CN101883569B - 具有抗流感活性之含奥司他伟膦酸酯同系物的合成 - Google Patents

Abstract

本发明叙述新颖的膦酸酯化合物。该等化合物具有作为神经胺酸苷酶抑制剂之活性，可对抗H1N1及H5N1病毒的野生型及H274Y突变株。本发明亦提供已知神经胺酸苷酶抑制剂奥司他伟(Oseltamivir)及抗流感药物克流感

以及新颖膦酸酯化合物之经由D-木糖的对映体选择性合成途径。本发明亦提供另一种有效且弹性的合成，以11步骤及＞20％的整体产率，由可轻易取得的发酵产物(1S-顺)-3-溴-3，5-环己二烯-1，2-二醇合成克流感以及高度强效神经胺酸苷酶抑制剂零流感(Tamiphosphor)。大部分的反应中间物皆在无冗长纯化流程的情形下以晶体形式取得。关键的转化作用包括溴苯顺-二氢二醇的起始位向及立体选择性溴酰胺化作用，以及最终的钯催化性羰基化及膦酰化作用。

Description

具有抗流感活性之含奥司他伟膦酸酯同系物的合成

相关申请案

本申请案将美国临时专利申请案60/969,491号(2007年8月31日申请)及61/048,507号(2008年4月28日申请)纳入作为参考文献，并主张其巴黎公约优先权。

技术领域

本发明叙述新颖的膦酸酯化合物。该等化合物具有作为神经胺酸苷酶抑制剂之活性，可对抗H1N1及H5N1病毒的野生型及H274Y突变株。本发明亦提供已知神经胺酸苷酶抑制剂奥司他伟(Oseltamivir)及抗流感药物克流感以及新颖膦酸酯化合物之经由D-木糖或溴苯的两种对映体选择性合成途径。

背景技术

流感依旧是人类及动物的重大健康问题(Kaye and Pringle，Clin.Infect.Dis.2005，40，108；以及Beigel et al.，N.Engl.J.Med.2005，353，1374)。目前共有四种药物核准用于流感之预防及治疗：金刚烷胺(amantadine)及金刚乙胺(rimantadine)是作为M2离子通道阻断剂，而克流感(奥司他伟乙醚之磷酸盐，Roche Laboratories，Inc.)及瑞乐沙(Relenza^TM)(扎那米伟(zanamivir)，Glaxo Wellcome，Inc.)则是抑制神经胺酸苷酶(NA)(Moscona，A.N.Engl.J.Med.2005，353，1363；Ward et al.，J.Antimicrob.Chemother.2005，55，Suppl.Si，15；以及De Clercq，E.Nature Rev.Drug Discov.2006，5，1015)。近来对于药物抗性禽流感的感染以及接受克流感治疗儿童的副作用的研究报告建议，在对抗大流行性流感威胁的战役中，仍需要能作为神经胺酸苷酶抑制剂的新颖化学物。在可取得安全及有效的疫苗来保护以对抗可能发生的大流行性禽流感之前，神经胺酸苷酶抑制剂是少数可用的治疗方法之一。

NA抑制剂(NAIs)经设计具有(氧杂)环己烯骨架，以模拟唾液酸的酶切割的氧鎓过渡状态(von Itzstein，M.et al.Nature 1993，363，418；Lew et al.，Curr.Med.Chem.2000，7，663；and Russell et al.，Nature 2006，443，45)。克流感(1，示于流程1)是一种口服投与的抗流感药物(Kim et al.，J.Am.Chem.Soc.1997，119，681；Rohloffet al.，J.Org.Chem.1998，63，4545；Karpf andTrussardi，J.Org.Chem.2001，66，2044；Harrington et al.，Org.Process Res.Deυ.2004，8，86；Yeung et al.，J.Am.Chem.Soc.2006，128，6310；Fukuta etal.，J.Am.Chem.Soc.2006，128，6312；Farina and Brown，Angew.Chem.Int.Ed.2006，45，7330；Mita et al.，Org.Lett.2007，9，259；Yamatsugu et al.，Tetrahedron Lett.2007，48，1403)。在由肝酯酶水解时，活化的羧酸盐奥司他伟(2，亦称为GS4071)会与NA活性位点中的三个精胺酸残基(Arg118、Arg292及Arg371)产生作用(von Itzstein，et al.，1993；Lew et al.，2000，及Russell et al.，2006)。

膦酸基一般是在药物设计中作为羧基的生物电子等排体(White et al.，J.MoI.Biol.1995，245，623；Streicher et al.，Tetrahedron 2001，57，8851；Streicher，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，361；Schug and Lindner，W.Chem.Rev.2005，105，67；Streicher and Busseb，Bioorg.Med.Chem.2006，14，1047)。使用已知的N1晶体结构(PDB编码：2HU4)(Russell et al.，2006)所进行的初步分子对接实验(图1)显示，除了类似NA-奥司他伟复合物之在结合袋中由该C₃-戊氧基、C₄-乙酰胺基、及C₅-胺基所产生的其它作用外，该推定之膦酸酯抑制剂3a尚可强力结合NA之三-精胺酸残基。相较于羧酸-胍离子对，膦酸离子与胍离子间具有更强之静电作用。针对奥司他伟/克流感的合成，先前所报告之方法(包括，如，Bischofberger et al.，美国专利第5,763,483号，其并入本文作为参考)并无法接受将C-1羧基交换成为膦酸基；因此，其需要新颖的方法来合成已知及新颖的神经胺酸苷酶抑制剂。

发明内容

本发明叙述新颖的膦酸酯化合物。该等化合物具有作为神经胺酸苷酶抑制剂的活性，以对抗H1N1及H5N1病毒的野生型及H274Y突变株。本发明亦提供已知神经胺酸苷酶抑制剂奥司他伟(Oseltamivir)及抗流感药物克流感

以及新颖膦酸酯化合物之经由D-木糖的对映体选择性合成途径。本发明亦提供另一种有效且弹性的合成，以11步骤及＞20％的整体产率，由可轻易取得的发酵产物(1S-顺)-3-溴-3，5-环己二烯-1，2-二醇合成克流感以及高度强效神经胺酸苷酶抑制剂零流感(Tamiphosphor)。大部分的反应中间物皆在无冗长纯化流程的情形下以晶体形式取得。关键的转化作用包括溴苯顺-二氢二醇的起始位向及立体选择性溴酰胺化作用，以及最终的钯催化性羰基化及膦酰化作用。

根据本发明的特征之一，其揭示一种组合物，包含治疗有效量之式I化合物

以及医药载体，其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且其中R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂。

根据本发明的特征之一，其揭示一种组合物，包含治疗有效量之至少一种下列化合物：

以及医药载体。

根据本发明的特征之一，其揭示一种方法，包含根据至少一种图3-5之流程制造式I化合物之组合物：

其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且其中R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂。由此种方法所产生之产物亦以类似方式为本发明预期。

根据本发明的特征之一，其揭示一种方法，包含提供治疗有效量之式I化合物组合物：

其中该组合物系设计用以投与至生物以抑制神经胺酸苷酶之活性，其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且其中R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂。

根据本发明的特征之一，其揭示一种方法，包含提供具有治疗有效量之至少一种下列化合物的组合物：

其中该组合物系设计用以投与至生物以抑制神经胺酸苷酶之活性。

在一实施例中，本发明提供式(I)之化合物：

其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂。

在一特定态样中，该化合物是：

在另一特定态样中，该化合物是：

在又另一特定态样中，该化合物是：

在另一特定态样中，该化合物是：

在另一特定态样中，该化合物是：

本发明之另一实施例提供下式之化合物：

本发明之另一实施例提供下式之化合物：

在一实施例中，本发明提供一种组合物，包含下列化合物中之任何一者：式(I)化合物，其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO⁴-、或NH(C＝NH)NH₂；3、3a、3b、13a、及13b，以及医药可接受之载体。

在另一实施例中，本发明提供制备式(I)化合物之方法：

其中A系CO₂R，或PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂；该方法包含：

(a)使用D-木糖作为掌性前体，制备中间化合物(7)：

其中E系CO₂R或PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自C1-C6烷基及芳基；

(b)处理中间化合物(7)而进行分子内之Horner-Wadsworth-Emmons反应，以形成中间化合物(8)：

其中E系CO₂R或PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自C1-C6烷基及芳基；

(c)以叠氮磷酸二苯酯处理中间化合物(8)而以迭氮基取代羟基并进行构型转化，以形成中间化合物(9)：

其中E系CO₂R或PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自C1-C6烷基及芳基；

(d)以Tf₂O、碱、及冠状醚处理中间化合物(9)而转化羟基，以形成中间化合物(10)：

其中E系CO₂R或PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自C1-C6烷基及芳基；

以及

(e)处理中间化合物(10)以形成式(I)化合物。

本发明之另一实施例提供一种用以抑制神经胺酸苷酶活性之方法，其包含使该神经胺酸苷酶接触下列化合物中之任何一者：式(I)化合物，其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂；3、3a、3b、13a、及13b。

在一态样中，该神经胺酸苷酶是活体内(in vivo)之流感神经胺酸苷酶。在另一态样中，该神经胺酸苷酶是试管内(in vitro)之流感神经胺酸苷酶。

在另一实施例中，本发明提供一种用以在需要的病患体内治疗流感之方法，该方法包含对该病患投与包含治疗有效量之下列化合物中任何一者的组合物：式(I)化合物，其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基、芳基、及X，其中X系一阳离子反离子，选自由铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己基铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、及钙阳离子、锌阳离子所组成之群；且R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂；3、3a、3b、13a、及13b。在一态样中，该组合物尚包含医药可接受之载体。

附图说明

上述本发明之特征以及标的将可在参照下文结合附呈图式之叙述时变得更为显著，在该等图式中，类似之参照数字系代表类似之组件，且其中：

图1显示奥司他伟2(A)及膦酸酯化合物3a(B)在流感病毒神经胺酸苷酶(N1亚型)活性位点中之分子模型；

图2显示化合物1、3、3b、3c、13b、及13c之分子模型；

图3显示克流感1、奥司他伟2、其胍类似物13a、及膦酸酯同系物3、3b、及13b之新颖合成途径；

图4显示克流感1以及膦酸酯同系物零流感3之新颖合成途径；

图5显示克流感1以及膦酸酯同系物零流感3之新颖合成途径；

图6显示克流感1以及膦酸酯同系物零流感3及13b之新颖合成途径；

图7显示膦酸酯同系物3c之新颖合成途径；

图8显示膦酸酯同系物13c之新颖合成途径；

图9显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以10mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图10显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以1mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图11显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以0.1mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图12显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以0.01mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图13显示经10MLD₅₀之NIBRG-14(H5N1)流感病毒接种并以10mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图14显示经10MLD₅₀之NIBRG-14(H5N1)流感病毒接种并以1mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图15显示经10MLD₅₀之NIBRG-14(H5N1)流感病毒接种并以0.1mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图16显示经10MLD₅₀之NIBRG-14(H5N1)流感病毒接种并以0.01mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图17显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以10mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图18显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以1mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图19显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以0.1mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图20显示经10MLD₅₀之A/WSN/33(H1N1)流感病毒接种并以0.01mg/kg/天之药物剂量治疗之小鼠的存活率(a组)及平均体重变化(b组)；

图21显示化合物5之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图22显示化合物5之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图23显示化合物6之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图24显示化合物6之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图25显示化合物7a之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图26显示化合物7b之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图27显示化合物8a之¹HNMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图28显示化合物8a之¹³C NMR光谱(150MＨz，CDCl₃)；

图29显示化合物9a之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图30显示化合物9a之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图31显示化合物10a之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图32显示化合物10a之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图33显示化合物10b之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图34显示化合物10b之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图35显示化合物10b之³¹P NMR光谱(162MHz，CDCl₃)；

图36显示化合物11a之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图37显示化合物11a之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图38显示化合物11b之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图39显示化合物11b之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图40显示化合物11b之³¹P NMR光谱(162MHz，CDCl₃)；

图41显示化合物1克流感之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图42显示化合物1克流感之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图43显示化合物1克流感之³¹P NMR光谱(162MHz，D₂O)；

图44显示化合物2奥司他伟之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图45显示化合物2奥司他伟之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图46显示化合物3之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图47显示化合物3之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图48显示化合物3之³¹P NMR光谱(162MHz，D₂O)；

图49显示化合物12a之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图50显示化合物12a之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图51显示化合物12b之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl³)；

图52显示化合物12b之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图53显示化合物12b之³¹P NMR光谱(162MHz，CDCl₃)；

图54显示化合物13a之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图55显示化合物13a之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图56显示化合物13b之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图57显示化合物13b之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图58显示化合物13b之³¹P NMR光谱(162MHz，D₂O)；

图59显示化合物14a之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图60显示化合物14a之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图61显示化合物14b之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图62显示化合物14b之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图63显示化合物14b之³¹P NMR光谱(162MHz，D₂O)；

图64显示化合物20之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图65显示化合物20之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图66显示化合物22之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图67显示化合物22之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图68显示化合物23之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图69显示化合物23之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图70显示化合物24之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图71显示化合物24之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图72显示化合物25之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图73显示化合物25之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图74显示化合物26之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图75显示化合物26之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图76显示化合物27之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图77显示化合物27之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图78显示化合物29之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图79显示化合物29之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图80显示化合物31a之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图81显示化合物31a之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图82显示化合物31b之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图83显示化合物31b之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图84显示化合物31b之³¹P NMR光谱(202MHz，CDCl³)；

图85显示化合物3c之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图86显示化合物3c之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图87显示化合物31b之³¹P NMR光谱(242MHz，D₂O)；

图88显示化合物13c之¹H NMR光谱(600MHz，D₂O)；

图89显示化合物13c之¹³C NMR光谱(150MHz，D₂O)；

图90显示化合物3b之¹H NMR光谱(600MHz，CDCl₃)；

图91显示化合物3b之¹³C NMR光谱(150MHz，CDCl₃)；

图92显示化合物3b之³¹P NMR光谱(162MHz，CDCl₃)。

具体实施方式

在下文本发明实施例之详述中，其参照附呈之图式，其中类似之参照数字代表类似之组件，且其中系以说明方式显示可实施本发明之具体实施例。此等具体实施例系以足够之细节进行叙述，以使一般技艺人士可据以实施本发明，且需明了者，可使用其它具体实施例，且可在不偏离本发明范围的情形下进行逻辑、机械、电学、功能、组成、及其它之改变。下文之详述因此不应被视为任何限制，而本发明之范围仅由附呈之申请专利范围定义。在本文中，「或」乙辞应被视为一种论理上之选言，且不应被视为一种排他性选言，除非其明示为如此或是被标示为「或不(xor)」乙辞。

本发明提供已知神经胺酸苷酶抑制剂奥司他伟及抗流感药物克流感以及新颖膦酸酯同系物的新颖合成途径。其使用D-木糖作为掌性前体以进行已知及新颖活性神经胺酸苷酶抑制剂的合成。新颖的膦酸酯同系物藉由抑制H1N1及H5N1病毒的野生型及H274Y突变株的神经胺酸苷酶而具有优于抗流感之较佳抗流感活性。

目前的克流感工业合成是依赖天然存在的莽草酸(shikimic acid)来作为起始物质。然而，具有一致纯度之莽草酸的取得可能造成问题。此种合成亦具有操作爆炸性迭氮化物反应试剂及中间化合物的缺点。数种新颖的克流感合成方法系着手于非莽草酸依赖性的方法。为建立克流感的环己烯羧酸酯核结构，已使用了各种类型的Diels-Alder反应。举例而言，可进行呋喃及丙烯酸酯间的Diels-Alder反应，接着进行酶法拆分，以取得克流感合成的掌性中间化合物。类似者，可使用1-三甲基系烷氧基-1，3-丁二烯与需要以掌性HPLC分离关键中间化合物的外消旋混合物。或者，可以催化对映选择性Diels-Alder反应提供所需的掌性环己烯羧酸酯以进行克流感的合成。

在一实施例中，本发明提供新颖的合成方法，以进行具有合理高产率(5.2-13.5％)的克流感、奥司他伟、各种膦酸酯同系物、以及其胍类似物的对映选择性合成。该合成途径示于图3(流程1)。本发明进行分子内之Horner-Wadsworth-Emmons反应以产生环己烯羧酸酯8a及膦酸酯8b。在根据Mitsunobu法以叠氮磷酸二苯酯处理时，8a/8b中之羟基可成功以迭氮基取代并具有转化之构型。在一态样中，此流程中免除了使用危险反应试剂迭氮化钠。在一较佳态样中，该合成流程可容许进行后期官能化作用，这使其就医药化学之观点而言相当具有吸引力。

该新颖的合成流程示于图3。述于图3的反应试剂及步骤如下：(a)Me₃CCOCl，吡啶，0℃，8h；89％。(b)PDC，Ac₂O，回流，1.5h；HONH₂-HCl，吡啶，60℃，24h；82％。(c)LiAlH₄，THF，0℃，接着回流1.5h；88％。(d)Ac₂O，吡啶，25℃，3h；HCl/1，4-二恶烷(4M)，BnOH，甲苯，0-25℃，24h；85％。(e)2，2′-二甲氧基丙烷，甲苯，催化量p-TsOH，80℃，4h；90％。(f)Tf₂O，吡啶，CH₂Cl₂，-15℃，2h；EtO₂CCH₂PO(OEt)₂或H₂C[PO(OEt)₂]₂，NaH，催化量15-冠醚-5，DMF，25℃，24h；7a产率80％而7b产率73％。(g)H₂，Pd/C，EtOH，25℃，24h；NaH，THF，25℃，1h，8a产率83％；or NaOEt，EtOH，25℃，5h，8b产率80％。(h)(PhO)₂PON₃，(i-Pr)N＝C＝N(i-Pr)，PPh₃，THF，25℃，48h。(i)HCl，EtOH，回流，1h；9a产率83％而9b产率74％。(j)Tf₂O，吡啶，CH₂Cl₂，-15至-10℃，2h；KNO₂，18-冠醚-6，DMF，40℃，24h；10a产率70％而10b产率71％。(k)Cl₃CC(＝NH)OCHEt₂，CF₃SO₃H，CH₂Cl₂，25℃，24h；11a产率78％而11b产率82％。(l)H₂，Lindlar催化剂，EtOH，25℃，16h；3b产率85％。(m)H₃PO₄，EtOH，40℃，1h；1之产率91％。(n)KOH，THF/H₂O，0-25℃，1h；2之产率88％而14a产率81％。(o)TMSBr，CHCl₃，25℃，24h；NH₄HCO₃水溶液，冻干；3之产率85％(铵盐)，13b产率72％而14b产率75％。(p)N，N′-双(第三丁氧羰基)硫脲，HgCl₂，Et₃N，DMF，0-25℃，10-16h；12a产率78％而12b产率58％。(q)TFA，CH₂Cl₂，0℃，1h；13a产率88％。各步骤的反应试剂、反应条件及产率进一步详述于下文之实验章节。

在另一方法中，其制备1，4-环己二烯的内消旋-氮丙啶衍生物，并以叠氮三甲基硅烷对其进行催化性的不对称性开环反应，以其作为克流感合成的平台方法。Ru-Al₂O₃催化经取代异酞酸二酯之氢化反应，提供所有取代基及二酯顺式-排列之环己烷核结构。接着对该内消旋-二酯进行酶性水解而成为光学活性之单酸，其是作为克流感合成之关键中间化合物。克流感的合成以环己二烯羧酸酯之掌性阳离子复合物的胺化作用起始示范，该复合物系由经(1R，2S)-2-苯基环己醇衍化之非镜相异构物的HPLC分离而取得。最后，以5-氧杂-双环[3.2.1]己烯-4-酮之钯催化性不对称烯丙基胺化反应示范为克流感合成之关键步骤。

发明人发现使用D-木糖作为平价起始物质的克流感及零流感的合成。该等目标化合物的环己烯核是由分子内之Horner-Wadsworth-Emmons反应建构。尽管此种弹性合成方法可以合理的整体产率(5-13％)提供克流感及零流感两者，但其冗长之途径(18-19反应步骤)对于大规模的合成而言并不理想。一种更为精确及实用的克流感及零流感的合成途径如图4所示叙述。

在此流程中，起始物质镜像纯性溴苯顺-1，2-二氢二醇(17)可由市售取得，且可在大规模下可以溴苯之微生物氧化作用轻易制备。由于其独特之官能基组合，该溴苯顺-二氢二醇已成功应用于各种天然产物及其相关分子的合成。此外，该溴原子可在该合成途径之后期阶段转化成为各种官能基，包括羧酸酯及膦酸酯。因此，此种合成流程在使用共同之中间化合物(如，26及29)作为关键点的情形下具有广泛用途而可合成克流感、零流感、及其它衍生物。此种后期之官能化作用就医药化学之观点而言相当具有吸引力。

根据此种合成计划，其在0℃下，于CH₃CN中，以N-溴乙酰胺(NBA)对(1S，2S)-顺-二醇17进行SnBr₄-催化性溴乙酰胺化反应，以位向及立体选择性之方式产生溴酰胺19，如图4所示。以X光散射分析确认19之结构(参见实例31及下列等等)。此种反应可能会接着在受阻较少之面形成溴离子，接着再在烯丙基C-5位置产生乙酰胺之选择性背后攻击。在LHMDS(1.1当量)之存在下，溴酰胺19会转化成为氮丙啶20，其以3-戊醇进行BF₃-中介性开环反应，以73％之产率产生化合物22。去保护后，以α-乙酰氧基异丁酰溴处理顺-二醇23而产生对应之乙酸-反-2-溴环己酯24。类似前述实例，此种反应可能涉及乙酰氧鎓离子(acetoxonium ion)之形成，以及溴离子在烯丙基C2位置之背后攻击。24与3当量LiBHEt₃

之反应可借着C1及C2位置之乙酰基及溴原子之同时还原而以82％产率(由23)产生干净产物25。在根据Mitsunobu法以叠氮磷酸二苯酯(DPPA)处理时，25中之羟基可成功以迭氮基取代并具有转化之构型，以84％产率产生26。亦发现少量(2％)之二烯27，其系藉由除去水分子而产生之副产物。对关键化合物26进行有机金属偶合反应，以纳入所欲之羧基及膦酰基。因此，在EtOH之存在下，26与Ni(CO)₂(PPh₃)₂之反应可以81％产率产生乙酯28a。另一方面，以催化剂Pd(PPh₃)₄达成亚磷酸二乙酯对26之膦酰化作用，以83％产率产生膦酸酯28b。在将28a及28b中之迭氮基还原成为胺后，根据我们先前报告之流程合成克流感及零流感。

上述的合成方法进一步由无迭氮化物之流程改良。我们发现，氰酸四丁铵是良好的胺官能基来源，如图5所示。醇25与Bu₄NOCN/PPh₃/DDQ反应产生异氰酸中间化合物，其接着以t-BuOH处理而以78％产率产生氨基甲酸酯29，如图5所示。进行与亚磷酸二乙酯之Pd-催化性偶合反应，形成膦酸酯31b，再在温和条件下以TMSBr进行Boc及乙基之同时去除而合成零流感。为避免使用化学计量量之毒性Ni(CO)₂(PPh₃)₂，29之Pd-催化性羰基化作用尝试失败。改将溴化物29转化成为更具活性之碘化物类似物30，该Pd-催化性羰基化作用即以高产率实现，产生羧酸酯31a。最后，以H₃PO₄处理31a，以一锅操作切除Boc基并形成磷酸盐而产生克流感。

总结言之，其使用可轻易取得的材料溴苯顺-二醇19(其可由溴苯之微生物氧化作用提供)，经由11步骤之反应序列，以21-26％的整体产率合成克流感及零流感。所有的反应皆在未使用潜在危险之中间化合物或毒性反应试剂的情形下进行。由于大部分之反应皆系以位向及立体选择性之方式产生结晶产物，其分离流程相对而言即简单且具成本效益。尽管在此实验中仅示范克级合成，克流感及零流感之大规模合成对抗流感药物之研发而言大有指望。

技艺中已知，可藉由使用膦酸二酯之碱性水解而取得膦酸单酯。膦酸单酯因此为本发明的态样之一预期。该单酯的合成在图7中针对化合物3c显示并在图8中针对化合物13c显示。此等化合物皆可以本文所揭示之其它合成流程而由起始化合物31b或12b轻易合成，以分别合成化合物3c及13c。

本发明之组合物视情况包含本文化合物之盐，特别是医药可接受之无毒性盐，其包含，例如，Na⁺、Li⁺、K⁺、Ca⁺⁺及Mg⁺⁺。此等盐可包括藉由组合适当之阳离子(诸如，碱金属及碱土金属离子或是铵及四级胺离子)与适当之酸阴离子分子部分而衍生者。

金属盐可借着使金属氢氧化物与本发明之化合物反应而制备。可以此方式制备之金属盐实例为含有Na⁺、Li⁺、K⁺之盐。

此外，可对碱性中心(一般为胺)或酸性基团进行部分有机或无机酸(如，HCl、HBr、H₂SO₄)或是有机磺酸之酸加成而形成盐。最后，咸应明了，本文之组合物包含未离子化以及两性离子形式，以及在水合物之形式中结合化学计量量之水的本发明化合物。本发明之另一态样系关于用以抑制神经胺酸苷酶活性之方法，其包含以本发明之化合物处理疑似含有神经胺酸苷酶之样本的步骤。

本发明之化合物是与习知之载体及赋形剂进行调配，该等载体及赋形剂将根据一般之实务而选择。锭剂将会含有赋形剂、助流剂、充填剂、黏合剂、及其类似者。水性调配物系以无菌形式制备，且在欲以非口服投与形式传递时，其一般而言将为等渗性。所有的调配物皆将视情况含有赋形剂，诸如述于″Handbook of Pharmaceutical Excipients[医药赋形剂手册]″(1986)中者，其以其全文明确纳入作为参考。赋形剂包括抗坏血酸及其它抗氧化剂、螯合剂(诸如EDTA)、糖类(诸如葡聚糖)、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸、及其类似者。该等调配物之pH范围为自pH 3至pH 11，但一般系约pH 7至pH 10。

一或多种本发明之化合物(其在本文中称为活性成分)可以适用于待治疗病况之任何途径投与。适当之途径包括口服、直肠、经鼻、局部(包括经颊及舌下)、阴道、及肠外(包括皮下、肌内、静脉、皮内、脑脊髓膜内、及硬脑膜外)、及其类似者。咸将可明了，较佳的途径可随例如接受者之状况而各异。

尽管可能单独投与该等活性成分，较佳者可能为将其以医药调配物之形式提供。该等本发明之调配物(包括兽医及人类用途两者)包含至少一种活性成分(如上所定义)，结合一或多种其可接受之载体及视情况之其它治疗成分。该(等)载体必须为「可接受」者，意谓其可与该调配物之其它成分兼容，并对其接受者为生理无害者。

该等调配物包括适于前述投与途径者。该等调配物可以单位剂形便利提供，且可以任何药学技艺中所熟知之方法制备。技术及调配物一般可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences[Remington医药科学](MackPublishing Co.，Easton，Pa.)。此等方法包括结合活性成分与构成一或多种附属成分之载体。一般而言，该等调配物系借着均匀及密切结合该活性成分与液态载体或是细切之固态载体或是两者，并接着，如需要，塑形该产物而进行制备。

适用于口服投与之本发明调配物系制备为不连续之单元，诸如，胶囊、药片、或锭剂，其各含有预定量之该活性成分；粉末或颗粒；水性液体或非水性液体中之溶液或悬浮液；或是水包油液态乳剂或油包水液态乳剂。该活性成分亦可以大丸药、干药糖剂、或糊剂之形式提供。

锭剂可借着压制或模制而制备，选择性结合一或多种附属成分。压制锭剂可借着在适用之机器中压制视情况混合黏合剂、润滑剂、钝性稀释剂、防腐剂、界面活性剂或分散剂之自由流动形式(诸如，粉末或颗粒)的活性成分而制备。模制锭剂可借着在适用之机器中模塑以钝性液体稀释剂湿润之粉末化活性成分的混合物而制备。锭剂可视情况进行包衣或截痕并视情况进行调配，以提供活性成分之缓释或控释。

就眼或其它外部组织(如，口及皮肤)的感染而言，该等调配物较佳系以含有该(等)活性成分之局部软膏或乳霜之形式施用，该(等)活性成分之量为，例如，0.075至20％w/w(包括范围介于0.1％及20％间以0.1％w/w增量之活性成分，诸如，0.6％w/w、0.7％w/w等)，较佳为0.2至15％w/w，且最佳为0.5至10％w/w。当调配于软膏中时，该等活性化合物可与石蜡性或水可分散性之软膏基质共同使用。或者，该等活性化合物可与水包油乳霜基质共同调配于乳霜中。

如需要，该乳霜基质之水相可包括，例如，至少30％w/w之多元醇，亦即，具有二或多个羟基之醇，诸如，丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、及聚乙二醇(包括PEG 400)、以及其混合物。局部调配物可能需要包括能够增进该活性成分穿过皮肤或其它受感染区域之吸收或穿透的化合物。此等皮肤穿透增进剂包括二甲基亚砜及相关类似物。

本发明乳剂之油相可以已知方法而由已知的成分构成。尽管该相可仅包含乳化剂(emulsifier)(亦称为乳化剂(emulgent))，其较佳系欲包含至少一种乳化剂与脂肪或是油或是脂肪及油两者的混合物。较佳者，其包括亲水性之乳化剂结合作为安定剂之亲脂性乳化剂。其亦较佳包括油及脂肪两者。含或不含安定剂之该(等)乳化剂共同构成所谓之乳化蜡，而该蜡与该油及脂肪则共同构成所谓之乳化软膏基质，其形成该等乳霜调配物之油分散相。

适用于本发明调配物之乳化剂及乳剂安定剂包括Tween^TM 60、Span^TM80、鲸蜡硬脂醇、苄醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯、及十二烷基硫酸钠。

调配物之适当油及脂肪的选择系根据达成所欲的化妆品特性。乳霜应较佳为不油腻、不染色、且可水洗之产品，具有适当之稠度而不会由管或其它容器渗漏。可使用直链或支链、单-或二碱性烷基酯(诸如，二-异己二酸酯、硬脂酸异十六烷酯、椰子脂肪酸之丙二醇二酯、肉荳蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸-2-乙基己酯、或是称为Crodamol CAP之支链酯混合物，最后三者为较佳的酯。此等酯可根据所需之特性而单独或结合使用。或者，可使用高熔点之脂质，诸如，白凡士林及/或液体石蜡或是其它矿物油。

适于进行眼之局部投药的调配物亦包括眼滴剂，其中该活性成分系溶解或悬浮于适当之载体中，特别是该活性成分之水性溶剂。该活性成分较佳系在此等调配物中以0.5至20％之浓度存在，较佳为0.5至10％，特别是约1.5％w/w。

适于进行口之局部投药的调配物包括糖锭，其在经调味之基质中包含该活性成分，该基质通常为蔗糖及阿拉伯胶或黄蓍胶；片剂，其在钝性基质中包含该活性成分，该基质诸如明胶及甘油，或是蔗糖及阿拉伯胶；以及漱口液，其在适当之液态载体中包含该活性成分。

用于进行直肠投与之调配物可以栓剂形式存在，结合适当之基质，包含，例如，可可脂或水杨酸。

适于进行肺内或经鼻投与之调配物具有，例如，0.1至500微米范围之颗粒大小(包括介于0.1及500微米间范围以微米增量之颗粒大小，诸如，0.5、1、30微米、35微米等)，其系借着经由鼻通道迅速吸入或是经口吸入以到达肺泡囊而投与。适当之调配物包括该活性成分之水性或油性溶液。适于进行气溶胶或干粉投与之调配物可根据习知之方法制备，且可与其它疗剂共同传递，诸如至今用于治疗或预防A或B型流感感染之化合物。

适于进行阴道投与之调配物可以子宫托、棉条、乳霜、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾调配物的形式存在，其在该活性成分外尚含有如技艺中已知为适用之诸等载体。

适于进行肠外投与之调配物包括水性及非水性之无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、以及使该调配物与目标接受者之血液等渗的溶质；以及水性及非水性之无菌悬浮液，。其可包括悬浮剂及增稠剂。

该等调配物系提供于单位剂量或多剂量之容器中，例如，密封安瓿及小瓶，且其可贮存在冷冻干燥(冻干)状态下，仅需在使用前实时加入无菌之液态载体，例如，注射用水。即席之注射溶液及悬浮液系由先前所述类型之无菌粉末、颗粒、及锭剂制备。较佳的单位剂量调配物系含有每日剂量或单位每日分次剂量，如上文所述，或是其适当部分之活性成分者。

应可明了，除了上文特别述及之成分外，本发明之调配物尚可包括其它技艺中习知与所述调配物类型相关之试剂，例如，适于进行口服投与者可包括调味剂。

本发明进一步提供兽医组合物，其包含至少一种如上文所定义之活性成分，结合其兽医用之载体。兽医用之载体系可用于投与组合物之目的的材料，且可为固体、液体、或气体材料，其在其它方面为钝性或是在兽医技艺中为可接受者，且其与该活性成分相容。此等兽医组合物可经口服、肠外、或任何其它所欲途径而投与。本发明之化合物可用于提供含有一或多种本发明化合物作为活性成分之医药调配物的受控释出(「控释调配物」)，其中该活性成分之释出系经控制或调控，以容许进行频率较低的投剂或是改良特定活性成分之医药动力学或毒性特征。活性成分之有效剂量至少取决于待治疗病况之性质、毒性、该化合物是以预防方式(较低剂量)使用或是用于对抗活动性流感感染、传递方法、以及医药调配物，且将可由临床医师使用习知之剂量累增试验而决定。其可预期为每天自约0.0001至约100mg/kg公斤体重。一般而言为每天自约0.01至约10mg/kg公斤体重。更一般而言为每天自约0.01至约5mg/kg公斤体重。更一般而言为每天自约0.05至约0.5mg/kg公斤体重。举例而言，就吸入而言，约70公斤体重之成人的每日候选剂量将会介于自1mg至1000mg，较佳为介于5mg及500mg间，且可以单或多剂之形式进行。

在一实施例中，本发明之活性成分亦用于结合其它活性成分。此等结合之选择系根据待治疗之病况、组成份之交叉反应性、以及该结合之药学特性。举例而言，在治疗呼吸系统之病毒感染时，特别系流感的感染，本发明之组合物可结合抗病毒剂(诸如，金刚胺(amantidine)、金刚乙胺(rimantadine)、及利巴韦林(ribavirin))、化痰剂、祛痰剂、支气管扩张剂、抗生素、解热剂、及止痛剂。一般而言，抗生素、解热剂、及止痛剂系与本发明之化合物共同投与。

本发明之另一实施例包括本文所述化合物之体内代谢产物，其条件为此等产物系新颖且对先前技艺而言系非显而易见者。此等产物可由，例如，经投与化合物之氧化、还原、水解、酰胺化、酯化、及其类似者而产生，主要是因为酵素作用。因此，本发明包括借着其中包含使本发明之化合物接触哺乳动物一段足以产生其代谢产物之时间的方法所产生之新颖及非显而易见的化合物。此等产物一般而言可藉由制备经放射标记(如，¹⁴C或³H)之本发明化合物，将其以可侦测之剂量对哺乳动物(诸如，大鼠、小鼠、豚鼠、猴)或人类进行肠外投与，给予足够之时间进行代谢(一般而言约30秒至30小时)，再由尿液、血液、或其它生物样本中分离其转化产物而辨识。此等产物因受到标记而可轻易分离(其它产物则可借着使用能够结合留存于该代谢物中之抗原表位的抗体而分离)。该等代谢物枝结构系以习知方式判定，如，藉由MS或NMR分析。一般而言，代谢物之分析系以熟习技艺者所熟知之习知药物代谢试验的相同方式进行。只要其在其它情形下并不存在于体内，该等转化产物可用于进行本发明化合物治疗投剂之诊断分析，即使其本身并不具有神经胺酸苷酶抑制活性。

其亦预期该等新颖膦酸酯同系物之前药。极性之膦酸基及胍基两者皆可视情况以技艺中所知之技术进一步官能化，以增进其药物动力学及/或药效学特性。举例而言，可调配及使用前药，如，酰氧甲基-及芳基膦酸酯，以用于增进其生物可利用率(Krise and Stella，Adv.Drug Deliv.Rev.1996，19，287)。

在本发明之一态样中，疑似含有神经胺酸苷酶之样本包括天然或人工材料，诸如活生物体；组织或细胞培养物；生物样本，诸如，生物材料样本(血液、血清、尿液、脑脊髓液、泪液、痰、唾液、组织样本、及其类似者)；实验室样本；食物、水、或空气样本；生物制品样本，诸如，细胞萃取物，特别是可合成所欲糖蛋白之重组细胞；及其类似者。一般而言，该样本将系疑似含有可制备神经胺酸苷酶的生物体，通常系病原性生物体，诸如病毒。样本可包含在任何基质中，包括水以及有机溶剂/水混合物。样本包括活生物体，诸如人类，以及人造材料，诸如细胞培养物。

本发明之处理步骤包含将本发明之组合物添加至该样本中，或者，其包含将该组合物之前体添加至该样本中。该添加步骤包含任何如上所述之投与方法。如需要，施用该组合物后之神经胺酸苷酶活性可以任何方法观察，包括侦测神经胺酸苷酶活性之直接及间接方法。判定神经胺酸苷酶活性之量性、质性、以及半量性皆为可预期者。一般而言其系应用上述之筛选方法之一，但是任何其它方法亦为可应用者，诸如观察活生物体之生理特性。

含有神经胺酸苷酶的生物体包括细菌(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、及Arthrobacter sialophilus)以及病毒(特别是正黏液病毒或副黏液病毒，诸如，流感病毒A(如，H1N1、H5N1)及B、副流感病毒、腮腺炎病毒、新城病病毒、鸡瘟病毒、及仙台病毒)。对于来自或是发现于任何此等生物体之神经胺酸苷酶活性的抑制属于本发明之标的范围中。流感病毒之病毒学述于″Fundamental Virology[基础病毒学]″(Raven Press，New York，1986)第24章。本发明之化合物可用于在动物(诸如，鸭及其它鸟类、鼠类、猪)或人类体内预防流感感染或是治疗既有之流感感染。

本发明之组合物可以任何用于评估酶活性之习知技术筛选其对抗神经胺酸苷酶之抑制活性。在本发明之内容中，一般而言，组合物首先在试管内进行对于神经胺酸苷酶之抑制的筛选，接着再对显示出抑制活性之组合物进行体内活性的筛选。具有小于约5x10^-6M之试管内Ki(抑制常数)的组合物，一般而言系小于约5x10^-7M，且较佳系小于约5x10^-8M者，系用于体内之较佳者。

可用之试管内筛选已经获得详述而将不在此处详尽说明(Itzstein，M.von et al.；″Nature″，363(6428)：418-423(1993)；Potier，M.；et al.；″Analyt.Biochem.″，94：287-296(1979)；Chong，A.K.J.；et al.；″Biochem.Biophys.Acta″，1077：65-71(1991)；及Colman，P.M.；et al.；国际专利公开案号WO92/06691(国际专利申请案号PCT/AU90/00501，公开日1992年4月30日)。

体内之筛选亦已经获得详述，参见，例如，Itzstein，et al.，1993，特别是第421页第2栏第一完整段落至第423页第2栏第一部分段落，以及Colman，p.36。本发明之NAIs已接受其对抗各种流感病毒神经胺酸苷酶之抑制活性的试验。表1显示对抗野生型及突变型流感病毒神经胺酸苷酶之抑制活性。

表1：^a取自流感病毒A/WSN/1933(H1N1)之神经胺酸苷酶(NA)。^b取自流感病毒A/WSN/1933(H1N1)之NA(H274Y)。^c取自流感病毒A/Hanoi/30408/2005(H5N1)之NA。^d取自流感病毒A/Hanoi/30408/2005(H5N1)之NA(H274Y)。^e呈图3所述之铵盐。^f未测定。

在H1N1及H5N1流感病毒的野生型神经胺酸苷酶中，观察到膦酸酯同系物3(零流感)相对于奥司他伟2以及胍13b相对于13a之较大强度(表1)。对于NAI抗性突变体H274Y7，化合物3及2两者之强度皆显著低于对于野生型酶者。然而，膦酸酯化合物13b系可以低nM浓度抑制两种突变酶的有效抑制剂。化合物14a及14b(其在C-3羟基位置缺乏戊氧基)相较于2及3显示较低的NAI活性。表2显示奥司他伟2、膦酸酯同系物3、以及相关类似物之神经胺酸苷酶抑制、抗流感、以及细胞毒性活性。

Cmpd	Ki(nM)a	EC50(nM)b	CC50(μM)c	S.I.d
					2	2.90(±0.30)	31.3(±3..5)	＞100	＞3200
3e	0.15(±0.02)	4.67(±0.68)	74(±5.7)	15800
					13a	2.02(±0.25)	5.60(±1.2)	＞100	＞17800
13be	0.06(±0.01)	0.09(±0.02)	～5	～56000

表2：^a对抗流感病毒A/WSN/1933(H1N1)之神经胺酸苷酶抑制作用。

Ki值系使用Cheng-Prusoff方程式测定。^b对于因为流感(A/WSN/1933)感染所造成之CPE效应具有50％保护力之NA抑制剂浓度。^c在于MDCK细胞上所进行的细胞毒性分析中所用之最高浓度为100μM。^d选择性指数，CC₅₀对EC₅₀之比值。^e呈图3所述之铵盐。

在本发明之一实施例中，膦酸酯3系一种强效之NA抑制剂以及对抗流感H1N1病毒之抗流感剂，其具有0.15及4.67nM之Ks及EC₅₀值(表2)。相较而言，膦酸酯3在NA抑制及抗流感分析中之活性分别为奥司他伟之19及7倍。以多种浓度进一步评估膦酸酯3，以测定其对于宿主MDCK细胞之生长抑制。膦酸酯3之推论CC₅₀值为74μM。显示具有大于15800之选择性指数的膦酸酯3因此唯一种对抗H1N1病毒之强效抗病毒剂，并对于宿主MDCK细胞不具有毒性。借着将3中之胺基置换成为胍基，膦酸酯13b具有增强之NA抑制作用(Ki＝0.06nM)及抗流感活性(EC₅₀＝0.09nM)。类似先前之报告，胍基可与Glu119、Asp151及Glu227产生强静电作用。

在一态样中，相较于其羧酸酯同系物，本实验中所述之膦酸酯同系物皆可显著更强效的对抗H1N1及H5N1的野生型神经胺酸苷酶。此外，化合物13b在19nM下是一种可对抗H5N1神经胺酸苷酶之H274Y突变物的有效抑制剂。

在本发明之另一实施例中，本发明之化合物是用于在体内治疗流感感染。在小鼠体内试验本发明之NAIs。每日两次经口强饲，以指定剂量之药物处理小鼠共5天。在第一次药物投剂4小时后，以25μL中之10MLD₅₀的感染性流感病毒[A/WSN/33(H1N1)或NIBRG-14(H5N1)]于鼻内对小鼠进行接种。每日观察小鼠之存活及体重共14天。表3显示化合物3及3b以及克流感之处理对于小鼠体内A/WSN/33(H1N1)流感病毒感染之作用。

化合物	剂量(mg/kg/天)a	存活者％b	平均至死天数c
				控制组		0(0)b	4.6
1(克流感)	10	0(100)b	9.8
					1	0(40)b	7.1
	0.1	0(20)b	6.4
					0.01	0(0)b	5.6
3	10	90(100)b	11
					1	50(100)b	9.8
	0.1	0(100)b	9.3
					0.01	0(10)b	4.7
3b	10	0(100)b	9.6
					1	0(100)b	8.9
	0.1	0(60)b	7.8
					0.01	0(30)b	7.0

表3

^a化合物是每日两次经口投与共5天，从以所指流感病毒感染前4小时开始。

^b存活者数目/总处理数目。第一个数字代表第14天之存活百分比，而括号内之数字代表第7天之存活百分比。

^c在第14天前死亡之小鼠的平均至死天数。

化合物3及3b以及克流感之对于小鼠体内NIBRG-14(H5N1)流感A病毒感染之处理作用示于表4。

化合物	剂量(mg/kg/天)a	存活者％b	平均至死天数c
				控制组		0(0)b	3.9
1(克流感)	10	10(100)b	9.4
					1	0(40)b	7.6
	0.1	0(0)b	5.3
					0.01	0(0)b	5.3
3	10	10(100)b	9.1
					1	0(60)b	8.7
	0.1	0(0)b	5.6
					0.01	0(0)b	5.7
3b	10	0(100)b	9.5
					1	0(20)b	7.3
	0.1	0(0)b	5.3
					0.01	0(0)b	4.9

表4

^a化合物是每日两次经口投与共5天，从以所指流感病毒感染前4小时开始。

^b存活者数目/总处理数目。第一个数字代表第14天之存活百分比，而括号内之数字代表第7天之存活百分比。

^c在第14天前死亡之小鼠的平均至死天数。

借着将化合物3对接至流感病毒神经胺酸苷酶(N1亚型，PDB编码：2HU4)之晶体结构中，建构复合NA之化合物3的分子模拟。以SYBYL 7.3修饰奥司他伟2之3-D结构(亦来自于2HU4)，建立化合物3之3-D结构。在本发明之一态样中，神经胺酸苷酶-膦酸酯复合物之分子模拟指出该膦酸酯与活性位点中之三个精胺酸残基的适当结合模式。使用已知N1晶体结构(PDB编码：2HU4)之初步分子对接实验(图1)揭露，除了类似NA-奥司他伟复合物之在结合袋中由该C₃-戊氧基、C₄-乙酰胺基、及C₅-胺基所产生的其它作用外，该推定之膦酸酯抑制剂3a尚的确可强力结合NA之三-精胺酸残基。图1显示奥司他伟2(A)以及膦酸酯化合物3a(B)在流感病毒神经胺酸苷酶(N1亚型)之活性位点的分子模型。膦酸酯化合物3a之复合物与NA活性位点中之重要残基具有较奥司他伟-NA复合物(6对配位体-NA之H-键)更为大量之氢键作用(8对配位体-NA之H-键)。

本文亦揭示用以进行克流感以及高度强效神经胺酸苷酶抑制剂零流感的合成的新颖及改良方法。如前文所述，克流感(磷酸奥司他伟，15-H₃PO₄)，一种用于流感治疗之热门药物，是一种口服投与之前药，其可由肝酯酶轻易水解，以产生对应之羧酸(16，图6)作为流感病毒上神经胺酸苷酶之活性抑制剂。由于克流感的副作用会造成青少年病患产生精神病症，并产生禽流感之药物抗性菌株，在对抗大流行性流感威胁的战役中，急需研发能够对抗流感病毒的新颖化学物。摘述于下文的合成于图4中完整呈现：

零流感(3)是一种可用于对抗禽流感及人流感两者之有望药物。借着以膦酰基置换奥司他伟中之羧基，零流感可与神经胺酸苷酶之三-精胺酸残基强力作用，且其可更为强效对抗H1N1及H5N1病毒的野生型神经胺酸苷酶。此外，其胍类似物3b是H5N1病毒神经胺酸苷酶之H274Y突变体之有效抑制剂(Ki＝19nM)。同时，初步试验指出，零流感亦具口服生物可利用性而保护小鼠对抗流感病毒之致命挑战。接由比较小鼠之存活率及平均存活时间(数据未显示)，就对抗H1N1人类流感病毒而言，零流感较克流感更为有效，且就对抗重组H5N1(NIBRG14)病毒而言，其至少为同样有效。

化合物3及13之单酯衍生物亦已被证明对于流感特别有效。如表5所示，小鼠试验显示，单酯化合物3c及13c可有效治疗具有流感之小鼠。表5显示以克流感(1)、零流感(3)、零流感单酯(3c)、零流感胍(13b)、及零流感胍单酯(13c)所进行的鼻内治疗对于小鼠体内流感A[A/WSN/33(H1N1)]病毒感染的作用。单酯3c及13经显示为特别有效者，具有改善之存活率以及较低浓度下之功效。

表5

^a化合物是每日两次经口投与共5天，从以所指流感病毒感染前4小时开始。

^b存活者数目/总处理数目(10只小鼠)。第一个数字代表第14天之存活百分比，而括号内之数字代表第7天之存活百分比。

^c在第14天前死亡之小鼠的平均至死天数。

图17-20以图式说明单酯化合物3c及13c相较于化合物3及13b之功效。该等化合物显示较佳的存活率以及较佳的体重维持。此种倾向可见于自10mg/kg/天至0.1mg/kg/天之浓度范围内。在较低的浓度下(图20)，该等单酯与化合物3及13b同样无效，且其密切近似控制组之结果，其因此建议，在此等低浓度下，该等膦酸酯同系物之有益作用可能丧失。

实例

所有的反应试剂皆为可由市售取得，且其不经进一步之纯化即予使用，除非另有明示。所有的溶剂皆为无水级，除非另有明示。偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)系在减压条件下于Na₂SO₄上蒸馏而纯化。所有的非水性反应皆系在于弱正压氩气下于烘箱中干燥之玻璃器皿内进行，除非另外注明。反应经磁搅拌，并在硅胶上以薄层层析监测。闪蒸层析系在60-200μm颗粒大小之硅胶上进行。产率系针对光谱纯性化合物报告。熔点系在Electrothermal MEL-

1101D熔点装置上记录且不经校正。NMR光谱系在Bruker AVANCE 600及400光谱仪上记录。化学位移系以相对于四甲基硅烷(TMS)之δ值提供；偶合常数J系以Hz单位提供。¹H-NMR光谱之内部标准物为CDCl₃(δ_H＝7.24)或D₂O(δ_H＝4.79)，¹³C-NMR光谱为CDCl₃(δ_H＝77.0)，而³¹P-NMR光谱则为D₂O中之H₃PO₄(δ_P＝0.00)。分裂模式报告为s(单峰)，d(双重峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(宽峰)，及dd(双重之双重峰)。IR光谱系在Thermo Nicolet 380FT-IR光谱仪上记录。旋光度系在Perkin-Elmer Model 341旋光仪上纪律，[α]及c之单位分别为deg cm³ g^-1 dm^-1及gcm^-3。高分辨率ESI质谱系在BrukerDaltonics光谱仪上记录。

合成流程及产物定性

实例1.1，2-O-异亚丙基-3-胺基-3-脱氧-α-D-核呋喃糖苷(5)(Nair，andEmanuel，J.Am.Chem.Soc.1977，99，1571-1576)

根据先前报告之流程(Suhara et al.，J.Org.Chem.2001，66，8760-8771)，将D-木糖(50g)、无水CuSO₄(70g)及浓H₂SO₄(5mL)于丙酮(1L)中之悬浮液，在室温下搅拌24h，接着再在40℃下，于HCl水溶液(110mL，0.1M)中部分水解2h，以产生呈无色糖浆状之1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃木糖(4，61g)。在0℃下，于吡啶(50mL)中，以新戊酰氯(6.6g，54.8mmol)对化合物4(10g，52.6mmol)进行处理8小时，以产生呈无色油体之1，2-O-异亚丙基-5-O-新戊酰基-α-D-呋喃木糖苷(13g，自D-木糖之产率85％)。

将重铬酸吡啶鎓(PDC，8.92g，23.7mmol)及AC₂O(12.2mL，130mmol)加入CH₂Cl₂(160mL)中之该新戊酰基酯(10.8g，39.4mmol)中。在回流温度下加热该混合物1.5h，接着再在减压条件下进行浓缩。将该残余物溶于EtOAc(30mL)中，再使其通过硅胶垫过滤，以EtOAc溶析。浓缩该滤液，并与甲苯进行共蒸发(2x)以除去AC₂O。在60℃下，于无水吡啶(75mL)中，使该粗制酮产物(10.2g)与盐酸羟胺(18.15g，260mmol)共同搅拌24h。在减压条件下浓缩该混合物，再将该残余物溶于EtOAc中。以水清洗该有机层，再以EtOAc萃取该水层(3x)。以MgSO₄对结合之有机层进行去水，过滤，再进行浓缩。在硅胶上以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，1∶3)纯化该残余油体，以产生呈顺式/反式异构物混合物(70∶30)之对应肟(9.27g，两步骤之产率82％)。无色油体；TLC(EtOAc/己烷，1∶4)R_f＝0.4；[α]_D ²⁰＝+162.5(c＝1，CHCl₃)；IR(净)3501，2988，1769，1292cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)(顺式/反式异构物＝7∶3)δ8.05(0.3H，br s)，7.97(0.7H，br s)，5.98(0.7H，d，J＝4.3Hz)，5.96(0.3H，d，J＝4.3Hz)，5.27-5.25(1H，m)，4.99(1H，dd，J＝4.2，1.3Hz)，4.97-4.96(0.3H，m)，4.55(0.7H，dd，J＝11.1，2.6Hz)，4.33(0.3H，dd，J＝11.1，2.6Hz)，4.23-4.20(1H，m)，1.47(3H，s)，1.42(3H，s)，1.16(9H，s)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ178.1/177.9，158.4/157.3，114.2/113.7，105.0/104.8，78.4/73.5，75.8/75.6，38.7/38.6，27.7，27.4，27.3，27.2，27.19，27.15；C₁₃H₂₂NO₆(M⁺+H)之HRMS计算值：288.1444，实验值：m/z 288.1452。

在冰(0℃)THF(60mL)中搅拌该肟(2.88g，10mmol)，再加入LiAlH₄(1.0M溶液于THF中，25mL，25mmol)。使该混合物回流3h，在室温下搅拌12h，接着再以EtOAc淬灭。使该混合物通过硅藻土过滤。浓缩该滤液，再在硅胶上以闪蒸管柱层析(MeOH/CH2Cl2，1∶9)纯化该残余油体，以产生呈黄色糖浆状之胺5(1.67g，88％)。TLC(MeOH/CH₂Cl₂，1∶9)Rf＝0.1；[α]_D ²⁰＝+54.6(c＝1，CHCl₃)[lit._s1[α]_D ²⁵＝+41(c＝1.15，CH₃OH)]；IR(净)3359，2911，1756，1298cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ5-77(1H，d，J＝3.7Hz)，4-45(1H，dd，J＝4.2，2.1Hz)，3.87(1H，dd，J＝11.8，3.7Hz)，3.77-3.70(2H，m)，3.17(1H，dd，J＝9.5，4.6Hz)，1.52(3H，s)，1.35(3H，s)；¹³C NMR(150MHz，CDCl3)δ112.1，104.3，80.7，80.6，61.5，55-2，26.6，26.4；C₈H₁₆NO₄(M⁺+H)之HRMS计算值：190.1079，实验值：m/z 190.1080。

实例2.O-苄基-2，3-O，N-异亚丙基-3-乙酰胺基-3-脱氧-α-D-核呋喃糖苷(6)

在室温下，在吡啶(10mL)中，将胺5(1.67g，8.8mmol)与Ac₂O(5mL)搅拌3h。加入MeOH(5mL)以淬灭反应。浓缩该混合物，并与甲苯进行共蒸发(3x)，以除去AC₂O及吡啶。由EtOAc使该残余固体样本再结晶，以产生乙酰化产物(2.35g)。以HCl(4.0M)于1，4-二恶烷(7.5mL，30mmol)中之溶液，处理该乙酰化产物及苯甲醇(5.84g，54mmol)于甲苯(16mL)中之冰溶液(0℃)，并在室温下搅拌24h。将该反应混合物倒入Et₂O(100mL)，并以0℃之饱和NaHCO₃溶液(80mL)中和。分离有机层，并以水(3x)及盐水清洗。以Et₂O(6x)萃取结合之水洗液。结合有机萃取液，以MgSO₄去水，过滤，并在减压条件下浓缩。在硅胶上以闪蒸管柱层析(MeOH/CH₂Cl₂，1∶19)纯化该残余油体，以产生2.10g(两步骤之产率85％)呈异位异构物混合物(α/β＝7∶3)(如以¹H NMR分析所示)之二醇产物O-苄基-3-乙酰胺基-3-脱氧-α-D-核呋喃糖苷。在硅胶上再次层析(MeOH/CH₂Cl₂，1∶99)以取得α-异位异构物之分析样本，R_f＝0.2。无色固体，mp 95-97℃；[α]_D ²⁰＝-72.8(c＝0.5，CHCl₃)；IR(净)3487，2955，1712，1265cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ7.35-7.27(5H，m)，6.38(1H，d，J＝8.0Hz)，4.74(1H，d，J＝11.9Hz)，4.52(1H，d，J＝11.9Hz)，4.24(1H，dd，J＝7.9，3.1Hz)，3.99(1H，d，J＝12.4Hz)，3.92(1H，s)，3.74-3.71(2H，m)，3.41(1H，br s)，3.00(1H，br s)，2.01(3H，s)；¹³C NMR(150MHz，CDCl3)δ170.1，136.9，128.5(3x)，128.0(2x)，98.9，69.8，69.1，68.4，63.6，46.3，23.4；C₁₄H₂₀NO₅(M⁺+H)之HRMS计算值：282.1341，实验值：m/z 282.1343。

在80℃下，将该二醇(2.10g，7.5mmol，为α/β异位异构物之混合物)、2，2-二甲氧基丙烷(10mL)、及对-甲苯磺酸单水合物(～0.2g)于甲苯(20mL)中之溶液搅拌4小时。在减压条件下浓缩该混合物，再自Et₂O使该残余物再结晶，以产生呈异位异构物混合物(α/β＝7∶3)(如以¹H NMR分析所示)之醇6(2.17g，90％)。在硅胶上再次层析(EtOAc/己烷，1∶9)以取得α-异位异构物之分析样本。无色晶体，mp 82-85℃；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.35；[α]_D20＝-125.6(c＝1，CHCl₃)；IR(净)3501，2988，1732，1288cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃，两滞留物(1∶1))δ7.36-7.27(5H，m)，5.20(0.5H，s)，5.15(0.5H，s)，4.74(0.5H，d，J＝11.6Hz)，4.68(0.5H，d，J＝11.6Hz)，4.64(0.5H，d，J＝5.9Hz)，4.61(0.5H，dd，J＝5.9，2.5Hz)，4.59-4.57(1.5H，m)，4.45(0.5H，d，J＝11.6Hz)，4.34-4.33(0.5H，m)，4.22(0.5H，dd，J＝8.1，4.0Hz)，4.02(0.5H，d，J＝9.1Hz)，3.81-3.74(1H，m)，3.69-3.66(1H，m)，2.72(0.5H，dd，J＝9.1，2.6Hz)，2.14(1.5H，s)，2.06(1.5H，m)，1.67(1.5H，s)，1.63(1.5H，s)，1.53(1.5H，s)，1.52(1.5H，s)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ167.6/167.3，136.5/136.1，128.7/128.6(2x)，128.4/128.29，128.27/128.1(2x)，106.2/105.0，98.2/95.7，89.2/89.1，84.2/82.4，70.4/69.4，65.1/61.7，64.4，28.2/26.3，26.0/24.4，24.2/21.9；C₁₇H₂₃NNaO₅(M⁺+Na)之HRMS计算值：344.1474，实验值：m/z 344.1477。

实例3.(O-苄基-2，3-O，N-异亚丙基-3-乙酰胺基-3，5，6-三脱氧-6-二乙氧基磷酰基-D-核-庚呋喃糖苷)糖醛酸乙酯(7a)

在-15℃下，搅拌醇6(2.17g，6.76mmol)及吡啶(1.2mL，14.73mmol)于CH₂Cl₂(20mL)中之溶液，同时以30min之时间，逐滴加入三氟甲磺酸酐(Tf₂O，1.49mL，8.86mmol)。在-15℃下再搅拌该混合物2h，以MeOH(1mL)淬灭，在顺序以冰水及冰KH₂PO₄水溶液(1M)清洗。以EtOAc(3x)萃取该水层。以MgSO₄对结合之有机层进行去水，过滤，浓缩，再与甲苯进行共蒸发以除去吡啶。该粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤。

在氮气大气下，以无水己烷(3x)清洗NaH(0.41g，10.2mmol；60％分散液于油中)，加入DMF(30mL)，再在冰浴中于0℃下搅拌。以30min之时间，逐滴加入膦酰基乙酸三乙酯(1.95g，10.9mmol)于DMF(10mL)中之溶液。除去冰浴，再搅拌该混合物2h，以产生澄清之黄色溶液。接着加入DMF(10mL)中之上文所制备的三氟甲磺酸酯(3.06g，～6.76mmol)，接着加入2滴之15-冠醚-5。在室温下搅拌该所得之溶液24h，冷却至0℃，再以KH₂PO₄水溶液(1M溶液)淬灭。以CH₂Cl₂(5x)萃取该混合物。以水清洗该结合之有机层，以MgSO₄去水，过滤，再在减压条件下浓缩。在硅胶上以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷梯度，1∶4至1∶1)纯化该残余棕色油体，以产生呈α/β异位异构物混合物之产物7a(2.85g，自6之产率80％)。

在硅胶上再次层析(EtOAc/己烷，1∶4)以取得α-异位异构物之分析样本。TLC(MeOH/CH2Cl2，1∶19)R_f＝0.2；¹H NMR(600MHz，CDCl₃，呈非镜像异构物之旋转异构物)δ7.33-7.26(5H，m)，5.15(1H，s)，4.74(1H，d，J＝11.9Hz)，4.68(1H，d，J＝5.8Hz)，4.46(1H，d，J＝11.9Hz)，4.29-4.19(4H，m)，4.12-4.05(3H，m)，4.00(1H，d，J＝12.4Hz)，3.41(1H，dd，J＝12.4，10.3Hz)，2.45-2.35(1H，m)，2.22-2.18(1H，m)，2.12(3H，s)，1.60(3H，m)，1.48(3H，s)，1.31-1.24(9H，m)；C₂₅H₃₉NO₉P(M⁺+H)之HRMS计算值：528.2362，实验值：m/z 528.2366。

实例4.O-苄基-2，3-O，N-异亚丙基-3-乙酰胺基-3，5，6-三脱氧-6，6-双(二乙氧基磷酰基)-D-核-己呋喃糖(7b)

藉由类似7a之流程，在DMF(35mL)中，以NaH(0.31g，7.75mmol；60％分散液于油中)对亚甲基二膦酸四乙酯(3.14g，10.9mmol)进行处理2h，接着在15-冠醚-5(2滴)之存在下，与醇6之三氟甲磺酸酯反应。在室温下搅拌该反应混合物24h，逐步进行，再在硅胶上以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷梯度，1∶4至1∶1)纯化，以产生呈α/β异位异构物混合物之产物7b(2.16g，自6之产率73％)。在硅胶上再次层析(MeOH/CH₂Cl₂，1∶99)以取得α-异位异构物之分析样本。TLC(MeOH/CH₂Cl₂，1∶19)Rf＝0.14；¹H NMR(600MHz，CDCl₃，为两旋转异构物)δ7.37-7.27(5H，m)，5.15(1H，s)，4.79-4.74(1H，m)，4.69-4.67(1H，m)，4.59-4.57(1H，m)，4.49-4.44(2H，m)，4.22-4.04(8H，m)，2.86-2.76(1H，m)，2.47-2.35(1H，m)，2.30-2.21(1H，m)，2.11(3H，s)，1.61(3H，s)，1.50(3H，s)，1.33-1.29(12H，m)；C₂₆H₄₃NNaO₁₀P₂(M⁺+Na)之HRMS计算值：614.2260，实验值：m/z614.2268。

实例5.(3S，4R，5R)-3，4-O，N-异亚丙基-4-乙酰胺基-3，5-二羟基-1-环己烯-1-羧酸乙酯(8a)

在氢气大气下，于室温，在乙醇(30mL)中，与Pd/C(0.5g)共同搅拌24h，以对膦酸酯7a(2.85g，5.4mmol)进行氢解。使该混合物通过硅藻土过滤，再浓缩该滤液，以产生呈浅黄色糖浆状之目标乳醇(2.36g)。在氮气大气下，将乳醇(2.36g)于THF(10mL)中之溶液逐滴加入NaH(7.0mmol；0.28g之60％油分散液，经己烷预洗三次)于THF(20mL)中之悬浮液中。在室温下搅拌该混合物1h以完成该分子内之Wittig-Horner-Emmons反应。将该混合物冷却至0℃，以KH₂PO₄水溶液(1M溶液)淬灭，再以CH₂Cl₂(5x)萃取。以MgSO₄对结合之有机层进行去水，过滤，再在减压条件下浓缩。以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，1∶1)纯化该残余物，以产生呈无色油体的环己烯羧酸酯8a(1.27g，自7a之产率83％)。TLC(EtOAc)R_f＝0.3；[α]_D ²⁰＝-15.6(c＝2.6，CHCl₃)；IR(净)3492，1769，1655，1221cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃，为两旋转异构物)δ7.07(0.8H，d，J＝3.4Hz)，6.99(0.2H，d，J＝3.4Hz)，4.61(0.8H，d，J＝5.9Hz)，4.56(0.8H，d，J＝5.9Hz)，4.47(0.2H，dd，J＝6.0，3.4Hz)，4.28-4.19(3H，m)，4.47(0.8H，dd，J＝6.0，3.4Hz)，3.03(0.8H，dd，J＝18.0，2.8Hz)，2.84(0.2H，dd，J＝18.0，2.8Hz)，2.38-2.27(1H，m)，2.19(0.6H，s)，2.14(2.4H，s)，2.09(0.8H，d，J＝9.2Hz)，1.98(0.2H，d，J＝9.2Hz)，1.70(3H，s)，1.62(3H，s)，1.31-1.27(3H，m)；¹³CNMR(150MHz，CDCl₃)δ168.0/167.4，166.1/165.9，132.2/131.8，131.4/130.7，95-8/93-7，68.7/68.4，64.2/62.6，61.3/61.1，59.6/59.3，31.1/30.6，27.4/25.1，26.3/23.8，23.2/22.6，14.1；C₁₄H₂₂NO₅(M⁺+H)之HRMS计算值：284.1498，实验值：m/z 284.1500。

实例6.(3S，4R，5R)-3，4-O，N-异亚丙基-4-乙酰胺基-3，5-二羟基-1-环己烯-1-膦酸二乙酯(8a)

在氢气大气下，于室温，在乙醇(35mL)中，将双膦酸酯7b(3.55g，6mmol)与Pd/C(1g)共同搅拌24h。使该混合物通过硅藻土过滤，再将乙醇钠(25mL，21％于乙醇中)加入该滤液中。搅拌该反应混合物5h，以饱和NH₄Cl水溶液淬灭，再在减压条件下浓缩。以CH₂Cl₂(3x)萃取该水层。以MgSO₄对结合之有机相进行去水，过滤，再进行浓缩。以闪蒸管柱层析(MeOH/CH₂Cl₂，1∶99)纯化该残余物，以产生呈无色油体的环己烯膦酸酯8b(1.67g，80％)。

实例7.(3S，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-羟基-1-环己烯-1-羧酸乙酯(9a)

在室温下，将8a(1.27g，4.5mmol)、三苯膦(2.36g，9.0mmol)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，1.82g，9.0mmol，新鲜蒸馏)、及叠氮磷酸二苯酯(DPPA，2.48g，9.0mmol)于THF(40mL)中之溶液搅拌48h。在减压条件下旋转蒸发以除去溶剂，再以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，1∶3)纯化该残余物，以产生具有5S构形之对应叠氮化物(1.21g，产率87％)。无色固体，mp91-93℃；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.4；[α]_D ²⁰＝+61.07(c＝3.2，CHCl₃)；IR(净)2101，1749，1655，1261cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃，为两旋转异构物)δ6.92-6.91(1H，m)，4.57-4.56(1H，m)，4.24-4.19(2H，m)，3.71-3.66(2H，m)，3.02(1H，dd，J＝15.4，3.8Hz)，2.26(3H，s)，2.23-2.19(1H，m)，1.66(3H，s)，1.62(3H，s)，1.28(3H，t，J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ168.8，165.1，133.3，132.0，95.9，70.8，61.4，60.7，60.1，29.9，27.8，24.2，23.7，14.1；C₁₄H₂₁N₄O₄(M⁺+H)之HRMS计算值：309.1563，实验值：m/z 309.1562。将乙醇(20mL)中之该叠氮化物(1.21g，3.93mmol)与HCl水溶液(5mL，1M)在回流温度下共同加热1h。在减压条件下浓缩该混合物，再以闪蒸管柱层析(EtOAc)纯化该残余物，以产生产物9a(1.01g，产率95％)。无色固体，mp 51-53℃；TLC(EtOAc)R_f＝0.3；[α]_D ²⁰＝+83.0(c＝1，CHCl₃)；IR(净)3491，2105，1722，1655，1251cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.86(1H，s)，6.21(1H，d，J＝8.1Hz)，4.42(1H，d，J＝3.5Hz)，4.19(2H，q，J＝7.1Hz)，4.11-4.07(1H，m)，3.79-3.74(1H，m)，2.86(1H，dd，J＝18.1，5.1Hz)，2.33(1H，dd，J＝18.1，8.7Hz)，2.04(3H，s)，1.27(3H，t，J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ171.1，165.8，136.1，130.4，64.8，61.3，56.3，52.1，29.6，23.3，14.1；C₁₁H₁₇N₄O₄(M⁺+H)之HRMS计算值：269.1250，实验值：m/z 269.1253。

实例8.(3S，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-羟基-1-环己烯-1-膦酸二乙酯(9b)

藉由类似9a之流程，在室温下，以THF(45mL)中之Ph₃P(2.42g，9.2mmol)、新鲜蒸馏之DIAD(1.86g，9.2mmol)、及DPPA(2.54g，9.2mmol)处理化合物8b(1.67g，4.8mmol)，在以闪蒸管柱层析(60％EtOAc/己烷，3∶2)纯化后，产生对应之叠氮化物产物(1.39g，产率78％)。接着在回流之EtOH/HCl(1M水溶液)中进行水解，产生目标产物9b(1.18g，产率95％)，其直接用于制备10b。

实例9.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-羟基-1-环己烯-1-羧酸乙酯(10a)

在9a(53.7mg，2mmol)及吡啶(1.3mL，16mmol)于CH₂Cl₂(10mL)中之冰(-15℃)溶液中，逐滴加入CH₂Cl₂(5mL)中之Tf₂O(0.67mL，4mmol)，再在-15～-10℃下搅拌2h。以KH₂PO₄水溶液(1M溶液，2x)、饱和NaHCO₃水溶液、水、及盐水清洗该混合物。以MgSO₄对有机层进行去水，再在真空下浓缩，以产生对应之三氟甲磺酸酯(0.82g)。在40℃下，于无水DMF(40mL)中，将该三氟甲磺酸酯与KNO₂(85.6mg，10mmol)及18-冠醚-6(3滴)共同搅拌24h。在反应结束时，以CH₂Cl₂稀释该混合物，再以盐水清洗。以MgSO₄对有机层进行去水，再在减压条件下浓缩。以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，4∶1)纯化该残余物，以产生具有3R构形之产物10a(0.3752g，产率70％)。无色固体，mp 40-42℃；TLC(EtOAc)R_f＝0.35；[α]_D ²⁰＝+45.5(c＝0.6，CHCl₃)；IR(净)3501，2101，1699，1538，1214cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.80(1H，d，J＝2.4Hz)，5.97(1H，br s)，5.20(1H，d，J＝3.2Hz)，4.38(1H，d，J＝3.2Hz)，4.21(2H，q，J＝7.2Hz)，3.65-3.57(2H，m)，2.95(1H，dd，J＝16.3，4.3Hz)，2.45-2.40(1H，m)，2.09(3H，s)，1.28(3H，t，J＝7.2Hz)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ173.7，165.6，138.3，127.8，71.2，61.3，57.9，57.5，29.5，23.2，14.1；C₁₁H₁₇N₄O₄(M⁺+H)之HRMS计算值：269.1250，实验值：m/z269.1257。

实例10.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-羟基-1-环己烯-1-膦酸二乙酯(10b)

藉由类似10a之流程，在-15～-10℃下，将上文所制备之化合物9b(1.18g，3.55mmol)，与CH₂Cl₂(10mL)中之Tf₂O(1.2mL，7.1mmol)及吡啶(2.3mL，28.5mmol)共同搅拌2h，以产生对应之三氟甲磺酸酯(1.65g)，其接着在40℃下，于无水DMF(50mL)中，以KNO₂(1.52g，17.3mmol)及18-冠醚-6(3滴)处理，以产生具有3R构形之产物10b(83.8mg，产率71％)。无色油体；TLC(MeOH/CH₂Cl₂，1:9)R_f＝0.2；[α]_D ²⁰＝-11.3(c＝2.0，CDCl₃)；IR(净)3499，2108，1755，1634，1240cm^-1；₁H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.56(1H，d，JP-2＝19.4Hz)，6.13(1H，d，J＝5.2Hz)，4.95(1H，br s)，4.35(1H，dd，J＝5.5，3.4Hz)，4.12-4.05(4H，m)，3.74-3.70(1H，m)，3.64-3.60(1H，m)，2.79-2.74(1H，m)，2.36-2.30(1H，m)，2.07(3H，s)，1.32(6H，t，J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ172.7，142.3，125.5(C-1，d，J_P-1＝184Hz)，71.5，62.5，62.3，57.9，57.5，29.9，23.4，16.39，16.35；³¹P NMR(162MHz，CDCl₃)δ16.54；C₁₂H₂₁N₄NaO₅P(M⁺+Na)之HRMS计算值：355.1147，实验值：m/z 355.1152。

实例11.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸乙酯(11a)(Rohloff et al.，J.Org.Chem.1998，63，4545-4550.)

如下制备三氯乙酰亚胺酸-3-戊酯。在氮气大气下，将3-戊醇(8.815g，100mmol)于无水Et₂O(14mL)中之溶液，逐滴加入悬浮于Et₂O(10mL)中之NaH(0.4g，10mmol；60％油分散液，经己烷预洗)中。在室温下搅拌该混合物10min，再在氮气大气下，以20min之时间，逐滴加至三氯乙腈(15mL，150mmol)于Et₂O(20mL)中之冰(-5℃)溶液中。使该混合物回温至室温，并搅拌2h。在除去溶剂后，以MeOH/己烷(1∶19，10mL)研制该残余物，并剧烈搅拌1min，以产生沈淀物，将其滤出，并以冰己烷清洗。在减压条件下将该滤液蒸发至干，产生呈浅棕色油体之三氯乙酰亚胺酸-3-戊酯(16g，产率70％)。TLC(EtOAc/己烷，1∶4)R_f＝0.3；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ8.17(1H，br s，NH)，4.89(1H，m，J＝6.0Hz)，1.69(4H，qd，J＝7-4，6.0Hz)，0.94(6H，t，J＝7A Hz)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ162.7，92.2，81.9，25.7(2x)，9.4(2x)；C₇H₁₃Cl₃NO(M⁺+H)之HRMS计算值：232.0063，实验值：m/z 232.0067。在氮气大气下，将该新鲜制备之三氯乙酰亚胺酸-3-戊酯(350mg，1.5mmol)及CF₃SO₃H(13μL，0.15mmol)加至醇10a(321mg，1.2mmol)于CH₂Cl₂(15mL)中之溶液中。在室温下搅拌该反应混合物24h，其中每4小时加入更多之亚胺酸酯及CF₃SO₃H(350mg及13μL mmol)共五5次。以NaHCO₃水溶液(5％)淬灭反应，以CH₂Cl₂(2x)萃取水层。以盐水清洗结合之有机相，以MgSO₄去水，再在真空下浓缩。以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，3∶7)纯化该残余物，以产生烷基化产物11a(317mg，产率78％)。无色固体，mp 115-117℃；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.4；[α]_D ²⁰＝-48.9(c＝1.1，CHCl₃)；IR(净)2101，1712，1655cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.75(1H，s)，5.98(1H，d，J＝7.4Hz)，4.53(1H，d，J＝5.0Hz)，4.51-4.16(3H，m)，3.33-3.28(2H，m)，2.82(1H，dd，J＝17.6，5.6Hz)，2.22-2.16(1H，m)，2.00(3H，s)，1.49-1.45(4H，m)，1.25(3H，t，J＝7.1Hz)，0.95-0.80(6H，m)；₁₃C NMR(150MHz，CDCl₃)δ171.1，165.8，137.9，128.1，82.0，73.4，61.0，58.0，57.2，30.5，26.2，25.6，23.5，14.1，9.5，9.3；C₁₆H₂₇N₄O₄(M⁺+H)之HRMS计算值：339.2032，实验值：m/z 339.2035。

实例12.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-膦酸二乙酯(11b)

藉由类似11a之流程，在CF₃SO₃H(15.6μL，0.18mmol)之存在下，进行醇10b(498mg，1.5mmol)与三氯乙酰亚胺酸-3-戊酯(420mg，1.8mmol)之反应，再与另一批次之亚胺酸酯与CF₃SO₃H反应，产生烷基化产物11b(495mg，产率82％)。无色油体；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.2；[α]_D ²⁰＝-61.3(c＝0.65，CDCl₃)；IR(净)2100，1756，1634，1246cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.56(1H，d，J_P-2＝21.6Hz)，5.71(1H，d，J＝6.9Hz)，4.52(1H，d，J＝7.8Hz)，4.34-4.30(1H，m)，4.11-4.01(4H，m)，3.31-3.23(2H，m)，2.69-2.64(1H，m)，2.12-2.08(1H，m)，2.01(3H，s)，1.51-1.43(4H，m)，1.39-1.31(6H，m)，0.90-0.81(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ171.0，141.7，126.3(C-1，d，J_P-1＝182Hz)，81.9，73.7，62.14，62.10，54.3，57.1，31.0，26.2，25.4，23.6，16.4，16.3，9.6，9.2；³¹P NMR(162MHz，CDCl₃)δ16.99；C₁₇H₃₂N₄O₅P(M⁺+H)之HRMS计算值：403.2110，实验值：m/z 403.2111。

实例13.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸乙酯磷酸化物(1，克流感)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(Lindlar′s catalyst)(100mg)，对迭氮化物11a(170mg，0.5mmol)于乙醇(20mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(155mg)，将其溶于乙醇(3mL)中，并逐份缓慢添加至乙醇(5mL)中之热(55℃)磷酸溶液(85％，115mg，0.6mmol)。结晶作用在几分钟内开始。在冷却至0℃后，过滤收集沈淀物，并以冰丙酮(2x)清洗，以产生1(187mg，产率91％)。白色晶体，mp 189-191℃[lit.(Fukuta et al.，J.Am.Chem.Soc.2006，128，6312-6313)mp 184-186℃]；[α]_D ²⁰＝-35.8(c＝1，H₂O)[lit.(Rohloff et al.，.J.Org.Chem.1998，63，4545-4550.)[α]_D＝-39.9(c＝1，H₂O)；或lit.(Fukuta et al.，2006)[α]_D ²²＝-30.5(c＝0.480，H₂O)]；IR(净)3501，1734，1612，1150cm^-1；¹H NMR(600MHz，D2O)δ6.91(1H，s)，4.39(1H，d，J＝8.0Hz)，4.32-4.30(2H，m)，4.11(1H，dd，J＝10.5，5.7Hz)，3.67-3.59(2H，m)，3.01(1H，dd，J＝17.4，5.4Hz)，2.60-2.56(1H，m)，2.14(3H，s)，1.61-1.50(4H，m)，1.34(3H，t，J＝7.1Hz)，0.94(3H，t，J＝7.3Hz)，0.89(3H，t，J＝7.3Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ178.1，170.3，140.7，130.4，87.2，77.9，65.2，55.4，52.0，30.9，28.3，27.9，25.2，16.1，11.36，11.30；³¹P NMR(162MHz，D₂O)δ0.43；C₁₆H₂₉N₂O₄(M⁺-H₃PO₄+H)之HRMS计算值：313.2127，实验值：m/z 313.2123。C₁₆H₃₁N₂O₈P之分析计算值：C，46.83；H，7.61；N，6.83，实验值：C，46.70；H，7.69；N，6.74。

实例14.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸(2，奥司他伟)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(70mg)，对迭氮化物11a(110mg，0.3mmol)于乙醇(15mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(95mg)，将其溶于THF(10mL)中，再在0℃下，以KOH水溶液(1M，0.5mL，0.5mmol)处理。使该反应混合物回温至室温，并搅拌1h。接着，以AmberliteIR-120将该混合物酸化至pH 5，过滤，并以乙醇水溶液(95％)冲洗。在减压条件下浓缩该滤液。在C18管柱上(CH₃CN/H₂O，1∶19)纯化该残余物，以产生2(75mg，产率88％)。白色固体，mp 185-187℃；[α]_D ²⁰＝-143.2(c＝0.4，H₂O)；IR(净)3525，2991，1751，1611，1050cm^-1；¹H NMR(600MHz，D2O)δ6.50(1H，s)，4.28(1H，d，J＝8.4Hz)，4.05(1H，dd，J＝9.6，4.8Hz)，3.57-3.52(2H，m)，2.89(1H，dd，J＝17.4，5.4Hz)，2.48(1H，dd，J＝17.4，10.8Hz)，2.09(3H，s)，1.61-1.52(3H，m)，1.50-1.43(1H，m)，0.90(3H，t，J＝7-5Hz)，0.87(3H，t，J＝7.5Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ175.1，173.8，133.0，132.4，84.2，75.6，52.9，49.7，29.5，25.4，25.1，22.3，8.54，8.45；C₁₄H₂₄N₂NaO₄(M⁺+Na)之HRMS计算值：307.1634，实验值：m/z307.1633。C₁₄H₂₄N₂O₄之分析计算值：C，59.13；H，8.51；N，9.85，实验值：C，59.04；H，8.58；N，9.79。

实例15.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-膦酸铵(3，零流感)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(80mg)，对迭氮化物11b(203mg，0.5mmol)于乙醇(18mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(185mg)，将其溶于CHCl₃(15mL)中，再在0℃下，以溴化三甲基硅烷(2mL，15mmol)处理。使该反应混合物回温至室温，并搅拌24h。接着，在减压条件下浓缩该混合物。将该残余物溶于水(10mL)中，在室温下搅拌2h，再进行冻干。在C18管柱上纯化该残余之浅黄色固体，以NH₄HCO₃水溶液(0.1M溶液)溶析，以产生磷酸铵3(150mg，产率85％)。白色固体，mp240℃(dec)；[α]_D ²⁰＝-56.0(c＝0.8，H₂O)；IR(净)3532，3001，1701，1656，1120cm^-1；¹H NMR(600MHz，D2O)δ6.15(1H，d，Jp-2＝18.8Hz)，4.12(1H，d，J＝8.1Hz)，3.94(1H，dd，J＝11.6，9.2Hz)，3.45-3.40(2H，m)，2.73-2.68(1H，m)，2.39-2.34(1H，m)，1.97(3H，s)，1.46-1.40(3H，m)，1.38-1.29(1H，m)，0.77(3H，t，J＝7.3Hz)，0.73(3H，t，J＝7.3Hz)；¹³CNMR(150MHz，D₂O)δ175.0，133.1，132.9(C-1，d，J_P-1＝170Hz)，84.3，76.0，52.9，49.7，29.3，25.3，25.0，22.2，8.5，8.3；³¹P NMR(162MHz，D₂O)δ10.35；C₁₃H₂₄N₂O₅P[M+H-2NH4]⁺之HRMS计算值：319.1434，实验值：m/z319.1709。C₁₃H₃₁N₄O₅PH₂O之分析计算值：C，41.93；H，8.93；N，15.04，实验值：C，41.87；H，8.99；N，15.01。

实例16.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-[N₂，N₃-双(第三丁氧羰基)胍基]-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸乙酯(12a)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(80mg)，对迭氮化物11a(150mg，0.41mmol)于乙醇(20mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(110mg)，将其溶于无水DMF(20mL)中，再以N，N-双(第三丁氧羰基)硫脲(148mg，0.51mmol)及Et₃N(148μL，1.03mmol)处理。将该反应混合物冷却至0℃，再缓慢加入HgCl₂(138mg，0.51mmol)。使该悬浮液回温至室温，并搅拌10h。接着，以EtOAc稀释该反应物，再通过硅藻土过滤。浓缩该滤液，再以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，3∶7)纯化，以产生胍12a(177mg，产率78％)。无色泡沫体；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.4；[α]_D20＝-81.6o(c＝1.0，CHCl₃)；IR(净)3302，1724，1635，1612，1120cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl³)δ11.36(1H，s)，8.60(1H，d，J＝8.1Hz)，6.78(1H，s)，6.21(1H，d，J＝9.0Hz)，4.37-4.34(1H，m)，4.17(2H，q，J＝7.1Hz)，4.14-4.08(1H，m)，3.98(1H，dd，J＝4.3，1.3Hz)，3.32-3.30(1H，m)，2.74(1H，dd，J＝17.8，5.3Hz)，2.35(1H，dd，J＝17.8，9.4Hz)，1.87(3H，s)，1.50-1.44(22H，m)，1.24(3H，t，J＝7.1Hz)，0.86(3H，t，J＝7.4Hz)，0.83(3H，t，J＝7.4Hz)；¹³CNMR(150MHz，CDCl₃)δ170.2，165.9，163.1，156.8，152.5，137.9，128.6，83.4，82.6，79.5，76.1，60.9，54.3，48.0，30.4，28.3(3χ)，28.0(3x)，26.0，25.7，23.2，14.1，9.5，9.3；C₂₇H₄7N₄O₈(M⁺+H)之HRMS计算值：555.3394，实验值：m/z 555.3398。

实例17.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-[N₂，N₃-双(第三丁氧羰基)胍基]-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-膦酸二乙酯(12b)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(85mg)，对迭氮化物11b(320mg，0.8mmol)于乙醇(25mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(225mg)，将其溶于无水DMF(30mL)中，再以N，N-双(第三丁氧羰基)硫脲(278mg，0.96mmol)及Et₃N(267μL，1.92mmol)处理。将该混合物冷却至0℃，再缓慢加入HgCl₂(260mg，0.96mmol)。使该悬浮液回温至室温，并搅拌16h。接着，以EtOAc稀释该反应物，再通过硅藻土过滤。浓缩该滤液，再以闪蒸管柱层析(MeOH/CH₂Cl₂，3∶97)纯化，以产生胍12b(287mg，产率58％)。无色泡沫体；TLC(MeOH/CH₂Cl₂，1∶19)R_f＝0.3；[α]_D ²⁰＝-76.8(c＝1.6，CDCl₃)；IR(净)3310，1801，1734，1642，1253cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ11.36(1H，s)，8.61(1H，d，J＝8.2Hz)，6.62(1H，d，J_P-2＝21.7Hz)，6.38(1H，d，J＝8.9Hz)，4.44-4.38(1H，m)，4.19-3.92(6H，m)，3.32-3.28(1H，m)，2.68-2.61(1H，m)，2.29-2.24(1H，m)，1.91(3H，s)，1.49-1.46(22H，m)，1.29(6H，t，J＝7.1Hz)，0.86(3H，t，J＝7.3Hz)，0.82(3H，t，J＝7.3Hz)；^C NMR(150MHz，CDCl₃)δ170.8，162.8，156.9，152.6，142.1，126.4(C-1，d，J_P-1＝181Hz)，83.8，82.6，80.1，76.3，62.2，62.1，54.4，48.2，30.9，28.2(3x)，28.0(3x)，26.0，25.6，23.4，16.4，16.3，9.7，9.2；³¹P NMR(162MHz，CDCl₃)δ17.20；C₂₈H₅₂N₄O₉P(M⁺+H)之HRMS计算值：619.3472，实验值：m/z619.3476。

实例18.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胍基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸(13a)(Kim et al.，.J.Med.Chem.1998，41，2451-2460.)

在0℃下，将KOH水溶液(0.5mL之1M溶液)加入12a(177mg，0.32mmol)于THF(10mL)中之溶液中。使该混合物回温至室温并搅拌1h，再以Amberlite IR-120(酸性树脂)处理。过滤该混合物，再以乙醇水溶液(95％)冲洗。浓缩该滤液，将该残余物溶于CH₂Cl₂(10mL)中，并冷却至0℃。逐滴加入三氟乙酸(5mL)，再在0℃下搅拌该混合物1h。接着，在减压条件下浓缩该混合物，并以C18管柱(CH₃CN/H₂O，1∶19)纯化该残余物，以产生酸13a(92mg，产率88％)。偏白色固体，mp 90-920℃；[α]_D ²⁰＝-190.5(c＝0.36，H₂O)；IR(净)3502，2989，1733，1625，1213cm^-1；¹H NMR(600MHz，D₂O)δ6.86(1H，s)，4.36(1H，d，J＝8.2Hz)，3.94(1H，dd，J＝10.1，5.2Hz)，3.87-3.82(1H，m)，3.56-3.54(1H，m)，2.87(1H，dd，J＝17.5，5.0Hz)，2.42(1H，dd，J＝17.5，10.1Hz)，2.05(3H，s)，1.60-1.54(3H，m)，1.50-1.44(1H，m)，0.91(3H，t，J＝7.2Hz)，0.86(3H，t，J＝7.2Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ174.7，169-3，156.8，138.2，128.7，84.3，75.3，54.8，50.5，29.8，25.6，25.2，21.9，8.55，8.50；C₁₅H₂₇N₄O₄(M⁺+H)之HRMS计算值：327.2032，实验值：m/z 327.2035。C₁₅H₂₆N₄O₄之分析计算值：C，55.20；H，8.03；N，17.17，实验值：C，55.10；H，8.11；N，17.14。

实例19.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胍基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-膦酸铵(13b)

将溴化三甲基硅烷(5mL，38mmol)加至12b(287mg，0.46mmol)于CHCl₃(20mL)中之冰(0℃)溶液中。在室温下搅拌该混合物24h，接着在减压条件下浓缩。将该残余物溶于水(15mL)中，在室温下搅拌2h，再进行冻干。以C18管柱(0.1M NH₄HCO₃水溶液)纯化该残余物，以产生磷酸铵13b(132mg，产率72％)。白色固体，mp 220-223℃；[α]_D20＝-55.3(c＝1.5，H₂O)；IR(净)3512，2901，1716，1101cm^-1；¹H NMR(600MHz，D2O)δ6.12(1H，d，J_P-2＝19.0Hz)，4.12(1H，d，J＝6.9Hz)，3.80(1H，dd，J＝10.0，5.0Hz)，3.71-3.62(1H，m)，3.41(1H，br s)，2.62-2.59(1H，m)，2.28-2.23(1H，m)，1.91(3H，s)，1.46-1.44(3H，m)，1.34-1.28(1H，m)，0.77(3H，t，J＝7.3Hz)，0.72(3H，t，J＝7.3Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ174.5，156.6，134.3(C-1，d，J_P-1＝168Hz)，132.7，84.2，76.3，55.2，51.0，30.8，25.5，25.2，21.8，8.6，8.2；³¹P NMR(162MHz，D₂O)δ10.92；C₁₄H₂₆N₄O₅P[M+H-2NH₄]⁺之HRMS计算值：361.1652，实验值：m/z 361.1637。C₁₄H₃₃N₆O₅P.(2H₂O)之分析计算值：C，38.88；H，8.62；N，19.43，实验值：C，38.74；H，8.71；N，19.39。

实例20.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-羟基-1-环己烯-1-羧酸(14a)(Kim et al.，.J.Med.Chem.1998，41，2451-2460)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(75mg)，对迭氮化物10a(81mg，0.3mmol)于乙醇(15mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(95mg)，将其溶于THF(10mL)中，再在0℃下，以KOH水溶液(0.5mL之1M溶液)处理。使该混合物回温至室温，搅拌1h，再以Amberlite IR-120酸化至pH 5。过滤该混合物，再以乙醇水溶液(95％)冲洗。浓缩该滤液，再以C18管柱(CH₃CN/H₂O，1∶19)纯化该残余物，以产生酸14a(52mg，产率81％)。白色固体，mp 220℃(dec)；[α]_D ²⁰＝-96.9(c＝0.7，H₂O)；IR(净)3511，1711，1610cm^-1；¹H NMR(600MHz，D₂O)δ6.85(1H，s)，4.48(1H，d，J＝8.7Hz)，4.06(1H，dd，J＝11.5，5.6Hz)，3.64-3.59(1H，m)，2.96(1H，dd，J＝17.3，5.6Hz)，2.57-2.51(1H，m)，2.10(3H，s)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ175.6，169.0，139.4，127.5，68.7，53.6，49.0，28.2，22.2；C₉H₁₅N₂O₄(M₊+H)之HRMS计算值：215.1032，实验值：m/z 215.1035。

实例21.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-羟基-1-环己烯-1-膦酸铵(14b)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(50mg)，对迭氮化物10b(101mg，0.3mmol)于乙醇(15mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(90mg)，将其溶于CHCl₃(10mL)中，再在0℃下，以溴化三甲基硅烷(1mL，7.6mmol)处理。使该反应混合物回温至室温，搅拌24h，再在减压条件下浓缩。将该残余物溶于水(10mL)中，在室温下搅拌2h，再进行冻干。以C18管柱(0.1M NH₄HCO₃水溶液)纯化该残余物，以产生磷酸铵14b(64mg，产率85％)。无色固体，mp 190-192℃；[α]_D ²⁰＝-56.3(c＝1.0，H₂O)；IR(净)3500，2891，1728，1159cm^-1；¹H NMR(600MHz，D2O)δ6.29(1H，d，J^P-2＝19.1Hz)，4.40(1H，d，J＝7.0Hz)，4.06(1H，dd，J＝10.6，5.3Hz)，3.90(1H，dd，J＝6.8，3.4Hz)，3.60(1H，br)，2.88-2.80(1H，m)，2.57-2.53(1H，m)，2.13(3H，s)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ175.6，135.0，132.3(C-1，d，J_P-1＝172Hz)，69.4，54.1，49.6，29.3，22.3；³¹P NMR(162MHz，D²O)δ13.52；C⁸H₁₄N₂O₅P[M+H-2NH₄]⁺之HRMS计算值：249.0651，实验值：m/z249.0869。

实例22.病毒

流感A/WSN/1933(H1N1)(得自Dr.Shin-Ru Shih，Chang GungUniversity，Taiwan)系在10-日龄之鸡胚胎蛋的尿囊腔中培养72h，并以蔗糖梯度离心纯化。

实例23.细胞

由美国形态培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va)取得Madin-Darby犬肾(MDCK)及293T细胞，并使其在含有10％胎牛血清(GibcoBRL)及青霉素-链霉素(GibcoBRL)之DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基，GibcoBRL)中，在5％CO₂、37℃下进行生长。

实例24.测定流感病毒之TCID₅₀

在96孔微试验盘上，在1x10⁵细胞/mL浓度之100μL MDCK细胞上，以流感病毒贮存物之系列稀释测定TCID₅₀(50％组织培养物感染剂量)。在5％CO₂、37℃下，培育经感染之细胞48h，再在各孔中加入每孔100μL之CellTiter水性非放射性细胞增殖分析反应试剂(Promega)，在盘视读器上判读490nm之吸收值。使用Reed-Muench法测定流感病毒之TCID⁵⁰(Reed and Muench，H.Am.J.Hyg.1938，27，493-497)。

实例25.制备重组神经胺酸苷酶以进行NAI评估

制备两种N1基团神经胺酸苷酶以及其H274Y突变形式。分别衍生自A/WSN/1933(H1N1)及A/Hanoi/30408/2005(H5N1)之NA基因的cDNANA(WNS)及NA(Hanoi)分别系取自Dr.King-Song Jeng(Institute ofMolecular Biology，Academia Sinica)及Dr.Po-Huang Liang(Institute ofBiological Chemistry，Academia Sinica)。以GeneTailor定位诱变系统(Invitrogen，CaI，USA)，根据制造商之指示，对该等NA基因进行进一步之诱变，以引入该H274Y突变。将NA(WSN)及其突变基因选殖进入pClneo(Promega，Wis，USA)，并将NA(Hanoi)及其突变基因选殖进入pCDNA6(Invitrogen)。使用该等NA基因之质体DNA转染进入293T细胞中，以在细胞表面表现重组神经胺酸苷酶。在48h时收集该等经转染之细胞，以PBS(pH 7.4)清洗两次，并用于评估神经胺酸苷酶抑制剂。

实例26.测定NA之活性

使用经流感A/WSN/1933(H1N1)感染之胚胎蛋的稀释尿囊液，测量神经胺酸苷酶之活性。以荧光发光受质2′-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰基神经胺酸(MUNANA；Sigma)，使用荧光分析测定NA活性。分别使用365及460nm之激发及发光波长，以Envision盘视读器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)，测量释出4-甲基伞形酮之荧光。以200μM之MUNANA测定神经胺酸苷酶神经胺酸苷酶之活性。酶活性以在室温下共置15min内之荧光增加表示。

实例27.测定NA抑制剂之IC₅₀及Ki

在室温下，将抑制剂与神经胺酸苷酶混合10min，接着再加入200μM之受质，以测定NA抑制作用。使用Graph Pad Prism 4，针对NA活性之抑制百分比对抑制剂之浓度作图，以测定抑制剂之IC₅₀值。藉由式K＝IC₅₀/(1+[S]/Km])测定抑制剂之Ki值(Cheng，Y.-C；Prusoff，W.H.Biochem.Pharmacol.1973，22，3099-3108)，其中[S]系用于IC₅₀测定试验中之受质(MUNANA；Sigma)浓度，而Km系可产生一半最大速度之受质浓度。Km系使用Michaelis-Menten方程式绘图而测定。

实例28.测定NA抑制剂之EC₅₀及CC₅₀

以EC₅₀值测量神经胺酸苷酶抑制剂之抗流感活性，其系对于H1N1CPE活性具有50％保护力之NA抑制剂浓度。将100TCID₅₀浓度之50μL稀释H1N1与等体积之不同浓度NA抑制剂混合。在96孔试验盘中，使用该混合物感染1x10⁵细胞/mL浓度之100μL MDCK细胞。在5％CO₂、37℃下培育48h后，如上所述以CellTiter

水性非放射性细胞增殖分析反应试剂测定细胞病变作用。使用Graph Pad Prism 4，针对CPE百分比对NA抑制剂浓度之曲线进行拟合，以测定抑制剂之EC₅₀值。CC₅₀值系测量NA抑制剂对MDCK细胞之毒性，并系以类似EC₅₀之测定但未进行病毒感染而测定。

实例29.体内分析

以舒泰(zoletil)麻醉BALB/c母鼠(4-5周龄)并由鼻内接种25μL的感染性流感病毒。藉由每日两次经口强饲，以每天每kg体重0.01、0.1、1.0、及10mg之剂量，对10只小鼠之试验组投予膦酸酯化合物3及3b共5天。控制组(安慰剂)之小鼠则以相同时程接受无菌水。在投与第一剂药物4小时后，以10MLD₅₀之流感病毒[A/WSN/33(H1N1)或NIBRG-14(H5N1)]接种小鼠。每日观察小鼠之存活及体重共14天。平均存活率之结果示于表3及4。个别存活率及平均体重示于图9至20。

实例30.N1神经胺酸苷酶抑制作用之计算机仿真

借着将化合物3对接至流感病毒神经胺酸苷酶(N1亚型，PDB编码：2HU4)(Russell et al.，Nature 2006，443，45-49)之晶体结构中，建构复合NA之化合物3的分子模拟。以SYBYL 7.3程序修饰奥司他伟2之3-D结构(亦来自于2HU4)，建立化合物3之3-D结构(SYBYL 7.3；The Tripos Associates：St.Louis，MO。该SYBYL计算机计算系在National Center for HighPerformance Computing，Taiwan.进行)。使用GOLD 3.1.1(Jones et al.，J.MoI.Biol.1995，245，43-53；Jones et al.，J.MoI.Biol.1997，267，727-748)，并开启弹性对接选项，以将化合物3对接至该蛋白上。使用SYBYL 7.3程序(Joneset al.，J.MoI.Biol.1997，267，727-748)，对该蛋白之原子指定Kollmann全原子电荷(Cornell et al.，J.Am.Chem.Soc.1995，117，5179-5197)，并对配位体之原子指定Gasteiger-Huckel电荷(Gasteiger and Marsili，Tetrahedron1980，36，3219-3228.；Marsili and Gasteiger，Croat.Chem.Acta 1980，53，601-614；Purcell and Singer，J.Chem.Eng.Data 1967，12，235-246)。最初的1000个独立基因演算计算循环系以介于-180及180度间不等之配位体扭转角度进行。搜寻效率设定为200％以确保对于对接构形空间之最彻底搜寻。所有其它参数接保持与系统预设相同。对接过程系分配至具有Intel(R)Xeon(TM)CPU 3.00GHz CPUs之包含40个处理器的Linux丛集。以GOLDSCORE评分函数对所得之配位体-蛋白复合物结构进行排名，以决定前1000名之结果。对于该等前位排名构形的人工检视确认，如图1b所示之共有结构明显可见。该结果预期系由NA之关键精胺酸与化合物3中之磷酸基间的强互补静电作用造成。在PyMOL软件(DeLano WL(2002)The PyMOL molecular graphics system San Carlos(California)：DeLanoScientific)中显示该等分子模型。在图1中，其明确显示以配位体为中心之

半径内之NA残基侧链中的碳原子。试行性之氢键供给者-接受者配对以虚线连接。膦酸酯化合物3a之复合物与NA活性位点中之重要残基具有较奥司他伟-NA复合物(6对配位体-NA之H-键)更为大量之氢键作用(8对配位体-NA之H-键)。

实例31.用于下列实施例的合成流程以及产物定性的材料

在下列之实施例中，所有的反应试剂皆为可由市售取得，且其不经进一步之纯化即予使用，除非另有明示。所有的溶剂皆为无水级，除非另有明示。偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)系在减压条件下于Na₂SO₄上蒸馏而纯化。所有的非水性反应皆系在于弱正压氩气下于烘箱中干燥之玻璃器皿内进行，除非另外注明。反应经磁搅拌，并在硅胶上以薄层层析监测。闪蒸层析系在60-200μm颗粒大小之硅胶上进行。产率系针对光谱纯性化合物报告。熔点系在Electrothermal MEL-

1101D熔点装置上记录且不经校正。NMR光谱系在Bruker AVANCE 600及400光谱仪上记录。化学位移系以相对于四甲基硅烷(TMS)之δ值提供；偶合常数J系以Hz单位提供。¹H-NMR光谱之内部标准物为CDCl₃(δH＝7.24)、CD₃OD(δH＝3.31)、或D₂O(δH＝4.79)，¹³C-NMR光谱为CDCl₃(δH＝77.0)或CD₃OD(δc＝49.15)，而³¹P-NMR光谱则为D₂O中之H₃PO₄(δP＝0.00)。分裂模式报告为s(单峰)，d(双重峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(宽峰)，及dd(双重之双重峰)。IR光谱系在Thermo Nicolet 380 FT-IR光谱仪上记录。旋光度系在Perkin-Elmer Model 341旋光仪上纪律，[α]D值系以10-1deg cm2 g-1之单位提供。高分辨率ESI质谱系在Bruker Daltonics光谱仪上记录。

与下列实施例相关之附件A系如其完全揭示于本文中般纳入作为参考。

实例31.N-[(1S，4S，5R，6R)-3，6-二溴-4，5-(异亚丙基-二氧)环己-2-烯-1-基]乙酰胺(19)

以对-甲苯磺酸单水合物(100mg，0.52mmol)，处理顺-二氢二醇17(8.0g，42.1mmol)于丙酮(20mL)及2，2-二甲氧基丙烷(40mL)混合物中之冰(0℃)溶液。在室温下搅拌该反应混合物30ain，接着加入饱和之NaHCO₃水溶液(60mL)而淬灭。在减压条件下除去有机溶剂，再以Et₂O(3x100mL)萃取该残余之水相。以盐水(100mL)清洗结合之有机萃取液，以MgSO₄去水，过滤，并在真空下浓缩(不可加热)，以产生呈浅黄色油体之粗制丙酮化物(8.92g)。

在黑暗中，于0℃，在N-溴代乙酰胺(NBA，6.49g，47mmol)于无水乙腈(250mL)中之溶液中，加入SnBr₄(4.7mL之1M溶液于CH₂Cl₂中，4.7mmol)及水(0.72mL，40mmol)。在该相同温度下，以1h之时间，将乙腈(150mL)中之上文制备之乙酰胺(8.92g，38.8mmol)，逐滴加入该NBA-SnBr₄混合物中。在0℃下剧烈搅拌该反应物8h，接着以饱和之NaHCO₃(100mL)及Na₂SO₃(100mL)水溶液进行淬灭。使该反应混合物回温至室温30min。在分离有机相后，以CH₂Cl₂(3x300mL)萃取水相。以水(3x200mL)及盐水(300mL)清洗结合之有机层，以MgSO₄去水，过滤，并在真空下浓缩。使该粗产物自Et₂O/CH₂Cl₂再结晶，以产生呈无色结晶固体之溴代乙酰胺19(11.66g，自顺-二氢二醇17产率75％)；m.p.150-152℃(dec)；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.40；[α]_D ²⁰＝+176.6(c＝1.63，CHCl₃)；IR(胶片)3209，2988，1655，1225cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.19(1H，d，J＝9.1Hz)，6.15(1H，d，J＝5.0Hz)，4.93-4.90(1H，m)，4.66(1H，d，J＝5.0Hz)，4.58(1H，dd，J＝5.2，2.6Hz)，4.19(1H，dd，J＝3.9；2.0Hz)，1.95(3H，s)，1.49(3H，s)，1.40(3H，s)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ168.9，127.9，124.7，112.0，77.9，75.8，50.2，44.3，27.8，26.5，23.3；C₁₁H₁₆Br₂NO₃(M⁺+H)之HRMS计算值：367.9497，实验值：m/z 367.9499。

实例32.(1S，4S，5S，6S)-7-乙酰基-3-溴-4，5-异亚丙基-二氧-7-氮杂双环[4.1.0]庚-2-烯(20)

在氮气大气下，于-10℃，将双(三甲硅烷基)酰胺锂(35mL之1.0M溶液于THF中，35mmol)逐滴加入溴代乙酰胺19(11.66g，31.8mmol)于THF(150mL)中之搅拌溶液中。使所得之溶液回温至0℃，并搅拌30min，以产生棕色悬浮液。在加入缓冲溶液(100mL，pH 7)后，以Et₂O(4x150mL)萃取该混合物。以盐水清洗结合之有机萃取液，以MgSO₄去水，过滤，再进行浓缩。该粗制氮丙啶20(8.32g)不经进一步之纯化即用于下一步骤。

在硅胶上对该粗产物进行闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，2∶3)，制备分析用之纯性样本20。无色固体；m.p.110-112℃；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.42；[α]_D ²⁰＝-77.6(c＝0.47，CHCl³)；IR(胶片)2967，1980，1706，1233，1072cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.69(1H，d，J＝4-7Hz)，4.72(1H，dd，J＝7.0，1.1Hz)，4.45(1H，dd，J＝7.0，4.2Hz)，3.19(1H，dd，J＝5.9，5.0Hz)，3.10(1H，dd，J＝5.6，2.8Hz)，2.16(3H，s)，1.55(3H，s)，1.41(3H，s)；¹³CNMR(150MHz，CDCl³)δ181.7，129.9，122.7，108.5，76.5，71.9，39.5，36.7，27.0，24.8，23.2；C¹¹H¹⁴BrNNaO³(M⁺+Na)之HRMS计算值：310.0055，实验值：m/z 310.0058。

实例33.N-[(1S，2R，5S，6S)-4-溴-2-(1-乙基丙氧基)-5，6-(异亚丙基二氧)环己-3-烯-1-基]乙酰胺(22)

在-10℃下，在粗制氮丙啶20(8.32g，28.8mmol)于3-戊醇(50mL)中之溶液中，逐滴加入三氟化硼-乙醚络合物(4.68mL，36mmol)。使该反应混合物回温至0℃，并搅拌6h，再在减压条件下浓缩。将该残余物溶于EtOAc(200mL)中，再以饱和之NaHCO₃水溶液(50mL)清洗该有机层。以EtOAc(3x100mL)萃取该水层，再以水(200mL)及盐水(300mL)清洗结合之有机层。以MgSO₄对该有机萃取液进行去水，过滤，并进行浓缩。在硅胶上以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，3∶7)纯化该残余油体，以产生呈无色泡沫体之醚产物22(8.82g，自20之产率73％)。TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.35；[α]_D ²⁰＝-123(c＝1.42，CHCl₃)；IR(胶片)3221，2988，1921，1711，1199，1075cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.15(1H，d，J＝2.1Hz)，5.70(1H，d，J＝9.0Hz)，4.59(1H，dd，J＝5.2，1.7Hz)，4.42(1H，dd，J＝5.2，2.6Hz)，4.31(1H，ddd，J＝11.5，8.8，2.6Hz)，3.90-3.88(1H，m)，3.27-3.23(1H，m)，2.01(3H，s)，1.50-1.45(4H，m)，1.40(3H，s)，1.36(3H，s)，0.89-0.85(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ169.9，132.6，122.7，110.0，82.3，76.9，76.1，73.5，51.3，27.3，26.3，26.0，25.6，23.2，9.5，9.2；C₁₆H₂₇BrNO₄(M⁺+H)之HRMS计算值：367.1123，实验值：m/z 367.1129。

实例34.N-[(1R，2R，5S，6S)-4-溴-2-(1-乙基丙氧基)-5，6-二羟基环己-3-烯-1-基]乙酰胺(23)

在丙酮化物22(8.82g，23.4mmol)于甲醇(100mL)中之溶液中，加入浓HCl溶液(2mL)。在50℃下搅拌该反应混合物约6h，直到TLC分析显示去保护作用完成。将该混合物冷却至室温，在减压条件下蒸发溶剂，再使该残余固体自Et₂O/THF再结晶，以产生呈无色结晶固体之二羟基乙酰胺23(7.42g，94％)；m.p.131-133℃(dec)；TLC(EtOAc)R_f＝0.35；[α]_D ²⁰＝-101.2(c＝0.67，MeOH)；IR(胶片)3678，3206，2972，1971，1698，1208，1072cm^-1；¹HNMR(600MHz，CD₃OD)δ6.04(1H，d，J＝3.1Hz)，4.13(1H，dd，J＝1.7，0.9Hz)，3.95(1H，dd，J＝4.3，2.2Hz)，3.92-3.89(2H，m)，3.32-3.29(1H，m)，1.86(3H，s)，1.44-1.33(4H，m)，0.85-0.79(6H，m)；¹³CNMR(150MHz，CD₃OD)δ173.3，132.0，128.1，83.4，75.9，72.7，70.8，55.1，27.5，27.3，23.0，10.1，9.9；C₁₃H₂₃BrNO₄(M⁺+H)之HRMS计算值：336.0810，实验值：m/z 336.0818。

实例35.(1S，2R，5R，6S)-6-乙酰胺基-2，3-二溴-5-(1-乙基-丙氧基)-环己-3-烯-1-基乙酸酯(24)

在氮气大气下，于0℃，在二醇23(7.42g，22.1mmol)于THF(150mL)中之搅拌溶液中，以10min之时间，逐滴加入α-乙酰氧基异丁酰溴(4.1mL，27.8mmol)。在该相同温度下搅拌该反应混合物30min，再回温至室温同时予以搅拌3.5h。蒸发溶剂，再在EtOAc(200mL)及5％NaHCO₃水溶液(50mL)间分配该残余油体。以水(100mL)清洗该有机层，以MgSO₄去水，过滤，再进行浓缩，以产生粗制溴代乙酸酯24(9.05g)。该粗制产物不经进一步之纯化即用于下一步骤。

在硅胶上对该粗产物进行闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，2∶1)，制备分析用之纯性样本24。浅黄色泡沫体；TLC(EtOAc/己烷，2∶1)R_f＝0.33；[α]_D ²⁰＝-43.2(c＝1.28，CHCl₃)；IR(胶片)3279，2981，1927，1702，1687，1221，1093cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.17(1H，d，J＝2.3Hz)，5.85(1H，br s)，5.29(1H，s)，4.78-4.75(1H，m)，4.54(1H，d，J＝2.8Hz)，4.03(1H，d，J＝8.6Hz)，3.26(1H，dd，J＝11.3，5-6Hz)，2.09(3H，s)，1.96(3H，s)，1.49-1.43(4H，m)，0.89-0.81(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ170.0，169.9，133-9，121.1，82.4，75.4，74.5，48.8，47.3，26.2，25.8，23.4，20.9，9.4，9.3；C₁₅H₂₄Br₂NO₄(M⁺+H)之HRMS计算值：440.0072，实验值：m/z440.0076。

实例36.N-[(1R，2R，6R)-4-溴-2-(1-乙基丙氧基)-6-羟基环己-3-烯-1-基]乙酰胺(25)

在氮气大气下，于0℃，将Super-

(LiBHEt₃，61.5mL之1M溶液于THF中，61.5mmol)逐滴加入溴化乙酸酯24(9.05g，20.5mmol)于THF(100mL)中之搅拌溶液中。使所得之溶液回温至室温，搅拌2h，再以饱和之NH₄Cl水溶液(50mL)处理。分离水层，再以EtOAc(6x100mL)萃取。以水(2x200mL)及盐水(200mL)清洗结合之有机层。以MgSO₄对该有机相进行去水，过滤，并进行浓缩，以产生浅黄色泡沫体残余物。自Et₂O再结晶而纯化该粗产物，以产生呈白色结晶固体之羟基乙酰胺25(5.78g，自二醇23产率82％)；m.p.102-104℃；TLC(EtOAc)R_f＝0.35；[α]_D ²⁰＝-107.7(c＝1.1，CHCl₃)；IR(胶片)3595，3217，2923，1984，1707，1286，1021cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl³)δ6.03(1H，d，J＝3.1Hz)，5.89(1H，d，J＝6.7Hz)，4.23(1H，br s)，4.07(1H，br s)，3.98(1H，br s)，3.93(1H，dd，J＝7.5，2.1Hz)，3.29-3.26(1H，m)，2.82(1H，dd，J＝18.2，4.7Hz)，2.50(1H，dd，J＝18.2，5.8Hz)，2.01(3H，s)，1.51-1.42(4H，m)，0.89-0.85(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ172.0，127.9，122.5，81.7，74.0，67.7，54.2，41.7，26.3，26.0，23.4，9.7，9.5；C₁₃H₂₂BrNNaO₃(M⁺+Na)之HRMS计算值：342.0681，实验值：m/z 342.0688。

实例37.N-[(1R，2R，6S)-4-溴-2-(1-乙基丙氧基)-6-迭氮基-环己-3-烯-1-基]乙酰胺(26)及N-[(1R，6R)-4-溴-6-(1-乙基丙氧基)-环己-2，4-二烯-1-基]乙酰胺(27)

在40℃下，将25(5.78g，18.1mmol)、三苯膦(9.96g，38.0mmol)、新鲜蒸馏之迭氮二羧酸二异丙酯(7.68g，38.0mmol)、及叠氮磷酸二苯酯(10.51g，38.0mmol)于THF(120mL)中之溶液搅拌24h。在减压条件下，以旋转蒸发除去溶剂，再以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，1∶2)纯化该残余物，以产生具有6S构形之对应迭氮化物产物26(5.23g，84％yield)，同时并有2％之副产物二烯27(108mg，0.36mmol)。

迭氮化物26：白色固体，m.p.138-140℃；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.45；[α]_D ²⁰＝-33.4(c＝0.7，CHCl₃)；IR(胶片)3119，2927，2178，1902，1698，1277，1054cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.33(1H，d，J＝7.8Hz)，5.98(1H，d，J＝2.2Hz)，4.27(1H，d，J＝8.2Hz)，4.22-4.17(1H，m)，3.44-3.40(1H，m)，3.23-3.20(1H，m)，2.77(1H，dd，J＝17.4，5.8Hz)，2.52-2.46(1H，m)，1.99(3H，s)，1.47-1.42(4H，m)，0.86-0.82(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ171.2，130.3，119.0，82.0，74.7，57.5，56.9，40.4，26.2，25.6，23.5，9.6，9.2；C₁₃H₂₂BrN₄O₂(M⁺+H)之HRMS计算值：345.0926，实验值：m/z345.0931。

二烯27：无色固体，m.p.68-70℃；TLC(EtOAc/己烷，2∶1)R_f＝0.60；[α]_D ²⁰＝-215.6(c＝0.98，CHCl₃)；IR(胶片)3331，1721，1607，1088cm^-1；¹HNMR(600MHz，CDCl₃)δ6.16(1H，d，J＝5.2Hz)，6.09(1H，dd，J＝9.8，1.3Hz)，5.81(1H，dd，J＝9.8，5.2Hz)，5.52(1H，d，J＝7.7Hz)，4.60(1H，ddd，J＝8.9，4.8，2.4Hz)，3.91(1H，dd，J＝4.8，2.4Hz)，3.43-3.39(1H，m)，1.94(3H，s)，1.49-1.41(4H，m)，0.88-0.82(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ169.9，129.9，128.0，126.7，120.0，80.8，74.8，47.0，26.6，26.5，23.3，9.9，9.5；C₁₃H₂₁BrNO₂(M⁺+H)之HRMS计算值：302.0756，实验值：m/z 302.0761。

实例38.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-(1-乙基-丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸乙酯(28a)

在氮气大气下，于80℃，将26(349mg，1mmol)、N，N-二异丙基乙胺(2.5mL，15.2mmol)、及双(三苯膦)二羰基镍(0)(960mg，1.5mmol)于乙醇(3mL)及THF(15mL)中之溶液搅拌24h。将该反应混合物冷却至室温，再蒸发溶剂。以EtOAc(20mL)稀释该残余油体，再使该混合物通过硅藻土垫过滤。蒸发该滤液，以产生浅黄色之油体，其经闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，3∶7)纯化，产生呈无色固体之酯28a(274mg，81％)；m.p.115-117℃；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.4；[α]_D ²⁰＝-48.9(c＝1.1，CHCl³)；IR(胶片)3401，2101，1712，1655，1273cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.75(1H，s)，5.98(1H，d，J＝7A Hz)，4.53(1H，d，J＝5.0Hz)，4.51-4.16(3H，m)，3.33-3.28(2H，m)，2.82(1H，dd，J＝17.6，5.6Hz)，2.22-2.16(1H，m)，2.00(3H，s)，1.49-1-45(4H，m)，1.25(3H，t，J＝7.1Hz)，0.95-0.80(6H，m)；¹³CNMR(150MHz，CDCl₃)δ171.1，165.8，137.9，128.1，82.0，73.4，61.0，58.0，57.2，30.5，26.2，25.6，23.5，14.1，9.5，9.3；C₁₅H₂₇N₄O₄(M⁺+H)之HRMS计算值：339.2032，实验值：m/z 339.2039。

实例39.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-迭氮基-3-(1-乙基-丙氧基)-1-环己烯膦酸二乙酯(28a)

对26(1.72g，10mmol)、，亚磷酸二乙酯(2.07g，15mmol)、及1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(3.37g，30mmol)于无水甲苯(50mL)中之混合物，以氮气吹泡10min而进行脱氧，接着将其加至置于氮气大气下之圆底烧瓶中之四(三苯膦)钯(0)(867mg，0.75mmol)中。将所得之溶液逐渐加热至90℃，并维持在此温度12h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再在减压条件下蒸发该滤液，以产生无色之泡沫体(3.91g)，其经闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，1∶1至2∶1)纯化，产生呈无色油体之膦酸酯28b(3.33g，83％)。TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.2；[α]_D ²⁰＝-62.4(c＝1.2，CHCl₃)；IR(胶片)3357，2108，1754，1651，1247cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.56(1H，d，JP_-2＝21.6Hz)，5.71(1H，d，J＝6.9Hz)，4.52(1H，d，J＝7.8Hz)，4.34-4.30(1H，m)，4.11-4.01(4H，m)，3-31-3-23(2H，m)，2.69-2.64(1H，m)，2.12-2.08(1H，m)，2.01(3H，s)，1.51-1.43(4H，m)，1.39-1.31(6H，m)，0.90-0.81(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ171.0，141.7，126.3(C-1，d，J_P-1＝182Hz)，81.9，73.7，62.14，62.10，54.3，57.1，31.0，26.2，25.4，23.6，16.4，16.3，9.6，9.2；³¹P NMR(162MHz，CDCl₃)δ16.99；C₁₇H₃₂N₄O₅(M⁺+H)之HRMS计算值：403.2110，实验值：m/z 403.2117。

实例40.(1S，5R，6R)-6-乙酰胺基-3-溴-5-(1-乙基-丙氧基)环己-3-烯-1-基胺基甲酸第三丁酯(29)

在室温下之2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(1.37g，6mmol)及三苯膦(1.57g，6mmol)于无水乙腈(30mL)中之混合物中，加入氰酸四丁基铵(1.71g，6mmol)，再加入醇25(1.58g，5mmol)。在室温下搅拌该混合物18h直到反应完成。蒸发溶剂，并将该黑色残余物溶于第三丁醇(20mL)中。在回流温度下加热该所得之溶液24h。在减压条件下蒸发溶剂，再以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，3∶7)纯化该残余物，以产生呈白色固体之胺基甲酸酯29(1.63g，78％)；m.p.153-155℃；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R_f＝0.5；[α]_D ²⁰＝-49.7(c＝1.35，CHCl₃)；IR(胶片)3327，2919，1708，1682，1523，1244cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl³)δ6.24(1H，d，J＝9.1Hz)，6.00(1H，s)，548(1H，d，J＝9.1Hz)，4.01(1H，dd，J＝17.0，9.3Hz)，3.85-3.81(2H，m)，3.28-3.24(1H，m)，2.71(1H，dd，J＝17.6，4.8Hz)，2.57(1H，dd，J＝17.6，8.6Hz)，1.93(3H，s)，1.46-1.39(4H，m)，1.36(9H，s)，0.85-0.80(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ170.8，156.0，129.5，121.2，81.9，79.6，76.4，53.1，49.8，40.6，28.3(3x)，26.0，25.7，23.2，9.5，9.2；C₁₈H₃₁BrN₂NaO₄(M⁺+Na)之HRMS计算值：441.1365，实验值：m/z 441.1368。

实例41.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-第三丁氧基-羰胺基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯羧酸乙酯(31a)

对溴乙烯29(2.11g，5mmol)、碘化钾(1.66g，10mmol)、及碘化铜(I)(477mg，2.5mmol)于正丁醇(35mL)中之混合物，以氮气吹泡10min而进行脱氧，接着将其加至置于氮气大气下之圆底烧瓶中之N，N′-二甲基乙二胺(54μL，0.5mmol)中。在120℃下搅拌该反应混合物24h。在冷却至室温后，在减压条件下蒸发溶剂。在EtOAc(50mL)及稀氨水溶液(50mL)间分配该残余物。以水(3x30mL)清洗该有机相，以MgSO₄去水，再进行浓缩。使该残余物通过短硅胶管柱过滤(EtOAc/己烷，1∶1)，以产生粗制碘乙烯30(2.29g)之无色固体样本，其不经进一步之纯化即用于下一步骤。

将醋酸钯(II)(90mg，0.4mmol)加入上文所制备之碘乙烯30(2.29g，4.9mmol)及醋酸钠(1.64g，20mmol)于无水乙醇(50mL)中之溶液中。在一氧化碳大气下，于室温搅拌该反应混合物24h。蒸发溶剂，再以闪蒸管柱层析(EtOAc/己烷，3∶7)纯化该残余物，以产生呈白色固体之31a(1.69g，82％from 29)；m.p.142-144℃[lit.^S ₃m.p.138-139℃]；TLC(EtOAc/己烷，1∶1)R^f＝0.35；[α]_D ²⁰＝-76.3(c＝1.67，CHCl₃)[lit.^S ₃[α]_D ²⁵＝-68.9(c＝1.0，CDCl₃)]；IR(胶片)3312，2951，1713，1688，1651，1244cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl³)δ6.70(1H，s)，6.24(1H，á，J＝9.2Hz)，5.26(1H，d，J＝9.3Hz)，4.18-4.12(2H，m)，4.03-3.98(1H，m)，3.95-3.94(1H，m)，3.75-3.72(1H，m)，3.30(1H，t，J＝5.6Hz)，2.67(1H，dd，J＝17.8，5.1Hz)，2.27-2.23(1H，m)，1.93(3H，s)，1.48-1.42(4H，m)，1.37(9H，s)，1.24(3H，t，J＝7.2Hz)，0.86-0.81(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃₎δ170.9，165.9，156.3，137.7，129.2，82.2，79.5，75.8，60.9，54.4，49.2，30.8，28.3(3x)，26.1，25.6，23.3，14.1，9.5，9.2；C²¹H³⁶N₂NaO⁵(M⁺+Na)之HRMS计算值：435.2471，实验值：m/z435.2477。

实例42.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-第三丁氧基-羰胺基-3-(1-乙基-丙氧基)-1-环己烯膦酸二乙酯(31b)

藉由类似28b之流程，在90℃下，将无水甲苯(50mL)中之溴乙烯29(4.21g，10mmol)、亚磷酸二乙酯(2.12g，15mmol)、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(3.43g，30mmol)与四(三苯膦)钯(0)(872mg，0.75mmol)之混合物加热12h。使该反应混合物通过硅藻土垫过滤，再在EtOAc(50mL)及水(30mL)间分配该滤液。再次以水(30mL)及盐水(30mL)清洗该有机相，以MgSO₄去水，再进行浓缩，以产生粗产物，使其自Et₂O/CH₂Cl₂再结晶，以产生呈白色结晶固体之膦酸酯31b(4.05g，85％)；m.p.167-169℃；TLC(EtOAc)R_f＝0.31；[α]_D ²⁰＝-88.8(c＝1.14，CHCl₃)；IR(胶片)3378，2901，1733，1626，1262，1159cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.57(1H，d，J_P-2＝21.6Hz)，5.81(1H，d，J＝9.0Hz)，5.06(1H，d，J＝8.9Hz)，4.06-4.01(5H，m)，3.88(1H，br s)，3.79-3.75(1H，m)，3.30(1H，t，J＝5.3Hz)，2.60-2.57(1H，m)，2.20-2.16(1H，m)，1.95(3H，s)，1.48-1.44(4H，m)，1.39(9H，s)，1.30-1.27(6H，m)，0.87-0.82(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ170.9，156.2，141.5，126.8(C-1，d，J_P-1＝181Hz)，82.1，79.6，76.0，62.0，61.9，54.2，49.1，31.0，28.3(3x)，26.0，25.5，23.3，16.37，16.33，9-5，9-1；³¹P NMR(202MHz，CDCl₃)δ17.25；C₂₂H₄₂N₂O₇P(M⁺+H)之HRMS计算值：477.2730，实验值：m/z 477.2732。

实例43.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯羧酸乙酯磷酸化物(15-H₃PO₄，克流感)

将化合物31a(1.24g，3mmol)溶于乙醇(20mL)中，再缓慢逐份加入热(50℃)磷酸溶液(10mL之1M溶液于乙醇中，10mmol)。在50℃下搅拌该溶液6h。在冷却至0℃后，过滤收集沈淀物，并以冰丙酮(3x 5mL)清洗，以产生呈白色晶体的克流感(998mg，81％)；m.p.187-190℃[lit.m.p.184-186℃]；[α]_D ²⁰＝-36.7(c＝1，H₂O)[lit.[α]_D＝-39.9(c＝1，H₂O)；或lit.[α]_D ²²＝-30.5(c＝0.480，H₂O)]；IR(胶片)3501，1734，1612，1150cm^-1；¹HNMR(600MHz，D₂O)δ6.91(1H，s)，4-39(1H，d，J＝8.0Hz)，4.32-4.30(2H，m)，4.11(1H，dd，J＝10.5，5.7Hz)，3.67-3.59(2H，m)，3.01(1H，dd，J＝17.4，5.4Hz)，2.60-2.56(1H，m)，2.14(3H，s)，1.61-1.50(4H，m)，1.34(3H，t，J＝7.1Hz)，0.94(3H，t，J＝7.3Hz)，0.89(3H，t，J＝7.3Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ178.1，170.3，140.7，130.4，87.2，77.9，65.2，55.4，52.0，30.9，28.3，27.9，25.2，16.1，11.36，11.30；³¹P NMR(162MHz，D₂O)δ0.43；C₁₆H₂₉N₂O₄(M⁺-H₃PO₄+H)之HRMS计算值：313.2127，实验值：m/z313.2132。C₁₆H₃₁N₂O₈P之分析计算值：C，46.83；H，7.61；N，6.83，实验值：C，46.72；H，7.68；N，6.75。

实例44.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-(1-乙基-丙氧基)-1-环己烯膦酸铵(3，零流感)

将膦酸二乙酯31b(2.38g，5mmol)溶于CH₂Cl₂(50mL)中，并在0℃下，以溴代三甲基硅烷(6.67mL，50mmol)处理。使该反应混合物回温至室温，搅拌18h，再在减压条件下浓缩。将该残余物溶于水(10mL)中，在室温下搅拌2h，再进行冻干。以Et₂O(3x20mL)清洗该残余之浅黄色固体残余物以产生白色固体，将其溶于NH₄HCO₃水溶液(0.1M溶液，20mL)中，在室温下搅拌1h，接着进行冻干，以产生呈白色固体之零流感3(1.56g，产率88％)；m.p.238-240℃(dec)；[α]_D ²⁰＝-56.7(c＝1.2，H₂O)；IR(胶片)3521，3212，2987，1712，1686，1121cm^-1；¹H NMR(600MHz，D₂O)δ6.15(1H，d，J^P-2＝18.8Hz)，4.12(1H，d，J＝8.1Hz)，3.94(1H，dd，J＝11.6，9.2Hz)，3.45-3.40(2H，m)，2.73-2.68(1H，m)，2.39-2.34(1H，m)，1.97(3H，s)，1.46-1.40(3H，m)，1.38-1.29(1H，m)，0.77(3H，t，J＝7.3Hz)，0.73(3H，t，J＝7.3Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ175.0，133.1，132.9(C-1，d，J_P-1＝170Hz)，843，76.0，52.9，49.7，29.3，25.3，25.0，22.2，8.5，8.3；³¹P NMR(162MHz，D₂O)δ10.35；C₁₃H₂₄N₂O₅P[M+H-2NH4]⁺之HRMS计算值：319.1423，实验值：m/z 319.1429。C₁₃H₃₁N₄O₅P.H₂O之分析计算值：C，41.93；H，8.93；N，15.04，实验值：C，41.89；H，8.99；N，15.07。

实例45.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-(1-乙基-丙氧基)-1-环己烯-1-膦酸乙酯铵盐(3c)

在氮气大气下，以乙醇中之乙酸钠(4.5mmol，4.5mL之1M溶液)，处理二乙酯31b(1.43g，3mmol)于乙醇(50mL)中之溶液。在室温下搅拌该混合物16h，接着以Amberlite IR-120(H⁺-形式)进行酸化。在40℃下搅拌该异相溶液2h，过滤，再在真空下浓缩。将该残余油体溶于水(15mL)中并进行冻干。以冰丙酮(20mL x3)清洗该残余无色固体，将其溶于NH₄HCO₃水溶液(15mL之0.1M溶液)中，在室温下搅拌1h，接着进行冻干，以产生呈白色固体之零流感单酯的铵盐3c(898mg，82％)。

C₁₅H₃₂N₃O₅P，mp 65-67℃；[α]_D ²⁰＝-36.2(c＝0.7，H₂O)；IR(净)3503，3211，2921，1714，1658，1121cm^-1；¹H NMR(600MHz，D₂O)δ6.33(1H，d，J_P-2＝19.2Hz)，4-23(1H，d，J＝9.4Hz)，3.99(1H，dd，J＝10.2，5.1Hz)，3.86-3.84(2H，m)，3.53(1H，br s)，3.48-3.45(1H，m)，2.76-2.73(1H，m)，2.41-2.37(1H，m)，2.07(3H，s)，1.61-1.40(4H，m)，1.24(3H，t，J＝6.8Hz)，0.89(3H，t，J＝7.1Hz)，0.84(3H，t，J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ175.1，136.4，130.3(C-1，d，J_P-1＝168Hz)，84.2，76.2，76.1，61.3，53.6，49.6，29.9，25.5，25.2，22.3，15.8，8.5；³¹P NMR(242MHz，D₂O)δ12.89；C₁₅H₂₈N₂NaO₅P[M+Na-NH4]⁺之HRMS计算值：370.1639，实验值：m/z370.1543。

实例46.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胍基-3-(1-乙基-丙氧基)-1-环己烯-1-膦酸乙酯铵盐(13c)

在氮气大气下，以乙醇中之乙酸钠(6mmol，6mL之1M溶液)，处理二乙酯12b(2.73g，4mmol)于乙醇(60mL)中之溶液。在室温下搅拌该混合物18h，接着以Amberlite IR-120(H⁺-形式)进行酸化。在40℃下搅拌该异相溶液3h，过滤，再在真空下浓缩。将该残余油体溶于水(15mL)中并进行冻干。以冰丙酮(20mL x3)清洗该残余无色固体，将其溶于NH₄HCO₃水溶液(15mL之0.1M溶液)中，在室温下搅拌1h，接着进行冻干，以产生呈白色固体之零流感胍单酯的铵盐13c(1.22g，75％)。

C₁₅H₃₄N₅O₅P，mp 70-72℃；[α]_D ²⁰＝-11.5(c＝0.6，H₂O)；IR(净)3521，1931，1756，1623，1210cm^-1；¹H NMR(600MHz，D₂O)δ6.29(1H，d，J_P-2＝19.1Hz)，4.25-4.22(1H，m)，3.91-3.82(4H，m)，3.51(1H，br s)，2.57-2.55(1H，m)，2.24-2.20(1H，m)，2.01(3H，s)，1.63-1.49(3H，m)，1.44-1.40(1H，m)，1.24(3H，t，J＝6.9Hz)，0.88(3H，t，J＝7.0Hz)，0.82(3H，t，J＝7.0Hz)；¹³C NMR(150MHz，D₂O)δ174.5，160.3，136.5，131.8(C-1，d，J_P-1＝171Hz)，84.2，76.9，76.8，61.2，55.6，51.0，31.6，25.6，25.3，22.0，15.7，8.5；C₁₆H₃₀N₄NaO₅P[M+Na-NH4]⁺之HRMS计算值：412.1857，实验值：m/z412.1859。

实例47.(3R，4R，5S)-4-乙酰胺基-5-胺基-3-(1-乙基-丙氧基)-1-环己烯-1-膦酸二乙酯(3b)

在氢气大气下，于室温，以林德拉催化剂(80mg)，对迭氮化物11b(204mg，0.5mmol)于乙醇(18mL)中之溶液处理16h。使该反应混合物通过硅藻土过滤，再以乙醇冲洗。在减压条件下蒸发该滤液，产生无色之泡沫体(183mg)，其以闪蒸管柱层析(MeOH/CH₂Cl₂，1∶4)纯化，产生膦酸二乙酯3b(141mg，产率75％)，浅黄色油体；[α]_D ²⁰＝-50.6(c＝2，CHCl₃)；IR(净)3321，2911，1702，1663，1510cm^-1；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ6.51(1H，d，J_P-2＝21.7Hz)，6.29(1H，d，J＝7.4Hz)，4.06-4.00(5H，m)，3.55(1H，dd，J＝18.5，9.4Hz)，3.28-3.26(1H，m)，3.19-3.09(1H，m)，2.59-2.56(1H，m)，2.28(3H，br s)，2.06-2.01(1H，m)，1.98(3H，s)，1.55-1.40(3H，m)，1.38-1.25(6H，m)，0.85-0.81(6H，m)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ171.2，141.7，127.3(C-1，d，J_P-1＝180Hz)，81.8，75.4，62.1，62.0，58.4，49.6，33.6，26.1，25.5，23.5，16.35，16.32，9.5，9.2；³¹P NMR(162MHz，CDCl₃)δ17.69；C₁₇H₃₄N₂O₅P(M+H)之HRMS计算值：377.2205，实验值：m/z 377.2207。

尽管本发明之组合物及方法已以目前视为最为实际且较佳的实施进行叙述，咸须明了，该揭示内容并不须限于所揭示之实施。其系欲涵括申请专利范围之精神及范围内所包括之各种不同修饰及类似安排，该申请专利范围之范围应符合其最广释义，以使其涵括所有此等修饰及类似结构。本揭示内容包括前述申请专利范围之任何及所有实施。

Claims (11)

1.一种式I化合物： 

其中A系PO(OR)(OR′)，其中R及R′独立选自H、C1-C6烷基及铵所组成之群；且 

R₁系NH₂、NH₃ ⁺H₂PO₄ ^-、或NH(C＝NH)NH₂。 

2.如权利要求1所述的化合物，其具以下结构： 

3.如权利要求1所述的化合物，其具以下结构： 

4.如权利要求1所述的化合物，其具以下结构： 

5.如权利要求1所述的化合物，其具以下结构： 

6.如权利要求1所述的化合物，其具以下结构： 

7.一种组合物，其包含治疗有效量之权利要求1-6中任一项的化合物以及医药载体。 

8.权利要求1-6中任一项的化合物作为制备治疗生物体流感药物的应用。 

9.如权利要求8所述的应用，其中该生物体是动物。 

10.如权利要求9所述的应用，其中该生物体是人类。 

11.如权利要求8所述的应用，其中该生物体具有类流感症状。 

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