施方式中，氮调节性多肽表达受调节的植物的一种或多种非种子组织中的氮水平可降低。与不表达该转基因的相应对照植物的种子氮水平相比，氮水平可降低5％，如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或大于50％。

调节非种子组织的氮水平可能对其有用的植物包括但不限于：苜蓿、莴苣、胡萝卜、洋葱、花椰菜、番茄、马铃薯、甘蔗、葡萄、甜玉米、爆裂种玉米、非甜质玉米、豌豆、豆类、红花、大豆、咖啡、苋菜、油菜籽、花生、向日葵、油椰、小麦、黑麦、大麦、燕麦、水稻、粟、草莓、菠萝、瓜类、桃、梨、苹果、樱桃、橙、柠檬、柚子、李子、芒果、香蕉、羊茅、黑麦草、早熟禾、三叶草、梯牧草、苏丹草、柳枝稷和高粱。

这些植物中非种子氮增加可提高食用水果和蔬菜中的营养含量，或改进动物饲料。非种子氮减少可使氮更有效地分配到收获用于人类或动物消耗的植物部分中。

一般地，用合适的参数或非参数统计，如X²检验、Student′s t-检验、Mann-Whitney检验或F-检验测得p≤0.05时，认为转基因植物或细胞相对于对照植物或细胞的氮含量差异(如增加)有统计学显著性。在一些实施方式中，p<0.01、p<0.005或p<0.001时，氮含量的差异有统计学显著性。转基因植物的种子中氮含量与对照植物的细胞有统计学显著性差异表明(1)转基因植物中存在的重组核酸导致氮水平改变和/或(2)应该作为改变植物氮含量的候选物进一步研究重组核酸。

制品

本文也提供了可包括(例如)来自本文所提供转基因植物的种子混合物(如基本均一的种子混合物)的制品。可用本领域已知方式调整和包装种子混合物，以制备制品。种子的包装可具有标签，，如固定在包装材料上的标记或标签、打印在包装材料上的标签或插入包装中的标签。标签中可说明，由此包装中所含种子长出的植物可产生种子氮水平高于对应对照植物的作物。

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不会限制权利要求书所述的本发明范围。

实施例

实施例1—转基因植物

实施例中采用以下符号：T₁：第一代转化子；T₂：第二代，自花授粉的T₁植株的子代；T₃：第三代，自花授粉的T₂植株的子代；T₄：第四代，自花授粉的T₃植株的子代。将独立转化称为事件。

以下核酸分离自拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Wassilewskija(Ws)植株。Ceres cDNA ID 2998984(SEQ ID NO：1)是预计编码505个氨基酸的(SEQ ID NO：2)推定寡肽转运多肽的基因组DNA克隆。Ceres克隆117581(cDNA ID 23364185；SEQID NO：3)是预计编码587个氨基酸的(SEQ ID NO：4)推定肽转运多肽的cDNA克隆。

将上述各分离多核苷酸克隆入含有草胺膦乙酰基转移酶基因的载体中，该载体能使转化的植物产生Finale^TM抗性。构建含有操作性连接于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S调控区的Ceres cDNA ID 2998984或Ceres克隆117581的NB42-35S双载体。NB42-35S双载体是pMOG800双载体的衍生物。

用含有Ceres cDNA ID 2998984或Ceres克隆117581的NB42-35S双载体各自转化野生型拟南芥生态型C24植株。基本上按照Bechtold等，CR.Acad.Sci.Paris，316：1194-1199(1993)所述进行转化。

含有Ceres cDNA ID 2998984或Ceres克隆117581的转基因拟南芥品系分别称为SR00829和SR05001。通过Finale^TM抗性、由绿叶组织提取物进行聚合酶链反应(PCR)扩增和对PCR产物进行测序验证了SR00829中存在Ceres cDNA ID 2998984载体，并且SR05001存在Ceres克隆117581载体。作为转基因拟南芥生态型C24植株的对照，用空载体NB42-35S转化野生型拟南芥生态型C24植株。

将Ceres cDNA ID 2998984和Ceres克隆117581的植物中核苷酸序列与同源性拟南芥生态型Columbia序列作比较。Ceres克隆117581的植物中核苷酸序列与同源性Columbia序列的差一个核苷酸。与同源性Columbia序列相比，Ceres cDNA ID2998984的植物中核苷酸序列含有碱基对插入、缺失和取代。

为了确定Ceres cDNA ID 2998984编码的预测多肽的总体结构是否类似于同源性Columbia核苷酸序列编码的预测多肽，用Tmpred程序(ch.embnet.org/software/TMPRED_form)分析这两个序列中可能的转运多肽特征性跨膜结构域。分析表明，这两种预测多肽具有预期的12个跨膜区。然而，对翻译起始位点的预测表明，Ceres cDNA ID 2998984编码的预测多肽的氨基末端比Columbia同源物编码的预测多肽短40个氨基酸。因此，根据SignalP算法(cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，Ceres cDNA ID 2998984编码的预测多肽缺少预测的Columbia多肽序列的前40个氨基酸所含的分泌信号肽序列。用iPSORT信号序列预测算法(hc.ims.u-tokyo.ac.jp/iPSORT/index.html#aaindex)分析Ceres cDNA ID 2998984编码的预测多肽序列表明，前40个氨基酸含有可能的叶绿体靶向信号序列。

如下所述筛选转基因拟南芥品系：1)筛选温室中T₁候选物的形态表型，2)分析T₂种子的碳和氮含量，3)验证T₃种子中碳和/或氮含量提高，和4)评价T₂植株的阴性表型和Finale^TM分离。

筛选SR00829和SR05001的各五个事件在T₁代中产生的可见表型改变。所有T₁植株的外表特征与相应对照植物相同。

实施例2—转基因拟南芥种子中碳和氮含量的分析

称量约2.00±0.15mg干燥的转基因拟南芥种子(约100粒)，加入锡罐中，分析总的碳和氮含量。以与试验样品相同的方式制备三种匹配对照，在整个批次中间隔均匀。每个批次中的前三个样品分别是空白样品(空锡罐)、旁路(bypass)(约5mg天冬氨酸)和标准样品(5.00±0.15mg天冬氨酸)。用分析天平称量天冬氨酸加入锡罐中。每15个试验样品之间插入一个空白样品。

用FlashEA1112NC分析仪(Thermo Finnigan，San Jose，CA)完成分析。设备参数如下：左炉900℃，右炉840℃，烘箱50℃，气流载体130mL/分钟，气流参比100mL/分钟。标准样品的数据参数LLOD为0.25mg，其它材料不同。标准样品的数据参数LLOQ为3mg，种子组织的数据参数LLOQ为1mg，其它材料不同。

用EA1112软件进行定量。使结果标准化，并用绝对百分数表示。一式三份地分析各个样品，计算标准差。以前测得非转基因对照的总碳含量为53.3±2.4％，总氮含量为3.9±0.3％。天冬氨酸标准品的理论标准差为碳±2.0％，氮±1.0％。为了被称为有效，需要各轮的天冬氨酸(标准品)重量为5mg±0.15mg，需要空白样品的氮或碳含量记录为零。需要重复样品之间的标准差百分数低于10％。

实施例3-SR00829事件结果

如实施例2所述分析含有Ceres cDNA ID 2998984的SR00829经两次事件后T₂和T₃种子中的总碳和总氮含量。

与相应的对照种子的氮含量相比，SR00829经两次事件后的T₂种子的氮含量显著增加。如表1所示，与对照种子的氮含量相比，经事件-01和-02的种子中氮含量增加到110％和109％。

表1：SR00829事件的T₂和T₃种子总氮含量(％对照)

	事件-01	事件-02	对照
	事件-01	事件-02	对照	T₂	110±1	109±2	100±1
p值	0.001	0.002	NA	T₂	110±1	109±2	100±1
p值	0.001	0.002	NA	T₃	111±3	118±5	100±3
p值	<0.01	0.01	NA	T₃	111±3	118±5	100±3

与相应的对照种子的氮含量相比，SR00829经两次事件后T₃种子的氮含量显著增加。如表1所示，与对照种子的氮含量相比，经事件-01和-02的种子中氮含量分别增加到111％和118％。

观察到SR00829事件的T₂和T₃种子的碳含量与相应对照种子的碳含量没有显著区别。

用于分析碳和氮含量的SR00829事件的T₃种子是从经过各事件的一个T₂植株收集的。

SR00829经过事件-01和-02后的T₂植株中FinaleTM抗性分离的结果是抗性与敏感比为3:1。

T₂SR00829和对照植物在萌发、开花初期、莲座区、能育性、植株高度和总体形态/结构方面都没有可观察的或统计学显著性差异。

实施例4-SR05001事件的结果

如实施例2所述分析含有Ceres克隆117581的SR05001经两次事件后T₂和T₃种子中的总碳和总氮含量。

与相应的对照种子的碳含量相比，SR05001经一次事件后T₂种子的碳含量显著降低。如表2所示，与对照种子的碳含量相比，经事件-02的种子中碳含量降低至97％。

表2：SR05001事件的T₂和T₃种子总碳含量(％对照)

	事件-02	事件-03	对照
	事件-02	事件-03	对照	T₂	97±2	102±2	100±1
p值	0.03	0.14	NA	T₂	97±2	102±2	100±1
p值	0.03	0.14	NA	T₃	106±1	107±2	100±2
p值	0.01	0.01	NA	T₃	106±1	107±2	100±2

与相应的对照种子的氮含量相比，SR05001经两次事件后T₂种子的氮含量显著增加。如表3所示，与对照种子的氮含量相比，经事件-02和-03的种子中氮含量分别增加到112％和115％。

表3：SR05001事件的T₂和T₃种子总氮含量(％对照)

	事件-02	事件-03	对照
	事件-02	事件-03	对照	T₂	112±3	115±1	100±4
p值	<0.01	<0.01	NA	T₂	112±3	115±1	100±4
p值	<0.01	<0.01	NA	T₃	109±1	106±2	100±2
p值	<0.01	0.01	NA	T₃	109±1	106±2	100±2

与相应的对照种子的碳含量相比，SR05001经两次事件后T₃种子的碳含量显著增加。如表2所示，与对照种子的碳含量相比，经事件-02和-03的种子中碳含量分别增加到106％和107％。

与相应的对照种子的氮含量相比，SR05001经两次事件后T₃种子的氮含量显著增加。如表3所示，与对照种子的氮含量相比，经事件-02和-03的种子中氮含量分别增加到109％和106％。

用于分析碳和氮含量的SR05001事件的T₃种子是从经过各事件的一个T₂植株收集的。

SR05001经过事件-02和-03后的T₂植株中Finale^TM抗性分离的结果是抗性与敏感比为3:1。

T₂SR05001和对照植物在萌发、开花初期、莲座区、能育性、种子大小和总体形态/结构方面都没有可观察的或统计学显著性差异。

实施例5-功能同源物和/或直向同源序列的确定

如果主题和查询序列编码的蛋白质具有相似功能和/或活性，则认为主题序列是查询序列的功能同源物和/或直向同源物。用称为交互BLAST(Rivera等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95：6239-6244(1998))的方法鉴定来自可用的公共和专利肽序列数据库，包括NCBI NR蛋白质数据库和Ceres克隆的肽翻译数据库中可能的功能同源物和/或直向同源序列。开始交互BLAST法之前，用BLAST在来源物种的所有肽中搜索特定的查询多肽，以鉴定与查询多肽的序列相同性为80％或更高并且比对长度占所比对较短序列的85％或更多的多肽。查询多肽与上述鉴定的多肽被称为簇。

主要的交互BLAST法由两轮BLAST搜索组成：正向搜索和反向搜索。在正向搜索步骤中，用感兴趣物种的所有蛋白序列BLAST检索来自来源种类SA的查询多肽序列“多肽A”。用E-值截止值10^-5和相同性截止值35％确定最高命中。在最高命中中，E值最低的序列被称为最佳命中，并被认为是潜在的功能同源物和/或直向同源物。与最佳命中或初始查询多肽的序列相同性为80％或更高的任何其它最高命中也被认为是潜在的功能同源物和/或直向同源物。对所有感兴趣种类重复此方法。在反向搜索中，用来源种类SA的所有蛋白序列BLAST检索正向搜索中从所有种类中鉴定出的最高命中。正向搜索的最高命中如果将上述簇的多肽返回为其最佳命中，也被认为是潜在的功能同源物和/或直向同源物。

手工检查潜在的功能同源物和/或直向同源物序列，以鉴定功能同源物和/或直向同源物。SEQ ID NO：4的代表性功能直向同源物见图1。功能直向同源物与SEQ IDNO：4的相同性百分数见表4。

表4：与Ceres克隆117581(SEQ ID NO：4)的相同性百分数

名称	物种	SEQ ID NO：	％相同性	e值
名称	物种	SEQ ID NO：	％相同性	e值	Ceres克隆：328378	玉蜀黍	5	70.4	0
gi\|2655098	大麦(Hordeum vulgare)vulgare亚种	6	68.2	0	Ceres克隆：328378	玉蜀黍	5	70.4	0
gi\|2655098	大麦(Hordeum vulgare)vulgare亚种	6	68.2	0	gi\|34895718	水稻日本亚种	7	68	0
gi\|50933627	水稻日本亚种	8	64	0	gi\|34895718	水稻日本亚种	7	68	0
gi\|50933627	水稻日本亚种	8	64	0	gi\|4102839	番茄	9	63	0
gi\|31088360	蚕豆(vicia faba)	10	62.9	0	gi\|4102839	番茄	9	63	0
gi\|31088360	蚕豆(vicia faba)	10	62.9	0	gi\|6635838	李子(prunus dulcis)	11	61.4	0
gi\|56784523	水稻日本亚种	12	56.7	0	gi\|6635838	李子(prunus dulcis)	11	61.4	0
gi\|56784523	水稻日本亚种	12	56.7	0	gi\|56784524	水稻日本亚种	13	51.6	0
gi\|6409176	水稻	15	49.5	0	gi\|56784524	水稻日本亚种	13	51.6	0
gi\|6409176	水稻	15	49.5	0	gi\|50059161	普通小麦	14	49.5	0
Ceres克隆：352232	玉蜀黍	16	48.5	0	gi\|50059161	普通小麦	14	49.5	0
Ceres克隆：352232	玉蜀黍	16	48.5	0	gi\|33411520	桃(prunus persica)	17	47.1	0
gi\|31429847	水稻	18	47.1	0	gi\|33411520	桃(prunus persica)	17	47.1	0

其它实施方式

应理解，虽然与本发明详述一起描述了本发明，但上述说明书旨在说明而非限制所附权利要求书的范围所确定的本发明范围。所附权利要求书的范围包括其它方面、优点和修改。

序列表

<110>Ceres，Inc.

<120>调节植物氮水平

<130>11696-150WO1

<150>US 60/705,119

<151>2005-08-02

<150>US 60/637,311

<151>2004-12-16

<160>25

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0.

<210>1

<211>1446

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1446)

<223>Ceres cDNAID编号2998984

<220>

<221>CDS

<222>(120)..(687)

<223>参见SEQ ID NO：2

<400>1

<210>2

<211>505

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(50)..(443)

<223>Pfam Name：PTR2；Pfam描述：POT家族

<400>2

<210>3

<211>1764

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1764)

<223>Ceres克隆ID编号117581

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1761)

<223>参见SEQ ID NO：4

<400>3

<210>4

<211>587

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(96)..(499)

<223>Pfam Name：PTR2；Pfam描述：POT家族

<400>4

<210>5

<211>580

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(580)

<223>Ceres克隆ID编号328378

<400>5

<210>6

<211>579

<212>PRT

<213>大麦(Hordeum vulgare)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(579)

<223>公共GI编号2655098

<400>6

<210>7

<211>580

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)(日本栽培种)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(580)

<223>公共GI编号34895718

<400>7

<210>8

<211>572

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)(日本栽培种)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(572)

<223>公共GI编号50933627

<400>8

<210>9

<211>580

<212>PRT

<213>番茄(Lycopersicon esculentum)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(580)

<223>公共GI编号4102839

<400>9

<210>10

<211>584

<212>PRT

<213>蚕豆(Vicia faba)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(584)

<223>公共GI编号31088360

<400>10

<210>11

<211>559

<212>PRT

<213>李子(prunus dulcis)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(559)

<223>公共GI编号6635838

<220>

<221>misc_feature

<222>(46)..(46)

<223>Xaa是任何aa、未知或其它

<400>11

<210>12

<211>557

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)(日本栽培种)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(557)

<223>公共GI编号56784523

<400>12

<210>13

<211>545

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)(日本栽培种)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(545)

<223>公共GI编号56784524

<400>13

<210>14

<211>586

<212>PRT

<213>普通小麦(Triticum aestivum)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(586)

<223>公共GI编号50059161

<400>14

<210>15

<211>584

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(584)

<223>公共GI编号6409176

<400>15

<210>16

<211>584

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(584)

<223>Ceres克隆ID编号352232

<220>

<221>misc_feature

<222>(524)..(524)

<223>Xaa是任何aa、未知或其它

<400>16

<210>17

<211>596

<212>PRT

<213>桃(prunus persica)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(596)

<223>公共GI编号33411520

<400>17

<210>18

<211>576

<212>PRT

<213>稻(oryza sativa)(日本栽培种)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(576)

<223>公共GI编号31429847

<400>18

<210>19

<211>1954

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1954)

<223>Ceres启动子p326

<400>19

<210>20

<211>881

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(881)

<223>Ceres启动子YP0144

<400>20

<210>21

<211>1002

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1002)

<223>Ceres启动子YP0190

<400>21

<210>22

<211>1514

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1514)

<223>Ceres启动子p13879

<400>22

<210>23

<211>1026

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1026)

<223>Ceres启动子YP0050

<400>23

<210>24

<211>2016

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2016)

<223>Ceres启动子p32449

<400>24

<210>25

<211>1823

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1823)

<223>Ceres启动子21876

<400>25

Claims

1.一种调节植物中氮水平的方法，所述方法包括将分离核酸引入植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4-18，和图1所示共有序列，所述植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含所述核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差异是氮水平升高。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离核酸操作性连接于调控区。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述调控区是选自下组的启动子：YP0092、PT0676、PT0708、PT0613、PT0672、PT0678、PT0688、PT0837、油菜籽蛋白启动子、Arcelin-5启动子、菜豆蛋白基因启动子、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子、ACP启动子、硬脂酰-ACP去饱和酶基因、β-伴大豆球蛋白的大豆α1亚基启动子、油质蛋白启动子、15kD玉米醇溶蛋白启动子、16kD玉米醇溶蛋白启动子、19kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、Osgt-1启动子、β-淀粉酶基因启动子和大麦醇溶蛋白基因启动子。

5.一种生产植物组织的方法，所述方法包括培养一种含有分离核酸的植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4-18，和图1所示共有序列，所述组织中的氮水平与不含所述核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

6.一种含有分离核酸的植物细胞，所述分离核酸包含编码与选自下组的氨基酸序列的序列相同性为80％或更高的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4-18，和图1所示共有序列，所述植物细胞产生的植物组织中的氮水平与不含所述核酸的对照植物组织中的相应水平有差异。

7.一种转基因植物，其包含权利要求6所述的植物细胞。

8.一种权利要求7所述的植物的子代，其特征在于，所述子代的氮水平与不含所述分离核酸的相应对照植物中的氮水平有差异。

9.一种权利要求7所述的转基因植物的种子。

10.一种权利要求7所述的转基因植物的营养组织。

11.一种食品，其包含权利要求7所述的转基因植物的营养组织。

12.一种饲料产品，其包含权利要求7所述的转基因植物的营养组织。