CN101949854B - 一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法。待测样品粉碎后置于烧杯中，加入萃取剂振摇或超声萃取。过滤，滤液水浴蒸发，定容后得供试品。在薄层硅胶板上分别点加同量的供试品和黄曲霉毒素B1标准品，并在样点中点加衍生试剂，再分别用展开剂展开。在紫外光灯下对两者的荧光强弱进行比较，以判断供试品中黄曲霉毒素的含量是否超标。本发明溶剂用量小，样品处理简单，测定时间短。不需要专业人员，只需配制小型仪器设备，特别适合现场快速检测。有效克服了三氟乙酸对操作者及环境的危害及污染，提高了方法灵敏度，其最低检出量0.00032μg，最低检出限3μg/kg。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检验技术领域，具体涉及一种快速检测食品、饲料中黄曲霉毒素残留含量的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。当粮食未能及时晒干及储藏不当时，往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素。在湿热地区的食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率很高。黄曲霉毒素主要污染饲料、粮油食品、动植物食品等；如饲料、花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果、辣椒类等中均会有黄曲霉毒素污染。其中以饲料、辣椒、花生和玉米污染最严重。而当人们误食了被黄曲霉毒素污染的食物后会对身体健康产生危害。目前，对于黄曲霉毒素污染的提前预防还比较困难。因此，如何对各种食品原材料中的黄曲霉毒素残留进行快速检测，从源头上避免黄曲霉毒素进入生产和消费环节就显得尤为重要。
现有技术中，黄曲霉毒素的快速检测方法主要为酶联免疫法，饲料企业、食品加工企业中所用的检测试剂盒大多是ELISA快速检测试剂盒。但该类试剂盒还存在检测花费高，检测步骤较复杂等问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的快速检测黄曲霉毒素含量的方法，在保证检测准确度和检测安全性的同时，降低检测成本，缩短检测时间。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法，包括以下步骤：
1、将待测样品粉碎后称取0.5～50g置于烧杯中，加入萃取剂10～100ml，振摇2～10min或超声萃取3～30min；所述的萃取剂为三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇、苯、异丁醇、异丙醇、甲基乙基酮、乙酸乙酯、四氢呋喃甲基异丁醇、醋酸丁酯、丙酮、乙腈或是甲醇浓度≥20％的甲醇乙腈混合物中的一种；
待测样品的称取质量按下式确定：待测样品质量＝(黄曲霉毒素B1标准品浓度μg/ml×供试品体积ml)/黄曲霉毒素的限量标准；其中，黄曲霉毒素的限量标准参考GB 13078-2001《饲料卫生标准》和GB 2715-2005《粮食卫生标准》；黄曲霉毒素B 1标准品浓度为0.02～1μg/ml。
所述的待测样品为饲料、花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果或辣椒类中的一种。
将待测样品粉碎至过20目筛网。
2、萃取物过滤后固液分离，滤液在水浴45～85℃下浓缩、挥发，定容至1～5ml得供试品；
3、在长度≥8cm的薄层硅胶板上分别点加同量的供试品和黄曲霉毒素B1标准品，然后分别在供试品和黄曲霉毒素B1标准品样点中点加5～30μl的衍生试剂；所述的衍生试剂为醋酸、盐酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、抗坏血酸、水杨酸、苹果酸或柠檬酸中的一种；其中，盐酸、硝酸和硫酸的浓度为体积百分数0.5～20％，其余酸的浓度为体积百分数0.5～50％；然后将薄层硅胶板上的供试品和黄曲霉毒素B1标准品用展开剂展开；
所述的展开方式为二次展开，展开剂分为1号展开剂和2号展开剂，其中，1号展开剂为乙醚、石油醚、己烷、环己烷或四氯化碳中的一种，2号展开剂为苯-丙酮、氯仿-丙酮、环己烷-乙酸乙酯或苯-乙酸乙酯的一种；二次展开的具体操作方式有两种：一种是：先使用1号展开剂竖向展开，然后再使用2号展开剂竖向展开，1号展开剂展开直径≥5cm，2号展开剂展开直径比1号展开剂展开直径小0.3～1.5cm；另一种是：先用1号展开剂横向展开，再用2号展开剂竖向展开；
所述的供试品与黄曲霉毒素B1标准品点样总量相同，样点大小保持一致，直径在0.2～0.6cm；点样一次性点完或是少量多次点完；
4、待供试品和黄曲霉毒素标准品B1挥干后，在波长300～400nm紫外灯下对两者的荧光强弱进行比较，衍生后黄曲霉毒素B1为蓝紫色，如果供试品样点出现与黄曲霉毒素标准品B1颜色相同、比移值相同的荧光条带，且供试品的荧光强度强于黄曲霉毒素标准品B1，则表示供试品中黄曲霉毒素含量超标，否则即为合格。
本发明相对于现有技术具有以下优点：
(1)溶剂用量小，环境污染小，样品处理简单。整个测定时间在20～30min/样次，可以批量测定样品。
(2)不需要专业人员，只需配制小型仪器设备(紫外灯，微量注射器等)，携带方便，可进行现场快速检测。
(3)检测方法灵活，样品质量的确定和标准品的选择可以根据情况而定。
(4)不再局限于使用现行国家标准中推荐的三氟乙酸作为衍生剂，带来两个明显的好处，一是克服了三氟乙酸对操作者及环境的危害及污染，二是提高了方法灵敏度，降低了检测限，本方法黄曲霉毒素B1最低检出量0.00032μg，最低检出限3μg/kg。
本发明与国家标准中的薄层色谱法的详细比较可见表一：
附图说明
图1为本发明快速检测黄曲霉毒素含量方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但它们不是对本发明的限定。
实施例1
检测仔猪前期配合饲料中黄曲霉毒素B1是否超标。根据GB13078-2001《饲料卫生标准》中规定肉用仔猪配合饲料及浓缩饲料≤10μg/kg。样品Mg计算公式：Mg＝(0.04μg/ml×1ml)/10μg/kg，Mg＝4g。取磨细过20目筛网待测样品4g至于100ml烧杯中，加入10ml三氯甲烷溶液振摇2min，用定性滤纸过滤。滤液水浴70℃加热浓缩、挥发至0.5ml左右，用三氯甲烷定容至1ml(简称供试品)。在长度为10cm的薄层硅胶板上点加供试品和黄曲霉毒素B1标准品各30μl(每次点样5μl，共点样6次)，再点加浓度为重量体积百分数1.5％的草酸10μl作为衍生试剂。挥干后放入盛有溶剂乙醚层析缸中进行一次展开，当溶剂前沿展开5cm时，换用氯仿∶丙酮(92∶8)进行二次展开，展开4cm。取出薄层板晾干。在365nm波长紫外灯下观察，供试品没有出现蓝色荧光条带。说明：仔猪前期配合饲料中黄曲霉毒素B1没有超标。
实施例2
检测212生长鸡中期配合饲料中黄曲霉毒素B1是否超标。根据GB13078-2001《饲料卫生标准》中规定肉用仔鸡后期、生长鸡、产蛋鸡配合饲料及浓缩饲料≤20μg/kg。样品Mg计算公式：Mg＝(0.20μg/ml×1ml)/20μg/kg，Mg＝10g。取磨细过20目筛网待测样品10g至于100ml烧杯中，加入20ml二氯甲烷溶液振摇5min，用定量滤纸过滤。滤液水浴65℃加热浓缩、挥发至1ml左右，用二氯甲烷定容至2ml(简称供试品)。在长宽度各为12cm的薄层硅胶板上点加供试品和黄曲霉毒素标准品B1各40μl(每次点样5μl，共点样8次)，再点加3％的衍生试剂稀盐酸15μl。挥干后放入盛有溶剂石油醚层析缸中进行一次竖向展开，溶剂前沿展开8cm，再换用苯∶丙酮(85∶15)进行二次横向展开，展开8cm。取出薄层板晾干。在350nm波长紫外灯下观察，供试品有荧光条带出现，与标准品黄曲霉毒素B1的荧光条带比移值相同，为蓝紫色，且亮度强于黄曲霉毒素标准品B1。说明：212生长鸡中期配合饲料中黄曲霉毒素B1超标。
实施例3
检测玉米中黄曲霉毒素B1是否超标。根据GB2715-2005《粮食卫生标准》中规定玉米中黄曲霉毒素B1的最高允许含量≤20μg/kg。样品Mg计算公式：Mg＝(0.20μg/ml×1ml)/20μg/kg，Mg＝10g。取磨细过20目筛网待测样品10g至于100ml烧杯中，加入30ml异丙醇溶液超声5min，用定性滤纸过滤。滤液水浴80℃加热浓缩、挥发至2ml左右，用异丙醇定容至3ml(简称供试品)。在长度为15cm的薄层硅胶板上点供试品①和标准品B1各24μl(每次点样6μl，共点样4次)，再点加2％的衍生试剂硫酸5μl。挥干后放入盛有溶剂己烷层析缸中进行一次展开，溶剂前沿展开10cm，再换用苯∶乙酸乙脂(70∶30)进行二次展开，展开9.5cm。取出薄层板晾干。在360nm波长紫外灯下观察，供试品没有荧光条带出现。说明：花生中黄曲霉毒素B1没有超标。
实施例4
检测绿豆中黄曲霉毒素B1。根据GB2715-2005《粮食卫生标准》中规定绿豆中黄曲霉毒素B1的最高允许含量≤5μg/kg。样品Mg计算公式：(0.04μg/ml×1ml)/Mg＝4μg/kg，Mg＝10g。取磨细过20目筛网待测样品10g至于100ml烧杯中，加入40ml乙腈溶液超声10min，用定量滤纸过滤，滤液水浴80℃加热挥发至1ml左右，用乙腈定容至2ml(简称供试品)。在长宽度各为12cm的薄层硅胶板上点加供试品和标准品B1各28μl(每次点样7μl，共点样4次)，再点加1.5％的衍生试剂硝酸20μl。挥干后放入盛有溶剂环己烷层析缸中进行一次竖向展开，溶剂前沿展开9cm，再换用环己烷-乙酸乙酯(80∶20)进行二次横向展开，展开9cm。取出薄层板晾干。在365nm波长紫外灯下观察，供试品有荧光条带出现，与标准品B1的荧光条带比移值相同，为蓝紫色，亮度弱于标准品B1。说明：绿豆中黄曲霉毒素B1没有超标。
实施例5
市场上买的黄曲霉毒素B1ELISA快速检测试剂盒、黄曲霉毒素快速检测试剂盒(带有免疫亲和柱)和本发明同时检测华港湾仔猪前期料中黄曲霉毒素B1是否超标。
本发明根据GB13078-2001《饲料卫生标准》中规定肉用仔猪配合饲料及浓缩饲料≤10μg/kg。样品Mg计算公式：(0.04μg/ml×1ml)/Mg＝10μg/kg，Mg＝4g。取磨细过20目筛网待测样品4g至于100ml烧杯中，加入10ml三氯甲烷溶液振摇5min，用定量滤纸过滤，滤液水浴70℃加热挥发至0.5ml左右，用三氯甲烷定容至1ml(简称供试品)。在长度为10cm的薄层硅胶板上点加供试品和标准品B1各30μl(每次点样5μl，共点样6次)，再点加1.5％的衍生试剂醋酸15μl。挥干后放入盛有溶剂乙醚层析缸中进行一次展开，当溶剂前沿展开5cm时，换用氯仿∶丙酮(92∶8)进行二次展开，展开4cm。取出薄层板晾干。在365nm波长紫外灯下观察，供试品没有出现蓝色荧光条带。说明：仔猪前期配合饲料中黄曲霉毒素B1没有超标。
市面上黄曲霉毒素B1ELISA快速检测试剂盒按说明书操作步骤，检测结果小于2.4ppb。
市面上买的黄曲霉毒素快速检测试剂盒(带有免疫亲和柱)按说明书操作步骤，检测结果没有在免疫亲和柱中产生蓝紫色荧光，即没有检测到有黄曲霉毒素B1。
实施例6
检测辣椒中黄曲霉毒素B1。重复实施例2，有以下不同点：萃取剂为乙酸乙酯；衍生试剂为重量体积百分数5％的酒石酸8μl。
实施例7
检测杏仁中黄曲霉毒素B1。重复实施例3，有以下不同点：萃取剂为丙酮；衍生试剂为重量体积百分数10％的水杨酸5μl。
实施例8
检测大米中黄曲霉毒素B1。重复实施例4，有以下不同点：萃取剂为甲醇-乙腈(30∶70)溶液；衍生试剂为重量体积百分数3％的柠檬酸10μl。
Claims (5)
1.一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法，包括以下步骤：
(1)将待测样品粉碎后称取0.5～50g置于烧杯中，加入萃取剂10～100ml，振摇2～10min或超声萃取3～30min；所述的萃取剂为三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇、苯、异丁醇、异丙醇、甲基乙基酮、乙酸乙酯、四氢呋喃甲基异丁醇、醋酸丁酯、丙酮、乙腈或是甲醇浓度≥20％的甲醇乙腈混合物中的一种；
(2)萃取物过滤后固液分离，滤液在水浴45～85℃下浓缩、挥发，定容至1～5ml得供试品；
(3)在长度≥8cm的薄层硅胶板上分别点加同量的供试品和黄曲霉毒素B1标准品，然后分别在供试品和黄曲霉毒素B1标准品样点中点加5～30μl的衍生试剂；然后将薄层硅胶板上的供试品和黄曲霉毒素B1标准品用展开剂展开；
(4)待供试品和黄曲霉毒素标准品B1挥干后，在波长300～400nm紫外灯下对两者的荧光强弱进行比较，衍生后黄曲霉毒素B1为蓝紫色，如果供试品样点出现与黄曲霉毒素标准品B1颜色相同、比移值相同的荧光条带，且供试品的荧光强度强于黄曲霉毒素标准品B1，则表示供试品中黄曲霉毒素含量超标，否则即为合格；
其中，所述的衍生试剂为醋酸、盐酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、抗坏血酸、水杨酸、苹果酸或柠檬酸中的一种；其中，盐酸、硝酸和硫酸的浓度为体积百分数0.5～20％，其余酸的浓度为体积百分数0.5～50％；
所述的展开方式为二次展开，展开剂分为1号展开剂和2号展开剂，其中，1号展开剂为乙醚、石油醚、己烷、环己烷或四氯化碳中的一种，2号展开剂为苯-丙酮、氯仿-丙酮、环己烷-乙酸乙酯或苯-乙酸乙酯的一种；二次展开的具体操作方式有两种：一种是：先使用1号展开剂竖向展开，然后再使用2号展开剂竖向展开，1号展开剂展开直径≥5cm，2号展开剂展开直径比1号展开剂展开直径小0.3～1.5cm；另一种是：先用1号展开剂横向展开，再用2号展开剂竖向展开。
2.根据权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素含量的方法，其特征在于：待测样品的称取质量按下式确定：待测样品质量＝(黄曲霉毒素B1标准品浓度μg/ml ×供试品体积ml)/黄曲霉毒素的限量标准；其中，黄曲霉毒素的限量标准参考GB 13078-2001《饲料卫生标准》和GB 2715-2005《粮食卫生标准》；黄曲霉毒素B1标准品浓度为0.02～1μg/ml。
3.根据权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素含量的方法，其特征在于：所述的待测样品为饲料、玉米，大米、小麦、豆类、坚果或辣椒类中的一种。
4.根据权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素含量的方法，其特征在于：将待测样品粉碎至过20目筛网。
5.根据权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素含量的方法，其特征在于：所述的供试品与黄曲霉毒素B1标准品点样总量相同，样点大小保持一致，直径在0.2～0.6cm；点样一次性点完或是少量多次点完。
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