CN101910406A

CN101910406A - 减少氧化还原活性金属离子对纤维素材料酶水解抑制作用的方法

Info

Publication number: CN101910406A
Application number: CN2008801237159A
Authority: CN
Inventors: 徐丰
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2010-12-08
Also published as: EP2235191A2; WO2009059234A3; WO2009059234A2; BRPI0818141A2; US20090130707A1

Abstract

本发明涉及产生下述纤维素材料的方法，即其具有还原态的氧化还原活性金属阳离子，其氧化还原电势(E^o)范围为约-0.4到约1.2伏，该方法包括用有效量的螯合剂处理所述纤维素材料以减少所述氧化还原活性金属阳离子对所述纤维素材料的酶降解或转化的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。本发明亦涉及供降解或转化纤维素材料的方法以及产生发酵产物的方法。

Description

减少氧化还原活性金属离子对纤维素材料酶水解抑制作用的方法

对序列表的援引

本申请包含计算机可读形式的序列表。本申请通过援引并入该序列表。

发明背景

技术领域

本发明涉及减少由氧化还原活性金属阳离子对纤维素分解酶组合物的抑制作用以改善纤维素材料水解为可发酵的糖类。

背景技术

供乙醇及其它化学物质产生的生物质原料在组成上为复杂的，包括纤维素，半纤维素，木质素与其它组分。在所述其它组分中包括金属阳离子。尽管碳水化合物为开发生物提炼酶(biorefinery enzyme)的主要目标，其它次要的生物质组分亦映入人眼帘，这是因为它们可能对纤维素材料的水解起不利作用。

在玉米秸秆，一种主要的生物质原料中，氧化铁可构成灰组分的0.5％(Morey等，2006，Characterization of feed streams and emissions from biomass gasification/combustion at fuel ethanol plants.American Society of Agricultural and Biological Engineers Annual International Meeting(Portland，Oregon USA，2006)，Paper#064180)。已有Fe(II)化合物对多种纤维素酶的抑制作用的报道Ferchak and Pye 1983，Biotechnol.Bioengineer.25：2865-2872；Okada 1988，Methods in Enzymology 160：259-264；Ohmiya等，1995，Plant Cell.Physiol.36，607-614；Li等，2003，Enzyme Microb.Technol.33：932-937；Li等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.70：430-436)。

美国专利Nos.5677154与5932456描述了自生物质产生乙醇与其它发酵产物，其中亚铁金属通过磁性方法移除。

本发明涉及减少氧化还原活性金属阳离子对纤维素材料酶水解的抑制作用的方法。

发明综述

本发明涉及产生氧化还原活性金属阳离子减少的纤维素材料的方法，所述金属阳离子具有范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原电势(E^o)(a cellulosic material reduced in a redox active metal cation having a redox potential(E^o)in the range ofabout-0.4to about 1.2volts)，该方法包括用有效量的螯合剂处理所述纤维素材料以减少所述氧化还原活性金属阳离子对酶降解或转化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还(and alternatively also)在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

本发明亦涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括：用有效量的纤维素分解酶组合物处理所述纤维素材料，其中将所述纤维素材料用有效量的螯合剂处理以减少具有氧化还原电势(E^o)范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原活性金属阳离子对用所述纤维素分解酶组合物酶降解或转化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

本发明亦涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；以及(c)回收发酵产物，其中用有效量的螯合剂处理所述纤维素材料以减少具有氧化还原电势(E^o)范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原活性金属阳离子对酶糖化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

附图简述

图1显示pAlLo27的限制性酶切图。

图2显示pMJ04的限制性酶切图。

图3显示pCaHj527的限制性酶切图。

图4显示pMT2188的限制性酶切图。

图5显示pCaHj568的限制性酶切图。

图6显示pMJ05的限制性酶切图。

图7显示pSMai130的限制性酶切图。

图8显示米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶天然信号序列的DNA序列和氨基酸序列(SEQ ID NO：95和96)。

图9显示特异腐质霉(Humicola insolens)内切葡聚糖酶V信号序列的DNA序列和氨基酸序列(SEQ ID NO：99和100)。

图10显示pSMai135的限制性酶切图。

图11显示pSMai140的限制性酶切图。

图12显示pSaMe-F1的限制性酶切图。

图13显示pSaMe-FX的限制性酶切图。

图14显示pAlLo47的限制性酶切图。

图15显示pSaMe-FH的限制性酶切图。

图16显示Fe(II)(10mM)对PCS水解的作用。所述水解使用每升50mM乙酸钠pH 5中43g PCS和0.25g纤维素分解酶组合物#2在50℃下进行。

图17A与17B显示了10mM FeSO₄对由纤维素分解酶组合物#1(A)纤维素分解酶组合物#2(B)进行的PCS水解的作用。所述水解使用每升50mM乙酸钠pH 5中43g PCS和0.25g纤维素分解酶组合物#1或#2在50℃下进行。

图18显示选定的氧化性金属阳离子和络合物的氧化还原电势与纤维素水解抑制作用之间的关联。关于E^o与纤维素分解酶组合物#1催化的水解的起始速率来自表3与4以及正文。关联线：相关率＝-46E^o+56，r²＝0.264。

图19A，19B，19C与19D显示Fe(II)对由纤维素分解酶组合物#1进行的

水解(A与B)以及对由纤维素分解酶组合物#1进行的PASC水解(C与D)的有效抑制浓度范围。所述

水解使用每升50mM乙酸钠pH 5中23g

与0.25g纤维素分解酶组合物#1在50℃下进行。FeSO₄(mM)：(○)0，(+)1，(△)3，(◇)5，(□)10。Dixon曲线线性回归线：1/速率＝(0.035±0.003)[Fe(II)]+(0.043±0.015)，r²＝0.978。速率自在24与6小时处的水解差异(％)进行估算。所述PASC水解使用每升50mM乙酸钠pH 5中2gPASC与50mg纤维素分解酶组合物#1在50℃下进行。Dixon曲线线性回归线：1/速率＝(0.0042±0.0003)[Fe(II)]+(0.059±0.002)，r²＝0.994。速率自在7小时处的水解差异(％)进行估算。

图20A，20B，20C与20D显示了10mM FeSO₄对里氏木霉(Trichoderma reesei)CEL7A CBHI(A)，CEL6A CBHII(B)，CEL7B EGI(C)与CEL5A EG-II(D)的作用。所述水解使用每升乙酸钠pH 5中2g PASC与40mg的酶在50℃下进行。

图21显示了10mM FeSO₄对米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的作用。所述水解使用每升50mM乙酸钠pH5中2g纤维二糖与1mg β-葡糖苷酶在50℃下进行。

图22A与22B显示了Fe(II)的氧化与螯合对抑制由纤维素分解酶组合物#2进行的PCS水解的作用。所述水解使用每升50mM乙酸钠pH 5中43g PCS与0.25g的纤维素分解酶组合物#2在50℃下进行。(A)Fe(II)与其氧化的作用：添加至水解的添加剂：(○)无，(□)2.5mM FeSO₄，(◇)2.5mM FeSO₄与10mMH₂O₂，(△)2.5mM FeSO₄，10mM H₂O₂与10mM去铁草酰胺。(B)H₂O₂与去铁草酰胺的作用：添加至水解的添加剂：(○)无，(×)10mM H₂O₂，(+)10mMH₂O₂与10mM去铁草酰胺。

图23A，23B，23C与23D显示了Fe(II)螯合剂的作用。所述水解使用每升50mM乙酸钠pH5中43g PCS与0.25g的纤维素分解酶组合物#2在50℃下进行。

定义

氧化还原活性金属阳离子：术语“氧化还原活性金属阳离子”在本文中定义为能够进行还原-氧化(缩写为氧化还原(redox))化学反应，并在该反应中其氧化值(氧化状态)发生变化的金属阳离子。该离子在氧化反应中丧失一个或更多电子。该离子在还原反应中得到一个或更多电子。在此申请中感兴趣的氧化还原活性金属阳离子针对标准氢电极具有范围为-0.4到1.2伏的氧化还原电势。该离子可为游离(仅经水合)于溶液的，或为由配体或螯合剂配位的(以形成金属阳离子络合物)。

氧化还原电势：术语“氧化还原电势”亦称为氧化/还原电势，并通常表示为E^o，在本文中定义为内在的热力学参数，其描述了化学物种(包括金属阳离子)丧失或获得电子的倾向。E^o是愈大的正值(more positive)，则该物种对电子的亲和性与其被还原的倾向性(同时氧化其它物种)愈强。

螯合剂：术语“螯合剂(chelator)”，亦称为配体，螯合物(chelant)，螯合试剂(chelating agent)或掩蔽剂(sequesting agent)，在本文中定义为下述离子或分子，即其通过给出其一个或更多电子填充到中心金属的空轨道中从而与中心金属键合。典型的螯合剂包括在它们的氨基，羧基，巯基或杂原子芳香官能团中的N，O或S原子。本申请的目标螯合剂为那些对氧化还原活性金属阳离子的氧化态(高价)较之其还原态(低价)具有更大偏好的螯合剂。

亚铁离子：术语“亚铁离子”在本文中定义为具有氧化值为+2的铁，其表示为Fe²⁺或Fe(II)，而铁表示其氧化值为+3，其表示为Fe³⁺或Fe(III)。

纤维素分解活性：术语“纤维素分解活性”在本文中定义为水解含纤维素材料的生物学活性。纤维素分解蛋白可水解滤纸(FP)，由此减少不可溶的纸的重量，并增加可溶性糖的量。该反应可通过检测与对羟基苯甲酰肼(p-hydroxybenzoic acid hydrazide)形成有色产物的还原糖来测定，以Filter Paper Assay Unit(滤纸测定单位)(FPU)的形式确定。纤维素分解蛋白可水解微晶纤维素或其它纤维质物质，由此减少不可溶的纤维素的重量并增加可溶性糖的量。该反应可通过用对羟基苯甲酰肼，高效液相色谱(HPLC)或电化学糖检测器(electrochemical sugar detector)检测还原糖的方法来测定。纤维素分解蛋白可水解可溶的，产色的，产荧光的或其它类似的糖苷物质，由此增加发色的，发荧光的或其它物理上可检测出的产物的量。该反应可使用分光光度计，荧光计或其它仪器监测。纤维素分解蛋白可水解羧甲基纤维素(CMC)，由此减少培育混合物的粘度。所导致的粘度减少可通过振动粘度计(vibration viscosimeter)(例如，来自Sofraser，France的MIVI 3000)来确定。以Cellulase Viscosity Unit(纤维素酶粘度单位)(CEVU)的形式确定纤维素酶活性，是通过测定样品减少羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力来量化存在于该样品中的催化活性。所述分析法在适于所述纤维素分解蛋白与底物的温度与pH下进行。举例而言，对CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S，

Denmark)，该分析法在40℃下在0.1M磷酸盐pH9.0缓冲液中以CMC作为底物(33.3g/升羧甲基纤维素Hercules 7LFD)以及大约3.3-4.2CEVU/ml的酶浓度进行。所述CEVU活性相对于已公知的酶标准，例如CELLUZYME^TM Standard17-1194(得自Novozymes A/S，

Denmark)来计算。

为了本发明的目标，纤维素分解活性通过测定在下述条件下由纤维素分解酶组合物进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-10mg的纤维素分解蛋白/g的PCS纤维素在50℃下进行5-7日，与未添加纤维素分解蛋白的对照水解相比较。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为一种内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(诸如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷联结；混合型β-1，3葡聚糖如谷物(cereal)β-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其他含纤维素组分的植物材料中的β-1，4键的内水解(endohydrolysis)。为本发明的目的，内切葡聚糖酶活性是根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的程序利用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定的。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为一种1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化水解纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-葡糖苷联结，从链的还原端或非还原端释放纤维二糖。为本发明的目的，纤维二糖水解酶活性是依照Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279和van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288记载的程序加以测定的。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化水解末端非还原性β-D-葡萄糖残基，并释放β-D-葡萄糖。为本发明的目的，β-葡糖苷酶活性是根据Venturi等，2002，J.Basic Microbiol.42：55-66记载的程序来测定的。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为：在100mM柠檬酸钠、0.01％

20中，50℃、pH 5条件下每分钟从作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷产生1.0微摩尔对硝基苯酚。

纤维素分解增强活性：术语“分解纤维素增强活性”在本文中定义为GH61多肽增强由具有纤维素分解活性的蛋白质对纤维素材料的水解的生物活性。为了本发明的目的，纤维素分解增强活性通过在下述条件下测定由纤维素分解蛋白进行的纤维素材料水解所得的还原糖的增加或总纤维二糖与葡萄糖的增加来确定：1-50mg总蛋白质/gPCS中的纤维素，其中总蛋白质包括80-99.5％w/w纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素与0.5-20％w/w的具纤维素分解增强活性的蛋白质在50℃下进行1-7日，与用相同总量但无纤维素分解增强活性的蛋白质加样进行的对照水解进行比较(1-50mg纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素)。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同程度水解所需的纤维素分解酶的量降低优选至少0.1倍，更优选至少0.2倍，更优选至少0.3倍，更优选至少0.4倍，更优选至少0.5倍，更优选至少1倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少10倍，更优选至少20倍，甚至更优选至少30倍，最优选至少50倍，并且甚至最优选至少100倍，来增强由具有纤维素分解活性的蛋白质催化的纤维素材料的水解。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，和Henrissat B.，and Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696落入糖苷水解酶家族61的多肽。目前，Henrissat将GH61家族列为未分类的，这指明对属于该家族的多肽，如机理，催化性亲核体/碱，催化性质子供体，以及3D结构等性质尚在未知之数。

纤维素材料：生物质的初生细胞壁中主要的多糖是纤维素，丰度第二高的是半纤维素，第三是果胶。在细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且通过与半纤维素共价交联的多聚体木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并因此是一种直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有复杂的分枝结构和一系列取代基。虽然纤维素一般是无定形的，但植物组织中发现的纤维素主要为由平行葡聚糖链构成的不溶性晶体基质。半纤维素通常通过氢键键合于纤维素以及其他半纤维素上，这有助于细胞壁基质的稳定化。

纤维素材料可以是任何含有纤维素的材料。纤维素通常存在于例如植株的茎、叶、果/种壳(hulls)、果/种皮(husks)和穗轴(cobs)，或者树的叶、枝、和木材等之中。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料(herbaceous material)、农业残余物(agricultural residues)、林业残余物(forestry residues)、城市固体废物(municipal solid wastes)、废纸(waste paper)，以及纸浆和造纸厂残余物(pulp and paper mill residue)。纤维素材料可以是任何类型的生物质，包括但不限于木材资源、城市固体废物、废纸、作物和作物残余物(见例如Wiselogel等，1995，《Handbook on Bioethanol》(Charles E.Wyman编)，第105-118页，Taylor &Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25：695-719；Mosier等，1999，Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics，《Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology》，T.Scheper总编，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag，New York)。在本文中应当理解，纤维素材料可为木素纤维素的形式，即在混合的基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。

在一方面，所述纤维素材料为草本材料。在另一方面，所述纤维素材料为农业残余物。在另一方面，所述纤维素材料为林业残余物。在另一方面，所述纤维素材料为城市固体废物。在另一方面，所述纤维素材料为废纸。在另一方面，所述纤维素材料为纸浆和造纸厂残余物。

在另一方面，所述纤维素材料为玉米秸秆。在另一优选的方面，所述纤维素材料为玉米纤维。在另一方面，所述纤维素材料为玉米穗轴。在另一方面，所述纤维素材料为橙皮。在另一方面，所述纤维素材料为稻秆。在另一方面所述纤维素材料为麦秆。在另一方面，所述纤维素材料为柳枝稷(switch grass)。在另一方面，所述纤维素材料为芒草(miscanthus)。在另一方面，所述纤维素材料为甘蔗渣。

纤维素材料可以直接使用，或者可以使用本领域已知的常规方法对其进行预处理。例如，物理预处理技术可包括各种类型的粉碎(milling)、辐射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆破(steaming/steam explosion)、和湿热分解作用(hydrothermolysis)；化学预处理技术可包括稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳、和pH受控的湿热分解作用；而生物预处理技术可涉及施用溶解木质素的微生物(参见，例如Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，《Handbook on Bioethanol：Production and Utilization》，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，《Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production》，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，《Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology》，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

预处理玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”在本文中定义为通过用热和稀酸处理从玉米秸秆衍生的纤维素材料。为本发明的目的，PCS是由实施例26所述方法或改变其时间、温度和酸量的变化形式来制备的。

分离的多肽：本文所用的术语“分离的多肽”是指自来源分离的多肽。在一个优选的方面，所述多肽是通过SDS-PAGE测定为至少1％纯、优选至少5％纯、更优选至少10％纯、更优选至少20％纯、更优选至少40％纯、更优选至少60％纯、甚至更优选至少80％纯、和最优选至少90％纯的。为了本发明的目的，术语“多肽”应理解为包括全长多肽，成熟多肽或催化结构域；或其具有酶活性的部分或片段。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文是指这样的多肽制备物，其含有以重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，和甚至最优选至多0.5％的与其天然地或重组地相伴随的(associated)其他多肽物质。因此，优选的是，基本上纯的多肽以制备物中存在的总多肽物质的重量计是至少92％纯、优选至少94％纯、更优选至少95％纯、更优选至少96％纯、更优选至少96％纯、更优选至少97％纯、更优选至少98％纯、甚至更优选至少99％、最优选至少99.5％纯、和甚至最优选100％纯的。多肽优选是基本上纯的形式，即，多肽制备物实质上不含与其天然地或重组地相伴随的其他多肽物质。这可以通过例如用公知的重组技术或通过经典的纯化方法制备所述多肽来实现。

分离的多核苷酸：本文中所用的术语“分离的多核苷酸”是指自来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，所述多核苷酸通过琼脂糖电泳测定为至少1％纯、优选至少5％纯、更优选至少10％纯、更优选至少20％纯、更优选至少40％纯、更优选至少60％纯、甚至更优选至少80％纯、最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：本文中所用的术语“基本上纯的多核苷酸”是指这样的多核苷酸制备物，其不含有其他无关或不需要的核苷酸，并且处于适合在经基因工程改造的蛋白质生产系统中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有以重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，和甚至最优选至多0.5％的与其天然地或重组地相伴随的其他多核苷酸物质。但是，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸以重量计为至少90％纯、优选至少92％纯、更优选至少94％纯、更优选至少95％纯、更优选至少96％纯、更优选至少97％纯、甚至更优选至少98％纯、最优选至少99％纯、和甚至最优选至少99.5％纯。多核苷酸优选是处于基本上纯的形式，即多核苷酸制备物实质上不含与其天然地或重组地相伴随的其他多核苷酸物质。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或者上述来源的任意组合。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为这样的DNA分子，它能够从获自真核细胞的成熟的、经剪接的mRNA分子通过逆转录制备得到。cDNA缺少在对应的基因组DNA中可能存在的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，它经历一系列步骤被加工之后作为成熟的、经剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过一个称为剪接的过程去除内含子序列。因此，从mRNA衍生而来的cDNA缺少任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”在用于本文时是指这样的单链或双链核酸分子：其是从天然存在的基因分离的，或者经过修饰而以原本不会存在于自然界中的方式包含核酸的片段，或者是合成的。当核酸构建体包含编码序列的表达所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”是同义的。

控制序列：术语“控制序列”在本文中定义为包括编码多肽的多核苷酸的表达所必需的所有组件。每个控制序列对于编码多肽的核苷酸序列而言可以是天然的或者外来的，或者每个控制序列对于彼此而言可以是天然的或者外来的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽(propeptide)序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最低程度上，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以具有接头，用来引入特异性限制性位点以帮助将控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文中是指这样一种构型，其中控制序列相对于多核苷酸序列的编码序列被置于合适的位置上，使得该控制序列指导多肽编码序列的表达。

编码序列：当用于本文时，术语“编码序列”是指这样的核苷酸序列，它直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般是由可读框决定的，后者通常以ATG起始密码子或其他可选的起始密码子如GTG及TTG开始，而以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、或重组的核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括多肽产生过程中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文中定义为一种线性或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，且可操作地连接于为其表达而提供的其他核苷酸。

宿主细胞：术语“宿主细胞”在用于本文时包括任何易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体所转化、转染、转导等的细胞类型。

发明详述

本发明涉及减少具有氧化还原电势(E^o)范围在约-0.4到约1.2伏的氧化还原活性金属阳离子对纤维素分解酶组合物的抑制作用以改善纤维素材料酶糖化(enzymatic saccharification)成可发酵的糖的效率的方法，所述糖可随即通过发酵转化为所期望的发酵产物。自纤维素材料产生所期望的发酵产物通常需要三个主要步骤，包括预处理，酶水解(糖化)与发酵。

所述纤维素材料优选经预处理以减小颗粒尺寸，破坏纤维壁，并暴露纤维素材料的碳水化合物。所述预处理增加所述纤维素材料碳水化合物对酶水解的易感性。然而，预处理亦可暴露氧化还原活性金属阳离子，例如，亚铁离子，其可在所述碳水化合物的酶水解过程中抑制所述纤维素分解酶组合物的组分。此外，在所述碳水化合物的酶水解过程中，可释放更多的抑制性氧化还原活性金属阳离子，其可进一步抑制所述纤维素分解组合物。因此，本发明改善纤维素材料酶糖化成可发酵糖类以及所述糖类转化为所期望的发酵产物的效率。氧化还原活性金属阳离子通常以无机盐或与视为Lewis碱的有机物质形成的络合物的形式存在于纤维素材料中。

在一方面，本发明涉及产生氧化还原活性金属阳离子减少的纤维素材料的方法，所述氧化还原活性金属阳离子具有范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原电势(E^o)，该方法包括用有效量的螯合剂处理所述纤维素材料以减少所述氧化还原活性金属阳离子对酶降解或转化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。举例而言，可包含有效量的氧化剂以将Fe(II)转化为Fe(III)，从而使得所述螯合剂可结合Fe(III)。

在另一方面，本发明亦涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括：用有效量的纤维素分解酶组合物处理所述纤维素材料，其中将所述纤维素材料用有效量的螯合剂处理以减少具有氧化还原电势(E^o)范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原活性金属阳离子对用所述纤维素分解酶组合物酶降解或转化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

在进一步的方面，本发明亦涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的步骤(a)的纤维素材料以产生发酵产物；以及(c)回收发酵产物，其中用有效量的螯合剂处理所述纤维素材料以减少具有氧化还原电势(E^o)范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原活性金属阳离子对酶糖化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

在本发明的方法中，所述氧化还原活性金属阳离子选自下组：Fe(II)，Fe(III)，Cu(II)，Cr(III)与Ru(III)。

在一方面，所述氧化还原活性金属阳离子为Fe(II)。在另一方面，所述氧化还原活性金属阳离子为Fe(III)。在另一方面，所述氧化还原活性金属阳离子为Cu(II)。在另一方面，所述氧化还原活性金属阳离子为Cr(III)。在另一方面，所述氧化还原活性金属阳离子为Ru(III)。

加工纤维素材料

本发明的方法可用于将纤维素材料，例如，木素纤维素，糖化成为可发酵的糖，并将该可发酵的糖转化为多种有用的物质，例如，化学品与染料。自所述纤维素材料产生所期望的发酵产物通常涉及预处理，酶水解(糖化)与发酵。

根据本发明对所述纤维素材料的加工可使用本领域常规方法达成。此外，本发明的方法可使用任何经配置以依照本发明操作的常规生物质加工装置加以实施。

分别或同时的水解(糖化)与发酵包括但不仅限于：分别水解与发酵(SHF)；同时糖化与发酵(SSF)；同时糖化与共发酵(SSCF)；混合水解与发酵(HHF)；SHCF(分别水解与共发酵)；HHCF(混合水解与共发酵(hybrid hydrolysis and cofermentation))，以及直接微生物转化(DMC)。SHF使用分别的过程步骤以首先将所述纤维素材料，例如，木素纤维素，酶水解为可发酵的糖，例如，葡萄糖，纤维二糖，纤维三糖与戊糖，并随即将所述可发酵的糖发酵为乙醇。在SSF中，所述纤维素材料，例如，木素纤维素的酶水解，以及糖发酵为乙醇合并为一步(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，《Handbook on Bioethanol：Production and Utilization》，Wyman，C.E.编辑，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF涉及多种糖类的共发酵(Sheehan，J.，and Himmel，M.，1999，Enzymes，energy and the environment：A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF涉及分别的水解分离步骤，并另外涉及同时的糖化与水解步骤，其可在同一个反应器中进行。在HHF过程中的步骤可在不同温度下进行，亦即，高温酶糖化继以在较低的、发酵菌株可容忍的温度下的SSF。DMC将所有三个过程(酶产生，木素纤维素水解与发酵)合并于一个或更多步骤，其中使用相同生物体来产生酶以供将所述纤维素材料，例如，木素纤维素，转化为可发酵的糖，并将所述可发酵的糖转化为终产物(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，and Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。在本文中应理解本领域任何包括预处理，酶水解(糖化)，发酵或其组合的已知方法可用于实施本发明的方法。

常规装置可包括分批补料搅拌反应器(fed-batch stirred reactor)，分批搅拌反应器(batch stirred reactor)，带超滤的连续流动搅拌反应器(continuous flow stirred reactor with ultrafiltration)和/或连续的活塞流柱式反应器(continuous plug-flow column reactor)(Fernanda de Castilhos Corazza，Flávio Faria de Moraes，Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel，2003，Optimal controlin fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis，Acta Scientiarum.Technology 25：33-38；Gusakov，A.V.，and Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose：1.A mathematical model for a batch reactor process，Enz.Microb.Technol.7：346-352)，磨耗反应器(an attrition reactor)(Ryu，S.K.，and Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.25：53-65)，或者带有由电磁场诱导的剧烈搅拌的反应器(areactor with intensive stirring induced by an electromagnetic field)(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.56：141-153)。其他类型的反应器包括：流化床(fluidized bed)、上流床(upflow blanket)、固定化的以及挤压器(extruder)类型反应器以供水解和/或发酵。

所述纤维素材料可在预处理之前，之中和/或之后，水解过程中，和/或发酵过程中用螯合剂处理。在一个优选方面，所述纤维素材料在预处理前用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在预处理过程中用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在预处理后用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在预处理之前，之中与之后用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在预处理之前，之中与之后中的两个或更多组合的过程中用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在水解过程中用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在发酵过程中用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在预处理之前，之中与之后，在水解过程中，以及在发酵过程中用螯合剂处理。在另一个优选方面，所述纤维素材料在预处理之前，之中与之后，在水解过程中，以及在发酵过程中的任意组合的过程中用螯合剂处理。在上述每一个方面，当所述氧化还原活性金属阳离子处于低价状态(例如，Fe(II))，并需要转化为高价状态(例如Fe(III))时，亦包含氧化剂。

预处理在实施本发明的方法时，本领域已知的任何预处理过程可用于破坏植物细胞壁组分。所述纤维素材料，例如，木素纤维素，亦可在预处理之前使用本领域已知方法对其进行预浸(pre-soaking)，润湿(wetting)，或调理(conditioning)。常规预处理包括但不限于，蒸汽预处理(爆炸或不爆炸)，稀酸预处理，热水预处理，石灰预处理，湿氧化，湿爆炸，氨纤维爆炸，有机溶剂预处理以及生物预处理。其它预处理包括超声，电穿孔，微波，超临界CO₂，超临界H₂O，与氨渗滤预处理。

所述纤维素材料可在水解和/或发酵前进行预处理。预处理优选在水解前进行。或者，所述预处理可与水解过程同时进行，例如与用一种或多种纤维素分解酶，或其它酶活性，例如，半纤维素酶处理纤维素材料同时进行，以释放可发酵的糖，例如葡萄糖和/或麦芽糖。在多数情况下，所述预处理步骤本身导致生物质部分转化为可发酵的糖(甚至酶不存在时亦如此)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，将所述纤维素材料加热以破坏其植物细胞壁组分，包括，例如，木质素，半纤维素与纤维素，以使所述纤维素与其它部分(例如，半纤维素)易受酶作用(accessible to enzymes)。使所述纤维素材料经过或通过反应容器，在该反应容器中注入蒸汽以增加温度至所需温度并增加压力，并在其中保持到所期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃下进行，更优选为160-200℃，且最优选为170-190℃，其中最佳温度范围取决于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的滞留时间优选为1-15分钟，更优选为3-12分钟，且最优选为4-10分钟，其中最佳滞留时间取决于温度范围和任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体装载，从而使得所述纤维素材料通常仅在预处理过程中为潮湿的。所述蒸汽预处理常常与预处理之后对所述材料的爆破性排出(explosive discharge)组合，其称为蒸汽爆破，亦即，所述材料迅速闪露于大气压力与湍流以通过碎裂增加其可接触表面积(Duff and Murray，1996，Bioresource Technology 855：1-33；Galbe and Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基团遭剪切，且所得的酸自催化半纤维素部分水解为单糖与寡糖。木质素仅部分程度移除。

如H₂SO₄或SO₂等的催化剂(通常为0.3到3％w/w)常常在蒸汽预处理前添加，其减少时间与温度，增加回收，并改善酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132：496-508；Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116：509-523；Sassner等，2006，Enzyme Microb.Technol.39：756-762)。

化学预处理：术语“化学预处理”指任何促进纤维素，半纤维素和/或木质素分离和/或释放的化学预处理。合适的化学预处理过程的示例包括，例如，稀酸预处理，石灰预处理，湿氧化，氨纤维/冷冻爆炸(ammonia fiber/freeze explosion，AFEX)，氨渗滤(APR)以及有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，将所述纤维素材料与稀酸，通常为H₂SO₄，以及水混合以形成浆料，由蒸汽加热至所期望的温度，并在滞留时间后闪露于大气压力。所述稀酸预处理可用多种设计的反应器来实施，例如，活塞流反应器，逆流反应器(counter-current reactor)或连续逆流收缩床反应器(continuous counter-current shrinking bed reactor)(Duff and Murray，1996，supra；Schell等，2004，Bioresource Technol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。

亦可使用数种碱性条件下的预处理方法。这些碱性预处理方法包括但不限于，石灰预处理，湿氧化，氨渗滤(APR)与氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

石灰预处理使用碳酸钙，氢氧化钠或氨在85-150℃的低温下以及自1小时到数日的滞留时间下进行(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，2005，Bioresource Technol.96：673-686)。WO2006/110891，WO 2006/11899，WO 2006/11900与WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿氧化为下述的热预处理方法，即其通常在180-200℃下进行5-15分钟，加以如过氧化氢或氧气超压(over-pressure)等的氧化剂(Schmidt and Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：1669-1677)。该预处理优选以1-40％干物质，更优选2-30％干物质，且最优选5-20％干物质进行，且起始pH常常通过添加碱性物质，例如碳酸钠来增加。

所述湿氧化预处理方法的改进，称为湿爆炸(合并湿氧化与蒸汽爆炸)，可处理多达30％的干物质。在湿爆炸中，氧化剂在预处理过程中一定滞留时间之后导入。所述预处理随即通过闪露于大气压力来终止(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及用液态或气态氨在中等温度，例如90-100℃，以及高压，例如17-20巴下对纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可高达60％(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol. 96：2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚，以及半纤维素的部分水解。木质素-碳水化合物复合物遭剪切。

有机溶剂预处理通过用乙醇水溶液(40-60％乙醇)在160-200℃下提取30-60分钟来将纤维素材料脱木质化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90：473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素得到移除。

合适的预处理方法的其它示例由Schell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.Vol.105-108，p.69-85与Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及公布的美国申请2002/0164730描述。

在一方面，所述化学预处理优选作为酸处理来进行，且更优选作为连续性稀酸和/或温和酸处理进行。所述酸通常为硫酸，但亦可使用其它酸，例如，乙酸，柠檬酸，硝酸，磷酸，酒石酸，琥珀酸，盐酸或其混合物。温和酸处理在pH范围优选为1-5，更优选为1-4，且最优选为1-3下进行。在一方面，所述酸浓度范围为优选0.01到20wt％的酸，更优选0.05到10wt％的酸，甚至更优选0.1到5wt％的酸，且最优选0.2到2.0wt％的酸。所述酸与纤维素材料接触，并保持在范围优选为160-220℃，且更优选为165-195℃的温度下数秒至数分钟范围的时间段，例如，1秒到60分钟。

在另一方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一方面，预处理在水性浆料中进行。在优选的方面，所述纤维素材料在预处理过程中以优选为10-80wt％，更优选为20-70wt％，且最优选为30-60wt％，例如约50wt％的量存在。所述经预处理的纤维素材料可不经洗涤，或使用本领域任何已知方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理：术语“机械预处理”指不同类型的磨碎或碾磨(grinding or milling)(例如，干碾磨，湿碾磨，或振动球碾磨(vibratory ball milling))。

物理预处理：术语“物理预处理”指任何改善自含木素纤维素的材料分离和/或释放纤维素，半纤维素和/或木质素的预处理。举例而言，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)，汽蒸/蒸汽爆炸，湿热分解以及其组合。

物理预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一方面，高压意为范围在优选约300到约600psi，更优选约350到约550psi，且最优选约400到约500psi，例如约450psi的压力。在另一方面，高温意为范围在约100到约300℃，优选约140到约235℃的温度。在优选方面，机械预处理在分批过程，蒸汽枪水解仪系统中进行，所述系统使用如上所述定义的高压与高温，例如，可自SundsDefibrator AB，Sweden获取的Sunds Hydrolyzer。

物理和化学联合预处理：所述纤维素材料可经物理与化学方法两者预处理。举例而言，所述预处理步骤可涉及稀酸或温和酸处理以及高温和/或高压处理。所述物理与化学预处理可视需要顺次或同时进行。亦可包含机械预处理。

相应的，在优选方面，可对所述纤维素材料进行机械，化学或物理预处理，或其任意组合以促进纤维素，半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指任何促进自含木素纤维素的材料分离和/或释放纤维素，半纤维素和/或木质素的生物预处理。生物预处理技术可涉及施用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，《Handbook on Bioethanol：Production and Utilization》，Wyman，C.E.编辑，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh and Singh，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，《Enzymatic Conversion of Biomass.for Fuels Production》，Himmel，M.E.，Baker，J.O.，and Overend，R.P.编辑，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，chapter 15；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，and Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，《Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology》，Scheper，T.编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson and Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander and Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

糖化在亦称为糖化的水解步骤中，将所述经预处理的纤维素材料水解以分解纤维素，并且可选地还将半纤维素分解为可发酵的糖，例如葡萄糖，木糖，木酮糖，阿拉伯糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖或可溶性寡糖。所述水解用酶法通过纤维素分解酶组合物进行。该组合物的酶亦可顺次添加。

酶水解优选在合适的水溶液环境中在本领域技术人员可容易地确定的条件下进行。在优选方面，水解在适于所述酶活性，亦即，对于所述酶为最佳的条件下进行。所述水解可以按分批补料或连续过程的方式进行，在后者中将经预处理的纤维素材料(底物)逐渐进料至，例如，含有酶的水解溶液。

所述糖化通常在搅拌釜式反应器或发酵罐中在受控的pH，温度和混合条件下进行。合适的过程时间，温度与pH条件可由本领域技术人员容易地确定。举例而言，所述糖化可持续长达200小时，但通常优选进行约12到约96小时，更优选约16到约72小时，且最优选约24到约48小时。温度范围优选约25℃到约80℃，更优选约30℃到约70℃，且最优选约40℃到60℃。pH范围优选约3到约8，更优选约3.5到约7，且最优选约4到约6，特别为约pH5。干物质含量范围优选约5到约50wt％，更优选约10到约40wt％，且最优选约20到约30wt％。

所述纤维素分解酶组合物优选包含具有内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶与β-葡糖苷酶活性的酶。在优选方面，所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选方面，所述纤维素分解酶制备物补充有一种或多种额外的选自下组的酶活性：半纤维素酶，酯酶(例如，脂肪酶，磷脂酶和/或角质酶)，蛋白酶，漆酶，过氧化物酶或其混合物。在本发明的方法中，所述额外的酶可在发酵之前或之中添加，包括在发酵微生物繁殖过程之中或之后添加。

所述酶可源自或得自任何合适的来源，包括细菌，真菌，酵母或哺乳动物来源。在本文中术语“得自”意为该酶可分离自天然产生该酶作为天然酶的生物。在本文中术语“得自”亦意为所述酶可在宿主生物中使用本文所描述的方法重组产生，其中所述重组产生的酶对于所述宿主生物可为天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或更多缺失，插入和/或取代的氨基酸，亦即，该重组产生的酶为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或者其为通过本领域已知的核酸改组过程(nucleic acid shuffling process)产生的酶。天然酶含意所涵盖的范围包括天然变体，而外源酶含意所涵盖的范围包括重组获得的变体，例如，通过定位诱变或改组得到的变体。

用于本发明中的酶可为任何适用于本文所描述的方法中的形式，例如，有或无细胞的粗发酵培养液，或基本上纯的多肽。所述酶可为干粉或颗粒，无尘颗粒，液体，稳定化的液体或受保护的酶。颗粒可以，例如，如美国专利Nos.4106991与4661452中公开的来产生，且可任选地通过本领域已知的过程包被。液体酶制备物可，例如，通过添加稳定剂，例如糖，糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或另一个有机酸根据已经建立的过程加以稳定化。经保护的酶可根据公开于EP 238216中的过程加以制备。

所述具有纤维素分解增强活性的酶和多肽的最佳量取决于多种因素，包括但不限于，组分纤维素分解蛋白的混合物，所述纤维素底物，纤维素底物的浓度，所述纤维素底物的预处理，温度，时间，pH以及发酵生物的包括(例如，供同时糖化与发酵的酵母)。

在优选方面，针对纤维素材料纤维素分解蛋白的有效量为每g纤维素材料约0.5到约50mg，优选约0.5到约40mg，更优选约0.5到约25mg，更优选约0.75到约20mg，更优选约0.75到约15mg，甚至更优选约0.5到约10mg，且最优选约2.5到约10mg。

在另一个优选方面，针对纤维素材料具有纤维素分解增强活性的多肽的有效量为每g纤维素材料约0.01到约50.0mg，优选约0.01到约40mg，更优选约0.01到约30mg，更优选约0.01到约20mg，更优选约0.01到约10mg，更优选约0.01到约5mg，更优选约0.025到约1.5mg，更优选约0.05到约1.25mg，更优选约0.075到约1.25mg，更优选约0.1到约1.25mg，甚至更优选约0.15到约1.25mg，且最优选约0.25到约1.0mg。

在另一个优选方面，针对纤维素分解蛋白的具有纤维素分解增强活性的多肽的有效量为每g纤维素分解蛋白约0.005到约1.0g，优选约0.01到约1.0g，更优选约0.15到约0.75g，更优选约0.15到约0.5g，更优选约0.1到约0.5g，甚至更优选约0.1到约0.5g，且最优选约0.05到约0.2g。

发酵得自所述经预处理与水解的纤维素材料的可发酵的糖可由一种或多种能够将所述糖直接或间接发酵为所期望的发酵产物的发酵微生物进行发酵。“发酵”或“发酵过程”指任何发酵过程或任何包含发酵步骤的过程。发酵过程亦包括用于醇类消费品工业(例如，啤酒与葡萄酒)，乳制品工业(例如，发酵的乳制品)，皮革工业与烟草工业的发酵过程。发酵条件取决于所期望的发酵产物以及发酵生物，且可由本领域技术人员简单地确定。

在所述发酵步骤中，作为预处理与酶水解步骤的结果自所述纤维素材料释放的糖由发酵生物，例如酵母，发酵为产物，例如乙醇。可分别或同时进行水解(糖化)与发酵。上述方法包括但不限于，分别水解与发酵(SHF)；同时糖化与发酵(SSF)；同时糖化与共发酵(SSCF)；混合水解与发酵(HHF)；SHCF(分别水解与共发酵)；HHCF(混合水解与共发酵)，以及直接微生物转化(DMC)。

任何合适的经水解的纤维素材料可在实行本发明时用于所述发酵步骤。所述材料通常基于所期望的发酵产物(即，自发酵获取的物质)，以及所用的过程选择，如本领域为众所周知的。

在本文中术语“发酵培养基”应理解为指在添加发酵微生物之前的培养基，例如，由糖化过程产生的培养基，以及用于同时糖化与发酵过程(SSF)的培养基。

“发酵微生物”指任何微生物，包括细菌与真菌生物，其适用于所期望的发酵过程以产生发酵产物。所述发酵生物可为C₆和/或C₅发酵生物，或其组合。C₆与C₅发酵生物均在本领域为众所周知。合适的发酵微生物能够将糖，例如葡萄糖，木糖，木酮糖，阿拉伯糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖或寡糖直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。一些生物也能转化可溶的C6与C5寡聚物。

产生乙醇的细菌与真菌发酵生物的示例描述于Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642。

可发酵C6糖的发酵微生物的示例包括细菌与真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。

可发酵C5糖的发酵生物的示例包括细菌与真菌生物，例如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤氏酵母属(Pichia)的菌株，优选为具柄毕赤氏酵母(Pichia stipitis)，例如具柄毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属(Candida)的菌株，优选为博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)，芸薹假丝酵母(Candida brassicae)，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，迪丹氏假丝酵母(Candida diddensii)，假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物包括发酵单胞菌属(Zymomonas)的菌株，例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)；汉逊氏酵母属(Hansenula)的菌株，例如异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌株，例如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；以及大肠杆菌(E.coli)，特别是经遗传修饰而改善了乙醇产量的大肠杆菌菌株。

在优选方面，所述酵母是酵母属菌种。在更优选方面，所述酵母为酿酒酵母。在另一个更优选方面，所述酵母为糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面，所述酵母为葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选方面，所述酵母属于克鲁维酵母属。在另一个更优选方面，所述酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选方面，所述酵母为脆壁克鲁维酵母。在另一个优选方面，所述酵母属于假丝酵母属。在另一个更优选方面，所述酵母为博伊丁氏假丝酵母。在另一个更优选方面，所述酵母为芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，所述酵母为迪丹氏假丝酵母。在另一个更优选方面，所述酵母为假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，所述酵母为产朊假丝酵母。在另一个优选方面，所述酵母为棍孢属(Clavispora)。在另一个更优选方面，所述酵母为葡萄牙棍孢(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选方面，所述酵母为仙人掌棍孢(Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面，所述酵母属于管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选方面，所述酵母为嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选方面，所述酵母属于毕赤氏酵母属。在另一个更优选方面，所述酵母为具柄毕赤氏酵母。在另一个优选方面，所述酵母属于酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选方面，所述酵母为克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，in Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编辑，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。

可有效将己糖与戊糖发酵为乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌与热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上)。

在优选方面，所述细菌属于发酵单胞菌属。在更优选方面，所述细菌为运动发酵单胞菌。在另一个优选方面，所述细菌属于梭菌属(Clostridium)。在另一个更优选方面，所述细菌为热纤维梭菌。

适用于产生乙醇的可市购的酵母包括，例如，ETHANOL RED^TM酵母(可得自Fermentis/Lesaffre，USA)，FALI^TM(可得自Fleischmann’s Yeast，USA)，SUPERSTART^TM与THERMOSACC^TM新鲜酵母(可得自Ethanol Technology，WI，USA)，BIOFERM^TM AFT与XR(可得自NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA)，GERT STRAND^TM(可得自Gert Strand AB，Sweden)，以及FERMIOL^TM(可得自DSM Specialties)。

在另一方面，所述发酵微生物可经遗传修饰以提供发酵戊糖的能力，例如使用木糖，使用阿拉伯糖以及共同使用木糖与阿拉伯糖的微生物。

将异源基因克隆入多种发酵微生物导致能够将己糖与戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物的构建(Chen and Ho，1993，Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40：135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64：1852-1859；Kotter and Ciriacy，1993，Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61：4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation：a proof of principle，FEMS Yeast Research 4：655-664；Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38：296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeg..58：204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470)。

在优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为酿酒酵母。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为运动发酵单胞菌。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为大肠杆菌。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

在本领域众所周知上述生物亦可用于产生其它物质，如本文所述。

所述发酵微生物通常添加至经降解的纤维素材料，且将所述发酵进行约8到约96小时，例如约24到约60小时。温度通常为约26℃到约60℃之间，特别是约32℃或50℃，且在约pH3到约pH8，例如约pH4-5，6或7。

在优选方面，将所述酵母和/或另一微生物施用于经降解的纤维素材料且所述发酵过程进行约12到约96小时，例如通常24-60小时。在优选方面，温度优选在约20℃到约60℃之间，更优选约25℃到约50℃，且最优选约32℃到约50℃，特别是约32℃或50℃，且pH通常为约pH3到约pH7之间，优选约pH4-7。然而，一些微生物，例如，细菌发酵生物具有较高的最佳发酵温度。酵母或其它微生物优选以每ml发酵培养液大约10⁵到10¹²，更优选大约10⁷到10¹⁰，且特别是大约2x10⁸活细胞计数的量施用。关于使用酵母以供发酵的进一步指导可见于，例如“The Alcohol Textbook”(编辑K.Jacques，T.P.Lyons and D.R.Kelsall，Nottingham University Press，United Kingdom 1999)，其以参照的方式包含于本文中。

发酵刺激剂(fermentation stimulator)可与任何本文所述的酶方法并用以进一步改善所述发酵过程，以及特别是所述发酵微生物的表现，例如，增强速率与乙醇产量。“发酵刺激剂”指针对所述发酵微生物(具体而言，酵母)生长的刺激剂。优选的针对生长的发酵刺激剂包括维生素与矿物质。维生素的示例包括多种维生素，生物素，泛酸，烟酸，内消旋肌醇，硫胺素，吡哆醇，对氨基苯甲酸，叶酸，核黄素和维生素A，B，C，D及E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其以参照的方式包含于本文中。矿物质的示例包括矿物质与无机盐，其可供应包括P，K，Mg，S，Ca，Fe，Zn，Mn与Cu的营养物。

发酵产物：发酵产物可为任何源自发酵的物质。所述发酵产物可为，醇(例如，阿拉伯糖醇，丁醇，乙醇，甘油，甲醇，1，3-丙二醇，山梨醇与木糖醇)；有机酸(例如，乙酸，醋酮酸，己二酸，抗坏血酸，柠檬酸，2，5-二酮-D-葡萄糖酸，蚁酸，富马酸，葡萄糖二酸，葡萄糖酸，葡糖醛酸，戊二酸，3-羟基丙酸，衣康酸，乳酸，苹果酸，丙二酸，草酸，丙酸，琥珀酸与木质酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，赖氨酸，丝氨酸和苏氨酸)；以及气体(例如，甲烷，氢气(H₂)，二氧化碳(CO₂)与一氧化碳(CO))，但不仅限于此。所述发酵产物亦可为作为高价值产物的蛋白质。

在优选方面，所述发酵产物为醇。应理解术语“醇”涵盖下述物质，即其包含一个或更多羟基部分(moiety)。在更优选方面，所述醇为阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，所述醇为丁醇。在另一个更优选方面，所述醇为乙醇。在另一个更优选方面，所述醇为甘油。在另一个更优选方面，所述醇为甲醇，在另一个更优选方面，所述醇为1，3-丙二醇。在另一个更优选方面，所述醇为山梨醇。在另一个更优选方面，所述醇为木糖醇。参见，例如Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，and Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，《Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology》，Scheper，T.编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.，and Jonas，R.，2002，The biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.，and Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol-a sugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.and Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in siturecovery by gas stripping，World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6)：595-603。

在另一个优选方面，所述发酵产物为有机酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为乙酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为醋酮酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为己二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为抗坏血酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为柠檬酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为2，5-二酮-D-葡萄糖酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为蚁酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为富马酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为葡萄糖二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为葡萄糖酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为葡糖醛酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为戊二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为3-羟基丙酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为衣康酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为乳酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为苹果酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为丙二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为草酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为丙酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为琥珀酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为木质酸。参见，例如，Chen，R.，and Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。

在另一个优选方面，所述发酵产物为酮。应理解术语“酮”涵盖含有一个或更多酮部分的物质。在另一个更优选方面，所述酮为丙酮。参见，例如，Qureshi and Blaschek，2003，见上。

在另一个优选方面，所述发酵产物为氨基酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为天冬氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为谷氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为甘氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为赖氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为丝氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为苏氨酸。参见，例如，Richard，A.，and Margaritis，A.，2004，Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。

在另一个优选方面，所述发酵产物为气体。在另一个更优选方面，所述气体为甲烷。在另一个更优选方面，所述气体为H₂。在另一个更优选方面，所述气体为CO₂。在另一个更优选方面，所述气体为CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya，and K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，Water Science and Technology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.in Biomass and Bioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass for methane production：A review。

回收所述发酵产物可任选地自所述发酵培养基使用任何本领域已知方法加以回收，所述方法包括但不仅限于，层析(例如，离子交换，亲和，疏水，层析聚焦以及大小排阻)，电泳过程(例如，制备型等电聚焦)，差示溶解度(differential solubility)(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE，蒸馏或提取。举例而言，醇自经发酵的纤维素材料分离并通过常规蒸馏方法纯化。可获取纯度高至约96vol.％的乙醇，其可用作，例如，燃料乙醇，饮用乙醇，亦即，可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。

螯合剂

在本发明的方法中，可使用任何能够螯合氧化还原活性金属阳离子的螯合剂。可使用的金属螯合剂的示例包括，但不仅限于，羧酸化合物如柠檬酸，草酸，琥珀酸，苹果酸，天冬氨酸，醛糖酸，糖醛酸，阿魏酸，苯甲酸，氨三乙酸(NTA)与乙二胺四乙酸(EDTA)；含氮化合物如2，2’-联吡啶，1，10-菲咯啉，咪唑，组氨酸，赖氨酸，氨，环烯(氮杂冠)(cyclen(aza-crown))，聚胍(poly(guanidyl))，酞菁，卟啉，植物螯合肽(phytochelatin)，7-(1-乙烯基-3，3，5，5-四甲基己基)-8-羟基喹啉；基于硫的化合物如半胱氨酸，甲硫氨酸，二硫代氨基甲酸，二(2，4，4-三甲基戊基)-二硫次膦酸，二(2-乙基己基)单硫磷酸；含氧化合物如冠醚，Calixarene，葡萄糖酸内酯，二(2，4，4-三甲基戊基)-次膦酸与酚类化合物(包括腐殖酸)；磷酸(包括三聚磷酸)；多聚物质如离子交换树脂(包括

)以及无机沸石(包括斜发沸石)；或上述的组合。

在一方面，所述螯合剂为羧酸化合物。在另一方面，所述螯合剂为含氧化合物。在另一方面，所述螯合剂为含氮化合物。在另一方面，所述螯合剂为含硫化合物。在另一方面，所述螯合剂为阴离子。在另一方面，所述螯合剂为磷酸。在另一方面，所述螯合剂为多聚物质。

在另一方面，所述螯合剂为柠檬酸。在另一方面，所述螯合剂为草酸。在另一方面，所述螯合剂为琥珀酸。在另一方面，所述螯合剂为苹果酸。在另一方面，所述螯合剂为醛糖酸。在另一方面，所述螯合剂为糖醛酸。在另一方面，所述螯合剂为阿魏酸。在另一方面，所述螯合剂为天冬氨酸。在另一方面，所述螯合剂为EDTA。在另一方面，所述螯合剂为氨三乙酸。

在另一方面，所述螯合剂为2，2’-联吡啶。在另一方面，所述螯合剂为1，10-菲咯啉。在另一方面，所述螯合剂为咪唑。在另一方面，所述螯合剂为组氨酸。在另一方面，所述螯合剂为赖氨酸。在另一方面，所述螯合剂为氨。在另一方面，所述螯合剂为环烯(氮杂冠)。在另一方面，所述螯合剂为植物螯合肽。在另一方面，所述螯合剂为去铁草酰胺(一种铁载体)。在另一方面，所述螯合剂为酞菁。在另一方面，所述螯合剂为卟啉。

在另一方面，所述螯合剂为半胱氨酸。在另一方面，所述螯合剂为甲硫氨酸。在另一方面，所述螯合剂为二硫代氨基甲酸。

在另一方面，所述螯合剂为冠醚。在另一方面，所述螯合剂为葡萄糖酸内酯。在另一方面，所述螯合剂为酚类化合物。在另一方面，所述螯合剂为腐殖酸。

在另一方面，所述螯合剂为磷酸。在另一方面，所述螯合剂为焦磷酸。在另一方面，所述螯合剂为三聚磷酸。在另一方面，所述螯合剂为肌醇六磷酸。在另一方面，所述螯合剂为次膦酸。在另一方面，所述螯合剂为硫代次膦酸。在另一方面，所述螯合剂为Amberlite树脂。在另一方面，所述螯合剂为斜发沸石。在另一方面，所述螯合剂为木素硫酸(lingosulfate)。

在另一方面，所述螯合剂为柠檬酸。在另一方面，所述螯合剂为苹果酸。在另一方面，所述螯合剂为草酸。在另一方面，所述螯合剂为去铁草酰胺。在另一方面，所述螯合剂为植物螯合肽。在另一方面，所述螯合剂为EDTA。在另一方面，所述螯合剂为焦磷酸。

在本发明的方法中，螯合剂的有效量范围为每kg干纤维素材料优选约0.01到约100mM，更优选约0.1到约10mM，且最优选为约0.5到约5mM。

在螯合剂处理过程中，pH范围优选为约1到约11，更优选约3到约9，且最优选约5到约7。温度范围优选为约5℃到约200℃，更优选约20℃到约80℃，且最优选约40℃到约60℃。

在螯合剂处理过程中，纤维素材料装载量范围按干重计优选为约1到50％，更优选约5到约30％，且最优选约10到约20％。

氧化剂

在本发明的方法中，可使用任何能够将具有低价状态的氧化还原活性金属阳离子氧化为高价状态(例如，从亚铁到铁)的氧化剂。可使用的氧化剂的示例包括但不仅限于，O₂(充气)，臭氧(O₃)，氯气(Cl₂)，溴(Br₂)，过氧化氢(H₂O₂)，无机或有机过氧化物或过酸，次氯酸钠(NaOCl)，二氧化氯(ClO₂)，一氧化氮(NO)，高锰酸钾(KMnO₄)以及硝酸盐(NO₃ ^-)或亚硝酸盐(NO₂ ^-)，或其组合。

在优选方面，所述氧化剂为O₂。在另一个优选方面，所述氧化剂为臭氧(O₃)。在另一个优选方面，所述氧化剂为过氧化氢(H₂O₂)。在另一个优选方面，所述氧化剂为无机过氧化物。在另一个优选方面，所述氧化剂为次氯酸钠(NaOCl)。在另一个优选方面，所述氧化剂为二氧化氯(ClO₂)。在另一个优选方面，所述氧化剂为硝酸盐(NO₃ ^-)。在另一个优选方面，所述氧化剂为亚硝酸盐(NO₂ ^-)。

在更优选方面，所述氧化剂为过氧化氢(H₂O₂)。在另一个更优选方面，所述氧化剂为次氯酸钠(NaOCl)。在另一个更优选方面，所述氧化剂为硝酸盐(NO₃ ^-)。

在氧化剂处理过程中，pH范围优选为约1到约11，更优选约3到约9，且最优选约5到约7。温度范围优选为约5℃到约200℃，更优选约20℃到约80℃，且最优选约40℃到约60℃。所述氧化剂优选剂量范围为每kg干纤维素材料约0.01到约100，更优选约0.05到约50，且最优选约0.5到约5g。

在一方面，将所述纤维素材料在用螯合剂处理之前用氧化剂处理。在另一方面，将所述纤维素材料用氧化剂和螯合剂同时处理。

纤维素分解酶组合物

在本发明的方法中，所述纤维素分解酶组合物可包含任何涉及将纤维素材料(例如，木素纤维素)加工为可发酵的糖(例如，葡萄糖)的蛋白质。

对纤维素降解，至少三类酶对将纤维素转化为可发酵的糖为重要的：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，其随机水解纤维素链；纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，其自所述纤维素链末端剪切纤维二糖单元；以及β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，其将纤维二糖与可溶性纤维糊精转化为葡萄糖。

所述纤维素分解酶组合物可为单组分制备物，例如，内切葡聚糖酶，多组分制备物，例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶，或多组分与单组分蛋白质制备物的组合。所述纤维素分解蛋白可在酸性，中性或碱性pH范围具有活性，即，可水解纤维素。

具有纤维素分解酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)的具有纤维素分解酶活性的多肽，或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)或尿枝原体属(Ureaplasma)的具有纤维素分解酶活性的多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的具有纤维素分解酶活性的多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)的具有纤维素分解酶活性的多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的具有纤维素分解酶活性的多肽。

具有纤维素分解酶活性的多肽还可以是真菌多肽，且更优选酵母多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)的具有纤维素分解酶活性的多肽；或者更优选丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属(Acremonium)、蘑菇属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、栗疫病菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)的具有纤维素分解酶活性的多肽。

在一个优选的方面所述多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)的具有纤维素分解酶活性的多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰色腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、乳白耙菌(Irpex lacteus)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢子梭孢壳(Thielavia microspora)、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢壳、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、绿色木霉(Trichoderma viride)或Trichophaea saccata的具有纤维素分解酶活性的多肽。

亦可使用纤维素分解蛋白的化学修饰的或工程改造的突变体。

所述纤维素分解酶组合物的一个或更多组分可为重组组分，亦即，通过克隆编码所述单一组分的DNA序列，并随后用所述DNA序列转化细胞并在宿主中表达来产生(参见，例如，WO 91/17243与WO 91/17244)。所述宿主优选为异源宿主(酶对宿主为外来的)，然而在一定条件下所述宿主亦可为同源宿主(酶对宿主为固有的)。单组分纤维素分解蛋白亦可通过自发酵培养液纯化上述蛋白质来加以制备。

在本发明方法中所用的纤维素分解蛋白可通过在含有合适的碳源与氮源以及无机盐的营养培养基上，使用本领域已知的步骤对上面提及的微生物菌株进行发酵来产生(参见，例如，Bennett，J.W.and LaSure，L.(eds.)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。合适的培养基可得自商业供应商或可根据公开发表的配方进行制备(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)。适于生长与纤维素分解蛋白产生的温度范围与其它条件在本领域中为已知的(参见，例如，Bailey，J.E.，and Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-Hill Book Company，NY，1986)。

所述发酵可为任何培养细胞的方法，只要其导致纤维素分解蛋白的表达或分离。发酵可以因此理解为包含在实验室或工业发酵罐中在合适培养基中并在允许所述纤维素分解蛋白表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或者小或大规模发酵(包括连续，批次，分批补料或固态发酵)。由上面所描述的方法所得的纤维素分解蛋白可自发酵培养基中回收，并通过本文所描述的常规步骤进行纯化。

适用于本发明的商业性纤维素分解酶制备物的示例包括，例如CELLUCLAST^TM(可得自Novozymes A/S)与NOVOZYM^TM 188(可得自Novozymes A/S)。其它可市购的可用的包含纤维素酶的制备物包括CELLUZYME^TM，CEREFLO^TM与ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，LAMINEX^TM与SPEZYME^TM CP(Genencor Int.)，ROHAMENT^TM7069W(

GmbH)，以及

LDI，

LBR或

150L(Dyadic International，Inc.，Jupiter，FL，USA)。所述纤维素酶以自约0.001％到约5.0％wt.的固体的有效量添加，更优选为自约0.025％到约4.0％wt.的固体，且最优选为自约0.005％到约2.0％wt.的固体。

可用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的示例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO93/15186；美国专利No.5275944；WO 96/02551；美国专利No.5536655，WO 00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；以及Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。

可用于本发明方法中的真菌内切葡聚糖酶的示例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene 45：253-263；GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo，等，1988，Gene 63：11-22；GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64：555-563；GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249：584-591；GENBANK^TM登录号Y11113)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，Molecular Microbiology 13：219-228；GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，Nucleic Acids Research18：5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，Current Genetics 27：435-439)；软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene 90：9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰色腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V(SEQ ID NO：12)；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：14)；担子菌纲CBS 495.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：16)；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：18)；土生梭孢壳RRL 8126 CEL6B内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：20)；土生梭孢壳NRRL 8126 CEL6C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：22)；土生梭孢壳NRRL 8126CEL7C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：24)；土生梭孢壳NRRL 8126 CEL7E内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：26)；土生梭孢壳NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：28)；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：30)；以及里氏木霉菌株No.VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQ ID NO：32；GENBANK^TM登录号M15665)。上述SEQ ID NO：12，SEQID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30与SEQ IDNO：32的内切葡聚糖酶分别由SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29与SEQ ID NO：31的成熟多肽编码序列所编码。

在本发明的方法中有用的纤维二糖水解酶的示例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO：34)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQ IDNO：36)；特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO：38)；嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO：40)；土生梭孢壳纤维二糖水解酶II(CEL6A)(SEQ IDNO：42)；嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I(SEQ IDNO：44)以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO：46)。上述SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQID NO：44与SEQ ID NO：46的纤维二糖水解酶分别由SEQ ID NO：33，SEQID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43与SEQ ID NO：45的成熟多肽编码序列所编码。

在本发明的方法中有用的β-葡糖苷酶的示例包括但不仅限于，米曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：48)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：50)；巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT 20888β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：52)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：54)；和棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO：56)。上述SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54与SEQ IDNO：56的β-葡糖苷酶分别由SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53与SEQ ID NO：55的成熟多肽编码序列所编码。

所述具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可以根据WO 2002/095014获得。所述具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可以根据WO 2005/047499获得。所述具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可以根据WO 2007/019442获得。所述具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可以根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275：4973-4980获得。所述具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可以根据Kawaguchi等，1996，Gene 173：287-288获得。

其它内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶与β-葡糖苷酶在多种使用根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，and Henrissat B.，and Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696的分类法的糖基水解酶家族中得到公开。

在另一个优选的方面，所述β-葡糖苷酶是SEQ ID NO：58的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或SEQ ID NO：60的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。在另一个优选的方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白由SEQ IDNO：57的多核苷酸编码或所述米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白由SEQ ID NO：59的多核苷酸编码。

所述纤维素分解酶组合物可进一步包含具有纤维素分解增强活性的多肽，其包含以下基序(motif)：

[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和

[FW]-[TF]-K-[AIV]，其中X是任意氨基酸，X(4，5)是在4或5个邻接位置上的任意氨基酸并且X(4)是在4个连邻接位置上的任意氨基酸。

包含上述基序的分离的多肽可进一步包含：

H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或

H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，

其中X是任意氨基酸，X(1，2)是在1个位置或2个邻接位置上的任意氨基酸，X(3)是在3个邻接位置上的任意氨基酸，并且X(2)是在2个邻接位置上的任意氨基酸。在以上基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽还包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽还包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。

具有纤维素分解增强活性的分离的多肽的示例包括具有纤维素分解增强活性的土生梭孢壳多肽(SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的成熟多肽)；橙色嗜热子囊菌(Thermoascus auranticus)(SEQ ID NO：74的成熟多肽)；或里氏木霉(SEQ ID NO：76的成熟多肽)。上述SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72与SEQ ID NO：74的具有纤维素分解增强活性的多肽分别由SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ IDNO：73与SEQ ID NO：75的成熟多肽编码序列所编码。

关于具有纤维素分解增强活性的多肽与其多核苷酸的进一步细节，参见WO 2005/074647，WO 2005/074656与公布的美国申请流水号No.2007/0077630，其以参照的方式包含于本文中。

所述纤维素分解酶组合物可进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶，酯酶，蛋白酶，漆酶，过氧化物酶或其混合物。

可使用任何适用于将半纤维素水解(优选水解成木糖)的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，葡萄糖醛酸糖苷酶，内切半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，内或外切阿拉伯糖酶，外切半乳聚糖酶，木糖苷酶与其组合。优选的，所述半纤维素酶具有在7以下，优选pH3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素酶的示例包括VISCOZYME^TM(可得自Novozymes A/S，Denmark)。

在一方面，所述半纤维素酶为木聚糖酶。所述木聚糖酶可为微生物来源，例如真菌来源(例如，木霉属，多孔菌属，腐质霉属，曲霉属，镰孢属)或细菌来源(例如，芽孢杆菌属)。在优选方面，所述木聚糖酶得自丝状真菌，优选得自曲霉属的菌株，例如棘孢曲霉，或腐质霉属的菌株，例如疏绵状腐质霉。所述木聚糖酶优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选为GH10或GH11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业性木聚糖酶的示例包括SHEARZYME^TM与BIOFEEDWHEAT^TM(Novozymes A/S，Denmark)。

所述半纤维素酶可以水解半纤维素的有效量添加，例如，以总固体(TS)的0.001到0.5wt.％的量，更优选TS的约0.05到0.5wt.％。

木聚糖酶可以0.001-1.0g/kg DM(干物质)底物的量添加，优选以0.005-0.5g/kg DM底物的量，且最优选0.05-0.10g/kg DM底物。

核酸构建体

可以将编码具有酶活性或者纤维素分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸用多种方法进行操作，以通过构建核酸构建体提供多肽的表达，所述核酸构建体含有与一种或多种控制序列可操作连接的编码所述多肽的分离的多核苷酸，所述控制序列指导所述编码序列在合适的宿主细胞中在与所述控制序列相容的条件下表达。取决于表达载体，在插入载体之前对多核苷酸的序列进行操作可能是理想的或者必要的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域公知的。

控制序列可以是合适的启动子序列，启动子序列是被宿主细胞所识别来表达编码这样的多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子序列可以是任何在所选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，而且可以从编码对宿主细胞而言为同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

适于指导核酸构建体的转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获自大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、以及原核β-内酰胺酶基因的启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，和tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。Scientific American，1980，242：74-94中的″Useful proteins from recombinant bacteria″和Sambrook等，1989(同上)中描述了其它启动子。

适于在丝状真菌宿主细胞中指导核酸构建体的转录的启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；以及它们的突变、截短和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得的。对酵母宿主细胞有用的其他启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

控制序列还可以是合适的转录终止子序列。终止子序列是被宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的3’末端。任何可在所选的宿主细胞中发挥功能的终止子都可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。

优选的用于酵母宿主细胞的终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得的。对酵母宿主细胞有用的其他终止子由Romanos等，1992(同上)描述。

控制序列也可以是合适的前导序列，前导序列是mRNA中的一种非翻译区，它对于宿主细胞进行的翻译而言是重要的。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’末端。任何可在所选择的宿主细胞中发挥功能的前导序列都可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。

用于酵母宿主细胞的合适的前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得的。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，聚腺苷酸化序列是一段与核苷酸序列的3’末端可操作连接的序列，并且在转录后被宿主细胞所识别，作为向被转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号。任何可在所选择的宿主细胞中发挥功能的聚腺苷酸化序列都可以用于本发明。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的。

Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990记载了对酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列。

控制序列还可以是信号肽编码序列，其编码的氨基酸序列连接于多肽的氨基末端，并引导所述编码的多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’端可以固有地包含信号肽编码序列，该序列天然地以符合翻译阅读框的方式与编码区中编码分泌型多肽的区段连接。或者，编码序列的5’端可以包含对该编码序列而言为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的场合，可能需要外源信号肽编码序列。或者，可以简单地用外源信号肽编码序列取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，引导表达的多肽进入所选的宿主细胞的分泌途径，即分泌到培养基中的任何信号肽编码序列都可以用于本发明。

对细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137记载了其它信号肽。

对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、和疏棉状腐质霉脂肪酶的基因获得的信号肽编码序列。

对酵母宿主细胞有用的信号肽是从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得的。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，同上文描述。

控制序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽被称为酶原(proenzyme)或原多肽(propolypeptide)(或者在某些情况下称为酶原(zymogen))。原多肽通常是没有活性的，并且通过将前肽从原多肽中催化或自催化切割出来可以转化为成熟的活性多肽。前肽编码序列可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶的基因获得(WO 95/33836)。

在信号肽和前肽序列都存在于多肽氨基末端的场合，前肽序列位于多肽氨基末端的相邻位置，而信号肽序列位于前肽序列的氨基末端的相邻位置。

添加这样的调控序列可能也是理想的：该序列容许相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调控系统的例子有导致基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控性化合物的存在)而开启或关闭的那些调控系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac、和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调控序列。其他调控序列的例子有使基因能够扩增的调控序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因，和在重金属存在下被扩增的金属硫蛋白基因。在这些场合，编码多肽的核苷酸序列将与调控序列可操作地连接。

表达载体

可以将本文中描述的各种核酸和控制序列连接起来产生重组表达载体，其包含编码具有酶活性或者纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号。所述表达载体可包括一个或多个便利的限制性位点以便于在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸序列。或者，可以将多核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入合适的表达用载体来表达编码这样的多肽的多核苷酸序列。在生成表达载体的过程中，将编码序列置于载体中使得该编码序列与合适的表达用控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何可便利地进行重组DNA程序并且能够带来多核苷酸序列的表达的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常会取决于载体与该载体要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或者闭合环状的质粒。

所述载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可含有任何用于保证自我复制的手段。或者，载体可以是这样的载体，当它被导入宿主细胞时，整合到基因组中并随同它整合到其中的染色体一起复制。另外，可以使用单一的载体或质粒，或两个或更多个共同包含要导入宿主细胞基因组的总DNA的载体或质粒，或者转座子。

载体优选含有一个或多个选择标记，这些标记容许容易地选择经过转化、转染、转导等的细胞。选择标记是这样的基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性，对营养缺陷型的原养性，等等。

细菌选择标记的例子有来自枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)，和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及它们的等同物。优选用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

载体优选包含容许载体整合到宿主细胞的基因组或者容许载体在细胞中不依赖基因组自主复制的元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，载体可能依赖多核苷酸的编码多肽的序列或者载体的任何其它元件来通过同源或异源重组整合到基因组中。或者，载体可含有附加的核苷酸序列，用来指导通过同源重组在染色体上的精确位置整合到宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置上整合的机率，整合元件优选应含有足够数目的与相应靶序列具有高度同一性的核酸，诸如100-10,000个碱基对，优选400-10,000个碱基对，且最优选800-10,000个碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码的或者编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。

为了自主复制，载体可进一步包含复制起点，该起点使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的任何介导自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例有容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中的复制起点的例子有2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的例子有AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离，以及包含该基因的质粒或载体的构建，可以根据WO 00/24883中公开的方法来实现。

可以向宿主细胞中插入编码这样的多肽的多核苷酸的多于一个拷贝以增加所述多肽的生产。可以通过下述方法获得多核苷酸的拷贝数的增加：向宿主细胞基因组中整合至少一个额外拷贝的序列；或者纳入伴随该多核苷酸的可扩增选择标记基因，由此通过在合适的选择剂的存在下培养细胞，可以选择出含有扩增拷贝数的选择标记基因，从而也就含有更多拷贝的所述多核苷酸的细胞。

用于连接上述元件来构建重组表达载体的程序是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上文)。

宿主细胞

包含编码具有酶活性或者纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸的重组宿主细胞可以有利地用于多肽的重组生产。将包含这样的多核苷酸的载体导入宿主细胞使得载体作为染色体整合子或者如前文所述的自复制的染色体外载体被保持。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何因复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择在很大程度上会取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或者非单细胞微生物，例如真核生物。

细菌宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏球菌属或尿枝原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。本发明的实践中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞也可以是任何链球菌属细胞。本发明的实践中有用的链球菌属细胞包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞。本发明的实践中有用的链霉菌属细胞包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

向芽孢杆菌属细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、通过电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)，或通过接合(参见例如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)来实现。向大肠杆菌细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化(参见例如Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见例如Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)来实现。向链霉菌属细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化和电穿孔来实现(参见例如Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)、接合(参见例如Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)、或转导(参见例如Burke等，2001，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 98：6289-6294)来实现。向假单胞菌属细胞中导入DNA可以通过例如电穿孔(参见例如Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见例如Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)来实现。向链球菌属细胞中导入DNA可以通过例如天然感受态(参见例如Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)、原生质体转化(参见例如Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-2070)、电穿孔(参见例如Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)、或接合(参见例如Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)来实现。尽管如此，本领域已知的任何用于将DNA导入宿主细胞的方法都可以使用。

宿主细胞也可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

在一个优选的方面，所述宿主细胞是真菌细胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中定义的)，和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上文，第171页引用的)等门，以及全部有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，同上文)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能有所改变，为了本发明的目的，酵母将如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述加以定义。

在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等，1995，同上文定义)。丝状真菌的一般特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝壁。营养生长是通过菌丝延伸，且碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖，且碳分解代谢可以是发酵的。

在一个进一步更优选的方面，丝状真菌宿主细胞枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、网孢菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、杂色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以用包括方式本身已知的原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法来加以转化。用于曲霉属和木霉属宿主细胞转化的合适方法描述于EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National.Academy ofSciences USA 81：1470-1474。Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO96/00787描述了转化镰孢属菌种的合适方法。酵母可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，第194卷，第182-187页，Academic Press，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920中所述的方法转化。

生产方法

生产具有酶活性或者纤维素分解增强活性的多肽的方法包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收多肽。

或者，生产具有酶活性或者纤维素分解增强活性的多肽的方法包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收多肽。

在产生方法中，用本领域中公知的方法在适于多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、和小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养细胞，这在合适的培养基中和使多肽能被表达和/或分离的条件下进行。用本领域中已知的程序，在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商得到或根据公开的组成(例如，于美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。如果该多肽不被分泌，则可从细胞裂解产物中回收它。

具有酶活性或者纤维素分解增强活性的多肽可用本文记载的方法或本领域已知方法检测。

得到的发酵液可以包括或不包括细胞碎片(debris)地直接使用，或者可以使用本领域已知的方法回收所述多肽。例如，可以通过常规方法，包括，但不限于，离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀将多肽从营养培养基中回收出来。

多肽可通过本领域中已知的多种方法进行纯化来获得基本上纯的多肽，所述方法包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(见，例如，Protein Purification J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

下面用实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为对本发明范围的限制。

实施例

DNA测序

DNA测序使用染料终止物化学(dye terminator chemistry)(Giesecke等，1992，Journal of Virol.Methods 38：47-60)用Applied Biosystems Model 3130XGenetic Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行。序列使用phred/phrap/consed(University of Washington，Seattle，WA，USA)用序列特异性引物进行装配。

培养基和溶液

YP培养基的组成为每升10g酵母提取物和20g细菌用胰蛋白胨。

纤维素酶诱导培养基的组成为每升20g纤维素、10g玉米浆固体、1.45g(NH₄)₂SO₄、2.08g KH₂PO₄、0.28g CaCl₂、0.42g MgSO₄·7H₂O和0.42ml痕量金属溶液。

痕量金属溶液的组成为每升216g FeCl₃·6H₂O、58g ZnSO₄·7H₂O、27gMnSO₄·H₂O、10g CuSO₄·5H₂O、2.4g H₃BO₃和336g柠檬酸。

STC的组成为1M山梨醇、10mM CaCl₂和10mM Tris-HCl，pH 7.5。

COVE平板的组成为每升342g蔗糖、10ml COVE盐溶液、10ml 1M乙酰胺、10ml 1.5M CsCl和25g诺布尔琼脂(Noble agar)。

COVE盐溶液的组成为每升26g KCl、26g MgS0₄、76g KH₂PO₄和50mlCOVE痕量金属溶液。

COVE痕量金属溶液的组成为每升0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O，0.4g的CuSO₄·5H₂O，1.2g的FeSO₄·7H₂O，0.7g的MnSO₄·H₂O，0.8g的Na₂MoO₂·H₂O与10g的ZnSO₄·7H₂O。

COVE2平板的组成为每升30g蔗糖、20ml COVE盐溶液、25g诺布尔琼脂和10ml 1M乙酰胺。

PDA平板的组成为每升39克马铃薯葡萄糖琼脂。

LB培养基的组成为每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠。

2X YT-Amp平板的组成为每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠和15g细菌用琼脂，然后在高压灭菌后加入2ml 50mg/ml的氨苄青霉素的过滤除菌溶液。

MDU2BP培养基的组成为每升45g麦芽糖、1g MgSO₄·7H₂O、1g NaCl、2g K₂HSO₄、12g KH₂PO₄、2g尿素和500μl AMG痕量金属溶液，将pH调至5.0并随后用0.22μm过滤元件进行过滤除菌。

AMG痕量金属溶液的组成为每升14.3g ZnSO₄·7H₂O、2.5gCuSO₄·5H₂O、0.5g NiCl₂·6H₂O、13.8g FeSO₄·H₂O、8.5g MnSO₄·7H₂O和3g柠檬酸。

基本培养基(minimal medium)平板的组成为每升6g NaNO₃、0.52KCl、1.52g KH₂PO₄、1ml COVE痕量金属溶液、20g诺布尔琼脂、20ml 50％葡萄糖、2.5ml 20％MgSO₄·7H₂O和20ml生物素贮存溶液。

生物素贮存溶液的组成为每升0.2g生物素。

SOC培养基的组成为2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂和10mM MgSO₄，高压灭菌后加入过滤除菌的葡萄糖至20mM。

Mandel’s培养基的组成为每升1.4g的(NH₄)₂SO₄，2.0g的KH₂PO₄，0.3g的尿素，0.3g的CaCl₂，0.3g的MgSO₄·7H₂O，5mg的FeSO₄·7H₂O，1.6mg的MnSO₄·H₂O，1.4mg的ZnSO₄.H₂O与2mg的CoCl₂。

材料

用磷酸泡涨的纤维素(PASC)自微晶纤维素(PH101；FMC，Philadelphia，PA，USA)根据Schulein，1997，J.Biotechnol.57：71-81的方法制备。

羧甲基纤维素(CMC，7L2类型，70％取代)自Hercules Inc.，Wilmington，DE，USA获取。

聚乙二醇(PEG 4000)自Alfa Aesar，Ward Hill，MA，USA获取。过氧化氢(30％)自Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA获取。硫酸亚铁，氯化亚铁，K₃Fe(CN)₆，K₄Fe(CN)₆，柠檬酸铁与其它金属盐，以及1，10-菲咯啉与2，2’-联吡啶，自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA获取。除非另行指定，Fe(II)的母液制备为0.25M FeSO₄水溶液。Fe(2，2’-联吡啶基)Cl₃与Fe(2，2’-联吡啶基)Cl₂通过分别将0.1M FeCl₃和FeCl₂与0.2M 2，2’-联吡啶混合制备成0.1M。Fe(1，10’-菲咯啉)Cl₃与Fe(1，10’-菲咯啉)Cl₂通过分别将0.1M FeCl₃和FeCl₂与0.2M 1，10-菲咯啉混合制备成0.1M。FeNaEDTA的母液通过将0.1M FeCl₃与0.1M Na₄EDTA混合制备为0.1M。

实施例1：制备具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽

具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽在米曲霉JaL250中根据WO 2005/074656重组产生。重组产生的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽首先通过使用10kDa膜的超滤浓缩，缓冲液交换至20mMTris-HCl pH 8.0中，并随即使用100ml Q-Big Beads柱(GEHealthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)以600ml 0-600mM NaCl的线性梯度在同一缓冲液中纯化。收集10ml的级分并基于SDS-PAGE将其汇集。将汇集的级分(90ml)随即使用20ml MONO

柱(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)以500ml 0-500mM NaCl的线性梯度在同一缓冲液中进一步纯化。收集6ml的级分并基于SDS-PAGE将其汇集。经汇集的级分(24ml)通过使用10kDa膜的超滤浓缩，并使用320ml

200SEC柱(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)以大约1.3升的150mM NaCl-20mM Tris-HCl pH 8.0的无梯度洗脱进行层析。收集20ml的级分并基于SDS-PAGE将其汇集。蛋白质浓度使用Microplate BCA^TMProtein Assay Kit(Pierce，Rockford，IL，USA)确定。

实施例2：制备里氏木霉CEL7A纤维二糖水解酶I

里氏木霉CEL7A纤维二糖水解酶I如Ding and Xu，2004，“Productive cellulase adsorption on cellulose”in Lignocellulose Biodegradation(Saha，B.C.编辑)，Symposium Series 889，154-169页，American Chemical Society，Washington，DC的描述制备。蛋白质浓度使用Microplate BCA^TMProtein Assay Kit(Pierce，Rockford，IL，USA)确定。

实施例3：制备米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶

米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶如WO 2004/099228中所述通过重组方法制备，并如Langston等，2006，Biochim.Biophys.Acta Proteins Proteomics 1764：972-978描述进行纯化。蛋白质浓度使用Microplate BCA^TM Protein Assay Kit(微量滴定板式BCA^TM蛋白质测定试剂盒)(Pierce，Rockford，IL，USA)确定。

实施例4：制备里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I

里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I如WO 2005/067531中的描述进行克隆并在米曲霉JaL250中表达。蛋白质浓度使用Microplate BCA^TM Protein Assay Kit(Pierce，Rockford，IL，USA)确定。

将所述里氏木霉CEL7B内切葡聚糖酶I脱盐，并使用

26/10Desalting Column(

26/10脱盐柱)(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)根据生产商的指示缓冲液交换至150mM NaCl-20mM乙酸钠pH 5.0中。

实施例5：制备里氏木霉CEL6A内切葡聚糖酶II

如下所述将里氏木霉GH5A家族内切葡聚糖酶II基因克隆入米曲霉表达载体中。

设计如下所示的两个合成寡聚核苷酸引物以自里氏木霉RutC30基因组DNA PCR扩增所述内切葡聚糖酶II基因。将基因组DNA使用

Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离。使用IN-FUSION^TMPCR Cloning Kit(IN-FUSION^TM PCR克隆试剂盒)(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)将所得片段直接克隆入pAILo2(WO 2004/099228)。

正向引物：

5’-ACTGGATTTACC

-3’(SEQ ID NO：67)

反向引物：

5’-TCACCTCTAGTTAATTAA-3’(SEQ ID NO：68)

粗体字母代表编码序列。剩下的序列与pAlLo2插入位点比较含有序列统一性。

将五十皮摩尔的上述每种引物用于含有下述物质的PCR反应中：200ng里氏木霉基因组DNA，1X Pfx Amplification Buffer(Pfx扩增缓冲液)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，6μl的10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物，2.5单位的

Pfx DNA聚合酶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，以及1μl的50mM MgSO₄(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，最终体积为50μl。使用

5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)以扩增所述片段，其程序为：一个循环的98℃下2分钟；35个循环的94℃下30秒，61℃下30秒以及68℃下1.5分钟。在35个循环后，将反应在68℃下培育10分钟并随即在10℃下冷却。1.5kb PCR反应产物在0.8％

琼脂糖凝胶(Cambrex Bioproducts，Rutherford，NJ，USA)上使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液和0.1μg/ml溴化乙锭分离。DNA条带用DARKREADER^TM(Clare Chemical Research，Dolores，CO，USA)协助显影。将1.5kb DNA条带用一次性刀片切出，并使用DA旋杯(spin cup)(Millipore，Billerica，MA，USA)根据生产商的指示进行纯化。

质粒pAlLo2(WO 2004/099228)通过用Nco I与Pac I的消化线性化。质粒片段如上所述通过凝胶电泳与超滤来纯化。将纯化的PCR片段克隆入经线性化和纯化的pAlLo2载体用IN-FUSION^TM PCR Cloning Kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)进行。反应(20μl)包含1X IN-FUSION^TMBufffer(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1X BSA(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1μl IN-FUSION^TM酶(1∶10稀释)(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，100ng的用NcoI与PacI消化的pAlLo2，以及100ng的里氏木霉CEL6A内切葡聚糖酶II PCR产物。该反应在室温下培育30分钟。使用2μl的反应样品以根据生产商的指示转化大肠杆菌XL10Gold细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。在恢复期后，将来自转化反应的两个100μl等分试样铺于补充以100μg/ml氨苄西林的150mm 2X YT板上。将该板在37℃下培养过夜。将一组三个推定的重组克隆自选择培养板上回收，并使用

9600(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA，USA)自其每个制备质粒DNA。克隆通过Pci I/BspLU11 I限制性消化进行分析。具有所期望的限制性消化样式的克隆随即经测序以确证在克隆插入中无突变。选取克隆#3并将其命名为pAlLo27(图1)。

米曲霉JaL250(WO 99/61651)原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备。五微克pAlLo27(以及pAlLo2作为对照)用于转化米曲霉JaL250原生质体。

用pAlLo27转化米曲霉JaL250得到约50个转化体。分离了十一个转化体到单独的PDA板上并在34℃下培育5日。

铺满的孢子板用3ml的0.01％

80洗涤，且将孢子悬浮液用于接种125ml玻璃摇瓶中的25ml的MDU2BP培养基。转化体培养物在34℃下以200rpm的恒速振荡进行培育。在接种后第五日，将培养物以6000xg进行离心，并收集其上清。将五微升的每个上清与同体积的2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合，并上样至1.5mm 8％-16％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上，并用SIMPLYBLUE^TM SafeStain(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)染色。所述培养液的SDS-PAGE概貌显示十一个转化体中的十个具有大约45kDa的新蛋白质条带。将命名为JaL250AlLo27的转化体1号在发酵罐中培养。

摇瓶培养基的组成为每升50g的蔗糖，10g的KH₂PO₄，0.5g的CaCl₂，2g的MgSO₄·7H₂O，2g的K₂SO₄，2g的尿素，10g的酵母提取物，2g的柠檬酸，以及0.5ml的痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升13.8g的FeSO₄·7H₂O，14.3g的ZnSO₄·7H₂O，8.5g的MnSO₄·H₂O，2.5g的CuSO₄·5H₂O，以及3g的柠檬酸。

将100ml的摇瓶培养基添加至500ml的摇瓶。所述摇瓶用来自固体平板培养物的两个琼脂块(plug)接种，并在34℃下在定轨振荡器上以200rpm培育24小时。使用50ml的摇瓶培养液以接种3升的发酵容器。

发酵分批培养基(fermentation batch medium)的组成为每升10g的酵母提取物，24g的蔗糖，5g的(NH₄)₂SO₄，2g的KH₂PO₄，0.5g的CaCl₂·2H₂O，2g的MgSO₄.7H₂O，1g的柠檬酸2g的K₂SO₄，0.5ml的消泡剂，以及0.5ml的痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升13.8g的FeSO₄·7H₂O，14.3g的ZnSO₄·7H₂O，8.5g的MnSO₄·H₂O，2.5g的CuSO₄·5H₂O，以及3g的柠檬酸。发酵补料培养基的组成为麦芽糖。

将总计1.8升的发酵分批培养基添加到Applikon Biotechnology三升玻璃套发酵器中。发酵补料培养基以0到4.4g/l/hr的速度在185小时的期间内添加。所述发酵容器保持在34℃的温度下，且pH使用Applikon 1030控制系统控制于6.1+/-0.1的固定点。将空气以1vvm的速率添加到所述容器中，且用以1100到1300rpm旋转的Rushton叶轮搅拌。在发酵结束时，自所述容器收获全部培养液，并在3000xg下离心以移除生物质。上清经过滤除菌储藏于5-10℃。

使用

26/10脱盐柱根据生产商的指示将上清脱盐并缓冲液交换至20mM乙酸钠-150mM NaCl pH 5.0中。蛋白质浓度使用Microplate BCA^TM Protein Assay Kit确定。

实施例6：制备里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II

里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II基因如WO 2005/056772所描述的分离自里氏木霉RutC30。

将里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II基因在镶片镰孢中使用pEJG61作为表达载体根据描述于公布的美国申请No.20060156437中的过程进行表达。如公布的美国申请No.20060156437中所述进行发酵。蛋白质浓度使用Microplate BCA^TM Protein Assay Kit确定。

使用

26/10脱盐柱根据生产商的指示将里氏木霉CEL6A纤维二糖水解酶II脱盐并缓冲液交换至20mM乙酸钠-150mM NaCl pH 5.0中。

实施例7：pMJ04表达载体的构建

使用如下所示的引物993429(反义)和993428(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNA PCR扩增了里氏木霉纤维二糖水解酶1基因(cbh1，CEL7A)终止子，由此构建了表达载体pMJ04。经过工程改造，所述反义引物在5’末端具有PacI位点，并且所述有义引物在3’末端具有SpeI位点。

引物993429(反义)：

5’-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3’(SEQ ID NO：69)

引物993428(有义)：

5’-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3’(SEQ ID NO：70)

用

Plant Maxi Kit分离了里氏木霉RutC30基因组DNA。

扩增反应(50μl)的组成为1X ThermoPol Reaction Buffer(ThermoPol反应缓冲液)(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)、0.3mM dNTP、100ng里氏木霉RutC30基因组DNA、0.3μM引物993429、0.3μM引物993428和2单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。将所述反应物在如下编程的

5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)中温育：进行5个循环的94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后进行25个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(最终延伸5分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下229bp的产物条带，并使用

GelExtraction Kit(

凝胶提取试剂盒)(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照制造商的说明进行纯化。

所得的PCR片段用PacI和SpeI消化后，用Rapid DNA Ligation Kit(快速DNA连接试剂盒)(Roche，Indianapolis，IN，USA)连接到经相同的限制酶消化的pAlLo1(WO 05/067531)中产生pMJ04(图2)。

实施例8：pCaHj568的构建

从pCaHj170(美国专利No.5,763,254)和pMT2188构建了质粒pCaHj568。质粒pCaHj170包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)全长编码区(SEQ ID NO：1，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列)。pMT2188的构建最先是用如下所示的引物142779和142780从pCaHj483(WO 98/00529)PCR扩增出pUC19复制起点。引物142780在PCR片段中引入BbuI位点。

引物142779：

5’-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3’(SEQ ID NO：71)

引物142780：

5’-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3’(SEQ ID NO：72)

该扩增使用

PCR System(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)依照制造商的说明进行。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用Jetquick Gel Extraction Spin Kit(离心式快速凝胶提取试剂盒)(Genomed，Wielandstr，Germany)分离并纯化出1160bp的片段。

使用如下所示的引物140288和142778，利用PCR System从通用酿酒酵母克隆载体pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中扩增出URA3基因。引物140288在PCR片段中引入EcoRI位点。

引物140288：

5’-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3’(SEQ ID NO：73)

引物142778：

5’-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3’(SEQ ID NO：74)

在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用Jetquick Gel Extraction Spin Kit分离并纯化出1126bp的片段。

通过混合所述两个PCR片段并用如上所示的引物142780和140288通过重叠剪接(overlap splicing)法(Horton等，1989，Gene 77：61-68)进行扩增，将这两个片段融合。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，再使用Jetquick Gel Extraction Spin Kit分离并纯化出2263bp的片段。

所得的片段用EcoRI和BbuI消化，并使用标准规程连接到用相同的限制酶消化过的pCaHj483的最大片段中。将连接混合物转化到依照Mandel和Higa，1970，J.Mol.Biol.45：154的方法制成感受态的pyrF阴性大肠杆菌菌株DB6507(ATCC 35673)中。在每升添加了1g酪蛋白氨基酸、500μg硫胺素和10mg卡那霉素的固体M9培养基(Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)上选择转化体。分离了来自一个转化体的质粒，命名为pCaHj527(图3)。

使用

PCR System依照制造商的说明，通过PCR对pCaHj527上存在的NA2-tpi启动子进行定点诱变。利用如下所示的诱变引物141223，将核苷酸134-144从GTACTAAAACC(SEQ ID NO：75)转变为CCGTTAAATTT(SEQ ID NO：76)。

引物141223：

5’-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3’(SEQ ID NO：77)

利用如下所示的诱变引物141222，将核苷酸423-436从ATGCAATTTAAACT(SEQ ID NO：78)转变为CGGCAATTTAACGG(SEQ IDNO：79)。

引物141222：

5’-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3’(SEQ ID NO：80)

所得的质粒命名为pMT2188(图4)。

将特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区从pCaHj170作为Bam HI-SalI片段转移到用Bam HI和Xho I消化过的pMT2188中，生成pCaHj568(图5)。质粒pCaHj568包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码序列可操作地连接的突变的NA2-tpi启动子。

实施例9：pMJ05的构建

质粒pMJ05的构建是通过使用如下所示的引物HiEGV-F和HiEGV-R从pCaHj568PCR扩增出915bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码区。

引物HiEGV-F(有义)：

5’-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQ ID NO：81)

引物HiEGV-R(反义)：

5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO：82)

扩增反应(50μl)的组成为1X ThermoPol Reaction Buffer(ThermoPol反应缓冲液)(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)、0.3mM dNTP、10ng/μlpCaHj568、0.3μM HiEGV-F引物、0.3μM HiEGV-R引物、和2单位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。将所述反应物在如下编程的

5333中温育：5个循环的94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后进行25个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(最终延伸5分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下937bp的产物条带，并使用

Gel Extraction Kit依照生产商的说明进行纯化。

用937bp的纯化片段作为模板DNA用下述引物进行后续扩增：

引物HiEGV-R(反义)：

5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO：83)

引物HiEGV-F-overlap(有义)：

5’-

ATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQ IDNO：84)

斜体表示的引物序列与里氏木霉纤维二糖水解酶I基因(cbh1)启动子的17bp同源，而带下划线的引物序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的29bp同源。启动子和编码序列之间36bp的重叠使得包含里氏木霉cbh1启动子的994bp片段能够精确的融合于包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的918bp片段。

扩增反应(50μl)的组成为1X ThermoPol Reaction Buffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mM dNTP、1μl纯化的937bp PCR片段、0.3μMHiEGV-F-overlap引物、0.3μM HiEGV-R引物、和2单位Vent DNA聚合酶。将所述反应物在如下编程的5333中温育：5个循环的94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后进行25个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(最终延伸5分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下945bp的产物条带，并使用

Gel Extraction Kit依照生产商的说明进行纯化。

另外使用如下所示的引物(该有义引物经工程改造在5’末端具有SalI限制位点)进行PCR，来从里氏木霉RutC30基因组DNA扩增里氏木霉cbh1启动子序列，该序列从所述基因的ATG起始密码子上游994bp开始延伸。里氏木霉RutC30基因组DNA是用Plant Maxi Kit分离的。

引物TrCBHIpro-F(有义)：

5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO：85)

引物TrCBHIpro-R(反义)：

5’-GATGCGCAGTCCGCGGT-3’(SEQ ID NO：86)

扩增反应(50μl)的组成为1X ThermoPol Reaction Buffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mM dNTP、100ng/μl里氏木霉RutC30基因组DNA、0.3μMTrCBHIpro-F引物、0.3μM TrCBHIpro-R引物、和2单位Vent DNA聚合酶。将所述反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃120秒(最终延伸5分钟)。将反应产物通过1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下998bp的产物条带，并使用

Gel Extraction Kit(

凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。

用纯化的998bp PCR片段作为模板DNA用下述引物进行后续扩增。

引物TrCBHIpro-F：

5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO：87)

引物TrCBHIpro-R-overlap：

5’-GGAGGGGGGAGGAACGCAT -3’(SEQ IDNO：88)

斜体表示的序列与里氏木霉cbh1启动子的17bp同源，而带下划线的序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的29bp同源。启动子和编码序列之间36bp的重叠使得包含里氏木霉cbh1启动子的994bp片段能够精确的融合于包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码区的918bp片段。

扩增反应(50μl)的组成为1X ThermoPol Reaction Buffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mM dNTP、1μl纯化的998bp PCR片段、0.3μM TrCBH1pro-F引物、0.3μM TrCBH1pro-R-overlap引物、和2单位Vent DNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的5333中温育：5个循环的94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后进行25个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(最终延伸5分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下1017bp的产物条带，并使用Gel Extraction Kit(

凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。

用1017bp里氏木霉cbh1启动子PCR片段和945bp特异腐质霉内切葡聚糖酶V PCR片段作为模板DNA用下述引物进行后续扩增，以利用重叠PCR精确地将994bp cbh1启动子融合于918bp内切葡聚糖酶V全长编码区。

引物TrCBHIpro-F：

5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO：89)

引物HiEGV-R：

5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO：90)

扩增反应(50μl)的组成为1X ThermoPol Reaction Buffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mM dNTP、0.3μM TrCBH1pro-F引物、0.3μM HiEGV-R引物和2单位Vent DNA聚合酶。将所述反应物在如下编程的

5333中温育：5个循环的94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后进行25个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(最终延伸5分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下1926bp的产物条带，使用

Gel Extraction Kit(

凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。

将所得的1926bp片段使用

PCR Cloning Kit(

PCR克隆试剂盒)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)依照制造商的规程克隆到

-Blunt-II-

载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。所得的质粒用NotI和SalI消化，并使用

Gel Extraction Kit(

凝胶提取试剂盒)凝胶纯化1926bp片段，然后使用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis，IN，USA)连接到pMJ04(其也用同样两种限制酶消化过)中，产生pMJ05(图6)。质粒pMJ05包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码序列可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子及终止子。

实施例10：pSMai130表达载体的构建

从作为模板的pJaL660(WO 2002/095014)用如下所示的引物993467(有义)和993456(反义)PCR扩增了米曲霉β-葡糖苷酶全长编码序列中从ATG起始密码子直到TAA终止密码子的2586bp的DNA片段(cDNA序列：SEQID NO：37；和推定的氨基酸序列：SEQ ID NO：38；大肠杆菌DSM 14240)。将Spe I位点工程构建到反义引物的5’末端以便于连接。斜体字的引物序列与里氏木霉cbh1启动子的24bp同源，且带下划线的序列与米曲霉β-葡糖苷酶编码区的22bp同源。

引物993467：

5’-

ATGAAGCTTGGTTGGATCGA GG-3’(SEQ ID NO：91)

引物993456：

5’-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3’(SEQ ID NO：92)

扩增反应(50μl)的组成为Pfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，0.25mM dNTP，10ng pJaL660，6.4μM引物993467，3.2μM引物993456，1mM MgCl₂和2.5单位Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。将这些反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个为94℃1分钟、55℃1分钟和72℃3分钟(最终延伸15分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下2586bp的产物条带，并使用

Gel Extraction Kit(凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。

另外使用如下所示的引物993453(有义)和引物993463(反义)进行PCR，来扩增里氏木霉cbh1启动子序列(其从该基因ATG起始密码子上游1000bp处开始延伸)，产生1000bp的PCR片段。

引物993453：

5’-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3’(SEQ ID NO：93)

引物993463：

5’-CCTCGATCCAACCAAGCTTCAT

-3’(SEQ ID NO：94)

斜体表示的引物序列与里氏木霉cbh1启动子的24bp同源，而带下划线的引物序列与米曲霉β-葡糖苷酶全长编码区的22bp同源。启动子和编码序列之间46bp的重叠使得包含里氏木霉cbh1启动子的1000bp片段能够精确的融合于包含米曲霉β-葡糖苷酶编码区的2586bp片段。

扩增反应(50μl)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTP、100ng里氏木霉RutC30基因组DNA、6.4μM引物993453、3.2μM引物993463、1mMMgCl₂和2.5单位Pfx DNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个为进行94℃1分钟、55℃1分钟和72℃3分钟(最终延伸15分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下1000bp的产物条带，并使用

Gel Extraction Kit(

凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。

用纯化的片段作为模板DNA，进一步通过使用上文所示的引物993453(有义)和引物993456(反义)的重叠PCR进行扩增，来将包含里氏木霉cbh1启动子的1000bp片段精确地融合于包含米曲霉β-葡糖苷酶全长编码区的2586bp片段。

扩增反应(50μl)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTP、6.4μM引物993453、3.2μM引物993456、1mM MgCl₂和2.5单位Pfx DNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个进行94℃1分钟、60℃1分钟和72℃4分钟(最终延伸15分钟)。

将所得的3586bp片段用Sal I和Spe I消化，并连接到用同样两种限制酶消化过的pMJ04中，产生pSMai130(图7)。质粒pSMai130包含与米曲霉天然β-葡糖苷酶信号序列及编码序列(即全长米曲霉β-葡糖苷酶编码序列)可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子及终止子。

实施例11：pSMai135的构建

从作为模板的pJaL660利用如下所示的引物993728(有义)及引物993727(反义)PCR扩增出从Lys-20到TAA终止密码子的米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码区(减去天然信号序列，见图8；SEQ ID NO：95和96代表信号肽和它的编码序列)。

引物993728：

5’-

AAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3’(SEQ ID NO：97)

引物993727：

5’-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3’(SEQ ID NO：98)

斜体字的序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的20bp同源，而带下划线的序列与米曲霉β-葡糖苷酶编码区的22bp同源。将Spe I位点工程化到反义引物的5’端中。

扩增反应(50μl)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTP、10ng/μlpJaL660、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、1mM MgCl₂和2.5单位Pfx DNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个进行94℃1分钟、55℃1分钟和72℃3分钟(最终延伸15分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下2523bp的产物条带，并使用

GelExtraction Kit(

凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。

另外使用如下所示的引物993724(有义)和引物993729(反义)进行PCR扩增，来扩增里氏木霉cbh1启动子的1000bp和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的63bp(ATG起始密码子到Ala-21，图9，SEQ ID NO：99和100)。

引物993724：

5’-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3’(SEQ ID NO：101)

引物993729：

5’-GGGAGTACGCGAGATCATCCTT -3’(SEQ ID NO：102)

斜体字的引物序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的20bp同源，而带下划线的引物序列与米曲霉β-葡糖苷酶编码区的22bp同源。

用包含cbh1启动子控制下的特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的质粒pMJ05作为模板，产生了包含里氏木霉cbh1启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列片段的1063bp片段。里氏木霉cbh1启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列与米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列之间有42bp的重叠，以提供所述启动子与2523bp米曲霉β-葡糖苷酶编码区的ATG起始密码子之间的完美连结。

扩增反应(50μl)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTP、10ng/μlpMJ05、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、1mM MgCl₂和2.5单位Pfx DNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个进行94℃1分钟、60℃1分钟和72℃4分钟(最终延伸15分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下1063bp的产物条带，并使用

GelExtraction Kit(

凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。

用纯化的重叠片段作为模板，用如上所述的引物993724(有义)和引物993727(反义)进行扩增，通过重叠PCR将所述包含里氏木霉cbh1启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的1063bp片段精确地融合于所述包含米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码区框的2523bp片段。

扩增反应(50μl)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTP、6.4μM引物993724、3.2μM引物993727、1mM MgCl₂和2.5单位Pfx DNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个进行94℃1分钟、60℃1分钟和72℃4分钟(最终延伸15分钟)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下3591bp的产物条带，并使用

将所得的3591bp片段用Sal I和Spe I消化，并连接到用相同的限制酶消化过的pMJ04中产生pSMai135(图10)。质粒pSMai135包含可操作地连接于特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列和米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子。

实施例12：带有特异腐质霉内切葡聚糖酶V分泌信号的米曲霉β-葡糖苷酶的表达

通过PEG-介导的转化(Penttila等，1987，Gene 61155-164)将编码与特异腐质霉内切葡聚糖酶V分泌信号连接的成熟米曲霉β-葡糖苷酶的质粒pSMai135(图9)导入里氏木霉RutC30中。该质粒含有构巢曲霉amdS基因，使得转化体可以利用乙酰胺作为唯一氮源生长。

将里氏木霉RutC30在25ml添加了2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的YP培养基中27℃、90rpm条件下培养17个小时。用Vacuum Driven Disposable Filtration System(一次性真空驱动过滤系统)(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤收集菌丝体，并用去离子水和1.2M山梨醇各洗涤两次。将经过洗涤的菌丝体悬浮在含15mg/ml

(Novozymes A/S，

Denmark)和0.36单位/ml壳多糖酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的20ml 1.2M山梨醇中，并在90rpm轻柔振荡下34℃温育15-25分钟，由此来生成原生质体。400xg离心7分钟收集原生质体，并用冷的1.2M山梨醇洗涤两次。原生质体用血细胞计数器计数后重悬于STC中至终浓度1X10⁸个原生质体/ml。多余的原生质体在Cryo 1℃Freezing Container(1℃冷冻柜)(Nalgene，Rochester，NY，USA)中在-80℃保存。

将大约7μg经Pme I消化的pSMai135加入100μl原生质体溶液中，轻柔混合，然后加入260μl PEG缓冲液，混合，室温温育30分钟。然后加入STC(3ml)，混合，并将转化溶液涂布到使用构巢曲霉amdS选择的COVE平板上。将平板在28℃温育5-7天。将转化体传代培养到COVE2平板上，并在28℃培养。

将用pSMai135获得的67个转化体(称为SMA135)传代培养到含有乙酰胺的新鲜平板上，让它们在28℃进行7天的孢子形成。

将这67个SMA135里氏木霉转化体在含25ml pH 6.0纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，其中用所述转化体的孢子接种培养基，在28℃、200rpm条件下温育7天。将里氏木霉RutC30作为对照进行。在第7天取出培养液样品。将每种培养液1ml在微量离心管中以15,700xg离心5分钟，并将上清液转移到新管中。样品保存在4℃直到进行酶测定。用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物测定上清液的β-葡糖苷酶活性，如下所述。

β-葡糖苷酶活性测定在环境温度下进行，使用25μl等份的在50mM琥珀酸盐(succinate)pH 5.0中1∶10稀释过的培养上清液，在作为底物的200μl0.5mg/ml对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(溶于50mM琥珀酸盐pH 5.0)中实施。温育15分钟后加入100μl 1M Tris-HCl pH 8.0终止反应，用分光光度计读取405nm吸光度。1个单位的β-葡糖苷酶活性对应于在环境温度、pH 5.0条件下每升每分钟产生1μmol对硝基苯。用黑曲霉β-葡糖苷酶(NOVOZYM^TM 188，Novozymes A/S，

Denmark)作为酶标准品。

若干个SMA135转化体显示了比里氏木霉RutC30所分泌的高数倍的β-葡糖苷酶活性。一个命名为SMA135-04的转化体产生了最高的β-葡糖苷酶活性。

用

系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)使用

Tris-HCl(5％分离型)凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行SDS-PAGE。将5μl第7天上清液(见上文)悬浮在2X浓度的Laemmli Sample Buffer(Laemmli样品缓冲液)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中，在5％β-巯基乙醇存在下煮沸3分钟。将上清液样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并用1X Tris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行电泳。所得的凝胶用BIO-

Coomassie Blue Stain(考马斯亮蓝染料)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)染色。

通过SDS-PAGE分析的38个里氏木霉SMA135转化体中，26个产生了大约110kDa的蛋白质，其未见于作为对照的里氏木霉RutC30。转化体里氏木霉SMA135-04产生的β-葡糖苷酶水平最高，这一点有通过SDS-PAGE所见的所述110kDa条带的丰度为证。

将里氏木霉SMA135-04进行孢子划线接种经过在板上的两轮生长以保证其为克隆菌株，且将多个小瓶在将生产扩大至生产规模的发酵罐前进行冻结(and multiple vials frozen prior to production scaled to process scale fermentor)。将所得的蛋白质培养液自真菌细胞群中回收，并对其进行过滤，浓缩与配制。所得的纤维素分解酶制备物命名为纤维素分解酶组合物#1。

实施例13：表达载体pSMai140的构建

表达载体pSMai140通过用Nco I消化质粒pSATe111BG41(WO04/099228)而构建，质粒pSATe111BG41携带米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41全长编码区(SEQ ID NO：103，其编码SEQ ID NO：104的氨基酸序列)。所得1243bp的片段用TAE缓冲液在1.0％的琼脂糖凝胶上分离并使用

Gel Extraction Kit根据制造商的说明进行纯化。

将表达载体pSMai135用Nco I消化，并将8286bp片段用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离并使用

Gel Extraction Kit根据制造商的说明进行纯化。然后用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis，IN，USA)根据制造商的规程将1243bp经Nco I消化的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41片段与所述8286bp的载体连接产生表达载体pSMai140(图11)。质粒pSMai140包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列以及米曲霉β-葡糖苷酶变体的成熟编码序列可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因启动子和终止子。

实施例14：用pSMai140转化里氏木霉RutC30

用Pme I将质粒pSMai140线性化并如实施例12所述转化入里氏木霉RutC30菌株。从四个独立的转化实验中共获得了100个转化体，将所有转化体在摇瓶中在纤维素酶诱导性培养基上培养，然后如实施例12所述从转化体的培养基中测定β-葡糖苷酶活性。许多里氏木霉SMA140转化体显示比里氏木霉RutC30高数倍的β-葡糖苷酶活性。

通过实施例12所述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Coomassie染色从分析过酶活性的同样13个培养物上清检测到培养基中米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41蛋白质的存在。所有13个具有高β-葡糖苷酶活性的转化体也以不同产率表达约110kDa的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41。

将经过β-葡糖苷酶活性测定和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评价的表达最高β-葡糖苷酶变体的转化体命名为里氏木霉SMA140-43。

实施例15：表达载体pSaMe-F1的构建

用pMJ05作为模板使用下述引物PCR扩增包含209bp的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V基因的核心区(SEQID NO：1的核苷酸1-702，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸1-234，WO 91/17243)的DNA片段。

引物995103：

5’-cccaagcttagccaagaaca-3’(SEQ ID NO：105)

引物995137：

5’-gggggaggaacgcatgggatctggacggc-3’(SEQ ID NO：106)

扩增反应(50μl)的组成为1X Pfx扩增缓冲液、10mM dNTP、50mMMgSO₄、10ng/μl pMJ05、50皮摩尔995103引物、50皮摩尔995137引物和2单位Pfx DNA聚合酶。所述反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个进行94℃30秒、55℃30秒和72℃60秒(3分钟最后延伸)。

反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，将911bp的产物条带从凝胶上切下，并根据制造商的说明用

Gel Extraction Kit纯化。

用pSMai140作为模板与下述引物PCR扩增包含806bp米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41基因的DNA片段。

引物995133：

5’-gccgtccagatccccatgcgttcctccccc-3’(SEQ ID NO：107)

引物995111：

5’-ccaagcttgttcagagtttc-3’(SEQ ID NO：108)

扩增反应(50μl)的组成为1X Pfx扩增缓冲液、10mM dNTP、50mMMgSO₄、100ng pSMai140、50皮摩尔995133引物、50皮摩尔995111引物和2单位Pfx DNA聚合酶。所述反应物在如下编程的

5333中温育：30个循环，每个进行94℃30秒、55℃30秒和72℃120秒(3分钟最后延伸)。

反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，将806bp的产物条带从凝胶上切下并根据制造商的说明用Gel Extraction Kit纯化。

然后将以上两个PCR片段进行重叠PCR。使用纯化的重叠片段作为扩增模板，用于使用上述引物995103(有义)和引物995111(反义)进行扩增，以将包含209bp的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列的702bp片段与包含米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41一部分编码区的806bp片段通过重叠PCR精确融合。

扩增反应(50μl)的组成为1X Pfx扩增缓冲液、10mM dNTP、50mMMgSO₄、2.5μl的每一种片段(20ng/μl)、50皮摩尔995103引物、50皮摩尔995111引物和2单位的高保真Pfx DNA聚合酶。所述反应物在如下编程的5333中温育：进行95℃初始变性3分钟，然后是30个驯养换，每个进行1分钟变性、1分钟60℃退火和3分钟72℃延伸。

反应产物用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，将1.7kb的产物条带从凝胶上切下并根据制造商的说明用

Gel Extraction Kit纯化。

根据制造商的说明将1.7kb的片段连入

平末端载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。然后根据制造商的快速化学转化步骤将构建体转化入ONE

TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。用质粒分离与消化的方法选择和分析菌落，其中消化使用Hind III进行以释放1.7kb的重叠PCR片段。

同样用Hind III消化质粒pSMai140以线性化质粒。将两个消化的片段根据制造商的说明在使用Rapid DNA Ligation Kit的连接反应中组合起来产生pSaMe-F1(图12)。

将大肠杆菌XL 1-Blue Subcloning-Grade Competent Cells(大肠杆菌XL 1-蓝色亚克隆级感受态细胞)(Stratagene，La Jolla，CA，USA)用连接产物转化。构建体的身份通过对从经转化的大肠杆菌中纯化的质粒的如下序列进行DNA测序来确认：里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列。一个包含重组质粒的克隆被命名为pSaMe-F1。质粒pSaMe-F1包含里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子，还有特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽序列，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽序列直接与特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽连接，特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽直接与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽融合，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽直接与米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列连接。米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：47和48。

实施例16：用pSaMe-F1转化里氏木霉RutC30

将含有25ml添加了2％葡萄糖和10mM尿苷的YP培养基的摇瓶用5X10⁷个里氏木霉RutC30的孢子接种。在27℃，90rpm的条件下大约16小时温育过夜之后，用一次性真空驱动过滤系统收集菌丝体。将菌丝体在100ml去离子水中洗涤两次，在1.2M的山梨醇中洗涤两次。如实施例12所述那样产生原生质体。

将两微克经Pme I线性化的pSaMe-F1DNA，100μl的里氏木霉RutC30原生质体和50％PEG(4000)混合并在室温下温育30分钟。然后加入3ml STC并将内容物倒至添加了10mM尿苷的COVE平板上。然后将平板在28℃温育。转化体在第6天开始出现并被挑出至COVE2平板上在28℃生长6天。回收了22个里氏木霉转化体。

将转化体在摇瓶中在纤维素酶诱导性培养基上培养，并如实施例12所述测定β-葡糖苷酶活性。许多pSaMe-F1转化体都产生β-葡糖苷酶活性。一个命名为里氏木霉SaMeF1-9的转化体产生了最大量的β-葡糖苷酶，并具有两倍于表达米曲霉β-葡糖苷酶变体的菌株(实施例15)的活性。

内切葡聚糖酶的活性根据Beguin，1983，Analytical Biochem.131(2)：333-336用羧甲基纤维素(CMC)覆盖测定法测定。将从5个培养液样品(那些具有最高β-葡糖苷酶活性的)中得到的5μg总蛋白用Native Sample Buffer(天然样品缓冲液)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)稀释并用10X Tris/甘氨酸运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)在

8-16％Tris-HCl凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上运行，然后将凝胶铺在含有1％羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)的平板上方。在37℃温育1小时后，将凝胶用0.1％Congo Red染色20分钟。然后用1M NaCl为平板脱色以鉴定指示内切葡聚糖酶活性的澄清区域。两个澄清区域可见，一个为约110kDa的上方区域，另一个为约25kDa的下方区域。特异腐质霉内切葡聚糖酶V和米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41融合蛋白的预测蛋白大小是118kDa，如果两个蛋白质未被切割而是作为单个多肽保留的话；单个内切葡聚糖酶V核心结构域的糖基化和β-葡糖苷酶的糖基化导致单个蛋白质迁移到比根据一级序列预测的更高的分子量。如果两个蛋白质被切割，那么特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心结构域的预测大小是24kDa而米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41的预测大小是94kDa。由于110kDa处有澄清区域，这一结果表明最起码内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶融合蛋白群体作为单个的大蛋白保持完整。下方澄清区域很可能代表内源的内切葡聚糖酶活性，且可能是由于特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心结构域从米曲霉β-葡糖苷酶的部分断裂而额外导致的。

所述结果证明特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心是有活性的，即使是将其连接到米曲霉β-葡糖苷酶。此外，β-葡糖苷酶活性的提高似乎是由于相对于非融合的β-葡糖苷酶的分泌效率，蛋白质分泌有所提高所致。通过将米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41序列连接到高效分泌的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心，使更多的β-葡糖苷酶被分泌。

实施例17：载体pSaMe-FX的构建

质粒pSaMe-FX通过修饰pSaMe-F1而构建。用Bst Z17和Eco RI消化质粒pSaMe-F1以产生含有β-葡糖苷酶变体BG41编码序列的1kb片段和包含质粒剩余部分的9.2kb片段。所述片段用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离，将9.2kb的片段切下并根据制造商的说明用

GelExtraction Kit纯化。质粒pSMai135也用Bst Z17和Eco RI消化以产生含有与米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41编码序列同源的碱基的1kb片段和含有质粒剩余部分的8.5kb片段。如上分离和纯化所述1kb片段。

根据制造商的说明在用Rapid DNA Ligation Kit的连接反应中组合9.2kb和1kb的片段以产生pSaMe-FX，除了它含有野生型β-葡糖苷酶成熟编码序列而不是变体成熟编码序列之外，其与pSaMe-F1相同。

用连接产物转化大肠杆菌

感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。构建体的身份通过对来自从经转化的大肠杆菌中纯化的质粒的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列进行DNA测序来确定。将一个含有所述重组质粒的克隆命名为pSaMe-FX(图13)。米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：49和50。

实施例18：木霉转化体的转化和表达

如实施例16所述用Pme I线性化pSaMe-FX构建体并将其转化入里氏木霉RutC30菌株。单次转化共获得63个转化体。将转化体在摇瓶中的纤维素酶诱导性培养基上培养并如实施例12所述测定β-葡糖苷酶活性。许多pSaMe-FX转化体产生了β-葡糖苷酶活性。一个命名为SaMe-FX16的转化体与里氏木霉SaMeF1-9(实施例16)相比产生了两倍量的β-葡糖苷酶活性。

实施例19：里氏木霉转化体的分析

如实施例15所述通过融合特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(包含其自身的天然信号序列)和与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列来构建融合蛋白。这种融合构建体和与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列相比，导致分泌的β-葡糖苷酶的活性提高了两倍。第二个融合构建体如实施例17所述产生，其由与米曲霉野生型β-葡糖苷酶编码序列(该序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接)融合的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(包括其自身信号序列)组成，而这导致β-葡糖苷酶活性的进一步提高。用野生型融合物转化的菌株相对于用β-葡糖苷酶变体BG41融合物转化的菌株具有两倍的分泌的β-葡糖苷酶活性。

实施例20：将β-葡糖苷酶融合蛋白编码序列克隆入米曲霉表达载体

设计如下所示的两个合成寡核苷酸引物，用以从编码β-葡糖苷酶融合蛋白的pSaMeFX PCR扩增全长开放式读码框。

PCR正向引物：

5’-GGACTGCGCAGC

-3’(SEQ ID NO：109)

PCR反向引物：

5’-AGTTAATTAA-3’(SEQ ID NO：110)

黑体字母代表编码序列。正向引物中带有下划线的“G”表示引入的用以产生SphI限制性位点的碱基改变。剩余的序列与pSaMeFX插入位点相比具有序列同一性。反向引物中带有下划线的序列表示添加的Pac I限制性位点，其有助于将该基因克隆在表达载体pAlLo2中(WO 04/099228)。

在终体积为50μl的PCR反应中使用50皮摩尔的以上每种引物，所述PCR反应包含50ng pSaMeFX DNA、1X Pfx扩增缓冲液、6μl10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5单位

Pfx DNA聚合酶，和1μl 50mM MgSO₄。用如下设定程序的 5333扩增片段：进行98℃2分钟的1个循环；和96℃30秒、61℃30秒和68℃3分钟的35个循环。35个循环之后，反应物在68℃温育10分钟，然后于10℃冷却。用TAE缓冲液和0.1μg/ml溴化乙锭在0.8％GTG-琼脂糖凝胶(Cambrex Bioproducts One Meadowlands Plaza East Rutherford，NJ，USA)上分离3.3kb的PCR反应产物。为了避免UV-诱导的突变，借助DARK READER^TM使DNA显像。用一次性剃刀片将3.3kb的DNA条带切下并根据制造商的说明用

-DA旋杯(spin cup)纯化。

将纯化的3.3kb PCR产物克隆入

4Blunt-

载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。将4微升纯化的PCR产物与1μl 2M氯化钠溶液和1μl

载体混合。将反应物在室温下温育15分钟，然后根据制造商的说明用2μl反应物转化One

TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将每个转化反应的三个83μl的等份试样涂布在添加了100μg/ml氨苄青霉素的三个150mm 2X YT平板上并在37℃温育过夜。

用8个重组菌落接种含有补充了100μg/ml氨苄青霉素的3ml LB培养基的液体培养物。用

9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)从这些培养物中制备质粒DNA。将克隆用Pac I限制酶消化进行分析。将来自每个克隆的质粒DNA用Pac I消化并用TAE缓冲液通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。所有的8个克隆都具有期望的限制性消化图式，选择克隆5、6、7和8进行测序以确认在克隆的插入物中没有突变。对它们的5’和3’末端的序列分析显示所有的4个克隆都具有正确的序列。选择克隆5和7进行后续测序。两个克隆都测序为Phred Q值超过40以确保没有PCR导致的错误。克隆5和7显示具有期望的序列而选择克隆5重克隆入pAlLo2。

通过用Sph I消化将来自克隆5的质粒DNA线性化。然后通过加入1.2μl 10mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物和6单位的T4DNA聚合酶(New England Bioloabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)将线性化的克隆平末端化。所述混合物在12℃温育20分钟，然后通过加入1μl 0.5M EDTA并在75℃加热20分钟停止反应使酶失活。编码β-葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段如上所述通过凝胶电泳和超滤纯化。

通过用Nco I消化使载体pAlLo2线性化。然后通过加入0.5μl10mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物和1单位的DNA聚合酶I使线性化的载体平末端化。在25℃将混合物温育15分钟，然后通过加入1μl 0.5MEDTA并在75℃加热15分钟停止反应使酶失活。然后用Pac I消化载体。平末端化的载体如上所述通过凝胶电泳和超滤纯化。

将编码β-葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段克隆入经线性化和纯化的pAlLo2载体，所述克隆是用Rapid DNA Ligation Kit进行的。根据制造商的说明用1μl反应样品转化大肠杆菌XL10

Gold细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。在恢复阶段之后，将来自转化反应的2个100μl等份试样铺板在补充了100μg/ml氨苄青霉素的2个150mm 2X YT平板上并在37℃温育过夜。从选择平板上随机挑选一组8个推定的重组克隆并用

9600从每个克隆制备质粒DNA。选择克隆1-4用pAlLo2特异性引物测序以确认连接载体/插入物具有正确的序列。克隆3具有完美的载体/插入物连接并被命名为pAlLo47(图14)。

为了获得无标记的表达菌株，进行限制性内切核酸酶消化将赋予对抗生素氨苄青霉素的抗性的blaA基因与表达构建体的其它部分分离。用Pme I消化30微克pAlLo47。然后将经消化的DNA如上所述用琼脂糖凝胶电泳纯化。用剃刀片将含有表达构建体但缺少blaA基因的6.4kb DNA条带切下并用

Gel Extraction Kit纯化。

实施例21：特异腐质霉/米曲霉cel45A核心-cel3A融合基因在米曲霉JaL355中的表达

根据Christensen等，1988，见上的方法制备了米曲霉JaL355(WO00/240694)的原生质体。使用10微升实施例20的经纯化的表达构建体转化米曲霉JaL355原生质体。米曲霉JaL355的转化产生了大约90个转化体。分离50个转化体至单独的PDA平板上并在34℃温育5天。

用3ml 0.01％

80洗涤48个铺满的孢子平板，并用孢子悬浮液接种125ml玻璃摇瓶中的25ml MDU2BP培养基。转化体培养物在34℃温育并以200rpm持续摇动。5天之后，将每个培养物的1ml等份试样在12,000xg下离心并收集其上清。5μl的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合并上样至1.5mm 8％-16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，用BIO-

Coomassie Blue染料染色。培养液的SDS-PAGE概貌显示，48个转化体中的33个能够表达表观分子量与期望的118kDa非常相近的新蛋白质。转化体21具有最佳产率并被选择用于进一步研究。

实施例22：米曲霉JaL355转化体21的单孢子分离

将米曲霉JaL355转化体21的孢子涂布在PDA平板上并在34℃温育5天。将铺满孢子的平板上的一小块区域用0.5ml 0.01％80洗涤以重悬孢子。将孢子悬浮液100μl的等份试样用5ml 0.01％

80稀释至终体积5ml。借助血细胞计数器测定孢子浓度并将其稀释至终浓度为每微升0.1个孢子。将孢子稀释液200μl的等份试样涂布在150mm基础培养基平板上并在34℃温育2-3天。将出现的菌落从平板上切下转移至PDA平板并在34℃温育3天。然后将孢子涂布在平板上并在34℃再温育5天。

将铺满孢子的平板用3ml 0.01％

80洗涤并用孢子悬浮液接种125ml玻璃摇瓶中的25ml MDU2BP培养基。单孢子培养物在34℃下温育并以200rpm持续摇动。5天之后，将每个培养物的1ml等份试样以12,000xg离心并收集其上清。将5μl的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合并上样至1.5mm 8％-16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，用BIO-Coomassie Blue染料染色。培养液的SDS-PAGE概貌显示所有的8个转化体都能够以非常高的水平表达β-葡糖苷酶融合蛋白，而名为米曲霉JaL355AlLo47的培养物之一产生了最高产率。

实施例23：pCW087的构建

设计如下所示的2个合成寡核苷酸引物以从质粒pDZA2-7(WO2005/074656)中PCR扩增橙色嗜热子囊菌GH61A多肽基因。正向引物产生平的5’末端而反向引物在3’末端引入Pac I位点。

正向引物：

5’-ATGTCCTTTTCCAAGATAATTGCTACTG-3’(SEQ ID NO：111)

反向引物：

5’-GCTTAATTAACCAGTATACAGAGGAG-3’(SEQ ID NO：112)

将50皮摩尔的以上各种引物用于终体积为50μl的PCR反应中，所述反应的组成为50ng pDZA2-7、1μl10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、5μl10X ACCUTAQ^TM DNA聚合酶缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)和5单位ACCUTAQ^TM DNA聚合酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)。用程序设定如下的

5333扩增DNA片段：1个循环的95℃3分钟；30个循环，每个为94℃45秒、55℃60秒和72℃1分30秒。25个循环之后，将反应在72℃温育10分钟然后冷却至4℃等待后续处理。用Pac I消化橙色嗜热子囊菌GH61A PCR片段的3’末端。根据制造商的说明用MINELUTE^TM Reaction Cleanup Kit(MINELUTE^TM反应清除试剂盒)(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)纯化消化产物。

利用5’末端平的Nco I位点和3’末端的Pac I位点将GH61A片段直接克隆入pSMai155(WO 2005/074647)。质粒pSMai155用Nco I和Pac I消化。然后用Klenow酶将Nco I位点变平以填补Nco I位点的5’凹陷。Klenow反应由20μl pSma155消化反应混合物加1mM dNTP和1μl Klenow酶组成，将该反应物短暂地在室温温育。将刚刚线性化的pSMai155质粒根据制造商的说明用MINELUTE^TM Reaction Cleanup Kit纯化。这些反应导致与新产生的GH61A片段相相容的5’平末端和3’Pac I位点的产生。然后根据制造商的说明用Rapid DNA Ligation Kit(快速DNA连接试剂盒)将GH61A片段克隆入pSMai155表达载体。用连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue亚克隆级感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。构建体的身份通过DNA测序来自质粒的GH61A编码序列加以确认，该质粒是从经转化的大肠杆菌中纯化的。含有重组质粒的一个大肠杆菌克隆被命名为pCW087-8。

实施例24：pSaMe-Ta61A的构建

表达载体pSaMe-Ta61通过用Nsi I消化含有amdS选择标记的质粒pMJ09，释放2.7kb的amdS片段而构建。然后用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离2.7kb的amdS片段并用

Gel Extraction Kit纯化。

用Nsi I消化表达载体pCW087，并将4.7kb的片段用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上分离并用

Gel Extraction Kit纯化。然后根据制造商的规程用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis，IN，USA)将所述2.7kb的amdS片段与4.7kb的载体片段连接以产生表达载体pSaMe-Ta61A。质粒pSaMe-Ta61A包含可操作地连接到橙色嗜热子囊菌GH61A成熟编码序列的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因的启动子和终止子。

实施例25：里氏木霉菌株SaMe-MF268的构建

用共转化将质粒pSaMe-FX和pSaMe-Ta61A导入里氏木霉RutC30。将质粒pSaMe-FX和pSaMe-Ta61A通过PEG-介导的转化(Penttila等，1987，同上)导入里氏木霉RutC30。每个质粒含有构巢曲霉amdS基因以使转化体能够用乙酰胺作为唯一氮源生长。

将里氏木霉RutC30在27℃和90rpm条件下在添加了2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的25ml YP培养基中培养17小时。用一次性真空驱动过滤系统通过过滤收集菌丝体并用去离子水洗涤2次，1.2M山梨醇洗涤2次。在含有15mg/ml

和0.36单位/ml壳多糖酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的20ml 1.2M山梨醇中悬浮洗涤后的菌丝体并在34℃以90rpm轻摇条件下温育15-25分钟以产生原生质体。通过在400xg离心7分钟收集原生质体并用冷的1.2M山梨醇洗涤2次。原生质体用血细胞计数器计数并在STC中重悬至终浓度1X10⁸个原生质体/ml。将过量的原生质体贮存在-80℃下的Cryo 1℃Freezing Container中。

用Pme I消化各约4μg的质粒pSaMe-FX和pSaMe-Ta61A以促进去除氨苄西林抗性标记。用Pme I消化之后，将线性片段用TAE缓冲液在1％琼脂糖凝胶上运行以分开不同的片段。将来自pSaMe-FX的7.5kb片段和来自pSaMe-Ta61A的4.7kb片段从凝胶上切下并根据制造商的说明用Gel Extraction Kit纯化。这些纯化的片段含有amdS选择性标记盒以及里氏木霉cbh1基因启动子和终止子。此外，所述片段包括特异腐质霉EGV核心/米曲霉BG融合编码序列或橙色嗜热子囊菌GH61A编码序列。转化中使用的片段不包含抗生素抗性标记，因为ampR片段通过这一凝胶纯化步骤被去除。然后将纯化的片段加至100μl原生质体溶液并轻柔混合，然后加入260μl PEG缓冲液，混合，并在室温下温育30分钟。然后加入STC(3ml)并混合，将转化溶液涂布在使用构巢曲霉amdS进行选择的COVE平板上。将平板在28℃温育5-7天。将转化体传代培养到COVE2平板上并在28℃下生长。

将超过400个转化体传代培养至新鲜的含有乙酰胺的平板上并允许其在28℃进行7天的孢子形成。

里氏木霉转化体在含有用转化体孢子接种的25ml pH 6.0纤维素酶诱导性培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，并在28℃和200rpm条件下温育5天。将里氏木霉RutC30作为对照。在第5天将培养液样品除去。在15,700xg条件下在微离心管中离心1ml的各种培养液5分钟并将上清转移至新管。

用

Tris-HCl(5％分离型)凝胶和

系统进行SDS-PAGE。在2X浓度的Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中悬浮5μl的第5天上清(见上)并在5％β-巯基乙醇存在下煮沸3分钟。将上清样品上样至聚丙烯酰胺凝胶并用1X Tris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行电泳。所得凝胶用BIO-

CoomassieBlue染料染色。将SDS-PAGE凝胶条带可视化后观察到，显示出同时表达橙色嗜热子囊菌GH61A多肽和由特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(CEL45A)与米曲霉β-葡糖苷酶融合组成的融合蛋白的转化体，然后在PCS水解反应中测试所述转化体以鉴定产生最佳水解液的菌株。

实施例26：里氏木霉菌株SaMe-MF268的鉴定

显示同时表达橙色嗜热子囊菌GH61A多肽以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的转化体在含有25ml pH 6.0的纤维素酶诱导性培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，其中将培养基用转化体的孢子接种，并在28℃和200rpm下温育5天。

将摇瓶培养液以6000xg离心并在水解前用STERICUP^TM EXPRESS^TM(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤至0.22μm。培养液的活性通过其水解PCS并产生糖的能力来测定，所述糖可以通过化学测定其还原端来检测。

在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory(NREL)，Boulder，CO，USA)用稀硫酸预处理玉米秸秆。用以下条件进行预处理：0.048g硫酸/g干生物质，190℃和25％w/w干固体，进行约1分钟。预处理的玉米秸秆(pretreated corn stover，PCS)中的水不溶固体包含59.2％纤维素，其通过极限消化PCS释放葡萄糖和纤维二糖来确定。酶水解之前，用大体积的双去离子水(double deionized water)洗涤PCS；水洗后PCS的干重为17.73％。

将1kg量的PCS悬浮在约20升双去离子水中，并在PCS沉降之后将水倒出。重复这一操作直到洗涤用水在pH 4.0以上，同时还原性的糖低于每升0.06g。如果是小量测定(如1ml)，将沉降后的浆料(slurry)用100目的网过筛以确保能够吸取。洗涤后PCS的百分比干重含量通过在105℃的烘箱干燥样品至少24小时(直至恒重)并与湿重比较而测定。

PCS水解在1ml体积中在96深孔板(Axygen Scientific)上进行，用ALPS300^TM自动实验室平板密封机(automated lab plate sealer)(ABgene Inc.，Rochester，NY，USA)对所述深孔板进行加热密封。在pH 5.0的50mM乙酸钠中，PCS浓度为每升10g。PCS水解在50℃进行，除在取样期间按照描述搅动以外不用额外地搅动。每个反应一式三份进行。释放的还原糖如下所述通过对羟基苯甲酰肼(p-hydroxy benzoic acid hydrazide，PHBAH)试剂分析。

将体积为0.8ml的PCS(每升水中12.5g)移液至96深孔板的每个孔中，然后是0.10ml pH 5.0的0.5M乙酸钠，然后是0.10ml稀释的酶溶液以起始终反应体积为1.0ml、PCS浓度为每升10g的反应。将平板密封。反应混合物在水解开始时和取得每个样品的时间点(taking each sample time point)前通过颠倒深孔板进行混合。在每个样品时间点，将平板混合然后将深孔板在2000rpm离心(带有RTH-250转子的RT7)10分钟，然后将20μl水解物(上清)移出并加至96孔微量滴定板中的180μl 0.4％NaOH中。在必要时，将这种反应已停止的溶液进一步稀释至合适的还原糖的范围。释放的还原糖用对羟基苯甲酰肼试剂(PHBAH，Sigma，4-hydroxy benzyhydrazide)测定：将50μl的PHBAH试剂(1.5％)与100μl样品在V型底的96孔THERMOWELL^TM平板(Costar 6511)中混合，在95℃的平板加热块上温育10分钟，然后向每个孔加入50μl双去离子水，混合，然后转移100μl至另一个平底的96孔板(Costar 9017)并在410nm处读取吸光度。还原糖使用同样条件下的葡萄糖校准曲线(calibration curve)进行计算。纤维素转化为还原糖的百分比转化如下计算：

％转化＝还原糖(mg/ml)/(所添加的纤维素(mg/ml)x1.11)

因子1.11修正将纤维素水解为葡萄糖的重量增加。

1ml的PCS水解测试之后，将最佳候选者在2升发酵罐中一式两份培养。

摇瓶培养基的组成为每升20g葡萄糖、10g玉米浆固体、1.45g(NH₄)₂SO₄、2.08g KH₂PO₄、0.36g CaCl₂、0.42g MgSO₄·7H₂O和0.42ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升216g FeCl₃·6H₂O、58gZnSO₄·7H₂O、27g MnSO₄·H₂O、10g CuSO₄·5H₂O、2.4g H₃BO₃和336g柠檬酸。

将10ml摇瓶培养基添加至500ml摇瓶。用2块固体平板培养物的琼脂块(plug)接种摇瓶，温育在定轨摇床上以200rpm在28℃进行48小时。用50ml摇瓶培养液接种3升发酵容器。

发酵分批培养基的组成为每升30g纤维素、4g葡萄糖、10g玉米浆固体、3.8g(NH₄)₂SO₄、2.8g KH₂PO₄、2.64g CaCl₂、1.63g MgSO₄.7H₂O、1.8ml消泡剂和0.66ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升216gFeCl₃·6H₂O、58g ZnSO₄·7H₂O、27g MnSO₄·H₂O、10g CuSO₄·5H₂O、2.4gH₃BO₃和336g柠檬酸。发酵补料培养基的组成为葡萄糖和纤维素。

将总共1.8升的发酵分批培养基添加至3升发酵罐。发酵补料培养基以0-4g/l/hr的速率定量提供165小时的时间。将发酵容器的温度保持在28℃，且pH控制在调定点4.75+/-0.1。以1vvm的速率向容器中加入空气，用以1100-1300rpm旋转的Rushton叶轮搅动培养液。在发酵结束时，自所述容器收获全部的培养液，并以3000rpm xg离心以移除生物质。将上清过滤除菌并储存在35到40℃。

测定总蛋白浓度并在50g的PCS水解反应中再次测试培养液，如下所述。每次实验之前，酶稀释剂从储存在4℃的贮存酶溶液中新鲜地制备。

PCS的水解使用125ml有旋塞的Erlenmeyer烧瓶(VWR，West Chester，PA，USA)用50g总反应质量根据NREL Laboratory Analytical Protocol#008(NREL实验室分析规程#008)进行。在这一规程中PCS的水解(约11.4％的PCS和在pH 5.0的50mM乙酸钠中6.8％的纤维素)用不同蛋白质加载量(表达为mg蛋白质/g纤维素)的2升发酵液样品进行。PCS水解能力的测定用4080培养箱(New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)在50℃以150rpm的轨道摇动进行。在水解过程中的72、120和168小时取等份试样并离心，使用

HV 0.45μm膜(Millipore，Billerica，MA，USA)通过使用

RT7平板离心机(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)在2000rpm离心10分钟来过滤上清液。不即刻使用时，将过滤的等份试样在-20℃冷冻。通过在65℃以每分钟0.4ml的流速用0.005M H₂SO₄从4.6x250mm

HPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)洗脱后测定在0.005M H₂SO₄中稀释后的样品中糖的浓度，其数值是通过整合葡萄糖和纤维二糖信号得到的，该信号得自经纯糖样品校准的、使用

1100HPLC(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)进行的折射率(refractive index)检测。所得当量(equivalent)用以计算每个反应的百分比纤维素转化。

用以下等式计算纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(转化，％)：

转化率(％)＝(葡萄糖+纤维二糖x1.053)_(mg/ml)x100x162/(纤维素_(mg/ml)x180)

＝

(葡萄糖+纤维二糖x1.053)_(mg/ml)x100/(纤维素_(mg/ml)x1.111)

在此等式中，因子1.111反映将纤维素转化为葡萄糖时的重量增加，而因子1.053反映将纤维二糖转化为葡萄糖时的重量增加。

表1显示上述50g烧瓶测定中PCS水解反应的结果。产生性能最佳培养液的一个菌株被命名为里氏木霉SaMe-MF268。

表1：168小时时间点时转化为糖的百分比

相对于蛋白质加载量的百分比转化率

(葡萄糖加纤维二糖)

培养液ID-菌株名称 2.5mg/g纤维素 4.0mg/g纤维素

XCL-461-SaMe-MF268 66.29 80.08

XCL-465-SaMe-MF268 69.13 82.80

XCL-462-SaMe-MF330 62.98 77.99

XCL-466-SaMe-MF330 63.34 77.90

XCL-463-SaMe-MF377 64.03 78.45

XCL-467-SaMe-MF377 64.19 79.06

实施例27：构建载体pSaMe-FH

表达载体pSaMe-FH(图15)通过用Bsp120I与PacI消化质粒pSMai155(WO 2005/074647)与质粒pSaMe-FX(实施例17)构建。来自pSMai155的5.5kb片段与来自pSaMeFX的3.9kb片段在1.0％琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离，并用

Gel Extraction Kit纯化。所述两个片段随即使用T4DNA连接酶根据生产商的实验方案连接。用所述连接产物转化大肠杆菌

感受态细胞。构建体的身份通过对来自纯化自经转化大肠杆菌的质粒的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列，特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列，米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列，以及里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列进行DNA测序来确定。将一个包含所述重组质粒的克隆命名为pSaMe-FH。质粒pSaMe-FH包含可操作的连接于特异腐质霉CEL45A核心/米曲霉β-葡糖苷酶的基因融合物的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因启动子与终止子。除移除了amdS选择性标记并取代以潮霉素抗性选择性标记之外，质粒pSaMe-FH与pSaMe-FX相同。

实施例28：分离具有增加的纤维素产生与增强的经预处理的玉米秸秆(PCS)降解能力的里氏木霉SMA135-04的突变体

将PCS(实施例26)用作纤维素底物用于纤维素分解酶测定法与选择平板。在测定之前，用大体积的去离子蒸馏水洗涤PCS直至滤液的pH大于pH4.0。另外，用100MF金属过滤器筛滤PCS以移除颗粒。将经洗涤与过滤的PCS重悬于蒸馏水中至浓度为60mg/ml悬浮液，并储藏于4℃

对里氏木霉菌株SMA135-04(实施例12)用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)进行诱变处理，NTG为主要诱导碱基取代和一些缺失的化学诱变剂(Rowlands，1984，Enzyme Microb.Technol.6：3-10)。存活曲线用恒定时间的接触和多种剂量的NTG，与恒定浓度的NTG和不同时间的接触制作，以获取10％的存活水平。为了获取此存活率，用0.2mg/ml的NTG对分生孢子悬浮液在37℃下随着轻柔的旋转处理20分钟。每个实验均与所述分生孢子未经NTG处理的对照一同进行。

突变体的初步选择在NTG处理后进行。将总共8x10⁶个经诱变后仍存活的分生孢子混合在30ml Mandel’s培养基中，所述培养基包含0.5％蛋白胨，0.1％

X-100与1.5g琼脂。随即将该悬浮液添加于深板(deep plate)(150mm直径，25mm深，Corning Inc.，NY，USA)，并允许所述琼脂在室温下硬化。在使该琼脂硬化之后，添加200ml的Mandels培养基，其包含0.5％蛋白胨，0.1％

X-100，1.5％琼脂糖，和1.0％PCS。在琼脂硬化后将所述平板在28℃下温育。在3-5日的温育后，使用700个在未经处理的菌株之前穿越PCS选择膜的克隆以供二次选择。

对于二次选择，将来自每个分离物的三接种环的分生孢子(three loopfulof conidia)添加至含有25ml纤维素酶诱导培养基的125ml摇瓶中，并在28℃与200rpm下培育5日以诱导纤维素酶的表达与分泌。1ml的每种培养液在微离心机中在400xg下离心5分钟，并分析上清的PCS水解活性以及总蛋白质收率。

“机器人化”的PCS水解测定法通过以1∶20将摇瓶培养液样品稀释于50mM乙酸钠pH 5.0中进行。将稀释样品以稀释前每g PCS 400μl样品添加至分析板(96-孔平底板)。使用

FX(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)，以每升10g PCS添加PCS，继以添加50mM乙酸钠pH 5.0使总体积为180μl。所述分析板在30℃下在增湿盒(humidified box)中培育5天，将所述盒以250rpm振荡。为了增加该测定法的统计学精确性，对每个样品进行6次重复。然而，对1∶20样品稀释进行2次重复。在培育5天后，使用PHBAH测定法测定在水解的PCS样品中还原糖(RS)的浓度，该测定法经修改并适应于96-孔微量滴定板形式。使用ORCA^TM机器人(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)，将所述培养板运送到

FX，并自所述分析板移出9μl的培养液样品，并将其等分于96-孔V底板中(MJ Research，Waltham，MA，USA)。反应通过添加135μl的0.533％PHBAH的2％氢氧化钠溶液来起始。每个分析板在

Thermal Cycler(

热循环仪)(MJ Research，Waltham，MA，USA)上在95℃加热10分钟，再冷却至室温。在培育后，将40μl反应样品稀释于160μl去离子水中，并转移至96-孔平底板。随即，使用

250(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)测定所述样品在405nm处的吸光度。使用自经与样品相似处理的六个葡萄糖标准品(每ml的去离子水0.000，0.040，0.800，0.120，0.165与0.200mg)产生的标准曲线将A₄₀₅值转化为相应的葡萄糖量。所述标准曲线的平均相关系数大于0.98。纤维素转化为还原糖的程度(RS产率)使用描述于实施例26中的方程计算。

总蛋白产量使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)分析法确定。将样品以1∶8稀释于水中以使浓度位于合适范围内。将白蛋白标准品(BSA)在水中稀释至自2.0mg/ml浓度至0.25mg/ml浓度的多种水平。使用

FX将总共20μl的每个稀释液(包括标准品)转移至96-孔平底板中。将两百微升的BCA底物溶液(BCA Protein Assay Kit(BCA蛋白测定试剂盒)，Pierce，Rockford，IL，USA)添加到每个孔中，并随即在37℃下培育45分钟。在培育完成时，使用

250测定所述96孔板在562nm处的吸光度。样品浓度通过自Microsoft Excel(Microsoft Corporation，Redmond，WA，USA)产生的标准曲线外推确定。

在挑取的初步分离物中，二十个产生了较之来自菌株SMA134-04的培养液显示改善的PCS水解活性的培养液。这些分离物产生了纤维素分解培养液，其能够产生相对于亲本菌株高5-15％的还原糖水平。一些分离物，例如，SMai-M104显示了每单位体积的培养液水解PCS纤维素的性力增加，此外分泌更高水平的总蛋白。

选取性能最佳的里氏木霉突变体菌株SMai-M104，是通过评估发酵产生的培养液的纤维素酶性能来确定的。所述发酵如实施例26中所述进行7天。将发酵样品在有螺旋瓶盖的125-ml Erlenmeyer烧瓶(VWR，West Chester，PA，USA)中在50g PCS水解中进行测试。反应条件如下：纤维素上样量为6.7％，酶上样量为6与12mg/g纤维素；总反应物为50g；50℃与pH 5.0。称量每个摇瓶与瓶盖，并且将所期望量的PCS添加至所述摇瓶，并记录总重量。将10ml蒸馏水添加至每个摇瓶中，并随即将所有摇瓶在121℃下高压灭菌30分钟。在高压灭菌后，允许所述烧瓶冷却至室温。为了将每个烧瓶的总重量调整为50克，添加5ml的0.5M乙酸钠pH 5.0再加培养液以达成所期望的上样量。随即添加合适量的蒸馏水以达到所期望的最终50g的重量。随即将所述烧瓶以50℃与130rpm置于培养箱振荡器中(New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)。在第3，5与7天，将1ml样品自每个烧瓶移出，并添加至96-深孔板(总体积2.0ml)。所述96孔板随即在3000rpm下使用

RT7平板离心机(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)离心15分钟。在离心后，将200μl上清转移至96孔0.45μm孔径过滤板(Millipore，Bedford，MA，USA)，并施加真空以收集滤液。随即将滤液用0.4％NaOH稀释至还原糖为合适范围，并使用PHBAH试剂(1.5％)用下述方法测定：将50μl PHBAH试剂与100μl样品添加至V底的96孔板中，并在95℃下培育10分钟。为了完成该反应，将50μl蒸馏水添加至每个孔中，并在混合样品后，将100μl的混合物转移至另一个平底96孔板以测定在410nm处的吸光度。还原糖的量使用葡萄糖校准曲线计算，且如下计算百分比消化率：

％消化＝还原糖(mg/ml)/(添加的纤维素(mg/ml)x1.11)，其中因子1.11反映了将纤维素转化为葡萄糖过程中重量的增加。

所述PCS水解分析法结果显示一个命名为SMai-M104的突变体略微(大约增加5％的葡萄糖)胜过亲本SMA135-04，特别是在高上样量的情况下(12mg/g纤维素)。

实施例29：构建里氏木霉菌株SMai26-30

使用共转化以将质粒pCW085(WO 2006/074435)，pSaMe-FH与pCW087(实施例23)导入里氏木霉SMai-M104。质粒pCW085为供土生梭孢壳NRRL8126纤维二糖水解酶(CEL6A)的表达载体。通过PEG介导转化将所有三个质粒导入里氏木霉SMai-M104(Penttila等，1987，见上)。每个质粒均含有大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因以使转化体能够在潮霉素B上生长。

将里氏木霉SMai-M104在27℃与90rpm在补充以2％(w/v)葡萄糖与10mM尿苷的25ml YP培养基中培养17小时。菌丝体通过使用Vacuum Driven Disposable Filtration System过滤来收集，并用去离子水与1.2M山梨醇各洗涤两次。原生质体通过将经洗涤的菌丝体悬浮在含15mg/ml

与0.36单位/ml的壳多糖酶的20ml 1.2M山梨醇中并在34℃下以90rpm的轻微振荡进行温育来生成。原生质体通过在400xg下离心7分钟来收集并用冷的1.2M山梨醇洗涤两次。所述原生质体用血细胞计数器来计数，并在STC中重悬至终浓度为每ml 1X10⁸个原生质体。多余的原生质体在-80℃下储藏于Cryo 1℃Freezing Container中。

将质粒pCW085，pSaMe-FH与pCW087各大约10μg用Pme I消化，并添加至100μl的原生质体溶液中并轻轻混合，继以添加260μl PEG缓冲液，混匀并在室温下温育30分钟。随即添加STC(3ml)并混合并将转化溶液涂布于含1M蔗糖与10mM尿苷的PDA平板上。该平板在28℃下培养16小时，并随即添加含潮霉素B(终浓度30μg/ml)的琼脂糖覆盖层，并继续温育4-6日。将八十个转化体在PDA板上传代培养，并使其于28℃下生长。

将里氏木霉转化体在含25ml纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板摇瓶中在pH6.0培养，其中所述培养基用所述转化体的孢子进行接种，并在28℃与200rpm条件下温育5日。里氏木霉SMai-M140作为对照运行。培养液样品在第5日移出。将每种培养液中的1ml在微离心机中以15700xg离心5分钟并将上清转移至新试管。

SDS-PAGE使用

Tris-HCl(5％分离型)凝胶用

系统进行。将第5日上清(见上)中的5μl悬浮于2X浓缩的Laemmli样品缓冲液中，并在5％β-巯基乙醇的存在下煮沸3分钟。将上清样品上样于聚丙烯酰胺凝胶并以1X Tris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液对其进行电泳。所得凝胶用BIO-

Coomassie Blue Stain进行染色。如见于SDS-PAGE凝胶条带的显影，显示表达橙色嗜热子囊菌GH61A多肽和由特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(CEL45A)与米曲霉β-葡糖苷酶及土生梭孢壳纤维二糖水解酶II融合组成的融合蛋白的转化体随即在如实施例26中描述的PCS水解反应中进行测试以鉴定产生最佳水解培养液的菌株。将一个产生最佳性能培养液的转化体命名为里氏木霉SMai26-30。

由里氏木霉菌株SMai26-30培养液进行的PCS水解如实施例26所描述进行，但包括下述修饰。PCS的批次与用于实施例26中的不同，但是在相似条件下制备。在该实验方案中，PCS的水解(在PCS中，大约11.3％，以及在50mM柠檬酸钠pH5.0缓冲水溶液中6.7％纤维素)使用不同蛋白质上样量(表示为每克纤维素的蛋白质mg数)的所述里氏木霉菌株SMai26-30发酵培养液来进行。在水解过程中，在48，120与168小时处取得等分试样。在上述50g烧瓶分析中PCS水解反应的结果如表2所示。

表2：在48，120与168小时处转化为糖的百分比转化率

将里氏木霉SMai26-30进行孢子划线接种通过在板上两轮的生长对以保证其为克隆菌株，并将多个小瓶在将生产扩大至生产规模的发酵罐前进行冻结。所得蛋白质培养液自真菌细胞群回收，对其进行过滤，浓缩与配制。所得纤维素分解酶制备物命名为纤维素分解酶组合物#2。

实施例30：不同盐对PCS水解的作用

在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory(NREL)，Boulder，CO，USA)用稀硫酸预处理玉米秸秆。用以下条件进行预处理：1.4wt％硫酸，195℃下4.5分钟。根据用过量纤维素酶的极限消化，预处理的玉米秸秆(PCS)中的水不溶固体包含59.5％纤维素。使用之前，用大体积的去离子水洗涤PCS直至可溶的酸与糖被移除。水洗后PCS的干重为19.16％。

不同盐(FeSO₄，FeCl₂，NaCl，Na₂SO₄，MnSO₄，MnCl₂)的作用在纤维素分解酶组合物#2导致的PCS水解中确定。PCS水解以一式两份在50mM乙酸钠pH5中含1ml 43.4g/l PCS(干重量)、10mM盐的加盖管(“小规模”(“mini-scale”))中进行。纤维素分解酶组合物#2以0.25g每升添加。未添加所述盐的反应充当对照。将加盖试管在50℃下在

4080培养箱振荡器(New Brunswick Scientific Co.，Inc.，Edison，NJ，USA)中以150rpm进行培育。

经时取样的悬浮液的等分试样通过使用0.45μmHV膜(Millipore，Billerica，MA，USA)在2000rpm下用

RT7离心机(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)离心15分钟进行过滤。当不即刻使用时，将经过滤的糖等分试样于-20℃冷冻。稀释于0.005M H₂SO₄中的样品的糖浓度在自4.6x250mm

HPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)通过0.005M H₂SO₄以0.4ml/分钟的流速在65℃下洗脱后，用通过整合使用折光率检测的葡萄糖与纤维二糖(

1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)来量化测定，所述折光率经葡萄糖与纤维二糖的标准品校准。所得当量用以计算每个反应的百分比纤维素转化。

纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖(％转化)的程度使用下述方程计算：

％转化＝(葡萄糖+纤维二糖x1.053)(mg/ml)x100x162/纤维素(mg/ml)x180)＝(葡萄糖+纤维二糖x1.053)(mg/ml)x100/(纤维素(mg/ml)x1.111)

在此方程中因子1.111反映了将纤维素转化为葡萄糖过程中的重量增加，而因子1.053反映了将纤维二糖转化为葡萄糖过程中的重量增加。PCS中的纤维素通过对PCS进行极限消化以释放葡萄糖与纤维二糖来确定。

图16所示的结果说明仅FeSO₄与FeCl₂造成对水解的显著抑制。因为其它测试的硫酸盐与氯化物是无害的(benign)，该抑制作用归结于Fe(II)。

实施例31：亚铁离子对PCS水解的作用

用纤维素分解酶组合物#1与纤维素分解酶组合物#2两者重复实施例30。可溶性还原糖通过HPLC如实施例30所述测定。将未添加FeSO₄的反应充当对照。

示于图17A与17B的结果说明FeSO₄显著抑制纤维素分解酶组合物#1与纤维素分解酶组合物#2两者对PCS的水解。

实施例32：金属阳离子对酶分解纤维素的差异抑制

将具有不同离子半径的不同(生物学上常见的)二价金属阳离子在含1ml50mM乙酸钠pH5中25g/l的

悬浮液的2.8ml深孔微量滴定板(VWRInternational，West Chester，PA，USA)(“微板规模”)中在50℃下进行测试。对每个水解过程，以每升0.25g添加纤维素分解酶组合物#1。将所述微板用ALPS 300^TM密封机(ABgene，Rochester，NY，USA)在160℃下封闭2秒。将经封闭的微板在

4080培养箱振荡器中以150rpm于50℃下培育。可溶性还原糖通过HPLC如实施例30所描述进行测定。对水解，在10mM下，MgCl₂与CaCl₂略显增强作用，而CoSO₄，MnSO₄，NiCl₂与ZnSO₄显示略微或中等的抑制作用(表3)。与之相对，FeSO₄，FeCl₂与CuSO₄导致丧失大约70％或更多的起始水解速率以及4日后的水解程度(表3)。MnSO₄亦于0.1到10mM的范围内受测试，且未观察到其对水解的作用，虽然在相同范围内的FeSO₄导致了浓度依赖性的抑制。

表3受测试金属阳离子的特性与作用

¹这些金属阳离子化合物的反荷离子，SO₄ ^2-与Cl^-在水解条件下是惰性的。²晶体中的离子半径，对于6配体的配位作用(Lide，1993，CRC Handbook of Chemistry and Physics，73rd ed.，CRC Press，Boca Raton，FL)。³针对NHE的单电子氧化还原电势。所列出的金属阳离子作为氧化剂(Fe(II)除外，其被氧化为Fe(III))使用。对于Mn(II)与Co(II)，无法获知其单电子E^o，因其还原直接得到Mn(O)与Co(O)，是故仅给出其双电子E^o(示于括号中)。对于Ni(II)与Zn(II)的E^o：M.V.SMIRNOV and A.M.Potapov，Ekctmchimica Acta 39：143-149(1994)；M.Domae等，Radiation Physics and Chemistry 56：315-322(1999)。⁴纤维素分解酶组合物#1对

的“微板规模”的水解。

由于其对O₂氧化的易感性，起初加入水解的Fe(II)不断转化为Fe(III)，如所述水解悬浮液的棕色外观所示。为研究Fe(III)，将FeCl₃添加至一系列纤维素分解酶组合物#1对

的“微板规模”水解反应(如上所述)。在10mM，FeCl₃造成了初始水解速率与4日后水解程度两者约90％的丧失(表3)。

除Fe(III)外，亦如上所述在用

的“微板规模”水解反应中测试了两种其它的三价氧化性金属阳离子Cr(III)与Ru(III)。在10mM，CrCl₃与RuCl₃分别对纤维素分解酶组合物#1施加中等和显著的抑制作用。

在如上所述，只不过使用在每升50mM乙酸钠pH5中2g的PASC与0.01g纤维素分解酶组合物#1进行的另一系列的“微板规模”水解反应中，10mM FeCl₃导致起始水解速率与4日后水解程度两者大约80％的丧失，较之FeCl₂导致的大约30％的丧失。因此，Fe(III)较之Fe(II)施加更大的抑制作用。

实施例33：铁-螯合剂络合物对纤维素酶水解的差异抑制

对不同大小或氧化还原特性的铁-螯合剂络合物测试了其抑制纤维素酶水解的能力。在使用如实施例32中所描述相同的过程的一系列“微板规模”水解反应中，评估了10mM Fe(2，2’-联吡啶基)₃Cl₃，FeCl₃，FeCl₂，Fe(2，2’-联吡啶基)₃Cl₂，FeNa(EDTA)，K₄Fe(CN)₆，K₃Fe(CN)₆或柠檬酸铁在纤维素分解酶组合物#1对

的水解中的抑制作用。结果显示所述铁络合物施加了完全，中等，略微的抑制作用或无抑制作用(表4)。具有更高氧化还原电势(E^o)的铁络合物较之具有低E^o的铁络合物导致了对水解的更大抑制(图18)。

表4.铁-螯合剂络合物的氧化电势与抑制作用

¹单电子氧化电势(Lide，1993，CRC Handbook of Chemistry and Physics，73rd ed.，CRC Press，Boca Raton，FL)。²Florence，1984，J.Inorg.Biochem.22：221-230，Dhungana等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100：3659-3664。未标明E^o的铁-螯合剂络合物为其相应的氧化络合物(给出E^o)对应的还原形式(reduced counterpart)。³纤维素分解酶组合物#1对

的“微板规模”水解

实施例34：亚铁离子抑制作用的浓度依赖性

亚铁离子的有效抑制浓度范围在纤维素分解酶组合物#1对

的水解中确定。

在根据描述于实施例30的过程进行的一个系列的“小规模”水解反应中，在纤维素分解酶组合物#1对

的水解中评估1mM到10mM FeSO₄的作用。在根据描述于实施例32的过程进行的一个系列的“微板规模”水解反应中，在纤维素分解酶组合物#1对PASC的水解中评估1mM到10mMFeSO₄的作用，但是使用每升50mM乙酸钠pH5中2g的PASC与0.05g纤维素分解酶组合物#1。

示于图19A与19C的结果说明亚铁离子在自1mM到10mM FeSO₄的浓度范围上具有增加的抑制作用。Dixon曲线(起始速率的倒数相对于抑制剂浓度)指明FeSO₄的K_i(x-轴截距)对

大约为1.3mM(图19B)，而对PASC为大约14mM(图19D)。

亚铁离子的有效抑制浓度范围亦根据实施例30所描述的过程针对由纤维素分解酶组合物#2进行的PCS水解来确定。在0.1与1mM，FeSO₄并不显著影响纤维素酶，这与用10mM Fe(II)观察到的大约70％的活性丧失相反(图17B)。

将上述研究扩展至某个范围的Fe(II)与纤维素浓度。在一系列的根据实施例32所描述的过程，但是使用每升50mM乙酸钠pH5的0.1到10mM的FeSO₄，0.6到4g的PASC以及0.01g的纤维素分解酶组合物#1而进行的“微板规模”水解反应中，观察到的“双倒数曲线”(1/(起始速率)相对于1/[PASC]作为[FeSO₄]的函数)指明混合类型的抑制作用，其复杂性使得不可能从中得出K_i。

在另一系列的根据实施例32所描述的过程，但是使用每升50mM乙酸钠pH5中0.5到4mM的FeSO₄和0.6到4g的

进行的“微板规模”水解反应中，所得的“双倒数曲线”指明混合类型的抑制作用，其复杂性使得不可能从中得出K_i。表5显示了自起始速率相对于FeSO₄浓度的曲线得到的I₅₀(导致丧失50％水解速率的抑制剂浓度)。

表5.Fe(II)对酶促纤维素分解的抑制参数I₅₀(均值±SD，以mM表示)

酶：纤维素分解酶组合物#1。ND：未确定。¹对纤维二糖水解。

亦在一系列的根据实施例32所描述的过程使用0.2到2mM抑制剂进行的“微板规模”水解反应中研究了其它所选金属阳离子与络合物抑制作用的浓度依赖性。如表6所示，氧化性Fe(III)，Ru(III)与Cu(II)物种具有远较Fe(II)为低的I₅₀。对FeNaEDTA，醌，FeNa₂EDTA与CrCl₃，分别根据有限的数据预计出大约10，大约5，＜10与＞10mM的I₅₀。

表6.所选抑制剂对于纤维素分解酶组合物#1对

水解的I₅₀(以mM表示)

实施例35：亚铁离子对个别纤维素分解酶的抑制作用

Fe(II)对里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I以及里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II的抑制作用通过一系列的根据实施例32所描述的过程而进行的“微板规模”水解来测定，但是使用每升50mM乙酸钠pH5中0，3，7，10，或15mM的FeSO₄与0.6，1，2或4g的PASC以及40mg的酶以及长达4小时的反应时间。Fe(II)对米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的抑制作用相似地测定，但是用纤维二糖替代PASC。起始速率相对于Fe(II)浓度的曲线表现为“混合”类型，其复杂性使得无法从中得到K_i。上面的表5显示了所得的I₅₀。

使用PASC作为底物确定了亚铁离子对里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I，里氏木霉Cel6A纤维二糖水解酶II，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I与里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II的抑制作用。

根据实施例30所描述的过程进行了一系列的重复的“小规模”水解反应，但是使用每升50mM乙酸钠pH5中10mM FeSO₄与2g的PASC(干重)，以及40mg的酶。

示于图20A，20B，20C以及20D的结果说明FeSO₄显著抑制了里氏木霉的酶。仅有FeSO₄时未观察到PASC的水解。

FeSO₄对米曲霉Cel3A β-葡糖苷酶的作用亦通过一系列的根据实施例30所描述的过程进行的“小规模”水解反应来评估，但是在存在或不存在10mMFeSO₄的情况下使用每升50mM乙酸钠pH5中2g的纤维二糖与1mg的米曲霉Cel3A β-葡糖苷酶。

示于图21的结果说明FeSO₄略微抑制米曲霉Cel3A β-葡糖苷酶。

实施例36：过氧化氢与铁离子螯合剂对亚铁离子抑制的减少

对铁离子螯合剂去铁草酰胺与过氧化氢就其减少亚铁离子对由纤维素分解酶组合物#2进行的PCS水解的抑制作用的能力进行评估。

水解在根据实施例32所描述的步骤的一系列重复实验的“微板规模”水解反应中进行，但在存在或不存在2.5mM FeSO₄的情况下使用每升50mM乙酸钠pH 5中43g的PCS与0.25g的纤维素分解酶组合物#2。然而，在添加纤维素分解酶组合物#2之前，用10mM H₂O₂处理PCS与FeSO₄的混合物30分钟。在一些情况下，亦添加10mM去铁草酰胺。未添加FeSO₄或H₂O₂的反应充当对照。

示于图22A与22B的结果说明用H₂O₂预处理FeSO₄减少了亚铁离子对纤维素分解酶组合物#2的抑制作用。去铁草酰胺，一种Fe³⁺强螯合剂的存在减弱了几乎所有的Fe(II)抑制作用。

在Fe(II)不存在的情况下，有或没有去铁草酰胺，H₂O₂仅在测试的水平轻微的影响水解(图22B)。在1与10mM，柠檬酸铁(Fe³⁺)并不影响由纤维素分解酶组合物#2进行的PCS水解。在10mM，单独的去铁草酰胺(一种铁载体)轻微增强(大约2％的水解程度增加)由纤维素分解酶组合物#2进行的PCS水解。

实施例37：亚铁离子螯合剂对亚铁离子导致的纤维素酶抑制的作用

对两种亚铁离子螯合剂，1，10-菲咯啉与2，2’-联吡啶就其对FeSO₄对由纤维素分解酶组合物#2进行的PCS水解的抑制作用的作用进行了评估。

水解在一系列根据实施例30所描述的步骤的重复“小规模”水解反应中进行。

示于图23A，23B，23C与23D的结果说明所述螯合剂，即1，10-菲咯啉与2，2’-联吡啶，在FeSO₄不存在的情况下显示了对纤维素分解酶组合物#1显著的抑制作用。发现1，7-菲咯啉，其同1，10-菲咯啉具有相同的组成与平面结构，但缺乏亚铁离子螯合性质，基本上在抑制纤维素分解酶组合物#1方面是无害的(图24B与24D)。然而，在1，10-与1，7-菲咯啉两者均存在的情况下，水解产物中的纤维二糖水平约为所述化合物不存在时的两倍。这种1，10-菲咯啉与2，2’-联吡啶的抑制作用使其用于减少Fe(II)对纤维素酶的抑制作用变得复杂。

在另一个实验中，对2，2’-联吡啶就其对实施例30所描述的“小规模”水解的作用进行了评估，但在3mM 2，2’-联吡啶存在或不存在的情况下使用了每升50mM乙酸钠pH5中23g的

与0.25g的纤维素分解酶组合物#1。未观察到2，2’-联吡啶显著的抑制作用。

实施例38：对纤维素酶与纤维素的铁离子抑制作用的差异靶向

为测试Fe(II)是否影响纤维素或纤维素酶，将10mM FeCl₂与每升50mM乙酸钠pH 5中25g的

或0.25g的纤维素分解酶组合物#1预培育三日。洗涤“经Fe预处理的”

并用BioSpin 6脱盐柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)凝胶过滤纤维素分解酶组合物#1以移除残余的铁离子。用新鲜的纤维素分解酶组合物#1或经“无FeCl₂”预培育与凝胶过滤的纤维素分解酶组合物#1水解经Fe预处理的

施用经Fe预处理的纤维素分解酶组合物#1以水解新鲜

或经“无FeCl₂”预培育与洗涤的与在有或没有10mM FeCl₂的情况下用新鲜的纤维素分解酶组合物#1(0.16g/L)水解新鲜的

(2g/L)相比较。所有的水解使用描述于实施例32中的“微板规模”水解反应步骤进行，但如上所述改变纤维素或纤维素酶。用或纤维素分解酶组合物#1预处理FeCl₂分别导致水解初始速率与程度大约10或20％的损失。新鲜FeCl₂导致新鲜纤维素分解酶组合物#1对新鲜

的水解的初始速率与程度二者大约50％的损失。用缓冲液预培育纤维素分解酶组合物#1或对水解未产生作用。用FeSO₄替换FeCl₂导致相似的结果。

为测试Fe(III)是否影响纤维素或纤维素酶，将10mM FeCl₃用每升50mM乙酸钠pH5中25g的

或0.25g的纤维素分解酶组合物#1预培育三日。所有的水解使用根据描述于实施例32中的步骤的“微板规模”水解反应进行，但如上所述改变纤维素或纤维素酶。与

或纤维素分解酶组合物#1一起预培育FeCl₃分别导致水解初始速率与程度大约80或20％的损失。新鲜FeCl₃导致由新鲜纤维素分解酶组合物#1对新鲜

的水解在水解初始速率和程度二者上大约90％的损失。

亦对PASC的水解进行了所述“预培育”研究。所述实验类似于上述的那些，但是2g PASC替代并且使用每升50mM乙酸钠pH50.01g的纤维素分解酶组合物#1，以及三日的预培育。所有的水解使用所述“微板规模”水解反应根据描述于实施例32的步骤进行，但如上所述改变纤维素或纤维素酶。与PASC一起预培育FeCl₂导致水解初始速率大约60％的损失，而未导致水解程度损失。与纤维素分解酶组合物#1一起预培育FeCl₂导致水解初始速率大约70％的损失，而未导致水解程度损失。新鲜FeCl₂导致了纤维素分解酶组合物#1(新鲜的或经缓冲液预培育的)对PASC的水解的初始速率大约30％的损失，而未导致水解程度损失。用FeSO₄替换FeCl₂导致了类似的结果。与PASC一起预培育FeCl₃分别导致水解初始速率与程度大约50％与10％损失。与纤维素分解酶组合物#1一起预培育FeCl₃导致水解初始速率大约50％的损失，而未导致水解程度损失。新鲜FeCl₃分别导致纤维素分解酶组合物#1(新鲜的或经缓冲液预培育的)对PASC的水解的初始速率与程度大约70％与30％损失。

为测试是否在PCS中有任何显著量的(易接近的)Fe(II)存在，以及是否用螯合剂将其剥除(stripping)会改善PCS水解，将经洗涤的PCS(43g每升)用10mM的2，2’-联吡啶，1，10-菲咯啉或1，7-菲咯啉“剥除”。在预培育过夜后，将所述PCS全面洗涤以移除所述螯合剂。水解在一系列重复“小规模”水解反应中根据描述于实施例30进行的步骤进行。所得结果显示用2，2’-联吡啶剥除PCS导致增强的水解(水解程度大约4％的增加)，其可归结于螯合剂在经洗涤的NREL PCS中螯合Fe(II)的作用。

本文中所描述并要求保护的发明的范围不应受到本文中公开的具体方面的限制，因为公开这些方面是为了举例说明本发明的一些方面。任何等同的方面都应落入本发明的范围。事实上，除了本文中显示和描述的那些之外，本领域技术人员根据前面的说明书可以容易地想到本发明的各种修改。这些修改也应落入本发明的范围。在冲突的情况下，应以包括定义在内的本公开内容为准。

本文引用了多种参考文献，它们以其整体纳入本文参考。

序列表

<110>诺维信股份有限公司(Novozymes，Inc.)

Xu，Feng

<120>减少氧化还原活性金属离子对纤维素材料酶水解抑制作用的方法

<130>11260.204-WO

<150>60/984,660

<151>2007-11-01

<160>112

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>923

<212>DNA

<213>特异腐质霉(Humicola insolens)

<400>1

atgcgttcct cccccctcct ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt 60

gccgctgatg gcaggtccac ccgctactgg gactgctgca agccttcgtg cggctgggcc 120

aagaaggctc ccgtgaacca gcctgtcttt tcctgcaacg ccaacttcca gcgtatcacg 180

gacttcgacg ccaagtccgg ctgcgagccg ggcggtgtcg cctactcgtg cgccgaccag 240

accccatggg ctgtgaacga cgacttcgcg ctcggttttg ctgccacctc tattgccggc 300

agcaatgagg cgggctggtg ctgcgcctgc tacgagctca ccttcacatc cggtcctgtt 360

gctggcaaga agatggtcgt ccagtccacc agcactggcg gtgatcttgg cagcaaccac 420

ttcgatctca acatccccgg cggcggcgtc ggcatcttcg acggatgcac tccccagttc 480

ggcggtctgc ccggccagcg ctacggcggc atctcgtccc gcaacgagtg cgatcggttc 540

cccgacgccc tcaagcccgg ctgctactgg cgcttcgact ggttcaagaa cgccgacaat 600

ccgagcttca gcttccgtca ggtccagtgc ccagccgagc tcgtcgctcg caccggatgc 660

cgccgcaacg acgacggcaa cttccctgcc gtccagatcc cctccagcag caccagctct 720

ccggtcaacc agcctaccag caccagcacc acgtccacct ccaccacctc gagcccgcca 780

gtccagccta cgactcccag cggctgcact gctgagaggt gggctcagtg cggcggcaat 840

ggctggagcg gctgcaccac ctgcgtcgct ggcagcactt gcacgaagat taatgactgg 900

taccatcagt gcctgtagaa ttc 923

<210>2

<211>305

<212>PRT

<213>特异腐质霉

<400>2

Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro

1 5 10 15

Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

20 25 30

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro

35 40 45

Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala

50 55 60

Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln

65 70 75 80

Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr

85 90 95

Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu

100 105 110

Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln

115 120 125

Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn

130 135 140

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe

145 150 155 160

Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu

165 170 175

Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe

180 185 190

Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val

195 200 205

Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp

210 215 220

Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser

225 230 235 240

Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr

245 250 255

Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu

260 265 270

Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys

275 280 285

Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys

290 295 300

Leu

305

<210>3

<211>1188

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

<400>3

cgacttgaaa cgccccaaat gaagtcctcc atcctcgcca gcgtcttcgc cacgggcgcc 60

gtggctcaaa gtggtccgtg gcagcaatgt ggtggcatcg gatggcaagg atcgaccgac 120

tgtgtgtcgg gctaccactg cgtctaccag aacgattggt acagccagtg cgtgcctggc 180

gcggcgtcga caacgctgca gacatcgacc acgtccaggc ccaccgccac cagcaccgcc 240

cctccgtcgt ccaccacctc gcctagcaag ggcaagctga agtggctcgg cagcaacgag 300

tcgggcgccg agttcgggga gggcaattac cccggcctct ggggcaagca cttcatcttc 360

ccgtcgactt cggcgattca gacgctcatc aatgatggat acaacatctt ccggatcgac 420

ttctcgatgg agcgtctggt gcccaaccag ttgacgtcgt ccttcgacca gggttacctc 480

cgcaacctga ccgaggtggt caacttcgtg acgaacgcgg gcaagtacgc cgtcctggac 540

ccgcacaact acggccggta ctacggcaac atcatcacgg acacgaacgc gttccggacc 600

ttctggacca acctggccaa gcagttcgcc tccaactcgc tcgtcatctt cgacaccaac 660

aacgagtaca acacgatgga ccagaccctg gtgctcaacc tcaaccaggc cgccatcgac 720

ggcatccggg ccgccggcgc gacctcgcag tacatcttcg tcgagggcaa cgcgtggagc 780

ggggcctgga gctggaacac gaccaacacc aacatggccg ccctgacgga cccgcagaac 840

aagatcgtgt acgagatgca ccagtacctc gactcggaca gctcgggcac ccacgccgag 900

tgcgtcagca gcaccatcgg cgcccagcgc gtcgtcggag ccacccagtg gctccgcgcc 960

aacggcaagc tcggcgtcct cggcgagttc gccggcggcg ccaacgccgt ctgccagcag 1020

gccgtcaccg gcctcctcga ccacctccag gacaacagcg acgtctggct gggtgccctc 1080

tggtgggccg ccggtccctg gtggggcgac tacatgtact cgttcgagcc tccttcgggc 1140

accggctatg tcaactacaa ctcgatcttg aagaagtact tgccgtaa 1188

<210>4

<211>389

<212>PRT

<213>嗜热毁丝霉

<400>4

Met Lys Ser Ser Ile Leu Ala Ser Val Phe Ala Thr Gly Ala Val Ala

1 5 10 15

Gln Ser Gly Pro Trp Gln Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Gln Gly Ser

20 25 30

Thr Asp Cys Val Ser Gly Tyr His Cys Val Tyr Gln Asn Asp Trp Tyr

35 40 45

Ser Gln Cys Val Pro Gly Ala Ala Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ser Thr

50 55 60

Thr Ser Arg Pro Thr Ala Thr Ser Thr Ala Pro Pro Ser Ser Thr Thr

65 70 75 80

Ser Pro Ser Lys Gly Lys Leu Lys Trp Leu Gly Ser Asn Glu Ser Gly

85 90 95

Ala Glu Phe Gly Glu Gly Asn Tyr Pro Gly Leu Trp Gly Lys His Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Ser Thr Ser Ala Ile Gln Thr Leu Ile Asn Asp Gly Tyr

115 120 125

Asn Ile Phe Arg Ile Asp Phe Ser Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Ser Phe Asp Gln Gly Tyr Leu Arg Asn Leu Thr Glu Val

145 150 155 160

Val Asn Phe Val Thr Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Val Leu Asp Pro His

165 170 175

Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile Thr Asp Thr Asn Ala Phe

180 185 190

Arg Thr Phe Trp Thr Asn Leu Ala Lys Gln Phe Ala Ser Asn Ser Leu

195 200 205

Val Ile Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Asn Thr Met Asp Gln Thr Leu

210 215 220

Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ala Ala Gly

225 230 235 240

Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe Val Glu Gly Asn Ala Trp Ser Gly Ala

245 250 255

Trp Ser Trp Asn Thr Thr Asn Thr Asn Met Ala Ala Leu Thr Asp Pro

260 265 270

Gln Asn Lys Ile Val Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Ser

275 280 285

Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Ala Gln Arg

290 295 300

Val Val Gly Ala Thr Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Leu Gly Val

305 310 315 320

Leu Gly Glu Phe Ala Gly Gly Ala Asn Ala Val Cys Gln Gln Ala Val

325 330 335

Thr Gly Leu Leu Asp His Leu Gln Asp Asn Ser Asp Val Trp Leu Gly

340 345 350

Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Tyr Ser

355 360 365

Phe Glu Pro Pro Ser Gly Thr Gly Tyr Val Asn Tyr Asn Ser Ile Leu

370 375 380

Lys Lys Tyr Leu Pro

385

<210>5

<211>1232

<212>DNA

<213>担子菌纲CBS 495.95(Basidiomycete CBS 495.95)

<400>5

ggatccactt agtaacggcc gccagtgtgc tggaaagcat gaagtctctc ttcctgtcac 60

ttgtagcgac cgtcgcgctc agctcgccag tattctctgt cgcagtctgg gggcaatgcg 120

gcggcattgg cttcagcgga agcaccgtct gtgatgcagg cgccggctgt gtgaagctca 180

acgactatta ctctcaatgc caacccggcg ctcccactgc tacatccgcg gcgccaagta 240

gcaacgcacc gtccggcact tcgacggcct cggccccctc ctccagcctt tgctctggca 300

gccgcacgcc gttccagttc ttcggtgtca acgaatccgg cgcggagttc ggcaacctga 360

acatccccgg tgttctgggc accgactaca cctggccgtc gccatccagc attgacttct 420

tcatgggcaa gggaatgaat accttccgta ttccgttcct catggagcgt cttgtccccc 480

ctgccactgg catcacagga cctctcgacc agacgtactt gggcggcctg cagacgattg 540

tcaactacat caccggcaaa ggcggctttg ctctcattga cccgcacaac tttatgatct 600

acaatggcca gacgatctcc agtaccagcg acttccagaa gttctggcag aacctcgcag 660

gagtgtttaa atcgaacagt cacgtcatct tcgatgttat gaacgagcct cacgatattc 720

ccgcccagac cgtgttccaa ctgaaccaag ccgctgtcaa tggcatccgt gcgagcggtg 780

cgacgtcgca gctcattctg gtcgagggca caagctggac tggagcctgg acctggacga 840

cctctggcaa cagcgatgca ttcggtgcca ttaaggatcc caacaacaac gtcgcgatcc 900

agatgcatca gtacctggat agcgatggct ctggcacttc gcagacctgc gtgtctccca 960

ccatcggtgc cgagcggttg caggctgcga ctcaatggtt gaagcagaac aacctcaagg 1020

gcttcctggg cgagatcggc gccggctcta actccgcttg catcagcgct gtgcagggtg 1080

cgttgtgttc gatgcagcaa tctggtgtgt ggctcggcgc tctctggtgg gctgcgggcc 1140

cgtggtgggg cgactactac cagtccatcg agccgccctc tggcccggcg gtgtccgcga 1200

tcctcccgca ggccctgctg ccgttcgcgt aa 1232

<210>6

<211>397

<212>PRT

<213>担子菌纲CBS 495.95

<400>6

Met Lys Ser Leu Phe Leu Ser Leu Val Ala Thr Val Ala Leu Ser Ser

1 5 10 15

Pro Val Phe Ser Val Ala Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe

20 25 30

Ser Gly Ser Thr Val Cys Asp Ala Gly Ala Gly Cys Val Lys Leu Asn

35 40 45

Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Gln Pro Gly Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala

50 55 60

Ala Pro Ser Ser Asn Ala Pro Ser Gly Thr Ser Thr Ala Ser Ala Pro

65 70 75 80

Ser Ser Ser Leu Cys Ser Gly Ser Arg Thr Pro Phe Gln Phe Phe Gly

85 90 95

Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn Leu Asn Ile Pro Gly Val

100 105 110

Leu Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Pro Ser Pro Ser Ser Ile Asp Phe Phe

115 120 125

Met Gly Lys Gly Met Asn Thr Phe Arg Ile Pro Phe Leu Met Glu Arg

130 135 140

Leu Val Pro Pro Ala Thr Gly Ile Thr Gly Pro Leu Asp Gln Thr Tyr

145 150 155 160

Leu Gly Gly Leu Gln Thr Ile Val Asn Tyr Ile Thr Gly Lys Gly Gly

165 170 175

Phe Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Phe Met Ile Tyr Asn Gly Gln Thr

180 185 190

Ile Ser Ser Thr Ser Asp Phe Gln Lys Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly

195 200 205

Val Phe Lys Ser Asn Ser His Val Ile Phe Asp Val Met Asn Glu Pro

210 215 220

His Asp Ile Pro Ala Gln Thr Val Phe Gln Leu Asn Gln Ala Ala Val

225 230 235 240

Asn Gly Ile Arg Ala Ser Gly Ala Thr Ser Gln Leu Ile Leu Val Glu

245 250 255

Gly Thr Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ser Gly Asn Ser

260 265 270

Asp Ala Phe Gly Ala Ile Lys Asp Pro Asn Asn Asn Val Ala Ile Gln

275 280 285

Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Gln Thr Cys

290 295 300

Val Ser Pro Thr Ile Gly Ala Glu Arg Leu Gln Ala Ala Thr Gln Trp

305 310 315 320

Leu Lys Gln Asn Asn Leu Lys Gly Phe Leu Gly Glu Ile Gly Ala Gly

325 330 335

Ser Asn Ser Ala Cys Ile Ser Ala Val Gln Gly Ala Leu Cys Ser Met

340 345 350

Gln Gln Ser Gly Val Trp Leu Gly Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro

355 360 365

Trp Trp Gly Asp Tyr Tyr Gln Ser Ile Glu Pro Pro Ser Gly Pro Ala

370 375 380

Val Ser Ala Ile Leu Pro Gln Ala Leu Leu Pro Phe Ala

385 390 395

<210>7

<211>1303

<212>DNA

<213>担子菌纲CBS 494.95

<400>7

ggaaagcgtc agtatggtga aatttgcgct tgtggcaact gtcggcgcaa tcttgagcgc 60

ttctgcggcc aatgcggctt ctatctacca gcaatgtgga ggcattggat ggtctgggtc 120

cactgtttgc gacgccggtc tcgcttgcgt tatcctcaat gcgtactact ttcagtgctt 180

gacgcccgcc gcgggccaga caacgacggg ctcgggcgca ccggcgtcaa catcaacctc 240

tcactcaacg gtcactacgg ggagctcaca ctcaacaacc gggacgacgg cgacgaaaac 300

aactaccact ccgtcgacca ccacgaccct acccgccatc tctgtgtctg gtcgcgtctg 360

ctctggctcc aggacgaagt tcaagttctt cggtgtgaat gaaagcggcg ccgaattcgg 420

gaacactgct tggccagggc agctcgggaa agactataca tggccttcgc ctagcagcgt 480

ggactacttc atgggggctg gattcaatac attccgtatc accttcttga tggagcgtat 540

gagccctccg gctaccggac tcactggccc attcaaccag acgtacctgt cgggcctcac 600

caccattgtc gactacatca cgaacaaagg aggatacgct cttattgacc cccacaactt 660

catgcgttac aacaacggca taatcagcag cacatctgac ttcgcgactt ggtggagcaa 720

tttggccact gtattcaaat ccacgaagaa cgccatcttc gacatccaga acgagccgta 780

cggaatcgat gcgcagaccg tatacgaact gaatcaagct gccatcaatt cgatccgcgc 840

cgctggcgct acgtcacagt tgattctggt tgaaggaacg tcatacactg gagcttggac 900

gtgggtctcg tccggaaacg gagctgcttt cgcggccgtt acggatcctt acaacaacac 960

ggcaattgaa atgcaccaat acctcgacag cgacggttct gggacaaacg aagactgtgt 1020

ctcctccacc attgggtcgc aacgtctcca agctgccact gcgtggctgc aacaaacagg 1080

actcaaggga ttcctcggag agacgggtgc tgggtcgaat tcccagtgca tcgacgccgt 1140

gttcgatgaa ctttgctata tgcaacagca aggcggctcc tggatcggtg cactctggtg 1200

ggctgcgggt ccctggtggg gcacgtacat ttactcgatt gaacctccga gcggtgccgc 1260

tatcccagaa gtccttcctc agggtctcgc tccattcctc tag 1303

<210>8

<211>429

<212>PRT

<213>担子菌纲CBS 494.95

<400>8

Met Val Lys Phe Ala Leu Val Ala Thr Val Gly Ala Ile Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ala Asn Ala Ala Ser Ile Tyr Gln Gln Cys Gly Gly Ile Gly

20 25 30

Trp Ser Gly Ser Thr Val Cys Asp Ala Gly Leu Ala Cys Val Ile Leu

35 40 45

Asn Ala Tyr Tyr Phe Gln Cys Leu Thr Pro Ala Ala Gly Gln Thr Thr

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Ala Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser His Ser Thr Val

65 70 75 80

Thr Thr Gly Ser Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Thr Ala Thr Lys Thr

85 90 95

Thr Thr Thr Pro Ser Thr Thr Thr Thr Leu Pro Ala Ile Ser Val Ser

100 105 110

Gly Arg Val Cys Ser Gly Ser Arg Thr Lys Phe Lys Phe Phe Gly Val

115 120 125

Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn Thr Ala Trp Pro Gly Gln Leu

130 135 140

Gly Lys Asp Tyr Thr Trp Pro Ser Pro Ser Ser Val Asp Tyr Phe Met

145 150 155 160

Gly Ala Gly Phe Asn Thr Phe Arg Ile Thr Phe Leu Met Glu Arg Met

165 170 175

Ser Pro Pro Ala Thr Gly Leu Thr Gly Pro Phe Asn Gln Thr Tyr Leu

180 185 190

Ser Gly Leu Thr Thr Ile Val Asp Tyr Ile Thr Asn Lys Gly Gly Tyr

195 200 205

Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Phe Met Arg Tyr Asn Asn Gly Ile Ile

210 215 220

Ser Ser Thr Ser Asp Phe Ala Thr Trp Trp Ser Asn Leu Ala Thr Val

225 230 235 240

Phe Lys Ser Thr Lys Asn Ala Ile Phe Asp Ile Gln Asn Glu Pro Tyr

245 250 255

Gly Ile Asp Ala Gln Thr Val Tyr Glu Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asn

260 265 270

Ser Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Leu Ile Leu Val Glu Gly

275 280 285

Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Val Ser Ser Gly Asn Gly Ala

290 295 300

Ala Phe Ala Ala Val Thr Asp Pro Tyr Asn Asn Thr Ala Ile Glu Met

305 310 315 320

His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Asn Glu Asp Cys Val

325 330 335

Ser Ser Thr Ile Gly Ser Gln Arg Leu Gln Ala Ala Thr Ala Trp Leu

340 345 350

Gln Gln Thr Gly Leu Lys Gly Phe Leu Gly Glu Thr Gly Ala Gly Ser

355 360 365

Asn Ser Gln Cys Ile Asp Ala Val Phe Asp Glu Leu Cys Tyr Met Gln

370 375 380

Gln Gln Gly Gly Ser Trp Ile Gly Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro

385 390 395 400

Trp Trp Gly Thr Tyr Ile Tyr Ser Ile Glu Pro Pro Ser Gly Ala Ala

405 410 415

Ile Pro Glu Val Leu Pro Gln Gly Leu Ala Pro Phe Leu

420 425

<210>9

<211>1580

<212>DNA

<213>土生梭孢壳(Thielavia terrestris)

<400>9

agccccccgt tcaggcacac ttggcatcag atcagcttag cagcgcctgc acagcatgaa 60

gctctcgcag tcggccgcgc tggcggcact caccgcgacg gcgctcgccg ccccctcgcc 120

cacgacgccg caggcgccga ggcaggcttc agccggctgc tcgtctgcgg tcacgctcga 180

cgccagcacc aacgtttgga agaagtacac gctgcacccc aacagctact accgcaagga 240

ggttgaggcc gcggtggcgc agatctcgga cccggacctc gccgccaagg ccaagaaggt 300

ggccgacgtc ggcaccttcc tgtggctcga ctcgatcgag aacatcggca agctggagcc 360

ggcgatccag gacgtgccct gcgagaacat cctgggcctg gtcatctacg acctgccggg 420

ccgcgactgc gcggccaagg cgtccaacgg cgagctcaag gtcggcgaga tcgaccgcta 480

caagaccgag tacatcgaca gtgagtgctg ccccccgggt tcgagaagag cgtgggggaa 540

agggaaaggg ttgactgact gacacggcgc actgcagaga tcgtgtcgat cctcaaggca 600

caccccaaca cggcgttcgc gctggtcatc gagccggact cgctgcccaa cctggtgacc 660

aacagcaact tggacacgtg ctcgagcagc gcgtcgggct accgcgaagg cgtggcttac 720

gccctcaaga acctcaacct gcccaacgtg atcatgtacc tcgacgccgg ccacggcggc 780

tggctcggct gggacgccaa cctgcagccc ggcgcgcagg agctagccaa ggcgtacaag 840

aacgccggct cgcccaagca gctccgcggc ttctcgacca acgtggccgg ctggaactcc 900

tggtgagctt ttttccattc catttcttct tcctcttctc tcttcgctcc cactctgcag 960

ccccccctcc cccaagcacc cactggcgtt ccggcttgct gactcggcct ccctttcccc 1020

gggcaccagg gatcaatcgc ccggcgaatt ctcccaggcg tccgacgcca agtacaacaa 1080

gtgccagaac gagaagatct acgtcagcac cttcggctcc gcgctccagt cggccggcat 1140

gcccaaccac gccatcgtcg acacgggccg caacggcgtc accggcctgc gcaaggagtg 1200

gggtgactgg tgcaacgtca acggtgcagg ttcgttgtct tctttttctc ctcttttgtt 1260

tgcacgtcgt ggtccttttc aagcagccgt gtttggttgg gggagatgga ctccggctga 1320

tgttctgctt cctctctagg cttcggcgtg cgcccgacga gcaacacggg cctcgagctg 1380

gccgacgcgt tcgtgtgggt caagcccggc ggcgagtcgg acggcaccag cgacagctcg 1440

tcgccgcgct acgacagctt ctgcggcaag gacgacgcct tcaagccctc gcccgaggcc 1500

ggcacctgga acgaggccta cttcgagatg ctgctcaaga acgccgtgcc gtcgttctaa 1560

gacggtccag catcatccgg 1580

<210>10

<211>396

<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>10

Met Lys Leu Ser Gln Ser Ala Ala Leu Ala Ala Leu Thr Ala Thr Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ala Pro Ser Pro Thr Thr Pro Gln Ala Pro Arg Gln Ala Ser

20 25 30

Ala Gly Cys Ser Ser Ala Val Thr Leu Asp Ala Ser Thr Asn Val Trp

35 40 45

Lys Lys Tyr Thr Leu His Pro Asn Ser Tyr Tyr Arg Lys Glu Val Glu

50 55 60

Ala Ala Val Ala Gln Ile Ser Asp Pro Asp Leu Ala Ala Lys Ala Lys

65 70 75 80

Lys Val Ala Asp Val Gly Thr Phe Leu Trp Leu Asp Ser Ile Glu Asn

85 90 95

Ile Gly Lys Leu Glu Pro Ala Ile Gln Asp Val Pro Cys Glu Asn Ile

100 105 110

Leu Gly Leu Val Ile Tyr Asp Leu Pro Gly Arg Asp Cys Ala Ala Lys

115 120 125

Ala Ser Asn Gly Glu Leu Lys Val Gly Glu Ile Asp Arg Tyr Lys Thr

130 135 140

Glu Tyr Ile Asp Lys Ile Val Ser Ile Leu Lys Ala His Pro Asn Thr

145 150 155 160

Ala Phe Ala Leu Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Pro Asn Leu Val Thr

165 170 175

Asn Ser Asn Leu Asp Thr Cys Ser Ser Ser Ala Ser Gly Tyr Arg Glu

180 185 190

Gly Val Ala Tyr Ala Leu Lys Asn Leu Asn Leu Pro Asn Val Ile Met

195 200 205

Tyr Leu Asp Ala Gly His Gly Gly Trp Leu Gly Trp Asp Ala Asn Leu

210 215 220

Gln Pro Gly Ala Gln Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Lys Asn Ala Gly Ser

225 230 235 240

Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ser Thr Asn Val Ala Gly Trp Asn Ser

245 250 255

Trp Asp Gln Ser Pro Gly Glu Phe Ser Gln Ala Ser Asp Ala Lys Tyr

260 265 270

Asn Lys Cys Gln Asn Glu Lys Ile Tyr Val Ser Thr Phe Gly Ser Ala

275 280 285

Leu Gln Ser Ala Gly Met Pro Asn His Ala Ile Val Asp Thr Gly Arg

290 295 300

Asn Gly Val Thr Gly Leu Arg Lys Glu Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val

305 310 315 320

Asn Gly Ala Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Ser Asn Thr Gly Leu Glu

325 330 335

Leu Ala Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly

340 345 350

Thr Ser Asp Ser Ser Ser Pro Arg Tyr Asp Ser Phe Cys Gly Lys Asp

355 360 365

Asp Ala Phe Lys Pro Ser Pro Glu Ala Gly Thr Trp Asn Glu Ala Tyr

370 375 380

Phe Glu Met Leu Leu Lys Asn Ala Val Pro Ser Phe

385 390 395

<210>11

<211>1203

<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>11

atgaagtacc tcaacctcct cgcagctctc ctcgccgtcg ctcctctctc cctcgctgca 60

cccagcatcg aggccagaca gtcgaacgtc aacccataca tcggcaagag cccgctcgtt 120

attaggtcgt acgcccaaaa gcttgaggag accgtcagga ccttccagca acgtggcgac 180

cagctcaacg ctgcgaggac acggacggtg cagaacgttg cgactttcgc ctggatctcg 240

gataccaatg gtattggagc cattcgacct ctcatccaag atgctctcgc ccagcaggct 300

cgcactggac agaaggtcat cgtccaaatc gtcgtctaca acctcccaga tcgcgactgc 360

tctgccaacg cctcgactgg agagttcacc gtaggaaacg acggtctcaa ccgatacaag 420

aactttgtca acaccatcgc ccgcgagctc tcgactgctg acgctgacaa gctccacttt 480

gccctcctcc tcgaacccga cgcacttgcc aacctcgtca ccaacgcgaa tgcccccagg 540

tgccgaatcg ccgctcccgc ttacaaggag ggtatcgcct acaccctcgc caccttgtcc 600

aagcccaacg tcgacgtcta catcgacgcc gccaacggtg gctggctcgg ctggaacgac 660

aacctccgcc ccttcgccga actcttcaag gaagtctacg acctcgcccg ccgcatcaac 720

cccaacgcca aggtccgcgg cgtccccgtc aacgtctcca actacaacca gtaccgcgct 780

gaagtccgcg agcccttcac cgagtggaag gacgcctggg acgagagccg ctacgtcaac 840

gtcctcaccc cgcacctcaa cgccgtcggc ttctccgcgc acttcatcgt tgaccaggga 900

cgcggtggca agggcggtat caggacggag tggggccagt ggtgcaacgt taggaacgct 960

gggttcggta tcaggcctac tgcggatcag ggcgtgctcc agaacccgaa tgtggatgcg 1020

attgtgtggg ttaagccggg tggagagtcg gatggcacga gtgatttgaa ctcgaacagg 1080

tatgatccta cgtgcaggag tccggtggcg catgttcccg ctcctgaggc tggccagtgg 1140

ttcaacgagt atgttgttaa cctcgttttg aacgctaacc cccctcttga gcctacctgg 1200

taa 1203

<210>12

<211>400

<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>12

Met Lys Tyr Leu Asn Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Val Ala Pro Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ala Ala Pro Ser Ile Glu Ala Arg Gln Ser Asn Val Asn Pro

20 25 30

Tyr Ile Gly Lys Ser Pro Leu Val Ile Arg Ser Tyr Ala Gln Lys Leu

35 40 45

Glu Glu Thr Val Arg Thr Phe Gln Gln Arg Gly Asp Gln Leu Asn Ala

50 55 60

Ala Arg Thr Arg Thr Val Gln Asn Val Ala Thr Phe Ala Trp Ile Ser

65 70 75 80

Asp Thr Asn Gly Ile Gly Ala Ile Arg Pro Leu Ile Gln Asp Ala Leu

85 90 95

Ala Gln Gln Ala Arg Thr Gly Gln Lys Val Ile Val Gln Ile Val Val

100 105 110

Tyr Asn Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ser Ala Asn Ala Ser Thr Gly Glu

115 120 125

Phe Thr Val Gly Asn Asp Gly Leu Asn Arg Tyr Lys Asn Phe Val Asn

130 135 140

Thr Ile Ala Arg Glu Leu Ser Thr Ala Asp Ala Asp Lys Leu His Phe

145 150 155 160

Ala Leu Leu Leu Glu Pro Asp Ala Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Ala

165 170 175

Asn Ala Pro Arg Cys Arg Ile Ala Ala Pro Ala Tyr Lys Glu Gly Ile

180 185 190

Ala Tyr Thr Leu Ala Thr Leu Ser Lys Pro Asn Val Asp Val Tyr Ile

195 200 205

Asp Ala Ala Asn Gly Gly Trp Leu Gly Trp Asn Asp Asn Leu Arg Pro

210 215 220

Phe Ala Glu Leu Phe Lys Glu Val Tyr Asp Leu Ala Arg Arg Ile Asn

225 230 235 240

Pro Asn Ala Lys Val Arg Gly Val Pro Val Asn Val Ser Asn Tyr Asn

245 250 255

Gln Tyr Arg Ala Glu Val Arg Glu Pro Phe Thr Glu Trp Lys Asp Ala

260 265 270

Trp Asp Glu Ser Arg Tyr Val Asn Val Leu Thr Pro His Leu Asn Ala

275 280 285

Val Gly Phe Ser Ala His Phe Ile Val Asp Gln Gly Arg Gly Gly Lys

290 295 300

Gly Gly Ile Arg Thr Glu Trp Gly Gln Trp Cys Asn Val Arg Asn Ala

305 310 315 320

Gly Phe Gly Ile Arg Pro Thr Ala Asp Gln Gly Val Leu Gln Asn Pro

325 330 335

Asn Val Asp Ala Ile Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly

340 345 350

Thr Ser Asp Leu Asn Ser Asn Arg Tyr Asp Pro Thr Cys Arg Ser Pro

355 360 365

Val Ala His Val Pro Ala Pro Glu Ala Gly Gln Trp Phe Asn Glu Tyr

370 375 380

Val Val Asn Leu Val Leu Asn Ala Asn Pro Pro Leu Glu Pro Thr Trp

385 390 395 400

<210>13

<211>1501

<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>13

gccgttgtca agatgggcca gaagacgctg cacggattcg ccgccacggc tttggccgtt 60

ctcccctttg tgaaggctca gcagcccggc aacttcacgc cggaggtgca cccgcaactg 120

ccaacgtgga agtgcacgac cgccggcggc tgcgttcagc aggacacttc ggtggtgctc 180

gactggaact accgttggat ccacaatgcc gacggcaccg cctcgtgcac gacgtccagc 240

ggggtcgacc acacgctgtg tccagatgag gcgacctgcg cgaagaactg cttcgtggaa 300

ggcgtcaact acacgagcag cggtgtcacc acatccggca gttcgctgac gatgaggcag 360

tatttcaagg ggagcaacgg gcagaccaac agcgtttcgc ctcgtctcta cctgctcggc 420

tcggatggaa actacgtaat gctcaagctg ctcggccagg agctgagctt cgatgtcgat 480

ctctccacgc tcccctgcgg cgagaacggc gcgctgtacc tgtccgagat ggacgcgacc 540

ggtggcagga accagtacaa caccggcggt gccaactacg gctcgggcta ctgtgacgcc 600

cagtgtcccg tgcagacgtg gatgaacggc acgctgaaca ccaacgggca gggctactgc 660

tgcaacgaga tggacatcct cgaggccaac tcccgcgcca acgcgatgac acctcacccc 720

tgcgccaacg gcagctgcga caagagcggg tgcggactca acccctacgc cgagggctac 780

aagagctact acggaccggg cctcacggtt gacacgtcga agcccttcac catcattacc 840

cgcttcatca ccgacgacgg cacgaccagc ggcaccctca accagatcca gcggatctat 900

gtgcagaatg gcaagacggt cgcgtcggct gcgtccggag gcgacatcat cacggcatcc 960

ggctgcacct cggcccaggc gttcggcggg ctggccaaca tgggcgcggc gcttggacgg 1020

ggcatggtgc tgaccttcag catctggaac gacgctgggg gctacatgaa ctggctcgac 1080

agcggcaaca acggcccgtg cagcagcacc gagggcaacc cgtccaacat cctggccaac 1140

tacccggaca cccacgtggt cttctccaac atccgctggg gagacatcgg ctcgacggtc 1200

caggtctcgg gaggcggcaa cggcggctcg accaccacca cgtcgaccac cacgctgagg 1260

acctcgacca cgaccaccac caccgccccg acggccactg ccacgcactg gggacaatgc 1320

ggcggaatcg gggtacgtca accgcctcct gcattctgtt gaggaagtta actaacgtgg 1380

cctacgcagt ggactggacc gaccgtctgc gaatcgccgt acgcatgcaa ggagctgaac 1440

ccctggtact accagtgcct ctaaagtatt gcagtgaagc catactccgt gctcggcatg 1500

g 1501

<210>14

<211>464

<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>14

Met Gly Gln Lys Thr Leu His Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ala Val

1 5 10 15

Leu Pro Phe Val Lys Ala Gln Gln Pro Gly Asn Phe Thr Pro Glu Val

20 25 30

His Pro Gln Leu Pro Thr Trp Lys Cys Thr Thr Ala Gly Gly Cys Val

35 40 45

Gln Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Ile His

50 55 60

Asn Ala Asp Gly Thr Ala Ser Cys Thr Thr Ser Ser Gly Val Asp His

65 70 75 80

Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Ala Lys Asn Cys Phe Val Glu

85 90 95

Gly Val Asn Tyr Thr Ser Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu

100 105 110

Thr Met Arg Gln Tyr Phe Lys Gly Ser Asn Gly Gln Thr Asn Ser Val

115 120 125

Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Val Met Leu

130 135 140

Lys Leu Leu Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Thr Leu

145 150 155 160

Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met Asp Ala Thr

165 170 175

Gly Gly Arg Asn Gln Tyr Asn Thr Gly Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly

180 185 190

Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Met Asn Gly Thr Leu

195 200 205

Asn Thr Asn Gly Gln Gly Tyr Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu

210 215 220

Ala Asn Ser Arg Ala Asn Ala Met Thr Pro His Pro Cys Ala Asn Gly

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Ser Gly Cys Gly Leu Asn Pro Tyr Ala Glu Gly Tyr

245 250 255

Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Pro Phe

260 265 270

Thr Ile Ile Thr Arg Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Thr Ser Gly Thr

275 280 285

Leu Asn Gln Ile Gln Arg Ile Tyr Val Gln Asn Gly Lys Thr Val Ala

290 295 300

Ser Ala Ala Ser Gly Gly Asp Ile Ile Thr Ala Ser Gly Cys Thr Ser

305 310 315 320

Ala Gln Ala Phe Gly Gly Leu Ala Asn Met Gly Ala Ala Leu Gly Arg

325 330 335

Gly Met Val Leu Thr Phe Ser Ile Trp Asn Asp Ala Gly Gly Tyr Met

340 345 350

Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Asn Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly

355 360 365

Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Tyr Pro Asp Thr His Val Val Phe

370 375 380

Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Val Gln Val Ser Gly

385 390 395 400

Gly Gly Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Leu Arg

405 410 415

Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Pro Thr Ala Thr Ala Thr His

420 425 430

Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Val Cys Glu

435 440 445

Ser Pro Tyr Ala Cys Lys Glu Leu Asn Pro Trp Tyr Tyr Gln Cys Leu

450 455 460

<210>15

<211>1368

<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>15

accgatccgc tcgaagatgg cgcccaagtc tacagttctg gccgcctggc tgctctcctc 60

gctggccgcg gcccagcaga tcggcaaagc cgtgcccgag gtccacccca aactgacaac 120

gcagaagtgc actctccgcg gcgggtgcaa gcctgtccgc acctcggtcg tgctcgactc 180

gtccgcgcgc tcgctgcaca aggtcgggga ccccaacacc agctgcagcg tcggcggcga 240

cctgtgctcg gacgcgaagt cgtgcggcaa gaactgcgcg ctcgagggcg tcgactacgc 300

ggcccacggc gtggcgacca agggcgacgc cctcacgctg caccagtggc tcaagggggc 360

cgacggcacc tacaggaccg tctcgccgcg cgtatacctc ctgggcgagg acgggaagaa 420

ctacgaggac ttcaagctgc tcaacgccga gctcagcttc gacgtcgacg tgtcccagct 480

cgtctgcggc atgaacggcg ccctgtactt ctccgagatg gagatggacg gcggccgcag 540

cccgctgaac ccggcgggcg ccacgtacgg cacgggctac tgcgacgcgc agtgccccaa 600

gttggacttt atcaacggcg aggtatttct tctctcttct gtttttcttt tccatcgctt 660

tttctgaccg gaatccgccc tcttagctca acaccaacca cacgtacggg gcgtgctgca 720

acgagatgga catctgggag gccaacgcgc tggcgcaggc gctcacgccg cacccgtgca 780

acgcgacgcg ggtgtacaag tgcgacacgg cggacgagtg cgggcagccg gtgggcgtgt 840

gcgacgaatg ggggtgctcg tacaacccgt ccaacttcgg ggtcaaggac tactacgggc 900

gcaacctgac ggtggacacg aaccgcaagt tcacggtgac gacgcagttc gtgacgtcca 960

acgggcgggc ggacggcgag ctgaccgaga tccggcggct gtacgtgcag gacggcgtgg 1020

tgatccagaa ccacgcggtc acggcgggcg gggcgacgta cgacagcatc acggacggct 1080

tctgcaacgc gacggccacc tggacgcagc agcggggcgg gctcgcgcgc atgggcgagg 1140

ccatcggccg cggcatggtg ctcatcttca gcctgtgggt tgacaacggc ggcttcatga 1200

actggctcga cagcggcaac gccgggccct gcaacgccac cgagggcgac ccggccctga 1260

tcctgcagca gcacccggac gccagcgtca ccttctccaa catccgatgg ggcgagatcg 1320

gcagcacgta caagagcgag tgcagccact agagtagagc ttgtaatt 1368

<210>16

<211>423

<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>16

Met Ala Pro Lys Ser Thr Val Leu Ala Ala Trp Leu Leu Ser Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Gln Gln Ile Gly Lys Ala Val Pro Glu Val His Pro Lys

20 25 30

Leu Thr Thr Gln Lys Cys Thr Leu Arg Gly Gly Cys Lys Pro Val Arg

35 40 45

Thr Ser Val Val Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Leu His Lys Val Gly

50 55 60

Asp Pro Asn Thr Ser Cys Ser Val Gly Gly Asp Leu Cys Ser Asp Ala

65 70 75 80

Lys Ser Cys Gly Lys Asn Cys Ala Leu Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala

85 90 95

His Gly Val Ala Thr Lys Gly Asp Ala Leu Thr Leu His Gln Trp Leu

100 105 110

Lys Gly Ala Asp Gly Thr Tyr Arg Thr Val Ser Pro Arg Val Tyr Leu

115 120 125

Leu Gly Glu Asp Gly Lys Asn Tyr Glu Asp Phe Lys Leu Leu Asn Ala

130 135 140

Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Val Cys Gly Met Asn

145 150 155 160

Gly Ala Leu Tyr Phe Ser Glu Met Glu Met Asp Gly Gly Arg Ser Pro

165 170 175

Leu Asn Pro Ala Gly Ala Thr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln

180 185 190

Cys Pro Lys Leu Asp Phe Ile Asn Gly Glu Leu Asn Thr Asn His Thr

195 200 205

Tyr Gly Ala Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ala Leu

210 215 220

Ala Gln Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Asn Ala Thr Arg Val Tyr Lys

225 230 235 240

Cys Asp Thr Ala Asp Glu Cys Gly Gln Pro Val Gly Val Cys Asp Glu

245 250 255

Trp Gly Cys Ser Tyr Asn Pro Ser Asn Phe Gly Val Lys Asp Tyr Tyr

260 265 270

Gly Arg Asn Leu Thr Val Asp Thr Asn Arg Lys Phe Thr Val Thr Thr

275 280 285

Gln Phe Val Thr Ser Asn Gly Arg Ala Asp Gly Glu Leu Thr Glu Ile

290 295 300

Arg Arg Leu Tyr Val Gln Asp Gly Val Val Ile Gln Asn His Ala Val

305 310 315 320

Thr Ala Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Ser Ile Thr Asp Gly Phe Cys Asn

325 330 335

Ala Thr Ala Thr Trp Thr Gln Gln Arg Gly Gly Leu Ala Arg Met Gly

340 345 350

Glu Ala Ile Gly Arg Gly Met Val Leu Ile Phe Ser Leu Trp Val Asp

355 360 365

Asn Gly Gly Phe Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys

370 375 380

Asn Ala Thr Glu Gly Asp Pro Ala Leu Ile Leu Gln Gln His Pro Asp

385 390 395 400

Ala Ser Val Thr Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Glu Ile Gly Ser Thr

405 410 415

Tyr Lys Ser Glu Cys Ser His

420

<210>17

<211>1011

<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>17

atgaccctac ggctccctgt catcagcctg ctggcctcgc tggcagcagg cgccgtcgtc 60

gtcccacggg cggagtttca cccccctctc ccgacttgga aatgcacgac ctccgggggc 120

tgcgtgcagc agaacaccag cgtcgtcctg gaccgtgact cgaagtacgc cgcacacagc 180

gccggctcgc ggacggaatc ggattacgcg gcaatgggag tgtccacttc gggcaatgcc 240

gtgacgctgt accactacgt caagaccaac ggcaccctcg tccccgcttc gccgcgcatc 300

tacctcctgg gcgcggacgg caagtacgtg cttatggacc tcctcaacca ggagctgtcg 360

gtggacgtcg acttctcggc gctgccgtgc ggcgagaacg gggccttcta cctgtccgag 420

atggcggcgg acgggcgggg cgacgcgggg gcgggcgacg ggtactgcga cgcgcagtgc 480

cagggctact gctgcaacga gatggacatc ctcgaggcca actcgatggc gacggccatg 540

acgccgcacc cgtgcaaggg caacaactgc gaccgcagcg gctgcggcta caacccgtac 600

gccagcggcc agcgcggctt ctacgggccc ggcaagacgg tcgacacgag caagcccttc 660

accgtcgtca cgcagttcgc cgccagcggc ggcaagctga cccagatcac ccgcaagtac 720

atccagaacg gccgggagat cggcggcggc ggcaccatct ccagctgcgg ctccgagtct 780

tcgacgggcg gcctgaccgg catgggcgag gcgctggggc gcggaatggt gctggccatg 840

agcatctgga acgacgcggc ccaggagatg gcatggctcg atgccggcaa caacggccct 900

tgcgccagtg gccagggcag cccgtccgtc attcagtcgc agcatcccga cacccacgtc 960

gtcttctcca acatcaggtg gggcgacatc gggtctacca cgaagaacta g 1011

<210>18

<211>336

<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>18

Met Thr Leu Arg Leu Pro Val Ile Ser Leu Leu Ala Ser Leu Ala Ala

1 5 10 15

Gly Ala Val Val Val Pro Arg Ala Glu Phe His Pro Pro Leu Pro Thr

20 25 30

Trp Lys Cys Thr Thr Ser Gly Gly Cys Val Gln Gln Asn Thr Ser Val

35 40 45

Val Leu Asp Arg Asp Ser Lys Tyr Ala Ala His Ser Ala Gly Ser Arg

50 55 60

Thr Glu Ser Asp Tyr Ala Ala Met Gly Val Ser Thr Ser Gly Asn Ala

65 70 75 80

Val Thr Leu Tyr His Tyr Val Lys Thr Asn Gly Thr Leu Val Pro Ala

85 90 95

Ser Pro Arg Ile Tyr Leu Leu Gly Ala Asp Gly Lys Tyr Val Leu Met

100 105 110

Asp Leu Leu Asn Gln Glu Leu Ser Val Asp Val Asp Phe Ser Ala Leu

115 120 125

Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ala Phe Tyr Leu Ser Glu Met Ala Ala Asp

130 135 140

Gly Arg Gly Asp Ala Gly Ala Gly Asp Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys

145 150 155 160

Gln Gly Tyr Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Ala Asn Ser Met

165 170 175

Ala Thr Ala Met Thr Pro His Pro Cys Lys Gly Asn Asn Cys Asp Arg

180 185 190

Ser Gly Cys Gly Tyr Asn Pro Tyr Ala Ser Gly Gln Arg Gly Phe Tyr

195 200 205

Gly Pro Gly Lys Thr Val Asp Thr Ser Lys Pro Phe Thr Val Val Thr

210 215 220

Gln Phe Ala Ala Ser Gly Gly Lys Leu Thr Gln Ile Thr Arg Lys Tyr

225 230 235 240

Ile Gln Asn Gly Arg Glu Ile Gly Gly Gly Gly Thr Ile Ser Ser Cys

245 250 255

Gly Ser Glu Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Gly Met Gly Glu Ala Leu

260 265 270

Gly Arg Gly Met Val Leu Ala Met Ser Ile Trp Asn Asp Ala Ala Gln

275 280 285

Glu Met Ala Trp Leu Asp Ala Gly Asn Asn Gly Pro Cys Ala Ser Gly

290 295 300

Gln Gly Ser Pro Ser Val Ile Gln Ser Gln His Pro Asp Thr His Val

305 310 315 320

Val Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Lys Asn

325 330 335

<210>19

<211>1480

<212>DNA

<213>Cladorrhinum foecundissimum

<400>19

gatccgaatt cctcctctcg ttctttagtc acagaccaga catctgccca cgatggttca 60

caagttcgcc ctcctcaccg gcctcgccgc ctccctcgca tctgcccagc agatcggcac 120

cgtcgtcccc gagtctcacc ccaagcttcc caccaagcgc tgcactctcg ccggtggctg 180

ccagaccgtc gacacctcca tcgtcatcga cgccttccag cgtcccctcc acaagatcgg 240

cgacccttcc actccttgcg tcgtcggcgg ccctctctgc cccgacgcca agtcctgcgc 300

tgagaactgc gcgctcgagg gtgtcgacta tgcctcctgg ggcatcaaga ccgagggcga 360

cgccctaact ctcaaccagt ggatgcccga cccggcgaac cctggccagt acaagacgac 420

tactccccgt acttaccttg ttgctgagga cggcaagaac tacgaggatg tgaagctcct 480

ggctaaggag atctcgtttg atgccgatgt cagcaacctt ccctgcggca tgaacggtgc 540

tttctacttg tctgagatgt tgatggatgg tggacgtggc gacctcaacc ctgctggtgc 600

cgagtatggt accggttact gtgatgcgca gtgcttcaag ttggatttca tcaacggcga 660

ggccaacatc gaccaaaagc acggcgcctg ctgcaacgaa atggacattt tcgaatccaa 720

ctcgcgcgcc aagaccttcg tcccccaccc ctgcaacatc acgcaggtct acaagtgcga 780

aggcgaagac gagtgcggcc agcccgtcgg cgtgtgcgac aagtgggggt gcggcttcaa 840

cgagtacaaa tggggcgtcg agtccttcta cggccggggc tcgcagttcg ccatcgactc 900

ctccaagaag ttcaccgtca ccacgcagtt cctgaccgac aacggcaagg aggacggcgt 960

cctcgtcgag atccgccgct tgtggcacca ggatggcaag ctgatcaaga acaccgctat 1020

ccaggttgag gagaactaca gcacggactc ggtgagcacc gagttctgcg agaagactgc 1080

ttctttcacc atgcagcgcg gtggtctcaa ggcgatgggc gaggctatcg gtcgtggtat 1140

ggtgctggtt ttcagcatct gggcggatga ttcgggtttt atgaactggt tggatgcgga 1200

gggtaatggc ccttgcagcg cgactgaggg cgatccgaag gagattgtca agaataagcc 1260

ggatgctagg gttacgttct caaacattag gattggtgag gttggtagca cgtatgctcc 1320

gggtgggaag tgcggtgtta agagcagggt tgctaggggg cttactgctt cttaaggggg 1380

gtgtgaagag aggaggaggt gttgttgggg gttggagatg ataattgggc gagatggtgt 1440

agagcgggtt ggttggatat gaatacgttg aattggatgt 1480

<210>20

<211>440

<212>PRT

<213>Cladorrhinum foecundissimum

<400>20

Met Val His Lys Phe Ala Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ala Gln Gln Ile Gly Thr Val Val Pro Glu Ser His Pro Lys Leu

20 25 30

Pro Thr Lys Arg Cys Thr Leu Ala Gly Gly Cys Gln Thr Val Asp Thr

35 40 45

Ser Ile Val Ile Asp Ala Phe Gln Arg Pro Leu His Lys Ile Gly Asp

50 55 60

Pro Ser Thr Pro Cys Val Val Gly Gly Pro Leu Cys Pro Asp Ala Lys

65 70 75 80

Ser Cys Ala Glu Asn Cys Ala Leu Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ser Trp

85 90 95

Gly Ile Lys Thr Glu Gly Asp Ala Leu Thr Leu Asn Gln Trp Met Pro

100 105 110

Asp Pro Ala Asn Pro Gly Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Pro Arg Thr Tyr

115 120 125

Leu Val Ala Glu Asp Gly Lys Asn Tyr Glu Asp Val Lys Leu Leu Ala

130 135 140

Lys Glu Ile Ser Phe Asp Ala Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Met

145 150 155 160

Asn Gly Ala Phe Tyr Leu Ser Glu Met Leu Met Asp Gly Gly Arg Gly

165 170 175

Asp Leu Asn Pro Ala Gly Ala Glu Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala

180 185 190

Gln Cys Phe Lys Leu Asp Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile Asp Gln

195 200 205

Lys His Gly Ala Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Phe Glu Ser Asn Ser

210 215 220

Arg Ala Lys Thr Phe Val Pro His Pro Cys Asn Ile Thr Gln Val Tyr

225 230 235 240

Lys Cys Glu Gly Glu Asp Glu Cys Gly Gln Pro Val Gly Val Cys Asp

245 250 255

Lys Trp Gly Cys Gly Phe Asn Glu Tyr Lys Trp Gly Val Glu Ser Phe

260 265 270

Tyr Gly Arg Gly Ser Gln Phe Ala Ile Asp Ser Ser Lys Lys Phe Thr

275 280 285

Val Thr Thr Gln Phe Leu Thr Asp Asn Gly Lys Glu Asp Gly Val Leu

290 295 300

Val Glu Ile Arg Arg Leu Trp His Gln Asp Gly Lys Leu Ile Lys Asn

305 310 315 320

Thr Ala Ile Gln Val Glu Glu Asn Tyr Ser Thr Asp Ser Val Ser Thr

325 330 335

Glu Phe Cys Glu Lys Thr Ala Ser Phe Thr Met Gln Arg Gly Gly Leu

340 345 350

Lys Ala Met Gly Glu Ala Ile Gly Arg Gly Met Val Leu Val Phe Ser

355 360 365

Ile Trp Ala Asp Asp Ser Gly Phe Met Asn Trp Leu Asp Ala Glu Gly

370 375 380

Asn Gly Pro Cys Ser Ala Thr Glu Gly Asp Pro Lys Glu Ile Val Lys

385 390 395 400

Asn Lys Pro Asp Ala Arg Val Thr Phe Ser Asn Ile Arg Ile Gly Glu

405 410 415

Val Gly Ser Thr Tyr Ala Pro Gly Gly Lys Cys Gly Val Lys Ser Arg

420 425 430

Val Ala Arg Gly Leu Thr Ala Ser

435 440

<210>21

<211>1380

<212>DNA

<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400>21

atggcgccct cagttacact gccgttgacc acggccatcc tggccattgc ccggctcgtc 60

gccgcccagc aaccgggtac cagcaccccc gaggtccatc ccaagttgac aacctacaag 120

tgtacaaagt ccggggggtg cgtggcccag gacacctcgg tggtccttga ctggaactac 180

cgctggatgc acgacgcaaa ctacaactcg tgcaccgtca acggcggcgt caacaccacg 240

ctctgccctg acgaggcgac ctgtggcaag aactgcttca tcgagggcgt cgactacgcc 300

gcctcgggcg tcacgacctc gggcagcagc ctcaccatga accagtacat gcccagcagc 360

tctggcggct acagcagcgt ctctcctcgg ctgtatctcc tggactctga cggtgagtac 420

gtgatgctga agctcaacgg ccaggagctg agcttcgacg tcgacctctc tgctctgccg 480

tgtggagaga acggctcgct ctacctgtct cagatggacg agaacggggg cgccaaccag 540

tataacacgg ccggtgccaa ctacgggagc ggctactgcg atgctcagtg ccccgtccag 600

acatggagga acggcaccct caacactagc caccagggct tctgctgcaa cgagatggat 660

atcctggagg gcaactcgag ggcgaatgcc ttgacccctc actcttgcac ggccacggcc 720

tgcgactctg ccggttgcgg cttcaacccc tatggcagcg gctacaaaag ctactacggc 780

cccggagata ccgttgacac ctccaagacc ttcaccatca tcacccagtt caacacggac 840

aacggctcgc cctcgggcaa ccttgtgagc atcacccgca agtaccagca aaacggcgtc 900

gacatcccca gcgcccagcc cggcggcgac accatctcgt cctgcccgtc cgcctcagcc 960

tacggcggcc tcgccaccat gggcaaggcc ctgagcagcg gcatggtgct cgtgttcagc 1020

atttggaacg acaacagcca gtacatgaac tggctcgaca gcggcaacgc cggcccctgc 1080

agcagcaccg agggcaaccc atccaacatc ctggccaaca accccaacac gcacgtcgtc 1140

ttctccaaca tccgctgggg agacattggg tctactacga actcgactgc gcccccgccc 1200

ccgcctgcgt ccagcacgac gttttcgact acacggagga gctcgacgac ttcgagcagc 1260

ccgagctgca cgcagactca ctgggggcag tgcggtggca ttgggtacag cgggtgcaag 1320

acgtgcacgt cgggcactac gtgccagtat agcaacgact actactcgca atgcctttag 1380

<210>22

<211>459

<212>PRT

<213>里氏木霉

<400>22

Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile

1 5 10 15

Ala Arg Leu Val Ala Ala Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val

20 25 30

His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val

35 40 45

Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His

50 55 60

Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr

65 70 75 80

Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly

85 90 95

Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr

100 105 110

Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser

115 120 125

Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys

130 135 140

Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro

145 150 155 160

Cys Gly Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly

165 170 175

Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr

180 185 190

Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn

195 200 205

Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly

210 215 220

Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala

225 230 235 240

Cys Asp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys

245 250 255

Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr

260 265 270

Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu

275 280 285

Val Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser

290 295 300

Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala

305 310 315 320

Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val

325 330 335

Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu

340 345 350

Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser

355 360 365

Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile

370 375 380

Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro

385 390 395 400

Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr

405 410 415

Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly

420 425 430

Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys

435 440 445

Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

450 455

<210>23

<211>1545

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>23

atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60

tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120

acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180

acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240

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ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtgcggctt gaacggagct 480

ctctacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540

ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600

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aacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900

accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960

tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020

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tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140

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<210>24

<211>514

<212>PRT

<213>里氏木霉

<400>24

Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg

1 5 10 15

Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr

20 25 30

Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser

35 40 45

Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser

50 55 60

Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp

65 70 75 80

Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala

85 90 95

Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe

100 105 110

Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met

115 120 125

Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe

130 135 140

Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala

145 150 155 160

Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro

165 170 175

Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln

180 185 190

Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly

195 200 205

Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly

210 215 220

Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu

225 230 235 240

Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu

245 250 255

Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr

260 265 270

Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr

275 280 285

Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys

290 295 300

Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr

305 310 315 320

Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly

325 330 335

Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu

340 345 350

Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln

355 360 365

Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp

370 375 380

Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr

385 390 395 400

Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr

405 410 415

Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys

420 425 430

Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn

435 440 445

Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr

450 455 460

Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln

465 470 475 480

Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val

485 490 495

Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln

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Cys Leu

<210>25

<211>1611

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>25

atgattgtcg gcattctcac cacgctggct acgctggcca cactcgcagc tagtgtgcct 60

ctagaggagc ggcaagcttg ctcaagcgtc tggtaattat gtgaaccctc tcaagagacc 120

caaatactga gatatgtcaa ggggccaatg tggtggccag aattggtcgg gtccgacttg 180

ctgtgcttcc ggaagcacat gcgtctactc caacgactat tactcccagt gtcttcccgg 240

cgctgcaagc tcaagctcgt ccacgcgcgc cgcgtcgacg acttctcgag tatcccccac 300

aacatcccgg tcgagctccg cgacgcctcc acctggttct actactacca gagtacctcc 360

agtcggatcg ggaaccgcta cgtattcagg caaccctttt gttggggtca ctccttgggc 420

caatgcatat tacgcctctg aagttagcag cctcgctatt cctagcttga ctggagccat 480

ggccactgct gcagcagctg tcgcaaaggt tccctctttt atgtggctgt aggtcctccc 540

ggaaccaagg caatctgtta ctgaaggctc atcattcact gcagagatac tcttgacaag 600

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tatgccggac agtttgtggt gtatgacttg ccggatcgcg attgcgctgc ccttgcctcg 720

aatggcgaat actctattgc cgatggtggc gtcgccaaat ataagaacta tatcgacacc 780

attcgtcaaa ttgtcgtgga atattccgat atccggaccc tcctggttat tggtatgagt 840

ttaaacacct gcctcccccc ccccttccct tcctttcccg ccggcatctt gtcgttgtgc 900

taactattgt tccctcttcc agagcctgac tctcttgcca acctggtgac caacctcggt 960

actccaaagt gtgccaatgc tcagtcagcc taccttgagt gcatcaacta cgccgtcaca 1020

cagctgaacc ttccaaatgt tgcgatgtat ttggacgctg gccatgcagg atggcttggc 1080

tggccggcaa accaagaccc ggccgctcag ctatttgcaa atgtttacaa gaatgcatcg 1140

tctccgagag ctcttcgcgg attggcaacc aatgtcgcca actacaacgg gtggaacatt 1200

accagccccc catcgtacac gcaaggcaac gctgtctaca acgagaagct gtacatccac 1260

gctattggac gtcttcttgc caatcacggc tggtccaacg ccttcttcat cactgatcaa 1320

ggtcgatcgg gaaagcagcc taccggacag caacagtggg gagactggtg caatgtgatc 1380

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gactcccact gtgcgctccc agatgccttg caaccggcgc ctcaagctgg tgcttggttc 1560

caagcctact ttgtgcagct tctcacaaac gcaaacccat cgttcctgta a 1611

<210>26

<211>471

<212>PRT

<213>里氏木霉

<400>26

Met Ile Val Gly Ile Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg Gln Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly

20 25 30

Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Ser Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly

35 40 45

Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Gly

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser Arg

65 70 75 80

Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro Gly

85 90 95

Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly Ser Gly Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Ser Gly Asn Pro Phe Val Gly Val Thr Pro Trp Ala Asn Ala Tyr Tyr

115 120 125

Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala Ile Pro Ser Leu Thr Gly Ala Met

130 135 140

Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val Pro Ser Phe Met Trp Leu

145 150 155 160

Asp Thr Leu Asp Lys Thr Pro Leu Met Glu Gln Thr Leu Ala Asp Ile

165 170 175

Arg Thr Ala Asn Lys Asn Gly Gly Asn Tyr Ala Gly Gln Phe Val Val

180 185 190

Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu

195 200 205

Tyr Ser Ile Ala Asp Gly Gly Val Ala Lys Tyr Lys Asn Tyr Ile Asp

210 215 220

Thr Ile Arg Gln Ile Val Val Glu Tyr Ser Asp Ile Arg Thr Leu Leu

225 230 235 240

Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Gly Thr

245 250 255

Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Ile Asn Tyr

260 265 270

Ala Val Thr Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala

275 280 285

Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Gln Asp Pro Ala Ala

290 295 300

Gln Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala Leu

305 310 315 320

Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Asn Ile Thr

325 330 335

Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gln Gly Asn Ala Val Tyr Asn Glu Lys Leu

340 345 350

Tyr Ile His Ala Ile Gly Arg Leu Leu Ala Asn His Gly Trp Ser Asn

355 360 365

Ala Phe Phe Ile Thr Asp Gln Gly Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr Gly

370 375 380

Gln Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly

385 390 395 400

Ile Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly Asp Ser Leu Leu Asp Ser Phe Val

405 410 415

Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser Ala

420 425 430

Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro Asp Ala Leu Gln Pro Ala

435 440 445

Pro Gln Ala Gly Ala Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Val Gln Leu Leu Thr

450 455 460

Asn Ala Asn Pro Ser Phe Leu

465 470

<210>27

<211>2046

<212>DNA

<213>特异腐质霉

<400>27

gccgtgacct tgcgcgcttt gggtggcggt ggcgagtcgt ggacggtgct tgctggtcgc 60

cggccttccc ggcgatccgc gtgatgagag ggccaccaac ggcgggatga tgctccatgg 120

ggaacttccc catggagaag agagagaaac ttgcggagcc gtgatctggg gaaagatgct 180

ccgtgtctcg tctatataac tcgagtctcc ccgagccctc aacaccacca gctctgatct 240

caccatcccc atcgacaatc acgcaaacac agcagttgtc gggccattcc ttcagacaca 300

tcagtcaccc tccttcaaaa tgcgtaccgc caagttcgcc accctcgccg cccttgtggc 360

ctcggccgcc gcccagcagg cgtgcagtct caccaccgag aggcaccctt ccctctcttg 420

gaacaagtgc accgccggcg gccagtgcca gaccgtccag gcttccatca ctctcgactc 480

caactggcgc tggactcacc aggtgtctgg ctccaccaac tgctacacgg gcaacaagtg 540

ggatactagc atctgcactg atgccaagtc gtgcgctcag aactgctgcg tcgatggtgc 600

cgactacacc agcacctatg gcatcaccac caacggtgat tccctgagcc tcaagttcgt 660

caccaagggc cagcactcga ccaacgtcgg ctcgcgtacc tacctgatgg acggcgagga 720

caagtatcag agtacgttct atcttcagcc ttctcgcgcc ttgaatcctg gctaacgttt 780

acacttcaca gccttcgagc tcctcggcaa cgagttcacc ttcgatgtcg atgtctccaa 840

catcggctgc ggtctcaacg gcgccctgta cttcgtctcc atggacgccg atggtggtct 900

cagccgctat cctggcaaca aggctggtgc caagtacggt accggctact gcgatgctca 960

gtgcccccgt gacatcaagt tcatcaacgg cgaggccaac attgagggct ggaccggctc 1020

caccaacgac cccaacgccg gcgcgggccg ctatggtacc tgctgctctg agatggatat 1080

ctgggaagcc aacaacatgg ctactgcctt cactcctcac ccttgcacca tcattggcca 1140

gagccgctgc gagggcgact cgtgcggtgg cacctacagc aacgagcgct acgccggcgt 1200

ctgcgacccc gatggctgcg acttcaactc gtaccgccag ggcaacaaga ccttctacgg 1260

caagggcatg accgtcgaca ccaccaagaa gatcactgtc gtcacccagt tcctcaagga 1320

tgccaacggc gatctcggcg agatcaagcg cttctacgtc caggatggca agatcatccc 1380

caactccgag tccaccatcc ccggcgtcga gggcaattcc atcacccagg actggtgcga 1440

ccgccagaag gttgcctttg gcgacattga cgacttcaac cgcaagggcg gcatgaagca 1500

gatgggcaag gccctcgccg gccccatggt cctggtcatg tccatctggg atgaccacgc 1560

ctccaacatg ctctggctcg actcgacctt ccctgtcgat gccgctggca agcccggcgc 1620

cgagcgcggt gcctgcccga ccacctcggg tgtccctgct gaggttgagg ccgaggcccc 1680

caacagcaac gtcgtcttct ccaacatccg cttcggcccc atcggctcga ccgttgctgg 1740

tctccccggc gcgggcaacg gcggcaacaa cggcggcaac cccccgcccc ccaccaccac 1800

cacctcctcg gctccggcca ccaccaccac cgccagcgct ggccccaagg ctggccgctg 1860

gcagcagtgc ggcggcatcg gcttcactgg cccgacccag tgcgaggagc cctacatttg 1920

caccaagctc aacgactggt actctcagtg cctgtaaatt ctgagtcgct gactcgacga 1980

tcacggccgg tttttgcatg aaaggaaaca aacgaccgcg ataaaaatgg agggtaatga 2040

gatgtc 2046

<210>28

<211>525

<212>PRT

<213>特异腐质霉

<400>28

Met Arg Thr Ala Lys Phe Ala Thr Leu Ala Ala Leu Val Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gln Gln Ala Cys Ser Leu Thr Thr Glu Arg His Pro Ser Leu

20 25 30

Ser Trp Asn Lys Cys Thr Ala Gly Gly Gln Cys Gln Thr Val Gln Ala

35 40 45

Ser Ile Thr Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Thr His Gln Val Ser Gly

50 55 60

Ser Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Lys Trp Asp Thr Ser Ile Cys Thr

65 70 75 80

Asp Ala Lys Ser Cys Ala Gln Asn Cys Cys Val Asp Gly Ala Asp Tyr

85 90 95

Thr Ser Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Asn Gly Asp Ser Leu Ser Leu Lys

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Phe Val Thr Lys Gly Gln His Ser Thr Asn Val Gly Ser Arg Thr Tyr

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Leu Met Asp Gly Glu Asp Lys Tyr Gln Thr Phe Glu Leu Leu Gly Asn

130 135 140

Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Ile Gly Cys Gly Leu Asn

145 150 155 160

Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Arg

165 170 175

Tyr Pro Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp

180 185 190

Ala Gln Cys Pro Arg Asp Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile

195 200 205

Glu Gly Trp Thr Gly Ser Thr Asn Asp Pro Asn Ala Gly Ala Gly Arg

210 215 220

Tyr Gly Thr Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Asn Met

225 230 235 240

Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Pro Cys Thr Ile Ile Gly Gln Ser Arg

245 250 255

Cys Glu Gly Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asn Glu Arg Tyr Ala

260 265 270

Gly Val Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Tyr Arg Gln Gly

275 280 285

Asn Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Thr Lys Lys

290 295 300

Ile Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Lys Asp Ala Asn Gly Asp Leu Gly

305 310 315 320

Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asp Gly Lys Ile Ile Pro Asn Ser

325 330 335

Glu Ser Thr Ile Pro Gly Val Glu Gly Asn Ser Ile Thr Gln Asp Trp

340 345 350

Cys Asp Arg Gln Lys Val Ala Phe Gly Asp Ile Asp Asp Phe Asn Arg

355 360 365

Lys Gly Gly Met Lys Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Gly Pro Met Val

370 375 380

Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His Ala Ser Asn Met Leu Trp Leu

385 390 395 400

Asp Ser Thr Phe Pro Val Asp Ala Ala Gly Lys Pro Gly Ala Glu Arg

405 410 415

Gly Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Glu

420 425 430

Ala Pro Asn Ser Asn Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile

435 440 445

Gly Ser Thr Val Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gly Asn Gly Gly Asn Asn

450 455 460

Gly Gly Asn Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Ala

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Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Gly Pro Lys Ala Gly Arg Trp Gln Gln

485 490 495

Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr Gly Pro Thr Gln Cys Glu Glu Pro Tyr

500 505 510

Ile Cys Thr Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu

515 520 525

<210>29

<211>1812

<212>DNA

<213>嗜热毁丝霉

<400>29

atggccaaga agcttttcat caccgccgcc cttgcggctg ccgtgttggc ggcccccgtc 60

attgaggagc gccagaactg cggcgctgtg tggtaagaaa gcccggtctg agtttcccat 120

gactttctca tcgagtaatg gcataaggcc caccccttcg actgactgtg agaatcgatc 180

aaatccagga ctcaatgcgg cggcaacggg tggcagggtc ccacatgctg cgcctcgggc 240

tcgacctgcg ttgcgcagaa cgagtggtac tctcagtgcc tgcccaacaa tcaggtgacg 300

agttccaaca ctccgtcgtc gacttccacc tcgcagcgca gcagcagcac ctccagcagc 360

agcaccagga gcggcagctc ctcctcctcc accaccacgc cccctcccgt ctccagcccc 420

gtgactagca ttcccggcgg tgcgaccacc acggcgagct actctggcaa ccccttctcg 480

ggcgtccggc tcttcgccaa cgactactac aggtccgagg tccacaatct cgccattcct 540

agcatgaccg gtactctggc ggccaaggct tccgccgtcg ccgaagtccc tagcttccag 600

tggctcgacc ggaacgtcac catcgacacc ctgatggtcc agactctgtc ccagatccgg 660

gctgccaata atgccggtgc caatcctccc tatgctggtg agttacatgg cggcgacttg 720

ccttctcgtc ccccaccttt cttgacggga tcggttacct gacctggagg caaaacaaaa 780

ccagcccaac ttgtcgtcta cgacctcccc gaccgtgact gcgccgccgc tgcgtccaac 840

ggcgagtttt cgattgcaaa cggcggcgcc gccaactaca ggagctacat cgacgctatc 900

cgcaagcaca tcattgagta ctcggacatc cggatcatcc tggttatcga gcccgactcg 960

atggccaaca tggtgaccaa catgaacgtg gccaagtgca gcaacgccgc gtcgacgtac 1020

cacgagttga ccgtgtacgc gctcaagcag ctgaacctgc ccaacgtcgc catgtatctc 1080

gacgccggcc acgccggctg gctcggctgg cccgccaaca tccagcccgc cgccgacctg 1140

tttgccggca tctacaatga cgccggcaag ccggctgccg tccgcggcct ggccactaac 1200

gtcgccaact acaacgcctg gagtatcgct tcggccccgt cgtacacgtc ccctaaccct 1260

aactacgacg agaagcacta catcgaggcc ttcagcccgc tcctgaacgc ggccggcttc 1320

cccgcacgct tcattgtcga cactggccgc aacggcaaac aacctaccgg tatggttttt 1380

ttcttttttt ttctctgttc ccctccccct tccccttcag ttggcgtcca caaggtctct 1440

tagtcttgct tcttctcgga ccaaccttcc cccaccccca aaacgcaccg cccacaaccg 1500

ttcgactcta tactcttggg aatgggcgcc gaaactgacc gttcgacagg ccaacaacag 1560

tggggtgact ggtgcaatgt caagggcact ggctttggcg tgcgcccgac ggccaacacg 1620

ggccacgacc tggtcgatgc ctttgtctgg gtcaagcccg gcggcgagtc cgacggcaca 1680

agcgacacca gcgccgcccg ctacgactac cactgcggcc tgtccgatgc cctgcagcct 1740

gctccggagg ctggacagtg gttccaggcc tacttcgagc agctgctcac caacgccaac 1800

ccgcccttct aa 1812

<210>30

<211>482

<212>PRT

<213>嗜热毁丝霉

<400>30

Met Ala Lys Lys Leu Phe Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Ile Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ala Val Trp Thr

20 25 30

Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Gln Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly

35 40 45

Ser Thr Cys Val Ala Gln Asn Glu Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn

50 55 60

Asn Gln Val Thr Ser Ser Asn Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gln

65 70 75 80

Arg Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Thr Thr Pro Pro Pro Val Ser Ser Pro Val Thr Ser Ile

100 105 110

Pro Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ser Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Ser

115 120 125

Gly Val Arg Leu Phe Ala Asn Asp Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His Asn

130 135 140

Leu Ala Ile Pro Ser Met Thr Gly Thr Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala

145 150 155 160

Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile

165 170 175

Asp Thr Leu Met Val Gln Thr Leu Ser Gln Ile Arg Ala Ala Asn Asn

180 185 190

Ala Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Ala Gln Leu Val Val Tyr Asp Leu

195 200 205

Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile

210 215 220

Ala Asn Gly Gly Ala Ala Asn Tyr Arg Ser Tyr Ile Asp Ala Ile Arg

225 230 235 240

Lys His Ile Ile Glu Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Ile Leu Val Ile Glu

245 250 255

Pro Asp Ser Met Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys Cys

260 265 270

Ser Asn Ala Ala Ser Thr Tyr His Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Lys

275 280 285

Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala

290 295 300

Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Asp Leu Phe

305 310 315 320

Ala Gly Ile Tyr Asn Asp Ala Gly Lys Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu

325 330 335

Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ala Ser Ala Pro

340 345 350

Ser Tyr Thr Ser Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr Ile Glu

355 360 365

Ala Phe Ser Pro Leu Leu Asn Ala Ala Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ile

370 375 380

Val Asp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Gln Gln Trp

385 390 395 400

Gly Asp Trp Cys Asn Val Lys Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr

405 410 415

Ala Asn Thr Gly His Asp Leu Val Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro

420 425 430

Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ala Arg Tyr Asp

435 440 445

Tyr His Cys Gly Leu Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly

450 455 460

Gln Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro

465 470 475 480

Pro Phe

<210>31

<211>1446

<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>31

atggctcaga agctccttct cgccgccgcc cttgcggcca gcgccctcgc tgctcccgtc 60

gtcgaggagc gccagaactg cggttccgtc tggagccaat gcggcggcat tggctggtcc 120

ggcgcgacct gctgcgcttc gggcaatacc tgcgttgagc tgaacccgta ctactcgcag 180

tgcctgccca acagccaggt gactacctcg accagcaaga ccacctccac caccaccagg 240

agcagcacca ccagccacag cagcggtccc accagcacga gcaccaccac caccagcagt 300

cccgtggtca ctaccccgcc gagtacctcc atccccggcg gtgcctcgtc aacggccagc 360

tggtccggca acccgttctc gggcgtgcag atgtgggcca acgactacta cgcctccgag 420

gtctcgtcgc tggccatccc cagcatgacg ggcgccatgg ccaccaaggc ggccgaggtg 480

gccaaggtgc ccagcttcca gtggcttgac cgcaacgtca ccatcgacac gctgttcgcc 540

cacacgctgt cgcagatccg cgcggccaac cagaaaggcg ccaacccgcc ctacgcgggc 600

atcttcgtgg tctacgacct tccggaccgc gactgcgccg ccgccgcgtc caacggcgag 660

ttctccatcg cgaacaacgg ggcggccaac tacaagacgt acatcgacgc gatccggagc 720

ctcgtcatcc agtactcaga catccgcatc atcttcgtca tcgagcccga ctcgctggcc 780

aacatggtga ccaacctgaa cgtggccaag tgcgccaacg ccgagtcgac ctacaaggag 840

ttgaccgtct acgcgctgca gcagctgaac ctgcccaacg tggccatgta cctggacgcc 900

ggccacgccg gctggctcgg ctggcccgcc aacatccagc cggccgccaa cctcttcgcc 960

gagatctaca cgagcgccgg caagccggcc gccgtgcgcg gcctcgccac caacgtggcc 1020

aactacaacg gctggagcct ggccacgccg ccctcgtaca cccagggcga ccccaactac 1080

gacgagagcc actacgtcca ggccctcgcc ccgctgctca ccgccaacgg cttccccgcc 1140

cacttcatca ccgacaccgg ccgcaacggc aagcagccga ccggacaacg gcaatgggga 1200

gactggtgca acgttatcgg aactggcttc ggcgtgcgcc cgacgacaaa caccggcctc 1260

gacatcgagg acgccttcgt ctgggtcaag cccggcggcg agtgcgacgg cacgagcaac 1320

acgacctctc cccgctacga ctaccactgc ggcctgtcgg acgcgctgca gcctgctccg 1380

gaggccggca cttggttcca ggcctacttc gagcagctcc tgaccaacgc caacccgccc 1440

ttttaa 1446

<210>32

<211>481

<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>32

Met Ala Gln Lys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Val Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ser Val Trp Ser

20 25 30

Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Ala Thr Cys Cys Ala Ser Gly

35 40 45

Asn Thr Cys Val Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn

50 55 60

Ser Gln Val Thr Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ser Thr Thr Thr Arg

65 70 75 80

Ser Ser Thr Thr Ser His Ser Ser Gly Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr

85 90 95

Thr Thr Ser Ser Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Ser Ile Pro

100 105 110

Gly Gly Ala Ser Ser Thr Ala Ser Trp Ser Gly Asn Pro Phe Ser Gly

115 120 125

Val Gln Met Trp Ala Asn Asp Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu

130 135 140

Ala Ile Pro Ser Met Thr Gly Ala Met Ala Thr Lys Ala Ala Glu Val

145 150 155 160

Ala Lys Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile Asp

165 170 175

Thr Leu Phe Ala His Thr Leu Ser Gln Ile Arg Ala Ala Asn Gln Lys

180 185 190

Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Gly Ile Phe Val Val Tyr Asp Leu Pro

195 200 205

Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile Ala

210 215 220

Asn Asn Gly Ala Ala Asn Tyr Lys Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Ser

225 230 235 240

Leu Val Ile Gln Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Ile Phe Val Ile Glu Pro

245 250 255

Asp Ser Leu Ala Asn Met Val Thr Asn Leu Asn Val Ala Lys Cys Ala

260 265 270

Asn Ala Glu Ser Thr Tyr Lys Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Gln Gln

275 280 285

Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala Gly

290 295 300

Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Asn Leu Phe Ala

305 310 315 320

Glu Ile Tyr Thr Ser Ala Gly Lys Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu Ala

325 330 335

Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Ser Leu Ala Thr Pro Pro Ser

340 345 350

Tyr Thr Gln Gly Asp Pro Asn Tyr Asp Glu Ser His Tyr Val Gln Ala

355 360 365

Leu Ala Pro Leu Leu Thr Ala Asn Gly Phe Pro Ala His Phe Ile Thr

370 375 380

Asp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Arg Gln Trp Gly

385 390 395 400

Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Thr

405 410 415

Asn Thr Gly Leu Asp Ile Glu Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly

420 425 430

Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asn Thr Thr Ser Pro Arg Tyr Asp Tyr

435 440 445

His Cys Gly Leu Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly Thr

450 455 460

Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro Pro

465 470 475 480

Phe

<210>33

<211>1593

<212>DNA

<213>嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)

<400>33

atgatgtaca agaagttcgc cgctctcgcc gccctcgtgg ctggcgccgc cgcccagcag 60

gcttgctccc tcaccactga gacccacccc agactcactt ggaagcgctg cacctctggc 120

ggcaactgct cgaccgtgaa cggcgccgtc accatcgatg ccaactggcg ctggactcac 180

actgtttccg gctcgaccaa ctgctacacc ggcaacgagt gggatacctc catctgctct 240

gatggcaaga gctgcgccca gacctgctgc gtcgacggcg ctgactactc ttcgacctat 300

ggtatcacca ccagcggtga ctccctgaac ctcaagttcg tcaccaagca ccagcacggc 360

accaatgtcg gctctcgtgt ctacctgatg gagaacgaca ccaagtacca gatgttcgag 420

ctcctcggca acgagttcac cttcgatgtc gatgtctcta acctgggctg cggtctcaac 480

ggcgccctct acttcgtctc catggacgct gatggtggta tgagcaagta ctctggcaac 540

aaggctggcg ccaagtacgg taccggctac tgcgatgctc agtgcccgcg cgaccttaag 600

ttcatcaacg gcgaggccaa cattgagaac tggacccctt cgaccaatga tgccaacgcc 660

ggtttcggcc gctatggcag ctgctgctct gagatggata tctgggatgc caacaacatg 720

gctactgcct tcactcctca cccttgcacc attatcggcc agagccgctg cgagggcaac 780

agctgcggtg gcacctacag ctctgagcgc tatgctggtg tttgcgatcc tgatggctgc 840

gacttcaacg cctaccgcca gggcgacaag accttctacg gcaagggcat gaccgtcgac 900

accaccaaga agatgaccgt cgtcacccag ttccacaaga actcggctgg cgtcctcagc 960

gagatcaagc gcttctacgt tcaggacggc aagatcattg ccaacgccga gtccaagatc 1020

cccggcaacc ccggcaactc catcacccag gagtggtgcg atgcccagaa ggtcgccttc 1080

ggtgacatcg atgacttcaa ccgcaagggc ggtatggctc agatgagcaa ggccctcgag 1140

ggccctatgg tcctggtcat gtccgtctgg gatgaccact acgccaacat gctctggctc 1200

gactcgacct accccattga caaggccggc acccccggcg ccgagcgcgg tgcttgcccg 1260

accacctccg gtgtccctgc cgagattgag gcccaggtcc ccaacagcaa cgttatcttc 1320

tccaacatcc gcttcggccc catcggctcg accgtccctg gcctcgacgg cagcaccccc 1380

agcaacccga ccgccaccgt tgctcctccc acttctacca ccaccagcgt gagaagcagc 1440

actactcaga tttccacccc gactagccag cccggcggct gcaccaccca gaagtggggc 1500

cagtgcggtg gtatcggcta caccggctgc actaactgcg ttgctggcac tacctgcact 1560

gagctcaacc cctggtacag ccagtgcctg taa 1593

<210>34

<211>530

<212>PRT

<213>嗜热毛壳菌

<400>34

Met Met Tyr Lys Lys Phe Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gln Gln Ala Cys Ser Leu Thr Thr Glu Thr His Pro Arg Leu

20 25 30

Thr Trp Lys Arg Cys Thr Ser Gly Gly Asn Cys Ser Thr Val Asn Gly

35 40 45

Ala Val Thr Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Thr Val Ser Gly

50 55 60

Ser Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Glu Trp Asp Thr Ser Ile Cys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Lys Ser Cys Ala Gln Thr Cys Cys Val Asp Gly Ala Asp Tyr

85 90 95

Ser Ser Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asp Ser Leu Asn Leu Lys

100 105 110

Phe Val Thr Lys His Gln His Gly Thr Asn Val Gly Ser Arg Val Tyr

115 120 125

Leu Met Glu Asn Asp Thr Lys Tyr Gln Met Phe Glu Leu Leu Gly Asn

130 135 140

Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Gly Cys Gly Leu Asn

145 150 155 160

Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys

165 170 175

Tyr Ser Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp

180 185 190

Ala Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile

195 200 205

Glu Asn Trp Thr Pro Ser Thr Asn Asp Ala Asn Ala Gly Phe Gly Arg

210 215 220

Tyr Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Asp Ala Asn Asn Met

225 230 235 240

Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Pro Cys Thr Ile Ile Gly Gln Ser Arg

245 250 255

Cys Glu Gly Asn Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Glu Arg Tyr Ala

260 265 270

Gly Val Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ala Tyr Arg Gln Gly

275 280 285

Asp Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Thr Lys Lys

290 295 300

Met Thr Val Val Thr Gln Phe His Lys Asn Ser Ala Gly Val Leu Ser

305 310 315 320

Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asp Gly Lys Ile Ile Ala Asn Ala

325 330 335

Glu Ser Lys Ile Pro Gly Asn Pro Gly Asn Ser Ile Thr Gln Glu Trp

340 345 350

Cys Asp Ala Gln Lys Val Ala Phe Gly Asp Ile Asp Asp Phe Asn Arg

355 360 365

Lys Gly Gly Met Ala Gln MetSer Lys Ala Leu Glu Gly Pro Met Val

370 375 380

Leu Val Met Ser Val Trp Asp Asp His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu

385 390 395 400

Asp Ser Thr Tyr Pro Ile Asp Lys Ala Gly Thr Pro Gly Ala Glu Arg

405 410 4l5

Gly Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Ile Glu Ala Gln

420 425 430

Val Pro Asn Ser Asn Val Ile Phe Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile

435 440 445

Gly Ser Thr Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Thr Pro Ser Asn Pro Thr

450 455 460

Ala Thr Val Ala Pro Pro Thr Ser Thr Thr Thr Ser Val Arg Ser Ser

465 470 475 480

Thr Thr Gln Ile Ser Thr Pro Thr Ser Gln Pro Gly Gly Cys Thr Thr

485 490 495

Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Asn

500 505 510

Cys Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Glu Leu Asn Pro Trp Tyr Ser Gln

515 520 525

Cys Leu

530

<210>35

<211>1434

<212>DNA

<213>嗜热毛壳菌

<400>35

atggctaagc agctgctgct cactgccgct cttgcggcca cttcgctggc tgcccctctc 60

cttgaggagc gccagagctg ctcctccgtc tggggtcaat gcggtggcat caattacaac 120

ggcccgacct gctgccagtc cggcagtgtt tgcacttacc tgaatgactg gtacagccag 180

tgcattcccg gtcaggctca gcccggcacg actagcacca cggctcggac caccagcacc 240

agcaccacca gcacttcgtc ggtccgcccg accacctcga atacccctgt gacgactgct 300

cccccgacga ccaccatccc gggcggcgcc tcgagcacgg ccagctacaa cggcaacccg 360

ttttcgggtg ttcaactttg ggccaacacc tactactcgt ccgaggtgca cactttggcc 420

atccccagct tgtctcctga gctggctgcc aaggccgcca aggtcgctga ggttcccagc 480

ttccagtggc tcgaccgcaa tgtgactgtt gacactctct tctccggcac tcttgccgaa 540

atccgcgccg ccaaccagcg cggtgccaac ccgccttatg ccggcatttt cgtggtttat 600

gacttaccag accgtgattg cgcggctgct gcttcgaacg gcgagtggtc tatcgccaac 660

aatggtgcca acaactacaa gcgctacatc gaccggatcc gtgagctcct tatccagtac 720

tccgatatcc gcactattct ggtcattgaa cctgattccc tggccaacat ggtcaccaac 780

atgaacgtcc agaagtgctc gaacgctgcc tccacttaca aggagcttac tgtctatgcc 840

ctcaaacagc tcaatcttcc tcacgttgcc atgtacatgg atgctggcca cgctggctgg 900

cttggctggc ccgccaacat ccagcctgct gctgagctct ttgctcaaat ctaccgcgac 960

gctggcaggc ccgctgctgt ccgcggtctt gcgaccaacg ttgccaacta caatgcttgg 1020

tcgatcgcca gccctccgtc ctacacctct cctaacccga actacgacga gaagcactat 1080

attgaggcct ttgctcctct tctccgcaac cagggcttcg acgcaaagtt catcgtcgac 1140

accggccgta acggcaagca gcccactggc cagcttgaat ggggtcactg gtgcaatgtc 1200

aagggaactg gcttcggtgt gcgccctact gctaacactg ggcatgaact tgttgatgct 1260

ttcgtgtggg tcaagcccgg tggcgagtcc gacggcacca gtgcggacac cagcgctgct 1320

cgttatgact atcactgcgg cctttccgac gcactgactc cggcgcctga ggctggccaa 1380

tggttccagg cttatttcga acagctgctc atcaatgcca accctccgct ctga 1434

<210>36

<211>477

<212>PRT

<213>嗜热毛壳菌

<400>36

Met Ala Lys Gln Leu Leu Leu Thr Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ser Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Leu Glu Glu Arg Gln Ser Cys Ser Ser Val Trp Gly

20 25 30

Gln Cys Gly Gly Ile Asn Tyr Asn Gly Pro Thr Cys Cys Gln Ser Gly

35 40 45

Ser Val Cys Thr Tyr Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Ile Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Gln Pro Gly Thr Thr Ser Thr Thr Ala Arg Thr Thr Ser Thr

65 70 75 80

Ser Thr Thr Ser Thr Ser Ser Val Arg Pro Thr Thr Ser Asn Thr Pro

85 90 95

Val Thr Thr Ala Pro Pro Thr Thr Thr Ile Pro Gly Gly Ala Ser Ser

100 105 110

Thr Ala Ser Tyr Asn Gly Asn Pro Phe Ser Gly Val Gln Leu Trp Ala

115 120 125

Asn Thr Tyr Tyr Ser Ser Glu Val His Thr Leu Ala Ile Pro Ser Leu

130 135 140

Ser Pro Glu Leu Ala Ala Lys Ala Ala Lys Val Ala Glu Val Pro Ser

145 150 155 160

Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Val Asp Thr Leu Phe Ser Gly

165 170 175

Thr Leu Ala Glu Ile Arg Ala Ala Asn Gln Arg Gly Ala Asn Pro Pro

180 185 190

Tyr Ala Gly Ile Phe Val Val Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala

195 200 205

Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Trp Ser Ile Ala Asn Asn Gly Ala Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Arg Tyr Ile Asp Arg Ile Arg Glu Leu Leu Ile Gln Tyr

225 230 235 240

Ser Asp Ile Arg Thr Ile Leu Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn

245 250 255

Met Val Thr Asn Met Asn Val Gln Lys Cys Ser Asn Ala Ala Ser Thr

260 265 270

Tyr Lys Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Lys Gln Leu Asn Leu Pro His

275 280 285

Val Ala Met Tyr Met Asp Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro

290 295 300

Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Glu Leu Phe Ala Gln Ile Tyr Arg Asp

305 310 315 320

Ala Gly Arg Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn

325 330 335

Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ala Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Ser Pro Asn

340 345 350

Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr Ile Glu Ala Phe Ala Pro Leu Leu

355 360 365

Arg Asn Gln Gly Phe Asp Ala Lys Phe Ile Val Asp Thr Gly Arg Asn

370 375 380

Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Leu Glu Trp Gly His Trp Cys Asn Val

385 390 395 400

Lys Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Ala Asn Thr Gly His Glu

405 410 415

Leu Val Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly

420 425 430

Thr Ser Ala Asp Thr Ser Ala Ala Arg Tyr Asp Tyr His Cys Gly Leu

435 440 445

Ser Asp Ala Leu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Gly Gln Trp Phe Gln Ala

450 455 460

Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Ile Asn Ala Asn Pro Pro Leu

465 470 475

<210>37

<211>2586

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>37

atgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cctcagtagt cagtgccaag 60

gatgatctcg cgtactcccc tcctttctac ccttccccat gggcagatgg tcagggtgaa 120

tgggcggaag tatacaaacg cgctgtagac atagtttccc agatgacgtt gacagagaaa 180

gtcaacttaa cgactggaac aggatggcaa ctagagaggt gtgttggaca aactggcagt 240

gttcccagac tcaacatccc cagcttgtgt ttgcaggata gtcctcttgg tattcgtttc 300

tcggactaca attcagcttt ccctgcgggt gttaatgtcg ctgccacctg ggacaagacg 360

ctcgcctacc ttcgtggtca ggcaatgggt gaggagttca gtgataaggg tattgacgtt 420

cagctgggtc ctgctgctgg ccctctcggt gctcatccgg atggcggtag aaactgggaa 480

ggtttctcac cagatccagc cctcaccggt gtactttttg cggagacgat taagggtatt 540

caagatgctg gtgtcattgc gacagctaag cattatatca tgaacgaaca agagcatttc 600

cgccaacaac ccgaggctgc gggttacgga ttcaacgtaa gcgacagttt gagttccaac 660

gttgatgaca agactatgca tgaattgtac ctctggccct tcgcggatgc agtacgcgct 720

ggagtcggtg ctgtcatgtg ctcttacaac caaatcaaca acagctacgg ttgcgagaat 780

agcgaaactc tgaacaagct tttgaaggcg gagcttggtt tccaaggctt cgtcatgagt 840

gattggaccg ctcatcacag cggcgtaggc gctgctttag caggtctgga tatgtcgatg 900

cccggtgatg ttaccttcga tagtggtacg tctttctggg gtgcaaactt gacggtcggt 960

gtccttaacg gtacaatccc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg tatcatggcc 1020

gcttattaca aggttggccg cgacaccaaa tacacccctc ccaacttcag ctcgtggacc 1080

agggacgaat atggtttcgc gcataaccat gtttcggaag gtgcttacga gagggtcaac 1140

gaattcgtgg acgtgcaacg cgatcatgcc gacctaatcc gtcgcatcgg cgcgcagagc 1200

actgttctgc tgaagaacaa gggtgccttg cccttgagcc gcaaggaaaa gctggtcgcc 1260

cttctgggag aggatgcggg ttccaactcg tggggcgcta acggctgtga tgaccgtggt 1320

tgcgataacg gtacccttgc catggcctgg ggtagcggta ctgcgaattt cccatacctc 1380

gtgacaccag agcaggcgat tcagaacgaa gttcttcagg gccgtggtaa tgtcttcgcc 1440

gtgaccgaca gttgggcgct cgacaagatc gctgcggctg cccgccaggc cagcgtatct 1500

ctcgtgttcg tcaactccga ctcaggagaa ggctatctta gtgtggatgg aaatgagggc 1560

gatcgtaaca acatcactct gtggaagaac ggcgacaatg tggtcaagac cgcagcgaat 1620

aactgtaaca acaccgttgt catcatccac tccgtcggac cagttttgat cgatgaatgg 1680

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cagtaa 2586

<210>38

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<212>PRT

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Val Ser Ala Lys Asp Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser

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Pro Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala

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Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala

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Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala

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<210>40

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<212>PRT

<213>烟曲霉

<400>40

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Gln Ala Ile Gln Arg Glu Val Ile Ser Asn Gly Gly Asn Val Phe Ala

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Val Thr Asp Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln

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Ser Ala Tyr Val Pro Thr Ser Gly Glu Thr Lys Pro Ala Pro Thr Tyr

675 680 685

Gly Glu Ile Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Lys

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Gly Ala Pro Gly Gly Asn Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val

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Ser Ala Thr Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu Val Pro

770 775 780

Gln Leu Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Arg Val Val Leu

785 790 795 800

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Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr

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<211>2800

<212>DNA

<213>巴西青霉(Penicillium brasilianum)

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caccttccat cggacagcca cctagccaga acctggatac ctacaagttc cctgctacat 2280

acaagtacat caaaaccttc atttatccct acctgaacag cactgtctcc ctccgcgctg 2340

cttccaagga tcccgaatac ggtcgtacag actttatccc accccacgcg cgtgatggct 2400

cccctcaacc tctcaacccc gctggagacc cagtggccag tggtggaaac aacatgctct 2460

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<210>42

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<212>PRT

<213>巴西青霉

<400>42

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Pro Val Ala Gly Pro Leu Gly Arg Ile Pro Glu Gly Gly Arg Asn Trp

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Glu Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Ile Ala Met Ala Glu

180 185 190

Thr Ile Lys Gly Met Gln Asp Thr Gly Val Ile Ala Cys Ala Lys His

195 200 205

Tyr Ile Gly Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Gly Glu Ala Ala

210 215 220

Gly His Gly Tyr Thr Ile Ser Asp Thr Ile Ser Ser Asn Ile Asp Asp

225 230 235 240

Arg Ala Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg

245 250 255

Ala Gly Val Gly Ser Phe Met Cys Ser Tyr Ser Gln Ile Asn Asn Ser

260 265 270

Tyr Gly Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ser Glu

275 280 285

Leu Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Gly Ala His His Ser

290 295 300

Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp

305 310 315 320

Thr Glu Phe Asp Ser Gly Leu Ser Phe Trp Gly Ser Asn Leu Thr Ile

325 330 335

Ala Ile Leu Asn Gly Thr Val Pro Glu Trp Arg Leu Asp Asp Met Ala

340 345 350

Met Arg Ile Met Ala Ala Tyr Phe Lys Val Gly Leu Thr Ile Glu Asp

355 360 365

Gln Pro Asp Val Asn Phe Asn Ala Trp Thr His Asp Thr Tyr Gly Tyr

370 375 380

Lys Tyr Ala Tyr Ser Lys Glu Asp Tyr Glu Gln Val Asn Trp His Val

385 390 395 400

Asp Val Arg Ser Asp His Asn Lys Leu Ile Arg Glu Thr Ala Ala Lys

405 410 415

Gly Thr Val Leu Leu Lys Asn Asn Phe His Ala Leu Pro Leu Lys Gln

420 425 430

Pro Arg Phe Val Ala Val Val Gly Gln Asp Ala Gly Pro Asn Pro Lys

435 440 445

Gly Pro Asn Gly Cys Ala Asp Arg Gly Cys Asp Gln Gly Thr Leu Ala

450 455 460

Met Gly Trp Gly Ser Gly Ser Thr Glu Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro

465 470 475 480

Asp Thr Ala Ile Gln Ser Lys Val Leu Glu Tyr Gly Gly Arg Tyr Glu

485 490 495

Ser Ile Phe Asp Asn Tyr Asp Asp Asn Ala Ile Leu Ser Leu Val Ser

500 505 510

Gln Pro Asp Ala Thr Cys Ile Val Phe Ala Asn Ala Asp Ser Gly Glu

515 520 525

Gly Tyr Ile Thr Val Asp Asn Asn Trp Gly Asp Arg Asn Asn Leu Thr

530 535 540

Leu Trp Gln Asn Ala Asp Gln Val Ile Ser Thr Val Ser Ser Arg Cys

545 550 555 560

Asn Asn Thr Ile Val Val Leu His Ser Val Gly Pro Val Leu Leu Asn

565 570 575

Gly Ile Tyr Glu His Pro Asn Ile Thr Ala Ile Val Trp Ala Gly Met

580 585 590

Pro Gly Glu Glu Ser Gly Asn Ala Leu Val Asp Ile Leu Trp Gly Asn

595 600 605

Val Asn Pro Ala Gly Arg Thr Pro Phe Thr Trp Ala Lys Ser Arg Glu

610 615 620

Asp Tyr Gly Thr Asp Ile Met Tyr Glu Pro Asn Asn Gly Gln Arg Ala

625 630 635 640

Pro Gln Gln Asp Phe Thr Glu Ser Ile Tyr Leu Asp Tyr Arg His Phe

645 650 655

Asp Lys Ala Gly Ile Glu Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Phe Gly Leu Ser

660 665 670

Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Ser Asp Leu Arg Val Val Lys Lys Tyr Val

675 680 685

Gln Pro Tyr Ser Pro Thr Thr Gly Thr Gly Ala Gln Ala Pro Ser Ile

690 695 700

Gly Gln Pro Pro Ser Gln Asn Leu Asp Thr Tyr Lys Phe Pro Ala Thr

705 710 715 720

Tyr Lys Tyr Ile Lys Thr Phe Ile Tyr Pro Tyr Leu Asn Ser Thr Val

725 730 735

Ser Leu Arg Ala Ala Ser Lys Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Phe

740 745 750

Ile Pro Pro His Ala Arg Asp Gly Ser Pro Gln Pro Leu Asn Pro Ala

755 760 765

Gly Asp Pro Val Ala Ser Gly Gly Asn Asn Met Leu Tyr Asp Glu Leu

770 775 780

Tyr Glu Val Thr Ala Gln Ile Lys Asn Thr Gly Asp Val Ala Gly Asp

785 790 795 800

Glu Val Val Gln Leu Tyr Val Asp Leu Gly Gly Asp Asn Pro Pro Arg

805 810 815

Gln Leu Arg Asn Phe Asp Arg Phe Tyr Leu Leu Pro Gly Gln Ser Ser

820 825 830

Thr Phe Arg Ala Thr Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ser Asn Trp Asp Ile

835 840 845

Glu Ala Gln Asn Trp Arg Val Thr Glu Ser Pro Lys Arg Val Tyr Val

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Gly Arg Ser Ser Arg Asp Leu Pro Leu Ser Ser Gln Leu Glu

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<210>43

<211>2583

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)

<400>43

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gatgctggtg tggttgcgac ggctaagcac tacattgctt acgagcaaga gcatttccgt 600

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gatgataaga ctatgcacga gctgtacctc tggcccttcg cggatgccat ccgtgcaggt 720

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tacactctga acaagctgct caaggccgag ctgggcttcc agggctttgt catgagtgat 840

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ggagacgtcg actacgacag tggtacgtct tactggggta caaacttgac cattagcgtg 960

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taa 2583

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<213>黑曲霉

<400>44

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Trp Ala Asn Gly Gln Gly Asp Trp Ala Gln Ala Tyr Gln Arg Ala Val

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Asp Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Asp Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr

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Ala Tyr Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Ala Pro Glu Ala Gln Gly Phe

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Gly Phe Asn Ile Ser Glu Ser Gly Ser Ala Asn Leu Asp Asp Lys Thr

210 215 220

Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Ile Arg Ala Gly

225 230 235 240

Ala Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly

245 250 255

Cys Gln Asn Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly

260 265 270

Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ala Ala His His Ala Gly Val

275 280 285

Ser Gly Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Asp

290 295 300

Tyr Asp Ser Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ser Val

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg

325 330 335

Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Trp Thr Pro

340 345 350

Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Tyr Lys Tyr Tyr

355 360 365

Tyr Val Ser Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn Gln Tyr Val Asn Val

370 375 380

Gln Arg Asn His Ser Glu Leu Ile Arg Arg Ile Gly Ala Asp Ser Thr

385 390 395 400

Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg

405 410 415

Leu Val Ala Leu Ile Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Tyr Gly Ala

420 425 430

Asn Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly

435 440 445

Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln

450 455 460

Ala Ile Ser Asn Glu Val Leu Lys His Lys Asn Gly Val Phe Thr Ala

465 470 475 480

Thr Asp Asn Trp Ala Ile Asp Gln Ile Glu Ala Leu Ala Lys Thr Ala

485 490 495

Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile

500 505 510

Asn Val Asp Gly Asn Leu Gly Asp Arg Arg Asn Leu Thr Leu Trp Arg

515 520 525

Asn Gly Asp Asn Val Ile Lys Ala Ala Ala Ser Asn Cys Asn Asn Thr

530 535 540

Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asn Glu Trp Tyr

545 550 555 560

Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Gly Gly Leu Pro Gly Gln

565 570 575

Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro

580 585 590

Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gln

595 600 605

Asp Tyr Leu Val Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Glu

610 615 620

Asp Phe Val Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg Gly Phe Asp Lys Arg

625 630 635 640

Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr

645 650 655

Phe Asn Tyr Ser Asn Leu Glu Val Gln Val Leu Ser Ala Pro Ala Tyr

660 665 670

Glu Pro Ala Ser Gly Glu Thr Glu Ala Ala Pro Thr Phe Gly Glu Val

675 680 685

Gly Asn Ala Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Ser Gly Leu Gln Arg Ile Thr

690 695 700

Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Gly Thr Asp Leu Glu Ala Ser Ser

705 710 715 720

Gly Asp Ala Ser Tyr Gly Gln Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Pro Glu Gly

725 730 735

Ala Thr Asp Gly Ser Ala Gln Pro Ile Leu Pro Ala Gly Gly Gly Pro

740 745 750

Gly Gly Asn Pro Arg Leu Tyr Asp Glu Leu Ile Arg Val Ser Val Thr

755 760 765

Ile Lys Asn Thr Gly Lys Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr

770 775 780

Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Ile Val Leu Arg Gln Phe

785 790 795 800

Glu Arg Ile Thr Leu Gln Pro Ser Glu Glu Thr Lys Trp Ser Thr Thr

805 810 815

Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asn Val Glu Lys Gln Asp Trp

820 825 830

Glu Ile Thr Ser Tyr Pro Lys Met Val Phe Val Gly Ser Ser Ser Arg

835 840 845

Lys Leu Pro Leu Arg Ala Ser Leu Pro Thr Val His

850 855 860

<210>45

<21l>2583

<212>DNA

<213>棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)

<400>45

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gatgacaaga ccattcatga aatgtacctc tggcccttcg cggatgccgt tcgcgccggc 720

gttggcgcca tcatgtgttc ctacaaccag atcaacaaca gctacggttg ccagaacagt 780

tacactctga acaagcttct gaaggccgag ctcggcttcc agggctttgt gatgtctgac 840

tggggtgctc accacagtgg tgttggctct gctttggccg gcttggatat gtcaatgcct 900

ggcgatatca ccttcgattc tgccactagt ttctggggta ccaacctgac cattgctgtg 960

ctcaacggta ccgtcccgca gtggcgcgtt gacgacatgg ctgtccgtat catggctgcc 1020

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cgcaacaacc tcaccctctg gaagaacggc gacaacctca tcaaggctgc tgcaaacaac 1620

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ggcaagacga gggaggcgta cggggattac cttgtccgtg agctcaacaa cggcaacgga 1860

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aatgagaccc cgatctacga gttcggacat ggtctgagct acaccacttt caactactct 1980

ggccttcaca tccaggttct caacgcttcc tccaacgctc aagtagccac tgagactggc 2040

gccgctccca ccttcggaca agtcggcaat gcctctgact acgtgtaccc tgagggattg 2100

accagaatca gcaagttcat ctatccctgg cttaattcca cagacctgaa ggcctcatct 2160

ggcgacccgt actatggagt cgacaccgcg gagcacgtgc ccgagggtgc tactgatggc 2220

tctccgcagc ccgttctgcc tgccggtggt ggctctggtg gtaacccgcg cctctacgat 2280

gagttgatcc gtgtttcggt gacagtcaag aacactggtc gtgttgccgg tgatgctgtg 2340

cctcaattgt atgtttccct tggtggaccc aatgagccca aggttgtgtt gcgcaaattc 2400

gaccgcctca ccctcaagcc ctccgaggag acggtgtgga cgactaccct gacccgccgc 2460

gatctgtcta actgggacgt tgcggctcag gactgggtca tcacttctta cccgaagaag 2520

gtccatgttg gtagctcttc gcgtcagctg ccccttcacg cggcgctccc gaaggtgcaa 2580

tga 2583

<210>46

<211>860

<212>PRT

<213>棘孢曲霉

<400>46

Met Lys Leu Ser Trp Leu Glu Ala Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Val Ser Ala Asp Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro

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Trp Ala Asn Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Ala Tyr Gln Arg Ala Val

35 40 45

Ala Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Asp Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr

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Gly Thr Gly Trp Glu Leu Glu Lys Cys Val Gly Gln Thr Gly Gly Val

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Pro Arg Leu Asn Ile Gly Gly Met Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu Gly

85 90 95

Ile Arg Asp Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val

100 105 110

Ala Ala Thr Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met

115 120 125

Gly Gln Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro Ala

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Ala Gly Pro Leu Gly Arg Ser Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly

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Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile

165 170 175

Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Val Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile

180 185 190

Leu Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Ala Glu Ala Ala Gly Tyr

195 200 205

Gly Phe Asn Ile Ser Asp Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr

210 215 220

Ile His Glu Met Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly

225 230 235 240

Val Gly Ala Ile Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly

245 250 255

Cys Gln Asn Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly

260 265 270

Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Gly Ala His His Ser Gly Val

275 280 285

Gly Ser Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile Thr

290 295 300

Phe Asp Ser Ala Thr Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ala Val

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg

325 330 335

Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Tyr Gln Pro

340 345 350

Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Lys Tyr Phe

355 360 365

Tyr Pro Gln Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn His Phe Val Asn Val

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Gln Arg Asn His Ser Glu Val Ile Arg Lys Leu Gly Ala Asp Ser Thr

385 390 395 400

Val Leu Leu Lys Asn Asn Asn Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg

405 410 415

Lys Val Ala Ile Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Ser Tyr Gly Ala

420 425 430

Asn Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala

435 440 445

Trp Gly Ser Gly Thr Ala Glu Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln

450 455 460

Ala Ile Gln Ala Glu Val Leu Lys His Lys Gly Ser Val Tyr Ala Ile

465 470 475 480

Thr Asp Asn Trp Ala Leu Ser Gln Val Glu Thr Leu Ala Lys Gln Ala

485 490 495

Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ser Asp Ala Gly Glu Gly Tyr Ile

500 505 510

Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Asn Asn Leu Thr Leu Trp Lys

515 520 525

Asn Gly Asp Asn Leu Ile Lys Ala Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn Thr

530 535 540

Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asp Glu Trp Tyr

545 550 555 560

Asp His Pro Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln

565 570 575

Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro

580 585 590

Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gly

595 600 605

Asp Tyr Leu Val Arg Glu Leu Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Asp

610 615 620

Asp Phe Ser Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg Gly Phe Asp Lys Arg

625 630 635 640

Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr

645 650 655

Phe Asn Tyr Ser Gly Leu His Ile Gln Val Leu Asn Ala Ser Ser Asn

660 665 670

Ala Gln Val Ala Thr Glu Thr Gly Ala Ala Pro Thr Phe Gly Gln Val

675 680 685

Gly Asn Ala Ser Asp Tyr Val Tyr Pro Glu Gly Leu Thr Arg Ile Ser

690 695 700

Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Lys Ala Ser Ser

705 710 715 720

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725 730 735

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740 745 750

Gly Gly Asn Pro Arg Leu Tyr Asp Glu Leu Ile Arg Val Ser Val Thr

755 760 765

Val Lys Asn Thr Gly Arg Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gln Leu Tyr

770 775 780

Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Val Val Leu Arg Lys Phe

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Asp Arg Leu Thr Leu Lys Pro Ser Glu Glu Thr Val Trp Thr Thr Thr

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Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ser Asn Trp Asp Val Ala Ala Gln Asp Trp

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Val Ile Thr Ser Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser Ser Ser Arg

835 840 845

Gln Leu Pro Leu His Ala Ala Leu Pro Lys Val Gln

850 855 860

<210>47

<211>3294

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>47

atgcgttcct cccccctcct ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt 60

gccgctgatg gcaggtccac ccgctactgg gactgctgca agccttcgtg cggctgggcc 120

aagaaggctc ccgtgaacca gcctgtcttt tcctgcaacg ccaacttcca gcgtatcacg 180

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980 985 990

Pro Gly Leu Tyr Glu Asp Leu Phe Arg Val Ser Val Lys Val Lys Asn

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Thr Gly Asn Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr Val Ser

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Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Val Val Leu Arg Lys Phe Glu

1025 1030 1035

Arg Ile His Leu Ala Pro Ser Gln Glu Ala Val Trp Thr Thr Thr

1040 1045 1050

Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Ser Ala Gln Asp

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Trp Thr Val Thr Pro Tyr Pro Lys Thr Ile Tyr Val Gly Asn Ser

1070 1075 1080

Ser Arg Lys Leu Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Lys Ala Gln

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<210>51

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<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>51

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<210>52

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<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>52

Met Lys Ser Phe Thr Ile Ala Ala Leu Ala Ala Leu Trp Ala Gln Glu

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Ala Ala Ala His Ala Thr Phe Gln Asp Leu Trp Ile Asp Gly Val Asp

20 25 30

Tyr Gly Ser Gln Cys Val Arg Leu Pro Ala Ser Asn Ser Pro Val Thr

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Asn Val Ala Ser Asp Asp Ile Arg Cys Asn Val Gly Thr Ser Arg Pro

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Thr Val Lys Cys Pro Val Lys Ala Gly Ser Thr Val Thr Ile Glu Met

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His Gln Gln Pro Gly Asp Arg Ser Cys Ala Asn Glu Ala Ile Gly Gly

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Val Thr Ala Asp Gly Ser Ser Gly Trp Phe Lys Val Phe Gln Asp Ser

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Thr Lys Asp Leu Asn Ser Cys Cys Gly Lys Met Asn Val Lys Ile Pro

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Glu Asp Ile Glu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Val Ile Ala

165 170 175

Leu His Val Ala Ala Ser Ser Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Met Ser Cys

180 185 190

Tyr Gln Leu Thr Val Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Pro Ser Thr Val

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Ala Gly Gly Ser Thr Lys Ser Ala Gly Ser Ser Cys Ser Gly Cys Glu

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Thr Ser Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly

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Cys Thr Ala Ala Lys Tyr Gln Gln Cys Gly Gly Thr Gly Tyr Thr Gly

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Cys Thr Thr Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Pro Pro

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325

<210>53

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<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>53

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<210>54

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<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>54

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1 5 10 15

Gly His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Pro

20 25 30

Gly Tyr Glu Gly Phe Ser Pro Ala Ser Ser Pro Pro Thr Ile Gln Tyr

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Gln Trp Pro Asp Tyr Asn Pro Thr Leu Ser Val Thr Asp Pro Lys Met

50 55 60

Arg Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Glu Leu Ser Ala Pro Val Gln Ala

65 70 75 80

Gly Glu Asn Val Thr Ala Val Trp Lys Gln Trp Thr His Gln Gln Gly

85 90 95

Pro Val Met Val Trp Met Phe Lys Cys Pro Gly Asp Phe Ser Ser Ser

100 105 110

His Gly Asp Gly Lys Gly Trp Phe Lys Ile Asp Gln Leu Gly Leu Trp

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Thr Leu Gln Trp Ser Asn Pro Ile Pro Lys Asn Leu Ala Pro Gly Asn

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Tyr Leu Ile Arg His Glu Leu Leu Ala Leu His Gln Ala Asn Thr Pro

165 170 175

Gln Phe Tyr Ala Glu Cys Ala Gln Leu Val Val Ser Gly Ser Gly Ser

180 185 190

Ala Leu Pro Pro Ser Asp Tyr Leu Tyr Ser Ile Pro Val Tyr Ala Pro

195 200 205

Gln Asn Asp Pro Gly Ile Thr Val Asp Ile Tyr Asn Gly Gly Leu Thr

210 215 220

Ser Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro Val Trp Ser Gly Phe Glu Phe Met

225 230 235 240

Arg Phe Asp Ala Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala Gly

245 250 255

His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Pro Gly

260 265 270

Tyr Glu Gly Phe Ser Pro Ala Ser Ser Pro Pro Thr Ile Gln Tyr Gln

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Asn Asn Leu Asn Ser Asn Asn Trp Gly Thr Ala Ile Val Tyr Lys Thr

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<212>DNA

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<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>56

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Ala Ala Ala His Gly Ala Val Thr Ser Tyr Ile Ile Ala Gly Lys Asn

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Gln Trp Gln Trp His Asp Tyr Asn Pro Val Leu Ser Cys Ser Asp Ser

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Lys Leu Arg Cys Asn Gly Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asn Ala Thr Ala

65 70 75 80

Ala Pro Gly Asp Thr Ile Thr Ala Ile Trp Ala Gln Trp Thr His Ser

85 90 95

Gln Gly Pro Ile Leu Val Trp Met Tyr Lys Cys Pro Gly Ser Phe Ser

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Ser Cys Asp Gly Ser Gly Ala Gly Trp Phe Lys Ile Asp Glu Ala Gly

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Gly Trp Asp Ile Ala Lys Leu Val Gly Gly Asn Lys Gln Trp Ser Ser

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Lys Val Pro Glu Gly Leu Ala Pro Gly Asn Tyr Leu Val Arg His Glu

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Tyr Lys Ala Ala Ile Pro Gly Tyr Cys Asn Gln Asn Asp Pro Asn Ile

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Gly Pro Pro Val Phe Lys Gly Thr Ala Ser Lys Lys Ala Arg Asp Phe

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Thr Ala Met Leu Leu Thr Ser Val Leu Gly Ser Ala Ala Leu Leu Ala

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275 280 285

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<212>DNA

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<213>土生梭孢壳

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Gly Val Ser Gly His Tyr Thr Trp Pro Arg Val Asn Asp Gly Ala Asp

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275 280 285

Pro Ala Pro Ser Val Leu Asn Thr Thr Ala Gly Ser Thr Val Thr Tyr

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Trp Ala Asn Pro Asp Val Tyr His Pro Gly Pro Val Gln Phe Tyr Met

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Ala Arg Val Pro Asp Gly Glu Asp Ile Asn Ser Trp Asn Gly Asp Gly

325 330 335

Ala Val Trp Phe Lys Val Tyr Glu Asp His Pro Thr Phe Gly Ala Gln

340 345 350

Leu Thr Trp Pro Ser Thr Gly Lys Ser Ser Phe Ala Val Pro Ile Pro

355 360 365

Pro Cys Ile Lys Ser Gly Tyr Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Gln Ile Gly

370 375 380

Leu His Val Ala Gln Ser Val Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys

385 390 395 400

Ala Gln Leu Ser Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Glu Pro Pro Asn Lys

405 410 415

Val Ala Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Ala Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile

420 425 430

Asn Ile Tyr Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Gln Asn Pro Gly Pro Ala

435 440 445

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<213>土生梭孢壳

<400>59

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tacatcttcc agcaactctc catcaacggg aaccagtttc cggtgtacca atatattcgc 120

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<213>土生梭孢壳

<400>60

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Val Thr Asp Leu Thr Ser Asp Asp Leu Arg Cys Asn Val Gly Ala Gln

50 55 60

Gly Ala Gly Thr Asp Thr Val Thr Val Lys Ala Gly Asp Gln Phe Thr

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Phe Thr Leu Asp Thr Pro Val Tyr His Gln Gly Pro Ile Ser Ile Tyr

85 90 95

Met Ser Lys Ala Pro Gly Ala Ala Ser Asp Tyr Asp Gly Ser Gly Gly

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165 170 175

Ile Thr Val Thr Gly Gly Gly Asn Gly Asn Pro Gly Pro Thr Ala Leu

180 185 190

Ile Pro Gly Ala Phe Lys Asp Thr Asp Pro Gly Tyr Thr Val Asn Ile

195 200 205

Tyr Thr Asn Phe His Asn Tyr Thr Val Pro Gly Pro Glu Val Phe Ser

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225 230 235 240

Pro Ala Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Thr Arg Thr Thr Ser Ser Thr

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260 265 270

Trp Gly Gln Cys Gly Gly Asn Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Thr Cys Ala

275 280 285

Ala Gly Ser Thr Cys Ser Lys Gln Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

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305 310 315 320

Ala Ser Ala His Tyr Ile Phe Gln Gln Leu Ser Ile Asn Gly Asn Gln

325 330 335

Phe Pro Val Tyr Gln Tyr Ile Arg Lys Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Pro

340 345 350

Val Thr Asp Leu Thr Ser Asp Asp Leu Arg Cys Asn Val Gly Ala Gln

355 360 365

Gly Ala Gly Thr Asp Thr Val Thr Val Lys Ala Gly Asp Gln Phe Thr

370 375 380

Phe Thr Leu Asp Thr Pro Val Tyr His Gln Gly Pro Ile Ser Ile Tyr

385 390 395 400

Met Ser Lys Ala Pro Gly Ala Ala Ser Asp Tyr Asp Gly Ser Gly Gly

405 410 415

Trp Phe Lys Ile Lys Asp Trp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr

420 425 430

Ala Thr Trp Asp Met Ala Gly Ser Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Thr Cys

435 440 445

Ile Pro Asp Gly Asp Tyr Leu Leu Arg Ile Gln Ser Leu Ala Ile His

450 455 460

Asn Pro Trp Pro Ala Gly Ile Pro Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala Gln

465 470 475 480

Ile Thr Val Thr Gly Gly Gly Asn Gly Asn Pro Gly Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ile Pro Gly Ala Phe Lys Asp Thr Asp Pro Gly Tyr Thr Val Asn Ile

500 505 510

Tyr Thr Asn Phe His Asn Tyr Thr Val Pro Gly Pro Glu Val Phe Ser

515 520 525

Cys Asn Gly Gly Gly Ser Asn Pro Pro Pro Pro Val Ser Ser Ser Thr

530 535 540

Pro Ala Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Thr Arg Thr Thr Ser Ser Thr

545 550 555 560

Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Ser Thr Gly Gly Cys Thr Val Ala Lys

565 570 575

Trp Gly Gln Cys Gly Gly Asn Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Thr Cys Ala

580 585 590

Ala Gly Ser Thr Cys Ser Lys Gln Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

595 600 605

<210>61

<211>954

<212>DNA

<213>土生梭孢壳

<400>61

atgaagggcc tcagcctcct cgccgctgcg tcggcagcga ctgctcatac catcttcgtg 60

cagctcgagt cagggggaac gacctatccg gtatcctacg gcatccggga ccctagctac 120

gacggtccca tcaccgacgt cacctccgac tcactggctt gcaatggtcc cccgaacccc 180

acgacgccgt ccccgtacat catcaacgtc accgccggca ccacggtcgc ggcgatctgg 240

aggcacaccc tcacatccgg ccccgacgat gtcatggacg ccagccacaa ggggccgacc 300

ctggcctacc tcaagaaggt cgatgatgcc ttgaccgaca cgggtatcgg cggcggctgg 360

ttcaagatcc aggaggccgg ttacgacaat ggcaattggg ctaccagcac ggtgatcacc 420

aacggtggct tccaatatat tgacatcccc gcctgcattc ccaacggcca gtatctgctc 480

cgcgccgaga tgatcgcgct ccacgccgcc agcacgcagg gtggtgccca gctctacatg 540

gagtgcgcgc agatcaacgt ggtgggcggc tccggcagcg ccagcccgca gacgtacagc 600

atcccgggca tctaccaggc aaccgacccg ggcctgctga tcaacatcta ctccatgacg 660

ccgtccagcc agtacaccat tccgggtccg cccctgttca cctgcagcgg cagcggcaac 720

aacggcggcg gcagcaaccc gtcgggcggg cagaccacga cggcgaagcc cacgacgacg 780

acggcggcga cgaccacctc ctccgccgct cctaccagca gccagggggg cagcagcggt 840

tgcaccgttc cccagtggca gcagtgcggt ggcatctcgt tcaccggctg caccacctgc 900

gcggcgggct acacctgcaa gtatctgaac gactattact cgcaatgcca gtaa 954

<210>62

<211>317

<212>PRT

<213>土生梭孢壳

<400>62

Met Lys Gly Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ala Thr Ala His

1 5 10 15

Thr Ile Phe Val Gln Leu Glu Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Pro Val Ser

20 25 30

Tyr Gly Ile Arg Asp Pro Ser Tyr Asp Gly Pro Ile Thr Asp Val Thr

35 40 45

Ser Asp Ser Leu Ala Cys Asn Gly Pro Pro Asn Pro Thr Thr Pro Ser

50 55 60

Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Ala Gly Thr Thr Val Ala Ala Ile Trp

65 70 75 80

Arg His Thr Leu Thr Ser Gly Pro Asp Asp Val Met Asp Ala Ser His

85 90 95

Lys Gly Pro Thr Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asp Asp Ala Leu Thr

100 105 110

Asp Thr Gly Ile Gly Gly Gly Trp Phe Lys Ile Gln Glu Ala Gly Tyr

115 120 125

Asp Asn Gly Asn Trp Ala Thr Ser Thr Val Ile Thr Asn Gly Gly Phe

130 135 140

Gln Tyr Ile Asp Ile Pro Ala Cys Ile Pro Asn Gly Gln Tyr Leu Leu

145 150 155 160

Arg Ala Glu Met Ile Ala Leu His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Ala

165 170 175

Gln Leu Tyr Met Glu Cys Ala Gln Ile Asn Val Val Gly Gly Ser Gly

180 185 190

Ser Ala Ser Pro Gln Thr Tyr Ser Ile Pro Gly Ile Tyr Gln Ala Thr

195 200 205

Asp Pro Gly Leu Leu Ile Asn Ile Tyr Ser Met Thr Pro Ser Ser Gln

210 215 220

Tyr Thr Ile Pro Gly Pro Pro Leu Phe Thr Cys Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Asn Gly Gly Gly Ser Asn Pro Ser Gly Gly Gln Thr Thr Thr Ala Lys

245 250 255

Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ser Ser Ala Ala Pro Thr

260 265 270

Ser Ser Gln Gly Gly Ser Ser Gly Cys Thr Val Pro Gln Trp Gln Gln

275 280 285

Cys Gly Gly Ile Ser Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Tyr

290 295 300

Thr Cys Lys Tyr Leu Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Gln

305 310 315

<210>63

<211>799

<212>DNA

<213>橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)

<400>63

atgtcctttt ccaagataat tgctactgcc ggcgttcttg cctctgcttc tctagtggct 60

ggccatggct tcgttcagaa catcgtgatt gatggtaaaa agtatgtcat tgcaagacgc 120

acataagcgg caacagctga caatcgacag ttatggcggg tatctagtga accagtatcc 180

atacatgtcc aatcctccag aggtcatcgc ctggtctact acggcaactg atcttggatt 240

tgtggacggt actggatacc aaaccccaga tatcatctgc cataggggcg ccaagcctgg 300

agccctgact gctccagtct ctccaggagg aactgttgag cttcaatgga ctccatggcc 360

tgattctcac catggcccag ttatcaacta ccttgctccg tgcaatggtg attgttccac 420

tgtggataag acccaattag aattcttcaa aattgccgag agcggtctca tcaatgatga 480

caatcctcct gggatctggg cttcagacaa tctgatagca gccaacaaca gctggactgt 540

caccattcca accacaattg cacctggaaa ctatgttctg aggcatgaga ttattgctct 600

tcactcagct cagaaccagg atggtgccca gaactatccc cagtgcatca atctgcaggt 660

cactggaggt ggttctgata accctgctgg aactcttgga acggcactct accacgatac 720

cgatcctgga attctgatca acatctatca gaaactttcc agctatatca tccctggtcc 780

tcctctgtat actggttaa 799

<210>64

<211>250

<212>PRT

<213>橙色嗜热子囊菌

<400>64

Met Ser Phe Ser Lys Ile Ile Ala Thr Ala Gly Val Leu Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ser Leu Val Ala Gly His Gly Phe Val Gln Asn Ile Val Ile Asp Gly

20 25 30

Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Tyr Leu Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser

35 40 45

Asn Pro Pro Glu Val Ile Ala Trp Ser Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly

50 55 60

Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr Gln Thr Pro Asp Ile Ile Cys His Arg

65 70 75 80

Gly Ala Lys Pro Gly Ala Leu Thr Ala Pro Val Ser Pro Gly Gly Thr

85 90 95

Val Glu Leu Gln Trp Thr Pro Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val

100 105 110

Ile Asn Tyr Leu Ala Pro Cys Asn Gly Asp Cys Ser Thr Val Asp Lys

115 120 125

Thr Gln Leu Glu Phe Phe Lys Ile Ala Glu Ser Gly Leu Ile Asn Asp

130 135 140

Asp Asn Pro Pro Gly Ile Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Ala Asn

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile Pro Thr Thr Ile Ala Pro Gly Asn Tyr

165 170 175

Val Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gln Asn Gln Asp

180 185 190

Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Leu Gln Val Thr Gly Gly

195 200 205

Gly Ser Asp Asn Pro Ala Gly Thr Leu Gly Thr Ala Leu Tyr His Asp

210 215 220

Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile Tyr Gln Lys Leu Ser Ser Tyr

225 230 235 240

Ile Ile Pro Gly Pro Pro Leu Tyr Thr Gly

245 250

<210>65

<211>1172

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>65

ggatctaagc cccatcgata tgaagtcctg cgccattctt gcagcccttg gctgtcttgc 60

cgggagcgtt ctcggccatg gacaagtcca aaacttcacg atcaatggac aatacaatca 120

gggtttcatt ctcgattact actatcagaa gcagaatact ggtcacttcc ccaacgttgc 180

tggctggtac gccgaggacc tagacctggg cttcatctcc cctgaccaat acaccacgcc 240

cgacattgtc tgtcacaaga acgcggcccc aggtgccatt tctgccactg cagcggccgg 300

cagcaacatc gtcttccaat ggggccctgg cgtctggcct cacccctacg gtcccatcgt 360

tacctacgtg gctgagtgca gcggatcgtg cacgaccgtg aacaagaaca acctgcgctg 420

ggtcaagatt caggaggccg gcatcaacta taacacccaa gtctgggcgc agcaggatct 480

gatcaaccag ggcaacaagt ggactgtgaa gatcccgtcg agcctcaggc ccggaaacta 540

tgtcttccgc catgaacttc ttgctgccca tggtgcctct agtgcgaacg gcatgcagaa 600

ctatcctcag tgcgtgaaca tcgccgtcac aggctcgggc acgaaagcgc tccctgccgg 660

aactcctgca actcagctct acaagcccac tgaccctggc atcttgttca acccttacac 720

aacaatcacg agctacacca tccctggccc agccctgtgg caaggctaga tccaggggta 780

cggtgttggc gttcgtgaag tcggagctgt tgacaaggat atctgatgat gaacggagag 840

gactgatggg cgtgactgag tgtatatatt tttgatgacc aaattgtata cgaaatccga 900

acgcatggtg atcattgttt atccctgtag tatattgtct ccaggctgct aagagcccac 960

cgggtgtatt acggcaacaa agtcaggaat ttgggtggca atgaacgcag gtctccatga 1020

atgtatatgt gaagaggcat cggctggcat gggcattacc agatataggc cctgtgaaac 1080

atatagtact tgaacgtgct actggaacgg atcataagca agtcatcaac atgtgaaaaa 1140

acactacatg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1172

<210>66

<211>249

<212>PRT

<213>里氏木霉

<400>66

Met Lys Ser Cys Ala Ile Leu Ala Ala Leu Gly Cys Leu Ala Gly Ser

1 5 10 15

Val Leu Gly His Gly Gln Val Gln Asn Phe Thr Ile Asn Gly Gln Tyr

20 25 30

Asn Gln Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr Tyr Gln Lys Gln Asn Thr Gly

35 40 45

His Phe Pro Asn Val Ala Gly Trp Tyr Ala Glu Asp Leu Asp Leu Gly

50 55 60

Phe Ile Ser Pro Asp Gln Tyr Thr Thr Pro Asp Ile Val Cys His Lys

65 70 75 80

Asn Ala Ala Pro Gly Ala Ile Ser Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ser Asn

85 90 95

Ile Val Phe Gln Trp Gly Pro Gly Val Trp Pro His Pro Tyr Gly Pro

100 105 110

Ile Val Thr Tyr Val Val Glu Cys Ser Gly Ser Cys Thr Thr Val Asn

115 120 125

Lys Asn Asn Leu Arg Trp Val Lys Ile Gln Glu Ala Gly Ile Asn Tyr

130 135 140

Asn Thr Gln Val Trp Ala Gln Gln Asp Leu Ile Asn Gln Gly Asn Lys

145 150 155 160

Trp Thr Val Lys Ile Pro Ser Ser Leu Arg Pro Gly Asn Tyr Val Phe

165 170 175

Arg His Glu Leu Leu Ala Ala His Gly Ala Ser Ser Ala Asn Gly Met

180 185 190

Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Val Asn Ile Ala Val Thr Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Pro Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Pro Thr

210 215 220

Asp Pro Gly Ile Leu Phe Asn Pro Tyr Thr Thr Ile Thr Ser Tyr Thr

225 230 235 240

Ile Pro Gly Pro Ala Leu Trp Gln Gly

245

<210>67

<211>38

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>67

actggattta ccatgaacaa gtccgtggct ccattgct 38

<210>68

<211>38

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>68

tcacctctag ttaattaact actttcttgc gagacacg 38

<210>69

<211>29

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>69

aacgttaatt aaggaatcgt tttgtgttt 29

<210>70

<211>29

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>70

agtactagta gctccgtggc gaaagcctg 29

<210>71

<211>31

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>71

ttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c 31

<210>72

<211>25

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>72

ttgcatgcgt aatcatggtc atagc 25

<210>73

<211>26

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>73

ttgaattcat gggtaataac tgatat 26

<210>74

<211>32

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>74

aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt 32

<210>75

<211>11

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>75

gtactaaaac c 11

<210>76

<211>11

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>76

ccgttaaatt t 11

<210>77

<211>45

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>77

ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc 45

<210>78

<211>14

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>78

atgcaattta aact 14

<210>79

<211>14

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>79

cggcaattta acgg 14

<210>80

<211>44

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>80

ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc 44

<210>81

<211>29

<212>DNA

<213>特异腐质霉

<400>81

aagcttaagc atgcgttcct cccccctcc 29

<210>82

<211>32

<212>DNA

<213>特异腐质霉

<400>82

ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag 32

<210>83

<211>32

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>83

ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag 32

<210>84

<211>36

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>84

accgcggact gcgcatcatg cgttcctccc ccctcc 36

<210>85

<211>29

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>85

aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 29

<210>86

<211>17

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>86

gatgcgcagt ccgcggt 17

<210>87

<211>29

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>87

aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 29

<210>88

<211>36

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>88

ggagggggga ggaacgcatg atgcgcagtc cgcggt 36

<210>89

<211>29

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>89

aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 29

<210>90

<211>32

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>90

ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag 32

<210>91

<211>46

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>91

atagtcaacc gcggactgcg catcatgaag cttggttgga tcgagg 46

<210>92

<211>26

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>92

actagt ttac tgggccttag gcagcg 26

<210>93

<211>26

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>93

gtcgactcga agcccgaatg taggat 26

<210>94

<211>45

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>94

cctcgatcca accaagcttc atgatgcgca gtccgcggtt gacta 45

<210>95

<211>57

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>95

atgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cctcagtagt cagtgcc 57

<210>96

<211>19

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>96

Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Val Ser Ala

<210>97

<211>42

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>97

tgccggtgtt ggcccttgcc aaggatgatc tcgcgtactc cc 42

<210>98

<211>28

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>98

gactagtctt actgggcctt aggcagcg 28

<210>99

<211>63

<212>DNA

<213>特异腐质霉

<400>99

atgcgttcct cccccctcct ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt 60

gcc 63

<210>100

<211>21

<212>PRT

<213>特异腐质霉

<400>100

Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro

1 5 10 15

Val Leu Ala Leu Ala

20

<210>101

<211>30

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>101

acgcgtcgac cgaatgtagg attgttatcc 30

<210>102

<211>42

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>102

gggagtacgc gagatcatcc ttggcaaggg ccaacaccgg ca 42

<210>103

<211>2586

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>103

atgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cctcagtagt cagtgccaag 60

gatgatctcg cgtactcccc tcctttctac ccttccccat gggcagatgg tcagggtgaa 120

tgggcggaag tatacaaacg cgctgtagac atagtttccc agatgacgtt gacagagaaa 180

gtcaacttaa cgactggaac aggatggcaa ctagagaggt gtgttggaca aactggcagt 240

gttcccagac tcaacatccc cagcttgtgt ttgcaggata gtcctcttgg tattcgtttc 300

tcggactaca attcagcttt ccctgcgggt gttaatgtcg ctgccacctg ggacaagacg 360

ctcgcctacc ttcgtggtca ggcaatgggt gaggagttca gtgataaggg tattgacgtt 420

cagctgggtc ctgctgctgg ccctctcggt gctcatccgg atggcggtag aaactgggaa 480

ggtttctcac cagatccagc cctcaccggt gtactttttg cggagacgat taagggtatt 540

caagatgctg gtgtcattgc gacagctaag cattatatca tgaacgaaca agagcatttc 600

cgccaacaac ccgaggctgc gggttacgga ttcaacgtaa gcgacagttt gagttccaac 660

gttgatgaca agactatgca tgaattgtac ctctggccct tcgcggatgc agtacgcgct 720

ggagtcggtg ctgtcatgtg ctcttacaac caaatcaaca acagctacgg ttgcgagaat 780

agcgaaactc tgaacaagct tttgaaggcg gagcttggtt tccaaggctt cgtcatgagt 840

gattggaccg ctcatcacag cggcgtaggc gctgctttag caggtctgga tatgtcgatg 900

cccggtgatg ttaccttcga tagtggtacg tctttctggg gtgcaaactt gacggtcggt 960

gtccttaacg gtacaatccc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg tatcatggcc 1020

gcttattaca aggttggccg cgacaccaaa tacacccctc ccaacttcag ctcgtggacc 1080

agggacgaat atggtttcgc gcataaccat gtttcggaag gtgcttacga gagggtcaac 1140

gaattcgtgg acgtgcaacg cgatcatgcc gacctaatcc gtcgcatcgg cgcgcagagc 1200

actgttctgc tgaagaacaa gggtgccttg cccttgagcc gcaaggaaaa gctggtcgcc 1260

cttctgggag aggatgcggg ttccaactcg tggggcgcta acggctgtga tgaccgtggt 1320

tgcgataacg gtacccttgc catggcctgg ggtagcggta ctgcgaattt cccatacctc 1380

gtgacaccag agcaggcgat tcagaacgaa gttcttcagg gccgtggtaa tgtcttcgcc 1440

gtgaccgaca gttgggcgct cgacaagatc gctgcggctg cccgccaggc cagcgtatct 1500

ctcgtgttcg tcaactccga ctcaggagaa ggctatctta gtgtggatgg aaatgagggc 1560

gatcgtaaca acatcactct gtggaagaac ggcgacaatg tggtcaagac cgcagcgaat 1620

aactgtaaca acaccgttgt catcatccac tccgtcggac cagttttgat cgatgaatgg 1680

tatgaccacc ccaatgtcac tggtattctc tgggctggtc tgccaggcca ggagtctggt 1740

aactccattg ccgatgtgct gtacggtcgt gtcaaccctg gcgccaagtc tcctttcact 1800

tggggcaaga cccgggagtc gtatggttct cccttggtca aggatgccaa caatggcaac 1860

ggagcgcccc agtctgattt cacccagggt gttttcatcg attaccgcca tttcgataag 1920

ttcaatgaga cccctatcta cgagtttggc tacggcttga gctacaccac cttcgagctc 1980

tccgacctcc atgttcagcc cctgaacgcg tcccgataca ctcccaccag tggcatgact 2040

gaagctgcaa agaactttgg tgaaattggc gatgcgtcgg agtacgtgta tccggagggg 2100

ctggaaagga tccatgagtt tatctatccc tggatcaact ctaccgacct gaaggcatcg 2160

tctgacgatt ctaactacgg ctgggaagac tccaagtata ttcccgaagg cgccacggat 2220

gggtctgccc agccccgttt gcccgctagt ggtggtgccg gaggaaaccc cggtctgtac 2280

gaggatcttt tccgcgtctc tgtgaaggtc aagaacacgg gcaatgtcgc cggtgatgaa 2340

gttcctcagc tgtacgtttc cctaggcggc ccgaatgagc ccaaggtggt actgcgcaag 2400

tttgagcgta ttcacttggc cccttcgcag gaggccgtgt ggacaacgac ccttacccgt 2460

cgtgaccttg caaactggga cgtttcggct caggactgga ccgtcactcc ttaccccaag 2520

acgatctacg ttggaaactc ctcacggaaa ctgccgctcc aggcctcgct gcctaaggcc 2580

cagtaa 2586

<210>104

<211>861

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>104

Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Val Ser Ala Lys Asp Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser

20 25 30

Pro Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala

35 40 45

Val Asp Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Thr Glu Lys Val Asn Leu Thr

50 55 60

Thr Gly Thr Gly Trp Gln Leu Glu Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser

65 70 75 80

Val Pro Arg Leu Asn Ile Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu

85 90 95

Gly Ile Arg Phe Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn

100 105 110

Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala

115 120 125

Met Gly Glu Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro

130 135 140

Ala Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu

145 150 155 160

Gly Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr

165 170 175

Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr

180 185 190

Ile Met Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly

195 200 205

Tyr Gly Phe Asn Val Ser Asp Ser Leu Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys

210 215 220

Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala

225 230 235 240

Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr

245 250 255

Gly Cys Glu Asn Ser Glu Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu

260 265 270

Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Thr Ala His His Ser Gly

275 280 285

Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val

290 295 300

Thr Phe Asp Ser Gly Thr Ser Phe Trp Gly Ala Asn Leu Thr Val Gly

305 310 315 320

Val Leu Asn Gly Thr Ile Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val

325 330 335

Arg Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Thr Lys Tyr Thr

340 345 350

Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Ala His

355 360 365

Asn His Val Ser Glu Gly Ala Tyr Glu Arg Val Asn Glu Phe Val Asp

370 375 380

Val Gln Arg Asp His Ala Asp Leu Ile Arg Arg Ile Gly Ala Gln Ser

385 390 395 400

Thr Val Leu Leu Lys Asn Lys Gly Ala Leu Pro Leu Ser Arg Lys Glu

405 410 415

Lys Leu Val Ala Leu Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Ser Trp Gly

420 425 430

Ala Asn Gly Cys Asp Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met

435 440 445

Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu

450 455 460

Gln Ala Ile Gln Asn Glu Val Leu Gln Gly Arg Gly Asn Val Phe Ala

465 470 475 480

Val Thr Asp Ser Trp Ala Leu Asp Lys Ile Ala Ala Ala Ala Arg Gln

485 490 495

Ala Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ser Asp Ser Gly Glu Gly Tyr

500 505 510

Leu Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Asn AsnIle Thr Leu Trp

515 520 525

Lys Asn Gly Asp Asn Val Val Lys Thr Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn

530 535 540

Thr Val Val Ile Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Glu Trp

545 550 555 560

Tyr Asp His Pro Asn Val Thr Gly Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly

565 570 575

Gln Glu Ser Gly Asn Ser Ile Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn

580 585 590

Pro Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr

595 600 605

Gly Ser Pro Leu Val Lys Asp Ala Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln

610 615 620

Ser Asp Phe Thr Gln Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys

625 630 635 640

Phe Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr

645 650 655

Thr Phe Glu Leu Ser Asp Leu His Val Gln Pro Leu Asn Ala Ser Arg

660 665 670

Tyr Thr Pro Thr Ser Gly Met Thr Glu Ala Ala Lys Asn Phe Gly Glu

675 680 685

Ile Gly Asp Ala Ser Glu Tyr Val Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Arg Ile

690 695 700

His Glu Phe Ile Tyr Pro Trp Ile Asn Ser Thr Asp Leu Lys Ala Ser

705 710 715 720

Ser Asp Asp Ser Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Lys Tyr Ile Pro Glu

725 730 735

Gly Ala Thr Asp Gly Ser Ala Gln Pro Arg Leu Pro Ala Ser Gly Gly

740 745 750

Ala Gly Gly Asn Pro Gly Leu Tyr Glu Asp Leu Phe Arg Val Ser Val

755 760 765

Lys Val Lys Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu

770 775 780

Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Val Val Leu Arg Lys

785 790 795 800

Phe Glu Arg Ile His Leu Ala Pro Ser Gln Glu Ala Val Trp Thr Thr

805 810 815

Thr Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Ser Ala Gln Asp

820 825 830

Trp Thr Val Thr Pro Tyr Pro Lys Thr Ile Tyr Val Gly Asn Ser Ser

835 840 845

Arg Lys Leu Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Lys Ala Gln

850 855 860

<210>105

<211>20

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>105

cccaagctta gccaagaaca 20

<210>106

<211>29

<212>DNA

<213>里氏木霉

<400>106

gggggaggaa cgcatgggat ctggacggc 29

<210>107

<211>30

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>107

gccgtccaga tccccatgcg ttcctccccc 30

<210>108

<211>20

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>108

ccaagcttgt tcagagtttc 20

<210>109

<211>20

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>109

ggactgcgca gcatgcgttc 20

<210>110

<211>30

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>110

agttaattaa ttactgggcc ttaggcagcg 30

<210>111

<211>28

<212>DNA

<213>橙色嗜热子囊菌

<400>111

atgtcctttt ccaagataat tgctactg 28

<210>112

<211>26

<212>DNA

<213>橙色嗜热子囊菌

<400>112

gcttaattaa ccagtataca gaggag 26

Claims

1.一种产生氧化还原活性金属阳离子减少的纤维素材料的方法，所述氧化还原活性金属阳离子具有范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原电势(E^o)，所述方法包括用有效量的螯合剂处理所述纤维素材料以减少所述氧化还原活性金属阳离子对酶降解或转化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

2.权利要求1所述的方法，其中螯合剂的有效量为每kg干纤维素材料优选约0.01mM到约1M，更优选约0.1mM到约0.1M，并且最优选约1mM到约10mM的范围。

3.权利要求1或2所述的方法，其中用所述螯合剂对所述纤维素材料的处理在优选约1到约11，更优选约3到约9，并且最优选约5到约7的范围内的pH进行。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中用所述螯合剂对所述纤维素材料的处理在优选约5℃到约200℃，更优选约20℃到约80℃，并且最优选约40℃到约60℃的范围内的温度进行。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中氧化剂的有效量为每kg干纤维素材料优选约0.01到约100g，更优选约0.05到约50g，并且最优选约0.5到约5g的范围。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中用所述氧化剂对所述纤维素材料的处理在优选约1到约11，更优选约3到约9，并且最优选约5到约7的范围内的pH进行。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中用所述氧化剂对所述纤维素材料的处理在优选约5℃到约200℃，更优选约20℃到约80℃，并且最优选约40℃到约60℃的范围内的温度进行。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在预处理之前、之中和/或之后和/或在糖化过程中和/或在发酵过程中将所述纤维素材料用所述螯合剂、所述氧化剂或其组合处理。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述螯合剂选自下组：柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、醛糖酸、糖醛酸、乙二胺四乙酸、氨三乙酸、烷基次膦酸、硫代次膦酸、焦磷酸、肌醇六磷酸、植物螯合肽、铁载体、沸石、木质素及其组合。

10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述氧化剂选自下组：O₂、臭氧(O₃)、氯(Cl₂)、溴(Br₂)、过氧化氢(H₂O₂)、无机过氧化物、有机过氧化物、过酸、次氯酸钠(NaOCl)、二氧化氯(ClO₂)、一氧化氮(NO)、高锰酸钾(KMnO₄)、硝酸盐(NO₃ ^-)、亚硝酸盐(NO₂ ^-)及其组合。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中将所述纤维素材料在用所述螯合剂处理之前或同时用所述氧化剂处理。

12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述氧化还原活性金属阳离子选自下组：Fe(II)、Fe(III)、Cu(II)、Cr(III)和Ru(III)。

13.一种降解或转化纤维素材料的方法，包括：用有效量的纤维素分解酶组合物处理所述纤维素材料，其中将所述纤维素材料用有效量的螯合剂处理以减少具有范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原电势(E^o)的氧化还原活性金属阳离子对用所述纤维素分解酶组合物酶降解或转化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

14.权利要求13所述的方法，其中在预处理之前、之中和/或之后和/或在降解或转化所述纤维素材料过程中将所述纤维素材料用所述螯合剂、所述氧化剂或其组合处理。

15.权利要求13或14所述的方法，其中螯合剂的有效量为每kg干纤维素材料优选约0.01mM到约1M，更优选约0.1mM到约0.1M，并且最优选约1mM到约10mM的范围。

16.权利要求13-15中任一项所述的方法，其中用所述螯合剂对所述纤维素材料的处理在优选约1到约11，更优选约3到约9，并且最优选约5到约7的范围内的pH进行。

17.权利要求13-16中任一项所述的方法，其中用所述螯合剂对所述纤维素材料的处理在优选约5℃到约200℃，更优选约20℃到约80℃，并且最优选约40℃到约60℃的范围内的温度进行。

18.权利要求13-17中任一项所述的方法，其中氧化剂的有效量为每kg干纤维素材料优选约0.01到约100g，更优选约0.05到约50g，并且最优选约0.5到约5g的范围。

19.权利要求13-18中任一项所述的方法，其中用所述氧化剂对所述纤维素材料的处理在优选约1到约11，更优选约3到约9，并且最优选约5到约7的范围内的pH进行。

20.权利要求13-19中任一项所述的方法，其中用所述氧化剂对所述纤维素材料的处理在优选约5℃到约200℃，更优选约20℃到约80℃，并且最优选约40℃到约60℃的范围内的温度进行。

21.权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶活性的多肽。

22.权利要求21所述的方法，其中所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。

23.权利要求21或22所述的方法，其中所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。

24.权利要求13-23中任一项所述的方法，进一步包括回收降解的纤维素材料。

25.权利要求24所述的方法，其中所述降解的纤维素材料为糖。

26.权利要求13-25中任一项所述的方法，其中所述螯合剂选自下组：柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、醛糖酸、糖醛酸、乙二胺四乙酸、氨三乙酸、烷基次膦酸、硫代次膦酸、焦磷酸、肌醇六磷酸、植物螯合肽、铁载体、沸石、木质素及其组合。

27.权利要求13-26中任一项所述的方法，其中所述氧化剂选自下组：O₂、臭氧(O₃)、氯(Cl₂)、溴(Br₂)、过氧化氢(H₂O₂)、无机过氧化物、有机过氧化物、过酸、次氯酸钠(NaOCl)、二氧化氯(ClO₂)、一氧化氮(NO)、高锰酸钾(KMnO₄)、硝酸盐(NO₃ ^-)、亚硝酸盐(NO₂ ^-)及其组合。

28.权利要求13-27中任一项所述的方法，其中将所述纤维素材料在用所述螯合剂处理之前或同时用所述氧化剂处理。

29.权利要求13-28中任一项所述的方法，其中所述氧化还原活性金属阳离子选自下组：Fe(II)、Fe(III)、Cu(II)、Cr(III)和Ru(III)。

30.一种产生发酵产物的方法，包括：(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的步骤(a)的纤维素材料以产生发酵产物；以及(c)回收发酵产物，其中用有效量的螯合剂处理所述纤维素材料以减少具有范围为约-0.4到约1.2伏的氧化还原电势(E^o)的氧化还原活性金属阳离子对酶糖化所述纤维素材料的抑制作用，并且可选地还在当所述氧化还原活性金属阳离子具有低价状态时用有效量的氧化剂处理所述纤维素材料以将所述氧化还原活性金属阳离子转化为高价状态，以优先螯合所述氧化还原活性金属阳离子。

31.权利要求30所述的方法，其中所述纤维素材料在糖化步骤前经预处理。

32.权利要求30或31所述的方法，其中在预处理之前、之中和/或之后和/或在糖化过程中和/或在发酵过程中将所述纤维素材料用所述螯合剂、所述氧化剂或其组合处理。

33.权利要求30-32中任一项所述的方法，其中螯合剂的有效量为每kg干纤维素材料优选约0.01mM到约1M，更优选约0.1mM到约0.1M，并且最优选约1mM到约10mM的范围。

34.权利要求30-33中任一项所述的方法，其中用所述螯合剂对所述纤维素材料的处理在优选约1到约11，更优选约3到约9，并且最优选约5到约7的范围内的pH进行。

35.权利要求30-34中任一项所述的方法，其中用所述螯合剂对所述纤维素材料的处理在优选约5℃到约200℃，更优选约30℃到约70℃，并且最优选约40℃到约60℃的范围内的温度进行。

36.权利要求30-35中任一项所述的方法，其中氧化剂的有效量为每kg干纤维素材料优选约0.01到约100g，更优选约0.05到约50g，并且最优选约0.5到约5g的范围。

37.权利要求30-36中任一项所述的方法，其中用所述氧化剂对所述纤维素材料的处理在优选约1到约11，更优选约3到约9，并且最优选约5到约7的范围内的pH进行。

38.权利要求30-37中任一项所述的方法，其中用所述氧化剂对所述纤维素材料的处理在优选约5℃到约200℃，更优选约20℃到约80℃，并且最优选约40℃到约60℃的范围内的温度进行。

39.权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解酶组合物包含具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶活性的多肽。

40.权利要求39所述的方法，其中所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。

41.权利要求39或40所述的方法，其中所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。

42.权利要求30-41中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化与发酵过程中是同时进行的。

43.权利要求30-42中任一项所述的方法，其中所述发酵产物为醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

44.权利要求30-43中任一项所述的方法，其中所述螯合剂选自下组：柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、醛糖酸、糖醛酸、乙二胺四乙酸、氨三乙酸、烷基次膦酸、硫代次膦酸、焦磷酸、肌醇六磷酸、植物螯合肽、铁载体、沸石、木质素及其组合。

45.权利要求30-44中任一项所述的方法，其中所述氧化剂选自下组：O₂、臭氧(O₃)、氯(Cl₂)、溴(Br₂)、过氧化氢(H₂O₂)、无机过氧化物、有机过氧化物、过酸、次氯酸钠(NaOCl)、二氧化氯(ClO₂)、一氧化氮(NO)、高锰酸钾(KMnO₄)、硝酸盐(NO₃ ^-)、亚硝酸盐(NO₂ ^-)及其组合。

46.权利要求30-45中任一项所述的方法，其中将所述纤维素材料在用所述螯合剂处理之前或同时用所述氧化剂处理。

47.权利要求30-46中任一项所述的方法，其中所述氧化还原活性金属阳离子选自下组：Fe(II)、Fe(III)、Cu(II)、Cr(III)和Ru(III)。