CN101663389A

CN101663389A - 敲除酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN101663389A
Application number: CN200880000969A
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 马玉超; 刘昌春; 沈忠耀
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2008-03-24
Filing date: 2008-03-24
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2028-03-24
Also published as: US8518685B2; CN101663389B; WO2009117843A1; US20110104690A1

Abstract

本发明公开了一种产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用，本发明产腈水合酶工程菌就是敲除或抑制了产腈水合酶原始菌株中的酰胺酶基因后得到的产腈水合酶突变菌株。该工程菌的构建方法是利用携带酰胺酶基因片断的重组自杀质粒，与野生菌的酰胺酶基因进行同源重组，通过自杀质粒大片断的插入阻断野生菌中酰胺酶基因的表达。本发明的产腈水合酶工程菌与相应的野生菌相比，其细胞生长和腈水合酶表达均有所提高；并且在催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺的过程中，产物丙烯酰胺的生成量显著提高，副产物丙烯酸的生成量大大降低。产品质量高，精制成本低，在微生物法生产丙烯酰胺过程中具有广泛的应用前景。

Description

敲除酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体地说涉及一种敲除了酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和这种腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺上的应用。背景技术

聚丙烯酰胺 (PAM)被称为 "百业助剂"，在三次采油、水处理、造纸、采矿、冶金、洗煤和制造高吸水性树脂等工业生产领域具有非常广泛的应用。聚丙烯酰胺的单体——丙烯酰胺（Acrylamide, 分子式为 C₃H₅NO，结构式为 H₂C=CHCONH₂)的生产一般是以丙烯腈为原料，进行催化水合而成。丙烯酰胺的水合方法经历了硫酸水合法、铜催化法、微生物法三个发展阶段。由于微生物法具有反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等优点，目前，已经成为丙烯酰胺生产的主要方法。

利用微生物法生产丙烯酰胺的方法主要从菌株的筛选和驯化以及生产工艺的建立和改造等两个方面开展工作。

在生产菌株的发现、驯化、诱变和改造方面，日本山田秀明研究组在专利《生物学生产酰胺的方法》（专利号： ZL88106735 ) ) 中公开了一种野生玫瑰色红球菌 J-1 ; 日本化学工业株式会社在专利《利用微生物制备酰胺的方法》（专利号： ZL86100062) 公开了一种红球菌 S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；英国西巴特殊化学水处理有限公司在专利《紫红红球菌菌株 NCIMB 41164及其生产腈水合酶的用途》（申请号： 200480035487.1 ) 中公幵了一种了紫红红球菌 NCIMB 41164菌株或其突变体；美国亚什兰许可和知识产权有限公司在专利《腈水合酶生产菌株紫红红球菌 M33的培养方法》（申请号： 200480043243.8) 中公开了一种紫红红球菌 M33 ; 上海市农药所在专利《微生物催化法生产丙烯酰胺》（申请号： 03115536.7)中公开了野生丙酸棒杆菌及其驯化菌株等不同的微生物进行丙烯酰胺的微生物法生产；清华大学在专利《提高腈水合酶产物耐受性的定向培育法》（专利号为： ZL03130658) 中公开了获得耐受性腈水合酶的方法。

近年来，在转化丙烯腈生产丙烯酰胺的基因研究及基因工程改造方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》（申请号：，93106122.9).; 三井. 化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌 JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》（专利号： ZL99106291.4), 《新型腈水合酶》（专利号： 02156180.X), 并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》

(申请号： 200580008206.8 ) ; 日本三菱丽阳株式会社公开了《改良型腈水合酶》（申请号： 200580016665.0)，提供了对腈水合酶基因进行定点突变来提高耐热性的方法；清华大学从诺卡氏菌中克隆获得了腈水合酶基因并申请了专利

《一种腈水合酶及其编码基因与应用》（专利号： ZL 200410042576.0)，进一步对该基因在重组大肠杆菌中的突变和高表达进行了研究。

在利用腈水合酶生产丙烯酰胺的菌株中，除腈水合酶外，还都存在酰胺酶 (amidase),酰胺酶可以将腈水合酶催化产生的丙烯酰胺进一步转化生成副产物丙烯酸，从而严重影响丙烯酰胺的质量和产量，同时增加分离纯化的难度和生产成本。腈水合酶基因与酰胺酶基因通常以一个大基因簇的形式（如： Pseudomonas Chlororaphis B23 、 Rhodococcus sp. N771 、 Rhodococcus rhodochrous Jl、 Rho dococcus sp. RHAl及 Bac illus sp. BR449等）或者独立基因族的形式 (如： Nocardia farcinica IFM 10152^Λ Rhodococcus rhodochrous sp. M8等）存在于菌株的染色体基因组中 (Brandao等. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69 (10)： 5754-5766； Ryabchenko等. Genetika, 2006, 42(8):1075-82.)o 如果能抑制或敲除酰胺酶基因，可以避免在丙烯酰胺生产过程中大量生成副产物丙烯酸，从而减轻精制工段的分离纯化压力，显著降低生产成本。

本发明通过敲除产腈水合酶菌株中的酰胺酶基因，达到在生产丙烯酰胺过程中阻抑副产物丙烯酸的生成的目的。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种敲除酰胺酶基因的产腈水合酶基因工程菌。本发明第二个目的是提供上述产腈水合酶工程菌的构建方法。

本发明第三个目的是提供上述产腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺上的应用。 .

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：本发明一种产腈水合酶工程菌，是指抑制或敲除了产腈水合酶原始菌株中的酰胺酶基因后得到的产腈水合酶突变菌株。

上述产腈水合酶原始菌株是指能表达腈水合酶基因，并能利用腈水合酶生产丙烯酰胺的菌株，如红球菌、诺卡氏菌、嗜热假诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、丙酸棒杆菌或其它产腈水合酶的革兰氏阳性菌等。

上述产腈水合酶工程菌是指红色红球菌 TH3(amdA-) CRhodococcus ruber TH3(amdA-) ) ,或其突变菌株等；所述的红色红球菌 TH3(amdA-)于 2008年 2 月 27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为 CGMCC No. 2381。红色红球菌 TH3(amdA-)是以红色红球菌 TH为出发菌，敲除酰胺酶基因后而获得的产腈水合酶工程菌。其酰胺酶基因被阻断表达，并携带四环素抗性基因。

上述红色红球菌 TH3(amdA-)的出发菌株是红色红球菌 TH C Rhodococcus rubber TH) , 该菌株于 2008年 2月 27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为 CGMCC No. 2380。

上述红色红球菌 TH C Rhodococcus rubber TH) 的筛选过程：

( 1 ) 将分别来自北京清华园、江苏南通、北京圆明园等地的池塘边、路边、果树下和化工厂附近的土样共 25份，各称取 l g，加入 10ml 无菌水溶解。然后转入 121 °C、 15min高温灭菌的 40ml富集培养基中（培养基的组成为：葡萄糖 10g/L， K₂HP0₄ 0.8g/L, KH₂P0₄ 3.3g/L, MgS0₄ H₂0 0.2 g/L, NaCl lg/L， FeS0₄ · 7H₂0 10 mg/L, CaCl₂ 15 mg/L,丙烯腈 lg/L， pH 7.0-7.2 ) ，并在 28 °C、转速为 200rpm摇床上培养 3〜4天。取所培养的上述菌液 1ml转接入新鲜的富集培养基中，共反复富集 3次。将富集培养得到的菌液稀释不同浓度梯度，然后取 200ul涂布在固体富集培养基平板上（培养基组成为：在上述富集培养基中加入 15g/L琼脂粉）。在 28°C培养箱中培养 2〜3天，平板上出现不同形态的单菌落。挑取不同形态的单菌落进行摇瓶培养（培养基组成为：葡萄糖 20g L，酵母膏 5.0g/L , 尿素 7.5g/L， KH₂P0₄ 0.75 g L , K₂HP0₄ 0.75 g L， MgS0₄-7H₂0 1.0 g/L, 味精 0.75 g L， CoCl₂ 0.06 mM， pH 7.5 , 其余为水）在 28 。C、 200rpm摇床培养 72小时，然后取样 lml，再在 8000 rpm离心 3min，用等体积水重悬。加入丙烯腈进行催化水合，水合液采用气相色谱检测（王铁钢，罗晖，等，气相色谱法快速定量检测丙烯腈的生物催化产物，分析试验室， 2007， 26(1)： 54-57 ) , 能够生成丙烯酰胺的菌株即为目标菌株。 (2)从上述样品中选出一株菌落形态为圆形、边缘规则、桔红色、表面光滑的菌株，检测结果表明具有高腈水合酶活性。设计引物 16SP1和 16SP2, 进行 PCR扩增，得该菌株的 16SrDNA序列，所述的引物序列为：

16SP1: 5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3 ' (SEQ ID NO: 4)， 16SP2: 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3 ' ( SEQ ID NO： 5)；测序得到 1487bp 16SrDNA序列（见 SEQ ID NO: 6);

(3) 经基因序列数据库 NCBI检索比对，发现上述 16SrDNA序列与红球菌 Rhodococcus 具有高同源性。其中，与标准菌株 R. rwb DSM43338^T的同源性为 99%，与 R. rhodochrous DSM 4324 的同源性为 91%,与 R. coprophilus DSM43347^T的同源性为 96%，与 R. r/zoi Y DSM43336^T的同源性为 96%。因此，说明该菌株属于红球菌属，并且与其他菌株不同，是一个新菌株，最后将该菌株分类命名为 (Rhodococcus ruber) TH。

本发明一种敲除酰胺酶基因的腈水合酶工程菌的构建方法，主要是利用基因单交换同源重组方法，将需要敲除的酰胺酶基因片段（SEQIDNO:3)插入自杀质粒载体，构建重组自杀质粒，然后将重组自杀质粒采用电穿孔转化法转入宿主菌进行同源交换，通过抗性筛选获得发生基因同源重组后酰胺酶基因被阻断的重组工程菌。

本发明一种敲除酰胺酶基因的腈水合酶工程菌的构建方法，按照如下步骤进行：

(1) 以 P1和 P2为引物，以携带有酰胺酶基因的原始菌的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，并回收扩增片段；所述的引物为：

上游引物 PI ： 5'-TCAGAATTCGCGGTGGTCAACTACAAGA-3' (下划线部分为 £o?RI酶切位点）（SEQIDNo:l)，

下游引物 P2: 5'-GATGGATCCAACAGGTGATTCTGGGACTG-3' (下划线部分为 ^zmM酶切位点）； (SEQIDNo:2);

(2)将步骤（1)所得扩增片段与质粒载体分别用 ^RI酶和^ 酶在 36〜38°C下进行双酶切反应 4〜6h; 然后将酶切产物纯化，再用 T4 DNA连接酶在 3〜5°C进行连接反应 14〜16h，得连接反应物；

(3)将连接反应物转化 CO//JM109感受态细胞，涂布 LB固体培养基上，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有酰胺酶基因片段的重组自杀质粒； (4) 将重组自杀质粒以电穿孔转化法转入原始菌；

(5) 将步骤（4)所得转化后的菌液涂布在抗生素抗性 LB固体培养基上，筛选阳性菌落，即获得了阻断酰胺酶基因表达的产腈水合酶工程菌。

上述构建方法步骤（1 ) 和步骤（4) 中所述的原始菌是指红球菌、诺卡氏菌、嗜热假诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、丙酸棒杆菌或其它产腈水合酶的革兰氏阳性菌。

上述构建方法步骤（2) 中所述的质粒载体可以是 pPHU2 81 (Hiibner P等. Mol Microbiol. 1993;10:123-132.)或其衍生质粒、大肠杆菌 pUC系列或 pET系列等质粒载体。

上述构建方法步骤（2) 中酶切产物的纯化可以采用 PCR产物回收试剂盒或其它分子克隆中常用的纯化方法。

上述构建方法步骤（3 )中所述的酰胺酶基因片段是指含有 SEQ ID NO: 3 所示的 DNA序列、 SEQ ID NO: 3所示序列的延伸片段、 SEQ ID NO: 3所示序列的部分片段、或与 SEQ ID NO: 3所示序列具有 70%以上同源性的 DNA .序列或片段等。

上述构建方法步骤（3 )中所述的重组自杀质粒携带的酰胺酶基因可与宿主菌中的酰胺酶基因发生同源单交换重组；携带抗生素抗性标记基因的重组自杀质粒大片断插入到宿主菌基因组中的酰胺酶基因内部，阻断 ¾胺酶基因的表达。

上述构建方法步骤（5 ) 中所述的筛选的标记基因可以是四环素抗性基因、卡那霉素抗性、红霉素抗性基因、氯霉素抗性基因及其它抗生素抗性基因。

红色红球菌 TH3(amdA-)的构建，按照上述构建方法进行构建，其中所述的原始菌为红色红球菌 TH; 所述的质粒载体为 pPHU281，所得重组自杀质粒为 pPHUA。

上述 LB 固体培养基的组成和配制方法参见 J.萨姆布鲁克和 D.W.拉赛尔著的《分子克隆指南》。

本发明所述的重组自杀质粒不含有宿主菌的复制子，因而在宿主菌中不能复制和遗传，会很快丢失。在自杀质粒上携带酰胺酶基因片段，可以与宿主菌染色体在较短时间内容发生同源重组，将质粒上的抗性基因插入到染色体的酰胺酶基因中，导致宿主菌的酰胺酶基因表达被阻断。没有发生重组的自杀质粒则在随后的菌株培养过程中丢失，因而不会影响菌株的性能。上述腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺上的应用。

利用上述敲除了酰胺酶基因的腈水合酶工程菌生产丙烯酰胺的方法，包括如下步骤：

( 1 )将在 4°C保藏的腈水合酶工程菌接入种子培养基中，在 28〜30°C、转速为 150〜250rpm的摇床上培养 32〜56小时，得到腈水合酶工程菌的种子液；所述的种子培养基的组成及其比例为：葡萄糖 10〜30g/L，酵母膏 l〜5g/L，蛋白胨 5〜10g/L， KH₂P0₄ 0.5〜0.75g/L， K₂HPO₄0.5〜0.75g/L， MgS0₄'7H₂0 0.5〜 l .Og/L, pH 7〜8，四环素： 10〜60mg/L，其余为水；

( 2 )按照 0.5〜10%的体积百分比将步骤（1 ) 的种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中，在 28〜30° (：、 pH7.5〜8.5条件下培养 36〜72小时，得发酵液；对发酵液进行离心，得产腈水合酶工程菌；所述发酵培养基的组成比例为：葡萄糖 10〜40g/L，酵母膏 5.0〜 10.0 g/L，尿素 5.0〜10.0g/L， KH₂P0₄ 0.5〜1.0g/L， K₂HPO₄ 0.5〜1.0g/L， MgS0₄'7H₂0 0.5〜1.5g/L，味精 0·5〜1.5 g/L， CoCl₂ 0.04〜0.12 mM， pH 7.5—8.5 , 其余为水；

( 3 ) 按照 5〜20 %的体积百分比配制步骤（2 ) 所得产腈水合酶工程菌细胞的水悬浮液，重悬液的酶活力为 1500〜4000U/ml;

( 4 ) 将步骤（3 ) 得到的细胞悬浮液加入水合反应釜或锥形瓶中，然后向釜内或瓶中流加丙烯腈，在 15 °C〜30°C， pH 6.5〜8.5条件下反应 1〜6小时，检测丙烯酰胺浓度，丙烯酰胺浓度达到 20〜50 % ( W/V) 时结束水合反应，得丙烯酰胺。

上述生产方法步骤（4 ) 中所述的反应温度可通过液氨、低温冷冻盐水、冷却水或低温乙醇等调节。

本发明的优点和有益效果：（1 ) 本发明腈水合酶工程菌的细胞生长和腈水合酶表达不受酰胺酶基因敲除的影响，反而略有提高；（2 ) 本发明腈水合酶工程菌在催化生产丙烯酰胺过程中，副产物丙烯酸的生成量大大降低，如本发明所得敲除了酰胺酶基因的红球菌，与野生红色红球菌 Rhodococcus ruber ΎΗ相比，副产物丙烯酸的生成量降低了 90 %左右；（ 3 )利用本发明工程菌株生产丙烯酰胺，可以提高水合温度，减少精制负担，从而降低生产成本，且产品质量高，适于工业化的生产。

附图说明

图 1 携带酰胺酶基因片段的重组自杀质粒 pPHUA的构建示意图。具体实施方式

实施例 1 '

携带酰胺酶基因片段的重组自杀质粒 pPHUA的构建

以红色红球菌 Rhodococcus ruber T Η的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，采用上游引物 PI : 5'-TCAGAATTCGCGGTGGTCAACTACAAGA-3' (下划线部分为^: coRI酶切位点），和下游引物 P2: 5,-GATGGATCCAACAGGTGA TTCTGGGACTG-3' (下划线部分为^ zm /I酶切位点）进行 PCR扩增。 PCR扩增条件为：预变性 95°C 5min; 然后扩增 30个循环（95 °C， 30s; 60 °C , 30s; 72 °C , lmin) , 最后 72°C延伸 10min。用 EcoR I和 BamfU (宝生物工程（大连）有限公司）双酶切扩增获得的酰胺酶基因片段（见 SEQ ID NO:3 ) 和自杀质粒 pPHU281 (Hubner P, Masepohl B， et al. Mol Microbiol. 1993;10: 123-132 ) , 37°C反应 4h; 将酶切产物用 PCR产物回收试剂盒纯化（天根生化科技（北京）有限公司），然后采用 T4 DNA连接酶（Promega公司）在 4°C进行连接反应 16 h; 将连接反应产物转化宿主菌 co/i JM109的感受态细胞（天根生化科技（北京）有限公司），采用四环素抗性 LB平板挑选阳性克隆，在 LB培养基中 37°C 过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得到含有酰胺酶基因片段的重组自杀质粒 pPHUA (见图 1 )。

实施例 2

重组红色红球菌 Rhodococcus ruber TH3(amdA- )的构建

将实施例 1构建的带有酰胺酶基因片断的重组自杀质粒 pPHUA 以电穿孔法转化红色红球菌 TH 的感受态细胞，以四环素抗性筛选即可获得基因重组红球菌。其中，红色红球菌感受态细胞的制备采用《分子克隆指南》（J.萨姆布鲁克， D.W.拉赛尔著）中革兰氏阳性菌感受态细胞的常规制备方法。取 Ι μΐ纯化后的质粒于一个 1.5ml的离心管中，将其和 0.1CM的'电转杯一起置于冰上预冷；将 50μ1制备好的感受态细胞转移至此 1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置 lOmin; 打开电转仪，调节电压为 1250V; 将自杀质粒和感受态细胞的混合物转移至已预冷的电转杯中，轻轻敲击使得混合物均匀进入电转杯的底部，同时注意混合物中不能有气泡。将电转杯放入电转化仪，按下电击键，听到蜂鸣声后，向杯中迅速加入 800μ1的 SOC液体培养基（配方见《分子克隆指南》），重悬细胞后，转移到 1.5ml的离心管中。置于 28°C， 220rpm摇床培养.2h_; 取 200μ1菌液涂布于含有 14 g/ml四环素的 LB固体培养基平板，放入 28°C培养箱培养 48 小时后出现重组红球菌的单菌落。挑取 20个单菌落进行培养并诱导腈水合酶表达，选出其中一株腈水合酶高表达、且酰胺酶活性最低的基因重组红球菌，对其进行单独培养。采用基因组提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取基因组 DNA，以其为模板，按照实施例 1所述 PCR引物和扩增条件进行 PCR扩增，常规琼脂糖凝胶电泳证实了自杀质粒大片段在酰胺酶基因中的正确插入。最后命名该敲除了酰胺酶基因的重组红色红球菌为： Rhodococcus ber T¾i3(amdA-) o

实施例 3

敲除了酰胺酶基因的 TH3(amdA-；)的细胞生长与腈水合酶表达试验

将实施例 2所得敲除了酰胺酶基因的重组红色红球菌 TH3(amdA- )和野生红色红球菌 TH进行平行培养。分别挑取 TH3(amdA-)和 TH LB固体平板上桔红色、光滑、湿润的单菌落，接种在 50ml种子培养基中（500ml摇瓶）， 28 °C 培养 48h，摇床转速 200转 /min (种子培养基的组成为：葡萄糖 20g/L，酵母膏 5g/L, 蛋白胨 10 g/L， KH₂P0₄ 0.5 g/L, K₂HPO₄ 0.5g/L, MgS0₄ 7H₂0 0.5 g/L, pH7.5 ,其余为水）；然后以体积比为 10%的接种量接种到 50ml发酵培养基（发酵培养基组成为：葡萄糖 20g/L，酵母膏 5.0g/L，尿素 7.5g/L， KH₂P0₄ 0.75 g/L， K₂HP0₄0.75 g/L, MgS0₄-7H₂0 1.0 g L, 味精 0.75 g/L, CoCl₂ 0.06 mM， pH 7.5 , 其余为水）中（500ml摇瓶），在 28°C、摇床转速 200rpm的条件下分批培养 48h。检测结果显示 TH3(amdA-)的酶活为 3820U/ml，而 TH的酶活为 3060U/ml; TH3(amdA- )在 460nm下的光密度 OD460为 41.8，而 TH的 OD460为 38.2。进一步对 TH3(amdA- )进行补料培养，分别在 40h、48h和 60h补加葡萄糖至 10g/L，并调节 pH7.0，继续培养至 74h， TH3(amdA-)腈水合酶酶活高达 9726U/ml，细胞密度 OD460达到 71.5。说明 TH3(amdA-)的生长情况和腈水合酶表达情况均优于原始野生菌 TH。其中，腈水合酶的酶活检测采用标准的气相色谱内标法（王铁钢，罗晖，等，气相色谱法快速定量检测丙烯腈的生物催化产物，分析试验室， 2007, 26(1)： 54-57 )。酶活的国际单位定义为：每分钟催化生成 Ι μιηοΐ 丙烯酰胺所需的酶量； Ιμπιοΐ丙烯酰胺 /. (mhvml菌液） = l U/ml。 .

实施例 4

利用 TH3(amdA- )生产丙烯酰胺的摇瓶试验

将实施例 3中所得的 TH3(amdA- )和 TH细胞分别在 8000rpm下离心 10min，收获沉淀物，分别获得 TH3(amdA-)和 TH细胞，按照 5 %的体积比配制细胞的悬浮液，置于 300ml锥形瓶中。重悬液的酶活力为 1800 U/ml， pH7.0。向重悬液中每 30min加入 500μ1 丙烯腈，在 18°C低温制冷摇床上进行水合反应； 6小时后结束水合反应。采用气相色谱检测反应体系内的丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸含量。结果 TH反应体系内无丙烯腈残留，产物丙烯酰胺的生成量为 93.76g/L，副产物丙烯酸的生成量为 14.12g/L。 TH3(amdA-)的反应体系内无丙烯腈残留，产物丙烯酰胺的生成量为 115.68g L, 比 TH提高 23 % ; 副产物丙烯酸的生成量为 1.97g/L，比 TH降低 86%，说明酰胺酶基因明显受到抑制。

实施例 5

利用敲除了酰胺酶基因的 TH3(amdA-)生产丙烯酰胺的反应釜试验按照实施例 4所述类似方法在搅拌式夹套反应釜（上海联环生物工程设备有限公司）中配制细胞悬浮液，对 TH3(amdA- )进行催化水合反应。反应体系中游离细胞含量为 13g干重 /L，菌液体积分数为 8%，其余为水， pH7.0。重悬液腈水合酶酶活为 2500 U/mL。向反应釜中连续滴加丙烯腈，滴加速度以控制反应温度为 20°C来调节。反应 3h，然后测定反应体系内丙烯酰胺产物浓度达到 345.6g/L，丙烯酸含量为 0.14 g/L。说明酰胺酶基因的表达得到抑制。

Claims

权利要求书

1、一种产腈水合酶工程菌，其特征在于所述的工程菌是敲除或抑制了产腈水合酶原始菌株中的酰胺酶基因后得到的产腈水合酶突变菌株。
2、按照权利要求 1所述的产腈水合酶工程菌，其特征在于所述的产腈水合酶原始菌株是红球菌、诺卡氏菌、嗜热假诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、丙酸棒杆菌或其它产腈水合酶的革兰氏阳性菌。

3、按照权利要求 1或 2所述的产腈水合酶工程菌，其特征在于所述的工程菌是红色红球菌 TH3(amdA-：)或其突变株；所述的红色红球菌 TH3(amdA-)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为 CGMCC No. 2381 ο

4、按照权利要求 3所述的产腈水合酶工程菌，其特征在于所述的红色红球菌 TH3(amdA-)的原始菌株是红色红球菌 TH，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为 CGMCC No. 2380。
5、权利要求 1或 2所述的产腈水合酶工程菌的构建方法，按照如下步骤进行：

( 1 ) 以 P 1和 P2为引物，以携带有酰胺酶基因的原始菌的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，并回收扩增片段；所述的引物为：

上游引物 P1 ： 5'-TCAGAATTCGCGGTGGTCAACTACAAGA-3'

下游引物 P2 : 5'-GATGGATCCAACAGGTGATTCTGGGACTG-3'；

( 2 )将步骤（1 )所得扩增片段与质粒载体分别用 coRI酶和 Sa M酶在 36〜38°C下进行双酶切反应 4〜6h; 然后将酶切产物纯化，再用 T4 DNA连接酶在 3〜5 °C进行连接反应 14〜16h，得连接反应物；

( 3 )将连接反应物转化 £. CO/ JM109感受态细胞，涂布 LB固体培养基上，挑选阳性克隆：并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，得带有酰胺酶基因片段的重组自杀质粒；

( 4 ) 将重组自杀质粒以电穿孔转化法转入原始菌；

( 5 ) 将步骤（4 ) 所得转化后的菌液涂布在抗生素抗性 LB固体培养基上，筛选阳性菌落，即获得了阻断酰胺酶基因表达的产腈水合酶工程菌。
6、按照权利要求 5所述的构建方法，其特征在于其所述的原始菌是指红球菌、诺卡氏菌、嗜热假诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、丙酸棒杆菌或其它产腈水合酶的革兰氏阳性菌等。
7、按照权利要求 5或 6所述的构建方法，其特征在于其步骤 (2)冲所述的质粒载体是 pPHU281或其衍生质粒、大肠杆菌 pUC系列或 pET系列奪质粒载体
8、按照权利要求 7所述的构建方法，其特征在于其步骤（3 ) 中所述的酰胺酶基因片段是指含有 SEQ ID NO: 3所示的 DNA序列、 SEQ ID NO: 3所示 DNA序列的延伸片段、 SEQ ID NO: 3所示 DNA序列的部分片段、或与 SEQ ID NO: 3具有 70%以上同源性的 DNA序列或其片段等。
9、按照权利要求 8所述的构建方法，其特征在于其步骤（5 ) 中所述的筛选的标记基因是四环素抗性基因、卡那霉素抗性、红霉素抗性基因、氯霉素抗性基因或其它抗生素抗性基因。
10、权利要求 1或 2所述的产腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺中的应用。