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CN101942523B - 一种检测pca3基因、psa基因的液相芯片法及其诊断试剂盒 - Google Patents

一种检测pca3基因、psa基因的液相芯片法及其诊断试剂盒 Download PDF

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CN101942523B CN 201010509924 CN201010509924A CN101942523B CN 101942523 B CN101942523 B CN 101942523B CN 201010509924 CN201010509924 CN 201010509924 CN 201010509924 A CN201010509924 A CN 201010509924A CN 101942523 B CN101942523 B CN 101942523B
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Abstract

本发明公开了一种检测PCA3基因、PSA基因的液相芯片法及诊断试剂盒，通过对PCA3基因的mRNA和/或PSA基因的mRNA设计引物和探针，将探针与微球共价结合形成的探针微球混合物，与逆转录PCR扩增产物杂交，加入链霉亲和素藻红蛋白后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中是否含有PCA3、PSA基因以及它们的表达状况，同时亦可得出PCA3/PSA比值。本发明所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点，能够对不同程度的前列腺疾病包括前列腺癌和良性前列腺增生相关的PCA3、PSA基因同时进行定性和定量检测，并对前列腺癌进行特异性诊断。

Description

一种检测PCA3基因、PSA基因的液相芯片法及其诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断检测技术领域，具体涉及前列腺疾病相关的特异基因PCA3、PSA的液相芯片检测方法及其诊断试剂盒。
背景技术
PCA3(prostate cancer antigen 3)基因，又称DD3(differential display code 3)基因，是1999年Bussemakers等发现的一种功能为非编码RNA的基因，由4个外显子和3个内含子组成。PCA3基因仅表达于前列腺组织，在正常前列腺和良性前列腺增生(BPH)组织中其表达极低或不表达，而在前列腺癌(PCa)细胞中呈高表达。因此，PCA3基因目前被认为是前列腺癌最特异的基因。
前列腺特异性抗原(PSA，prostate specific antigen)目前虽然已被广泛应用于前列腺癌的普查、诊断、分期、疗效观察和预后判断，但PSA基因不具有肿瘤特异性，在前列腺增生(BPH)和前列腺炎等良性病变中也可升高，而且PSA基因并不能提高前列腺癌的早期诊断率。
前列腺穿刺活检是不同的前列腺疾病鉴别诊断的金标准，但其是有创检查，且常有假阴性的发生。直肠指诊及相关辅助检查如B超、MRI(核磁共振成像)等虽为非侵入性，但都有局限性。因此，寻找更加特异、早期、无创的检测手段是前列腺疾病鉴别诊断的必然趋势。
当前国内外广泛使用的分子生物学检测前列腺疾病相关的特异性基因的方法中，荧光定量PCR存在着检测通量的局限性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。因此临床上需要有一种检测方法，能够迅速、稳定、准确地对前列腺疾病相关的特异基因进行联合检测，液相芯片(xMAP)技术正是这样一种新型检测技术。
液相芯片能够对少量样本进行定性、定量检测，具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点。该系统是由许多微球为主要基质构成的，在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。根据检测物的不同，微球表面可以共价结合各种各样的核酸检测探针，在杂交反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。反应结束后，通过微流体技术将微球排成单列快速流经液相芯片检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球上的红色分类荧光，将各个不同的反应区分开来而定性；绿色激光则激发结合在待测样本上的荧光标记进行定量。当标记好的待测样本与特定微球上的探针结合在一起时，两束激光所激发的光均可被检测到。最后，通过计算机的高速数字信号处理器，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度，从而确定检测物的种类和数量。
本发明基于液相芯片技术的高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点，对前列腺疾病相关的特异基因进行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种前列腺疾病相关的特异基因的检测方法及诊断试剂盒。该方法及试剂盒包含对PCA3基因和/或PSA基因进行检测，可以对不同程度的前列腺疾病，尤其是前列腺癌进行特异和早期诊断、分期、疗效观察和预后判断，对良性前列腺增生和前列腺癌进行鉴别诊断，以及对其他相关疾病进行早期诊断、疗效观察和预后判断。本检测方法及诊断试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。
为解决上述技术问题，在本发明的一方面，提供一种检测前列腺疾病相关的特异基因PCA3基因、PSA基因以及PCA3基因/PSA基因的比值的液相芯片方法，包括以下步骤：
(1)设计一种羧基微球Beads，该微球上共价结合针对PCA3基因或PSA基因的mRNA所设计的特异性核酸探针；或者设计包含两种不同荧光编码的羧基微球Beads，每种微球上分别共价结合针对PCA3基因和基因PSA的mRNA所设计的特异性核酸探针；所述的PCA3基因可以单独作为前列腺癌的特异基因进行检测，PSA基因可以单独作为相关的前列腺疾病的特异基因进行检测，PCA3和PSA基因可以组合起来作为相关前列腺疾病的特异性基因进行联合检测，同时还可以根据PCA3基因/PSA基因的比值对相关的前列腺疾病进行鉴别诊断。PCA3基因和/或PSA基因也可以与其它基因组合起来作为相关前列腺疾病的特异性基因进行联合检测；
(2)针对PCA3基因和/或PSA基因的mRNA，分别设计上下游引物，通过逆转录PCR扩增出相应的产物；
(3)含有特异性核酸探针的微球与PCA3基因和/或PSA基因的mRNA的逆转录扩增产物杂交后，加入链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)，通过液相芯片法xMAP检测荧光信号；
(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较，从而确定检测样品中是否存在前列腺疾病相关的基因PCA3基因和/或PSA基因，及其在样品中的表达状况，同时亦可计算出PCA3基因/PSA基因的比值。
以上检测方法的步骤(1)中所述的微球是平均直径为5.6μm，结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即色彩编码微球(color-coded beads)；
步骤(1)中，所述的共价结合于微球上的针对PCA3基因和/或PSA基因的mRNA所设计的特异性核酸探针，包括如下序列(其中5’端含氨基修饰)：
针对PCA3基因的mRNA：
探针(1)：5’-AminolinkerC12 ATTTCTCACCTCTGTATCATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
探针(2)、(3)、(5)、(6)同探针(1)，如SEQ ID NO.1所示；
探针(4)：5’-AminolinkerC12 CTCACCTCTGTATCATCAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针(7)：5’-AminolinkerC12 ATCTCTGTGCTTCCTTTTGT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
探针(8)同探针(7)，如SEQ ID NO.3所示
探针(9)：5’-AminolinkerC12 CAAATCTGTAATCCCGTTCA-3’，如SEQ ID NO.4所示；
探针(10)：5’-AminolinkerC12 TATGTGTCAAGAGGAGAGCC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；
针对PSA基因的mRNA：
探针A：5’-AminolinkerC12 CAGAATCACCCGAGCAGGTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；
探针B：5’-AminolinkerC12 GGGGTCAAGAACTCCTCTGG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
探针C：5’-AminolinkerC12 CACGCTTTTGTTCCTGATGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
探针D同PSA探针A，如SEQ ID NO.6所示；
探针E同PSA探针B，如SEQ ID NO.7所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
步骤(2)中，所述的针对PCA3基因和/或PSA基因的mRNA所设计的上下游引物，包括如下序列(其中上游引物5’端含生物素标签)：
针对PCA3基因的mRNA：
引物组(1)：上游5’-biotin AAGAAATAGCAAGTGCCGAGAAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
           下游5’-GTGTGGCCTCAGATGGTAAAGTC-3’，如SEQ ID NO.10所示；
引物组(2)：上游5’-biotin TGGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.11所示；
           下游5’-TCTCCCAGGGATCTCTGTGCTT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
引物组(3)：上游5’-biotin GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；
           下游5’-TAAAGGGGCTGGAAATGTGC-3’，如SEQ ID NO.14所示；
引物组(4)：上游5’-biotin AGCCGAGGGAGACCAGGAAG-3’，如SEQ ID NO.15所示；
           下游5’-CAGCAGATGTGTGGCCTCAGAT-3’，如SEQ ID NO.16所示；
引物组(5)：上游5’-biotin CCGAGGGAGACCAGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO.17所示；
           下游5’-CACAGGGCGAGGCTCATC-3’，如SEQ ID NO.18所示；
引物组(6)：上游5’-biotin AGAAATAGCAAGTGCCGAGAAGC-3’，如SEQ ID NO.19所示；
           下游5’-CACAGGGCGAGGCTCATC-3’，如SEQ ID NO.20所示；
引物组(7)：上游5’-biotin TATCCACACACACAGGAAGCAC-3’，如SEQ ID NO.21所示；
           下游5’-CCTCTCATTGGTAATGCTCACTTT-3’，如SEQ ID NO.22所示；
引物组(8)：上游5’-biotin AAGGCTGCTGACTTTACCATCTG-3’，如SEQ ID NO.23所示；
           下游5’-TCTAATGTCCTTCCCTCACAAGC-3’，如SEQ ID NO.24所示；
引物组(9)：上游5’-biotin CGCTTGTGAGGGAAGGACATTAG-3’，如SEQ ID NO.25所示；
           下游5’-GTGAAGCCATCAAGATTTTCTCGTC-3’，如SEQ ID NO.26所示；
引物组(10)：上游5’-biotin CAGCAGGACCCAACGCAT-3’，如SEQ ID NO.27所示；
            下游5’-GAGAGAGGATTGGTAAGCGATGTG-3’，如SEQ ID NO.28所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；
针对PSA基因的mRNA：
引物组A：上游5’-biotin TTGACCCCAAAGAAACTTCAGTGT-3’，如SEQ ID NO.29所示；
         下游5’-TGCCCCATGACGTGATACCT-3’，如SEQ ID NO.30所示；
引物组B：上游5’-biotin TCCCACACCCGCTCTACGAT-3’，如SEQ ID NO.31所示；
         下游5’-CGTCCAGCACACAGCATGAACT-3’，如SEQ ID NO.32所示
引物组C：上游5’-biotin TGCACCCCTCATCCTGTCTC-3’，如SEQ ID NO.33所示；
         下游5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’，如SEQ ID NO.34所示
引物组D：上游5’-biotin GGCAGCATTGAACCAGAGGAGT-3’，如SEQ ID NO.35所示；
         下游5’-CGATGGTGTCCTTGATCCACTT-3’，如SEQ ID NO.36所示
引物组E：上游5’-biotin TCCTCAGGCCAGGTGATGACT-3’，如SEQ ID NO.37所示；
         下游5’-CGTCCAGCACACAGCATGAACT-3’，如SEQ ID NO.38所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
以上针对PCA3所设计的引物组(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)与上述设计的PCA3探针(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)一一对应，即相应的引物组扩增出的产物与相对应的探针进行步骤(3)中的杂交；
以上针对PSA所设计的引物组A、B、C、D、E与上述设计的PSA探针A、B、C、D、E一一对应，即相应的引物组扩增出的产物与相对应的探针进行步骤(3)中的杂交；
步骤(4)中，所述的内参基因β-actin基因的引物和探针序列如下：
上游引物：5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；
下游引物：5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示；
探针：5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
在本发明另一方面，提供一种检测前列腺疾病相关的特异基因PCA3、PSA的诊断试剂盒，包含共价结合了PCA3基因的mRNA和/或PSA基因的mRNA特异性探针的微球混合物、结合了β-actin基因探针的微球、针对PCA3基因的mRNA和/或PSA的mRNA的上下游引物、β-actin基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白Streptavidin-PE、质控品(阴性对照和阳性对照)。
以上试剂盒中所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有PCA3基因和/或PSA基因的质粒混合液(包括含β-actin基因的质粒)，阴性对照品为不含有PCA3基因、PSA基因及β-actin基因的质粒；所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
本发明的另一方面，提供一种检测前列腺疾病相关的特异基因PCA3、PSA的诊断试剂盒在检测体外样品，对不同程度的前列腺疾病(尤其是前列腺癌)进行特异和早期诊断、分期、疗效观察和预后判断中的应用，对良性前列腺增生和前列腺癌进行鉴别诊断中的应用，以及对其他相关疾病进行早期诊断、分期、疗效观察和预后判断中的应用。
由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对PCA3基因和/或PSA基因进行定性和定量检测，并能计算出PCA3基因/PSA基因的比值，因此能在临床检测及诊断上得到更好的应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明，但并不能理解为对本发明的限制。所述的实施例只提供阐明核酸引物、探针、检测方法、试剂盒的制作和应用方法而不为其所限制。期间各种变化形式在本发明和所述的权项的范围内是可预期的。
实验材料：
引物和探针均由invitrogen公司合成；Trizol购自invitrogen公司；总RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；逆转录cDNA合成试剂盒购自Fermentas公司；多重PCR试剂盒、不同编号的微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购自QIAGEN公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自Pierce公司；2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂酰基氨酸钠(Sarkosyl)、四甲基氯化铵(TMAC)均购自sigma公司。
缓冲液、杂交液及其它溶液的配制：
偶联缓冲液，pH4.5             250ml
MES                           4.88g；
1.5×TMAC杂交溶液             250ml
5M TMAC                       225ml
20％Sarkosyl                  1.88ml
1M Tris-HCl，pH8.0            18.75ml
0.5M EDTA，pH8.0              3.0ml
H2O                           1.37ml；
1.5×TMAC杂交溶液               250ml
5M TMAC                         150ml
20％Sarkosyl                    1.25ml
1M Tris-HCl，pH8.0              12.5ml
0.5M EDTA，pH8.0                2.0ml
H2O                             84.25ml；
TE缓冲液，pH8.0                 500ml
1M Tris-HCl，pH8.0              5ml
0.5M EDTA，pH8.0                1ml
H2O                             444ml
D-Hanks液的配制：KCl 0.4g，NaCI 8.0g，NaHCO3 0.35g，Na2HPO4·12H2O 0.15g，
                 KH2PO4 0.06g，依次溶于去离子水，加离子水至1000ml。15
                 KPa×30min灭菌，4℃保存。
DEPC处理水配置：去离子水加DEPC使其浓度为0.1％，37。C水浴2小时，15KPa
                ×20min高压灭菌。
实施例1：不同引物及探针组合检测尿液中PCA3基因的液相芯片方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测PCA3基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
针对PCA3基因的mRNA：
探针(1)5’-AminolinkerC12 ATTTCTCACCTCTGTATCATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
探针(2)、(3)、(5)、(6)同探针(1)，如SEQ ID NO.1所示；
探针(4)5’-AminolinkerC12 CTCACCTCTGTATCATCAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；探针(7)5’-AminolinkerC12 ATCTCTGTGCTTCCTTTTGT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
探针(8)同探针(7)，如SEQ ID NO.3所示
探针(9)5’-AminolinkerC12 CAAATCTGTAATCCCGTTCA-3’，如SEQ ID NO.4所示；探针(10)5’-AminolinkerC12 TATGTGTCAAGAGGAGAGCC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
β-actin基因：5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示。
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、13、15、21、25、61、62、63、64、65、66号的11种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解PCA3、β-actin的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、13、15、21、25、61、62、63、64、65、66号的11种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到十一个离心管中；
2.5 10,000g，离心，1-2min；
2.6移除上清液，用50μl 0.1M MES，pH4.5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2.7将十一种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释，使其浓度为0.1nmol/μl；
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里，涡旋混合；
2.9用dH2O配制10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意：保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC的使用)；
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的的新鲜EDC溶液分别到十一种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀；
2.11室温避光孵育30min；
2.12用dH2O配制第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意：EDC粉末如果潮解，则应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；
2.13十一种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混匀；
2.14室温避光孵育30min；
2.15十一种偶联微球中各加入1ml 0.02％Tween-20；
2.16 10,000g，离心，1-2min；
2.17移除上清，分别用1ml 0.1％SDS重悬十一种偶联微球，振荡混匀；
2.18 10,000g，离心，1-2min；
2.19移除上清，分别加入100μl TE，pH8.0，涡旋混合20s，重悬微球；
2.20用细胞计数器计数十一种偶联了寡核苷酸探针的微球；
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释；
b.涡旋震荡充分混匀；
c.取10μl到细胞计数器上；
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；
e.微球/μl＝(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：分别为PCA3探针(1)微球11、PCA3探针(2)微球13、PCA3探针(3)微球15、PCA3探针(4)微球21、PCA3探针(5)微球25、PCA3探针(6)微球61、PCA3探针(7)微球62、PCA3探针(8)微球63、PCA3探针(9)微球64、PCA3探针(10)微球65、β-actin探针微球66，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-5号临床样本为前列腺癌(PCa)患者的尿液，6-8号临床样本为正常人的尿液：
1.对受试者采用传统前列腺按摩方法，即检查者作直肠指诊，自前列腺两侧向中央沟，自上而下纵向按摩2到3次，再按摩中央沟一次，将前列腺液挤入尿道。
2.嘱咐受试者立即排尿后收集初始段尿液20～30ml，立即放入冰中冷却。于4℃ 3000r/min离心10min收集尿沉渣，加适量预冷D-Hanks液洗涤两次；
3.将尿沉渣收集于1.5ml Eppendorf管中，立即加含酸性异硫氰酸胍的变性液(即RNAisoReagent)500μl混匀置-70℃保存。
4.从-70℃取出已加入含500μl RNAiso Reagent的尿沉渣标本，待融解后离心。
5.加入1/5 RNAiso Reagent体积量氯仿，振荡混匀，室温静置5分钟后，12000r/min 4℃离心15min。
6.小心将上层水相移入RNase-free的1.5ml Eppendorf管中，然后加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置5分钟后，12000r/min离心10min。
7.弃上清液，用1ml 75％预冷乙醇洗涤沉淀2次，离心彻底去除乙醇。
8.将得到的RNA沉淀溶解于适量DEPC处理水中，将标本中提取的总RNA在紫外分光光度仪上进行定量。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-8号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管，置于冰上，建立下列反应体系；
Total RNA                                 5～10μg/3μl
Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl)             1μl
RNase-free water      forward to          12μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
②离心管于70℃温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；
5×reaction buffer                4μl
RNase Inhibitor(20U/μl)          1μl
10mM dNTPs Mix                    2μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
④离心管于37℃温育5分钟；
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl)，终体积为20μl；
⑥离心管于42℃反应60分钟；
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却；
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
针对PCA3基因的mRNA：
引物组(1)上游5’-biotin AAGAAATAGCAAGTGCCGAGAAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
         下游5’-GTGTGGCCTCAGATGGTAAAGTC-3’，如SEQ ID NO.10所示；
引物组(2)上游5’-biotin TGGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.11所示；
         下游5’-TCTCCCAGGGATCTCTGTGCTT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
引物组(3)上游5’-biotin GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；
         下游5’-TAAAGGGGCTGGAAATGTGC-3’，如SEQ ID NO.14所示；
引物组(4)上游5’-biotin AGCCGAGGGAGACCAGGAAG-3’，如SEQ ID NO.15所示；
         下游5’-CAGCAGATGTGTGGCCTCAGAT-3’，如SEQ ID NO.16所示；
引物组(5)上游5’-biotin CCGAGGGAGACCAGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO.17所示；
         下游5’-CACAGGGCGAGGCTCATC-3’，如SEQ ID NO.18所示；
引物组(6)上游5’-biotin AGAAATAGCAAGTGCCGAGAAGC-3’，如SEQ ID NO.19所示；
         下游5’-CACAGGGCGAGGCTCATC-3’，如SEQ ID NO.20所示；
引物组(7)上游5’-biotin TATCCACACACACAGGAAGCAC-3’，如SEQ ID NO.21所示；
         下游5’-CCTCTCATTGGTAATGCTCACTTT-3’，如SEQ ID NO.22所示；
引物组(8)上游5’-biotin AAGGCTGCTGACTTTACCATCTG-3’，如SEQ ID NO.23所示；
         下游5’-TCTAATGTCCTTCCCTCACAAGC-3’，如SEQ ID NO.24所示；
引物组(9)上游5’-biotin CGCTTGTGAGGGAAGGACATTAG-3’，如SEQ ID NO.25所示；
         下游5’-GTGAAGCCATCAAGATTTTCTCGTC-3’，如SEQ ID NO.26所示；
引物组(10)上游5’-biotin CAGCAGGACCCAACGCAT-3’，如SEQ ID NO.27所示；
          下游5’-GAGAGAGGATTGGTAAGCGATGTG-3’，如SEQ ID NO.28所示；
以上针对PCA3所设计的引物组(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)与上述设计的PCA3探针(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)一一对应，分别对应组合为PCA3引物/探针组1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(见表1和表2)；
β-actin基因：
上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；
下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示；
2.2多重PCR反应：
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒，体系如下
Template cDNA                                     10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix                25μl
10×Primer mix                                    5μl
RNase-free water                                  10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTP Mix。)
PCR扩增程序：95℃ 15min；94℃ 30s，55℃ 90s，72℃ 90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配制的寡核苷酸探针微球混合物；
2.涡旋震荡20s，混匀微球；
3.制备微球工作液，用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。(注：每个反应需要33μl的微球工作液)；
4.涡旋震荡20s，混匀微球工作液；
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液；
6.向每个样品孔内分别加入1-8号样本的PCR扩增产物和TE溶液(pH为8.0)，总体积为17μl；
7.用排枪上下吸打，温柔混匀反应液；
8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100℃下孵育1-3min，使样品中的寡核苷酸去掉二级结构；
9.在杂交温度下孵育反应板15min；
10.制备新鲜的检测混合液，用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液)；
11.向每孔加入25μl的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混匀；
12.在杂交温度下孵育5min；
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并：
95℃，1-3min；
杂交温度，forever；
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN和Luminex公司)上，保持杂交温度，对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值(平均荧光强度)。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表1所示：
表1
Figure BDA0000028570270000121
结果分析如表2所示：
表2
Figure BDA0000028570270000131
不同的引物/探针组检测1-5号前列腺癌(PCa)患者尿液中的PCA3均为阳性。
不同的引物/探针组检测6-8号正常人尿液中的PCA3均为阴性。
同时，将患者呈现的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比，可得出PCA3基因的表达状况。
实施例2：不同引物及探针组合检测尿液中PSA基因的液相芯片方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测PSA基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
针对PSA基因的mRNA：
探针A：5’-AminolinkerC12 CAGAATCACCCGAGCAGGTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；
探针B：5’-AminolinkerC12 GGGGTCAAGAACTCCTCTGG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
探针C：5’-AminolinkerC12 CACGCTTTTGTTCCTGATGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
探针D：同PSA探针A，如SEQ ID NO.6所示；
探针E：同PSA探针B，如SEQ ID NO.7所示；
β-actin基因：5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示；
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、13、15、21、25、66号的6种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解PSA、β-actin的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、13、15、21、25、66号的6种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4-2.20同实施例1中的2.4-2.20，只是将11管相应减少到6管，其他不变。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：分别为PSA探针A微球11、PSA探针B微球13、PSA探针C微球15、PSA探针D微球21、PSA探针E微球25、β-actin探针微球66，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-5号临床样本为前列腺癌(PCa)患者的尿液，6-8号临床样本为正常人的尿液，制备方法同实施例1中样本的制备方法。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-8号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成方法同实施例1中cDNA第一链的合成方法。
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
针对PSA基因的mRNA：
引物组A：上游5’-biotin TTGACCCCAAAGAAACTTCAGTGT-3’，如SEQ ID NO.29所示；
         下游5’-TGCCCCATGACGTGATACCT-3’，如SEQ ID NO.30所示；
引物组B：上游5’-biotin TCCCACACCCGCTCTACGAT-3’，如SEQ ID NO.31所示；
         下游5’-CGTCCAGCACACAGCATGAACT-3’，如SEQ ID NO.32所示
引物组C：上游5’-biotin TGCACCCCTCATCCTGTCTC-3’，如SEQ ID NO.33所示；
         下游5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’，如SEQ ID NO.34所示
引物组D：上游5’-biotin GGCAGCATTGAACCAGAGGAGT-3’，如SEQ ID NO.35所示；
         下游5’-CGATGGTGTCCTTGATCCACTT-3’，如SEQ ID NO.36所示
引物组E：上游5’-biotin TCCTCAGGCCAGGTGATGACT-3’，如SEQ ID NO.37所示；
         下游5’-CGTCCAGCACACAGCATGAACT-3’，如SEQ ID NO.38所示
以上针对PSA所设计的引物组A、B、C、D、E与上述设计的PSA探针A、B、C、D、E一一对应，分别对应组合为PSA引物/探针组1、2、3、4、5(见表3和表4)；
β-actin基因：
上游5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；
下游5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示；
2.2多重PCR反应：
方法同实施例1中(三、2.2)多重PCR反应方法。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
方法同实施例1中(四)寡核苷酸探针和PCR产物的杂交方法。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表3所示：
表3
Figure BDA0000028570270000151
结果分析如表4所示：
表4
Figure BDA0000028570270000152
不同的引物/探针组检测1-5号前列腺癌(RCa)患者尿液中的PSA均为阳性。
不同的引物/探针组检测6-8号正常人尿液中的PSA均为阴性。
同时，将患者呈现的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比，可得出PSA基因的表达状况。
实施例3：联合检测尿液中PCA3、PSA及PCA3/PSA比值的液相芯片方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测PSA基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
PCA3：5’-AminolinkerC12 ATTTCTCACCTCTGTATCATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
PSA：5’-AminolinkerC12 CACGCTTTTGTTCCTGATGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
β-actin基因：5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示；
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、13、66号的3种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解PCA3、PSA、β-actin的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、13、66号的3种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4-2.20同实施例1中的2.4-2.20，只是将11管相应减少到3管，其他不变。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：分别为PCA3探针微球11、PSA探针微球13、β-actin探针微球66，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-10号患者的临床样本为前列腺癌(PCa)患者的尿液，11-20号患者的临床样本为良性前列腺增生(BPH)患者的尿液，制备方法同实施例1中样本的制备方法。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-20号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成方法同实施例1中cDNA第一链的合成方法。
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
PCA3：上游5’-biotin GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；
      下游5’-TAAAGGGGCTGGAAATGTGC-3’，如SEQ ID NO.14所示
PSA：上游5’-biotin TGCACCCCTCATCCTGTCTC-3’，如SEQ ID NO.33所示；
     下游5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’，如SEQ ID NO.34所示
β-actin基因：
上游5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；
下游5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示；
2.2多重PCR反应：
方法同实施例1中(三、2.2)多重PCR反应方法。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
方法同实施例1中(四)寡核苷酸探针和PCR产物的杂交方法。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表5所示：
表5
Figure BDA0000028570270000171
结果分析如表6所示：
表6
Figure BDA0000028570270000172
Figure BDA0000028570270000181
PCA3/PSA比值的平均值及分析如表7所示：
表7
Figure BDA0000028570270000182
1-10号前列腺癌(PCa)组患者尿液中的PCA3和PSA均为阳性；11-20号良性前列腺增生(BPH)组患者尿液中的PCA3为阴性，PSA为阳性；两组患者PCA3/PSA平均值相差21倍。此方法很好地把前列腺癌患者与良性前列腺增生患者区分开来。
同时，将患者呈现阳性的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比，可得出PCA3基因和PSA基因的表达状况。
实施例4：不同引物及探针组合检测血液中PCA3基因的液相芯片法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测PCA3基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
针对PCA3基因：
探针(1)：5’-AminolinkerC12 ATTTCTCACCTCTGTATCATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
探针(3)、(5)同探针(1)，如SEQ ID NO.1所示；
β-actin基因：5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示；
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、13、15、66号的4种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解PCA3、β-actin的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、13、15、66号的4种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4-2.20同实施例1中的2.4-2.20，只是将11管相应减少到4管，其他不变。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：分别为PCA3(1)探针微球11、PCA3(3)探针微球13、PCA3(5)探针微球15、β-actin探针微球66，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-5号临床样本为前列腺癌(PCa)患者的静脉血，6-8号临床样本为正常人的静脉血，分别按照下面的步骤提取RNA：
1.淋巴细胞提取：取受试者早餐前的抗凝静脉血5ml，混匀后3000r/min离心，10min，4℃，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞；
2.取1个离心管(经DEPC水处理)加入淋巴细胞液150μl.然后加1ml TRIZOL，室温放置5min，使其充分裂解；
3.12,000rpm离心5min，取上清；
4.每1ml Trizol中加入200μl氯仿，剧振荡混匀后室温放置15min；
5.4℃ 12,000g离心15min；
6.吸取上层水相，至另一离心管中；
7.每1ml Trizol中加入500μl异丙醇混匀，室温放置5-10min；
8.4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
9.按每1ml Trizol中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
10.4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清；
11.室温晾干或真空干燥5-10min；
12.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min；
13.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-8号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成方法同实施例1中cDNA第一链的合成方法。
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
针对PCA3基因：
引物(1)上游5’-biotin AAGAAATAGCAAGTGCCGAGAAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
       下游5’-GTGTGGCCTCAGATGGTAAAGTC-3’，如SEQ ID NO.10所示；
引物(3)上游5’-biotin GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；
       下游5’-TAAAGGGGCTGGAAATGTGC-3’，如SEQ ID NO.14所示；
引物(5)上游5’-biotin CCGAGGGAGACCAGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO.17所示；
       下游5’-CACAGGGCGAGGCTCATC-3’，如SEQ ID NO.18所示；
以上针对PCA3基因所设计的引物组(1)、(3)、(5)与上述设计的PCA3基因探针(1)、(3)、(5)一一对应，分别对应组合为PSA引物/探针组1、3、5(见表8和表9)；
β-actin基因：上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示；
2.2多重PCR反应：
方法同实施例1中(三、2.2)多重PCR反应方法。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
方法同实施例1中(四)寡核苷酸探针和PCR产物的杂交方法。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表8所示：
表8
Figure BDA0000028570270000211
结果分析如表9所示：
表9
Figure BDA0000028570270000212
不同的引物/探针组检测1-5号前列腺癌(PCa)患者血液中的PCA3均为阳性。
不同的引物/探针组检测6-8号正常人血液中的PCA3均为阴性。
同时，将患者呈现的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比，可得出PCA3基因的表达状况。
实施例5：不同引物及探针组合检测血液中PSA基因的液相芯片方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测PSA基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
针对PSA基因：
探针A：5’-AminolinkerC12 CAGAATCACCCGAGCAGGTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；
探针C：5’-AminolinkerC12 CACGCTTTTGTTCCTGATGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
β-actin基因：5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示；
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、13、66号的3种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解PSA、β-actin的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、13、66号的3种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4-2.20同实施例1中的2.4-2.20，只是将11管相应减少到3管，其他不变。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：分别为PSA探针A微球11、PSA探针C微球13、β-actin探针微球66，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-5号临床样本为前列腺癌(PCa)患者的静脉血，6-8号临床样本为正常人的静脉血，制备方法同实施例4中(二)样本的制备方法。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-8号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成方法同实施例1中cDNA第一链的合成方法。
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物
针对PSA基因：
引物A：上游5’-biotin TTGACCCCAAAGAAACTTCAGTGT-3’，如SEQ ID NO.29所示；
       下游5’-TGCCCCATGACGTGATACCT-3’，如SEQ ID NO.30所示；
引物C：上游5’-biotin TGCACCCCTCATCCTGTCTC-3’，如SEQ ID NO.33所示；
       下游5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’，如SEQ ID NO.34所示；
以上针对PSA所设计的引物组A、C与上述设计的PSA探针A、C一一对应，分别对应组合为PSA引物/探针组1、3(见表10和表11)；
β-actin基因：
上游引物5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；
下游引物5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示。
2.2多重PCR反应：
方法同实施例1中(三、2.2)多重PCR反应方法。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
方法同实施例1中(四)寡核苷酸探针和PCR产物的杂交方法。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表10所示：
表10
Figure BDA0000028570270000221
Figure BDA0000028570270000231
结果分析如表11所示：
表11
Figure BDA0000028570270000232
不同的引物/探针组检测1-5号前列腺癌(PCa)患者血液中的PSA均为阳性。
不同的引物/探针组检测6-8号正常人血液中的PSA均为阴性。
同时，将患者呈现的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比，可得出PSA基因的表达状况。
实施例6：联合检测血液中PCA3基因、PSA基因及PCA3/PSA比值的液相芯片方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测PSA基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
PCA3：5’-AminolinkerC12 ATTTCTCACCTCTGTATCATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
PSA：5’-AminolinkerC12 CACGCTTTTGTTCCTGATGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
β-actin基因：5’-AminolinkerC12 TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示；
2.将含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、13、66号的3种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解PCA3、PSA、β-actin的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、13、66号的3种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4-2.20同实施例1中的2.4-2.20，只是将11管相应减少到3管，其他不变。
3.微球混合液的配制
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：分别为PCA3探针微球11、PSA探针微球13、β-actin探针微球66，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-10号患者的临床样本为前列腺癌(PCa)患者的静脉血，11-20号患者的临床样本为良性前列腺增生(BPH)患者的静脉血，制备方法同实施例4(二)中样本的制备方法。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-20号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成方法同实施例1中cDNA第一链的合成方法。
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
PCA3：上游5’-biotin GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；
      下游5’-TAAAGGGGCTGGAAATGTGC-3’，如SEQ ID NO.14所示
PSA：上游5’-biotin TGCACCCCTCATCCTGTCTC-3’，如SEQ ID NO.33所示；
     下游5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’，如SEQ ID NO.34所示
β-actin基因：
上游5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；
下游5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示；
2.2多重PCR反应：
方法同实施例1中(三、2.2)多重PCR反应方法。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
方法同实施例1中(四)寡核苷酸探针和PCR产物的杂交方法。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表12所示：
表12
Figure BDA0000028570270000251
结果分析如表13所示：
表13
Figure BDA0000028570270000252
Figure BDA0000028570270000261
PCA3/PSA平均值及分析如表14
表14
Figure BDA0000028570270000262
1-10号前列腺癌(PCa)组患者血液中的PCA3和PSA均为阳性；11-20号良性前列腺增生(BPH)组患者血液中的PCA3为阴性，PSA为阳性；两组患者PCA3/PSA平均值相差27倍。此方法很好地把前列腺癌患者与良性前列腺增生患者区分开来。
同时，将患者呈现阳性的荧光MFI值与内参β-actin基因的荧光MFI值相比，可得出PCA3基因和PSA基因的表达状况。
在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。
序列表
<110>邵棠
<120>一种检测PCA3基因、PSA基因的液相芯片法及其诊断试剂盒
<130>CPC-NP-10-14646
<160>41
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(21)
<400>1
atttctcacc tctgtatcat c                                     21
<210>2
<211>19
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<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(19)
<400>2
ctcacctctg tatcatcag                                        19
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(20)
<400>3
atctctgtgc ttccttttgt                                       20
<210>4
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<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(20)
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caaatctgta atcccgttca                        20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(20)
<400>5
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<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>7
<211>20
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223>引物
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aaggctgctg actttaccat ctg                        23
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
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<400>24
tctaatgtcc ttccctcaca agc                        23
<210>25
<211>23
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<220>
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<223>引物
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<223>引物
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<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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cgtccagcac acagcatgaa ct                         22
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<213>人工序列
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<223>引物
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<223>引物
<400>40
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<210>41
<211>20
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<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(20)
<400>41
tcattgtaga aggtgtggtg                        20

Claims (3)

1.一种检测PCA3基因、PSA基因的诊断试剂盒，其特征在于，包含了共价结合了PCA3基因的mRNA和/或PSA基因的mRNA特异性探针的微球混合物及结合了β-actin基因探针的微球、针对PCA3基因的mRNA和/或PSA基因的mRNA的上下游引物及β-actin基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白和质控品；
所述PCA3基因的mRNA和/或PSA基因的mRNA特异性探针，采用如下序列，其中5’端含氨基修饰：
针对PCA3基因的mRNA：
探针（1）：5’-AminolinkerC12 ATTTCTCACCTCTGTATCATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
探针（2）、（3）、（5）、（6）同探针（1），如SEQ ID NO.1所示；
探针（4）：5’-Aminol inkerC12CTCACCTCTGTATCATCAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针（7）：5’-AminolinkerC12 ATCTCTGTGCTTCCTTTTGT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
探针（8）同探针（7），如SEQ ID NO.3所示；
探针（9）：5’-AminolinkerC12 CAAATCTGTAATCCCGTTCA-3’，如SEQ ID NO.4所示；
探针（10）：5’-AminolinkerC12TATGTGTCAAGAGGAGAGCC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；
针对PSA基因的mRNA：
探针A：5’-Aminol inkerC12CAGAATCACCCGAGCAGGTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；
探针B：5’-AminolinkerC12GGGGTCAAGAACTCCTCTGG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
探针C：5’-AminolinkerC12CACGCTTTTGTTCCTGATGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
探针D同探针A，如SEQ ID NO.6所示；
探针E同探针B，如SEQ ID NO.7所示；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；
所述针对PCA3基因的mRNA和/或PSA基因的mRNA的上下游引物，采用如下序列，其中上游引物5’端含生物素标签；
针对PCA3基因的mRNA：
引物组（1）：上游5’-biotin AAGAAATAGCAAGTGCCGAGAAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
下游5’-GTGTGGCCTCAGATGGTAAAGTC-3’，如SEQ ID NO.10所示；
引物组（2）：上游5’-biotinTGGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.11所示；
下游5’-TCTCCCAGGGATCTCTGTGCTT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
引物组（3）：上游5’-biotin GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；
下游5’-TAAAGGGGCTGGAAATGTGC-3’，如SEQ ID NO.14所示；
引物组（4）：上游5’-biotin AGCCGAGGGAGACCAGGAAG-3’，如SEQ ID NO.15所示；
下游5’-CAGCAGATGTGTGGCCTCAGAT-3’，如SEQ ID NO.16所示；
引物组（5）：上游5’-biotin CCGAGGGAGACCAGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO.17所示；
下游5’-CACAGGGCGAGGCTCATC-3’，如SEQ ID NO.18所示；
引物组（6）：上游5’-biotin AGAAATAGCAAGTGCCGAGAAGC-3’，如SEQ ID NO.19所示；
下游5’-CACAGGGCGAGGCTCATC-3’，如SEQ ID NO.20所示；
引物组（7）：上游5’-biotin TATCCACACACACAGGAAGCAC-3’，如SEQ ID NO.21所示；
下游5’-CCTCTCATTGGTAATGCTCACTTT-3’，如SEQ ID NO.22所示；
引物组（8）：上游5’-biotin AAGGCTGCTGACTTTACCATCTG-3’，如SEQ ID NO.23所示；
下游5’-TCTAATGTCCTTCCCTCACAAGC-3’，如SEQ ID NO.24所示；
引物组（9）：上游5’-biotin CGCTTGTGAGGGAAGGACATTAG-3’，如SEQ ID NO.25所示；
下游5’-GTGAAGCCATCAAGATTTTCTCGTC-3’，如SEQ ID NO.26所示；
引物组（10）：上游5’-biotin CAGCAGGACCCAACGCAT-3’，如SEQ ID NO.27所示；
下游5’-GAGAGAGGATTGGTAAGCGATGTG-3’，如SEQ ID NO.28所示；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；
针对PSA基因的mRNA：
引物组A：上游5’-biotin TTGACCCCAAAGAAACTTCAGTGT-3’，如SEQ ID NO.29所示；
下游5’-TGCCCCATGACGTGATACCT-3’，如SEQ ID NO.30所示；
引物组B：上游5’-biotin TCCCACACCCGCTCTACGAT-3’，如SEQ ID NO.31所示；
下游5’-CGTCCAGCACACAGCATGAACT-3’，如SEQ ID NO.32所示；
引物组C：上游5’-biotin TGCACCCCTCATCCTGTCTC-3’，如SEQ ID NO.33所示；
下游5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’，如SEQ ID NO.34所示；
引物组D：上游5’-biotin GGCAGCATTGAACCAGAGGAGT-3’，如SEQ ID NO.35所示；
下游5’-CGATGGTGTCCTTGATCCACTT-3’，如SEQ ID NO.36所示；
引物组E：上游5’-biotin TCCTCAGGCCAGGTGATGACT-3’，如SEQ ID NO.37所示；
下游5’-CGTCCAGCACACAGCATGAACT-3’，如SEQ ID NO.38所示；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；
以上针对PCA3基因所设计的引物组（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）、（8）、（9）、（10）与PCA3探针（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）、（8）、（9）、（10）一一对应；
以上针对PSA基因所设计的引物组A、B、C、D、E与PSA探针A、B、C、D、E一一对应；
所述β-actin基因，其引物和探针序列如下：
上游引物：5’-biotin TGGGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3’，如SEQ ID NO.39所示；
下游引物：5’-GCTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’，如SEQ ID NO.40所示；
探针：5’-Aminol inkerC12TCATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO.41所示；
或者与上述序列的碱基互补序列。
2.如权利要求1所述的检测PCA3基因、PSA基因的诊断试剂盒，其特征在于，所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
3.如权利要求1所述的检测PCA3基因、PSA基因的诊断试剂盒，其特征在于，所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有PCA3基因和/或PSA基因质粒的混合液，包括含β-actin基因的质粒；阴性对照为不含有PCA3基因、PSA基因及β-actin基因的质粒溶液。
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