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CN101809038B - 双链聚乙二醇修饰的生长激素及其制备方法和应用 - Google Patents

双链聚乙二醇修饰的生长激素及其制备方法和应用 Download PDF

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CN101809038B CN200880009718XA CN200880009718A CN101809038B CN 101809038 B CN101809038 B CN 101809038B CN 200880009718X A CN200880009718X A CN 200880009718XA CN 200880009718 A CN200880009718 A CN 200880009718A CN 101809038 B CN101809038 B CN 101809038B
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Abstract

提供了双链聚乙二醇单修饰的生长激素及其制备方法。聚乙二醇化的生长激素具有比未修饰的生长激素更高的生物学活性和更长的半衰期等。含有聚乙二醇化生长激素的组合物可用于治疗生长或发育障碍如生长激素缺乏、Turner综合症等。

Description

双链聚乙二醇修饰的生长激素及其制备方法和应用
技术领域
本发明属生物制剂技术领域。具体涉及高生物活性的双链聚乙二醇修饰生长激素及其制备方法，以及获得的聚乙二醇化生长激素在制药领域中的应用。
背景技术
人生长激素(HuGH)是人脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，前体由217个氨基酸残基组成，其中前26个氨基酸残基组成信号肽，其它191个氨基酸残基组成成熟分子；具有2对分子内二硫键(Cys79和Cys191，Cys208和Cys215)，无糖基化，分子量22kD，序列如SEQ ID NO：1所示(NCBI：P01241，AAA72260；Denoto F M，et al.Human growth hormoneDNA sequence and mRNA structure：possible alternative splicing.NucleicAcids Res.，9：3719-3730，1981；Roskam W，et al.Molecular cloning andnucleotide sequence of the human growth hormone structural gene.NucleicAcids Res.，7：305-320，1979；Martial J A，et al.Human growth hormone：Complementary DNA cloning and expression in bacteria.Science，205：602-607，1979；Chen E Y，et al.The human growth hormone locus：nucleiotidesequence，biology and evolution.Genomics，4：479-497，1989)。其主要功能为促进细胞、器官和骨骼的生长，并与机体的合成代谢密切相关(IglesiasP，et al.Recombinant human growth hormone therapy in malnourisheddialysis patients：a randomized controlled study.Am.J.Kidney Dis.，32(3)：454-463，1998；Neely E K，Use and abuse of human growth hormone.Annu.Rev.Med.，45：407-410，1994)。利用重组DNA技术生产的重组人生长激素(rHuGH)经过二十多年的临床应用，已证明其在临床上的有效性和安全性。
大量的研究结果表明，rHuGH对治疗矮小症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、肾衰竭、AIDS、合成代谢障碍、内源性生长素缺乏性矮小症、Turner综合症和成人生长激素缺乏等有明显疗效，对抗衰老治疗也有明显效果；目前rHuGH是治疗矮小症的唯一有效药物。截止至2001年3月，美国FDA批准rHuGH进入临床研究的适应症有：严重烧伤的氮保留强化治疗、短肠综合症(独立用药或与谷氨酰胺联合用药)、AIDS相关之生长停滞等。目前rHuGH已被批准上市的适应症主要有：青少年内源性生长素缺乏性矮小症、Turner综合症相关之矮小症、青少年自发性或器官性生长素缺乏性矮小症、Prader-Willi综合症、早产性生长障碍、AIDS相关之分解代谢障碍、慢性肾衰竭相关之生长迟滞和成人生长素缺乏症等。
聚乙二醇(PEG)是一种惰性、无毒、可生物降解的有机多聚物，在生物技术和制药领域有重要用途。PEG修饰技术是通过共价结合将PEG连接到活性蛋白上。蛋白质药物经PEG化后，其性状有显著改善，具体包括药代半衰期延长、免疫原性降低、安全性提高、疗效增强、给药频度降低、药物可溶性和水溶性提高、蛋白酶酶解抗性增强、方便药物的控释等(Inada et al.J.Bioact.and Compatible Polymers，5，343，1990；Delgado，et al.Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，9，249，1992；Katre，Advanced Drug Delivery Systems，10，91，1993和Davis等的美国专利4179337)。美国专利4179337揭示，PEG与酶和胰岛素等蛋白质结合后，蛋白质的免疫原性降低的同时蛋白质的细胞学活性明显下降，但同时仍保留了原蛋白质一定比例的活性。这种效应在G-CSF(Satake-Ishikawa，et al.Cell Structure and Function，17，157-160，1992)、IL-2(Katre，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1487，1987)、TNF-α(Tsutsumi，etal.Jpn.J.Cancer Res.，85，9，1994)、IL-6(Inoue，et al.J.Lab.Clin.Med.，124，529，1994)和CD4-IgG(Chamow，et al.Bioconj.Chem.，5，133，1994)中均有发现。
美国专利5824784利用末端带醛基的PEG修饰剂，实现了固定位点(蛋白质N-端氨基酸)单修饰的PEG-G-CSF。用N-羟基琥珀酰亚胺活化法合成的PEG-NHS修饰剂能与G-CSF的赖氨酸的ε-氨基形成酰胺键。PEG-NHS的化学活性高，选择性较差，很难获得固定位点单修饰的修饰产物。单修饰产物与多修饰产物相比更均一，有利于分离纯化，易于大规模制备时的质量控制和保证批间稳定性。
目前已有多种PEG化治疗性蛋白质药物应用于临床。如PEG化腺苷脱氨酶(Adagen.RTM，Enzon Pharmaceuticals)；PEG化L-天冬酰胺酶(Oncapspar.RTM，Enzon Pharmaceuticals)；PEG化干扰素α2b(PEG-Intron.RTM，Schering-Plough)和PEG化干扰素α2a(Pegasys，Roche)；PEG化粒细胞集落刺激因子(Neulasta.RTM，Amgen)。药物中的PEG部分(或PEG)在体内的代谢过程已相当清楚，已证实其是一种良好的、安全的、无副作用的药物改性剂。
能与蛋白质药物结合的PEG通常需经过衍生，使PEG两端的一个或二个端基被化学活化后具有适当的官能团，该官能团对要结合的药物中的至少一个官能团具有活性，能与之形成稳定的共价键。例如，PEG可连接到蛋白质肽链中的Lys残基的ε-NH2上，或连接到蛋白质肽链N端氨基酸残基的α-NH2上。已经用于修饰蛋白质的聚乙二醇通常有三种形式：直链分子形式(EP 0593868；Yu-Sen Wang et al.Advanced DrugDelivery Reviews，54：547-570，2002；Yu-Sen Wang et al.Biochemistry，39，10634-10640，2000.)、U形分支的支链分子形式(EP 0809996)和Y形分支的支链分子形式(CN1243779C、EP1496076)。欧洲专利EP0809996描述了IFN-α的PEG化。
本领域普遍认为，经PEG修饰后，大多数蛋白质的性质会发生以下变化：1.免疫原性与抗原性降低；2.循环半衰期延长；3.溶解性增加；4.耐蛋白酶水解；5.生物利用度提高；6.毒性降低；7.热稳定性及机械稳定性增加；8.等电点、电泳行为、动力学性质等改变。另外，很重要的一点是蛋白质经PEG修饰后会引起细胞学活性的降低，主要原因为终产品中引进的基团、包括PEG以及PEG和修饰蛋白质之间的连接键所致，也与偶联的条件、产生的副产物等有关。Doris Brugger等(US Patent，Pub.No.：US 2004/0223950A1)描述了干扰素α2a的不同修饰位点的双链UPEG单位点修饰产物的体外抗病毒活性有明显区别，其中Lys31位点的UPEG单位点修饰产物的比活性最高，Lys121位点的UPEG单位点修饰产物的比活性最低，二者的比活性可相差5倍。
李伟华等(中国专利公开号：CN 1477126A)描述了制备PEG修饰生长激素的方法。该方法优选pH 6.5-7.0进行生长激素的分叉型PEG(mPEGn-NHS)修饰反应，纯化的生长激素分叉型PEG单位点修饰物采用去脑垂体大鼠法测定生物活性。结果表明，等量的聚乙二醇生长激素偶联物(PEG为双链PEG-NHS、分子量为40kD)与每天注射的生长激素的增重效果相当。
发明简述
本发明提供了一种制备双链聚乙二醇化生长激素的方法，包括如下步骤：
a)在pH不低于6.0、优选不低于7.0、优选不低于8.0、优选不低于9.0、优选不低于9.5、优选不低于10.0、最优选为10.5的溶液中将U型或Y型分支的双链聚乙二醇和生长激素优选人生长激素接触，优选所述生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为大约1∶2；
b)在适当浓度的SDS-PAGE、优选12％SDS-PAGE中检测a)步骤所得的聚乙二醇单位点修饰产物，其中所述产物为两条带或以表观分子量小的条带为主；
c)分离、回收所述两条带中表观分子量小的聚乙二醇单位点修饰产物；
任选地还包括纯化步骤，优选使用凝胶层析方法如Q Sepharose FF层析、DEAE Sepharose FF层析或MacroCap SP层析纯化。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种制备双链聚乙二醇化生长激素的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(I)的Y型聚乙二醇，
Figure GPCT142671363150141000D000041
其中：Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种制备双链聚乙二醇化生长激素的方法，其中所述Y型聚乙二醇具有如下结构式(II)：
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种制备双链聚乙二醇化生长激素的方法，其中所述Y型聚乙二醇具有如下结构式(III)：
Figure GPCT142671363150141000D000052
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500，最优选910；聚乙二醇的总平均分子量为约26kD至60kD，优选为40kD；j为1-12的整数。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种制备双链聚乙二醇化生长激素的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(IV)的U型聚乙二醇，
其中，R和R’为独立无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基；n和n’表征聚合度，为任何整数；n+n’介于600-1500之间，最优选910；所述U型聚乙二醇平均分子量为约26kD至66kD，最优选为约40kD。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种制备双链聚乙二醇化生长激素的方法，包括如下步骤：
a)在pH9.0或10.5的溶液中将下式(III)所示的聚乙二醇和人生长激素接触，其中所述人生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为大约1∶2；
Figure GPCT142671363150141000D000062
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m+m’为910；j为1-12的整数；聚乙二醇的总平均分子量为约40kD；
b)在12％SDS-PAGE中检测a)步骤所得的聚乙二醇单位点修饰产物，其中所述产物为两条带；
c)使用凝胶层析方法纯化分离、回收所述表观分子量小的聚乙二醇单位点修饰产物；所述凝胶层析方法选自Q Sepharose FF层析、DEAESepharose FF层析或MacroCap SP层析。
本发明还提供了用上述方法制备的聚乙二醇化生长激素，其中所述生长激素为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的重组生长激素，优选具有SEQ ID NO：1所示序列。
在一个优选实施方案中，本发明提供了用上述方法制备的聚乙二醇化生长激素，其中所述聚乙二醇化生长激素分子量为62kD，如下式(VII)所示：
Figure GPCT142671363150141000D000071
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m+m’为910；j为1-12的整数。
本发明还提供了一种制备聚乙二醇化生长激素制备物的方法，包括如下步骤：
a)在pH不低于8.0优选不低于9.0、优选不低于9.5、优选不低于10.0、最优选为10.5的溶液中将U型或Y型分支的双链聚乙二醇和生长激素优选人生长激素接触，优选所述生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为大约1∶2；
b)在适当浓度的SDS-PAGE、优选12％SDS-PAGE中检测a)步骤所得的聚乙二醇单位点修饰产物，其中所述产物为两条带；
c)分离、回收所述聚乙二醇单位点修饰产物；
所述回收的产物是以表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物为主的混合物，其中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于70％、优选不低于80％、最优选不低于90％，
任选地还包括纯化步骤，优选使用凝胶层析方法如Q Sepharose FF层析、DEAE Sepharose FF层析或MacroCap SP层析纯化。
在一个优选实施方案中，本发明还提供了一种制备聚乙二醇化生长激素制备物的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(I)的Y型聚乙二醇，
Figure GPCT142671363150141000D000072
其中：Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
在一个优选实施方案中，本发明还提供了一种制备聚乙二醇化生长激素制备物的方法，其中所述Y型聚乙二醇具有如下结构式(II)：
Figure GPCT142671363150141000D000081
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500，最优选910；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
在一个优选实施方案中，本发明还提供了一种制备聚乙二醇化生长激素制备物的方法，其中所述Y型聚乙二醇具有如下结构式(III)：
Figure GPCT142671363150141000D000082
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500，最优选910；j为1-12的整数；优选聚乙二醇的总平均分子量为约26kD至60kD，优选为40kD。
在一个优选实施方案中，本发明还提供了一种制备聚乙二醇化生长激素制备物的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(IV)的U型聚乙二醇，
其中R和R’为独立无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基；n和n’表征聚合度，为任何整数；n+n’介于600-1500之间，最优选910；所述U型聚乙二醇平均分子量为约26kD至66kD，最优选为约40kD。
在一个优选实施方案中，本发明还提供了一种制备聚乙二醇化生长激素制备物的方法，其包括如下步骤：
a)在pH 9.0或10.5的溶液中将下式(III)所示的聚乙二醇和人生长激素接触，其中所述人生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为大约1∶2；
Figure GPCT142671363150141000D000092
其中R和R’为独立无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基；m+m’为910，j为1-12的整数；聚乙二醇的总平均分子量为约40kD；
b)在12％SDS-PAGE中检测a)步骤中所得的聚乙二醇单位点修饰产物；
c)使用凝胶层析方法分离、回收所述聚乙二醇单位点修饰产物，所述凝胶层析方法选自Q Sepharose FF层析、DEAE Sepharose FF层析或MacroCap SP层析，所述回收的产物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于70％、优选不低于80％、最优选不低于90％。
本发明还提供了用上述方法制备的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述生长激素为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的重组生长激素，优选具有SEQ ID NO：1所示序列。优选地，所述聚乙二醇化生长激素制备物中聚乙二醇单位点修饰产物如下式(VII)所示：
Figure GPCT142671363150141000D000101
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m+m’为910；j为1-12的整数，所述聚乙二醇化生长激素制备物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于70％、优选不低于80％、最优选不低于90％。
在本发明的一个优选实施方案中，所述重组人生长激素是人工合成的或由选自如下一组的表达系统表达：原核系统如大肠杆菌；真核酵母系统如毕赤酵母；昆虫细胞系统；和哺乳动物细胞系统如CHO细胞。
本发明还提供了一种组合物，其包含药物学有效剂量的上述聚乙二醇化生长激素或聚乙二醇化生长激素制备物和药物学可接受的载体或赋形剂，优选包含甘露醇、氨基酸、氯化钠、醋酸和醋酸钠，其中氨基酸优选天冬氨酸、天冬酰氨、赖氨酸和甘氨酸。
本发明还提供了上述聚乙二醇化生长激素或聚乙二醇化生长激素制备物或组合物在制备用于治疗需要用生长激素治疗的疾病和抗衰老治疗的药物中的应用，所述需要用生长激素治疗的疾病优选选自矮小症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、肾衰竭、AIDS、内源性生长素缺乏性矮小症、Turner综合症、合成代谢障碍和成人生长激素缺乏。
本发明还提供了一种治疗患有需要用生长激素治疗的疾病的患者和抗衰老治疗的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的上述聚乙二醇化生长激素或聚乙二醇化生长激素制备物或组合物，其中所述需要用生长激素治疗的疾病优选选自矮小症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、肾衰竭、AIDS、内源性生长素缺乏性矮小症、Turner综合症、合成代谢障碍和成人生长激素缺乏。
发明详述
本发明提供了高生物活性的双链PEG修饰生长激素及其制备方法。本发明的显著特点是在优化反应条件和分离方法后，可显著减少生长激素的PEG单位点修饰物中低细胞学活性成分的含量。在双链PEG分子量为40kD的一个实施例中，低细胞学活性单位点修饰物的特征是在12％SDS-PAGE分离胶上可与高细胞学活性的单位点修饰物完全分离成2个条带，且低细胞学活性单位点修饰物的表观分子量大于高细胞学活性单位点修饰物。以去脑垂体大鼠为动物模型，以重组人生长激素为阳性对照，按《中国药典》2005版二部附录XII P生长激素生物测定法测定最终制备的高细胞学活性单位点修饰物的体内生物活性。高细胞学活性单位点修饰物的生物比活性显著高于普通生长激素，其表现为普通生长激素的1.5倍以上；食蟹猴药代动力学研究表明，其平均血清药代半衰期比普通生长激素延长了20倍以上，具有长效的作用。
在本发明的一个实施方案中，在pH8.0的条件下进行生长激素的双链PEG-NHS修饰反应，采用SDS-PAGE电泳检测反应产物，银染显色。令人惊奇的是，生长激素的PEG单位点修饰产物为2条主带，不同于此前的报道(Ross Clark，Kenneth Olson，et al.Long-acting growth hormonesproduced by conjugation with polyethylene glycol.J.Biol.Chem.，271：21969-21977，1996.李伟华、董建等，长效生长激素及药物组合物，中国专利公开号：CN1477126A)。在进一步的实验中，考察了pH6.0-10.5范围内生长激素的双链PEG-NHS修饰情况，SDS-PAGE检测时均发现单位点修饰产物为2条主带，并且随反应pH升高，表观分子量小的条带含量相应升高，至pH≥10.0，单位点修饰产物基本以表观分子量小的条带为主。
在本发明一个优选的实施方案中，采用适宜的凝胶层析纯化工艺分别制备pH10.5和pH6.0条件下的重组人生长激素的PEG单位点修饰物纯品。采用分离胶浓度为12％的SDS-PAGE检测，银染显色。pH6.0条件下的重组人生长激素的PEG单位点修饰物纯品为明显的双带；pH10.5条件下的重组人生长激素的PEG单位点修饰物纯品以表观分子量小的条带为主，其SDS-PAGE含量不低于80％；均只检出微量底物蛋白(不超过0.5％)。MALDI-TOF MS检测确证该2种pH条件下的修饰产物均为生长激素的PEG单位点修饰物；细胞学活性检测表明，pH10.5条件下的单位点修饰物的细胞学活性显著高于pH6.0条件下的单位点修饰物，前者的细胞学比活性约为后者的2倍。
在本发明一个优选的实施方案中，经Q Sepharose FF层析纯化和MacroCap SP层析纯化等步骤制备pH6.0条件下重组人生长激素的PEG修饰产物中表观分子量大的单位点修饰产物纯品。MALDI-TOF MS检测确证该重组人生长激素PEG修饰物为PEG单位点修饰物；细胞学活性检测表明，其细胞学比活性显著低于pH10.5条件下的重组人生长激素PEG单位点修饰物(表观分子量小)纯品，后者的细胞学比活性可达前者的3倍左右。
在本发明进一步的实施方案中，按《中国药典》2005年版附录XII P生长激素生物测定法，以重组人生长激素为阳性对照，采用去脑垂体大鼠法检测pH10.5条件下重组人生长激素的PEG-NHS 40kD单位点修饰物的体内生物学活性。重组人生长激素每天给药一次，连续给药6次；重组人生长激素PEG单位点修饰物按与重组人生长激素6次给药剂量总和一致的剂量一次性给药。该重组人生长激素PEG单位点修饰物的生物学活性显著高于重组人生长激素，可达后者生物学比活性的1.5倍以上，其药理学具有长效的特点。食蟹猴药代动力学研究表明，该重组人生长激素PEG单位点修饰物的药代半衰期较普通重组人生长激素延长了20倍以上。
本发明采用分支型(U型分支和Y型分支)PEG衍生物修饰生长激素。本发明所采用的Y型分支PEG衍生物是一种新型的分支型PEG衍生物，其结构不同于直链PEG和U型分支PEG，其与U型分支PEG的主要区别在于：本发明采用的Y型PEG衍生物的2条PEG分支链通过N原子连接在一起，而U型PEG衍生物的2条PEG分支链通过C原子连接在一起。本发明所述Y型和U型PEG修饰主要发生在蛋白质或肽的N末端游离的α-氨基和Lys侧链的ε-氨基上。Y型PEG衍生物分子组成示于下式(I)：
Figure GPCT142671363150141000D000131
其中：Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
在本发明一个优选的实施方案中，所述Y形PEG衍生物结构式中Pa和Pb可为相同或不同的聚乙二醇，如下式(II)所示：
Figure GPCT142671363150141000D000132
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500，最优选910；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基、或杂烷基；j为1-12的整数。F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或巯基反应形成共价键。优选地，其中聚乙二醇的总平均分子量为约26kD-60kD，最优选为约40kD。
在一个实施方案中，本发明提供了一种聚乙二醇化生长激素，其具有如下式(VI)结构：
Figure GPCT142671363150141000D000141
其中：R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基、或杂烷基；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或巯基反应形成共价键。在本发明一个优选的实施方案中，一种Y型PEG衍生物分子(YPEG-NHS)结构式如下式(III)所示：
Figure GPCT142671363150141000D000142
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500，最优选为910。
在本发明另一个优选的实施方案中，一种U型PEG衍生物分子(UPEG-NHS)结构式如下式(IV)所示：
式中，R和R’为独立无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基；n和n’表征聚合度，为任何整数；n+n’介于600-1500之间，最优选910；PEG平均分子量为约26kD-66kD，最优选为约40kD。
在本发明的一个实施方案中，为了获得YPEG或UPEG修饰的GH，首先将YPEG和UPEG经活化的衍生物如聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(PEG-NHS)，通过亲核取代反应，将PEG部分共价结合在蛋白质的氨基(-NH2)上，包括蛋白质N端的α-氨基和赖氨酸残基的ε-氨基。GH与YPEG-NHS反应生成YPEG-GH的反应方程式如下：
Figure GPCT142671363150141000D000151
GH与UPEG-NHS反应生成UPEG-GH的反应方程式如下：
优选地，聚乙二醇的总平均分子量为约26kD-60kD，最优选为40kD。
在进一步优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇化生长激素具有如下式(VII)结构：
                     
Figure GPCT142671363150141000D000153
其中R和R’为无关的低分子量烷基，优选C1-C4烷基，最优选甲基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500。该结构中，Y分支PEG通过单位点结合到生长激素分子上。m和m’可为相同或不同整数。上式中的YPEG-GH的分子量主要取决于聚合度m和m’。m+m’优选600到1500，对应YPEG的平均分子量为约26kD到约66kD；其中m+m’优选795到1030，对应YPEG平均分子量为约35kD到45kD；m+m’特别优选885到1030，对应YPEG平均分子量为约39kD到45kD；m+m’最优选910，对应YPEG平均分子量为约40kD。m和m’的比值范围可以为0.5到1.5，优选0.8到1.2。
任选地，本发明的生长激素可以为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的生长激素。优选地，所述生长激素为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的具有SEQ ID NO：1所示序列的人生长激素。更优选地，所述人生长激素是重组人生长激素。生长激素可以是人工合成的，也可以是原核系统如大肠杆菌(E.Coli)表达的，也可以是真核酵母系统如毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的，也可以是其它昆虫细胞系统或哺乳动物细胞系统如CHO表达的。制备天然或重组生长激素的方法以及生长激素和其PEG修饰产物的活性检测方法为本领域现有技术。
本发明所述YPEG-GH和UPEG-GH与GH的临床用途相同，均适用于治疗矮小症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、肾衰竭、AIDS、合成代谢障碍、成人生长激素缺乏等和抗衰老治疗。本发明的YPEG-GH和UPEG-GH可以以组合物的形式给予患者，所述组合物中包含药物学有效剂量的YPEG-GH或UPEG-GH和药物学可接受的载体或赋形剂。因此，本发明另一方面提供了一种组合物，其包含药物学有效剂量的本发明的聚乙二醇化生长激素和药物学可接受的载体或赋形剂。本发明使用的药物学上可接受的载体包括对于以所用剂量和浓度与其接触的细胞或哺乳动物无毒的药用上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂。通常生理学上可接受的载体是含水的pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的例子包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸在内的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(不超过10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性多聚体；诸如甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖包括葡萄糖和甘露糖、二糖或糊精等其他糖类；诸如EDTA等螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇等糖醇；诸如钠等成盐反离子；和/或诸如TWEEN、聚乙二醇、和PLURONICS等非离子表面活性剂。赋形剂优选无菌且一般不含不良物质。这些组合物可通过常规的灭菌技术进行灭菌。在本发明的一个实施方案中，所述组合物其进一步包含甘露醇、氨基酸、氯化钠、醋酸和醋酸钠，其中氨基酸优选赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨和甘氨酸。
在另一方面，本发明还提供了本发明的聚乙二醇化生长激素或包含发明的聚乙二醇化生长激素的组合物在制备用于治疗需要用生长激素治疗的疾病和抗衰老治疗的药物中的应用。优选地，所述需要用生长激素治疗的疾病选自矮小症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、肾衰竭、AIDS、内源性生长素缺乏性矮小症、Turner综合症、合成代谢障碍和成人生长激素缺乏等。
附图说明
图1：pH8.0条件下rHuGH的YPEG-NHS 40kD或UPEG-NHS 40kD修饰反应样非还原型SDS-PAGE电泳结果，分离胶浓度12％，银染显色。泳道1：marker，LMW，GE Healthcare；泳道2：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH8.0，上样量2μg；泳道3：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH8.0，上样量5μg；泳道4：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH8.0，上样量5μg。
图2：不同pH条件下rHuGH的YPEG-NHS 40kD修饰反应样非还原型SDS-PAGE电泳结果，分离胶浓度12％，银染显色。泳道1：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH6.0；泳道2：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH7.0；泳道3：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH8.0；泳道4：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH9.0；泳道5：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH9.5；泳道6：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH10.0；泳道7：rHuGH的YPEG-NHS修饰反应样，反应pH10.5；泳道8：marker，LMW，GE Healthcare。各样品上样量均为5μg。
图3：不同pH条件下rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样非还原型SDS-PAGE电泳结果，分离胶浓度12％，银染显色。泳道1：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH6.0；泳道2：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH7.0；泳道3：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH8.0；泳道4：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH9.0；泳道5：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH9.5；泳道6：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH10.0；泳道7：rHuGH的UPEG-NHS修饰反应样，反应pH10.5；泳道8：marker，LMW，GE Healthcare。各样品上样量均为5μg。
图4：pH6.0和pH10.5条件下rHuGH的YPEG-NHS 40kD或UPEG-NHS 40kD单位点修饰物纯品非还原型SDS-PAGE电泳结果，分离胶浓度12％，银染显色。泳道1：UPEG-rHuGH U10.5，上样量10μg；泳道2：UPEG-rHuGH U10.5，上样量2μg；泳道3：UPEG-rHuGH U6.0，上样量10μg；泳道4：UPEG-rHuGH U6.0，上样量2μg；泳道5：marker，LMW，GE Healthcar；泳道6：YPEG-rHuGH Y10.5，上样量10μg；泳道7：YPEG-rHuGH Y10.5，上样量2μg；泳道8：YPEG-rHuGH Y6.0，上样量10μg；泳道9：YPEG-rHuGH Y6.0，上样量2μg；泳道10：rHuGH，上样量100ng；泳道11：rHuGH，上样量50ng。
图5：pH6.0和pH10.5条件下rHuGH的UPEG-NHS 40kD单位点修饰物纯品细胞学活性检测结果，2块平行板。
图6：pH6.0、pH10.5条件下rHuGH的YPEG-NHS 40kD单位点修饰物纯品细胞学活性检测结果，2块平行板。
图7：pH6.0、pH9.0、pH 10.5条件下rHuGH的YPEG-NHS 40kD单位点修饰物纯品和UPEG-NHS 40kD单位点修饰物纯品MALDI-TOF MS分子量检测结果。a：YPEG-rHuGH，Y6；b：YPEG-rHuGH，Y9；c：YPEG-rHuGH，Y10.5；d：YPEG-rHuGH，Y6-1；e：UPEG-rHuGH，U6；f：UPEG-rHuGH，U9；g：UPEG-rHuGH，U10.5；h：UPEG-rHuGH，U6-1；i：YPEG-NHS，40kD；j：UPEG-NHS，40kD；k：Protein CalibrateStandard II，BRUKER；l：rHuGH；m：Protein Calibrate Standard I，BRUKER。
图8：pH6.0条件下rHuGH的PEG-NHS 40kD修饰产物之表观分子量大的PEG单位点修饰物纯品与pH10.5条件下rHuGH的PEG-NHS 40kD单位点修饰物纯品非还原型SDS-PAGE检测结果，分离胶浓度12％，银染显色。泳道1：YPEG-rHuGH Y10.5，上样量2μg；泳道2：YPEG-rHuGHY6.0-1，上样量2μg；泳道3：UPEG-rHuGH U10.5，上样量2μg；泳道4：UPEG-rHuGH U6.0-1，上样量2μg；泳道5：rHuGH，上样量50ng；泳道6：rHuGH，上样量100ng；泳道7：marker，LMW，GE Healthcare；泳道8：YPEG-rHuGH Y10.5，上样量10μg；泳道9：YPEG-rHuGH Y6.0-1，上样量10μg；泳道10：UPEG-rHuGH U10.5，上样量10μg；泳道11：UPEG-rHuGH U6.0-1，上样量10μg。
图9：pH6.0条件下rHuGH的PEG-NHS 40kD修饰产物之表观分子量大的PEG单位点修饰物纯品(Y6-1、U6-1)和pH10.5条件下rHuGH的PEG-NHS 40kD单位点修饰物纯品(Y10.5、U10.5)还原型SDS-PAGE表观分子量检测结果。泳道1：YPEG-rHuGH Y6-1+YPEG-rHuGH Y10.5，各25ng；泳道2：YPEG-rHuGH Y6-1，50ng；泳道3：YPEG-rHuGH Y10.5，50ng；泳道4、6：空白；泳道5：marker，HMW，GE Healthcare；泳道7：UPEG-rHuGH U6-1+UPEG-rHuGH U10.5，各25ng；泳道8：UPEG-rHuGH U6-1，50ng；泳道9：UPEG-rHuGH U10.5，50ng。
图10：食蟹猴单次皮下注射分别给予300μg·kg-1 rHuGH和YPEG-rHuGH(Y10.5)的平均血清药物浓度-时间曲线比较。
具体实施方式
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。
实施例1
重组人生长激素的U型和Y型分支PEG修饰
分别取200mg UPEG-NHS和YPEG-NHS(平均分子量40kD，等臂；批号分别为ZZ004P182、ZZ004P167)(北京键凯科技有限公司)各1份，分别溶解于2ml 2mM HCl(广东光华化学厂有限公司)；分别加入50mg的rHuGH(厦门特宝生物工程股份有限公司)和50mM硼酸/硼砂缓冲液(pH8.0)(中国医药集团上海化学试剂公司)使反应总体积为10ml。该反应体系中，rHuGH反应终浓度为5mg/ml，rHuGH与PEG-NHS反应摩尔比约为1∶2。振荡条件下＜10℃温浴2h，加入冰乙酸(汕头市西陇化工厂)使pH＜4.0终止反应。取样进行SDS-PAGE电泳，银染显色。SDS-PAGE电泳结果示于图1。由图1电泳结果可见，pH8.0条件下的修饰产物主带为双带，UPEG-NHS和YPEG-NHS修饰反应样的SDS-PAGE电泳行为一致。
实施例2
不同pH条件下重组人生长激素的U型和Y型分支PEG修饰
分别取200mg UPEG-NHS和YPEG-NHS(平均分子量40kD，等臂；批号分别为ZZ004P182、ZZ004P167)(北京键凯科技有限公司)各1份，分别溶解于2ml 2mM HCl(广东光华化学厂有限公司)；分别加入50mg的rHuGH(厦门特宝生物工程股份有限公司)和相应的缓冲液，使反应总体积为10ml。反应pH 6.0、7.0和8.0采用相应pH值的10mM PBNa缓冲液(中国医药集团上海化学试剂公司)，反应pH 9.0、9.5、10.0和10.5采用相应pH值的50mM硼砂缓冲液(中国医药集团上海化学试剂公司)。该反应体系中，rHuGH反应终浓度为5mg/ml，rHuGH与PEG-NHS反应摩尔比约为1∶2。振荡条件下＜10℃温浴2h，加入冰乙酸(汕头市西陇化工厂)使pH＜4.0终止反应。取样进行SDS-PAGE电泳，银染显色；采用凝胶成像系统(型号：FR-200，上海复日科技有限公司)分析电泳结果。SDS-PAGE电泳结果示于图2、图3，凝胶成像系统分析结果见表1。由电泳结果可见，pH6.0-9.5条件下的修饰产物主带均为明显的双带，并且随着反应pH的升高，表观分子量小的主带含量相应增加；pH10.0和10.5条件下的修饰产物基本以表观分子量小的条带为主。UPEG-NHS和YPEG-NHS修饰反应样的SDS-PAGE电泳行为一致。
表1.不同pH条件下重组人生长激素的U型和Y型分支PEG修饰物SDS-PAGE结果凝胶成像系统分析结果
Figure GPCT142671363150141000D000201
注：含量指rHuGH的PEG单位点修饰产物之条带1(表观分子量大)和条带2(表观分子量小)之间的相对百分含量。
实施例3
pH6.0、pH9.0和10.5条件下重组人生长激素的U型和Y型分支PEG单位点修饰产物的制备及细胞学活性和分子量检测
1、修饰反应
分别取1200mg UPEG-NHS和YPEG-NHS(平均分子量40kD，等臂；批号分别为ZZ004P182、ZZ004P167)(北京键凯科技有限公司)各3份，分别溶解于12ml 2mM HCl(广东光华化学厂有限公司)；分别加入300mg的rHuGH(厦门特宝生物工程股份有限公司)和50mM硼砂缓冲液(pH10.5)或50mM硼砂/硼酸缓冲液(pH9.0)或10mM PBNa(pH6.0)(中国医药集团上海化学试剂公司)使反应总体积为60ml。该反应体系中，rHuGH反应终浓度为5mg/ml，rHuGH与PEG-NHS反应摩尔比约为1∶2，反应pH分别为10.5、9.0和6.0，振荡条件下＜10℃温浴2h，加入冰乙酸(汕头市西陇化工厂)使pH＜4.0终止反应。取样进行SDS-PAGE电泳，银染显色。
2、纯化制备
2.1Q Sepharose FF层析纯化
rHuGH的PEG修饰反应样用超纯水稀释3倍，分别将稀释样的pH值用NaOH或HCl调至9.0。
2.1.1rHuGH PEG修饰反应样(pH6.0)Q Sepharose FF层析纯化
层析柱体(上海锦华层析设备厂)规格为Φ18mm×400mm，QSepharose FF填料(GE Healthcare)装填规格为Φ18mm×240mm，柱床体积(CV)为61ml。Q Sepharose FF层析柱用0.5M NaOH 5ml/min×30min在位清洗，ddH2O 5ml/min洗脱3CV，1M NaCl 5ml/min洗脱3CV再生，20mM硼砂/硼酸-17mM NaCl(pH 9.0，A液)5ml/min洗脱5CV。rHuGH的PEG修饰反应超纯水稀释样按3ml/min流速上样，洗脱液检测波长280nm(AKTA Basic100，GE Healthcare)。A液5ml/min洗脱至第1个峰完全洗出；换20mM硼砂/硼酸-100mM NaCl(pH 9.0，B液)，5ml/min洗脱至第2个峰完全洗出；换20mM硼砂/硼酸-200mM NaCl(pH 9.0，C液)，5ml/min洗脱至第3个峰完全洗出。收集第2个峰样品即为目的样。用5K超滤器(Millipore，聚醚砜材质)将目的样的缓冲体系超滤替换成20mM硼砂/硼酸(pH 9.0)。
2.1.2rHuGH PEG修饰反应样(pH9.0和10.5)Q Sepharose FF层析纯化
层析柱体(上海锦华层析设备厂)规格为Φ18mm×400mm，QSepharose FF填料(GE Healthcare)装填规格为Φ18mm×240mm，柱床体积(CV)为61ml。Q Sepharose FF层析柱用0.5M NaOH 5ml/min×30min在位清洗，ddH2O 5ml/min洗脱3CV，1M NaCl 5ml/min洗脱3CV再生，20mM硼砂/硼酸-17mM NaCl(pH 9.0，A液)5ml/min洗脱5CV。rHuGH的PEG修饰反应超纯水稀释样按3ml/min流速上样，洗脱液检测波长280nm(AKTA Basic100，GE Healthcare)。A液5ml/min洗脱至第1个峰完全洗出；换20mM硼砂/硼酸-40mM NaCl(pH 9.0，B液)，5ml/min洗脱至第2个峰完全洗出；换20mM硼砂/硼酸-100mM NaCl(pH 9.0，C液)，5ml/min洗脱至第3个峰完全洗出；换20mM硼砂/硼酸-200mM NaCl(pH 9.0，D液)，5ml/min洗脱至第4个峰完全洗出。收集第3个峰样品即为目的样。用5K超滤器(Millipore，聚醚砜材质)将目的样的缓冲体系超滤替换成20mM硼砂/硼酸(pH 9.0)。
2.2DEAE Sepharose FF层析纯化
层析柱体(上海锦华层析设备厂)规格为Φ18mm×400mm，DEAESepharose FF填料(GE Healthcare)装填规格为Φ18mm×235mm，1CV＝60ml。
DEAE Sepharose FF层析柱用0.5M NaOH 5ml/min×30min在位清洗，ddH2O 5ml/min洗脱3CV，1M NaCl 5ml/min洗脱3CV再生，20mM硼砂/硼酸(pH 9.0，A液)5ml/min洗脱3CV。PEG-rHuGH的Q Sepharose FF纯化超滤替换样按3ml/min流速上样，A液5ml/min洗脱3CV，20mM硼砂/硼酸-30mM NaCl(pH 9.0，B液)5ml/min洗脱6CV；换20mM硼砂/硼酸-100mM NaCl(pH 9.0，C液)，5ml/min洗脱至第1、2峰完全洗出。洗脱液检测波长280nm(AKTA Basic100，GE Healthcare)。收集第2峰样品即为目的样。用5K超滤器(Millipore，聚醚砜材质)将目的蛋白样的缓冲体系超滤替换成5mM PBNa(pH 8.5)并适当浓缩。
2.3Q Sepharose FF层析精细纯化
层析柱体(上海锦华层析设备厂)规格为Φ25mm×400mm，QSepharose FF填料(GE Healthcare)装填规格为Φ25mm×200mm，1CV＝98ml。
Q Sepharose FF层析柱用0.5M NaOH 10ml/min×30min在位清洗，ddH2O 10ml/min洗脱3CV，1M NaCl 10ml/min洗脱3CV再生，5mM PBNa(pH 8.5，A液)10ml/min洗脱3CV。PEG-rHuGH的DEAE Sepharose FF纯化超滤替换样按6ml/min流速上样，A液10ml/min洗脱3CV；换5mMPBNa-90mM NaCl(pH 8.5，B液)，10ml/min洗脱至第1个峰完全洗出；换5mM PBNa-300mM NaCl(pH 8.5，C液)，10ml/min洗脱至第2个峰完全洗出。洗脱液检测波长280nm(AKTA Basic100，GE Healthcare)。收集第1个峰样品即为目的样。用5K超滤器(Millipore，聚醚砜材质)将目的样的缓冲体系超滤替换成3mM NaAc/HAc-7mM NaCl-5mM Lys(pH 5.0)，补加甘露醇至终浓度45mg/ml，0.2μm过滤除菌；取样SDS-PAGE电泳，银染显色；余样-70℃冻存。pH6.0修饰反应产物命名为Y6或U6，其中表观分子量大的条带命名为Y6-1或U6-1，表观分子量小的条带命名为Y6-2或U6-2；pH9.0修饰反应产物命名为Y9或U9；pH10.5修饰反应产物命名为Y10.5或U10.5。
SDS-PAGE电泳结果示于图4。由电泳结果可见，pH6.0修饰反应产物为明显的双带；pH10.5修饰反应产物以表观分子量小的条带为主，其SDS-PAGE含量不低于80％。
3、细胞学活性检测
以GH国家标准品为对照，采用HuGH依赖型大鼠淋巴瘤细胞株Nb2-11检测PEG-rHuGH各样品的细胞学活性。
Nb2-11细胞稀释至终浓度5×104cell/ml。GH国家标准品(批号：35-20002，1mg/ml/支，3IU/支；购自中国药品生物制品检定所)预稀释至100ng/ml(0.0003IU/ml)，PEG-rHuGH各待检品根据预实验结果预稀释至0.0003IU/ml；在预稀释的基础上，各样品再按倍半梯度稀释后再行检测。样品活性计算公式如下：
Figure GPCT142671363150141000D000231
其中：C1为待检样品相当于标准品半效量的稀释倍数
C2为标准品半效稀释倍数
D1为待检样品预稀释倍数
D2为标准品预稀释倍数
检测方法：
(1)取对数生长期细胞，反复吹打、离心清洗；用稀释液重悬细胞，调整细胞浓度至5×104cell/ml。
(2)各待检品预稀释样分别在细胞板(96孔板，Corning)上做两倍梯度稀释，共做10个梯度，每个梯度做复孔，50μl/孔。阳性对照同法做8个梯度。以稀释液为阴性对照。
(3)按100μl/孔加入细胞，置二氧化碳培养箱37℃培养约70小时；按30μl/孔加入AlamarBlueTM溶液(BioSource)，震荡混匀1分钟；置二氧化碳培养箱37℃孵育5小时。室温振荡5分钟，读板(激发光波长530nm，发射波长590nm)。
(4)采用四参数回归法制作标准品曲线和待测样品曲线。根据标准品曲线和待测样品曲线方程计算出各供检品的效价。
细胞学活性检测结果见表2和图5、图6，每种样品同步检测2个平行样。rHuGH的YPEG-NHS pH6.0修饰产物(Y6)的细胞学比活性为1.08×10-1IU/mg，pH9.0修饰产物(Y9)的细胞学比活性为1.66×10-1IU/mg；pH10.5修饰产物(Y10.5)的细胞学比活性为2.09×10-1IU/mg；Y10.5的细胞学比活性约为Y6的2倍。rHuGH的UPEG-NHS pH6.0修饰产物(U6)的细胞学比活性为8.85×10-2IU/mg，pH9.0修饰产物(U9)的细胞学比活性为1.42×10-1IU/mg；pH10.5修饰产物(U10.5)的细胞学比活性为1.82×10-1IU/mg；U10.5的细胞学比活性约为U6的2倍。随着修饰反应pH值的提高，PEG单位点修饰产物(2条主带)的细胞学活性相应提高。
表2.YPEG-rHuGH和UPEG-rHuGH各样品细胞学活性检测结果*
Figure GPCT142671363150141000D000241
注：*以GH国家标准品为标准。标准品批号：35-20002，1mg/ml/支，3IU/支，购自中国药品生物制品检定所。
4、MALDI-TOF MS分子量检测
采用德国BRUKER公司Autoflex III TOF/TOF质谱仪，MALDI-TOFMS法测定PEG-rHuGH各样品的分子量。基质采用芥子酸(SA，C11H12O5，MW 224.22；批号2006236870002，BRUKER)，蛋白分子量标准品采用BRUKER公司之Protein Calibration Standard I(Part No.206355)和ProteinCalibration Standard II(Part No.207234)，分析软件为flexAnalysisVer.3.0.54.0.。结果示于图7。
rHuGH的YPEG-NHS pH6.0修饰产物(Y6)、pH9.0修饰产物(Y9)和pH10.5修饰产物(Y10.5)的MS分子量均在62012道尔顿±10％的范围内，与YPEG单位点修饰rHuGH的理论分子量一致(YPEG-NHS的分子量为40kD±10％)，说明Y6、Y9和Y10.5均为rHuGH的YPEG单位点修饰物。rHuGH的UPEG-NHS pH6.0修饰产物(U6)、pH9.0修饰产物(U9)和pH10.5修饰产物(U10.5)的MS分子量均在62012道尔顿±10％的范围内，与UPEG单位点修饰rHuGH的理论分子量一致(UPEG-NHS的分子量为40kD±10％)，说明U6、U9和U10.5均为rHuGH的UPEG单位点修饰物。
实施例4
pH6.0条件下重组人生长激素U型和Y型分支PEG修饰产物中表观分子量大的单位点修饰产物(Y6-1、U6-1)的制备及分子量和细胞学活性检测
1、修饰反应
分别取1200mg UPEG-NHS和YPEG-NHS(平均分子量40kD，等臂；批号分别为ZZ004P182、ZZ004P167)(北京键凯科技有限公司)各2份，分别溶解于12ml 2mM HCl(广东光华化学厂有限公司)；分别加入300mg的rHuGH(厦门特宝生物工程股份有限公司)和10mM PBNa(pH6.0)(中国医药集团上海化学试剂公司)使反应总体积为60ml。该反应体系中，rHuGH反应终浓度为5mg/ml，rHuGH与PEG-NHS反应摩尔比约为1∶2，反应pH为6.0。振荡条件下＜10℃温浴2h，加入冰乙酸(汕头市西陇化工厂)使pH＜4.0终止反应。
2、表观分子量大的PEG单位点修饰产物(Y6-1、U6-1)的纯化制备
2.1Q Sepharose FF层析纯化
rHuGH的PEG修饰反应样(反应pH 6.0)用超纯水稀释3倍，分别用NaOH调pH至9.0。
层析柱体(上海锦华层析设备厂)规格为Φ25mm×500mm，QSepharose FF填料(GE Healthcare)装填规格为Φ25mm×310mm，1CV＝152ml。Q Sepharose FF层析柱用0.5M NaOH 10ml/min×30min在位清洗，ddH2O 10ml/min洗脱3CV，1M NaCl 10ml/min×3CV再生，20mM硼砂/硼酸-17mM NaCl(pH 9.0，A液)10ml/min洗脱5CV。rHuGH的PEG修饰反应超纯水稀释样按6ml/min流速上样，A液10ml/min洗脱至第1个峰完全洗出；换20mM硼砂/硼酸-100mM NaCl(pH 9.0，B液)，10ml/min洗脱至第2个峰完全洗出；换20mM硼砂/硼酸-200mM NaCl(pH 9.0，C液)，10ml/min洗脱至第3个峰完全洗出。洗脱液检测波长280nm(AKTA Basic100，GE Healthcare)。收集第2个峰样品即为目的样。用5K超滤器(Millipore，聚醚砜材质)将目的样的缓冲体系超滤替换成5mM NaAc/HAc(pH 4.5)。
2.2MacroCap SP层析纯化
层析柱体(上海锦华层析设备厂)规格为Φ12mm×300mm，MacroCapSP填料(GE Healthcare)装填规格为Φ12mm×180mm，1CV＝20ml。MacroCap SP层析柱用0.5M NaOH 1ml/min×30min在位清洗，ddH2O1ml/min洗脱3CV，1M NaCl 1ml/min×3CV再生，5mM NaAc/HAc(pH 4.5，A液)1ml/min洗脱5CV。PEG-rHuGH的Q Sepharose FF层析纯化超滤替换样1ml/min上样，A液1ml/min洗脱3CV；换5mM NaAc/HAc-100mMNaCl(pH 4.5，B液)，0％-30％B液1ml/min梯度洗脱5CV，30％-45％B梯度洗脱10CV；换5mM NaAc/HAc-1M NaCl(pH 4.5，C液)，1ml/min洗脱至第1、2峰完全洗出。洗脱液检测波长280nm(AKTA Basic100，GE Healthcare)。收集30％-45％B梯度洗脱时之第5到第8个CV的洗脱样品即为目的样。用5K超滤器(Millipore，聚醚砜材质)将目的样的缓冲体系超滤替换成3mM NaAc/HAc-7mM NaCl-5mM Lys(pH 5.0)，补加甘露醇至终浓度45mg/ml，0.2μm过滤除菌；取样SDS-PAGE电泳，银染显色；余样-70℃冻存，样品编号：U6-1、Y6-1。SDS-PAGE电泳检测结果示于图8，SDS-PAGE电泳表观分子量检测结果示于图9。
PEG-rHuGH各样品上样10μg情况下均检出少量多位点修饰物，各样品底物蛋白(rHuGH)含量均不超过0.5％(图8)，主带含量均不低于80％。PEG-rHuGH各样品SDS-PAGE电泳表观分子量检测结果均为1条主带，Y6-1的表观分子量明显大于Y10.5，U6-1的表观分子量明显大于U10.5(图9)。
3、MALDI-TOF MS分子量检测
采用德国BRUKER公司autoflex TOF/TOF质谱仪，MALDI-TOF MS法测定PEG-rHuGH各样品的分子量。检测方法同实施例3。结果示于图7。
Y6-1和U6-1的MS分子量均在62012道尔顿±10％的范围内，与PEG单位点修饰rHuGH的理论分子量一致(YPEG-NHS和UPEG-NHS的分子量为40kD±10％)，均为PEG单位点修饰物。
4、细胞学活性检测
以GH国家标准品为对照，采用HuGH依赖型大鼠淋巴瘤细胞株Nb2-11检测PEG-rHuGH各样品的细胞学活性，比较Y6-1与Y10.5、U6-1与U10.5的细胞学活性的差别。检测方法同实施例3。检测结果示于表3，每个样品检测3个平行样。
Y10.5的平均细胞学比活性为2.08×10-1IU/mg，Y6-1的平均细胞学比活性为5.50×10-2IU/mg；U10.5的平均细胞学比活性为2.28×10-1IU/mg，U6-1的平均细胞学比活性为5.00×10-2IU/mg。Y10.5/U10.5的平均细胞学比活性明显高于Y6-1/U6-1，可达后者的3倍左右。
表3.YPEG-rHuGH和UPEG-rHuGH各样品细胞学活性检测结果1
样品 PEG类型  PEG分子量(kD)   PEG修饰位点数   细胞学比活性(×10-1IU/mg)2
  YPEG-rHuGH，Y10.5   Y分支   40   单位点   2.08±0.10
  YPEG-rHuGH，Y6-1   Y分支   40   单位点   0.55±0.06
  UPEG-rHuGH，U10.5   U分支   40   单位点   2.28±0.14
  UPEG-rHuGH，U6-1   U分支   40   单位点   0.50±0.06
注：1、以GH国家标准品为标准，标准品批号：35-20002，1mg/ml/支，3IU/支，购自中国药品生物制品检定所。2、为3个平行样检测结果的平均。
实施例5
YPEG-rHuGH(Y10.5)和UPEG-rHuGH(U10.5)的体内生物学
活性检测
以去脑垂体大鼠为动物模型，按《中国药典》2005年版附录XII P生长激素生物测定法测定YPEG-rHuGH(Y10.5)和UPEG-rHuGH(U10.5)的体内促进动物生长的生物学活性，即观察一次性给药一周后对去脑垂体大鼠(无内源性生长激素)生长发育作用的影响。
采用Wistar大鼠，SPF级，雄性，出生26-28d，体重60-80g；由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(京)2005-0004号。试验前2-3周无菌条件下手术摘除大鼠脑垂体，于二级实验室正常饲养使其恢复备用。筛选合格去脑垂体大鼠，按体重均匀分成10组，每组10只，具体为：阴性对照(空白溶剂)组；阳性对照rHuGH(GH国家标准品，由中国药品生物制品检定所制备，规格3IU·mg-1·支-1)低(2.7IU·kg-1)、中(5.3IU·kg-1)、高(10.7IU·kg-1)剂量组，分6次给药，每日一次，连续6日；供试品Y10.5低(2.7IU·kg-1)、中(5.3IU·kg-1)、高(10.7IU·kg-1)剂量组，供试品U10.5低(2.7IU·kg-1)、中(5.3IU·kg-1)、高(10.7IU·kg-1)剂量组，与标准品给药的第一天同时一次性给药。Y10.5和U10.5按估计效价3IU/mg配制。于动物颈部皮下注射给药，给药容积0.5ml；阴性对照组只给予溶剂，每天给药1次、共连续给药6次。于阳性对照组最后1次给药后24h处死大鼠，检测体重和胫骨骨骺板宽度。按《中国药典》2005年版附录XII P生长激素生物测定法和附录XI V生物检定统计法处理数据。
YPEG-rHuGH(Y10.5)的生物效价为5.0IU·mg-1，UPEG-rHuGH(U10.5)的生物效价为5.2IU·mg-1，均为普通rHuGH的1.5倍以上。YPEG-rHuGH(Y10.5)和UPEG-rHuGH(U10.5)一次给药比需每天注射给药的rHuGH具有更高的促进动物机体生长的生物活性和长效的药理作用。
实施例6
YPEG-rHuGH(Y10.5)食蟹猴血清药代半衰期检测
选用6只食蟹猴，雌3雄3，体重3.24-5.48kg(广西北海市玉琦实验动物科技有限公司，合格证编号：SCXK(桂)2005-0005)。实验分为2组，每组3只食蟹猴，分别为：YPEG-rHuGH(Y10.5)皮下注射300μg·kg-1(♂2只，♀1只)组和rHuGH(Saizen，思真；瑞士雪兰诺大药厂)皮下注射300μg·kg-1组(♂1只，♀2只)；单次给药。给药后定时抽取注药对侧后肢静脉血，分离血清；采用R&D公司的Human Growth HormoneELISA试剂盒ELISA法检测血药浓度，绘制血药浓度变化曲线，计算药代半衰期。结果示于图10。
食蟹猴皮下注射300μg·kg-1YPEG-rHuGH(Y10.5)后，血清药物浓度达峰时间在8-24h，药物消除缓慢；平均血清药代半衰期为41.33h。食蟹猴皮下注射300μg·kg-1 rHuGH(思真)后，血清药物浓度达峰时间在1-2h，至24h已降到药前水平，消除明显快于YPEG-rHuGH(Y10.5)；平均血清药代半衰期为1.80h。YPEG-rHuGH(Y10.5)的平均血清药代半衰期为rHuGH的20倍以上。

Claims (64)

1.一种制备聚乙二醇化生长激素的方法，包括如下步骤：
a)在pH不低于9.0的溶液中将U型或Y型分支的双链聚乙二醇和生长激素接触，其中所述双链聚乙二醇是等臂的双链聚乙二醇，所述U型分支的双链聚乙二醇平均分子量为26kD至66kD，以及所述Y型分支的双链聚乙二醇平均分子量为26kD至60kD；
b)在适当浓度的SDS-PAGE中检测a)步骤所得的聚乙二醇单位点修饰产物，其中所述产物为两条带；
c)分离、回收所述两条带中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物；
任选地还包括纯化步骤。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的pH不低于9.5。
3.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的pH不低于10.0。
4.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的pH为10.5。
5.权利要求1的方法，其中所述生长激素为人生长激素。
6.权利要求1的方法，其中步骤(a)中所述生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为1∶2。
7.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的SDS-PAGE为12％SDS-PAGE。
8.权利要求1的方法，其中纯化步骤使用凝胶层析方法纯化。
9.权利要求8的方法，其中纯化步骤使用Q Sepharose FF层析、DEAESepharose FF层析或MacroCap SP层析方法纯化。
10.权利要求1的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(I)的Y型分支的双链聚乙二醇，
Figure FSB0000112969530000021
其中：Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基或取代芳基；X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
11.权利要求10的方法，其中Ri为取代或未经取代的芳烷基或杂烷基。
12.权利要求10的方法，其中所述Y型分支的双链聚乙二醇具有如下结构式(II)：
其中R和R’为无关的C1-C4烷基；m和m’表征聚合度，为任何整数。
13.权利要求12的方法，其中R和R’为甲基。
14.权利要求12的方法，其中m+m’为600到1500。
15.权利要求12的方法，其中m+m’为910。
16.权利要求12的方法，其中所述Y型分支的双链聚乙二醇具有如下结构式(III)：
17.权利要求16的方法，其中Y型分支的双链聚乙二醇的总平均分子量为40kD。
18.权利要求1的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(IV)的U型分支的双链聚乙二醇，
Figure FSB0000112969530000032
其中R和R’为独立无关的C1-C4烷基；n和n’表征聚合度，为任何整数；n+n’介于600-1500之间。
19.权利要求18的方法，其中n+n’为910。
20.权利要求18的方法，其中U型分支的双链聚乙二醇平均分子量为约40kD。
21.权利要求16的方法，其包括如下步骤：
a)在pH9.0或10.5的溶液中将下式(III)所示的聚乙二醇和人生长激素接触，其中所述人生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为1∶2；
Figure FSB0000112969530000041
其中m+m，为910，双链聚乙二醇的总平均分子量为约40kD；
b)在12％SDS-PAGE中检测a)步骤中所得的聚乙二醇单位点修饰产物，其中所述产物为以表观分子量低的条带为主；
c)使用凝胶层析方法分离、回收所述表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物；所述凝胶层析方法选自Q Sepharose FF层析、DEAE Sepharose FF层析或MacroCap SP层析。
22.一种制备聚乙二醇化生长激素制备物的方法，包括如下步骤：
a)在pH不低于9.0的溶液中将U型或Y型分支的双链聚乙二醇和生长激素接触，其中所述双链聚乙二醇是等臂的，所述U型分支的双链聚乙二醇平均分子量为26kD至66kD，以及所述Y型分支的双链聚乙二醇平均分子量为26kD至60kD；
b)在适当浓度的SDS-PAGE中检测a)步骤所得的聚7二醇单位点修饰产物，其中所述产物为两条带；
c)分离、回收所述聚乙二醇单位点修饰产物；
所述回收的产物是以表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物为主的混合物，其中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于70％，
任选地还包括纯化步骤。
23.权利要求22的方法，其中步骤a)中pH不低于9.5。
24.权利要求22的方法，其中步骤a)中pH不低于10.0。
25.权利要求22的方法，其中步骤a)中pH为10.5。
26.权利要求22的方法，其中所述生长激素为人生长激素。
27.权利要求22的方法，其中步骤a)中所述生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为1∶2。
28.权利要求22的方法，其中步骤b)中SDS-PAGE为12％SDS-PAGE。
29.权利要求22的方法，其中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于80％。
30.权利要求22的方法，其中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于90％。
31.权利要求22的方法，其中纯化步骤使用凝胶层析方法。
32.权利要求22的方法，其中纯化步骤使用Q Sepharose FF层析、DEAESepharose FF层析或MacroCap SP层析方法纯化。
33.权利要求22的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(I)的Y型分支的双链聚乙二醇，
Figure FSB0000112969530000051
其中：Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基或取代芳基；X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或硫羟基反应形成共价键。
34.权利要求33的方法，其中Ri为取代或未经取代的芳烷基或杂烷基。
35.权利要求33的方法，其中所述Y型分支的双链聚乙二醇具有如下结构式(II)：
Figure FSB0000112969530000061
其中R和R’为无关的C1-C4烷基；m和m’表征聚合度，为任何整数。
36.权利要求35的方法，其中R和R’为甲基。
37.权利要求35的方法，其中m+m’为600到1500。
38.权利要求35的方法，其中m+m’为910。
39.权利要求35的方法，其中所述Y型分支的双链聚乙二醇具有如下结构式(III)：
Figure FSB0000112969530000062
40.权利要求39的方法，其中Y型聚乙二醇的总平均分子量为40kD。
41.权利要求22的方法，其中所述双链聚乙二醇为具有如下结构式(IV)的U型分支的双链聚乙二醇，
Figure FSB0000112969530000071
其中，R和R’为独立无关的C1-C4烷基；n和n’表征聚合度，为任何整数；n+n’介于600-1500之间。
42.权利要求41的方法，其中n+n’为910。
43.权利要求41的方法，其中所述U型分支的双链聚乙二醇平均分子量为约40kD。
44.权利要求39的方法，其包括如下步骤：
a)在pH9.0或10.5的溶液中将下式(III)所示的聚乙二醇和人生长激素接触，其中所述人生长激素和双链聚乙二醇的摩尔比为1∶2；
其中m+m’为910，双链聚乙二醇的总平均分子量为约40kD；
b)在12％SDS-PAGE中检测a)步骤中所得的聚乙二醇单位点修饰产物；
c)使用凝胶层析方法分离、回收所述聚乙二醇单位点修饰产物，所述凝胶层析方法选自Q Sepharose FF层析、DEAE Sepharose FF层析或MacroCap SP层析，所述回收的产物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于70％。
45.权利要求44的方法，其中回收的产物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于80％。
46.权利要求44的方法，其中回收的产物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于90％。
47.用权利要求22-40和44-46任一项的方法制备的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述生长激素为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的重组生长激素。
48.权利要求47的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述重组生长激素由SEQ ID NO：1所示序列组成。
49.权利要求47的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述聚乙二醇单位点修饰产物如下式(VII)所示：
Figure FSB0000112969530000081
其中R和R’为无关的C1-C4烷基；m+m’为910；j为1-12的整数，所述聚乙二醇化生长激素制备物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于70％。
50.权利要求49的聚乙二醇化生长激素制备物，其中R和R’为甲基。
51.权利要求49的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述聚乙二醇化生长激素制备物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于80％。
52.权利要求49的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述聚乙二醇化生长激素制备物中表观分子量低的聚乙二醇单位点修饰产物的SDS-PAGE含量不低于90％。
53.用权利要求41-43任一项的方法制备的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述生长激素为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的重组生长激素。
54.权利要求53的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述重组生长激素由SEQ ID NO：1所示序列组成。
55.权利要求47-54任一项的聚乙二醇化生长激素制备物，其中所述重组生长激素是人工合成的或由选自如下一组的表达系统表达：原核系统，真核酵母系统，昆虫细胞系统和哺乳动物细胞系统。
56.权利要求55的聚乙二醇化生长激素制备物，其中原核系统是大肠杆菌。
57.权利要求55的聚乙二醇化生长激素制备物，其中真核酵母系统是毕赤酵母。
58.权利要求55的聚乙二醇化生长激素制备物，其中哺乳动物细胞系统是CHO细胞。
59.一种组合物，其包含药物学有效剂量的权利要求47-58任一项的聚乙二醇化生长激素制备物和药物学可接受的载体或赋形剂。
60.权利要求59的组合物，其还包含甘露醇、氨基酸、氯化钠、醋酸和醋酸钠。
61.权利要求60的组合物，其中所述氨基酸选自天冬氨酸、天冬酰氨、赖氨酸和甘氨酸。
62.权利要求47-58任一项的聚乙二醇化生长激素制备物或权利要求59-61任一项的组合物在制备用于治疗需要用生长激素治疗的疾病和抗衰老治疗的药物中的应用。
63.权利要求62的应用，其中所述需要用生长激素治疗的疾病选自矮小症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、肾衰竭、AIDS、Turner综合症、合成代谢障碍和成人生长激素缺乏。
64.权利要求62的应用，其中所述需要用生长激素治疗的疾病是内源性生长素缺乏性矮小症。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2010010953A (es) 2008-04-03 2011-04-21 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Hormona de crecimiento modificada con glicol de polietileno de doble cadena, metodo de preparacion y aplicación del a misma.
US10047623B2 (en) * 2014-12-17 2018-08-14 United Technologies Corporation Compliant seal assembly and method of operating
CN107446908A (zh) * 2016-06-01 2017-12-08 湖南华腾制药有限公司 分支型聚乙二醇修饰的l‑门冬酰胺酶及其制备方法
CN114539384B (zh) * 2020-11-19 2024-09-06 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用
CN114740108B (zh) * 2022-03-28 2023-07-14 天津键凯科技有限公司 一种聚合物修饰抗体类药物的修饰度的测定方法
CN115845079B (zh) * 2022-11-24 2023-07-18 武汉禾元生物科技股份有限公司 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6342375B1 (en) * 1996-10-24 2002-01-29 Universidad Autonoma De Nuevo Leon Modified methylotrophic Pichia pastoris yeast which secretes human growth hormone
WO2003076490A1 (fr) * 2002-03-13 2003-09-18 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Derive polymere hydrophile a ramification de type y et procede de preparation d'un composite medical contenant le compose precite
CN1608079A (zh) * 2001-11-20 2005-04-20 法玛西雅公司 化学修饰的人生长激素缀合物
WO2006102659A2 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation CONJUGATES OF AN hGH MOIETY AND A POLYMER

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
RU2158603C2 (ru) * 1994-05-31 2000-11-10 Амген Инк. Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
JP4593048B2 (ja) * 1999-12-24 2010-12-08 協和発酵キリン株式会社 分岐型ポリアルキレングリコール類
WO2003040211A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
CN1477126A (zh) 2002-07-22 2004-02-25 长春金赛药业有限责任公司 长效生长激素及药物组合物
KR20050065677A (ko) 2002-11-15 2005-06-29 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐｅｇ ｉｆｎ 알파 2ａ의 위치 이성질체
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US20050281778A1 (en) * 2003-03-28 2005-12-22 Myung-Ok Park Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
WO2006094530A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
EP2236521A4 (en) * 2007-12-29 2013-07-10 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd BY POLYETHYLENE GLYCOL OF Y-TYPE MODIFIED G-CSF AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
MX2010010953A (es) 2008-04-03 2011-04-21 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Hormona de crecimiento modificada con glicol de polietileno de doble cadena, metodo de preparacion y aplicación del a misma.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6342375B1 (en) * 1996-10-24 2002-01-29 Universidad Autonoma De Nuevo Leon Modified methylotrophic Pichia pastoris yeast which secretes human growth hormone
CN1608079A (zh) * 2001-11-20 2005-04-20 法玛西雅公司 化学修饰的人生长激素缀合物
WO2003076490A1 (fr) * 2002-03-13 2003-09-18 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Derive polymere hydrophile a ramification de type y et procede de preparation d'un composite medical contenant le compose precite
WO2006102659A2 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation CONJUGATES OF AN hGH MOIETY AND A POLYMER

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