CN101688216B - 编码杀虫蛋白质的新基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码来自苏云金芽孢杆菌的杀虫Cry1C蛋白质的新DNA序列，以及它们在植物中控制虫害的用途。本文还包括的是包含此类基因的植物细胞或植物，和产生或使用它们的方法，以及包含本发明Cry1C嵌合基因和至少一种其它嵌合基因，如编码杀虫Cry1Ab蛋白质的嵌合基因的植物细胞或植物，和产生或使用这种植物细胞或植物的方法。

Description

编码杀虫蛋白质的新基因

引言

本发明涉及编码苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株产生的杀虫蛋白质的新DNA序列。尤其是提供了编码Cry1C蛋白质的新嵌合基因，其用于保护植物免受昆虫损害。本文也包括的是包含此类基因的植物细胞或植物，尤其是稻植物细胞或植物，及制备或使用它们的方法，以及包含cry1C嵌合基因和编码杀虫蛋白质的至少一个其它基因，如编码Cry1A蛋白质的嵌合基因的植物细胞或植物。

发明背景

来自苏云金芽孢杆菌(本文简写为″Bt″)的菌株和蛋白质以其对虫害的特定毒性而众所周知，并且自从几乎一个世纪来它们就已经被用来控制虫害。目前可获得表达Bt蛋白质的一些转基因植物种，并且它们成功地限制了昆虫对植物的损害。

尽管分离了许多杀虫Bt蛋白质，但仅很少的Bt蛋白质在已经商品化的转基因植物中表达，并且这仅存在于一些农作物中。

虫害是稻生产的重要限制并发生在所有稻生长环境中。昆虫显著降低稻产量，并且在亚洲(不包括中国)已经报道了因昆虫引起的损失为约31.5％(Heinrichs，1994)。已经报道通过在稻植物中表达编码苏云金芽孢杆菌杀虫Cry1Ab或Cry1Ac蛋白质的基因提高稻的昆虫抗性(例如，Fujimoto等，1993；Wunn等，1996；Wu等1997；Ghareyazie等，1997；Nayak等，1997；和Cheng等，1998)。对Bt蛋白质Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1G、和Cry2A种类中的一些蛋白质而言，已经评估了分离的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质对一些鳞翅目稻虫害的毒性(Karim等，1997；Lee等，1997)，但是存在每一种这些蛋白质类的若干不同形式(例如，今天在Crickmore等(1998)和Crickmore等(2005)中已经报道了约14种不同的Cry1C和约20种不同的Cry1Ab形式)，并且针对稻虫害仅检测了一种或少数这些蛋白质。相信没有科学出版物描述Cry1Ca4蛋白质对特定稻虫害的活性。

同样，Strizhov等(1998)描述了编码Cry1Ca5蛋白质的合成基因的设计。分析并与已知蛋白质(Cry1Ca1、2、3和4；第18页，第3行至第1页，第6行)比较后，他们推断Cry1Ca5蛋白质的序列因氨基酸置换A124E而与Cry1Ca4蛋白质不同。Strizhov等(1998)推断Cry1Ca4中位置124处谷氨酸的出现完全是个错误。Strizhov等(1998)也相信当时已知的Cry1C序列，包括Cry1Ca4，含有关键错误，具有Cry1C蛋白质功能或稳定性的不利结果，在已知野生型DNA序列的基础上已经设计了相应的合成基因。然而，本发明人成功产生了编码杀虫Cry1C蛋白质的重要合成cry1C基因，并使用这些基因获得了对昆虫有抗性的植物，所述Cry1C蛋白质在位置124处具有谷氨酸(Glu)氨基酸。

不能通过商业途径获得含有cry1C基因的稻植株。Tang等(2006)描述了具有编码Cry1Ca5蛋白质的合成基因的抗昆虫转基因籼稻的开发，但并没有公开所述基因的DNA序列。当使用EMBOSS中Needleman和Wunsch算法，对于EDNAFULL矩阵用标准设定进行测定时，据说在Tang等(2006)中所用的基因与天然的cry1Ca5 DNA具有84％的同一性，而本发明的cry1C编码序列与相同长度的天然cry1Ca5 DNA具有69.7％的同一性，并因此非常不同于Tang等(2006)的cry1Ca5基因(在相同设定下，对于SEQID No.1的cry1C DNA序列，与相同长度的天然cry1Ca5 DNA的序列同一性仅为55％)。同样，Tang等(2006)中提供的PCR引物组将不允许检测本发明的cry1C编码区，说明所述基因与本发明的cry1C基因之间存在明显差异。

Strizhov等(1996)报道了cry1Ca5基因在苜蓿和烟草中的表达。Cao等(1999)和Zhao等(2003)已经描述了表达Cry1Ca5 Bt毒素的转基因绿花椰菜植株，以及与表达Cry1Ac毒素的绿花椰菜植株杂交，使得Cry1Ac和Cry1Ca5毒素在同一植物中表达。当使用EMBOSS中Needleman和Wunsch算法，对于EDNAFULL矩阵用标准设定进行测定时，本发明的cry1C编码序列与Strizhov等(1996，Genbank登录号X99103)的合成cry1Ca5基因的编码序列仅有78％的同一性(使用EMBOSS中相同的标准设定，SEQ ID No.1的DNA与Strizhov等的合成cry1Ca5基因仅具有61.1％的序列同一性)。

本发明提供编码来自Cry1Ca4 Bt蛋白质的蛋白质的新合成基因，其可与编码Bt Cry蛋白质(如Cry1Ab蛋白质)的基因组合用于在植物，尤其是稻中表达。本发明cry1C基因的DNA序列并非天然发生，并且与任何已知的DNA序列不同。

发明目的及简述

在本发明中，提供编码来自Bt的蛋白质的几个新昆虫控制基因用于植物中。尤其是，这些基因用于稻中，特别是物种稻(Oryza sativa)的植物中。可通过转化植物细胞并产生包含本发明基因的植物或种子获得包含至少一个本发明新基因的植物或种子。此处同样包括的是通过转化以含有至少一个本发明基因的植物与其它植物杂交，并选择包含本发明基因的那些植物或种子获得的植物或种子。显然，可用本发明的基因转化任何植物种，以获得对这些昆虫抗性提高的转基因植物和种子，所述植物物种待受保护免于本发明新基因编码的Bt蛋白质杀死或控制的昆虫种类。

同样，本发明提供编码杀虫蛋白质的新Cry1C基因，所述蛋白质包含其编码序列中的功能性植物内含子。内含子的存在允许在植物细胞中高水平表达，并同时保证当原核(微)生物中含有所述基因时，如在克隆步骤过程中所述基因不表达杀虫蛋白质。

本发明同样包括的是编码叶绿体转运肽的DNA，特别是包含SEQ IDNo.3的从核苷酸位置7到核苷酸位置372的序列，特别是SEQ ID No.3的序列的DNA。

在本发明的一个实施方案中，提供的是编码Cry1C蛋白质或包含其杀虫部分的蛋白质的合成的、密码子优化的DNA序列控制鳞翅目稻虫害，尤其是控制纵卷叶螟或螟虫的用途，以及控制这些昆虫的方法(其包括步骤：用包含有效连接这些DNA序列的植物可表达启动子区的嵌合基因转化植物，并在田地中播种、种植或生长此类植物，或包括步骤：在植物，尤其是稻植物中表达此类蛋白质)，所述包含杀虫部分的蛋白质如与SEQID NO.2从氨基酸位置28到627的蛋白质具有至少85％，尤其是至少90或95％序列同一性的任何杀虫蛋白质，其在对应于SEQ ID NO.2中位置124的氨基酸位置处具有谷氨酸(可使用氨基酸序列比对测定)。

本发明还提供转化有本发明cry1C基因的植物，其在基因组中也包含编码选自以下蛋白质的DNA：Cry1Ab、Cry1B、Cry1D、Cry1E、Cry1Aa、Cry1Ac、Cry1I、Cry1J、Cry2A、Cry6B、Cry9C、Cry3A、VIP3A毒素、蛋白质酶抑制剂如豇豆胰蛋白质酶抑制剂、蛋白质酶抑制剂II或半胱氨酸蛋白质酶抑制剂(例如，Xu等，1996或Duan等，1996的蛋白质酶抑制剂)、GNA凝集素、或来自Xhenorhabdus、灵杆菌或发光杆菌菌株的杀虫蛋白质(例如，Waterfield等，2001；ffrench-Constant和Bowen，2000)、或杂合或融合Bt Cry蛋白质如Cry1A-杂合毒素，例如水稻品种TT51中的Cry1Ab-Cry1Ac融合蛋白质(中国专利申请200510062980，公开号1840655)或Ho等(2006)中的Cry1Ab/Cry1B融合蛋白质。

本文也包括的是控制昆虫的方法，其包括步骤：在田地中种植或播种包含任何本发明嵌合基因或DNA的植物；以及在稻属种植物中控制昆虫的方法，其包括步骤：在植物中表达任何上述嵌合基因或DNA；或产生对昆虫有抗性的植物或种子的方法，其包括步骤：a)获得转化有本发明cry1C嵌合基因，或转化有本发明cry1C和cry1Ab嵌合基因的植物，和b)选择所述植物或其种子的后代，其含有所述基因或DNA。

根据本发明也提供的是包含以下有效连接的序列的嵌合基因：a)编码杀虫蛋白质，尤其是来自Bt的杀虫蛋白或其杀虫片段或变体的编码序列的第一个片段，b)单子叶植物内含子序列，尤其是来自其中该内含子被剪接的单子叶植物基因的内含子序列，c)所述编码序列的第二个片段，d)能够在植物细胞中指导表达的启动子区，并且其中所述第一个和第二个蛋白质片段本身不能杀虫，并且其中在靶植物细胞中剪接所述内含子后，当嵌合基因转录并翻译时，可产生功能性的杀虫蛋白质。本文也提供的是包含这些嵌合基因的稻植物细胞和稻植物。尤其是，在给定宿主细胞中从该嵌合基因不能产生杀虫蛋白质，在所述宿主细胞中，如原核生物中内含子没有被剪接。在一个实施方案中，所述内含子是稻或玉米内含子，如玉米(Zeamays)醇脱氢酶-1基因的内含子。

本文提供的是嵌合cry1C基因，其包含以下有效连接的序列：

a)能够在植物细胞中指导表达的启动子区；

b)编码杀虫Cry1C蛋白质的DNA，其包含与SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置2415的DNA序列或编码序列，或SEQ ID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置2784的DNA序列或编码序列具有至少95％序列同一性的DNA序列；和

c)3’多聚腺苷酸化和转录终止区；尤其是该嵌合基因，其中所述杀虫Cry1C蛋白质包含SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.6的氨基酸位置3到氨基酸位置750的氨基酸序列，或包含Cry1C蛋白质的氨基酸序列，或包含其杀虫部分的蛋白质，其在对应于SEQ ID NO.2中位置124的氨基酸处具有谷氨酸。

也提供的是上述嵌合cry1C基因，其中编码杀虫Cry1C蛋白质的所述DNA包含SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置2415的DNA序列或编码序列，或SEQ ID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置2784的DNA序列或编码序列，或包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.5或SEQ ID No.1或SEQ ID No.5的编码序列；尤其是此类嵌合基因，其中所述杀虫Cry1C蛋白质包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.6的氨基酸序列。

在一个实施方案中，任何一个上述嵌合cry1C基因中的启动子区包含SEQ ID No.9、10、13或14任何一项的序列，或包含SEQ ID No.9的核苷酸位置1到核苷酸位置1997的序列，或其核苷酸与任何此类序列具有低于1到5％，尤其是低于2％不同的等同序列。在一个实施方案中，本发明嵌合cry1C基因中的3’多聚腺苷酸化和转录终止区来自根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因。

本发明也提供的是包含任何一个上述嵌合cry1C基因的DNA，其进一步包含第二个嵌合基因，所述第二个嵌合基因包含以下有效连接的序列：

a)能够在植物细胞中指导表达的第二个启动子区；

b)编码杀虫Cry1Ab蛋白质的第二个编码区，如包含与SEQ ID No.11的核苷酸位置88到核苷酸位置1851的DNA序列具有至少95％序列同一性的DNA序列的编码区；和

c)3’多聚腺苷酸化和转录终止区；尤其是这样的DNA，其包含与SEQID No.11的核苷酸位置7到核苷酸位置1851的DNA序列具有至少95％序列同一性的DNA序列的第二个编码区，连接SEQ ID No.3的转运肽编码序列的下游(3’)，使得产生编码融合蛋白质的融合编码区。

在一个实施方案中，在包含cry1C和cry1Ab嵌合基因的此类DNA中的Cry1Ab蛋白质包含与SEQ ID No.12的氨基酸位置30到氨基酸位置617的序列，或SEQ ID No.12的氨基酸位置3到氨基酸位置617的序列，或SEQ ID No.12的序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，或为由包含SEQ ID No.11的核苷酸位置7到核苷酸位置1851的核苷酸序列，或包含SEQ ID No.11的核苷酸位置88到核苷酸位置1851的核苷酸序列，或包含有效连接SEQ ID No.3(下游)序列的SEQ ID No.11序列的DNA编码的杀虫蛋白质。

本文还提供的是这样的上述DNA，其中所述第二个启动子区不同于cry1C嵌合基因启动子区，并且其中所述第二个启动子包含SEQ ID No.9、10、13或14任何一项的序列，或包含SEQ ID No.9的核苷酸位置1到核苷酸位置1997的序列，或其核苷酸与任何此类序列具有低于1到5％，尤其是低于2％不同的等同序列。

本发明中进一步提供的是转基因植物细胞或植物，其包含任何一个上述嵌合cry1C基因或任何一个上述DNA(其包含稳定整合到其基因组中的cry1C和cry1Ab嵌合基因)；以及转基因植物细胞或植物，其包含任何一个上述cry1C嵌合基因，和包含以下有效连接的序列的第二个嵌合基因：a)能够在植物细胞中指导表达的第二个启动子区；b)编码杀虫Cry1Ab蛋白质的第二个编码区，如包含与SEQ ID No.11的核苷酸位置88到核苷酸位置1851的DNA序列具有至少95％序列同一性，或与SEQ ID No.11的核苷酸位置7到核苷酸位置1851的DNA序列具有至少95％序列同一性的DNA序列的编码区，和c)第二个3’多聚腺苷酸化和转录终止区。

本文也提供的是这样的植物细胞，其包含作为第二个编码区的DNA序列，其与包含SEQ ID No.11的核苷酸位置7到核苷酸位置1851的核苷酸序列的DNA序列具有至少95％序列同一性，所述第二个编码区连接SEQ ID No.3的转运肽编码序列的下游(3’))，或包含SEQ ID No.3的核苷酸位置7到核苷酸位置372的核苷酸序列，使得产生编码融合蛋白质的融合编码区；尤其是这样的植物细胞，其中所述Cry1Ab蛋白质包含与SEQID No.12的氨基酸位置30到氨基酸位置617的序列、SEQ ID No.12的氨基酸位置3到氨基酸位置617的序列、或SEQ ID No.12的序列相同或具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，任何一个这些上述植物细胞具有不同于cry1C嵌合基因启动子区的第二个启动子区，并包含SEQ ID No.9(或核苷酸1到核苷酸1997的SEQ ID No.9的序列)、10、13或14，尤其是SEQ ID No.13或14任何一项的序列，或其核苷酸与任何此类序列具有低于1到5％，尤其低于2％不同的等同序列。在另一实施方案中，所述cry1Ab嵌合基因包含来自根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的3’多聚腺苷酸化和转录终止区(例如，由De Greve等，1983描述)。

本文也提供的是包含上述植物细胞，尤其是稻植物细胞任何一项的植物或种子，以及包含此类植物细胞的稻植物，尤其是选自以下的植物或种子：玉米、棉花、大豆、小麦、油菜、甘蔗、大豆、花椰菜、卷心菜、白菜、萝卜、芥菜、油菜、羽衣甘蓝、花茎甘蓝。

在本发明的一个实施方案中，提供了来自包含任何一个上述嵌合cry1C基因，或包含任何一个上述嵌合cry1C基因和嵌合cry1Ab基因(如上述第二个嵌合基因)的此类植物，尤其是稻植物的种子、谷物或加工的谷物。

本文也提供的是植物，如稻植物，其对鳞翅目植物虫害，如二化螟或稻纵卷叶螟有抗性，包含稳定整合到其基因组中的任何一个上述嵌合cry1C基因或任何一个上述嵌合cry1C基因和嵌合cry1Ab基因(如上述第二个嵌合基因)，尤其是这样的植物是稻植物，其对二化螟(Chilosuppressalis)、Marasmia patnalis、三化螟(Scirpophaga incertulas)、大螟(Sesamia inferens)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)或稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)有抗性。

本文进一步提供的是控制鳞翅目植物虫害，尤其是二化螟或稻纵卷叶螟的方法，其包括：在田地中种植或播种植物，尤其是稻植物，其包含任何一个上述嵌合cry1C基因或任何一个上述嵌合cry1C基因和cry1Ab嵌合基因(如上述第二个嵌合基因)，或控制二化螟或稻纵卷叶螟的方法，其包括：在植物，如稻植物中表达任何一个上述嵌合cry1C嵌合基因，或任何一个上述嵌合cry1C基因和cry1Ab嵌合基因(如上述第二个嵌合基因)。

根据本发明也提供的是用于获得对二化螟、Marasmia patnalis、稻纵卷叶螟、大螟、斜纹叶蛾或三化螟有抗性的稻植物及其后代的方法，其包括用任何一个上述嵌合cry1C基因或任何一个上述嵌合cry1C基因和cry1Ab嵌合基因(如上述第二个嵌合基因)转化稻植物，并获得其包含这样基因或多个基因的后代。

本文也提供的是产生对昆虫有抗性的植物或种子的方法，其包括步骤：a)获得转化有任何一个上述嵌合cry1C基因或任何一个上述嵌合cry1C基因和嵌合cry1Ab基因(如上述第二个嵌合基因)的植物，和b)如通过使用特异性引物或探针选择包含所述基因或多个基因的所述植物的后代，或其种子。

本文也提供的是包含任何一个上述嵌合cry1C基因，或其编码序列，或包含嵌合cry1C基因和嵌合cry1Ab基因(如上述第二个嵌合基因)的任何一个上述DNA，或其编码序列的微生物，尤其是埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)或农杆菌属(Agrobacterium)的微生物。

本文也提供的是任何一个上述嵌合cry1C基因或任何一个上述嵌合cry1C基因和嵌合cry1Ab基因(如上述第二个嵌合基因)控制虫害的用途，以及任何一个上述嵌合cry1C基因或任何一个上述嵌合cry1C基因和嵌合cry1Ab基因(如上述第二个嵌合基因)用于获得植物，尤其是稻植物的用途，所述植物被保护免受鳞翅目植物虫害，尤其是二化螟、Marasmiapatnalis、稻纵卷叶螟、大螟、斜纹叶蛾或三化螟。

另外，根据本发明提供的是用于在生物材料，如植物材料，例如在稻谷物或种子，或稻产品中检测本发明的cry1C编码序列的存在的方法，其包括步骤：使用特异性寡核苷酸引物或探针，如对本发明的cry1C编码区特异的PCR引物，如包含SEQ ID No.7或8的序列的引物。本文也提供的是包含特异性识别SEQ ID No.1序列的两条引物的试剂盒，如包含第一条引物和第二条引物的试剂盒，所述第一条引物包含SEQ ID No.7的序列，所述第二条引物包含SEQ ID No.8的序列。

本文进一步提供的是用于控制鳞翅目稻虫害的方法，其包括：在稻植物中表达杀虫Cry1C蛋白质和杀虫Cry1Ab蛋白质，其中所述Cry1C蛋白质包含SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的氨基酸序列，尤其是其中所述Cry1Ab蛋白质包含与SEQ ID No.12的氨基酸位置30到氨基酸位置617的序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。本文尤其提供的是这样的方法，其中所述稻昆虫是二化螟、Marasmia patnalis、稻纵卷叶螟、大螟、斜纹叶蛾或三化螟，并且其中所述Cry1Ab蛋白质包含SEQ ID No.12的氨基酸位置30到氨基酸位置617的氨基酸序列。

本文也提供的是编码杀虫Cry1C蛋白质的DNA获得被保护免受二化螟、Marasmia patnalis、稻纵卷叶螟、大螟、斜纹叶蛾或三化螟的稻植物的用途，所述杀虫Cry1C蛋白质包含SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的氨基酸序列。

发明详述

根据本发明，“核酸序列”指单链或双链形式的DNA或RNA分子，优选DNA分子。如此处所用，“分离的DNA”指并非天然发生的或不再处于其最初存在的天然环境中的DNA，例如嵌合基因中与其它调节元件相关的DNA编码序列、转移到另一宿主细胞如植物细胞中的DNA、相比于任何已知天然发生的DNA序列具有不用核苷酸序列的人工合成DNA序列。

根据本发明，已经构建了编码Bt Cry毒素或其变体的核酸序列，尤其是DNA序列。此处将新DAN序列命名为cry1C，并且此处将它们的编码蛋白质命名为Cry1C(例如，Cry1C1或Cry1C2)蛋白质。此处也提供的是编码优选叶绿体转运肽的新DNA序列，例如，包含SEQ ID No.3的核苷酸位置7到核苷酸位置371的序列，尤其是SEQ ID No.3的序列的DNA。

如此处所用，术语“本发明的Cry1C蛋白质”指包含保留杀虫活性的SEQ ID No.2的氨基酸序列最小片段的任何杀虫蛋白质(下文称作“最小毒性片段”)，尤其是包含与SEQ ID No.2中氨基酸位置28到氨基酸位置627的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列的任何蛋白质，优选包含与SEQ ID No.2的氨基酸位置2到氨基酸位置627的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列的任何杀虫蛋白质，尤其是在SEQ ID No.2中氨基酸位置124处，或在更短或更长序列中等同位置处含有Glu氨基酸的此类蛋白质(或任何Cry1C蛋白质，如包含与SEQ ID No.2的氨基酸位置28到627的序列具有至少85％，尤其至少90或95％序列同一性的任何杀虫蛋白质)(如可在氨基酸序列比对中进行测定)。在该定义中也包括的是包含SEQ ID No.2的氨基酸位置1到氨基酸位置627的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.2的氨基酸序列的杀虫蛋白质(此处命名为Cry1C1蛋白质)，以及包含SEQ ID No.5的氨基酸位置3到氨基酸位置627的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.5的氨基酸序列的杀虫蛋白质(此处命名为Cry1C2蛋白质)，以及这样的杀虫蛋白质，其中在不改变SEQ ID No.2中氨基酸位置124处，或更短或更长蛋白质中等同位置处Glu氨基酸的情况下，1-5个氨基酸已经缺失或被其它氨基酸替代。

此处也包括本发明的Cry1C蛋白质是较小的氨基酸添加，如在本发明的Cry1C蛋白质第一个和第二个氨基酸之间插入Ala或Asp氨基酸，以产生前两个氨基酸Met Ala或Met Asp，或本发明的Cry1C蛋白质融合到另一蛋白质或肽，如转运肽-Cry1C融合蛋白质。

因为在不改变其杀虫活性的情况下对Cry1C氨基酸序列进行一些改变是可能的(例如，引入DNA限制性酶切割位点，用于制备编码Cry1C蛋白质的基因)，本发明中也包括的作为如此处所用的Cry1C蛋白质是包含SEQ ID No.2中氨基酸位置28到氨基酸位置627处氨基酸的氨基酸序列的等同物的任何蛋白质，但是其中在不负面影响所述蛋白质的杀虫活性的情况下，在SEQ ID No.2中该区域内少于10个，优选1到5个氨基酸被其它氨基酸替代。优选地，在该蛋白质中，SEQ ID No.2中氨基酸位置124处或SEQ ID No.5中位置247处(或在更长或更短序列中等同位置处)的氨基酸是谷氨酸(Glu)。

同样用于本发明的是SEQ ID No.2的Cry1C蛋白质的变体，如使用EMBOSS中Needleman-Wunsch总体比对算法(Rice等，2000)，使用默认设定(空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5；对于氨基酸序列比较，使用EBLOSUM62矩阵)找到序列全长上的最佳比对来测定，所述变体包含在氨基酸序列水平上与来自SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的区域有至少95％，尤其至少96％、97％、98％或至少99％序列同一性的序列。本发明Cry1C蛋白质的优选变体包括包含SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的序列的蛋白质，但是相比于SEQ ID No.2中的位置，其中以下位置处的以下氨基酸中的一个、一些或全部被改变了：位置183处的氨基酸是缬氨酸、位置294处的氨基酸是精氨酸、位置453处的氨基酸是天冬氨酸、或位置592处的氨基酸是精氨酸。尤其是，本发明Cry1C蛋白质的变体与SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的Cry1C蛋白质具有不超过5个氨基酸的差异，并保留了SEQ IDNo.2中位置124处(或更短或更长序列中的等同位置处)的Glu氨基酸。

包含SEQ ID No.2中氨基酸位置28到氨基酸位置627的氨基酸序列的Cry1C蛋白质保留了对其全部或绝大多数靶昆虫的杀虫活性，所述靶昆虫被自然界中苏云金芽孢杆菌产生的完整蛋白质杀死或其生长被抑制，并且在其N或C末端部分添加氨基酸或蛋白质序列不破坏该杀虫活性。因此，特征为含有或包括该区域的氨基酸序列的任何蛋白质是有用的并构成了本发明的一部分。

如此处所用，“包含”特定序列X的术语DNA或蛋白质指包括或含有至少所述序列X的DNA或蛋白质，使得在5’(或N末端)和/或3’(或C末端)末端包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如在EP 0193259中公开的可选标记蛋白质(的核苷酸序列)、转运肽(的核苷酸序列)和/或5′前导序列或3′尾随序列。类似地，应该理解全文及该申请的权利要求中的术语“包含”、“含有”或“包括”的使用意味着包括所述整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤组。

为了本发明目的，表述为百分比的两条相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”指两条最佳比对序列中具有相同残基的位置数目(x100)除以进行比较的位置数目。将空位，即其中比对中残基在一条序列中出现但在另一条序列中不出现的位置视作没有相同残基的位置。通过EMBOSS中Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)，使用默认设定(空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5)进行两条序列的比对(Rice等，2000)，以找到序列全长上的最佳比对。

如此处所用，本发明Cry1C蛋白质的“最小毒性片段”是Cry1C蛋白质的保留杀虫活性的最小片段或部分，其可通过酶促消化，如胰蛋白质酶或胰凝乳蛋白质酶消化全长Cry蛋白质获得，或Cry蛋白质的保留杀虫活性的最小片段或部分，其可通过在编码Cry1C蛋白质的DNA中产生核苷酸缺失获得。也可通过用来自对该Cry1C蛋白质敏感(即，被其杀死或生长或进食被负面影响)的昆虫的昆虫消化道汁液，优选中肠汁液处理Cry1C蛋白质获得这种最小毒性片段。

如此处所用，术语“cry1C DNA”或“cry1C基因”指编码本发明Cry1C蛋白质的任何DNA序列。这包括编码本发明Cry1C蛋白质的天然发生的、人工的或合成的DNA序列，如与SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置2415的DNA或编码序列，或SEQ ID No.1的核苷酸位置4到2415的DNA序列或编码序列，或SEQ ID No.1的DNA或编码序列，或SEQ IDNo.5的核苷酸位置7到核苷酸2784的DNA或编码序列，或SEQ ID No.5的核苷酸位置1到核苷酸位置2784的DNA或编码序列，或SEQ ID No.5的DNA或编码序列相同或具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的DNA。本文也包括的是编码杀虫蛋白质的DNA序列，其与SEQ ID No.1或5的DNA序列中的任何一项足以类似，使得它们可以(即，具有能力)在严格杂交条件下与这些DNA序列杂交。如此处所用，“严格的杂交条件”尤其指以下条件：将相关DNA序列固定在滤器上，并在50％甲酰胺、5％SSPE、2x Denhardt’s试剂和0.1％SDS中于42℃将滤器预杂交1或2小时，或在6x SSC、2xDenhardt’s试剂和0.1％SDS中于68℃预杂交1或2小时。然后向预杂交液中直接加入变性的dig-或放射性标记的探针，并在上文提及的适当温度下进行温育16到24小时。温育后，然后在2xSSC、0.1％SDS中室温下将滤器洗涤30分钟，随后在0.5x SSC和0.1％SDS中于68℃下洗涤2次，每次30分钟。在-70℃增光屏下，通过将滤器曝光至X光片(Kodak XAR-2或等同物)形成放射自显影图。当然，在仍能保持想要的严格杂交条件的同时，该方法中可使用等同条件和参数。

本文也包括的作为本发明的cry1C基因是编码杀虫蛋白质的DNA序列，尤其是编码Cry1C蛋白质的DNA，所述DNA序列与SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置2415的DNA序列，或SEQ ID No.1的核苷酸位置4到2415的DNA序列，或SEQ ID No.1的DNA序列，或SEQID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置2784的DNA序列，或SEQ ID No.5的DNA序列具有至少80％或90％，优选至少93到97％，尤其是至少95、至少98或至少99％序列同一性，所述Cry1C蛋白质包含与SEQ ID No.2中氨基酸位置2或28到氨基酸位置627的氨基酸序列，或SEQ ID No.2或5的氨基酸序列具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，尤其是其中SEQ ID No.2中位置124处(或另一序列中等同位置处)的氨基酸是Glu的这种Cry1C蛋白质。使用EMBOSS中Need1eman-Wunsch总体比对算法，使用默认设定(空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5；对于DNA序列比较，使用EDNAFULL矩阵；对于氨基酸序列比较，使用EBLOSUM62矩阵)(Rice等，2000)以找到序列全长上的最佳比对来计算此处涉及的DNA序列同一性。

在一个实施方案中，术语“本发明的cry1C DNA(或基因)”指编码杀虫蛋白质，尤其是杀虫Cry1C蛋白质的任何DNA(或基因)序列，其包含：a)SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置2415的核苷酸序列，b)SEQ ID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置2784的核苷酸序列，c)SEQID No.1的核苷酸位置4到核苷酸位置2415的核苷酸序列，d)SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置590的核苷酸序列，其连接SEQ ID No.1中核苷酸位置1125到核苷酸位置2415的核苷酸序列，或e)SEQ ID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置959的核苷酸序列，其连接SEQ ID No.5中核苷酸位置1794到核苷酸位置2784的核苷酸序列，或f)上文a)到c)的核苷酸序列任何一项的编码序列。在一个实施方案中，本发明的cry1C DNA是SEQ ID No.1的cry1C1 DNA或SEQ ID NO.5的cry1C2 DNA序列。

在另一实施方案中，本发明的cry1C DNA指编码杀虫蛋白质，尤其是杀虫Cry1C蛋白质的任何DNA，其在严格的杂交条件下与包含以下的DNA杂交：a)SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置2415的核苷酸序列，b)SEQ ID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置2784的核苷酸序列，c)SEQ ID No.1的核苷酸位置4到核苷酸位置2415的核苷酸序列，或d)a)到c)任何一项的核苷酸序列的编码序列，或与包含以下的DNA具有至少80％或90％，优选至少93到97％，尤其至少95、至少98或至少99％序列同一性的任何DNA：a)SEQ ID No.1的核苷酸位置82到核苷酸位置2415的核苷酸序列，b)SEQ ID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置2784的核苷酸序列，c)SEQ ID No.1的核苷酸位置4到核苷酸位置2415的核苷酸序列，或d)a)到c)任何一项的核苷酸序列的编码序列。

如此处所用，蛋白质的“杀虫活性”指当此蛋白质被昆虫摄取后，所述蛋白质杀死昆虫、抑制其生长或引起昆虫摄食减少的能力。在本发明中，这种摄取优选此类昆虫摄取表达本发明蛋白质的重组宿主细胞，如植物细胞、种子或植物。应理解对一个昆虫物种的昆虫的活性，优选对其幼虫的活性对蛋白质而言足以具有如此处所用的杀虫活性，尽管不同昆虫物种的昆虫经常受到本发明蛋白质的影响。通常针对特定的关键虫害种类开发或靶定表达本发明Cry1C蛋白质的重组宿主，用于其中这些昆虫物种对其是害虫的特定农作物或区域(例如在中国、印度、印尼、越南、巴基斯坦、孟加拉国、缅甸和泰国对稻农作物是害虫的鳞翅目二化螟和纵卷叶螟)，但是其它昆虫也会受到本发明重组宿主的控制，如通过转基因植物细胞或植物，例如包含任何一个本发明嵌合cry1C基因的转基因稻植物细胞或植物。

含有本发明cry1C基因的本发明的植物允许使用新的农业方法，其中在植物，如稻上使用更少或不使用杀虫剂，来控制植物虫害，如二化螟或稻纵卷叶螟，并且本发明一个实施方案因此包括使用包含本发明cry1C基因的本发明的植物或植物细胞，如稻植物或植物细胞控制植物虫害，如稻虫害，尤其是二化螟和稻纵卷叶螟，以及通过在植物细胞、种子或植物，尤其是稻植物细胞、种子或植物中表达本发明的Cry1C蛋白质，或通过种植、播种或培养包含本发明cry1C基因的植物，如稻植物来控制植物虫害，如稻虫害，例如二化螟和稻纵卷叶螟的方法。

如此处所用，Cry1C蛋白质，或表达本发明Cry1C蛋白质的重组宿主的“(昆虫)控制量”或通过Cry1C蛋白质，或表达本发明Cry1C蛋白质的重组宿主进行“控制”指蛋白质的量，其通过昆虫在该植物上摄食，例如通过杀死昆虫或通过抑制昆虫发育、生育或生长，以该方式昆虫物种对植物产生更少的损害而足以限制对植物的损害。这并不意味着将不再需要用化学杀虫剂处理(例如来控制不受本发明蛋白质影响的虫害，如(次要)鳞翅目昆虫或双翅目虫害)，但是化学杀虫剂对本发明蛋白质靶标昆虫的处理可以显著降低或避免，而同时仍然获得田地中合适的植物性能和可接受的产量。

本发明的cry1C基因优选用于稻细胞、植物或种子中，以控制稻虫害。如此处所用，“稻”指培养以获取其可食谷物的稻属的谷类，优选稻(Oryzasativa)和Oryza glaberrima，尤其是稻。如此处所用，“稻谷”包括糙米粒，精米粒或白米粒，以及蒸、油炸或蒸煮、破碎或蒸过的谷物，和预发芽的稻米。如此处所用的稻包括稻任何方式的生产或生长，如灌溉的或非灌溉的稻、漂浮的或深水稻、水稻、旱稻、开放授粉或杂交稻，并包括籼稻、粳稻或javonica栽培种。杂交稻，尤其是ArizeTM杂交稻是本发明的优选实施方案，因为其具有更高的谷物产量，和最佳的谷物和种子质量。当此处广泛使用时，稻也指稻植株的种子、细胞、原生质体、花粉或任何部分或组织。

如此处所用，“加工的稻谷”指碾碎的、研磨的、脱壳的、速煮的、转化的、破碎的、蒸过的或煮熟的谷物。此处包括的加工稻谷物也是(部分)煮熟的或清蒸的糙米，如速食的或即席的糙米，和不再含有可生长成稻植物的存活胚的任何类型的稻谷。

如此处所用，“稻产品”指含有或由本发明的稻植物、种子、细胞或谷物制成的产品，包括米粉、面条、粥、饮料、rice dishes等。

根据本发明，对本发明Cry1C蛋白质敏感的昆虫以控制昆虫的量，优选杀死昆虫的量与这些蛋白质接触。在本发明的一个实施方案种，本发明的重组宿主，如本发明的转基因植物细胞或植物以高水平表达本发明的蛋白质或蛋白质的组合，使得获得“高剂量”水平。如此处所用，当指重组植物细胞或植物时，“高剂量水平”、“高剂量昆虫抗性”或“高剂量”表达指植物细胞或植物中杀虫蛋白质的浓度(通过ELISA测定为总可溶性蛋白质的百分比，在提取缓冲液(例如，在Jansens等，1997中描述的提取缓冲液)中提取可溶性蛋白质后，使用Bradford分析(Bio-Rad，Richmond，CA；Bradford，1976))测定总的可溶性蛋白质)，其杀死靶标昆虫的发育阶段，所述靶标昆虫对毒素敏感性与昆虫的第一个幼虫阶段相比显著更低，优选低至少25倍，并因此可预计保证对靶标昆虫的完全控制。在一个实施方案中，这指在使用合适对照的常规昆虫生物测定中(使用正常敏感昆虫集落(并非选择对Bt蛋白质有抗性的昆虫))，优选整株植物昆虫生物测定中，如在昆虫侵袭这种植物细胞或植物，或其部分后10到14天测定，获得对第四个幼虫龄期(对具有5个幼虫龄期的昆虫而言)或最后一个幼虫龄期(对具有4个或更少幼虫龄期的昆虫而言)至少97％，优选至少99％，最优选100％的死亡率。

根据本发明，一种靶标昆虫物种(即，昆虫物种，优选其幼虫，其可对植物物种产生严重损害，并且其通常是针对其设计并开发转基因植物的昆虫)的存在对植物而言足以被命名为给出“高剂量”表达，本发明转化植物细胞或植物对所述靶标昆虫物种提供“高剂量”水平的昆虫抗性。

本发明植物和植物细胞的优选靶标昆虫是植物的经济上损害性的鳞翅目虫害，其以植物为食或损害植物并因而降低植物产量(此处称作“鳞翅目植物虫害”)，尤其是二化螟和稻纵卷叶螟，优选选自以下的昆虫：条纹螟虫二化螟、黄色螟虫三化螟(也命名为三化螟Tryporyza incertulas)、白色螟虫白螟(也命名为Tryporyza innotata)、黑头螟虫Chilo polychrysa、粉色螟虫大螟、甘蔗蛀虫小蔗螟、稻螟虫禾草螟、稻纵卷叶螟Marasmiapatnalis、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis、和昆虫如Hereitogrammalicarisalis、稻螟蛉、稻眉眼蝶、稻显纹刷须野螟、Marasmia ruralis、稻三点水螟、斜纹夜蛾、Rupela albinella、草地夜蛾、Mythimna unipuncta、Chilo zacconius和稻苞虫。最特别的是，本发明Cry1C植物、细胞或种子的靶标昆虫是以下属的稻虫害种类：Chilo、Scirpophaga、Marasmia、Cnaphalocrocis、Diatraea和Spodoptera，优选二化螟、三化螟、Marasmiapatnalis、稻纵卷叶螟和斜纹叶蛾昆虫。显然，在不同国家或区域，不同的地方名称可用于相同物种的昆虫。

如此处所用，“嵌合基因”用于指包含有效连接的并且彼此之间并非天然相关的或来源于不同来源的至少两个不同DNA片段(如启动子、5’非翻译前导序列、编码叶绿体转运肽的编码区、cry1C编码区、内含子、3’非翻译尾巴和3’末端转录形成和多聚腺苷酸化区域)的DNA，优选地该术语指包含有效连接编码本发明Cry1C蛋白质的DNA序列的植物可表达启动子的DNA，如SEQ ID No.1或5的DNA或编码序列。

如此处所用，当指本发明的cry1C基因时，“编码序列”或“编码区”指编码氨基酸序列的DNA序列并排除5’或3’非翻译前导序列或尾随序列，或非翻译序列，如内含子。因此，SEQ ID No.1的编码区是SEQ ID No.1中核苷酸位置1到590的DNA序列，其连接核苷酸位置1125到2415的DNA序列，形成编码一个蛋白质的一个连续可读框，不被非翻译部分如内含子或终止密码子中断。如此处所用，编码序列不包括终止密码子，但包括(Met)翻译起始密码子。

如此处所用，如术语“编码蛋白质X的基因或DNA”中的术语“编码”指该基因中含有的编码序列在靶标宿主细胞进行转录并翻译后产生蛋白质的能力。因此，本发明的cry1C1嵌合基因编码本发明的Cry1C1蛋白质，即使该嵌合基因含有被非编码内含子序列中断的两个编码序列(或外显子)。

可使用常规技术化学合成编码本发明Cry1C1蛋白质的DNA，并且其可插入表达载体中以产生大量的Cry1C蛋白质。可使用本发明的Cry1C蛋白质以常规方式(

等，1988)制备特异性的单克隆或多克隆抗体来进行免疫测定法(例如，ELISA、Western印迹、抗体包被的浸渍片)，以检测在任何材料，如植物材料中这些蛋白质的存在或缺失。

开发来鉴定包含本发明任何一个cry1C基因的转基因植物细胞、植物或植物来源材料如叶、种子、谷物或稻产品，或包含或来自包含本发明cry1C基因的植物材料的DNA的产品的工具是基于本发明新基因的特异性序列特征，如包含引入(外源)cry1C基因的基因组区域的特异性限制性图谱，或基于整合到植物基因组中的外源DNA序列的序列的特异性分子标记。

一旦知道了外源DNA如本发明cry1C基因的序列，可通过分子生物学技术制备引物和探针，其特异性识别样品的核酸(DNA或RNA)中的这些序列。例如，可开发PCR方法鉴定生物样品(如植物、植物材料或包含植物材料的产品，如本文定义的稻谷或种子或稻产品样品)中的本发明基因。该PCR基于至少两条特异性“引物”，例如，两条均识别本发明cry1C DNA或cry1C编码区内的序列(如SEQ ID No.1或5的DNA，或SEQ ID No.1或5的编码区)，或者一条识别cry1C DNA内的序列，而另一条识别相连转运肽序列内或调节区如包含本发明cry1C DNA的嵌合基因的启动子或3’末端内的序列。所述引物优选具有或包含15到35个核苷酸的序列，其在最佳PCR条件下特异性识别本发明cry1C嵌合基因或编码区内的序列，使得从包含本发明cry1C基因的核酸样品中扩增特异性片段(“整合片段”或差别性扩增子)。这意味着在最佳PCR条件下仅扩增靶标整合片段，不扩增植物基因组或外源DNA中的其它序列。

适合于本发明的PCR引物是长度在17个核苷酸到约200个核苷酸范围内的寡核苷酸，其包含选自转入本发明植物细胞或植物中的cry1CDNA或cry1C嵌合基因序列的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列。

当然引物可以多于所提及的17个连续核苷酸，并可以是例如20、21、22、30、35、50、75、100、150、200nt长，或者甚至更长。引物可以完全由选自cry1C核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，其5’末端(即，位于3’的17个连续核苷酸的外侧)的引物核苷酸序列较不重要。因此，引物的5’序列可由选自cry1C嵌合基因序列的核苷酸序列组成，但适当时可含有几个(例如1、2、5、10)个错配。引物的5’序列甚至完全由与本发明cry1C基因无关的核苷酸序列组成，如代表一个或更多个限制性酶识别位点的核苷酸序列。具有错配的这些无关序列或侧翼DNA序列优选不应该多于100个，更优选不多于50个或不多于25个核苷酸。

此外，合适的引物可包含或由其3’末端核苷酸序列组成，横跨本发明cry1C编码区与整合到植物DNA的cry1C嵌合基因中的相连转运肽序列或调节元件，如启动子序列、前导序列、尾随序列或3’转录终止和多聚腺苷酸化序列之间的连接区。对技术人员同样显而易见的是适当选择的PCR引物对也不应该包含彼此互补的序列。

如此处所用，术语“引物”包括任何核酸，其在模板依赖性过程，如PCR中能够启动新生核酸的合成。通常，引物为10到30个核苷酸的寡核苷酸，但可使用更长的序列。可以双链形式提供引物，尽管优选单链形式。探针可用作引物，但被设计以结合靶DNA或RNA，并不需用于扩增过程。

如此处所用，当涉及特异性引物时，术语“识别”指这样的事实：特异引物在标准的PCR鉴定方案中与本发明cry1C基因中的核酸序列特异性杂交，其中通过本领域熟知的阳性和阴性对照的存在测定特异性。

本文也包括的是检测生物材料中本发明cry1C基因的试剂盒，以及该试剂盒筛选生物材料的用途。如此处所用，“试剂盒”指用于进行生物样品中本发明cry1C基因鉴定目的的一组试剂。具体而言，本发明试剂盒的优选实施方案包含至少一条或两条特异引物，如上所述。任选地，所述试剂盒还包含此处在PCR鉴定方案中所述的任何其它试剂。或者，根据本发明的另一实施方案，所述试剂盒可包含如上所述的特异探针，其与生物样品的核酸特异性杂交，以鉴定其中cry1C基因的存在。任选地，所述试剂盒还可包含使用特异探针鉴定生物样品中cry1C基因的任何其它试剂(如，不限于杂交缓冲液、标记物)。

在本领域中，如在“PCR Applications Manual”(Roche MolecularBiochemicals，第2版，1999)中描述了标准的PCR方案。在用于各个含cry1C基因的植物物种的PCR鉴定方案中详细说明了用于PCR的最佳条件，包括特异引物的序列。然而，应理解PCR鉴定方案中的多个参数需要调整至特定的实验室条件，并可稍微进行修改以获得类似的结果。例如，制备DNA的不同方法的使用需要调整例如引物、聚合酶的量和所用的退火条件。类似地，其它引物的选择可规定用于PCR鉴定方案的其它最佳条件。然而，这些调整对本领域技术人员将是显而易见的，并在目前的PCR扩增手册如上文引用的手册中详述。

根据本发明用于检测本发明cry1C DNA的合适引物组合的实例是包含SEQ ID No.7的序列的引物(引物P1C203)和包含SEQ ID No.8的序列的引物(引物P1C204)。因此，在本发明中包括编码杀虫Cry1C蛋白质的任何DNA(其被这些引物特异性识别)，以及使用这些或其它特异引物检测该DNA的任何方法或任何试剂盒。引物P1C203和P1C204，或包含SEQID No.7或9的序列的引物也可用作检测本发明cry1C基因存在的探针。

也可设计特异性标记物或标记的探针，以检测本发明的DNA序列，并且此处包括针对本发明任何cry1C基因的特异标记物或探针的任何用途。在本发明的一个实施方案中，所述特异标记物、引物或标记的探针并不检测或识别不含本发明cry1C序列的任何植物，优选相同物种的任何植物，如试验植物，尤其是任何这种标记物、引物或标记的探针并不检测或识别表达Cry1C蛋白质的任何植物，其中该植物不含本发明的DNA序列(如此处定义的cry1CDNA，例如包含SEQ ID No.1或5任何一项的核苷酸序列的DNA，或SEQ ID No.1或5的编码序列)。

可稍微对本发明的DNA序列进行修改，以允许更便利的限制性酶切位点，或在不改变功效的情况下进行小的改变，并且其中该DNA编码与本发明的Cry1C蛋白质具有相同或基本上相同的杀虫活性的蛋白质。实际上，因为遗传密码子的简并性，众所周知的是在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，大多数氨基酸密码子可被其它密码子替换。此外，一些氨基酸可被其它等同氨基酸取代或加入，而不显著改变所述蛋白质杀虫活性。本发明DNA序列的等同物包括相比于如此处定义的本发明cry1C基因或编码序列具有少于20个，优选5-10个核苷酸差异的DNA序列，但其编码如此处定义的本发明的杀虫Cry1C蛋白质。

当涉及本发明Cry1C蛋白质的氨基酸序列时，术语“基本上相同的”指包括与比较的蛋白质氨基酸序列具有不高于5％，优选不高于2％，尤其不高于1％差异的氨基酸序列；并且当涉及Cry1C蛋白质的毒性和杀虫活性时，其指包括在生物测定的相同条件下(优选在使用来自相同种群的昆虫和合适对照的同一生物测定中)获得的LC50值与比较的蛋白质获得的LC50值具有不高于2倍，优选不高于50％差异的蛋白质。

如此处所用，“微生物”指仅在显微镜的帮助才可观察到的任何活的生物，如细菌、酵母细胞、植物细胞、病毒、真菌。这包括尺寸在视力范围下的所有广泛的单细胞生物，其可在实验室中繁殖和操作，通常是原核或单细胞真核生命形式，包括组织培养物和质粒。

编码Cry1C蛋白质的DNA序列的“杀虫有效部分(或部分或片段)”指编码多肽的DNA序列，所述多肽具有比自然界中Bt产生的Cry1C原毒素更少的氨基酸，但仍然可以杀虫。

为了在微生物或重组宿主，例如大肠杆菌、Bt菌株、植物或植物细胞中表达编码本发明Cry蛋白质的DNA序列的全部或杀虫有效部分，可在DNA序列侧翼引入合适的限制酶位点。这可通过位点定向诱变，使用众所周知的方法完成(Stanssens等，1989；White等，1989)。

为了在植物中获得杀虫蛋白质增强的表达和/或当杀虫蛋白质不存在于植物宿主细胞中(如在细菌或其它原核生物宿主细胞中)时防止杀虫蛋白质表达，在本发明一个实施方案中，将植物内含子，优选单子叶植物内含子插入本发明的嵌合cry1C基因中，优选插入其编码序列中。此处可使用任何已知的植物内含子，优选单子叶植物内含子(例如，Brown，1986，Brown和Simpson，1998，Brown等，1996)，只要所述内含子有效连接编码序列片段，以保证在植物细胞中进行正确剪接。可通过RT-PCR、Northern印迹或通过本领域可得的任何其它手段检查活性蛋白质的产生，来方便地检查靶宿主植物物种或其细胞中内含子的有效连接和所得正确剪接。在优选的实施方案中，本发明的内含子是单子叶内含子，如Dennis等(1984)描述的Adh1内含子，例如SEQ ID No.1的核苷酸位置591到核苷酸位置1124的核苷酸序列。在本发明另一实施方案中，杀虫蛋白质编码序列尤其是Cry1C编码序列中含有的内含子，是Eckes等(1986)描述的马铃薯(Solanum tuberosum)(马铃薯)光诱导性的组织特异性ST-LS1基因的第二个内含子。

在本发明一个实施方案中，植物内含子有效连接待在植物细胞中表达的任何Bt杀虫蛋白质编码序列的部分，使得其在植物细胞中有效剪接并产生Bt杀虫蛋白质。可使用常规技术，如RT-PCR、Northern印迹或植物细胞中产生的功能性蛋白质的检测来测定植物细胞中的有效剪接。当然，为有效剪接，内含子需要插入到编码序列的正确位置中，使得在序列中获得功能性的5’和3’剪接位点。因为在昆虫生物测定中，在表达这些cry1C嵌合基因的植物上观察到高的昆虫死亡率，所以本发明中的cry1C嵌合基因，如cry1C1或cry1C2嵌合基因中的内含子在稻植物细胞中被有效剪接。RT-PCR也显示包含本发明cry1C基因的植物产生编码期望的Cry蛋白质的mRNA。

根据本发明的一个实施方案，Cry1C蛋白质靶向细胞内细胞器，如质体，优选叶绿体或线粒体。为了该目的，本发明的嵌合基因包含编码信号肽或靶肽的编码区，其连接编码本发明Cry1C蛋白质的DNA。本发明的蛋白质中包括的尤其优选的肽是靶向叶绿体或其他质体的转运肽，尤其是来自其基因产物靶向所述质体的植物基因的重复转运肽区域，如SEQ IDNo.4的优化转运肽，Lebrun等(1996)，或Capellades等(美国专利5,635,618)描述的优化转运肽，来自菠菜的铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶的转运肽(Oelmuller等，1993)、Wong等(1992)中描述的转运肽或公开的PCT专利申请WO 00/26371中的靶向肽。在本发明的一个实施方案中，所述叶绿体转运肽包含SEQ ID No.4的氨基酸位置3到氨基酸位置124的序列或其变体，如包含SEQ ID No.4的氨基酸位置3到氨基酸位置124的序列的叶绿体转运肽，其中位置55处的Cys氨基酸被SEQ ID No.4中的Tyr替代，和/或其中在SEQ ID No.4中位置51处的Gly氨基酸后添加Gly氨基酸。

编码根据本发明的信号肽的尤其有用的DNA与本发明cry1C DNA组合包括编码任何一个以下蛋白质或其组合的DNA：Van Den Broeck等(1985)描述的叶绿体转运肽、引起蛋白质转运至叶绿体的美国专利5,510,471和美国专利5,635,618的优化叶绿体转运肽、分泌信号肽或将蛋白质靶向其它质体、线粒体、ER或另一细胞器的肽。编码本发明转运肽的优选DNA是包含SEQ ID No.3的核苷酸位置7到核苷酸位置372的序列，尤其是SEQ ID No.3的序列，或与SEQ ID No.3的核苷酸位置7到核苷酸位置372的序列具有至少95％，尤其是至少97或99％序列同一性的等同序列的DNA。

此外，对于任何靶虫害，可使用本领域已知的方法评估本发明的Cry蛋白质的结合性质(例如，Van Rie等，1990，EP 408403)，以测定本发明的Cry1蛋白质是否结合靶昆虫中肠上的位点，所述位点不被其它Cry或非Cry蛋白质识别(或竞争)。除了本发明任何一个cry1C基因，结合相关敏感昆虫中不同结合位点的其它Bt晶体蛋白质，或来自Bt菌株或其它来源的具有不同作用模式的其它毒素(如VIP毒素(例如，在http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip.html列出的 VIP3A毒素，或Estruch等，1996的VIP3Aa毒素)或昆虫(肠)蛋白质酶抑制剂)也在植物中表达以防止或延迟对表达杀虫毒素的植物的昆虫抵抗力的发展，并增加受本发明植物控制的昆虫种类。在一方法中，可通过筛选蛋白质对Cry1C抗性昆虫的杀虫效果找到与本发明Cry1C蛋白质具有不同作用模式的蛋白质，或者发现该蛋白质作用的生化机制或途径与Cry1C蛋白质所用的机制或途径不同时，使得引起Cry1C抗性的昆虫中的突变不太可能影响其它蛋白质的毒性。因为新cry1C基因的特征，它们对转化植物，例如单子叶植物，如玉米、甘蔗、稻或小麦和双子叶植物，如棉花、大豆、茄子和芸苔种植物以保护这些植物免受虫害极其有用。

尤其是为了特定虫害昆虫抗性管理的目的，优选将本发明的cry1C基因与编码不同昆虫控制蛋白质的另一基因，尤其是Bt晶体蛋白质组合。与本发明的Cry1C蛋白质组合的优选昆虫控制蛋白质，尤其是用于在植物，优选稻植物中同时表达的蛋白质是Cry1Ab蛋白质。如此处所用，“Cry1Ab蛋白质”是任何杀虫Cry1Ab蛋白质，尤其是包含与SEQ ID No.12的氨基酸位置30到氨基酸位置617的序列相同或具有至少95％、97％、98％或99％同一性，或与SEQ ID No.12的氨基酸位置3到氨基酸位置617的序列相同或具有至少95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的杀虫蛋白质，或包含与SEQ ID No.12的氨基酸位置3到氨基酸位置617的序列相同或具有至少95％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的杀虫蛋白质，其在N末端与SEQ ID No.4的蛋白质融合。

在一个实施方案中，通过用包含cry1C和cry1Ab嵌合基因的质粒转化植物，或通过用包含cry1C嵌合基因的质粒和包含cry1Ab嵌合基因的质粒共转化植物，或通过用cry1Ab嵌合基因转化已经含有本发明cry1C基因的植物获得这种共表达。如此处所用，“cry1Ab嵌合基因”是编码上文定义的Cry1Ab蛋白质的嵌合基因，例如包含以下有效连接的序列的嵌合基因：a)编码杀虫Cry1Ab蛋白质的编码区，其包含与SEQ ID No.11的核苷酸位置88到核苷酸位置1851的DNA序列具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的DNA序列，或包含与SEQ ID No.11的核苷酸位置7到核苷酸位置1851的DNA序列具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的DNA序列，或包含SEQ ID No.11的核苷酸位置88到核苷酸位置1851的DNA序列，或包含SEQ ID No.11的核苷酸位置7到核苷酸位置1851的DNA序列，或包含任何这些DNA序列，如SEQ ID No.11的核苷酸位置7到核苷酸位置1851的序列，其在5‘末端连接SEQ ID No.3的转运肽编码序列，和b)能够在植物细胞中指导表达的(第二个)启动子区。由这种嵌合基因编码的Cry1Ab蛋白质包含与SEQ ID No.12的氨基酸位置30到氨基酸位置617的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No.12的氨基酸位置3到氨基酸位置617的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No.12的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列，或包含氨基酸位置30到氨基酸位置617的SEQ ID No.12的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.12的氨基酸位置3到氨基酸位置617的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.12的氨基酸序列。

也可通过包含如上文定义的任何一个嵌合cry1Ab基因的植物与包含任何一个本发明嵌合cry1C嵌合基因的植物杂交获得包含cry1C和cry1Ab嵌合基因的转化植物。在一个实施方案中，本发明的植物、细胞、种子和谷物，尤其是本发明的稻植物、细胞、种子或谷物在同一个基因座上包含如上定义的本发明的嵌合cry1C基因和嵌合cry1Ab基因，使得这些基因在后代植物细胞、植物、种子或谷物中不分离。

在EP专利0408403中描述了用于获得在同一植物中表达不同Bt嵌合基因以努力减少或防止对转基因抗昆虫植物的抗性发展的一般方法。

为了选择目的，也是为了增加杂草控制选择，也可以用编码使广谱除草剂失活的蛋白质或编码除草剂蛋白质靶标的变体的蛋白质(但所述蛋白质变体对这种除草剂例如基于草铵膦或草甘膦的除草剂不敏感)的DNA转化本发明的转基因植物。在这些除草剂抗性基因稍后从本发明的cry1C植物中被去除或删除的情况下，所述除草剂抗性基因优选位于不同于本发明的cry1C或cry1C和cry1Ab基因的另一基因座。根据本发明，优选的除草剂抗性基因是有效连接到35S启动子(Odell等，1985)和农杆菌胭脂碱合酶基因的3’非翻译区(Depicker等，1982)的bar编码序列(Thompson等，1987)，使得转化有这种嵌合bar基因的植物对草铵膦除草剂具有抵抗力。

本发明杀虫有效的cry1C DNA，优选本发明的cry1C嵌合基因可以常规方式稳定整合到植物细胞的核基因组中，并且如此转化的植物细胞可用于以常规方式产生包含本发明的cry1C基因的抗昆虫植物和种子。在这方面，农杆菌例如根癌农杆菌中含有杀虫有效的cry1C基因部分的卸甲Ti质粒可用于转化植物细胞，其后可使用任何已知方法，例如EP 0116718、EP 0270822、PCT申请WO 84/02913和公开的欧洲专利申请(″EP″)0242246和De Block等(1989)中描述的方法从转化的植物细胞再生转化的植物。优选的Ti质粒载体在边界序列之间，或至少位于Ti质粒的T-DNA右边界序列的左侧各自含有杀虫有效的cry基因部分。当然，使用方法，如直接基因转移(例如EP 0233247中所述)、花粉介导的转化(例如EP 0270356、PCT公开WO 85/01856和美国专利4,684,611中所述)、植物RNA病毒介导的转化(例如EP 0067553和美国专利4,407,956中所述)、脂质体介导的转化(例如US专利4,536,475中所述)和其它方法，如用于转化玉米某些株系的方法(例如美国专利6,140,553；Fromm等，1990；Gordon-Kamm等，1990)的方法和通常用于转化单子叶的方法(PCT公开WO 92/09696)，用其它类型的载体转化植物细胞。对于稻转化，优选的是在WO 92/09696中描述的转化方法。对于棉花转化，尤其优选的是在PCT专利公开WO 00/71733中描述的方法。对于大豆转化，参考本领域已知的方法，例如Hinchee等(1988)和Christou等(1990)，或WO 00/42207的方法。

所得转化植物可用于常规植物育种方案中，以产生具有相同特征的更多转化植物，或在相同或相关植物物种的其它变种中引入杀虫有效的cry1C基因。从转化植物获得的种子含有作为稳定基因组插入序列的杀虫有效的cry基因部分。

本发明的杀虫有效的cry1C DNA，优选包含SEQ ID No.1或5的序列的DNA插入植物细胞基因组中，使得所述插入的基因处于可在植物细胞中指导基因表达的启动子(因此命名为“植物表达启动子”)的下游(即，3′)，并处于其控制之下。这优选通过插入cry1C嵌合基因来完成，所述嵌合基因包含植物细胞基因组中，尤其是核或质体(例如，叶绿体)基因组中的植物表达启动子。优选的植物表达启动子包括：隔离群CM1841(Gardner等，1981)、CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)的花椰菜花叶病毒(CaMV)的强组成型35S启动子(“35S启动子”)、Odell等(1985)描述的35S启动子、来自泛蛋白家族的启动子(例如，Christensen等，1992的玉米泛蛋白启动子，也参阅Cornejo等，1993)、gos2启动子(de Pater等，1992)、emu启动子(Last等，1990)、拟南芥肌动蛋白质启动子，如An等(1996)描述的启动子、稻肌动蛋白质启动子，如Zhang等(1991)或McElroy等(1990)描述的启动子；木薯叶脉花叶病毒的启动子(WO 97/48819，Verdaguer等(1998))、来自地三叶草矮化病毒的pPLEX系列的启动子(WO 96/06932)、尤其是Boevink等(1995)或Schünmann等(2003)描述的来自地三叶草矮化病毒基因组区段4或7的重复启动子区(此处称作“S7S7”或“S4S4”启动子)、醇脱氢酶启动子，例如pAdh1S(GenBank登录号X04049、X00581)、和分别驱动T-DNA的1′和2′基因表达的TR1′启动子和TR2′启动子(分别为″TR1′启动子″和″TR2′启动子″)(Velten等，1984)。或者，可利用并非组成型但对植物的一个或更多个组织或器官(例如，叶和/或根)特异的启动子，由此插入的cry基因部分仅在特定组织或器官的细胞中表达。例如，可通过将杀虫有效的基因部分置于光诱导启动子(如所述植物本身或在美国专利5,254,799中公开的另一植物如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子)的控制下，在植物(例如玉米、棉花)的叶中选择性表达杀虫有效的cry基因部分。另一种选择是使用其表达优选被创伤如昆虫喂食诱导的启动子，例如，Cordero等(1994，Genbank登录号X78988)描述的MPI启动子，或农杆菌TR2’或甘露碱合酶启动子(Velten等，1984)或由化学因素诱导的启动子。在本发明的一个实施方案中，如果需要，可通过将CaMV 35S启动子区或另一启动子或至少启动子增强元件置于创伤诱导型启动子的附近，并优选置于与其相同方向(5’到3’)增强此类创伤诱导型启动子的表达，使得基础表达水平提高，但保留创伤时的诱导。

在本发明的一个实施方案中，用于本发明cry1C嵌合基因或本发明cry1Ab嵌合基因中的优选启动子包括包含SEQ ID No.9(或包含SEQ IDNo.9中核苷酸位置1到1997的序列)、10、13、14任何一项的DNA序列，或与任何这些序列的核苷酸具有低于1到5％，尤其低于2％不同的等同序列的启动子。这些启动子可包括非翻译前导序列，并还可包含内含子。在本发明的一个实施方案中，所述cry1C嵌合基因在启动子与编码区之间包含玉米泛蛋白基因的前导序列，例如Christensen等(1992)所述，并且所述cry1Ab嵌合基因在启动子与编码区之间包含稻Actin 1基因(McElroy等，1990)的内含子和前导序列。

cry1C DNA优选插入植物基因组中，使得所插入的编码序列位于合适的3′末端转录调节信号(即，转录形成和多聚腺苷酸化信号)的上游(即，5′)。这可通过将cry1C嵌合基因插入植物细胞基因组中实现。优选的多聚腺苷酸化和转录形成信号包括来自黄顶菊(Flaveria bidentis)的NADP-苹果酸酶基因(Marshall等，1996)、胭脂碱合酶基因(Depicker等，1982)、章鱼碱合酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的3’非翻译区的那些信号，其在转化的植物细胞中作为3′-非翻译DNA序列起作用。

在本发明的一个实施方案中，本发明的cry1C基因转化到以下植物中：玉米、棉花、稻、大豆、甘蔗、小麦、芸苔、大豆、蔬菜、十字花科植物种、芸苔植物种如花椰菜、卷心菜、白菜、萝卜、芥菜、油菜、羽衣甘蓝、花茎甘蓝。在本发明的一个实施方案中，以下芸苔属种植物受本发明cry1C基因的保护免于昆虫：B.carinata、芥菜(B.juncea)、欧洲油菜(B.napus)、B.nigra、甘蓝(B.oleracea)和芜青(B.rapa)。

本发明包括转化有本发明cry1C基因的植物、细胞或种子，尤其是稻植物、细胞或种子，以及含有与此类转化植物、细胞或种子杂交或育种后获得的本发明基因的植物、细胞或种子，尤其是稻植物、细胞或种子。可使用本领域已知的常规育种技术，但也包括已知的体外工作如重双单倍体产生、胚拯救、原生质体融合等完成这种杂交或育种。像这样，本发明还涉及粳稻植物、细胞或种子，及其与cry1C-转化籼稻植物、细胞或种子杂交获得的含有本发明cry1C基因的后代，和此类植物、细胞或种子的任何用途。此处包括的是包含本发明任何cry1C和/或cry1Ab嵌合基因的稻植物与包含赋予昆虫控制或另一有益特征(例如，除草剂耐受性、产量提高、胁迫耐受性等)的稻转化事件的其它植物的杂交，如与表达Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白质的Bt-稻事件TT51的杂交(中国专利申请200510062980，公开号1840655)，或与表达Cry1Ca5蛋白质(如事件T1C-19，参阅Tang等2006)、Cry1B蛋白质(参阅例如，Breitler等(2001))、或Cry2A蛋白质(参阅例如，Maqbool等(1998))、或表达Cry1Ab-Cry1B融合蛋白质(Ho等，2006)的稻品种的杂交，以及包含叠加昆虫控制基因的稻植物或其控制昆虫，尤其是二化螟或稻纵卷叶螟的用途。

植物细胞的转化也可用于在植物细胞培养物中产生本发明的cry1C蛋白质，例如产生适当配制后可应用到农作物的Cry1C蛋白质。当指在此处产生转基因植物细胞时，这指分离状态或组织培养中的植物细胞(或也可以是植物原生质体)，或指在植物或分化器官或组织中含有的植物细胞(或原生质体)，并且此处明确包括这两种可能性。因此，说明书或权利要求中植物细胞的参考并非仅指培养物中分离的细胞，也指任何植物细胞，无论其定位于哪里或其存在于哪种类型的植物组织或器官中。如此处所用，植物细胞也指原生质体或花粉。

本发明cry1C基因的编码序列也可用于转化微生物，如对鳞翅目或鞘翅目具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株。因此，可产生转化微生物，如Bt菌株，其用于抵抗广谱鳞翅目和鞘翅目虫害或抵抗额外的鳞翅目虫害。可以常规方式，优选使用如Mahillon等(1989)和PCT专利申请WO90/06999中所述的常规电穿孔技术进行用整合至合适克隆载体中的本发明的cry1C基因的编码序列转化微生物，如假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌。

可通过常规方法(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)发酵含有cry1C编码序列的转化芽孢杆菌种菌株，以提供高产量的细胞。在熟知的适当条件(Dulmage，1981)，这些菌株各自形成孢子，产生含有Cry1C蛋白质的晶体蛋白质。

可以常规方式，使用表达作为活性成分的Cry1C毒素的微生物，和合适载体、稀释剂、乳化剂和/或分散剂配制本发明的杀虫组合物，尤其是抗鳞翅目组合物(例如Bernhard和Utz，1993所述)。该杀虫组合物可配制成可湿性粉剂、片剂、颗粒剂或粉末，或配制成具有水溶剂或非水溶剂的液体制剂，如泡沫、凝胶、悬浮液、浓缩物等。

根据本发明，用于控制昆虫，尤其是鳞翅目，优选鳞翅目稻昆虫如螟虫和纵卷叶螟的方法可包括向待受保护的位点(区域)应用(例如喷雾)杀虫量的Cry1C蛋白质或转化有本发明cry1C基因的宿主细胞。待受保护的位点包括例如，虫害或生长植物的产地，如稻田，或植物生长的区域。

在本发明的一个实施方案中，本发明cry1C基因或Cry1C蛋白质所抗的昆虫包括选自以下的昆虫：小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、贪夜蛾(Spodoptera littoralis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)、烟草天蛾(Manduca sexta)、云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana)、Choristoneura occidentalis、蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)、褐卷蛾(Pandemis pyrusana)、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、白斑天幕毛虫(Orgyia leucostigma)、天幕毛虫(Malacosoma disstria)、Lambina fiscellaria、二化螟(Chilosuppressalis)、禾草螟(Chilo plejadellus)、Chilo polychrysa、斑禾草螟(Chilo partellus)、三化螟(Scirpophaga incertulas)、白螟(Scirpophagainnotata)、大螟(Sesamia inferens)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)、Marasmia patnalis、橘带卷蛾(Argyrotaenia citrana)、菜粉蝶(Artogeia rapa)、Chrysomela scripta、玉米螟(Ostrinia nubilalis)、甘蔗螟虫(Diatraea saccharalis)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)、Hereitogramma licarisalis、稻螟蛉(Naranga aenescens)、稻眉眼蝶(Mycalesis gotama)、稻显纹刷须野螟(Marasmia exigua)、Marasmia ruralis、稻三点水螟(Nymphuladepunctalis)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、Rupela albinella、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、Mythimna unipuncta、Chilo zacconius和稻苞虫(Parnara guttata)。

在一个实施方案中，优选的靶标虫害是鳞翅目稻虫害，如二化螟或稻纵卷叶螟，或鳞翅目稻虫害如条纹螟虫二化螟、黄色螟虫三化螟(也命名为三化螟Tryporyza incertulas)、白色螟虫白螟(也命名为Tryporyzainnotata)、黑头螟虫Chilo polychrysa、粉色螟虫大螟、甘蔗蛀虫Diatraeasaccharalis、稻茎蛀虫禾草螟、稻纵卷叶螟Marasmia patnalis、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis，和昆虫如Hereitogramma licarisalis、稻螟蛉、稻眉眼蝶，稻显纹刷须野螟、Marasmia ruralis、稻三点水螟、斜纹叶蛾、Rupela albinella、草地贪夜蛾、Mythimna unipuncta、Chilo zacconius和稻苞虫。本发明cry1C或cry1C和cry1Ab基因编码的蛋白质尤其用于控制这些昆虫，例如通过在植物细胞，尤其是稻植物细胞中表达本发明的cry1C和/或cry1Ab基因。

可通过在田地中播种、种植或生长包含任何一个本发明cry1C嵌合基因的植物，或通过在被这些昆虫侵袭的植物中或植物上保证本发明Cry1C蛋白质的存在(例如，通过播种或种植转化有本发明cry1C嵌合基因，如cry1C1或cry1C2嵌合基因的稻植物)控制这些昆虫。本发明也涉及本发明cry1C嵌合基因，至少cry1C1或cry1C2嵌合基因，优选与另一cry基因，如cry1Ab嵌合基因，优选cry1Ab1或cry1Ab2嵌合基因的组合在植物、细胞或种子，尤其是稻植物、细胞或种子中保护它们免受鳞翅目虫害的用途。

在本发明中，还提供编码优化的叶绿体转运肽的修饰的编码序列，以及其将蛋白质靶定到叶绿体的用途。在本发明的一个实施方案中，优化的转运肽的编码序列包含与SEQ ID No.3的核苷酸位置7到核苷酸位置372的核苷酸序列，尤其是与SEQ ID No.3的序列相同或具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列，或编码包含与SEQ ID No.4的序列相同或具有至少95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的DNA。在本发明中也包括包含本发明修饰的转运肽编码序列的植物细胞、植物或种子，尤其是稻植物细胞、植物或种子，以及该转运肽编码序列用于将任何蛋白质靶定至叶绿体，尤其是稻植物的叶绿体中的用途。在本发明的一个实施方案中，包含SEQ ID No.3的核苷酸位置7到核苷酸位置372的核苷酸序列，尤其是SEQ ID No.3的序列的优化的转运肽的编码序列有效连接编码本发明Cry1C蛋白质的DNA，如cry1C1或cry1C2基因，和/或有效连接cry1Ab基因的编码序列，如cry1Ab1或cry1Ab2编码序列，以保证本发明植物细胞、植物或种子，尤其是稻植物细胞、植物或种子的叶绿体靶定。

在权利要求的措辞中反映了本发明的这些和/或其它实施方案，其形成本发明说明书的一部分。

以下实施例阐明了本发明，而且并非提供用来限制本发明或寻求的保护。除非另有说明，根据Sambrook等(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY并在Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的第1卷和第2卷中所述的标准方案进行所有的重组DNA技术。在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)and Blackwell ScientificPublications，UK出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述了用于植物分子工作的标准材料和方法。

实施例、权利要求和说明书中涉及的所附序列表如下：

序列表

SEQ ID No.1：优化用于植物中表达的cry1C1 DNA序列

SEQ ID No.2：SEQ ID No.1编码的Cry1C1蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID No.3：编码优化的叶绿体转运肽的编码序列

SEQ ID No.4：SEQ ID No.3的序列编码的叶绿体转运肽的氨基酸序列

SEQ ID No.5：有效连接编码Cry1C2蛋白质的SEQ ID No.3的序列的优化cry1C1 DNA序列

SEQ ID No.6：由SEQ ID No.5编码的Cry1C2蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID No.7：cry1C引物P1C203

SEQ ID No.8：cry1C引物P1C204

SEQ ID No.9：玉米泛蛋白启动子，包括玉米泛蛋白5’非翻译前导序列及内含子序列(pUbi)

SEQ ID No.10：玉米蛋白质酶抑制剂(mpi(2K))启动子(pMPI(2K))

SEQ ID No.11：优化的cry1Ab编码序列

SEQ ID No.12：由SEQ ID No.11序列编码的Cry1Ab蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID No.13：包含内含子序列的稻肌动蛋白质1启动子(pAct1)

SEQ ID No.14：玉米蛋白质酶抑制剂(mpi(C1))启动子(pMPI(C1))

实施例

1.嵌合基因和转化载体的构建

设计用于转化植物尤其是稻植物的几种cry1C嵌合基因。基因及调控元件的多样性的使用允许为不同目的或用途来选择植物。使用SEQ ID No.2的Cry1C蛋白质(Cry1Ca4)的生物测定显示该蛋白质对于鳞翅目昆虫三化螟、大螟、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、Marasmia patnalis和稻纵卷叶螟具有毒性，并且因此是可在转基因植物中表达的有用蛋白质。

设计用于在植物细胞尤其是稻中进行最适表达的cry1C1 DNA示于SEQ ID No.1中。该cry1C1 DNA具有插入到cry1C编码序列中的玉米Adh1内含子I(Dennis等，1984)。该DNA编码本发明的杀虫Cry1C1蛋白质(SEQ ID No.2)。对于植物转化，构建了包含以下有效连接元件(5’至3’)的几种嵌合基因(cry1C1嵌合基因)：包含SEQ ID No.9(pUbi)或10(pMPI(2K))的启动子区的启动子、SEQ ID No.1的cry1C1 DNA和包括来自农杆菌章鱼碱合酶基因的3’非翻译区的序列(De Greve等，1983)。

为了保证Cry1C蛋白质对植物细胞叶绿体的靶向作用，还构建了cry1C1嵌合基因的变体，其包含编码基本上如Lebrun等(1996)描述的优化转运肽(SEQ ID No.4)的修饰序列，有效连接编码Cry1C蛋白质的DNA，使得转运肽融合蛋白质(Cry1C2蛋白质)在植物细胞中表达。对于植物转化，构建了包含以下有效连接元件(5’至3’)的几种嵌合基因：包含SEQ ID No.9或10的启动子区域的启动子、SEQ ID No.5的cry1C2DNA和包括来自农杆菌章鱼碱合酶基因的3’非翻译区的序列(De Greve等，1983)。

为获得表达两种不同Cry蛋白质的植物，还设计并装配cry1Ab嵌合基因以获得可用于植物、尤其稻植物的一组cry1Ab嵌合基因。此处还使用不同基因及调控元件为不同目的或用途来选择植物。

设计用于植物细胞中最适表达的cry1Ab1 DNA示在SEQ ID No.11中。该DNA编码杀虫的Cry1Ab1蛋白质(SEQ ID No.12)。对于植物转化，构建了包含以下有效连接元件(5’至3’)的几种嵌合基因(cry1Ab1嵌合基因)：包含SEQ ID No.9、10、13或14的启动子区域的启动子、SEQ IDNo.11的cry1Ab1 DNA和包括来自农杆菌章鱼碱合酶基因的3’多聚腺苷酸化及转录终止区的序列(De Greve等，1983)。

为了保证Cry1Ab蛋白质对植物细胞叶绿体的靶向作用，构建了cry1Ab1嵌合基因的变体，其包含了编码基本上如Lebrun等(1996)描述的优化转运肽(SEQ ID No.4)的修饰序列，有效连接编码cry1Ab1编码区，使得转运肽融合蛋白质(Cry1Ab2蛋白质)在植物细胞中表达。对于植物转化，构建了包含以下有效连接元件(5’至3’)的几种嵌合基因(cry1Ab2嵌合基因)：包含SEQ ID No.9、10、13或14的启动子区域的启动子、连接SEQ ID No.5的核苷酸位置7到核苷酸位置1854的cry1Ab1 DNA上游(5’)的SEQ ID No.3的转运肽DNA和包括来自农杆菌章鱼碱合酶基因的3’非翻译区的序列(De Greve等，1983)。

在一些嵌合基因中，还使用CaMV 35S启动子区来控制如上描述的有效连接的cry1C(1或2)或cry1Ab(1或2)编码序列的转录。

包含本发明基因的转化载体(中间克隆载体)来自pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele，1989)。载体骨架包含以下遗传元件：

a)包含来自质粒pBR322(Bolivar等，1977)用于在大肠杆菌中复制的复制起点的质粒核心和包含来自假单胞菌质粒pVS1(Itoh等，1984)用于在根癌农杆菌中复制的复制起点的限制性片段。

b)赋予对链霉素和壮观霉素(aadA)抗性用于质粒在大肠杆菌及根癌农杆菌中增殖和选择的选择性标记基因。

c)由来自转座子Tn903的nptI基因的新霉素磷酸转移酶编码序列的片段组成的DNA区(Oka等，1981)。

每一转化载体的T-DNA区也可进一步包含-在上述一个cry基因之外-用作选择性标记基因的嵌合bar基因。bar基因的表达允许产生酶，膦丝菌素-乙酰转移酶，其引起除草剂草铵膦代谢，因此将其在植物内转化为非除草剂。嵌合bar基因包含来自花椰菜叶病毒35S转录物的35S3启动子区(Odell等，1985)、Thompson等(1987)描述的吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的膦丝菌素乙酰转移酶的bar编码序列、和来自pTiT37的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’非翻译区的3’转录终止及多聚腺苷酸化序列(Depicker等，1982)。在一些转化中，使用两种中间克隆质粒用于转化：一种质粒含有cry1C嵌合基因或含有cry1C和cry1Ab嵌合基因，另一种质粒含有嵌合bar基因；在其它转化中一种质粒包含cry1C嵌合基因，另一种质粒包含cry1Ab嵌合基因(每一种或两种此类质粒也可包含嵌合bar基因)。该方法允许获得在稻植物基因组的不同基因座或在相同基因座上具有不同基因的不同类型的稻转化株，使得在一些植株中一种嵌合基因(例如，bar基因、或一种cry基因)在植株中可通过育种从其它嵌合基因中去除，例如，在不需要待市售的最终稻植物的除草剂耐受性的情况下，或在仅cry1C基因将与含有另一cry基因的稻植物杂交(例如本发明的cry1C基因与稻事件TT51中的cry1A基因的堆叠的情况下(中国专利申请200510062980，公开号1840655))。

在用于植物转化前，通过限制性内切酶消化分析和DNA测序确认所有构建的质粒为正确的。

2.植物转化及再生

受体农杆菌菌株携带有不形成瘤(卸甲的)Ti质粒，其T区已经被去除。该Ti质粒携带必要的vir基因功能，该功能为中间克隆载体的T-DNA区(含有如上的cry1C和/或cry1Ab嵌合基因)向植物基因组转移所需。它还具有可以与中间克隆载体形成共整合的同源区。

在大肠杆菌中构建中间克隆载体。经包含携带移动辅助质粒的大肠杆菌菌株的三亲融合将其转移至受体根癌农杆菌菌株中。在所获的农杆菌菌株中的T-DNA结构通过Southern印迹杂交验证(Deblaere等，1985)。

中间克隆载体的农杆菌介导的基因转移导致位于T-DNA边界重复序列之间的DNA片段转移至植物基因组中。

关于用于转化的靶组织，使用已切成小块的来自粳稻和籼稻栽培种的未成熟胚或胚来源的愈伤组织，基本上使用PCT专利公开WO 92/09696中描述的技术。将农杆菌与稻组织共培养一些天，随后通过合适的抗生素将其去除。通过向稻组织培养基中加入草铵膦(具有5mg/L的膦丝菌素)来选择转化的稻细胞。

将在具有草铵膦的培养基上生长的愈伤组织转移至再生培养基上。当幼苗生长出根和芽时，将它们转移至土壤中并置于温室内。

当它们开花时，所选的转化稻植株自交，并在成熟时收获含引入的嵌合基因的种子。

油菜植株也使用根癌农杆菌用本发明的cry1C和/或cry1Ab嵌合基因转化。在常规转化和再生方法，例如De Block等(1989)描述的方法中使用欧洲油菜的下胚轴外植体。

3.转化体分析

一旦转化稻植株再生，使用PCR和Southern分析来验证转基因的整合。准备用于检测本发明的cry1C编码区存在的特异引物，将它们命名为PS1203和P1C204(分别为SEQ ID No.7和8)。

通过Southern印迹来选择具有整合到其基因组的单一拷贝cry1C嵌合基因的稻和油菜植株。使用如Cry1C(或Cry1Ab-)特异性ELISA测定的免疫分析或Western印迹来选择显示Cry1C蛋白质或Cry1C和Cry1Ab蛋白质最佳表达水平的那些转化植株。用含PUbi-cry1C1-3’ocs嵌合基因(除了P35S-bar-3′nos嵌合基因和PAct1-cry1Ab1-3′ocs嵌合基因)的质粒转化稻植株之后获得包含不同转化事件的12株T0植株上的初期酶联免疫吸附测定显示Cry1Ca4蛋白质的值介于8.4至47.9微克/克鲜叶重之间，验证了在这些转化的稻植株中Cry1Ca蛋白质良好的表达。

在从显示转化有SEQ ID No.1或3的cry1C基因(包含植物内含子)的稻植株中收集的RNA上的RT-PCR实验显示剪接正确发生，并且产生了有功能的Cry1C蛋白质。

在标准昆虫生物检测条件下，在含有处于SEQ ID No.10的mpi启动子(pMPI)调控下的本发明cry1C2基因的所选转化稻植株中进行的使用甜菜夜蛾新生幼虫的昆虫检测显示转化植株具有高杀虫活性。3天后，在酶联免疫吸附测定中显示Cry1C蛋白质显著表达的所有稻植株中，发现了对甜菜夜蛾幼虫100％的致死率，一些植株没有显示可见的叶损伤，而对照植株或未检测到Cry1C表达水平的植株显示出严重的叶损伤或没有剩余叶片。这些昆虫检测证实了本发明cry1C2嵌合基因编码区中含有的内含子在转基因稻植株中正确地进行剪接。

在对转化有本发明cry1C2嵌合基因的植株的昆虫生物检测中，在明显的杀虫效果中可见到油菜中的有效剪接。

而且，在MPI启动子调控下表达Cry1C或Cry1Ab蛋白质的稻植株中，在受伤的植株中已表明Cry1C或Cry1Ab蛋白质表达的显著升高。

使用粉色螟虫(Sesamia inferens)昆虫侵袭(在不同日期应用的60幼虫/植物)的单基因拷贝cry1C、cry1Ab和cry1C+cry1Ab转化的稻植株(代表多种不同转化事件，其中嵌合基因处于如上描述的pMPI(2K)或pUbi的调控下，一些嵌合基因包含有效连接至cry编码区的SEQ ID No.4的转运肽(见附表1))的最初温室试验证实了单基因及双基因稻植株(T1代植株，每一转化事件分析10株)的高杀虫活性。在未转化的对照稻植株中存在大量的“死心”情况，每株的分蘖数目低(每株约6个)，整个叶鞘损伤，并且在植株上发现更多的昆虫幼虫或蛹；在转化Cry1C、Cry1Ab和双Bt(Cry1C+Cry1Ab)的稻植株中，未发现死心情况，每株的分蘖数更高(每株介于约7至约13个分蘖，大多数每株超过10个分蘖)，没有发现或仅发现一些昆虫钻的洞，而且叶鞘未显示任何主要损伤，并且在大部分植株上未发现活的昆虫。大多数转基因稻植株显示出无虫洞，而对照植株的茎被完全钻洞。ELISA测定证实了这些植株具有显著而明显可检测水平的Cry1C和Cry1Ab蛋白质。在粉色螟虫侵袭后对最初的昆虫试验数据(对于选择的稻转化事件)的摘录示于下文所附的表1中，其显示了从每一转化事件的10个植株中所获数据的平均值。

用于黄色螟虫(三化螟)的最初温室试验也显示了转基因T1植株(每一事件检测2株植株，事件转化有表1第一列中提及的同一嵌合基因)对这种昆虫(每一植株应用10-15个幼虫)的良好抗性。对于该昆虫，在含嵌合cry基因的稻植株上未发现存活的幼虫(应用昆虫后约一个月)，而在未转化的对照植物中发现了几个处于晚期的幼虫和蛹(也是约一个月之后)。含有本发明嵌合cry基因(cry1C、cry1Ab或cry1C+cry1Ab)的稻植株未显示死心症状，或显示任何蛀洞，而对照植株严重受损(高水平的死心及许多蛀洞)。

使用温室中对黄色螟虫、粉色螟虫和纵卷叶螟的昆虫检测来完成对表达Cry1C蛋白质或表达Cry1C和Cry1Ab蛋白质的转化稻植株的进一步选择。对于这些检测，将每一预选的转化事件(以及阴性对照)的几个转基因植株系列种植于温室并在稻发育不同时期用黄色螟虫、粉色螟虫和纵卷叶螟的新生幼虫进行侵袭。

第一系列的植株在分蘖期用黄色螟虫、粉色螟虫或纵卷叶螟的新生幼虫进行侵袭。约三周之后解剖所有植株并对每一种检测的昆虫造成的昆虫损伤进行计数(对黄色螟虫和粉色螟虫计算死心及幼虫存活的百分比，并且对纵卷叶螟计算损伤分蘖、幼虫存活百分比及损伤等级(0-9))。

第二系列植株在抽穗期用黄色螟虫或粉色螟虫的新生幼虫进行侵袭。约三周之后解剖所有植株并对昆虫损伤(白头及幼虫存活的百分比)进行计数。

第三系列植株在开花后期用黄色螟虫或粉色螟虫的新生幼虫进行侵袭。约三周之后解剖所有植株并对昆虫损伤(白头及幼虫存活的百分比)进行打分。

选择显示最佳昆虫对照的油菜和稻植株用于进一步分析和再生。

还从本发明转化并选择的植株中获得后代植株和种子，并且本发明的基因显示在此类后代中按预期的孟德尔形式进行分离。在温室和田间多地点的转基因植株的选择导致植物株系的鉴定，所述植物株系具有cry1C(或cry1C和cry1Ab)嵌合基因的最佳稳定性及表达和最佳农艺学性状。在重复回交后，所选的具有最佳表现的转基因事件与不同商业种质的杂交导致不同遗传背景中本发明的cry1C基因或cry1C和cry1Ab基因的存在最适于不同地区或气候条件。

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所有引用文献此处作为参考引入说明书中。任何这些参考的引用均不解释为对这些参考中含有的每一说明的准确性的认可，也不解释为这些参考是相关现有技术，具有充分(能够)公开，或形成任何国家一般常识的部分。

Claims (28)

1.嵌合基因，其具有以下有效连接的序列： 

a)能够在植物细胞中指导表达的启动子区； 

b)编码杀虫Cry1C蛋白质的DNA，其是与SEQ ID No.1的DNA序列，或SEQ ID No.5的DNA序列有至少99％序列同一性的DNA序列，并且其中所述DNA编码的所述Cry1C蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID NO：2或6；和 

c)3’多聚腺苷酸化和转录终止区。 

2.权利要求1的嵌合基因，其中编码杀虫Cry1C蛋白质的所述DNA的DNA序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.5。 

3.权利要求1或2的嵌合基因，其中所述启动子区的序列是SEQ ID No.9、10、13或14的任何一个。 

4.权利要求1到3任何一项的嵌合基因，其中所述3’多聚腺苷酸化和转录终止区来自根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因。 

5.DNA，其具有权利要求1到4任何一项的嵌合基因，和第二个嵌合基因，所述第二个嵌合基因具有以下有效连接的序列： 

a)能够在植物细胞中指导表达的第二个启动子区； 

b)编码杀虫Cry1Ab蛋白质的第二个编码区，其是与SEQ ID No.11的DNA序列有至少99％序列同一性的DNA序列，其中所述第二个编码区编码的所述Cry1Ab蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.12；和 

c)3’多聚腺苷酸化和转录终止区。 

6.权利要求5的DNA，其包含作为第二个编码区的SEQ ID No.11的DNA序列，其连接SEQ ID No.3的转运肽编码序列的下游(3’)，使得产生编码融合蛋白质的融合编码区。 

7.权利要求5或6的DNA，其中所述Cry1Ab蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.12。 

8.权利要求5到7任何一项的DNA，其中所述第二个启动子区与所述cry1C嵌合基因启动区不同，并且其中所述第二个启动子区的序列是SEQ ID No.9、10、13或14的任何一个。 

9.转基因植物细胞，其包含权利要求1到4任何一项的嵌合基因或稳定整合到其基因组中的权利要求5到8任何一项的DNA，其中所述植物细胞不能再生为植物。 

10.植物或种子在控制鳞翅目稻虫害中的用途，所述植物或种子包含稳定整合到其基因组中的权利要求1到4任一项的嵌合基因或权利要求5到8任一项的DNA。 

11.权利要求9的植物细胞，其为稻植物细胞。 

12.稻植物在控制鳞翅目稻虫害中的用途，所述稻植物包含稳定整合到其基因组中的权利要求1到4任一项的嵌合基因或权利要求5到8任一项的DNA。 

13.权利要求10的用途，其中所述植物或种子选自如下植物或其种子：玉米、棉花、大豆、甘蔗、小麦、油菜、大豆、花椰菜、卷心菜、白菜、萝卜、芥菜、油菜、羽衣甘蓝、花茎甘蓝。 

14.来自权利要求12的稻植物的加工的谷物，其包含权利要求1到4任何一项的嵌合基因。 

15.权利要求14的加工的谷物，其为碾碎的、研磨的、脱壳的、速煮的、转化的、破碎的、蒸过的或煮熟的谷物，使得其不再含有可长成植物的存活胚。 

16.稻植物用于控制鳞翅目二化螟或稻纵卷叶螟的用途，其中所述植物具有稳定整合到其基因组中的权利要求1到4任何一项的嵌合基因，或权利要求5到8任何一项的DNA。 

17.权利要求16的用途，其中所述植物对二化螟、Marasmia patnalis、三化螟或稻纵卷叶螟具有抗性。 

18.控制鳞翅目植物虫害的方法，其包括：在田地中种植或播种包含 权利要求1到4任何一项的嵌合基因或权利要求5到8任何一项的DNA的植物。 

19.控制鳞翅目植物虫害的方法，其包括：在稻植物中表达权利要求1到4任何一项的嵌合基因或权利要求5到8任何一项的DNA。 

20.权利要求18或19的方法，其中所述鳞翅目植物虫害是二化螟或稻纵卷叶螟。 

21.用于获得对二化螟、Marasmia patnalis、稻纵卷叶螟或三化螟具有抗性的稻植物及其后代的方法，其包括用权利要求1到4任何一项的嵌合基因或权利要求5到8任何一项的DNA转化稻植物。 

22.产生对昆虫有抗性的植物或种子的方法，其包括步骤： 

a)获得转化有权利要求1到4任何一项的基因或权利要求5到8任何一项的DNA的植物，和 

b)使用特异性引物或探针选择所述植物的含有所述基因或DNA的后代，或其种子。 

23.微生物，其包含权利要求1到4任何一项的嵌合基因或权利要求5到8任何一项的DNA。 

24.权利要求23的微生物，其为埃希氏菌属、芽孢杆菌属或农杆菌属的微生物。 

25.权利要求1到4任何一项的嵌合基因或权利要求5到8任何一项的DNA用于控制虫害的用途。 

26.权利要求1到4任何一项的嵌合基因或权利要求5到8任何一项的DNA用于获得保护免于二化螟、Marasmia patnalis、稻纵卷叶螟或三化螟损害的稻植物的用途。 

27.控制鳞翅目稻虫害的方法，其包括：在稻植物中表达杀虫Cry1C蛋白质和杀虫Cry1Ab蛋白质，其中所述Cry1C蛋白质包含SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的氨基酸序列，并且其中所述Cry1Ab蛋白质包含SEQ ID No.12的氨基酸位置30到氨基酸位置617的氨基酸序 列。 

28.编码杀虫Cry1C蛋白质的DNA用于获得保护免受二化螟、Marasmia patnalis、稻纵卷叶螟或三化螟损害的稻植物的用途，所述杀虫Cry1C蛋白质包含SEQ ID No.2的氨基酸位置28到氨基酸位置627的氨基酸序列。