CN101589142B

CN101589142B - 甘油糖脂脂肪酶

Info

Publication number: CN101589142B
Application number: CN2008800028457A
Authority: CN
Inventors: 塚崎薰; 深沢徹也; 田中一新
Original assignee: Mitsubishi Chemical Foods Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2028-01-30
Also published as: JP2008206515A; JP5179208B2; EP2119781A4; EP2119781A1; CN101589142A; US20130122144A1; WO2008093720A1; DK2119781T3; EP2119781B1; US20110236531A1; US8338133B2

Abstract

本发明提供甘油糖脂脂肪酶，其安全性优异，具有在pH 6附近水解中性脂肪、甘油磷脂和甘油糖脂的能力，具有一定程度的热稳定性，且具有在水解卵磷脂的同时不水解溶血卵磷脂的性质；将所述甘油糖脂脂肪酶用于制面包用途时，单独使用即具有发起效果，不残存令人不快的气味。所述甘油糖脂脂肪酶来自丝状菌日本曲霉(Aspergillus japonicus)。

Description

甘油糖脂脂肪酶

技术领域

本发明涉及甘油糖脂脂肪酶、产生该脂肪酶的丝状菌、从丝状菌的培养物中分离精制该脂肪酶的方法、编码该脂肪酶的DNA和该脂肪酶的制造方法等。具体地说，本发明涉及特别适合在食品工业和医药品工业中使用的该脂肪酶、特别是来自丝状菌日本曲霉(Aspergillus japonicus)的甘油糖脂脂肪酶、产生该脂肪酶的丝状菌、从丝状菌的培养物中分离精制该脂肪酶的方法、编码该脂肪酶的DNA和该脂肪酶的制造方法、使用该脂肪酶的面包制造方法等。

背景技术

〔1〕糖脂脂肪酶

已知植物和微生物产生将甘油糖脂水解的脂肪酶。来自植物的酶主要具有水解甘油磷脂和甘油糖脂的能力，但其水解中性脂肪、尤其是水解甘油三脂的能力极低。已知还有来自微生物中的放线菌、细菌和霉菌的脂肪酶。来自放线菌和细菌的脂肪酶具有在水解甘油糖脂的同时还水解甘油磷脂的性质。已知来自丝状菌的脂肪酶水解中性脂肪、甘油磷脂和甘油糖脂。在本说明书中，甘油糖脂脂肪酶是指具有将甘油糖脂水解成溶血甘油糖脂和脂肪酸的活性(下文中称为“甘油糖脂分解活性”)的酶。双半乳糖二酰基甘油分解活性(下文中称为“DGDG分解活性”)是包括在甘油糖脂分解活性中的概念。另外，在本说明书中，“相对分解活性”是指，以在活性最高的pH或温度条件下的DGDG分解活性或卵磷脂分解活性为100％时，在各pH或温度条件下的DGDG分解活性或卵磷脂分解活性各自的相对值。另外，在本说明书中，“相对残存分解活性”是指，以在各pH或温度条件下处理后活性最高的pH或温度条件下的DGDG分解活性或卵磷脂分解活性为100％时，在各pH或温度条件下处理后的各 pH或温度条件下的DGDG分解活性或卵磷脂分解活性各自的相对值。

作为来自细菌的对甘油糖脂进行水解的脂肪酶，例如已知有来自棒杆菌(Cornebacterium efficiens)、褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)等的脂肪酶(专利文献1)。

作为来自放线菌的对甘油糖脂进行水解的脂肪酶，例如已知有来自链霉菌(Streptomyces sp.)的脂肪酶(专利文献1)。

作为来自霉菌的对甘油糖脂进行水解的脂肪酶，例如已知有来自镰孢霉(Fusarium venenatum)、硫色镰刀菌(Fusarium sulfureum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀霉(Fusariumu oxysporum)、贝克莱枝顶孢菌(Acremonium berkeleyanum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)等的脂肪酶(专利文献2～4)。

〔2〕甘油脂质

甘油糖脂主要存在于革兰氏阳性细菌和高等植物叶绿体中。甘油糖脂是1，2-二酰基甘油的3位上以共价键的形式结合有糖链的化合物。作为糖链包括半乳糖等，其组成比例根据来源而不同。例如甘油糖脂包括单半乳糖二酰基甘油(下文中称为“MGDG”)和双半乳糖二酰基甘油(下文中称为“DGDG”。)等。

甘油磷脂广泛分布在动物、植物、菌类中。甘油磷脂是在1，2-二酰基甘油的3位上以共价键的形式结合有磷酰基碱的化合物。作为碱包括胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇和甘油等，其组成比例根据来源而不同。例如甘油磷脂包括卵磷脂等。

中性脂肪也广泛分布在动物、植物、菌类中。中性脂肪是单酰基甘油、二酰基甘油、三酰基甘油的总称。

〔3〕卵磷脂或者甘油糖脂的酶处理

卵磷脂或者甘油糖脂在分子中具有2个疏水性的脂肪酸，其作为亲油性的表面活性剂而被熟知。利用脂肪酶将其中一个脂肪酸水解来增加亲水性，变成具有与卵磷脂或者甘油糖脂不同的性质的物质。实际上使磷脂酶作用于卵磷脂而生成的溶血卵磷脂是水溶性的，作为食品添加物使用时，由于所得到的食品的物性与卵磷脂不同，因而在食品工业中的应用仍在研究中。

甘油糖脂通过甘油糖脂脂肪酶也部分发生水解，由此能够产生溶血甘油糖脂。溶血甘油糖脂也成为亲水性增加的物质。例如，溶血甘油糖脂包括双半乳糖甘油一酯(下文中称为“DGMG”)等。

〔4〕甘油糖脂脂肪酶在食品中的使用

如果使用甘油糖脂脂肪酶，则可以如下图所示那样在水的存在下由甘油糖脂产生溶血甘油糖脂。

甘油糖脂溶血甘油糖脂

(式中，R₁和R₂分别表示烷基，Gal表示半乳糖。)

如果是兼具卵磷脂分解活性的酶，则还能够同时从卵磷脂产生作为溶血甘油磷脂的溶血卵磷脂。

卵磷脂溶血卵磷脂

(式中，R₁和R₂分别表示烷基，R₃表示胆碱、乙醇胺、甘油、肌醇等碱。)

通过在食品材料中发生这样的反应，能够提供含有亲水性表面活性剂的商品。

此外，在食品工业中，为了防止食品变质，大多在中性到弱酸性范围进行各种处理，期望酶剂在该pH范围仍具有高活性。

〔5〕制面包中的甘油糖脂脂肪酶的使用

在制造面包时，基于体积的增大和口感的改善等理由，多使用化学合成的表面活性剂。但是，近年来从逐步趋向自然的方面出发，需求一种在不添加合成表面活性剂的情况下所制造的面包。另外，以改善口感为目的，目前还在面包中添加油脂或者蛋黄等，但是，从提高健康的目的或者过敏问题的方面出发，期望制造不添加这些添加物的面包。

已知面包中使用的小麦粉中含有中性脂肪、甘油糖脂和甘油磷脂等(非专利文献1)。可以期待其中的甘油糖脂和甘油磷脂会起到表面活性剂的作用，然而若仅这样的话，则由于亲油性因而性能不能得到充分发挥。因此，若将这些脂质类部分水解，形成溶血甘油糖脂和溶血甘油磷脂，制成亲水性的表面活性剂，则能够充分发挥出性能。如果能够以小麦粉本身的成分来补充表面活性剂，则没有必要使用合成表面活性剂或者可以减少合成表面活性剂的用量。作为小麦粉中的成分，已知其中甘油糖脂的含量要多于甘油磷脂(非专利文献1)。因此，在制面包领域中，期望能够以与甘油磷脂相比更高的效率对甘油糖脂进行水解来产生溶血甘油糖脂从而提高其表面活性能力。进而希望对所产生的溶血甘油糖脂和溶血卵磷脂的酶活性低。即，希望对溶血磷脂酰胆碱(下文中称为“LPC”)的酶活性低。

此外，除了水解甘油糖脂和甘油磷脂以外还对中性脂肪进行水解的酶显示出在制面包中具有效果(专利文献5)。另一方面，也存在难以对中性脂肪进行水解的酶在制面包中具有效果的例子(专利文献6)。

另外，在制面包中，多在pH6左右混合原料，在30～42℃保温发酵。因此，希望所使用的甘油糖脂脂肪酶在这些条件下具有活性且稳定。

〔6〕已知的甘油糖脂脂肪酶的问题

起源于植物的脂肪酶在通用性上存在问题。对起源于细菌的脂肪酶没有详细记载。来自放线菌的甘油糖脂脂肪酶兼具卵磷脂分解活性。另外，起源于丝状菌的脂肪酶多来自病原菌，在安全性上存在部分问题。并且对于酶的性质没有详细记载。例如，据推测起源于作为植物病原菌的尖孢镰刀菌的脂肪酶在实际的制面包中也具有效果。但是，该脂肪酶最适pH为pH9左右，在制面包中重要的pH6的pH范围中的酶活性仅为最适pH下的酶活性的35％以下。另外据记载，起源于作为非病原菌的黑曲霉的脂肪酶在pH4.5或者pH5具有酶活性，但在制面包中被认为是重要的pH6左右的pH范围却不显示活性，不清楚是否具有效果。

如此，对于以往已知的甘油糖脂脂肪酶，仅得到不充分的效果的可能性较高，或者在安全性上存在问题，或者存在酶反应效率差等问题。作为理想的甘油糖脂脂肪酶的性质，可以举出：来自安全性上没有问题的微生物，具有在pH6左右高效水解甘油糖脂和甘油磷脂的能力，具有一定程度的热稳定性，以及溶血卵磷脂不发生水解。

专利文献1：WO2006008653

专利文献2：WO2002000852

专利文献3：US2006075518

专利文献4：WO2004018660

专利文献5：日本特许第3824174号

专利文献6：日本特表2007-528732

非专利文献1：Carr N.et.al.，Critical Reviews in Food Science andNutrition，1992年，31卷，p.237-258

发明内容

如上所述，作为理想的甘油糖脂脂肪酶的性质，可以举出：来自在安全性上没有问题的微生物，具有在pH6左右高效水解甘油糖脂的能力，具有一定程度的热稳定性。还可以举出具有在水解卵磷脂的同时不水解溶血卵磷脂的性质的甘油糖脂脂肪酶。

此外，在制面包领域中，对于现有的脂肪酶来说，存在单独使用时发起效果小，且残存奶酪臭等作为食品令人不快的气味这样的缺点。因此，期望开发出一种单独使用时具有发起效果、不残存令人不快的气味的甘油糖脂脂肪酶。

提供这样的甘油糖脂脂肪酶是在该技术领域中关心度非常高的事情。

本发明人为了发现一种在安全性上优异、具有在pH6左右高效水解甘油糖脂的能力、具有一定程度的热稳定性、具有在水解卵磷脂的同时不水解溶血卵磷脂的性质、用于制面包用途时单独使用即具有发起效果且不残存令人不快的气味、对小麦粉中的含量高于甘油磷脂的甘油糖脂进行高效水解的甘油糖脂脂肪酶而进行了深入研究，结果通过对来自日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株的甘油糖脂脂肪酶进行精制并将其基因克隆而完成了本发明。

即，本发明涉及以下技术方案。

(1)一种甘油糖脂脂肪酶，其显示出以下性质：

1)利用SDS-PAGE电泳法显示出分子量约29,000；

2)在pH6.0水解中性脂肪、卵磷脂和甘油糖脂；

3)在pH3.6～pH8.9的pH范围，甘油糖脂分解活性是卵磷脂分解活性的至少10倍。

(2)如技术方案1所述的甘油糖脂脂肪酶，其中，该甘油糖脂脂肪酶还显示出以下性质：

4)对甘油糖脂的相对分解活性在pH4.1～pH7.7的pH范围为至少80％以上；

5)对卵磷脂的相对分解活性在pH5.1～pH7.1的pH范围为至少80％以上；

6)在80℃以上的温度不具有上述5)记载的水解活性；

7)在pH4.1～pH10.7的pH范围具有75％以上的对甘油糖脂的相对残存分解活性。

(3)如上述(1)或(2)所述的甘油糖脂脂肪酶，其中，所述甘油糖脂脂肪酶来自丝状菌日本曲霉(Aspergillus japonicus)。

(4)如上述(3)所述的甘油糖脂脂肪酶，其中，丝状菌是日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株。

(5)一种甘油糖脂脂肪酶，其是下述a)～e)任一项所述的蛋白质：

a)由序列表的序列编号2记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

b)由下述氨基酸序列所构成的蛋白质，所述氨基酸序列是由序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；

c)由下述氨基酸序列所构成且具有甘油糖脂分解活性的蛋白质，所述氨基酸序列是在a)或b)中记载的氨基酸序列中有一个或两个以上的氨基酸发生了置换、缺失、插入或增加的氨基酸序列；

d)由下述氨基酸序列所构成且具有甘油糖脂分解活性的蛋白质，所述氨基酸序列是与上述a)中记载的蛋白质具有70％以上的氨基酸序列相同性的氨基酸序列；

e)包含a)或b)中记载的氨基酸序列的蛋白质。

(6)一种DNA，其为下述a)～e)任一项所述的DNA：

a)由序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列构成的DNA；

b)由与上述a)中记载的DNA具有70％以上的核苷酸序列相同性的核苷酸序列构成、且编码具有甘油糖脂分解活性的蛋白质的DNA；

c)与上述a)中记载的DNA在严格条件下进行杂交、且编码具有甘油糖脂分解活性的蛋白质的DNA；

d)编码由序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

e)通过含有序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列而构成的DNA。

(7)一种甘油糖脂脂肪酶，其由上述(6)所示的DNA编码。

(8)一种经分离的丝状菌日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株，其具有产生上述(1)～(5)或(7)任意一项所述的甘油糖脂脂肪酶的能力。

(9)一种甘油糖脂脂肪酶的制造方法，其包括下述1)～2)工序：

1)在产生甘油糖脂脂肪酶的条件下培养日本曲霉(Aspergillusjaponicus)的工序，

2)从1)的培养产物中分离出甘油糖脂脂肪酶并进行精制的工序。

(10)如上述(9)所述的方法，其中，日本曲霉(Aspergillus japonicus)是日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株。

(11)一种甘油糖脂脂肪酶，其通过上述(9)或上述(10)所述的方法制造。

(12)一种面包的制造方法，该方法使用上述(1)～(5)、(7)或(11)任一项所述的甘油糖脂脂肪酶。

(13)用于制造面包的上述(1)～(5)、(7)或(11)任一项所述的甘油糖脂脂肪酶。

附图说明

图1是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以DGDG为底物的pH活性的图。

图2是显示Lipopan F精制酶的以DGDG为底物的pH活性的图。

图3是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-1的以卵磷脂为底物的pH活性的图。

图4是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以卵磷脂为底物的pH活性的图。

图5是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以DGDG为底物的pH稳定性的图。

图6是显示Lipopan F精制酶的以DGDG为底物的pH稳定性的图。

图7是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以卵磷脂为底物的pH稳定性的图。

图8是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以DGDG为底物的温度活性的图。

图9是显示Lipopan F精制酶的以DGDG为底物的温度活性的图。

图10是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-1的以卵磷脂为底物的温度活性的图。

图11是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以卵磷脂为底物的温度活性的图。

图12是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以DGDG为底物的温度稳定性的图。

图13是显示Lipopan F精制酶的以DGDG为底物的温度稳定性的图。

图14是显示来自SANK 11298株的精制甘油糖脂脂肪酶G-2的以卵磷脂为底物的温度稳定性的图。

具体实施方式

下面详细说明本发明。

本发明涉及用于水解甘油糖脂的来自作为丝状菌的日本曲霉(Aspergillus japonicus)的甘油糖脂脂肪酶。

本发明的甘油糖脂脂肪酶中含有用于产生甘油糖脂脂肪酶的微生物的培养物中的具有甘油糖脂分解活性的蛋白质。作为这样的甘油糖脂脂肪酶的例子，可以举出来自日本曲霉(Aspergillus japonicus)的甘油糖脂脂肪酶。更适合的是来自日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株的甘油糖脂脂肪酶。

此外，作为本发明的甘油糖脂脂肪酶的另一个例子，可以举出由序列表的序列编号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

此外，在由序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质中，对于在1个或2个以上部位有1个或2个以上氨基酸残基发生置换、缺失、插入和/或增加的蛋白质，只要其具有甘油糖脂分解活性，也包含在本发明中。2个以上是指不超过10个的个数，优选是指不超过5个的个数。作为具有经置换的氨基酸序列的蛋白质具有与天然型蛋白质同等活性的例子，已知例如，将白细胞介素2(IL-2)基因的与半胱氨酸相当的核苷酸序列转化为与丝氨酸相当的核苷酸序列而得到的蛋白质仍保持IL-2的活性(Wang，A.et al.(1984)Science 224，1431-1433)。

作为本发明的蛋白质的其它例子，与由序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质具有70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上的核苷酸序列相同性的蛋白质只要具有甘油糖脂分解活性，则也包含在本发明中。

在本发明中，“本发明的DNA”是指编码本发明的甘油糖脂脂肪酶的DNA。作为DNA，可以采用cDNA、基因组DNA、人工改变的DNA、化学合成的DNA等现在已知的任意形态。

作为本发明的DNA的例子，可以举出作为序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列且编码具有甘油糖脂分解活性的蛋白质的DNA。

作为本发明的DNA的其它例子，可以举出与序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上的核苷酸序列相同性且编码具有甘油糖脂分解活性的蛋白质的DNA。作为这样的DNA，包括在自然界中发现的变异型DNA、人工改变的变异型DNA、来自异种生物的相同DNA等。

作为本发明的DNA的其它例子，可以举出与序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列在严格条件下杂交、且编码具有甘油糖脂分解活性的蛋白质的DNA。

作为本发明中的“严格条件”，可以举出例如，在Sambrook等编的“分子克隆法：实验室手册第二版(Molecular Cloning：A LaboratoryManual 2nd Ed.)”〔(美国冷泉港实验室出版社(1989))等中记载的条件。具体可以举出例如如下条件：(i)在含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt’s、100μg/mL变性片断化的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺的溶液中，与探针一同在42℃保温一夜；(ii)通过清洗除去经非特异性杂交的探针的步骤，此处，从进一步提高精度的方面考虑，在如下条件进行清洗：在例如2×SSC的更低的离子强度的条件下、更严格地在0.1×SSC等的条件下，和/或在更高的温度条件下进行清洗，所述温度例如为所使用的核酸的Tm值的40℃以下、更严格地在30℃以下、进一步严格地在25℃以下、更进一步严格地在10℃以下的温度，具体地说，该温度根据所使用的核酸的Tm值的不同而不同，但在25℃以上、更严格地在37℃以上、进一步严格地在42℃以上、更进一步严格地在50℃以上、再进一步严格地在60℃以上等。

需要说明的是，Tm例如通过下式求出：Tm＝81.5+16.6(log[Na⁺])+0.41(％G+C)-(600/N)(式中，N为寡聚核苷酸的链长，％G+C是寡聚核苷酸中的鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含量)。

此外，作为本发明的核苷酸的其他另外的例子，可以举出编码由序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。需要说明的是，对应于所期望的氨基酸的密码子的选择也是任意的，例如，可以考虑所利用的宿主的密码子的使用频率，根据常规方法来确定对应于所期望的氨基酸的密码子(Grantham，R.et al.(1981)Nucleic Acids Res.9，143-174)。另外，这些核苷酸序列的密码子的部分改变可以按照常规方法根据利用了由编码所期望的改变的合成寡聚核苷酸所构成的引物的位点特异性变异引入法(Mark，D.F.et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，5662-5666)等来进行。

作为本发明的DNA的另一例子，可以举出由序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列构成的DNA。另外，对于通过含有由序列表的序列编号1的核苷酸编号110～991所示的核苷酸序列构成的DNA而构成的DNA来说，只要其包含编码具有甘油糖脂分解活性的蛋白质的区域，就包含在本发明中。

此外，本发明的甘油糖脂脂肪酶可以举出由经本发明的DNA编码的氨基酸序列构成的蛋白质。另外，为了制作在本发明的甘油糖脂脂肪酶中缺失任意一个或者两个以上的氨基酸的改变体，可以使用利用核酸外切酶Bal31等从末端切割DNA的方法(岸本利光等“继生化学实验讲座1-基因研究法II”335-354)、盒式突变法(岸本利光、“新生化学实验讲座2-核酸III重组DNA技术”242-251)等进行。如此，即使是通过基于本发明的DNA的基因工程方法得到的蛋白质，只要具有甘油糖脂分解活性，就包括在本发明中。这样的甘油糖脂脂肪酶不一定具有序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列的全部，例如即使是含有其部分序列的蛋白质，只要该蛋白质显示出甘油糖脂分解活性，就包括在本发明的甘油糖脂脂肪酶中。另外，编码这样的甘油糖脂脂肪酶的DNA也包括在本发明中。

用于本发明的甘油糖脂脂肪酶可以直接使用从甘油糖脂脂肪酶产生菌的培养液中精制的物质、粗精制的物质、菌体的破碎液、以及菌体的培养上清。在培养甘油糖脂脂肪酶产生菌时，优选在培养基中添加碳源、氮源和表面活性剂来进行培养。或者优选在大豆粉、磨碎的芝麻、棉籽渣、米糠等天然材料的培养基中进行培养。作为表面活性剂，可以举出曲拉通(Triton)、吐温(Tween)、蔗糖脂肪酸酯、胆酸钠、脱氧胆酸钠和皂角苷等。

甘油糖脂脂肪酶产生菌的培养可以使用通常的培养装置、培养基来进行。对于培养，可以适当选择液体培养、固体培养等方法。液体培养的情况下，可以进行烧瓶培养、使用发酵槽的培养，在培养开始后，可以使用不追加培养基的分批培养法或适当地在培养中添加培养基的流加培养法。在培养基中添加碳源、氮源，根据需要可以添加维生素、微量金属等。作为碳源，可以举出葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖类；麦芽糖、纤维素二糖、异麦芽糖、乳糖、蔗糖等二糖类；淀粉等多糖类；麦芽提取物等，然而只要是甘油糖脂产生菌能生长的碳源，就不限定于这些。作为氮源，可以使用氨、硫酸铵、硝酸铵等无机氮；酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、胨等有机氮，但是只要是甘油糖脂脂肪酶产生菌能生长的氮源，就不限定于这些。另外，为了增加甘油糖脂脂肪酶产生菌的甘油糖脂脂肪酶的产生量，还可以在培养基中添加曲拉通、吐温、蔗糖脂肪酸酯、胆酸钠、脱氧胆酸钠、卵磷脂和皂角苷等表面活性剂。可以适当选择培养基中的这些组成物的量。可以适当选择培养温度、pH、通气搅拌量以便适合甘油糖脂脂肪酶产生。

在甘油糖脂脂肪酶产生菌的培养终止后，去除菌体，可以直接将培养上清作为粗酶液来使用。并且，还可以使用通过通常的再构成处理、利用蛋白沉淀剂的处理(盐析法)、离心分离、渗压震扰法、冰冻熔化法、超声波破碎、超滤、凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、高速液相色谱法(HPLC)等各种液相色谱法、透析法、它们的组合等对粗酶液进行粗精制或精制而成的物质。

众所周知，丝状菌在自然界中或通过人工操作(例如，紫外线照射、放射线照射、化学药品处理等)容易发生变异，本发明的日本曲霉(Aspergillus japonicus)在这方面也是同样的。本发明中所指的日本曲霉(Aspergillus japonicus)包括其全部的变异株。并且，这些变异株包括通过遗传方法例如重组、转导、转化等得到的物质。即，产生甘油糖脂脂肪酶的日本曲霉(Aspergillus japonicus)、其变异株以及与这些没有明确区别的菌株全部包括在日本曲霉(Aspergillus japonicus)中。

此外，对于本发明的甘油糖脂脂肪酶来说，还可以利用在载体中插入有本发明的DNA的重组质粒对宿主细胞进行转化，由该经转化的细胞的培养产物中得到该甘油糖脂脂肪酶。如此在适当的载体中插入有本发明的DNA的重组质粒也包含在本发明中。作为在这样的目的中使用的载体，可以使用通常已知的各种载体。作为适合的载体，可以举出原核细胞用载体、真核细胞用载体、来自哺乳动物的细胞用载体等，但不限于此。利用这样的重组质粒可以使其他的原核生物或真核生物的宿主细胞发生转化。另外，通过使用具有适当的启动子序列和/或与性状表达相关的序列的载体、或者引入这样的序列来制成表达载体，能够在各宿主中使基因得以表达。这样的表达载体是本发明的重组质粒的适宜方式。

通过将本发明的重组质粒引入各种细胞中，可以得到宿主细胞。这样的细胞只要是能够引入质粒的细胞即可，可以是原核细胞，也可以是真核细胞。

作为原核细胞的宿主，可以举出例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)等。为了使目的基因在这些宿主细胞内转化，使用来自能与宿主适合的种的复制子即复制起点和包含调节序列的质粒载体对宿主细胞进行转化。并且，作为载体，优选具有能对转化细胞赋予表型性状(表型)的选择性的序列的载体。

例如，常使用K12株等作为大肠杆菌，作为载体，通常使用pBR322、pUC系的质粒，但不限于此，公知的各种菌株和载体均可使用。

作为启动子，对大肠杆菌来说，可以举出色氨酸(trp)启动子、乳糖(lac)启动子、色氨酸-乳糖(tac)启动子、脂蛋白(lpp)启动子、多肽链延伸因子Tu(tufB)启动子等，上述任意启动子均可以用于本发明的甘油糖脂脂肪酶的产生。

作为枯草杆菌优选例如207-25株，作为载体，使用pTUB228(Ohmura，K.et al.(1984)J.Biochem.95，87-93)等，但并不限于此。

作为启动子，通过连接编码枯草杆菌的α-淀粉酶的信号肽序列的DNA序列，也能够在菌体外分泌表达。

真核细胞的宿主细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等的细胞，作为脊椎动物细胞，常使用来自哺乳动物的细胞，例如，猴子细胞COS细胞 (Gluzman，Y.(1981)Cell 23，175-182、ATCC CRL-1650)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞、ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶缺失株(Urlaub，G.andChasin，L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4126-4220)等，但不限于这些。

作为脊椎动物细胞的表达启动子，通常可以使用位于要表达的基因的上游的启动子、具有RNA的剪接位点、多聚腺苷化位点和转录终止序列等的启动子，另外，该启动子根据需要可以具有复制起点。作为该表达载体的例子，可以举出具有SV40初期启动子的pSV2dhfr(Subramani，S.et al.(1981)Mol.Cell.Biol.1，854-864)等，但不限于此。

以使用COS细胞作为宿主细胞的情况为例进行例举时，作为表达载体，可以使用具有SV40复制起点，在COS细胞中能够独立增殖，并且具备转录启动子、转录终止信号和RNA剪接位点的载体。该表达载体可以通过二乙基氨基乙基(DEAE)-右旋糖苷法(Luthman，H.and Magnusson，G.(1983)Nucleic Acids Res，11，1295-1308)、磷酸钙-DNA共沉淀法(Graham，F.L.and van der Eb，A.J.(1973)Virology 52，456-457)、和电脉冲穿孔法(Neumann，E.et al.(1982)EMBO J.1，841-845)等进入COS细胞中，如此能够得到所期望的转化细胞。另外，在使用CHO细胞作为宿主细胞时，通过将能够表达起到抗生物质G418耐性标记作用的neo基因的载体(例如pRSVneo(Sambrook，J.et al.(1989)：″分子克隆法：实验室手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)″美国冷泉港实验室，纽约)、pSV2-neo(Southern，P.J.and Berg，P.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)等)与表达载体一同共转染，并选择G418耐性的菌落，能够得到稳定产生本发明的甘油糖脂脂肪酶的转化细胞。

将昆虫细胞用作宿主细胞时，鳞翅目夜蛾科的草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的卵巢细胞衍生株化细胞(Sf-9或Sf-21)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的卵细胞衍生High Five细胞(Wickham，T.J.et al，(1992)Biotechnol.Prog.I：391-396)等常用作宿主细胞，作为杆状病毒转移载体，常使用利用了苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白质的启动子的pVL1392/1393(Kidd，I.M.and V.C.Emery(1993)The use of baculoviruses as expression vectors.Applied Biochemistry and Biotechnology 42，137-159)。除此以外，也可以使用利用了杆状病毒的P10、同碱性蛋白质的启动子的载体。另外，通过将AcNPV的包膜表面蛋白质GP67的分泌信号序列连接在目的蛋白质的N末端侧，也能够使重组蛋白质作为分泌蛋白质来表达(Zhe-mei Wang，et al.(1998)Biol.Chem.，379，167-174)。

作为以真核微生物为宿主细胞的表达类，通常熟知的是酵母，其中优选酵母属酵母，例如面包酵母Saccharomyces cerevisiae、石油酵母PichiaPastoris。作为该酵母等真核微生物的表达载体，例如，可以优选利用醇脱氢酶基因的启动子(Bennetzen，J.L.and Hall，B.D.(1982)J.Biol.Chem.257，3018-3025)、酸性磷酸酯酶基因的启动子(Miyanohara，A.et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，1-5)等。另外，作为分泌型蛋白质来表达时，也可以作为在N末端侧具有分泌信号序列以及宿主细胞所具有的内在性蛋白酶或者已知的蛋白酶的切断位点的重组体来表达。例如，已知在用石油酵母使胰岛素型丝氨酸蛋白酶的人类肥大细胞类胰蛋白酶表达的体系中，通过将酵母的α因子的分泌信号序列和石油酵母所具有的KEX2蛋白酶的切断位点连接在N末端侧来表达，活性型类胰蛋白酶分泌在培养基中(Andrew，L.Niles，et al.(1998)Biotechnol.Appl.Biochem.28，125-131)。

如上得到的转化体可以按照常规方法来培养，通过该培养在细胞内或细胞外产生本发明的甘油糖脂脂肪酶。作为该培养所用的培养基，可以根据所采用的宿主细胞来适当选择惯用的各种培养基，例如，如果是上述COS细胞，可以使用在RPMI1640培养基或Dulbecco改良Eagle培养基(下文中称为“DMEM”)等培养基中根据必要添加有胎牛血清等血清成分的培养基。作为培养条件，只要CO₂浓度处于0～50％的范围即可，优选CO₂浓度为1～10％，更优选CO₂浓度为5％。培养温度为0～99℃即可，优选为20～50℃，更优选为35～40℃。

通过上述培养在转化体的细胞内或细胞外以重组蛋白质的形式产生的本发明的甘油糖脂脂肪酶可通过利用了该蛋白质的物理化学性质、化学性质、生化性质(酶活性等)等的各种分离操作(参照《生化数据手册II》、 1175-1259项、第1版第1次印刷、1980年6月23日株式会社东京化学同人发行；Biochemistry，vol.25，No.25，p8274-8277(1986)；Eur.J.Biochem.，163，p313-321(1987)等)从培养产物中分离出来并精制。作为该方法，具体可例举出例如，通常的再构成处理、利用蛋白沉淀剂的处理(盐析法)、离心分离、渗压震扰法、冰冻熔化法、超声波破碎、超滤、凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、高速液相色谱法(HPLC)等各种液相色谱法、透析法、它们的组合等。据此能够以高收率工业规模制造所期望的重组蛋白质。另外，在表达的重组蛋白质中连接由6残基构成的组氨酸，由此能够以镍亲和柱高效地进行精制。通过组合上述方法，能够容易地以高收率、高纯度大量制造本发明的甘油糖脂脂肪酶。

作为本发明的优选的例子，也可以举出利用上述那样的方法制造的甘油糖脂脂肪酶。

甘油糖脂脂肪酶产生菌是指实质上先天具有甘油糖脂脂肪酶产生能力的微生物，包括在菌体内蓄积甘油糖脂脂肪酶的微生物、将甘油糖脂脂肪酶分泌至菌体外的微生物等。使用甘油糖脂脂肪酶产生菌的培养上清或从培养上清精制得到的甘油糖脂脂肪酶时，可以使用将甘油糖脂脂肪酶分泌至菌体外的菌。

作为用于本发明的甘油糖脂脂肪酶，可以使用日本曲霉(Aspergillusjaponicus)的甘油糖脂脂肪酶，更优选使用来自日本曲霉(Aspergillusjaponicus)SANK 11298株的甘油糖脂脂肪酶。甘油糖脂脂肪酶既可以来自这些日本曲霉(Aspergillus japonicus)自身，也可以来自其变异体或修饰体，还可以是由将编码这些甘油糖脂脂肪酶产生菌的甘油糖脂脂肪酶的基因引入宿主中得到的转化体产生的重组蛋白质。

作为产生甘油糖脂脂肪酶的微生物，没有特别限定，可以举出曲霉属丝状菌，优选为日本曲霉(Aspergillus japonicus)，更优选为日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株(以下称为“SANK 11298株”)。SANK11298株是从采集于群马县的土壤中分离出的。

按照Klich的文献(Klich，M.A.(2002)Identification of commonAspergillus species.The Centraalbureau voor Schimmelcultures，Utrecht，The Netherlands)，将SANK 11298株接种在3种培养基(CYA培养基、MEA培养基和CY20S培养基)中，观察菌学性状。3种培养基(CYA培养基、MEA培养基和CY20S培养基)的组成如下。

CYA培养基(Czapek Yeast Extract Agar培养基)

KH₂PO₄ 1g

Czapek浓缩液10ml

(NaNO₃ 30g，KCl 5g，MgSO₄·7H₂O 5g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，CuSO₄·5H₂O0.05g，蒸馏水100ml)

酵母提取物 5g

蔗糖 30g

琼脂 15g

蒸馏水 1000ml

MEA培养基(Malt Extract Agar培养基)

麦芽提取物 20g

胨 1g

葡萄糖 20g

琼脂 20g

蒸馏水 1000ml

CY20S培养基(Czapek Yeast Extract Agar with 20％sucrose培养基)

KH₂PO₄ 1g

Czapek浓缩液 10ml

酵母提取物 5g

蔗糖 200g

琼脂 15g

蒸馏水 1000ml

对于CYA培养基上的菌落的直径，在25℃培养7天时为62-64mm。菌落具有放射状沟纹。分生孢子形成部为绒状，呈土黄色(5F4)。菌丝体呈白色。观察不到菌核、可溶性色素、浸出液。背面呈浅橙色(5A3)。对于MEA培养基上的菌落的直径，在25℃培养7天时为62-65mm。分生孢子没有密集地形成。菌丝体呈白色。没有观察到浸出液。背面颜色无变化。对于CY20S培养基上的菌落的直径，在25℃培养7天时为58-61mm。菌落厚，菌丝体呈白色。没有观察到分生孢子、浸出液。背面呈黄白色(4A2)。对于37℃的CYA培养基上的菌落的直径，培养7天时为13-17mm。菌落具有放射状沟纹。观察到可溶性色素，其为淡褐色，中心部呈淡红色。背面呈棕色(7F4)或绿褐色(7E3)。需要说明的是，色调的表示基于梅休因色彩手册(Kornerup A.& Wanscher J.H.1978.Methuenhandbook of colour(3rd.edition).Erye Metuen，London)。

分生孢子头为放射状。分生孢子柄为(100-)300-800(-1200)×3.5-9μm、平滑、呈无色或前端呈淡褐色。顶囊宽为(11-)20-39μm、为球形。曲霉是一列。瓶梗为6-8×3-3.5μm，形成的尺寸为顶囊的3/4以上。分生孢子的直径为3.5-5×3-4μm，形状从球形到亚球形或常常为椭圆形，表面为针状。

根据以上的菌学性状，除了在CY20S培养基上的性状以外，其它与Klich的文献(上面已给出)中记载的日本曲霉的性状一致，因此确定SANK11298株为日本曲霉。

SANK 11298株在平成18年12月27日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-10753。

由甘油糖脂脂肪酶产生菌得到的甘油糖脂脂肪酶的具体性质如下所示，但本发明的甘油糖脂脂肪酶具有的性质并不限于这些。

利用SANK 11298株产生并经精制得到的甘油糖脂脂肪酶具有以下性质。

1)利用SDS-PAGE电泳法显示出分子量约29,000；

2)在pH6.0水解中性脂肪、卵磷脂和甘油糖脂；

3)在pH3.6～pH8.9的pH范围，甘油糖脂分解活性是卵磷脂分解活性的至少10倍；

6)在80℃以上的温度不具有上述5)记载的水解活性；

7)在pH4.1～pH10.7的pH范围，具有75％以上的对甘油糖脂的相对残存分解活性。

在各种pH下测定对甘油糖脂DGDG的脂肪酸游离活性(下文中称为“DGDG分解活性”)和对大豆卵磷脂的脂肪酸游离活性(下文中称为“卵磷脂分解活性”)。关于以各pH下的DGDG分解活性为100％时的相对卵磷脂分解活性，下面给出本发明的酶与制面包业中广泛使用的脂肪酶Lipopan F(注册商标、LipoPan F、novozymes Japan)的比较。需要说明的是，来自大豆的卵磷脂从辻制油株式会社购入。以下卵磷脂是指来自大豆的卵磷脂。

本发明的酶(甘油糖脂脂肪酶G-2)

pH DGDG分解活性卵磷脂分解活性

3.6 100 2.6

4.1 100 4.6

4.9 100 5.9

5.9 100 6.1

6.7 100 5.3

7.7 100 4.6

8.1 100 6.8

8.9 100 8.5

Lipopan F精制酶

pH DGDG分解活性卵磷脂分解活性

3.4 100 41.4

4.1 100 142

5.1 100 220

5.9 100 186

6.9 100 171

7.7 100 118

8.5 100 118

9.2 100 110

9.9 100 106

由上可知，本发明的酶在pH3.6～pH8.9的pH范围，甘油糖脂分解活性是卵磷脂分解活性的至少10倍。相对于此，市售的脂肪酶Lipopan F在pH3.4～pH9.9的pH范围，甘油糖脂分解活性最多是卵磷脂分解活性的3倍，在pH4.1～pH9.9的pH范围，甘油糖脂分解活性是卵磷脂分解活性的同等以下。

此外，利用SANK 11298株产生、并精制得到的甘油糖脂脂肪酶具有序列编号3所示的部分氨基酸序列。序列从N末端起书写。

由上可知，作为本发明的甘油糖脂脂肪酶具有的性质，可以举出如下性质，但并不限于此。

1)利用SDS-PAGE电泳法显示出分子量约29,000；

2)在pH6.0水解中性脂肪、卵磷脂和甘油糖脂；

6)在80℃以上的温度不具有上述5)记载的水解活性；

此外，制造本发明的甘油糖脂脂肪酶的方法也包含在本发明中。

通过在培养基中培养以SANK 11298株为首的甘油糖脂脂肪酶产生微生物，可以产生甘油糖脂脂肪酶。例如，在0.1～5.0％葡萄糖(和光纯药株式会社制造)、0.1～5.0％酵母提取物(Difco株式会社制造)、0.1～5.0％酪蛋白氨基酸(Difco)、0.1～5.0％Tween80(Sigma-Aldrich Japan Co.Ltd.)、0.01～1.0％磷酸氢二钾、0.005～1.0％硫酸镁中添加有0.05～5.0％磨碎的芝麻的培养基中，在16～45℃以100～250rpm振荡培养1～15天。

实施例

下面给出实施例和试验例，但本发明的范围并不限于这些。

实施例1.来自SANK 11298株的甘油糖脂脂肪酶的精制

1)粗酶液的制备

在装有100ml经灭菌的具有下述组成的培养基的500ml容积的三角烧瓶中接种SANK 11298株的菌体，在26℃以170rpm振荡培养4天。

培养基组成

葡萄糖 20g

酵母提取物 10g

酪蛋白氨基酸 10g

磨碎的芝麻 20g

Tween80 10g

磷酸氢二钾 0.1g

硫酸镁 0.05g

用纯水调成1,000ml。

培养终止后，在4℃、10,000×G的条件下离心分离10分钟。所得到的上清作为粗酶液。

2)酶活性测定法

甘油糖脂脂肪酶的水解活性如下测定。

1.以DGDG为底物的情况(DGDG分解活性)

将从日清制粉株式会社的日清面粉薄力小麦粉中提取、精制得到的在TLC中显示为一个点(one spot)且在质谱中显示与SIGMA D4651-10MG双半乳糖甘油二酯同样的结果的级分作为以下的DGDG。

将200mg DGDG溶解于10ml 4％Triton X-100中，制成2％DGDG溶液。将210μl 2％DGDG溶液和30μl 400mM MOPS缓冲液(pH6)的混合液在37℃保温5分钟，向保温后的溶液中添加30μl酶液，搅拌均匀后，在37℃保温10分钟。加入30μl 1N盐酸，使酶反应停止。酶液用1％TritonX-100稀释后使用。

2.以卵磷脂或LPC为底物的情况(卵磷脂分解活性)

将200mg卵磷脂(SLP-white、辻制油株式会社制造)溶解于10ml4％Triton X-100中，制成2％卵磷脂溶液。将500μl 2％卵磷脂溶液和250μl200mM MOPS缓冲液(pH6)的混合液在37℃保温5分钟，向保温后的溶液中添加150μl酶液，搅拌均匀后，在37℃保温10分钟。加入100μl 1N盐酸，使酶反应停止。酶液用1％Triton X-100稀释后使用。以LPC为底物的情况也与上述的条件同样地进行。

3.以橄榄油为底物的情况(中性脂肪分解活性)

将10ml水加到200mg橄榄油(Nacalai Tesque株式会社制造)和100mg阿拉伯胶(和光纯药工业株式会社制造)中，用搅拌机(日本精机株式会社制造)以10,000rpm的条件乳化1分钟。将200μl乳化后的溶液、100μl200mM MOPS缓冲液(pH6)和20μl 100mM氯化钙溶液的混合液在37℃保温5分钟，向保温后的溶液中添加40μl酶液，搅拌均匀后，在37℃保温10分钟。加入40μl 1N盐酸，使酶反应停止。向该混合液中加入400μl 4％Triton X-100，使游离脂肪酸溶解。

4.游离脂肪酸的定量

用NEFA(协和医药株式会社制造)对由酶反应所产生的游离脂肪酸进行定量。在遮光条件下将3ml NEFA溶液添加到30μl上述1.或2.或3.中得到的反应液中，在37℃反应10分钟。测定该混合液在660nm的吸光度。对于DGDG分解活性，将由DGDG在1分钟产生1μmol的游离脂肪酸的酶量定义为1个单位。对于卵磷脂分解活性，将由卵磷脂在1分钟产生1μmol的游离脂肪酸的酶量定义为1个单位。对于中性脂肪分解活性，将由橄榄油在1分钟产生1μmol的游离脂肪酸的酶量定义为1个单位。

3)精制酶液的制备

在500ml 1)中得到的粗酶液中加入硫酸铵(和光纯药株式会社制造)，调整最终浓度为1M。将其添加到预先用1M硫酸铵平衡化的TOYOPEARL Butyl 650M(东曹株式会社制造)柱(直径2.2cm×长度20cm)中进行吸附。在用1M硫酸铵充分清洗该柱后，在600ml中制作1～0M/0.1％Tween80的硫酸铵的线性浓度梯度，使吸附在该柱上的成分溶出。卵磷脂分解活性溶出在硫酸铵浓度为0M～0.2M的级分(120ml)中。将其作为粗精制酶级分。

将120ml所得到的活性级分在4,000ml的10mM Tris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)中透析3次，每次12小时，然后添加到预先用10mM Tris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)平衡化的TOYOPEARL DEAE 650M(东曹株式会社制造)柱(直径2.2cm×长度20cm)中进行吸附。将该柱用10mM Tris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)充分清洗后，在10mM Tris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)中制作0～1.0M的氯化钠的线性浓度梯度，使吸附在该柱上的成分溶出。卵磷脂分解活性溶出在氯化钠浓度为0.42M～0.59M的级分(120ml)中。

将40ml所得到的活性级分浓缩，添加到预先用含0.15M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化的HiLoad Sephadex200pg(GEHealthcare Biosciences株式会社制造)柱(直径16mm×60cm)中后，用含0.15M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)进行溶出。卵磷脂分解活性溶出在溶出量为60ml～67.5ml和81ml～90ml的级分中。前者为甘油糖脂脂肪酶G-1、后者为甘油糖脂脂肪酶G-2。

将该级分作为精制酶溶液。

4)精制酶的分子量测定

通过使用12.5％聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE电泳法(参照Laemmli，U.K.，Nature，227，680(1970))，求出精制酶的分子量。使用如下物质作为标准蛋白质：a.磷酸化酶，分子量97,000；b.白蛋白，分子量66,000；c.卵清蛋白，分子量45000；d.碳酸酐酶，分子量30,000；e.胰蛋白酶抑制剂，分子量20,100；f.α-乳白蛋白，分子量14,400。甘油糖脂脂肪酶G-1和甘油糖脂脂肪酶G-2均显示出分子量约29,000的单一条带。

5)等电点的测定

使用PhastGel IEF 3-9(Amersham Biosciences株式会社制造)进行测定。甘油糖脂脂肪酶G-2显示pI4.5左右。使用如下物质作为标准蛋白质：a.戊基葡萄糖苷酶，pI3.50；b.胰蛋白酶抑制剂，pI4.55；c.β-乳球蛋白A，pI 5.20；d.碳酸酐酶B(牛)，pI 5.85；e.碳酸酐酶B(人)，pI 6.55；f.肌红蛋白酸性条带，pI 6.85；g.肌红蛋白碱性条带，pI 7.35；h.晶体状凝集素酸性，pI 8.15；i.晶体状凝集素中性，pI 8.45；j.晶体状凝集素碱性，pI 8.65；k.胰蛋白酶原，pI 9.30。

实施例2.来自Lipopan F的甘油糖脂脂肪酶的精制

在Lipopan F(20g)中加入1M硫酸铵溶液，使酶溶出后，将沉淀去除。将上清添加到预先用1M硫酸铵平衡化的TOYOPEARL Butyl 650M(东曹株式会社制造)柱(直径2.2cm×长度20cm)中进行吸附。用1M硫酸铵充分清洗该柱后，在600ml中制作1～0M/0.1％Tween80的硫酸铵的线性浓度梯度，使吸附在该柱上的成分溶出。卵磷脂分解活性溶出在硫酸铵浓度为0M～0.2M的级分(120ml)中。将其作为Lipopan F粗精制酶级分。

将120ml所得到的活性级分在4,000ml的10mM Tris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)中透析3次，每次12小时，然后添加到预先用10mM Tris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)平衡化的TOYOPEARL DEAE 650M(东曹株式会社制造)柱(直径2.2cm×长度20cm)中进行吸附。将该柱用10mMTris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)充分清洗后，在10mM Tris-盐酸/0.1％Tween80缓冲液(pH8)中制作0～1.0M的氯化钠的线性浓度梯度，使吸附在该柱上的成分溶出。卵磷脂分解活性溶出在氯化钠浓度为0.42M～0.59M的级分(120ml)中。

将该级分作为Lipopan F的精制酶。

实施例3.来自SANK 11298株的甘油糖脂脂肪酶的N末端氨基酸序列的确定

利用实施例1.4)所示的方法对精制的酶施用SDS-PAGE后，在PVDF膜上印迹。对其用氨基酸序列解析装置(Procise cLC、Applied Biosystem)解析氨基酸序列。其结果得到的部分氨基酸序列从氨基末端侧开始书写(序列编号3)。

实施例3.编码SANK 11298株的甘油糖脂脂肪酶的DNA的鉴定

1)全RNA的精制

将SANK 11298株在20ml液体培养基(2％多聚蛋白胨(和光纯药株式会社制造)、0.5％酵母提取物、0.02％磷酸氢二钾、0.05％硫酸镁)中于26℃进行前培养2天。其后，在液体培养基(2％葡萄糖、1％酵母提取物、1％酪蛋白氨基酸、2％磨碎的芝麻、1％Tween80、0.1％磷酸氢二钾、0.02％硫酸镁)中进行1％的接种，于26℃培养4天。对培养后的菌体进行抽吸集菌，转移到冷却至-80℃的研钵(已高压釜灭菌)中。一边加入液氮，一边用研棒破碎菌体，使成粉末状。使用RNeasy Plant MiniKit(Qiagen株式会社制造)对完全变为粉末状的菌体进行全RNA的精制。得到50μl浓度为660ng/μg的溶液。

2)甘油糖脂脂肪酶基因的解读

用5’RACE法和3’RACE法进行基因序列的解读。具体地说，使用5’RACE System和3’RACE System(均为Invitrogen株式会社制造)，使用EX Taq^TM(Takara Bio株式会社制造)作为聚合酶进行PCR。对于此时使用的PCR引物，在5’侧的基因序列扩增用途中使用序列编号4以及5、3’侧的基因序列扩增用途中使用序列编号6和7。在PCR循环中，以94℃·5分钟、(94℃·30秒、55℃·30秒、72℃·2分30秒)×30、72℃·10分钟在4℃扩增。5’侧的基因序列约1,000bp长度的DNA扩增、3’侧的基因序列约1,200bp长度的DNA扩增。

对各PCR产物进行了琼脂糖凝胶电泳后，用Qiaquick Gel ExtractionKit(Qiagen株式会社制造)进行精制。使用TOPO^TMTA克隆试剂盒 (Invitrogen株式会社制造)将精制物与载体连接，进行转化。将转化的大肠杆菌于37℃在琼脂培养基(LB/Agar(和光纯药株式会社制造))上培养一夜后，将生长的菌落于37℃在液体培养基(LBbroth(和光纯药株式会社制造))中培养一夜。使用Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen株式会社制造)从生长的大肠杆菌中精制质粒，进行DNA序列解析。DNA序列解析的结果表示在序列编号1中。并且，将从DNA序列推定的氨基酸序列表示在序列编号2中。

试验例1.来自SANK 11298株的甘油糖脂脂肪酶的精制酶液的诸性质

对实施例1.3)中得到的精制酶液进行活性测定。

1)底物选择性

制备各底物的2％溶液，根据实施例1.2)的方法，酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-2或者实施例2.给出的Lipopan F精制酶进行测定。用将DGDG分解活性设为100％时的相对活性来表示。卵磷脂表示SLP-white。LPC来自大豆，从Sigma-Aldrich Japan购入。

底物 G-2 Lipopan F未精制酶 Lipopan F精制酶

DGDG 100 100 100

卵磷脂 6.1 229 186

LPC 0.5 9.9 0.7

橄榄油 28.3 27.4 ND

2)pH活性

1.将DGDG用于底物的情况

根据实施例1.2)1.中给出的方法进行活性测定。酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-2或者实施例2.给出的Lipopan F精制酶。对于缓冲液，pH3-6使用乙酸缓冲液、pH6-8使用MOPS缓冲液、pH8-11使用Atkins-Pantin缓冲液。各pH下的这两种酶的相对分解活性记载于下文中。另外，使用甘油糖脂脂肪酶G-2时的结果表示在图1中，使用LipopanF精制酶时的结果表示在图2中。

pH活性(图1和图2)

G-2 Lipopan F精制酶

pH 相对活性(％) pH 相对活性(％)

3.6 78.2 3.4 8.7

4.1 87.0 4.1 12.3

4.9 96.4 5.1 18.4

5.9 99.3 5.9 31.1

6.7 100 6.9 52.7

7.7 90.5 7.7 88.2

8.1 64.1 8.5 92.7

8.9 43.7 9.2 100

9.6 13.5 9.9 94.3

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对活性的pH定义为最适pH。因此，本发明的甘油糖脂脂肪酶G-2的最适pH为pH4.1～7.7。另外，Lipopan F精制酶的最适pH为pH7.7～9.9。另外，对于具有90％以上相对活性的pH，甘油糖脂脂肪酶G-2为4.9～7.7、Lipopan F精制酶为8.5～9.9。

2.将卵磷脂用于底物的情况

根据实施例1.2)2.中给出的方法进行活性测定。酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-1或者甘油糖脂脂肪酶G-2。缓冲液使用如下物质：pH3.4～pH6.1的情况使用乙酸-乙酸钠缓冲液；pH6.0～pH8.0的情况使用MOPS缓冲液；pH7.5～pH9.0的情况使用Tris-盐酸缓冲液。各pH下的这两种酶的相对分解活性记载于下文中。另外，使用甘油糖脂脂肪酶G-1时的结果表示在图3中，使用甘油糖脂脂肪酶G-2时的结果表示在图4中。

pH活性(图3和图4)

pH 相对活性(％)

G-1 G-2

3.4 37.9 40.1

4.1 62.9 67.6

5.1 79.3 94.2

6.0 100 100

7.1 88.3 93.9

8.0 72.9 71.8

9.0 55.0 60.3

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对活性的pH定义为最适pH。因此，以卵磷脂为底物时的本发明的甘油糖脂脂肪酶G-1的最适pH为pH6.0～7.1。另外，甘油糖脂脂肪酶G-2的最适pH为pH5.1～7.1。

3)pH稳定性

1.将DGDG用于底物的情况

酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-2或者实施例2.中给出的Lipopan F精制酶，将10μl上述甘油糖脂脂肪酶G-2或Lipopan F精制酶和190μl 20mM缓冲液/1％Triton X-100溶液的混合液于37℃保温30分钟后，立刻冰冷。对于缓冲液，pH3-6使用乙酸缓冲液、pH6-8使用MOPS缓冲液、pH8-11使用Atkins-Pantin缓冲液。将各加温酶液用水稀释10倍后马上采用实施例1.2)1.的方法测定相对残存分解活性。以活性最高的pH条件下的残存分解活性为100％，将各pH下的酶的相对残存分解活性以相对值记载于下文中。另外，使用甘油糖脂脂肪酶G-2时的结果表示在图5中，使用Lipopan F精制酶时的结果表示在图6中。

pH稳定性(图5和图6)

相对残存分解活性(％)

pH G-2 Lipopan F精制酶

3.4 45.7 68.1

4.1 77.8 81.0

5.1 99.6 93.7

6.1 99.0 96.3

6.9 96.3 100

7.8 97.4 99.0

8.4 93.5 91.8

9.0 94.6 92.5

9.8 100 89.1

10.7 91.5 39.0

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对残存分解活性的pH定义为稳定pH。因此，本发明的甘油糖脂脂肪酶G-2的稳定pH为pH5.1～10.7。另外，Lipopan F精制酶的稳定pH为pH4.1～9.8。

2.将卵磷脂用于底物的情况

在50μl实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-2中添加50μl以下所述的各pH的200mM缓冲液，在37℃保温30分钟。缓冲液使用如下物质：pH3.0～pH6.0的情况使用乙酸-乙酸钠缓冲液；pH5.9～pH7.9的情况使用MOPS缓冲液；pH7.6～pH9.0的情况使用Tris-盐酸缓冲液。将各加温酶液用水稀释10倍后立刻采用实施例1.2)2.的方法测定相对残存分解活性。将活性最高的pH条件下的残存分解活性设为100％，将各pH下的酶的相对残存分解活性以相对值记载于下文中。另外，结果见图7。

pH稳定性(图7)

pH 相对残存分解活性(％)

3.0 69.4

4.0 85.4

4.9 87.1

6.0 100

7.0 100

7.5 100

7.9 100

9.0 100

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对残存分解活性的pH定义为稳定pH。因此，以卵磷脂为底物时的本发明的甘油糖脂脂肪酶G-2的稳定pH为pH4.0～9.0。

4)温度活性

1.将DGDG用于底物的情况

测定MOPS缓冲液(pH6)中的温度活性。酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-2或者实施例2.中给出的Lipopan F精制酶。测定法基于实施例1.2)1.中给出的方法。各温度下的这两种酶的相对分解活性记载于下文中。另外，使用甘油糖脂脂肪酶G-2时的结果表示在图8中，使用Lipopan F精制酶时的结果表示在图9中。

温度活性(图8和图9)

温度(℃) 相对活性(％)

G-2 Lipopan F精制酶

37 95.1 94.9

40 97.7 100

45 100 95.6

50 86.1 90.5

55 50.4 55.5

60 33.5 17.3

65 12.1 4.8

70 8.2 7.6

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对活性的温度定义为最适温度。因此，以DGDG为底物时的本发明的甘油糖脂脂肪酶G-2的最适温度为37～50℃。另外Lipopan F精制酶的最适温度也为37～50℃。

2.将卵磷脂用于底物的情况

测定MOPS缓冲液(pH6)中的温度活性。酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-1或者甘油糖脂脂肪酶G-2。测定法基于实施例1.2)2.中给出的方法。各温度下的这两种酶的相对分解活性记载于下文中。另外，使用甘油糖脂脂肪酶G-1时的结果表示在图10中，使用甘油糖脂脂肪酶G-2时的结果表示在图11中。

温度活性(图10和图11)

温度(℃) 相对活性(％)

G-1 G-2

30 100 100

35 96.2 94.7

40 99.5 87.6

45 88.0 90.0

50 88.5 75.6

55 79.3 79.9

60 76.0 70.8

65 68.8 65.6

70 47.6 45.4

75 10.1 12.4

80 0.5 6.7

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对活性的温度定义为最适温度。因此，以卵磷脂为底物时的甘油糖脂脂肪酶G-1的最适温度为30～50℃。另外，甘油糖脂脂肪酶G-2的最适温度为30～45℃。

5)温度稳定性

1.将DGDG用于底物的情况

在预先保持在处理温度的37.5μl 400mM MOPS缓冲液(pH6)和62.5μl 1％Triton X-100溶液中加入50μl精制酶液，搅拌均匀后，保温30分钟，然后立刻冰冷。酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-2或者实施例2.中给出的Lipopan F精制酶。测定法基于实施例1.2)1.中给出的方法。将活性最高的温度条件下的残存分解活性设为100％，将各温度的酶的相对残存分解活性以相对值记载于下文中。另外，使用甘油糖脂脂肪酶G-2时的结果表示在图12中，使用Lipopan F精制酶时的结果表示在图13中。

温度稳定性(图12和图13)

温度(℃) 相对残存活性(％)

G-2 LipopanF精制酶

4 99.0 100

37 100 99.4

40 99.0 98.1

45 68.3 75.2

50 32.8 6.5

55 26.1 0.1

60 9.6 0.0

65 3.2 1.2

70 1.9 0.0

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对残存活性的温度定义为稳定温度。因此，以DGDG为底物时的本发明的甘油糖脂脂肪酶G-2的稳定温度为4～40℃。另外，Lipopan F精制酶的稳定温度也为4～40℃。

2.将卵磷脂用于底物的情况

在预先保持在处理温度的37.5μl 400mM MOPS缓冲液(pH6)和62.5μl 1％Triton X-100溶液中加入50μl精制酶液，搅拌均匀后，保温30分钟，然后立刻冰冷。酶使用实施例1.3)中给出的甘油糖脂脂肪酶G-2。测定法基于实施例1.2)2.中给出的方法。将活性最高的温度条件下的残存活性设为100％，将各温度的酶的相对残存分解活性以相对值记载于下文中。另外，结果表示在图14中。

温度活性(图14)

温度(℃) 相对残存活性(％)

4 100

30 100

35 100

40 100

45 100

50 100

55 100

60 86.2

65 22.5

70 0.0

需要说明的是，在本发明中，将具有80％以上的相对残存活性的温度定义为稳定温度。因此，以卵磷脂为底物时的本发明的甘油糖脂脂肪酶G-2的稳定温度为4～60℃。

试验例2.溶血甘油糖脂生成的确认

1)试样制作

在210μl实施例1.2)1.中记载的2％DGDG溶液中加入30μl 400mMMOPS缓冲液(pH6)和30μl实施例1.3)中记载的甘油糖脂脂肪酶G-2，在37℃进行酶反应4小时。用毛细管点滴在硅胶板(No.5626)3×10cm上，每滴为1μl，用展开溶剂展开。展开后，喷雾显色试剂，用加热板加热，使其显色。

TLC条件

板：薄层色谱法玻璃板

(Merck株式会社制造硅胶60 No.5626)

展开溶剂：三氯甲烷∶甲醇∶水∶乙酸乙酯∶2-丙醇(5∶2∶1∶5∶5)

显色试剂(苔黑酚-硫酸)：其是将20mg苔黑酚一水合物(NacalaiTesque株式会社制造)溶解在1.1ml浓硫酸中，慢慢地加到一边用冰冷却一边搅拌的9ml蒸馏水中而制备的。(保存在冷暗处)

呈色反应：将显色试药喷雾到展开后的板上，用加热板加热使之显色。

Rf值：DGDG为0.35左右、DGMG为0.20左右。

2)利用质谱确认DGMG

利用LC/MS法测定分子量。

测定条件LC：Waters Acquity

柱：UPLC BEH C18 2.1×100mm 1.7μm

洗脱液条件：A＝H₂O(0.1％HCOOH) B＝CH₃CN

梯度条件：0min.10％B→8min.100％B(保持2min.)

流速：0.2ml/min.

MS：Waters LCT Premier XE

离子化法：ESI(+/-)

锥孔电压：+/-50V

用LC将DGDG分离或将在1)中分离出的DGMG分离，用MS测定最大峰部分的分子量。DGDG在m/z974处观察到峰、DGMG在m/z701处观察到峰。

试验例3.制面包试验

1)面包的烤制

将280g强力面粉、11g黄油、2大勺砂糖、1大勺脱脂乳、1小勺盐、200ml水、1小勺干酵母、72.5个单位的甘油糖脂脂肪酶G-2或者LipopanF精制酶(DGDG分解活性)混合，用家庭用面包机(Panasonic(株)SD-BT50)烤面包。烤制后冷却到室温左右，装入塑料袋中密封后，在放有装入了水的盘皿的20℃的恒温槽内保存一天。其后测定比容等。

2)面包的比容

用菜籽置换法求出面包的比容。与不添加酶的情况相比，观察到添加了本发明的甘油糖脂脂肪酶G-2的情况下面包的比容增加了2.7％。添加Lipopan F精制酶的情况下面包的比容减少了13％。

3)面包的香味

1.利用感观评价

用3名被测者来对烤出后经过1天的面包判断令人不快的奶酪臭，以判断的平均值来表示。但是，以使用Lipopan F精制酶时的气味为10来表示。

没有添加酶 G-2 Lipopan F精制酶

奶酪臭 0 4 10

2.使用GC/MASS分析气味成分

在下述条件下对面包的约1g的中心部分进行分析。

GC/MS(EI)条件

装置(GC)：HP6890(Agilent社制造)

(MS)：MASS Sensitive Detector 5973N

(Agilent社制造)

柱：HP-INNOWAX(L：60m*ID：0.25，Df：0.5μm)

(Agilent社制造)

柱流量：1.8ml/min.(恒流)

载气：氦气

脱附条件：250℃(8分钟)在GC进样口

注入口温度：250℃

柱温度：40℃：13min.～10℃/min.～250℃*15min.

检测器：MS(EI Scan-Positive)

通过与标准品的保留时间进行比较，进行峰的鉴定。

对下述化合物发现差异。表示的是以使用Lipopan F精制酶时为100的相对值。

未添加酶 G-2 Lipopan F精制酶

己酸乙酯 22.5 26.4 100

辛酸乙酯 15.9 46.3 100

癸酸乙酯 12.1 65.7 100

9-癸烯酸乙酯 N.D. 64.6 100

肉豆蔻酸异丙酯 N.D. N.D. 100

辛酸 N.D. 43.2 100

此处N.D.表示没有检测出。在上述化合物中，通常已知辛酸使面包发出令人不快的山羊的奶酪臭。使用了本发明的酶的情况中，上述化合物的产生量减少。

如上所述，本发明的甘油糖脂脂肪酶来自日本曲霉(Aspergillusjaponicus)SANK 11298株，在安全性方面优异，具有水解中性脂肪、甘油磷脂和甘油糖脂的能力，在弱酸性附近具有最高的活性，同时具有一定程度的热稳定性，是实质上不水解溶血甘油糖脂和溶血甘油磷脂的酶，在食品工业和制面包工业的任意领域均能产生优异的效果。

序列表

<110>三菱化学食品株式会社

<120>甘油糖脂脂肪酶

<130>FP2952PCT

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1101

<212>DNA

<213>日本曲霉

<220>

<221>CDS

<222>(110)..(991)

<223>

<400>1

ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc gcccttgctc cttgcctgtt cgttttggtt 60

atcgacttga cctgggttgg cgctgtatat atactcccaa actgcaagc atg gta tat 118

Met Val Tyr

1

ttc act cgt ttg ggt ggg gtg gtg gcc gct ctt gcg gcc ttg gtt gtg 166

Phe Thr Arg Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Val

5 10 15

gct gct ccg gtt gat att cga gat gtc tcg acc act gtc tac acg cag 214

Ala Ala Pro Val Asp Ile Arg Asp Val Ser Thr Thr Val Tyr Thr Gln

20 25 30 35

ctg gat ctg ttc gcg caa tac tcc gcc gcg gcg tac tgc tcg acc aac 262

Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Thr Asn

40 45 50

ctc gat tcc ccg aat acg agc gtg acc tgc acg aac gga ctt tgt ccg 310

Leu Asp Ser Pro Asn Thr Ser Val Thr Cys Thr Asn Gly Leu Cys Pro

55 60 65

tta ctc gca gct gcc acg acc aag agt ctg gcc gag ttc gag gct tct 358

Leu Leu Ala Ala Ala Thr Thr Lys Ser Leu Ala Glu Phe Glu Ala Ser

70 75 80

gat tcc tac ggc gat aca gca gga ttc ctc gtg gtt gac tcc acc aac 406

Asp Ser Tyr Gly Asp Thr Ala Gly Phe Leu Val Val Asp Ser Thr Asn

85 90 95

aag aag ctg gtg gtg tcg ttc cgc gga agc agc tcg att gag aac tgg 454

Lys Lys Leu Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Glu Asn Trp

100 105 110 115

atc gcc aat ttg gac ttc atc ttc acg gat gcc agc gcg gtc tgc agt 502

Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile Phe Thr Asp Ala Ser Ala Val Cys Ser

120 125 130

ggc tgc cag gtc cac cag ggc ttc tgg aag gcc tgg agc tct gtc gcg 550

Gly Cys Gln Val His Gln Gly Phe Trp Lys Ala Trp Ser Ser Val Ala

135 140 145

gac acc ttg acg acg gag atc gcg tct gcg gta acc gct tac ccc ggc 598

Asp Thr Leu Thr Thr Glu Ile Ala Ser Ala Val Thr Ala Tyr Pro Gly

150 155 160

tat agc ctg gtg ttc acg ggg cat agt ctg gga gga gcg ttg gcg acc 646

Tyr Ser Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr

165 170 175

atc ggc gcg acg gtg ctg cgg aat gcg gga tac tcc gtt caa ctg tat 694

Ile Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Ser Val Gln Leu Tyr

180 185 190 195

tcc tat gga gcg ccc cga gtg ggc aac acg gcg ctg gcc aac tat atc 742

Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Thr Ala Leu Ala Asn Tyr Ile

200 205 210

acg agc aaa ggc tct ggc tcg aat ttc cga gtg act cac ctc aac gat 790

Thr Ser Lys Gly Ser Gly Ser Asn Phe Arg Val Thr His Leu Asn Asp

215 220 225

gtc gtg cct aga ctt ccg ccg aga ctg ctt ggt tat agt cac cca agc 838

Val Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Leu Leu Gly Tyr Ser His Pro Ser

230 235 240

ccg gaa tac tgg atc act agc gga act ggt gct gca gtg acc tca tcg 886

Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ala Val Thr Ser Ser

245 250 255

gat atc gac atc atc cag ggc gtc gac tcc tct gct gga aac gcg ggg 934

Asp Ile Asp Ile Ile Gln Gly Val Asp Ser Ser Ala Gly Asn Ala Gly

260 265 270 275

gag aat atc acc agc gtg ctg gcg cac ctg tgg tac ttc atc agt att 982

Glu Asn Ile Thr Ser Val Leu Ala His Leu Trp Tyr Phe Ile Ser Ile

280 285 290

ggc act tgt taatcgttgt acatatgtga ggtatgagac aatgtgggaa 1031

Gly Thr Cys

gggcgaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gagcatgcat ctagagggcc 1091

caatcgccct 1101

<210>2

<211>294

<212>PRT

<213>日本曲霉

<400>2

Met Val Tyr Phe Thr Arg Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Leu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Val Val Ala Ala Pro Val Asp Ile Arg Asp Val Ser Thr Thr Val

20 25 30

Tyr Thr Gln Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys

35 40 45

Ser Thr Asn Leu Asp Ser Pro Asn Thr Ser Val Thr Cys Thr Asn Gly

50 55 60

Leu Cys Pro Leu Leu Ala Ala Ala Thr Thr Lys Ser Leu Ala Glu Phe

65 70 75 80

Glu Ala Ser Asp Ser Tyr Gly Asp Thr Ala Gly Phe Leu Val Val Asp

85 90 95

Ser Thr Asn Lys Lys Leu Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile

100 105 110

Glu Asn Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile Phe Thr Asp Ala Ser Ala

115 120 125

Val Cys Ser Gly Cys Gln Val His Gln Gly Phe Trp Lys Ala Trp Ser

130 135 140

Ser Val Ala Asp Thr Leu Thr Thr Glu Ile Ala Ser Ala Val Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Pro Gly Tyr Ser Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala

165 170 175

Leu Ala Thr Ile Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Ser Val

180 185 190

Gln Leu Tyr Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Thr Ala Leu Ala

195 200 205

Asn Tyr Ile Thr Ser Lys Gly Ser Gly Ser Asn Phe Arg Val Thr His

210 215 220

Leu Asn Asp Val Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Leu Leu Gly Tyr Ser

225 230 235 240

His Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ala Val

245 250 255

Thr Ser Ser Asp Ile Asp Ile Ile Gln Gly Val Asp Ser Ser Ala Gly

260 265 270

Asn Ala Gly Glu Asn Ile Thr Ser Val Leu Ala His Leu Trp Tyr Phe

275 280 285

Ile Ser Ile Gly Thr Cys

290

<210>3

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端序列

<400>3

Asp Val Ser Thr Thr Val Tyr Thr Gln Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gcacacttca tgcatcatat aca 23

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

cccacattgt ctcatacctc a 21

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cgtctgcgtt tgctgatatt 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gctccttgcc tgttcgtttt 20

Claims

1.一种甘油糖脂脂肪酶，该甘油糖脂脂肪酶来自日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株，并且显示出以下性质：

1)利用SDS-PAGE电泳法显示出分子量约29,000；

2)在pH6.0水解中性脂肪、卵磷脂和甘油糖脂；

3)在pH3.6～pH8.9的pH范围，甘油糖脂分解活性是卵磷脂分解活性的至少10倍，

其中，SANK 11298株的保藏编号为FERM BP-10753。

2.如权利要求1所述的甘油糖脂脂肪酶，其中，该甘油糖脂脂肪酶还显示出以下性质：

4)对甘油糖脂的相对分解活性在pH4.1～pH7.7的pH范围为80％以上；

5)对卵磷脂的相对分解活性在pH5.1～pH7.1的pH范围为80％以上；

6)在80℃以上的温度不具有上述5)中所述的水解活性；

3.一种经分离的丝状菌日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK 11298株，其具有产生权利要求1或2所述的甘油糖脂脂肪酶的能力，SANK11298株的保藏编号为FERM BP-10753。

4.一种甘油糖脂脂肪酶的制造方法，该方法包括下述1)～2)工序：

1)在产生甘油糖脂脂肪酶的条件下培养日本曲霉(Aspergillusjaponicus)的工序，所述日本曲霉为日本曲霉(Aspergillus japonicus)SANK11298株，该SANK 11298株的保藏编号为FERM BP-10753；

2)从1)的培养产物中分离具有权利要求1或2所述的性质的甘油糖脂脂肪酶并进行精制的工序。

5.一种甘油糖脂脂肪酶，该甘油糖脂脂肪酶是通过权利要求4所述的方法制造的。

6.一种面包的制造方法，该方法使用权利要求1、2或5所述的甘油糖脂脂肪酶作为添加物。

7.作为添加物用于制造面包的、权利要求1、2或5所述的甘油糖脂脂肪酶的应用。