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CN101970668A - 淀粉代谢途径经过修饰的作物 - Google Patents

淀粉代谢途径经过修饰的作物 Download PDF

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CN101970668A CN2008801256592A CN200880125659A CN101970668A CN 101970668 A CN101970668 A CN 101970668A CN 2008801256592 A CN2008801256592 A CN 2008801256592A CN 200880125659 A CN200880125659 A CN 200880125659A CN 101970668 A CN101970668 A CN 101970668A
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Abstract

本发明提供获取遗传修饰作物的方法，其与对照作物相比，生产潜力提高，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定与对照作物相比，生产潜力提高且含有异源多聚核苷酸的作物，以及iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列连接的转录调控序列。在一些实施例中，与对照作物相比，提高了作物的转葡糖基酶或消化率。在一些专门的实施例中，内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是通过改变选自下述组的一种或多种酶的表达或活性进行修饰的，所述组包括α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、淀粉磷酸化酶(EC2.4.1.1)、转葡糖基酶(EC 3.1.33)、蔗糖酶-异麦芽糖酶(EC3.2.10)、淀粉麦芽糖酶(EC 2.4.1.25)、麦芽糖酶(EC 3.2.1.20)、异淀粉酶和α-葡聚糖水二激酶(α-glucan，water dikinase，GWD，EC 2.7.9.4)。

Description

淀粉代谢途径经过修饰的作物
技术领域
本发明描述了提高生物生产潜力的方法。特别地，本发明涉及作物淀粉代谢途径并提供具有修饰淀粉代谢途径和生产潜力的作物，包括禾本科作物如小麦和大麦。本发明描述了各种繁殖具有改进的生产潜力，如提高的产率、生长、生物量、活力等的作物的方法，以及由所述修饰的作物生产感兴趣的产品的方法。
背景技术
本发明中作者参考的出版物的详细书目收录于说明书末尾。
本发明参考的任何在先出版物(或来自于该在先出版物的信息)或任何已知事件，本发明涉及领域的公知常识的在先出版物(或来自于该在先出版物的信息)或已知事件部分不应被承认或接受或给出任何形式的建议。
作物是可重复使用能源的主要来源，提高给定作物生产潜力的方法是人们所热衷探索的。淀粉是作物中碳水化合物的主要储备形式，也是人类膳食的主要能量供应成分。淀粉功能性对于最终产品例如食品品质的重要性，逐渐被人们所认识。淀粉的结构性质在工业(非食品)应用中也是重要的，例如淀粉用作凝胶剂、膨胀剂、水分保持剂或粘附剂。
在谷物中，淀粉占成熟谷粒重量的约45-65％。淀粉仅由糖苷构成，发现有两种类型的分子，直链淀粉和支链淀粉，可基于分子大小或其它性质进行区分。直链淀粉主要是由α-1，4糖苷单位构成的线性聚合体，而支链淀粉是带有α-1，6糖苷键连接许多α-1，4糖苷单位直链的高度分支的分子。支链淀粉由分子大小为数以万计至数十万计的带有约5％α-1，6支链的葡萄糖单位的大分子组成。另一方面，直链淀粉由分子大小为数以百计至数以千计的带有不到1％支链的糖苷构成的分子(参见Buleon等，1998)。典型的野生型谷物淀粉含20-30％直链淀粉，其余为支链淀粉。
淀粉起初在作物光合组织如叶片的叶绿体中以过渡淀粉的形式合成。其是在暗期调动起来，以供应碳运输至器官和能量代谢或贮藏在器官如籽粒或块茎中。淀粉的合成和长期贮藏产生于贮藏器官的淀粉质体中，其中淀粉以直径达100μm的半结晶颗粒存在。颗粒包含直链淀粉和支链淀粉，前者在天然淀粉颗粒中为典型的无定形物质，后者通过线性核苷链的堆积呈半结晶态。
高等作物胚乳中淀粉的合成是由一组催化四个关键步骤的酶实现的。第一步，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶通过1-磷酸葡萄糖和三磷酸腺苷(ATP)合成腺苷二磷酸葡萄糖活化淀粉单体前体。第二步，在淀粉合酶的作用下，将活化的葡萄糖基供体，腺苷二磷酸葡萄糖转移至α-1，4键的非还原末端。第三步，淀粉分支酶通过向α-1，4连接的葡聚糖的分开区引入分支点，接着将分开的链转移至受体链，形成新的α-1，6键。淀粉分支酶是唯一的可以将α-1，6键引入α-葡聚糖的酶，因此在支链淀粉的形成中起重要作用。最后，淀粉去分支酶去除一些分支键，但其作用机制尚且未知。
已经清楚至少这四步反应对于高等作物中普通淀粉颗粒合成是必须的，在高等作物的胚乳中发现各步反应的多亚型，基于突变分析或用转基因方法进行基因表达水平的修饰，提出各亚型的特殊作用(Abel等，1996，Jobling等，1999，Schwall等，2000)。然而，每步反应各亚型对淀粉生物合成所起的精确作用尚且未知，这些作用在种间差异显著。在谷类胚乳中，存在两种亚型的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，一种亚型存在于淀粉质体中，一种亚型位于细胞质中(Denyer等，1996，Thorbjornsen等，1996)。在谷类胚乳中发现四类淀粉合酶，一种亚型单独存在于淀粉颗粒中，颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)是直链淀粉合成必须的，两种形式分别位于颗粒和可溶部分之间(SSI，Li等，1999a，SSII，Li等，1999b)，第四种形式完全位于可溶部分，SSIII(Cao等2000，Li等，1999b，Li等，2000)。SSII和SSIII中的突变已证明改变支链淀粉结构(Gao等，1998，Craig等，1998)。没有确定SSI活性作用突变的描述。
在谷类胚乳中表达三种形式的分支酶，分支酶I(SBEI)，分支酶IIa(SBEIIa)和分支酶IIb(SBEIIb)(Hedman和Boyer，1982，Boyer和Preiss，1978，Mizuno等，1992，Sun等，1997)。水稻(Nakamura和Yamanouchi，1992)，玉米(Baba等，1991；Fisher等，1993；Gao等，1997)和小麦(Repellin等，1997；Nair等，1997 Rahman等，1997)的基因组和cDNA序列已测定。核苷酸和氨基酸水平上的序列比对显示出高度的序列相似性，将分支酶分为SBEI、SBEIIa和SBEIIb。SBEIIa和SBEIIb一般具有约80％的序列一致性，特别是所述基因的中间区域。
在高等作物中存在两种类型的去分支酶，是基于其作用底物的专一性确定的，异淀粉酶型去分支酶和支链淀粉酶型去分支酶(Myers 等，2000)。玉米和水稻中的糖-1突变(Sugary-1 mutations)与两种去分支酶的缺失有关(James等，1995，Kubo等，1999)，然而因果突变图谱(causal mutation maps)与异淀粉酶型去分支酶基因的位置相同。
从几乎所有作物中提取的淀粉为一定程度上磷酸化的淀粉。磷酸化程度通常为核苷残基的0.1-0.4％，其是在碳3或碳6的葡萄糖基磷酸化作为磷酸单脂(Blennow等，2000a)。典型地，约80％的磷酸基团结合在C-6位置，约20％结合在C-3位置。然而，不同作物的磷酸化程度差异显著。马铃薯块茎中的淀粉为平均25nmol葡萄糖-6-磷酸/mg淀粉，而谷类贮藏的淀粉中仅为十分之一该量的葡萄糖-6-磷酸。淀粉中磷酸基团的存在影响到凝胶化后淀粉糊的水分吸收能力及粘性。
淀粉磷酸化是由属于二激酶家族的一组酶催化的。在马铃薯和拟南芥中鉴定出两种实现淀粉磷酸化的酶，命名为α-葡聚糖水二激酶(GWD，EC 2.7.9.4，即已知的R1蛋白或OK1)和磷酸多糖水二激酶(PWD，EC 2.7.9.5)。前者催化转移ATP的β-磷酸至葡萄糖基的C-3或C-6位置，将γ-磷酸转移至水分子，释放正磷酸，而后者催化转移磷酸至磷酸多糖(已经过GWD磷酸化)和水(Baunsgaard等，2005；Kotting等，2005)。近来，Ritte等建议淀粉中葡萄糖基的3位或6位上的磷酸化是由PWD和GWD分别催化的(Ritte G等，2006)。
马铃薯中编码GWD基因的反义抑制使结合磷酸的淀粉含量下降至80％(
Figure BPA00001186587900041
-Nielsen等，2001)。此外，拟南芥中指定Sex1(Starch Excess表型)基因的突变去除了淀粉磷酸化，表明GWD是主要的酶(Zeeman和Rees，1999)。此外，拟南芥突变株和转基因反义马铃薯的叶片中显示出淀粉过量的表型，表明GWD在过渡淀粉分解中的作用。除了淀粉的磷酸化抑制，没有观察到那些作物中淀粉结构的修饰。然而，GWD反义马铃薯块茎中显示出减低的“低温糖化”(″cold sweetening″)以及叶片中显示出淀粉过量的表型(Lorberth等，1998)。马铃薯作物还显示出块茎数量的增加伴随着各块茎重量的降低，但没有显示出块茎中对淀粉积累的其它影响。过渡淀粉代谢途径受影响的拟南芥Sex1突变体还改变了碳水化合物代谢途径，使生长缓慢，开花延迟(Yu等，2001)。
淀粉分解和淀粉磷酸含量之间的关系尚不清楚。马铃薯的反义系产生的淀粉显示出高度的抵御β-淀粉酶分解的能力，表明淀粉磷酸化可能是β-淀粉酶分解的必要条件。磷酸化残基可能是该酶的靶信号，以在暗期分解淀粉。一些研究表明，α-淀粉酶和R1蛋白(GWD)与淀粉颗粒结合后，淀粉开始分解。
萌发谷类籽粒如小麦中的淀粉分解和磷酸化较少被了解，其是包括组织退化和水解酶诱导以及淀粉分解的高度专一化系统。
小麦是许多国家的主要食物产品，为世界总人口提供了食物的约20％千焦的热量。小麦的加工特性决定了它用于主要以谷类为主的加工产品，如面包、通心面和面条，是优选的原料。随着小麦产量的增加，其消耗也在世界范围内增加。面包小麦(Triticum aestivum)是具有三个不同基因组的六倍体，A、B和D，小麦中大部分已知基因有三个，每个基因组含有一个。面包小麦基因组六倍体这一性质，使得在三个基因组的各基因组中发现和结合基因突变成为挑战。与二倍体物种中易于鉴定的突变相比，三个基因组的存在通过隐藏各基因组中的突变而产生缓冲效果。与玉米或水稻中可获得的变化形式相比，小麦中淀粉结构的已知变化形式是有限的。另一个原因是由于小麦的转化效率滞后于其它谷类。可以认为，小麦淀粉磷酸化中包含的基因及其影响之前未被研究，对双子叶作物马铃薯和拟南芥中淀粉磷酸化的影响是否与单子叶作物如小麦中的相似。
发明概述
本发明一部分是基于作物中内源淀粉磷酸化和/或分解的修饰改变作物生产能力这一发现做出的。在一些实施例中，与对照作物相比，促进了生产潜力的提高，比如但不限于提高的或增加的生物量、活力、萌发、幼苗活力、生长率、高度、总叶面积、单位叶面积的光合速率、单株叶片数量、单株花冠数量、单株分蘖数量、单株籽粒数量、单一花冠籽粒数量、平均籽粒重量、单株籽粒总重、籽粒或块茎的淀粉含量或组成、茎厚度、节间数量、分枝数量、开花数量、花的大小或形状、花色、单株豆荚数量、豆荚大小、单一豆荚籽粒数量、单株结实数量、坐果、果实大小、果实形状、果实颜色、果实品质、抵御疾病、根系质量、生根量、根系长度和/或产率和/或延迟衰老。在其它实施例中，与对照作物相比，提高了作物的内源转葡糖基酶和/或消化率。
因此，在一个实施例中，本发明描述了通过修饰作物中内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解，提高作物生产潜力的方法。在一些实施例中，该方法包括获取与对照作物相比，生产潜力提高的遗传修饰的作物。在一些实施例中，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定一株与对照作物相比，生产潜力提高且含有异源多聚核苷酸的作物。在一些实施例中，该方法包括iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
在另一个实施例中，本发明描述了获取与对照作物相比，内源转葡糖基酶提高的遗传修饰的作物的方法。在一些实施例中，该方法包括该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定一株与对照作物相比，转葡糖基酶提高且含有异源多聚核苷酸的遗传修饰的作物。在一些实施例中，该方法包括iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
在另一个实施例中，本发明描述了获取与对照作物相比，至少某一部位的消化率提高的遗传修饰的作物的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定一株与对照作物相比，至少某一部位的消化率提高且含有异源多聚核苷酸的遗传修饰的作物。在一些实施例中，该方法包括iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
在另一个相关实施例中，本发明描述了测定与对照作物相比，遗传修饰的作物，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高的方法，该方法包括步骤i)获取一株或多株基因组内含有异源多聚核苷酸的作物，以及ii)测定与对照作物相比，所述一株或多株作物，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
优选地，步骤ii)直接鉴定或测定提高的生产潜力、提高的内源转葡糖基酶活性或提高的消化率，包括评价其表型，和/或鉴定作物，其具有修饰的淀粉含量或组成如淀粉磷酸化水平、与对照作物相比提高的生产潜力、至少一些细胞或器官中提高的内源转葡糖基酶或至少某一部位提高的消化率。
本发明还描述了鉴定与对照作物相比，使作物生产潜力提高的基因的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，每株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)测定与对照作物相比，每株的生产潜力以及任意地其内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高，iii)鉴定生产潜力提高的作物，以及iv)鉴定其中的异源多聚核苷酸，从而鉴定基因，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
本发明进一步描述了鉴定与对照作物相比，能够提高作物生产潜力，提高作物内源转葡糖基酶或提高作物至少某一部位的消化率的多聚核苷酸的方法，该方法包括步骤i)获取一个或多个多聚核苷酸，每个核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，ii)将所述异源多聚核苷酸引入前体细胞、组织、器官、种子或作物，iii)繁殖大量上述作物，iv)测定与对照作物相比，至少一株含有异源多聚核苷酸的作物是否提高了生产潜力、提高了内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率，以及v)筛选所述多聚核苷酸。
在一个实施例中，本发明提供了繁殖与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的遗传修饰的作物的方法。在一些实施例中，该方法包括步骤i)获取异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，ii)将所述异源多聚核苷酸引入前体细胞、组织、器官、种子或作物，iii)获取大量上述作物，至少其一基因组内含有所述异源多聚核苷酸，iv)从所述大量作物中鉴定与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的且含有所述异源多聚核苷酸的作物，以及v)筛选该作物，从而繁殖该遗传修饰的作物。在另一个实施例中，该方法包括步骤i)诱变前体细胞、组织、器官、种子或作物，ii)从中获取大量作物，至少其一基因组内含有异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，以及iii)从所述大量作物中鉴定与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的作物。
可通过任何适当的方法将目的异源多聚核苷酸引入作物。在一些实施例中，该方法包括将所述异源多聚核苷酸引入前体细胞、组织、器官、种子或作物并繁殖所述大量作物的步骤。在其它实施例中，所述步骤包括转化和/或诱变所述前体细胞、组织、器官、种子或作物。
在一些实施例中，所述目的因子下调在内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解中包含的酶的编码基因的表达或其功能活性。在特定的实施例中，所述因子下调作物内源淀粉磷酸化。
在一些实施例中，本发明方法进一步包括检测来自作物的核酸样本以得到在淀粉分解和/或淀粉磷酸化中包含的多肽的编码基因的突变。
在一些实施例中，内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是通过改变在淀粉分解和/或淀粉磷酸化中包含的一种或多种酶或调控蛋白的表达或活性进行修饰的，典型的酶选自下述组，所述组包括α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、淀粉磷酸化酶(EC2.4.1.1)、转葡糖基酶(EC 3.1.33)、蔗糖酶-异麦芽糖酶(EC3.2.10)、淀粉麦芽糖酶(EC 2.4.1.25)、麦芽糖酶(EC 3.2.1.20)、异淀粉酶和α-葡聚糖水二激酶(α-glucan，water dikinase，GWD，EC 2.7.9.4)。在特定的实施例中，内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是通过提高α-淀粉酶或β-淀粉酶的表达活性，和/或降低GWD的表达活性进行修饰的。在一些实施例中，该方法进一步包括降低磷酸多糖水二激酶(phosphoglycan，water dikinase，PWD，EC 2.7.9.5)的表达活性。在优选实施例中，所述调控蛋白不是拟南芥和/或马铃薯中sex1和/或sex4基因编码的蛋白。
在一些实施例中，所述目的因子表达于作物的贮藏器官，如发育的籽粒、根、块茎或茎中。在特定的实施例中，所述因子表达于作物的光合活性组织中。在其它特定的实施例中，所述内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是过渡淀粉的。
在一些典型的与提高内源转葡糖基酶有关的实施例中，所述转葡糖基酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或转葡糖基酶或它们的组合。
本发明描述的方法不限于特定作物类型。参考作物包括选自下述作物：草、蔬菜、谷类、豆类和结实或开花作物。在一些实施例中，所述谷类为小麦、谷物(玉米)、大麦、水稻、黑麦、燕麦、小米、高粱、黑小麦、荞麦、福尼奥米、茱藜、斯佩尔特小麦、硬粒小麦、面包小麦、单粒小麦、苋菜、野生稻或画眉草。
在上述方法的一些实施例中，所述目的遗传修饰的作物进一步含有异源多聚核苷酸，其编码的因子下调α-淀粉酶或β-淀粉酶的表达或活性，或α-淀粉酶或β-淀粉酶编码基因的突变。在一些实施例中，作物选自至少一种作物器官中α-淀粉酶或β-淀粉酶的表达或活性降低的作物。在一些实施例中，所述因子表达于贮藏器官中或所述α-淀粉酶或β-淀粉酶编码基因表达于贮藏器官中。在其它实施例中，所述因子为下调二激酶表达的RNA分子。在一些实施例中，转葡糖基酶结合下调表达，如α-淀粉酶和β-淀粉酶。
另一方面，本发明提供通过本发明方法生产的作物、作物部分和作物产品，它们的应用以及作物、作物部分和作物产品的加工。所述作物或作物部分可根据本发明描述的任一方法或它们的任意组合进行修饰。因此，本发明提供了通过本发明方法获取的、生产的或鉴定的遗传修饰的作物。参考作物或作物部分包括作物的籽粒、叶片、茎、根、块茎、花、果实、豆荚或从作物得到的插条部分。
更具体地，本发明描述了遗传修饰的作物，其基因组内含有异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，其中所述作物特征在于，与对照作物相比，其具有修饰的淀粉磷酸化和/或淀粉分解，此外其具有提高的生产潜力、提高的内源转葡糖基酶和/或至少某一部位提高的消化率。
因此，在一些实施例中，本发明提供了遗传修饰的作物，其基因组内含有引入的突变，该突变基因编码内源淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶，其中所述作物特征在于，与对照作物相比，其具有提高的生产潜力、提高的内源转葡糖基酶和/或至少某一部位提高的消化率。
在其它实施例中，本发明提供了遗传修饰的作物，其基因组内含有一个或多个异源多聚核苷酸，各多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，其中所述作物特征在于，与对照作物相比，至少所述作物的一部分具有降低的淀粉磷酸化和/或淀粉分解，作物成熟籽粒中提高的或降低的转葡糖基酶，优选为淀粉酶的表达和/或活性，以及提高的生产潜力。在其它实施例中，所述的作物其至少在作物的第一器官中显示出靶淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶降低的水平且任意地，至少在作物的第二器官中显示出靶淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶升高的水平，其中第一或第二器官为相同的或不同的器官。在一些实施例中，所述靶多肽或酶选自由下述物质组成的组：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、淀粉磷酸化酶、转葡糖基酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶、淀粉麦芽糖酶、麦芽糖酶、异淀粉酶和α-葡聚糖水二激酶。
在典型的实施例中，所述因子下调在内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解中包含的酶的表达或功能活性。在一些实施例中，所述因子下调二激酶的水平或功能活性。在一些实施例中，所述二激酶为GWD或GWD和PWD。
在一些实施例中，所述因子表达于作物的贮藏器官中。在其它实施例中，所述因子表达于作物的光合活性组织中。在典型的实施例中，所述淀粉磷酸化和/或淀粉分解是过渡淀粉的。
本发明还提供叶片和/或谷粒中降低的淀粉磷酸化以及谷粒中升高的转葡糖基酶的谷粒。除了提高作物生产力之外，两个特征的结合给谷粒的应用带来了特殊的益处。与对照作物相比，二者的结合使淀粉磷酸化下降至至少50％，优选至少70％，至少80％，至少90％或至少95％。与对照作物相比，二者的结合使转葡糖基酶，优选为α-淀粉酶升高至至少100％，优选至少200％，至少300％或更优选500％。
本发明中描述的作物组合物不限于特定的作物类型。参考作物包括作物选自：被子作物、单子叶作物、双子叶作物、草、蔬菜、谷类、豆类和结实或开花作物或这些类别的任意组合形成的亚类。在一些实施例中，修饰的双子叶作物被改良。在特定的实施例中，禾本科单子叶作物如谷类作物、甘蔗、甜菜、高粱、黑麦等生产力增加。
在一些实施例中，谷类为小麦、谷物(玉米)、大麦、水稻、黑麦、燕麦、小米、高粱、黑小麦、荞麦、福尼奥米、茱藜、斯佩尔特小麦、硬粒小麦、面包小麦、单粒小麦、苋菜、野生稻或画眉草。小麦可以是面包小麦(六倍体小麦)、硬粒小麦或黑小麦。玉米优选为马齿型玉米，可以是白玉米或黄玉米。在一些实施例中，作物并非拟南芥和/或玉米。
在一些实施例中，所述表达调控序列优先调控贮藏器官中和/或作物光合活性组织中多聚核苷酸的表达。
在其它实施例中，所述作物进一步含有多聚核苷酸，其可操作地连接于编码下调淀粉酶活性的因子的转录调控序列。
在其它实施例中，所述作物部分特征在于与对照作物部分相比，具有修饰的淀粉含量或组成，提高的生产潜力，提高的内源转葡糖基酶或提高的消化率。
在特定的实施例中，本发明提供了含淀粉的籽粒，其中籽粒淀粉中葡萄糖-6-磷酸的水平低于10ng/mg淀粉，籽粒粉中淀粉酶活力水平至少为4个单位/g粉。
本发明涉及遗传修饰的作物的产品。
在一个实施例中，本发明提供产品，其为加工的谷物、面粉、全麦粉或至少部分纯化的淀粉，其中所述产品与对照作物的产品相比，具有修饰的淀粉含量或总淀粉组成。
本发明公开了生产产品的方法，包括使作物生长和/或收获作物或部分遗传修饰的作物。在一些实施例中，所述方法用于从遗传修饰的作物中生产加工的谷物、面粉、全麦粉或至少部分纯化的淀粉，包括加工作物局部如谷粒。
在其它实施例中，本发明提供了生产食物产品的方法，包括将所述作物或部分或所述产品与另一食物成分混合，并任意烹调、烘烤、油煎、蒸煮、煮沸、挤压或其它加工所述混合物的方法。
在另一个实施例中，所述产品为发酵产品，本发明描述了发酵产品的方法，所述产品为加工的谷物、面粉、全麦粉或至少部分纯化的淀粉，其中所述产品与对照作物的产品相比，具有修饰的淀粉含量或修饰的总淀粉组成，或通过从遗传修饰的作物中加工作物局部如谷粒生产的面粉或淀粉。在一些实施例中，所述发酵产品为乙醇。
在另一个实施例中，本发明提供供给人类或动物食物的方法，包括将此处或上述遗传修饰的作物、作物部分、产品或通过所述方法生产的产品提供给人类或动物。在一些实施例中，本发明提供通过上述或此处方法生产的产品。
另一方面，本发明公开了应用异源多聚核苷酸生产与对照作物相比，生产潜力提高、内源转葡糖基酶提高或其籽粒或其器官的至少一部分消化率提高的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
在另一个实施例中，本发明提供此处或上述遗传修饰的含淀粉的作物或其部分的应用，生产食物产品或非食物产品，或作为动物饲料以增强动物的生长或健康。在一些实施例中，所述产品为乙醇。
在另一个实施例中，本发明公开了应用作物或其部分生产人类消耗的食物，其中作物或其部分通过引入至少两个异源多聚核苷酸进行遗传修饰，其中作物特征在于，其生产潜力提高，作物叶片中的淀粉磷酸化和/或淀粉分解降低，作物籽粒中的内源转葡糖基酶降低，其中各异源多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
在另一个实施例中，本发明提供了鉴定或使用与对照作物相比，作物生产潜力、提高的内源转葡糖基酶或籽粒或至少作物的部位消化率提高的分子标记的方法，该方法包括获取作物的核酸样本，鉴定编码作物GWD基因的多态性或其遗传连接。
在另一个实施例中，本发明提供了测定作物的方法，包括获取作物的核酸样本，处理样本以测定GWD基因中选择核苷酸的同一性，并鉴定任何与作物生产潜力有关的核苷酸。
本发明提供新的核酸分子。在一个实施例中，本发明描述了含有编码α-葡聚糖水二激酶多肽或与其互补的核苷酸序列的分离的或嵌合的核酸分子，所述α-葡聚糖水二激酶多肽含有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其生物活性部分或至少具有SEQ ID NO：3序列90％同源性的变化形式。
在另一个实施例中，本发明提供了含有与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10(水稻GWD)或SEQ ID NO：11，12，13或14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其编码蛋白或其生物活性部分或与SEQ ID NO：2(小麦GWD)或SEQ ID NO：5(小麦GWD)或SEQ ID NO：8，9或10(水稻GWD)或SEQ ID NO：11，SEQID NO：12，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其蛋白编码区90％序列同源性的变化形式一致或互补的核苷酸序列的分离的或嵌合的核酸分子。
在一些实施例中，本发明描述了含有在严格条件下与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8，9或10所示核苷酸序列或其编码蛋白或其生物活性部分或与SEQ ID NO：2(小麦GWD)或SEQ IDNO：5(小麦GWD)或SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10(水稻GWD)或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其蛋白编码区90％序列同源性的变化形式杂交的核苷酸序列的分离的或嵌合的核酸分子。
在一些实施例中，本发明提供了含有与转录调控序列可操作连接的核酸分子的嵌合核酸构型。在一些实施例中，本发明提供了能够降低谷类作物中编码具有GWD活性的多肽的基因表达的分离的或嵌合的核酸分子。在一些实施例中，所述的核酸分子为或编码反义RNA、共抑制RNA、双链RNA、发夹RNA或核酶。
在一些实施例中，本发明描述了应用分离的或嵌合的核酸分子降低谷类作物中编码具有GWD活性的多肽的基因的表达。
在另一个实施例中，本发明提供了含有20个连续核苷酸的单链核酸探针，其中所述20个核苷酸的核苷酸序列与含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8，9或10(水稻PWD)或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其编码蛋白或其生物活性部分或与SEQ ID NO：2(小麦GWD)或SEQ ID NO：5(小麦GWD)或SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10(水稻PWD)或SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQID NO：13或SEQ ID NO：14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其蛋白编码区90％序列同源性的变化形式的核酸分子的补体序列相同。
在另一个实施例中，本发明提供了含有20个连续核苷酸的单链核酸探针，其中所述20个核苷酸的核苷酸序列与含有在严格条件下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10(水稻PWD)或SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其编码蛋白或其生物活性部分或与SEQ ID NO：2(小麦GWD)或SEQ ID NO：5(小麦GWD)或SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10(水稻PWD)或SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14(高粱GWD)所示核苷酸序列或其蛋白编码区90％序列同源性的变化形式杂交的核苷酸序列的核酸分子序列相同。
在另一个实施例中，本发明提供了含有20个连续核苷酸的单链核酸探针，其中所述20个核苷酸的核苷酸序列与含有编码α-葡聚糖水二激酶多肽的含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或其生物活性部分或至少90％SEQ ID NO：3序列同源性的变化形式的核酸分子的补体序列相同。
在另一个实施例中，本发明提供了附着于固体支持物的核酸分子阵列，该阵列含有的寡核苷酸选择性地与含有谷类作物中编码具有GWD活性的多肽的基因的核酸分子杂交。
在另一个实施例中，本发明提供了含有上述分离的或嵌合的核酸分子或含有与转录调控序列可操作连接的所述核酸分子的构型的表达载体、宿主细胞、作物细胞、作物局部、作物或籽粒。在一些实施例中，所述构型表达于宿主细胞、作物细胞、作物、作物局部或籽粒中，本发明提供了生产谷类GWD多肽或其变化形式的方法，或生产生物活性片段或其变化形式的方法，所述方法包括在宿主细胞、作物细胞、作物、作物局部或籽粒中表达该构型。
因此，在一些实施例中，本发明提供了改良作物的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定一株与对照作物相比，生产潜力提高且含有异源多聚核苷酸的作物，以及iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，其中所述遗传修饰的作物与对照作物相比，提高了生产潜力。
在另一个相关实施例中，本发明描述了改良作物的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定一株与对照作物相比，转葡糖基酶提高且含有异源多聚核苷酸的遗传修饰的作物，以及iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，其中所述遗传修饰的作物与对照作物相比，提高了内源转葡糖基酶。
在另一个实施例中，本发明描述了改良作物的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定一株与对照作物相比，至少某一部位的消化率提高且含有异源多聚核苷酸的遗传修饰的作物，以及iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，其中所述遗传修饰的作物与对照作物相比，提高了至少某一部位的消化率。
在另外的实施例中，本发明描述了改良作物的方法，该方法包括步骤i)获取一株或多株基因组内含有异源多聚核苷酸的作物，以及ii)测定与对照作物相比，所述一株或多株作物，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，其中所述遗传修饰的作物与对照作物相比，提高了生产潜力，提高了内源转葡糖基酶或提高了至少某一部位的消化率。
在另外的实施例中，本发明描述了改良作物的方法，该方法包括步骤i)获取异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，ii)将所述异源多聚核苷酸引入前体细胞、组织、器官、种子或作物，iii)获取大量上述作物，至少其一基因组内含有所述异源多聚核苷酸，iv)从所述大量作物中鉴定与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的且含有所述异源多聚核苷酸的作物，以及v)筛选该作物，从而繁殖该遗传修饰的作物，其中所述遗传修饰的作物与对照作物相比，提高了生产潜力，提高了内源转葡糖基酶或提高了至少某一部位的消化率。
在另外的实施例中，本发明描述了改良作物的方法，该方法包括步骤i)诱变前体细胞、组织、器官、种子或作物，ii)从中获取大量作物，至少其一基因组内含有异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，以及iii)从所述大量作物中鉴定与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的且含有所述异源多聚核苷酸的作物，其中所述遗传修饰的作物与对照作物相比，提高了生产潜力，提高了内源转葡糖基酶或提高了至少某一部位的消化率。
附图说明
图1图表显示了rsGWD转基因小麦系的谷物淀粉中葡萄糖-6-磷酸G6P含量。
图2图表显示了rsGWD转基因小麦的谷物淀粉中淀粉酶含量。
图3图表数据显示了rsGWD转基因小麦的谷物淀粉的溶胀力。
图4图表数据显示了rsGWD转基因小麦的谷物淀粉(或者是不含α-淀粉酶抑制剂的全麦粉，或者是含有α-淀粉酶抑制剂的纯化淀粉)的糊化性质(淀粉粘性)。
图5数据显示了与对照相比，提高的rsGWD转基因小麦籽粒的α-淀粉酶活力。
图6图片显示了rsGWD转基因小麦提高的活力、生物量和产率。
图7图表数据显示了rsGWD转基因小麦系的过渡(叶片)淀粉中降低的G6P含量水平。
图8图表数据显示了不同遗传背景的转基因小麦系中每株增加的穗状花序量。
图9图表数据显示了与对照相比，rsGWD转基因小麦籽粒提高的α-淀粉酶活力。
表格说明
表1提供了本发明SEQ ID NOs的说明。
表2提供了氨基酸亚类。
表3提供了典型的氨基酸取代。
表4提供了rsGWD转基因小麦的粘度值。
表5提供了rsGWD转基因小麦的生长分析(籽粒重量、籽粒产率)结果。
表6提供了rsGWD转基因小麦的生长分析(叶面积、分蘖、花冠)结果。
表7提供了与水稻GWD相比，小麦的外含子/内含子结构。
优选实施方式详述
下文中所有说明书和权利要求中，除非上下文中有要求，术语“包含(comprise)”及其变体，如“包含(comprises)”和“含有(comprising)”应该被理解为表示包含规定的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它的整数或步骤或整数或步骤的组。不论短语“由...组成(consisting of)”跟随的是什么，“由...组成(consisting of)”的含义都为“包括(including)”且仅限于。因此短语“由...组成(consisting of)”表示列出的成分是必须的或强制性的，并且没有其它成分存在。″基本由......组成(consisting essentially of)″表示包含短语后列出的任何成分，并限于那些不会对公开的列出成分的活性或特定功能有干扰或贡献的其它成分。因此，短语″基本由...组成(consisting essentially of)″表示列出的成分是必须或强制性的，但可选择性地有其它成分，其根据它们是否会影响列出成分的活性或功能而出现或不出现。
除非有特别规定，否则本说明书中的每个具体实施方式均可通过适当变动而变成其它的具体实施方式。
核苷酸及氨基酸序列用序列标识码(SEQ ID NO：)表示。SEQ IDNos对应序列标识中的数字，<400>1(SEQ ID NO：1)，<400>2(SEQ IDNO：2)，等。序列标识的说明见实施例后的表1。权利要求书后给出了序列列表。
除非进行定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本领域技术人员对其适合于发明的一般理解的含义相同。尽管任何与本文中描述的相类似或等价的方法和物质都可以用于实施或测试本发明，但是本文描述了优选的方法和物质。为了实现本发明的目的，下文对下列术语进行了定义。
本文中使用的冠词“一(a)”和”一种/一个(an)”是指一件或多于一件(即至少一件)的文章的语法对象。例如，“成分”是指一种成分或多于一种成分。
本文中使用的术语“约(about)”是指数量、水平、价值、尺度、长度、位置、尺寸或含量在所述数量、水平、价值、尺度、长度、位置尺寸或含量水平的30％左右范围变化，优选20％范围左右，更优选10％范围左右。
淀粉
本发明是基于如下发现的，植物中特别是叶片中淀粉磷酸化和淀粉降解中的基因的改性表达与植物的产量参数，如谷物产量的惊人影响相关。由于之前的研究已经表明，改性淀粉的合成或贮藏会导致产量的降低，因此其是令人惊讶的。通常不期望叶片中过渡淀粉磷酸化或降解减少，其包括将固定碳聚集到植物的其它部分，会导致产量增加。
“淀粉”在本文中被定义为：基本上由α-吡喃葡萄糖构成的多糖。淀粉是植物，如谷物包括小麦中贮存的主要碳水化合物。淀粉被合成为淀粉体并以颗粒形式形成且贮藏在生长中的贮藏器官，如谷物中；本文中指“贮藏淀粉”。它包括直链淀粉，基本上线性(＜0.1％的分支)的α-1，4-D-吡喃葡萄糖聚合体，和支链淀粉，其具有α-D-吡喃葡萄糖的短链单元，其是预先通过α-1，4键与α-1，6连接分支连接的。来自野生型植物的谷物淀粉包括高达约20％-30％的直链淀粉和约70％-80％的支链淀粉。直链淀粉和支链淀粉的另一个显著不同在于聚合体的分子量。直链淀粉具有螺旋状的构造，具有104-106道尔顿的分子量，而支链淀粉具有约107至108道尔顿的分子量。最近的研究表明，在直链淀粉中可能存在约0.1％的α-1，6-糖苷分支点，因此其被称为“基本上线性”。“直链淀粉”在本文中被定义为包括基本线性分子的，连接有α-1，4糖苷(吡喃葡萄糖)单元，且直链淀粉状的长链支链淀粉(有时也被称为“中间物质”或“直链淀粉状支链淀粉”Takeda等，1993b；Fergason，1994)。本文中定义的淀粉中直链淀粉的比例是基于重量/重量(w/w)的，即直链淀粉重量相对于谷物淀粉总重量的百分比。直链淀粉含量可以通过本领域已知的任意方法测定，包括HPLC尺寸排除法，例如在90％(w/v)的DMSO中，刀豆素A法(Megazyme Int，Ireland)，或优选通过碘量法，例如实施例1中所描述的。HPLC法可以包括淀粉的脱支(Batey and Curtin，1996)或不包括脱支。
淀粉是最初在叶子和植物的其它绿色组织中合成并累积作为光合作用的产物。本文中的淀粉是指“过渡淀粉“或类似物，这是因为，与种子或块茎中的淀粉相比，其白天在光合作用组织中累积而至少在晚上降解。因此，合成酶和降解酶都会同时在细胞中存在，且系统会每天进行调节。在晚上，过渡淀粉被水解成糖，基本上是蔗糖，其从供源组织被传送到能源贮存组织而作为新陈代谢的能量来源被用于植物生长或作为贮藏淀粉被贮藏在组织中。近来Zeeman等于2004研究了叶片中过渡淀粉的分解。该分解通过酶，如淀粉酶，脱支酶，α-葡聚糖磷酸化酶和葡聚糖转移酶的功能实现。
几乎所有的植物淀粉都可被磷酸化成具有C3和C6羟基基团长度的支链淀粉，但是磷酸化作用的程度的变化取决于植物的种类。马铃薯块茎淀粉通常在每mg淀粉中具有25nmoles的葡糖糖-6-磷酸，范围在0.2-0.4％(w/w)。马铃薯淀粉中的多数磷酸盐基团是与支链淀粉连接的，仅有非常少的与直链淀粉连接。与马铃薯淀粉相比，谷物淀粉仅含有0.02-0.04％的磷酸盐。本文中使用的“磷酸化淀粉”是指那些在葡糖糖单位的C-3和/或C-6位置连接有磷酸盐基团作为单酯的淀粉。淀粉样品中磷酸盐基团的水平可以通过本领域已知的方法测定，优选通过实施例1中所描述的孔雀绿方法测定，其通常表示为每毫克淀粉中的毫摩尔数。淀粉样品中残留的葡糖基-6-磷酸盐可以通过实施例1中所描述的葡糖苷酶测定法测定。
淀粉的降解
所有叶片和发芽种子中的淀粉降解的初始步骤包括：内切淀粉酶(α-淀粉酶，EC3.2.1.1)，其在发芽种子中是由糊粉层分泌的，但是在叶片中其存在叶绿体中。该酶在特定点攻击淀粉的淀粉颗粒而使颗粒表面凹陷。对淀粉分子的进一步攻击通过α-葡聚糖磷酸化酶(EC2.4.1.1)，其由α-1，4葡聚糖链的非还原性末端产生葡萄糖-1-磷酸盐，以及脱支酶，如异淀粉酶(EC3.2.1.68)和支链淀粉酶(EC3.2.2.142)进行，它们去除α-1，6支点。其中包括的其它酶有，外切型淀粉酶，β-淀粉酶(EC3.2.1.2)，其从葡聚糖链的非还原性末端释放出麦芽糖，岐化酶(D-酶，EC2.4.1.25)和α-葡糖苷酶(麦芽糖酶，EC3.2.1.20)或麦芽糖磷酸化酶(EC2.4.1.8)，其能作为直链。在拟南芥和其它双子叶植物中，β-淀粉酶的活性超过其它葡聚糖-代谢酶约一个数量级，且在叶绿体的内部和外部都有出现。葡聚糖，水二激酶(GWD，EC2.7.9.4)能够调节其它酶攻击淀粉颗粒的程度。GWD将ATP的β-磷酸转移到支链淀粉中糖基单元的C6或C3位置，且该磷酸的存在可能是降解发生的信号。我们认为：磷酸基团的存在可能会改变葡聚糖链之间或与蛋白质之间的静电作用，而使该过程开始。在淀粉降解期间，GWD是与叶片淀粉颗粒结合的(Ritte等，2000)，且其在该阶段具有更高的活性。至少在一些植物中，通过昼/夜的循环GWD自身的活性似乎也被调节为昼夜模式的。
减少马铃薯中GWD(也叫作R1蛋白或OK1)表达的反义实验减少了高达90％结合了磷酸的淀粉(-Nielsen等，2001)。Arabidopsis thaliana中同源基因的突变(称为淀粉过显型sex1)与淀粉磷酸含量的抑制作用有关，并证实在淀粉的磷酸化中包含GWD(Zeeman和Rees，1999)。此外，拟南芥突变体和马铃薯抑制系都表现出“淀粉过量”的表型，其中累积的淀粉超过了叶片中的普通水平，证实了GWD在过渡淀粉降解中的作用。在这些研究中没有观察到这些植物中淀粉结构的变化。马铃薯块茎中淀粉磷酸含量的降低伴随着马铃薯块茎的“低温糖化”的减少(Lorberth等.，1998)，这表明淀粉酶或其它水解酶的活性降低了。拟南芥sex1突变体影响其中过渡淀粉的代谢，也会改变碳水化合物的代谢，使其生长缓慢并延迟开花(Yu等，2001)。
2005年，Baunsgaard等定义了一种新类型的水二激酶，磷酸葡萄糖水二激酶(PWD)。该酶既与GWD类似却又不同，其会在之后的预磷酸化淀粉的磷酸化中被激活(Kotting等，2005)。Ritte等提出，淀粉中C3或C6位置的葡萄糖残基的磷酸化作用可通过PWD和GWD分别催化(Ritte G.等，2006)。
发芽谷物种子中淀粉的降解和磷酸化部分已知，但是其是包括组织退化和水解酶诱导的高度专门的系统。
在一些具体实施方式中，本发明提供了通过改变植物中淀粉磷酸化和/或降解作用而提高了植物的生产率或利用度，且其是基于对两者联系的观测结果的。淀粉磷酸化和/或降解的修饰可存在于过渡淀粉中，例如，在植物叶片中，或是在例如谷物的贮藏淀粉中，或者存在于两者中。根据本发明，植物的修饰，特别是谷类作物，包括却不限于叶片和/或胚乳中的一种或多种对淀粉磷酸化和/或降解(分解)酶的活性或含量的改变。
本文中使用的“修饰”表示，对物质或其功能的变化，其可以是产品数量、活性、比例，钝化率，分解率的增加或减少，开始延迟，开始提前，物质增加或去除，突变或它们的任意组合，只要最终是功能上的改变即可。本文中使用的“对功能水平的调节”或类似术语表示，感兴趣的基因或蛋白质的功能水平的增加或降低。“功能水平”应该被理解为是指活性蛋白的水平，in casu蛋白能够进行淀粉磷酸化或淀粉降解的水平。该功能水平是与宿主细胞中存在的蛋白质的实际水平和蛋白质的特定活性相关的。因此，例如功能水平可以通过增加或降低宿主细胞中的实际蛋白浓度来改变，其可以通过改变基因编码蛋白的表达而容易地实现。功能水平还可以通过调节蛋白的特定活性来改变。特定活性的增加或降低可以通过用更高或更低的特定活性表达或通过用该变量的等位基因编码代替相关蛋白的内源基因编码来获得。特定活性的增加或降低还可以通过效应分子的表达来激活。在某个具体实施方式中，酶的适当编码顺序或活性或含量的表达水平是经过选择的，其比参照的表达水平高出至少约10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少80％或甚至至少约100％，至少200％，至少500％，或至少1000％；或比其低至少约10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％，或降低到无法检测的水平。
本文中使用的术语“修饰”，“改变”，“增加”，“减少”，“降低”，“已降低”，“抑制”，“突变”或类似词汇被认为是相对性的术语，即与野生型或未改变型比较。本文中的野生型植物也是指“对照植物”，且该术语可以转换的。“蛋白水平”是指特定蛋白的量，如GWD，其可以通过本领域已知的任何方法测得，例如Western印迹分析法或其它免疫学方法。“酶活性水平”是指酶检验中测定的特定酶的量。如果生产了更多或更少的活性蛋白，但是却不是蛋白自身的表达水平(量)，则酶活性水平能在突变体中被改变就是我们所期望的。相反，蛋白的量会被改变，而活性(每单位蛋白)却保持不变。含量和活性都减少也是可能的，例如，当酶的基因编码表达在转录或转录后被降低时。在某个具体实施方式中，与叶片或未修饰的谷物，如小麦胚乳中的蛋白水平或活性相比，例如GWD的蛋白水平或活性降低了至少40％，或至少60％，或至少75％，至少90％或至少95％。蛋白水平或酶活性水平或基因表达水平的减少可以在叶片、种子或谷物的生长的任何阶段发生，特别是在白天，当光合作用发生时，或在谷物灌浆期，这时淀粉会在生长的胚乳中合成，或在谷物生长成熟过程中的所有阶段发生。本文中使用的术语“野生型”具有其在遗传学领域的普通含义，且其包括植物、特别是谷物，栽培作物或基因型，其在本文的教导中是未被修饰过的。公众容易获得的优选“野生型”品种有：面包小麦(breadwheat)，品种Bob White；玉米(Zea mays)，Roundup Ready Corn 2；水稻，Nipponbare；高粱(Sorghum bicolor)，品种Sumac。
在一个实施例中，植物叶片或胚乳中的改变包括GWD量和/或活性的减少，其会导致在叶片和/或成熟种子，如谷粒的淀粉中的磷酸含量的降低。在另一个实施例中，修饰包括PWD和GWD活性的降低。在其它的实施例中，修饰包括谷粒中的GWD的减少以及淀粉酶活性的升高，尤其是α-淀粉酶。其它上述相关的淀粉降解酶也可能改变，包括β-淀粉酶、磷酸化酶或淀粉脱支酶，如异淀粉酶或支链淀粉酶。改变可以是，例如，活性增加，活性降低，活性作用的位置或时间改变。当这些酶的改变联合起来，除磷酸含量之外的淀粉的性质也会改变。在一个实施例中，改性植物，尤其是谷类植物，包括在胚乳中的多种淀粉降解酶活性的改变，特别是包括了GWD活性的降低，导致了谷类淀粉中磷酸含量的降低。在另一个实施例中，在除胚乳或叶片之外的植物组织中的一种或多种的淀粉降解酶的活性会改变，如胚乳中GWD的活性有可能会增加，其是为了补偿由转基因编码的主要在叶片中表达的GWD抑制分子引起的活性损失，或者是胚乳中淀粉酶尤其是α-淀粉酶的活性会降低。酶活性的改变可能是量的增加或减少，也可能是表达时间的改变。淀粉的合成可以通过一种或多种的淀粉生物合成酶的过表达并联合GWD的降低来进一步提高。编码这些酶的基因可以来自于本领域中已知的各种来源，如来源于细菌，谷类或其它来源，其被改造以改变催化特性，如改变酶与温度的关系(例见WO 94/09144)。
可以通过部分或完全抑制GWD基因，或GWD和PWD基因的表达来获得经过修饰的表型。此处使用的“低淀粉磷酸含量”的表型等指的是从植物或植物部分(如叶片或谷粒)中获得的全部淀粉具有少于0.02％的淀粉磷酸含量，或相对相应的对照淀粉来说，减少至少50％。基因被抑制的程度在某种程度上决定了麦粒中淀粉的特性。从改造的小麦胚乳中提取的蛋白的凝胶电泳结果显示出GWD和/或PWD活性改变的本质和程度。改变可以是GWD活性的降低，或酶活性的完全丧失，或改变在叶片或胚乳中的GWD或其它酶的分布。例如，可以通过影响胚乳中酶的分布而减少GWD或其它的活性，比如减少颗粒结合型淀粉的酶水平。为实施检测，从小麦胚乳中提取出淀粉并分析其中的蛋白(Rahman等，1995)。采用本领域已知的技术如SDS-PAGE和免疫印迹对可溶性淀粉颗粒片段进行了分析，其结果用来确定植物或谷物中GWD或其它酶发生改变的位置。
可以通过向谷类，尤其小麦植株中导入一种或多种遗传变异来获取淀粉磷酸化或降解酶的活性的改变。即，遗传变异直接或间接地导致了植物局部在生长期或发育期的酶活性的改变，最终形成了上述的改性淀粉。遗传变异可以是将异源多聚核苷酸通过如转化或诱变的方式引入植物或祖细胞中。遗传变异随后通过杂交引入不同的遗传背景，此为已知的植物育种技术。
组织或植株部分中的GWD或淀粉酶的量或活性可以采用本领域任何已知的方法测定，例如，通过酶分析，免疫检测方法，Western 印迹或ELISA分析，或相关的mRNA水平可以通过如Northern印迹杂交技术或反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来测定。在淀粉合成过程中，也可以通过测定磷酸化淀粉的水平来显示酶的水平。在其胚乳中具有改变的特殊蛋白水平或酶活性的谷类作物或谷粒可以通过降低的蛋白水平或酶水平(直接检测)来筛选，也可以基于小麦植株的谷粒的表型如升高的或降低的磷酸水平、或植株或植株部分的可视表型来筛选，其中可视表型例如为缩小的谷粒、或淀粉颗粒性质改变或植株形态学改变。此处使用的具有改变的淀粉性质的小麦植株可以通过本领域已知的任何方法鉴别，直接检测其中淀粉的性质，或间接地，例如，检测植株或谷粒中遗传变异的存在。植株可以是众多小麦作物家族中的一株，例如，小麦育种家族中的一株。
生产潜力
本发明提供了增强生产特性的植物。可提高的生产特性包括但不限于，对栽培者有益的特性如生长、产率、生物量和活力等，还有相关的特性，如抗压、抗旱、抗害虫或疾病、或者改良的花或叶的感官质量；对收获自植物的农产品的消费者有益的特性，如在人类食品或饮品或动物饲料中提高营养物质或风味物质含量，或对食品业或加工业有益的特性，如提高加工特性。在这些用途中，植物通常是为了其谷物、果实和其它植物部分的用途而生长，其它植物部分包括叶、茎、壳、蔬菜部分和在人类或动物食物或饮料中作为部分动物饲料用途或用于观赏植物用途。在一个实施例中，本发明的植物材料具有作为青贮动物饲料的新用途，例如在公开号为US2006/0150278的美国专利申请中所描述的，其作为参考文献引入本文。在该具体实施方式中，优选异源多聚核苷酸由转录调控序列表达，其优选在植物的营养部分中表达，优选叶子或茎，且更优选异源多聚核苷酸在植物种子中以低水平或不能检测的水平表达。
根据感兴趣的参数，可以采用本领域已知的任何方法测定增加的生产潜力。
如实施例中所述，淀粉磷酸化下降的作物导致下游调控GWD的产量也表现出α-淀粉酶水平增强。因此，在一些具体实施方式中，说明书提供了一种生产与对照植物相比，降低了淀粉磷酸化水平和提高了内源糖化酶水平的遗传修饰作物的方法，该方法包括，从大量作物中选择一株，其中在大量作物的基因组内含有与转录调控序列可操作连接的异源多聚核苷酸，其编码因子下游调控内源淀粉磷酸化，该植株下游调控淀粉磷酸化的活性以及与对照植株相比，其中内源糖化酶水平增加。任选地，内源多聚核苷酸可以是突变基因，例如包括诱变，相应的野生型基因编码包含于淀粉磷酸化中的酶或调节蛋白，其中突变的结果是降低淀粉磷酸化。本文中使用的“大量作物”是指，至少两种作物，优选至少10种物，更优选至少50、100或200种作物。通常，大量作物中的每一种都包括转基因或诱变的，但并不是所有的都表现出同样的修饰程度，而是表现出一定影响程度内的范围。因此，本发明的方法可以包括一个选择或鉴别的步骤，其中鉴别并选择出具有最佳修饰水平的植物。
在一些具体实施方式中，淀粉降解或淀粉降解中包括的酶的水平或功能活性，或淀粉磷酸化被降低到比相应的对照植物低约80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％或15％的水平，更适宜被降低到低约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的水平，而获得生产潜力的提高。在一个具体的实施方式中，淀粉降解或淀粉降解中包括的酶的水平或功能活性的降低或淀粉磷酸化下游调控光合作用组织例如叶片而获得生产潜力的提高，或选择性地是淀粉贮藏器官，优选种子。更优选，在该具体实施方式中，上述的减少会使生产潜力充分增加，与相应的在同样的环境条件下生长的对照植物相比，该生产潜力通常能有至少约20％，25％或30％，但是特别是至少约40％，45％，50％或55％，更特别是至少约60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的增加。淀粉降解减少的量或所需淀粉磷酸化的减少可能还取决于其它因素，例如植物品种或品系以及淀粉降解的水平、位置或时机或淀粉磷酸化酶活性和/或其在淀粉降解途径中的底物和/或辅助分子或辅助因子的水平或活性。但是，可以认为在该方法中可能需要的任何优化是可以用那些包括本文中所述的常规方法获得。
淀粉降解减少可以在整个植物的组织中实现，例如用组成型启动子驱动异源多聚核苷酸的表达以调控下游淀粉降解。选择性的，其可以在源组织(叶片)、输送组织或能源贮存组织(胚乳)中用组织特异性或生长调节启动子来实现。本文中使用的“能源贮存细胞”和“能源贮存组织”是指那些包括有机碳净流入的细胞、组织或器官，流入的有机碳是以除了例如二氧化碳的固定型之外，如糖或其它碳水化合物的形式进入细胞。在植物中，能源贮存组织包括所有非光合作用组织以及具有被其它光合作用细胞固定的有机碳净流入，或者反之，靠除二氧化碳的直接固定之外的方式而从周围介质或环境中获得有机碳的光合作用组织。
在另一个具体实施方式中，内源淀粉磷酸化水平通过使用不同功能活性的淀粉磷酸化酶来调节。这可能是由在其中完成淀粉降解的细胞室中的酶的特定活性或稳定性的不同而引起。在某些具体实施方式中，用于降解内源淀粉的淀粉降解酶的活性与对照植物中的相应酶的水平相比提高了至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％，或提高至少约100％，200％，300％，400％，500％，600％，700％，800％，900％或1000％，或减少至少约10％，20％，30％40％，50％，60％，70％，80％，90％，92％，94％，96％，97％，98％或99％，或甚至至少约99.5％，或99.9％。淀粉降解酶的不同活性可以是自然发生的，也可以通过合成或重组的方法获得，例如通过修饰相关酶或前体酶催化位点或任何其它位点(如底物结合位点，辅助因子结合位点)。通常，修饰是通过用本领域已知的，例如合理的或确定的诱变方法或组合的化学方法在前体酶序列上取代，增加或删除至少一个氨基酸。不同的淀粉降解酶可以包括保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是其中的氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基代替。具有类似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括：具有基础侧链的氨基酸(如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天门冬胺酸，谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸，天门冬醯胺酸，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯基丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，前体酶中的氨基酸残基适宜地被来源于相同侧链家族的另一种氨基酸残基取代。选择性的，在另一个具体实施方式中，突变能沿着所有或部分编码相关酶的多聚核苷酸而被随机引入，例如通过饱和突变，而且得到的突变体的酶活可以通过筛选以确定突变体具有与前体酶不同的活性。
在另一个具体实施方式中，内源淀粉降解的水平和位置是通过用淀粉降解酶直接进入不同功能的亚细胞室来调节的。在说明性实施例中，活性在叶片和/或种子中被改变。其可以通过核基因的表达来完成，导致在细胞液中形成一种形式的酶，其不具有传递给其它细胞室的信号序列。在另一个说明性实施例中，活性直接指贮藏室，如淀粉体或液泡，或指贮藏和输送室，例如胞外(原生质的)空间，通过在酶序列内部包括信号来将酶从胞液输送到期望的细胞室。某些信号序列会导致酶活性在两个或多个细胞室之间分配。
这些方法包括用例如电泳技术，色谱技术(包括纸色谱法，薄层色谱法，气相色谱法，气-液色谱法和高效液相色谱法)对植物或植苗的分析。分离的成分通常是通过将分离曲线与已知确定物的标准对比来确认的，或通过如质谱分析和核磁共振分析的分析技术来确认。例如，实施例9可以参考的文献有：Robinson，The Organic Constituents of Higher Plants，Cordus Press，North Amherst，USA，1980；Adams等，Anal.Biochem.，266：77-84，1999；Veronese等，Enz.Microbial Tech.，24：263-269，1999；Hendrix等，J.Insect Physiol.，47：423-432，2001；Thompson等，Carbohydrate Res.，331：149-161，2001；以及它们引用的参考文献。碳水化合物可以用本领域技术人员已知的标准方案来测定。
基因
本发明包括对基因活性的修饰以及嵌合基因的构建和使用。本文中使用的术语“基因“包括任何脱氧核苷酸序列，其包括结构基因的蛋白编码区域或其在细胞中被转录而不是被翻译，以及相关的非编码区和调控区。该结合域通常位于在5′和3′末端的编码区附近，距离每端约2kb。在这方面，基因可以包括控制信号，如启动子，增强子，终止子和/或多聚腺苷化信号，其天然地与给定基因，或异源控制信号结合，在该情况下，基因是指“嵌合基因“。位于编码区5′处，且出现在mRNA上的序列是指5′非翻译序列。位于3′或编码区域下游，且出现在mRNA上的序列是指3′非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。
本文中使用的“小麦GWD基因”或其类似物是指小麦中编码GWD的核苷酸序列，本领域技术人员可以将其容易地与PWD或其它蛋白相区别。小麦GWD基因包括小麦中存在的天然发生的变异，其包括那些由面包小麦的A，B和D基因组编码的变异，以及非天然发生的变异，其可以由那些本领域技术人员进行基因改造而产生。在一个优选的具体实施方式中，小麦GWD基因是指核酸分子，其可以存在于或从小麦或其衍生物中分离出来，其包括具有至少80％与SEQID NO：2中给出的GWD基因编码区相同的序列的核苷酸。
以类似的方式，本文中使用的“小麦PWD基因”或其类似物是指小麦中编码PWD的核苷酸序列，本领域的技术人员可以容易地将其与其它二激酶或其它蛋白相区别。其包括小麦基因中存在的天然产生的变异，其包括那些由面包小麦的A，B和D基因组编码的变异，以及那些可以由本领域技术人员进行基因改造而产生的非天然发生的变异。
含有编码区的基因的基因组形式或克隆可以由非编码序列中断，该非编码序列被称为“内含子”或“间隔区”或“间隔序列”。本文中使用的“内含子”是一个基因片段，其作为初级RNA转录的一部分而被转录，却并没有存在于成熟的mRNA分子中。内含子会从核或初级转录中去除或“剪掉”；因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)中。内含子可以含有调节成分，如增强子。本文中使用的“外显子”是指与存在于成熟mRNA中或成熟RNA分子中的RNA序列相应的DNA区，那里的RNA分子没有被翻译。mRNA在翻译过程中作用以确定新生多肽中的氨基酸序列或顺序。术语“基因”包括合成的或融合的编码本发明中所描述的全部或部分蛋白的分子以及上述任一互补的核苷序列。为了在细胞染色体外保留或为了整合至宿主基因组中，基因可被引入适宜的载体中。
本文中使用的“嵌合基因”是指那些在其天然位置并不存在的基因。通常，嵌合基因包括天然不存在的调节的和转录的或蛋白编码序列。因此，嵌合基因可以包括不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源的调控序列和编码序列，但是以与天然发现的不同的方式排列。本文中使用的术语“内源的”是指那些通常在未改进植物中与研究植物相同生长阶段产生的物质。“内源基因”是指在生物体基因组的天然位置的天然基因。本文中使用的“重组核酸分子”是指通过DNA重组技术构建或改进的核酸分子。术语“外来多聚核苷酸”或“外源多聚核苷酸”或“异源多聚核苷酸”及其类似物是指通过实验操作被引入细胞基因组的任何核酸。其包括细胞中发现的基因序列，只要引入基因包括一些与天然产生的基因相关的改进(例如突变，选择性标记基因的出现，等)。外来或外源基因可以是在自然界发现的被插入非天然生物体的基因，引入到天然宿主内新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是指通过转化步骤而被引入到基因组中的基因。术语“遗传修饰”包括将基因引入细胞，使细胞中的基因突变以及改变或调节细胞或生物体中基因的调控使其或其后代完成这些过程。
多聚核苷酸
本发明涉及各种多聚核苷酸。本文中使用的“多聚核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”的含义是核苷聚合体，其可以是DNA或RNA或它们的组合，且包括mRNA，cRNA，cDNA，tRNA，siRNA，shRNA和hpRNA。其可以是细胞的，基因组或合成来源，例如自动合成仪制备的DNA或RNA，且其可以与碳水化合物，脂类，蛋白或其它物质结合，可以用荧光或其它基团标记，或依附于固体载体而具有本文中定义的特殊活性。核苷的聚合体可以根据本领域已知的方法进行修饰，例如，磷酸二酯连锁类似物包括：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，phosphoroselenoate，phosphorodiselenoate，phosphoroanilothioate，phosphoranilidate，氨基磷酸酯，但是多聚核苷酸优选是未修饰的或修饰仅仅发生在细胞中。聚合体可以是单链的，基本双链或部分双链的。部分双链RNA分子的一个例子是发夹RNA(hpRNA)，短片段发夹RNA(shRNA)或自身互补RNA，其包括由核苷酸序列及其互补序列通过碱基配对形成的双链的茎以及共价连接到核苷酸序列及其互补序列的环状序列。本文中使用的碱基配对是指核苷之间的标准碱基配对，包括G:U碱基对。“互补的”表示两种多聚核苷酸沿着它们的部分长度，或沿着一种或两种的全部长度能够形成碱基配对。本文中术语“多聚核苷酸”可以与术语“核酸”替换使用。
“分离的”是指物质被完全或基本上从通常在其天然态下伴随其的成分中游离出来。本文中使用的“分离的多聚核苷酸”或“分离的核酸分子”指至少部分，优选完全或基本上从相同类型的多聚核苷酸序列中分离出来的多聚核苷酸，其在天然态下其是与该相同类型的多聚核苷酸结合或相连接的。例如，“分离的多聚核苷酸”包括被纯化或从在天然状态从两侧连接它的序列中分离出来的多聚核苷酸，例如从通常邻近片段的序列中分离出的DNA片段。优选，分离的多聚核苷酸至少90％游离于其它成分，如蛋白，碳水化合物，脂类等。本文中使用的术语“重组多聚核苷酸”是指通过使核酸形成非天然通常发现的形式而在体外形成的多聚核苷酸。例如，重组核苷酸可以是表达载体形式的。通常而言，该表达载体包括可操作的连接于核苷酸序列的转录和翻译调控核苷酸。
本发明还涉及低聚核苷酸的用途。本文中使用的“寡核苷酸”是长度达到50个核苷的多聚核苷酸。其可以是RNA，DNA或其组合或其中任一的衍生物。寡核苷酸通常为相对短的10至30个核苷的单链分子，通常长度为15-25个核苷。当在扩增试验中用作探针或用作引物时，该寡核苷酸的最小尺寸为寡核苷酸和互补序列之间在靶核酸分子上形成稳定杂合体所需要的尺寸。优选，寡核苷酸有至少15个核苷，更优选至少18个核苷，更优选至少19个核苷，更优选至少20个核苷，更优选至少有25个核苷的长度。
用作探针的多聚核苷酸通常是与可探测标签，例如放射性同位素，酶，生物素，荧光分子或化学发光分子共轭的。本发明中的寡核苷酸用于检测GWD或其它的与感兴趣的性状(例如改性的淀粉)相关基因的等位基因。该方法，例如使用核酸杂交，且在很多情况下包括通过适宜的聚合酶将寡核苷酸引物延伸(如PCR中使用的)。
本发明中不同的寡核苷酸包括不同大小的和/或能够杂交的分子，例如能使小麦基因组与本文中所定义的特定寡核苷酸分子相近的分子。例如，不同的大小可以包括额外的核苷(如1，2，3，4或更多)，或更少核苷只要其仍然能够与靶区域杂交。此外，一些核苷可以被取代而不会影响寡核苷酸与靶区域杂交的能力。而且，不同大小可以容易地设计成使杂交邻近于(例如但不限于，在50个核苷之内)本文定义的特定寡核苷酸杂交的植物基因组区域。
术语“多聚核苷酸变化形式”和“变化形式”及类似术语是指多聚核苷酸或它们的互补形式，其序列与参照多聚核苷酸序列相同。这些术语还包括那些通过添加、删除或代替至少一个核苷而与参照多聚核苷酸不同的多聚核苷酸。因此，术语“多聚核苷酸变化形式”和“变化形式”包括其中的一个或多个核苷被增加或删除，或被不同核苷所代替的多聚核苷酸。基于这种观点，本领域很好理解的是，可以对参照多聚核苷酸作出包括突变，增加，删除和替代的某些改变，由此，使改变的多聚核苷酸保持参照核苷酸的生物功能或活性。因此，这些术语包括那些表现出酶活性或其它调节活性编码多肽的多聚核苷酸，或能够作为选择探针或其它杂交因子的多聚核苷酸。术语“多聚核苷酸变化形式”和“变化形式”也包括天然出现的等位基因变化形式。
用“相等的”或“相应的”表示下列的多聚核苷酸：(a)具有与参照多聚核苷酸序列完全一样或对其全部或部分互补的核苷酸序列；(b)编码氨基酸序列与肽或蛋白中的氨基酸序列相同。该短语在其范围内还包括具有与参照肽或蛋白中的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列的肽或多肽。用来描述两种或多种多聚核苷酸或多肽之间关系的术语包括“参照序列”，“对比窗口”，“序列同一性”，“序列同一性百分比”，“基本同一性”和“同一”，且其用核苷或氨基酸残基的最小数或超过全部长度来定义。在本文中可相互替代使用的术语“序列同一性”和“同一性”是指基于核苷对核苷或基于氨基酸对氨基酸基的窗口比较，是同一的序列范围。因此，“序列同一性百分比”是通过下列方法计算的：对比窗口中两种最佳排列序列，确定在该位置上同一核酸基(如A，T，C，G，U)或同一氨基酸残基(如Ala，Pro，Ser，Thr，Gly，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Lys，Arg，His，Asp，Glu，Asn，Gln，Cys和Met)出现在两条序列中匹配位置的数目，用对比窗口中位置总数(如窗口大小)除相配位置的数目，再用100乘以该结果，得到序列同一性百分比。
多聚核苷酸的同一性百分比可以通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析法(GCG程序)在空位罚分＝5，和空位罚分＝0.3的条件下测定。除非另作规定，查询序列至少为45个核苷的长度，而GAP分析比对了两条序列至少45个核苷的区域。优选，查询序列至少有150个核苷的长度，而GAP分析比对了两条序列至少150个核苷的区域。更优选，查询序列有至少300个核苷的长度，而GAP分析法比对了两条序列至少300个核苷的区域，或在每种情形下至少400，500或600个核苷。还可以参照例如由Altschul等在Nucl.Acids Res.25：3389，1997中公开的BLAST家族的程序。对序列分析的详细讨论可见于Ausubel等的″Current Protocols in Molecular Biology″John Wiley & Sons公司，1994-1998，第15章的19.3部分。
当该序列具有至少约75％，特别是至少约80％，更特别是至少约85％，最特别约90％，特别约95％，更特别约100％的序列同一性，最特别是完全相同时，核苷或氨基酸序列被称为“基本相似”。很清楚的是，当RNA序列被描述为与DNA序列本质上相似或具有某种程度的序列同一性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)就被认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)相同。
有关定义的多聚核苷酸，则希望出现的同一性百分比比上述优选实施例中的高。因此，可以使用出现的同一性百分比的最小值，其优选多聚核苷酸包括至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，甚至更优选至少99.9％的与所述相应SEQ ID NO同一的多聚核苷酸序列。
优选的，本发明中编码具有GWD活性的多肽的多聚核苷酸有多于400，更优选多于500，更优选多于600，更优选多于700，更优选多于800，更优选多于900，甚至更优选多于1000个核苷的长度。
本发明中的多聚核苷酸与天然存在的分子相比，具有一种或多种突变，其核苷残基被删除，插入，或替代。突变体可以是天然存在的(即从天然源中分离出来的)，或是合成的(例如，通过对核酸进行定向变异)。
本发明引用杂交条件的严格度来定义两个多聚核苷酸的互补范围。本文中使用的“严格度”是指温度和离子强度条件，或在杂交期间某种有机溶剂的存在或缺失。严格度越高，靶核苷序列和标记多聚核苷序列之间的互补程度就越大。“严格的条件”是指温度和离子条件，在该条件下，仅具有高度碱基互补的核苷酸序列才能进行杂交。如本文中使用的术语“在低严格度，中严格度，高严格度，或很高严格度条件下的杂交”描述了杂交和洗涤的条件。实施杂交反应的指南可见于《分子生物学通用手册)》，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。该参考书目中描述的水性或非水性方法均可以使用。本文中使用的术语“在低严格度，中严格度，高严格度，或很高严格度条件下的杂交”描述了杂交和洗涤的条件。本文中所指的特点杂交条件如下：1)低严格度杂交条件为：约45℃，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，接着在50-55℃下，0.2XSSC，0.1％SDS中洗涤两次；2)中严格度杂交条件为：约45℃，在6XSSC中，然后在60℃下0.2XSSC，0.1％SDS中洗涤一或多次；3)高严格度杂交条件为：约45℃，在6XSSC中，接着在65℃下0.2XSSC，0.1％SDS中洗涤一或多次；和4)极高严格度杂交条件为：65℃，0.5M磷酸钠，7％SDS，接着在65℃下0.2XSSC，1％SDS洗涤一或多次。
多肽
术语“多肽”和“蛋白”通常可替换使用。本文中使用的术语“蛋白”和“多肽”也包括本发明中所描述的多肽的变化形式，突变体，修饰体，类似无和/或衍生物。本文中使用的“完全纯化的多肽”是指从与其天然态结合的脂质，核酸，其它多肽和分子中分离出来的多肽。优选地，完全纯化的多肽是指从与其天然态结合的成分中游离的至少60％，更优选至少75％，更优选至少90％的多肽。“重组多肽”指用重组技术制得的多肽，即通过在细胞中表达重组多聚核苷酸，细胞优选植物细胞，更优选谷类作物细胞。
一种多肽相对于另一种多肽的同一性百分比可以通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析法(GCG程序)测定，条件为空位罚分＝5，和空位罚分＝0.3。查询序列有至少15个氨基酸的长度，而GAP分析法比对两条序列至少15个氨基酸的的区域。更优选，查询序列有至少50个氨基酸的长度，而GAP分析法使其排列成至少50个氨基酸的两个序列。更优选，查询序列有至少100个氨基酸的长度，而GAP分析法比对两条序列至少100个氨基酸的的区域。甚至更优选，查询序列有至少250个氨基酸的长度，而GAP分析法比对两条序列至少250个氨基酸的的区域。
本文中使用的“生物活性”片段是本发明中多肽的一部分，其保留了全长多肽定义的活性。在一个特别优选的实施方式中，生物活性片段能够将淀粉磷酸化以生产C6磷酸化淀粉。生物活性片段可以是任意尺寸的，只要他们保留了定义的活性，但是优选有至少100或200个氨基酸残基的长度。
有关定义的多肽，希望的是：同一性百分比要高于上述提供的包括优选具体实施方式的同一性百分。因此，用于同一性百分比的最小值，优选该多肽包括与给出SEQ ID NO相应的同一性至少为75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，且甚至更优选至少99.9％的氨基酸序列。
本发明中多肽的氨基酸序列突变体可以通过引入适宜的核苷而变成本发明中的核酸而制备，或通过体外合成期望的多肽。该突变体包括，例如删除，插入或代替氨基酸序列中的残基。为了使最终肽产品具有期望的特性，可以组合使用删除，插入和替代以得到最终的结构。
突变(改变)肽可以用任何本领域已知技术制备，例如本发明的多聚核苷酸可以经过体外诱变形成。该体外诱变技术包括将多聚核苷酸亚克隆至适宜的载体；再将该载体转化至“突变”菌株，例如E.coli XL-1红色(Stratagene)，并繁殖转化细菌成适宜数量的子代。在另一个实施例中，本发明中的多聚核苷酸是经过如Harayama(1998)中广泛描述的DNA穿梭技术的。这些DNA穿梭技术可以包括与本发明的那些相关的基因，例如来源于除了小麦或大麦之外的植物品种的GWD基因，和/或包括来自于相同植物编码类似蛋白的不同基因(例如小麦GWD基因)。来自于突变/改变DNA的产品可以容易地用本文中描述的技术被筛选出来以确定其是否具有，如GWD活性。
在设计的氨基酸序列突变体中，突变体位点的位置和突变体的本性取决于改变的特性。突变体的位点可以被单独修饰或成组修饰，例如通过(1)首先用保守的氨基酸选择取代，然后用更激进的选择取代，这取决于要获得的结果，(2)删除靶残基，或(3)在邻近位点插入其它残基。
对氨基酸序列的删除通常的范围在约1至15个残基，更有选约1至10个残基，且典型的是约1至5个邻近残基。
突变体的替代是多肽分子中的至少一个氨基酸残基被移除，而另一个残基插入到其位置。替代突变的最佳插入位点包括被确定为活性位点的位点。其它有利位点是那些获取自不同菌株或同样物种的一致的特定残基。这些位置可能对于生物活性是很重要的。这些位点，特别是那些落入至少三个其它相同保守位点的序列，优选以相对保守的方式被取代。该保守的取代见下文标题为“典型取代”中的表3。
还包括在本发明范围中的是本发明的多肽是在合成期间或之后经过不同改进的，例如生物素化，苯甲基化，糖基化，乙酰化，磷酸化，氨基化，通过已知的保护/阻碍基团的衍生化，蛋白水解，连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些改进可以提高本发明中多肽的稳定性和/或生物活性，或作为配体帮助连接另一种分子。
本发明的多肽可以以各种方式制备，包括天然多肽的制备和回收，重组多肽的制备和回收，以及化学合成多肽。在一个具体实施方式中，本发明中的分离多肽是通过培养能够在有效产生多肽的条件下能表达多肽的细胞，并回收多肽的方法制得的。优选的培养细胞是本发明的重组细胞。有效扼培养条件包括，但不限于：允许多肽产生的有效培养基，生物反应器，温度，pH和氧气条件。有效培养基是指细胞能在其中培养以产生本发明中多肽的任何培养基。该培养基通常包括，具有可吸收碳、氮和磷酸盐源的水性培养基，和适宜盐，矿物质，金属盒其它营养成分，如维生素。本发明的细胞可以在传统的发酵生物器，摇瓶，试管，微量滴定盘和培养皿中培养。培养可以在适宜重组细胞的温度，pH和氧气条件下进行。这些培养条件均在本领域一般技术人员专业技能范围之内。
本发明是指那些是可操作的连接或链接的要素。“可操作的连接”或“可操作的链接”及类似表述是指多肽要素功能性连接。通常，可操作连接的核酸序列是连续联接的，且其必须在读码框内结合两个邻近的蛋白编码区域。当RNA聚合酶将这两个编码序列转录成单一RNA时，其如果翻译，其当时会被翻译成单一的具有来自两个编码序列的氨基酸的多肽，编码序列“可操作连接到”另一个编码系列。编码序列不需要是彼此邻近的，只要表达序列最终产生期望的蛋白即可。
如本文中使用的术语“顺式作用序列”，“顺式作用因子”或“顺式调控区域”或“调控区域”或类似术语是表示当其被设置在相对于可表达基因序列而言适宜时，能够调节，至少部分调节基因序列的表达的任何核苷序列。本领域技术人员了解顺式调控区域可能能够激活，沉默，增强，抑制或者改变表达的水平和/或细胞型专一性水平和/或基因序列在转录或转录后水平上的表达专一性。在本发明的某些实施方式中，该顺式作用序列是增强或刺激可表达基因序列表达的激活基因。
转录多肽的“可操作连接”启动子或增强子是指将可转录多肽(例如蛋白编码多聚核苷酸或其它转录)置于启动子的调控之下，然后其会控制该多聚核苷酸的转录。在异源启动子/结构基因结合的结构中，通常优选设置启动子或其变化形式在转录多聚核苷酸的转录开始位点处，其大约与启动子和在其天然设置中控制的基因之间的距离相同；即那些从其中衍生出启动子的基因。如本领域已知，在该距离的一些变异会被调节却不会丧失功能。同样，对涉及被设置在其控制之下的可转录多聚核苷酸的调控序列因子(如操纵子，增强子等)的设置优选通过设置要素在其天然设置中而定义；即那些衍生的基因。
“启动子”或“启动子序列”在本文中以其最广义使用，并包括基因区域，通常是RNA编码区域的上游(5′)，其控制转录的起始及转录水平。“启动子”包括经典基因组基因的转录调节序列，包括TATA盒和CCAAT盒序列，以及其它的调节因子(如上游激活序列，增强子和沉默子)，其以适应发育和/或环境刺激，或以组织特异性或细胞型特异的方式改变基因表达。启动子通常但不是必须(例如，某些PolIII启动子)，位于其调节的表达的结构基因的上游。而且，调节因子包括通常位于基因转录的起始位点2kb以内的启动子。启动子可以含有其它的特定调节因子，位于起始位点的更末梢处以进一步增强在细胞中的表达，和/或改变可操作连接其上的结构基因表达的时机或可诱导性。
“组成型启动子”是指那些指导可操作连接到植物的某些或全部组织的转录序列表达的启动子。本文中使用的术语组成型不是必须表示在所有细胞类型中以相同水平表达的基因，但是该基因以细胞类型的宽范围表达，尽管某些在该水平的变化常常是可检测的。本文中使用的“选择性表达”是指在植物特定器官中几乎专一地表达，例如，胚乳，胚芽，叶片，果实，块茎或根。在一个具体的实施方式中，启动子在所有光合作用组织中表达，其相当于植物的所有地上部分，例如被包括在用于光合作用表达的基因的启动子，如加氧酶小亚基启动子。该术语还可以指器官中特定发育阶段的表达，如胚芽形成的早期或晚期或成熟的不同阶段；或通过某些环境条件或处理诱导表达。因此，选择性表达可以与组成型表达形成对照，其是指植物的某些或全部组织中，在植物经历的大多数或所有条件下的表达。
选择性表达还可能会导致特定植物组织，器官或发育阶段中基因表达产物的区分。特定亚细胞位置，如胞浆，液泡或非原质体空间的区分可通过包含在基因产物结构中，能转移到需要的细胞间隔中的适宜信号实现，或在半自主性的细胞器官(质体和线粒体)的情况下，通过转基因的结合使适宜的调节序列进入细胞器官基因组。
“组织特异启动子”或“器官特异启动子”是在一个组织或器官中相对于其它组织或其中优选表达的启动子，优选大多数而不是所有其它植物组织或器官。通常，特定组织或器官中启动子以比其它组织或器官中的高出10倍的水平表达。示例性的组织特异性启动子是高分子量(HMW)麦谷蛋白基因Bx17的启动子。“能源贮存组织特异性启动子”是与植物其它组织相比，优选指导植物能源贮存组织(如胚乳，果实组织，根组织，块茎组织，种子组织，茎组织或能源贮存叶片组织)中可操作连接转录序列的表达的启动子，包括源组织(如叶片)中的表达。
通过本发明预期的启动子可以是宿主植物天然的经过转化的启动子或是源自于选择性源的启动子，其在宿主植物中的区域是功能性的。其它来源包括农杆菌属T-DNA基因，例如生物合成胭脂碱，octapine，甘露氨酸基因的启动子，或其它冠瘿碱启动子；来源于植物的启动子，如泛素启动子，如来源于玉米ubi-1基因的Ubi启动子，Christensen等，(1996)(例如参见，U.S.Patent No.4,962,028)，或肌动蛋白启动子；组织特异性启动子(例如参见U.S.Patent No.5,459,252，Conkling等；WO 91/13992 to Advanced Technologies)；来自病毒(包括宿主特异性病毒)的启动子，或部分或全部合成的启动子。在单或双子叶植物中，许多功能性的启动子是本领域已知的(例如参见Greve，(1983)，Salomon等，(1984)，Garfinkel等，(1983)；Barker等，(1983)；其包括各种从植物和病毒的启动子，如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S，19S)。一些组织特异性启动子区域是已知的，例如加氧酶小亚基启动子，其在叶片组织中优先表达。在某些组织中或在某些生长条件下优先提供转录的其它转录起始区域，包括来自于napin，种子或叶片ACP，玉米蛋白及类似物。果实特异性启动子也是已知的，该启动子之一是E8启动子，由Deikman等(1988)和DellaPenna等(1989)所描述。评价启动子活性的非限制性方法由Medberry等(1992，1993)，Sambrook等1989，和McPherson等(U.S.Patent No.5,164,316)公开。
可替换的或其它的，启动子可以为诱导型启动子或发育调节启动子，其可以在植物适当的发育期促进导入的多聚核苷酸的表达。在下一个实施例中，转录调控因子是适合的控制表达时机的发育调节启动子。启动子的选择可以允许导入的多聚核苷酸利用淀粉水平的上下浮动，适时地专门表达。启动子序列可以包括调节转录的顺式作用序列，其中的调节包括，如，化学的或物理的抑制或诱导(如，基于代谢的调节，光，或其它物理化学的因素)或基于不同细胞的调节(如相关的叶、根、种子、或植物中的类似结构，参见美国专利No.5,459,252中公开的根特异性启动子)。这样，启动子区域，或此区域的调节部位，获自被调节的适当的基因。例如，1，5-核酮糖二磷酸羧化酶基因是光诱导的，可以用于转录的起始。其它如通过压力、温度、创伤和病原体的影响等所诱导的基因也是已知的。
其它的顺式作用序列可以包括转录和/或翻译增强子。增强子区域是本领域技术人员所熟知的，可以包括ATG翻译起始密码子和邻近的序列。起始密码子包括编码相关外源或内源多聚核苷酸的序列的阅读框，以确保完整序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子的来源有很多，可以为天然的和合成的。翻译起始区域可以来自于转录起始区域，或来自于外源或内源多聚核苷酸。序列还可以来自于促进转录的启动子，可以被特殊改造以提高mRNA的翻译。
转录增强子的例子包括，但不限于，CaMV 35S启动子的部件和章鱼肉碱合成酶(octopine synthase)基因，如Last等(美国专利No.5,290,924，引作参考)中所述。
本发明的核苷酸结构通常包含3′非翻译序列，大约50-1000核苷碱基对，其包括转录终止序列。3′非翻译序列包含转录终止和/或多腺苷酸化信号，以及其它可以影响mRNA作用或基因表达的调节信号。多腺苷酸化信号的特征是，影响多聚腺苷酸添加至mRNA前体的3′端。多腺苷酸化信号通常可以通过与规范的形式5′AATAAA-3′的同源性来识别，尽管变化形式是常见的。适合的3′非翻译序列的例子是3′转录非翻译区域，包含来自于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合成酶(nos)基因的多腺苷酸化信号(Bevan等，(1983))和根癌土壤杆菌的章鱼肉碱合成酶基因的T7转录产物的终止子。可选择地，适合的3′非翻译序列可以来自植物基因，如来自于马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3′端，大豆存储蛋白基因和1，5-核酮糖二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基，尽管其它的本领域技术人员已知的3′因子也可以用。可选择地，3′非翻译调节序列可以通过新合成获得，如，Enzymology，153：292，1987中所述的方法，其在此处引为参考。
当DNA序列在转录起始位点和编码序列起始处之间插入时，例如，非翻译的5′引物序列(5′UTR)，会影响基因表达，还可以一种特殊的前导序列。适合的前导序列包括那些选自指导外源或内源DNA序列最佳表达的序列。例如，这样的前导序列包括一首选的共有序列，其可以提高或保持mRNA的稳定性，并且阻止不适当的翻译的起始，如在Joshi(1987)中所述。此外，靶向序列可以用于靶向定位外源或内源多聚核苷酸编码的酶至胞内区室，例如，至植物细胞中叶绿体内，或至胞外环境中。例如，编码转运或信号肽的核苷酸序列可以与编码本发明的选择的酶的序列可操作地连接，当翻译时，转运或信号肽可以转运酶至特别的胞内或胞外目的地，可以在翻译后随意地去除。转运或信号肽作用于在胞内膜上的蛋白的转运，例如，内质网、液泡、囊、质体、线粒体和质膜薄膜。例如，靶向序列可以指导所需的蛋白运至特殊的细胞器官，如液泡或质粒(如叶绿体)，而不是细胞溶质中。这样，本发明的核苷酸结构进一步包含质粒转运肽编码核苷酸序列，其连接在启动子区域和外源或内源多聚核苷酸之间。
载体
本发明使用载体进行基因结构的操作或转移。“载体”指的是核酸分子，特别是DNA分子，分离自，如，质粒，噬菌体，或植物病毒，其中可以插入或克隆核苷酸序列。载体优选包含一种或多种独特的限制性内切酶位点，并可以在确定的寄主细胞中自我复制，所述寄主细胞包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织，或累积确定的寄主的基因组以使克隆的序列再生。据此，载体可以是自我复制载体，即，存在于染色体整体外的载体，其复制与染色体的复制无关，例如，线性的或闭合的质粒，染色体外因子，微染色体，或人工染色体。载体包含任何可自我复制的方式。可选择地，载体可以是，当其导入细胞中时，可以重复复制感受细胞的基因组，并且和完整的基因组一起复制。载体系统可以包含单独的载体或质粒，两种载体或质粒，其一起包含全部的DNA，其将被导入寄主细胞或转座子的基因组。载体的选择最好依赖于载体与导入载体的细胞的兼容性。载体可以包括一筛选标记，例如用于筛选合适的转化子的抗性基因。此抗性基因是本领域已知的。
本发明的核苷酸结构可以导入至载体如质粒中。质粒载体通常包括额外的核苷酸序列，其易于筛选，扩增，和在原核和真核细胞的表达盒中转化，例如，pUC载体，pSK载体，pGEM载体，pSP载体，或pBS载体。额外的核苷酸序列包括复制起点，其提供载体的自我复制；可筛选的标记基因，优选编码抗生素或除草剂抗性；唯一的多克隆位点，其提供插入核酸序列或在核酸结构中的编码基因的多位点；并且序列可以提高原核或真核细胞(尤其植物)的转化。
“标记基因”指的是将不同的表型传递至表达标记基因的细胞的基因，使得转化的细胞可以和没有标记的细胞区别开来。选择性标记基因具有与有选择性试剂(例如，除草剂，抗生素，辐射，热，或其它可破坏没有转化的细胞的处理)的抗性的特性。筛选标记基因(或报告基因)具有可通过观察或检测鉴定的特性，即，通过筛选(如，β-葡糖苷酸酶、荧光素酶、GFP或其它在未转化的细胞中不存在的活性酶)。标记基因和感兴趣的核苷酸序列不一定连接在一起。
为了鉴定转化子，所需的核苷酸结构应包含选择或筛选标记基因，或者，外来或外源的多聚核苷酸。标记的实际选择不是最重要的，只要其具有与植物细胞的选择功能性(即选泽性)地结合。本发明的标记基因和感兴趣的外来或外源多聚核苷酸不一定连接在一起，因为未连接的基因的共转化，如，在美国专利No.4,399,216中描述的，其在植物转化中是有效途径。
细菌的选择性标记的例子为抗性标记如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性。典型的用于筛选植物转化子的筛选标记包括，但不限于，编码潮霉素B抗性的hyg基因；新霉素磷酸转移酶(npt)基因，其具有卡那霉素、巴龙霉素、G418和类似物抗性，例如，Potrykus等(Mol.Gen.Genet.，199：183，1985)所描述的；来自老鼠肝细胞的谷胱甘肽-S-转移酶基因对除草剂的谷胱甘肽具有抗性，如EP-A 256 223中所述的。谷酰胺合成酶基因在过表达时具有谷酰胺合成酶抑制剂的抗性，例如草丁磷(phosphinothricin)，WO87/05327中所述；来自于青绿色链霉菌的乙酰基转移酶基因具有选择性试剂草丁磷(phosphinothricin)抗性，如EP-A 275 957中所述；编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸盐合成酶(EPSPS)的基因具有N-膦酰基甲基甘氨酸的耐受性，如Hinchee等中所述(Biotech.，6：915，1988)；具有bialaphos抗性的bar基因，如WO91/02071中所述；来自Klebsiella ozaenae的腈水解酶基因如bxn具有溴草腈抗性(Stalker等，Science，242：419，1988)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因具有甲氯蝶呤抗性(Thillet等，J.Biol.Chem.，263：12500，1988)；突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)具有咪唑啉酮、磺胺尿素或其它ALS-抑制物质抗性(EP-A-154 204)；突变的邻氨基苯甲酸合成酶基因具有5-甲基色氨酸抗性；或茅草枯脱卤素酶基因具有除草剂抗性。
优选的筛选标记包括，但不限于，编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的uidA基因，其中各种生色底物是已知的，编码用于已知生色底物的酶的β-牛乳糖基因，水母发光蛋白基因(Prasher等，1985)，都可以用于钙-敏感的生物发光检测；绿荧光蛋白基因(Niedz等，1995)；荧光素酶(luc)基因(Ow等，1986)，其用于发光检测，和其它本领域已知的检测。本发明说明书中使用的“报告分子”指的是那些分子，通过其化学性质，可以分析鉴定信号，用于检测启动子与相关蛋白产物的活性。
改造基因表达的方法
在一些实施例中，内源淀粉磷酸化的水平和/或通过提高核苷酸序列的表达水平来调节降解，所述序列编码植物细胞中多肽的活性，或降低编码蛋白的基因的表达水平，所述蛋白包括在植物的活性中。在例子中，这可以在转录的水平获得，通过使用不通长度的启动子或诱导型启动子，其可以控制编码序列的转录表达水平。在一些实施例中，可以调整或提高基因表达量的编码转录因子的异源序列被导入，其产物降低调节了淀粉磷酸化。基因的表达水平可以通过改变每细胞中的拷贝数来调节，所述细胞的结构包含编码序列和与其可操作连接的转录调控因子，其在细胞中是功能性的。可选择地，可以筛选出大量的转化子，并且筛选出令人满意的水平和/或转基因表达的特性，其在转基因插入位点的附近影响了内源序列。转基因表达的令人满意的水平和模式可以导致植物生产潜力稳定的提高，如产率或生物量或植物细胞中淀粉降解的显著的降低。这可以通过在不同发育阶段的转化子的简单的测试来检测。
基因表达的降低可以通过导入寄主细胞中“基因-沉默嵌合基因”的导入和转录来获得。沉默基因嵌合基因可以稳定地导入寄主细胞的基因组中，优选核基因组，或其可以短暂地导入，例如在病毒载体中。此处使用的“基因沉默因子”指的是在寄主细胞中降低靶核苷酸的表达量，优选植物细胞，其可以通过导入沉默RNA而获得。这样的降低可以导致转录的降低，包括通过重组染色质的甲基化，或转录后的RNA分子的改造，包括通过RNA降解，或二者。基因-沉默不必解释为靶核苷酸或基因表达的抑制。在沉默的RNA存在的情况下靶核苷酸表达的水平比其不存在的情况下要低。表达的水平可以降低至少约10％，或至少约15％，或至少约20％，或至少约25％，或至少约30％，或至少约35％，或至少约40％，或至少约45％，或至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约100％。靶核苷酸可以包括内源基因，转基因或病毒基因或通过病毒载体导入的基因。靶核苷酸可以进一步包括可以在寄主细胞基因组中稳定导入的基因，优选寄主细胞的核基因组。
反义RNA分子
根据本发明，使用反义技术来降低基因表达量。术语“反义RNA”表示与至少部分的特殊的mRNA分子互补的RNA分子，其可以降低编码mRNA基因的表达量。这种降低通常以序列依赖的方式存在，被认为是通过干扰转录后事件而产生，如mRNA从核转运到细胞质，mRNA稳定性或翻译抑制。本领域已知使用反义的方法(如参见，G.Hartmann和S.Endres，Manual of Antisense Methodology，Kluwer (1999))。在植物中使用反义的技术已有所披露(Bourque(1995)和Senior(1998))。1995年，Bourque列出了大量如何在植物体系中使用反义序列作为使基因灭活的手段的实例。她甚至获得了任意一种酶活的100％的抑制，其可能作为局部抑制而不是必需的，但是获得了在体系中可测量的改变。严格来说，1998年定义的反义方法到现在还是基因表达操作中十分确定的技术。
此处使用的，术语“在生理条件下杂交的反义多聚核苷酸”指的是多聚核苷酸(全部或部分为单链)至少能把抑制的基因的RNA产物形成双链多聚核苷酸，通常是编码在正常条件下细胞中的蛋白的mRNA。反义分子可以包括与结构基因相应的序列或可影响基因表达或拼接的控制的序列。例如，反义的序列可与编码本发明的区域的靶基因相对应，或为5′-非翻译区域(UTR)或3′-UTR或其组合。其可能与部分内含子序列互补，其在转录时或转录后拼接而成，优选只针对靶基因的外显子序列。由于通常有UTRs的不同，定位这些靶区域提供了更好的基因抑制的特异性。
反义序列的长度至少为19个连续的核苷酸，优选为至少50个核苷酸，最优选为至少100、200、500或1000个核苷酸，其是相对于需抑制的基因的最大全长来说的。可以使用与整体基因转录物互补的全长序列。长度最优选为100-2000个核苷酸。靶转录物的反义序列的同一性的程度至少为90％，更优选为95-100％。反义RNA分子当然可以包含不相关的序列，其可以用于稳定分子。
表达反义RNA的遗传结构可以通过在“反义”方向与靶基因的区域连接启动子序列而制备，其在此处指的是相对于在植物细胞中的靶基因的序列的转录和翻译(如有)的方向来说为相反的方向。
核酶
术语“核酶”指的是能特别识别特殊的底物RNA并催化其断裂的RNA分子。通常地，核酶包含能特殊识别靶核酸的反义序列和称为“催化区域”的酶区域。本发明特别适用的核酶的类型为锤头状核酶(hammerhead ribozyme)(Haseloff和Gerlach，1988，Perriman等，1992)和发夹状核酶(hairpin ribozyme)(Shippy等，1999)。编码核酶的DNA可以采用本领域已知的方法化学合成。因此，本发明还提供了编码本发明的核酶的核苷酸分子。通常地，编码核酶的DNA可以插入表达盒或转录盒。在任何潜在的靶RNA的特异核酶断裂位点中，通过扫描靶分子的特异核酶断裂位点，其包括以下的序列GUA、GUU和GUC。一旦确定，对应靶基因区域的15-20个核糖核苷酸之间的含有断裂位点的短RNA序列，包含可用于预测结构如二级结构的特征，可以使寡核苷酸序列不适合。当应用时，核酶可以选自由以下组成的组：锤头状核酶(hammerhead ribozymes)、斧头状核酶(axehead ribozymes)、纽特卫星核酶(newt satellite ribozymes)、四膜虫核酶(Tetrahymena ribozymes)和RNAse P，其是按照本领域已知的方法基于靶基因的序列设计的(参见美国专利5,741,679)。合适的候选靶子可以通过检测他们与互补的寡核苷酸的杂交性能来选择，利用核糖核酸酶保护试验。
本发明所述的反义多聚核苷酸、核酶在生理条件下能与靶核酸分子杂交(如，编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5所示的多肽的mRNA)，在细胞内这些条件命名为，如小麦或大麦细胞等植物细胞中的特殊条件。
RNA干扰/双链RNA
此处使用的，“人工导入dsRNA分子”指的是直接导入的dsRNA分子，其可能从编码此dsRNA分子的嵌合基因通过转录内源地发生，并不指的是真核细胞或植物细胞的中的单链RNA分子转变成dsRNA。RNA干扰(RNAi)对降低基因的表达或抑制特殊蛋白质的产生特别有用。尽管从理论上不希望其得到限制，Waterhouse等(1998)提供了一种通过dsRNA用来降低蛋白质产量的模型机制。此技术依赖于dsRNA的存在，其含有与感兴趣的基因或其部分的mRNA基本上一致的序列。方便地，dsRNA可以在重组载体或寄主细胞中从单启动子产生，其中的正义或反义序列转录后产生发夹RNA，其中的正义和反义序列杂交形成dsRNA区域，连同独立的序列形成环状结构，所以发夹状RNA包含茎环结构。本发明中适合的dsRNA由本领域的技术人员设计及产生，特别涉及Waterhouse等(1998)；Smith 等(2000)；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 99/49029；和WO01/34815。
在一个例子中，导入的DNA指导合成至少部分的与将被灭活的靶基因同源的双链RNA产物。因此DNA包含正义和反义序列，当其被转录成RNA时，可以杂交形成双链RNA区域。在一个优选实施例中，正义和反义序列通过包含内含子的间隔区分开，当其转录成RNA时被去掉。这样的方案可以导致较高的基因沉默的效率。双链区域可以包含从一个或两个DNA区域转录来的一个或两个RNA分子。dsRNA可以分为长hpRNA，具有长的、正义和反义区域，其可以大部分互补，但不完全互补(通常长于约200bp，在200-1000bp范围内)。hpRNA也可以是更小的双链，大约30-42bp长，但不长于94bp(见WO04/073390，此处引作参考)。双链RNA区域的存在被认为激发了来自内源植物系统的反应，破坏了靶植物基因的双链RNA和同源RNA转录物，其有效降低或减弱了靶基因的活性。
杂交的正义和反义序列的长度为至少为19个邻近的核苷酸，优选至少30或50个核苷酸，更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。使用相当于整个基因转录物的全长序列。长度最好为100-2000个核苷酸。与转录靶物的正义和反义序列一致的程度至少为85％，优选为至少90％，最优为95-100％。序列越长，对全序列一致性的要求越不严格。RNA分子可以包含不相关的可以使分子稳定的序列。启动子用于表达dsRNA-形成结构，如果产生的dsRNA对于在用于破坏的细胞谱系中的基因产物是特殊的，其可以是各种类型的启动子。可选择地，启动子可以是特殊谱系，其仅表达于细胞中特殊发育的谱系中。这对于观察到的与表达于非靶细胞谱系中的基因同源的重叠可能是有利的。启动子还可以被外源调控因子，或胞内环境因子所诱导。通常地，RNA分子在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的调控下表达，后者的实例包括tRNA或snRNA启动子。
dsRNA分子的例子为在实施例7和10中提供的，其可用于调控下游具有GWD活性的多肽的产生。
其它的沉默的RNA可以是“未被多腺苷酸化的RNA“，其包含至少20个连续的核苷酸，具有与靶基因RNA转录物的核酸序列互补的序列至少95％的序列同一性，如WO01/12824或US6423885中所述(引为参考)。还有另一种沉默的RNA是如WO03/076619中所述(引为参考)的RNA分子，其包含至少20个连续的核苷酸，其具有与靶核酸序列或其互补的序列至少95％的序列同一性，和进一步包含大部分的双链区域，如WO03/076619中所述。沉默的RNA可以是包含正义和反义链的双链RNA，所述正义和反义链能互相碱基配对以形成双链RNA区域(优选所述的正义和反义RNA的至少20个连续的核苷酸是彼此互补的)。正义和反义区域可能同时存在于一个RNA分子中，如当正义和反义区域形成双链RNA区域时，可形成发夹RNA(hpRNA)。hpRNA是本领域技术人员已知的(如WO99/53050，引为参考)。
小RNA调控是基因调控RNA沉默路径的清楚的专门的分支，其与传统的RNAi/PTGS不同。小RNAs是特殊的小RNAs类，其编码形成于特征性的反向重复中的基因类似因子。转录时，小RNA基因引起茎-环前体RNAs，然后从其持续产生小RNAs。小RNAs的长度通常约为21个核苷酸。其释放出的miRNAs合并为RISC类似的复合物，所述复合物包含特殊的可以行使特殊序列基因抑制的Argonaute蛋白亚基(参见，例如，Millar和Waterhouse，2005；Pasquinelli 等，2005；Almeida和Allshire，2005)。
共抑制
可以使用的另一个分子生物学的方法是共抑制。共抑制的机制不是很清楚但是其被认为包括转录后基因沉默(PTGS)，这点可能和许多反义抑制的例子类似。其包括在植物的“正义方向”导入基因或片段的拷贝利用启动子来表达，其在此处使用指的是相对于靶基因的序列的序列转录和翻译的相同方向(如果发生)。正义片段的大小，它与靶基因区域相一致，它相对于靶基因的同源性程度如上述的反义序列。在有些情况下，基因序列的额外拷贝妨碍了靶植物基因的表达。可以参考专利说明书WO 97/20936和欧洲专利说明书0465572中实施共抑制的方法。反义、共抑制或双链RNA可能同时包含大量的双链RNA区域，优选包含核定位信号，如WO 03/076619中所述。
任何降低基因表达的方法可用于协调降低多倍基因的活性。例如，RNA分子可以靶对应相关基因的家族，通过共有基因上的靶区域。可选择地，不相关的基因可以通过一个RNA分子中含有的多个区域进行靶定位，每个区域靶定位不同的基因。这可以通过在单启动子的控制下融合多个区域来完成。
将核酸导入植物细胞中的方法/转化
许多技术可以用于将核酸分子导入植物寄主细胞，这是本领域技术人员熟知的。术语“转化”意味着改变生物体的基因型，例如，通过向细菌或植物中导入外来或外源的核酸。“转化子”指改变的生物体。此处使用的术语“转基因”指的是遗传修饰的植物，其内源基因组被添加或修饰，通过随机或定向整合，或以可复制的非整合形式稳定保持，导入外来或外源基因或序列。“转基因”意味着外来或外源的基因或序列导入植物中。核酸分子可能牢固地整合到植物的基因组中，也可能作为核外染色体成分被复制。“基因组”指细胞、植物或植物部分的所有可继承的遗传补体，并且包含染色体DNA，质粒DNA，线粒体DNA和核外染色体DNA分子。此处使用的与植物原料有关的术语“再生”指的是从一个植物细胞、一组植物细胞或植物部分，如种子，或来自胚、胚鳞、原生质体、愈伤组织或其它组织的植物部分，生长成整株不同的植物。
转化技术的专门选择是由其转化的特定植物品种的效率以及实施本发明的人员所选择的特定方法的经验和偏好所决定的。对熟练的技术人员来说是显而易见的，假使达到了可以接受的核酸转化水平，选择专门的转化系统将核酸结构导入植物细胞中，不是必须的或受本发明限制的。用于植物改造时实际使用的转化体系在Birch(1997)中有所指导。
原则上，双子叶植物和单子叶植物都可通过转化进行改良，可以导入核酸结构至受体细胞，长出新生植物，所述植物含有并表达本发明的多聚核苷酸。
可在双子叶植物中导入并表达外来或外源多聚核苷酸，如，烟草，马铃薯，豆科植物，例如紫花苜蓿已经被证明可以使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的T-DNA(例如，参见，Umbeck，美国专利No.5,004,863，和国际申请PCT/US93/02480)。本发明的结构可以是利用含有Ti质粒根癌土壤杆菌导入植物细胞中。当使用根癌土壤杆菌培养物作为转化载体时，最好是使用土壤杆菌属(Agrobacterium)的非致癌品系作为载体以使转化组织的正常的非致癌的分化成为可能。最好所述土壤杆菌属(Agrobacterium)含双Ti质粒体系。这样的双体系包含(1)具有为将转化DNA(T-DNA)导入植物中所必需的致病区域的第一Ti质粒，和(2)嵌合质粒。所述嵌合质粒至少包含一个两侧将转化核酸的野生型的Ti质粒的T-DNA的边缘区域。双Ti质粒体系对转化植物细胞是十分有效的，例如，De Framond(Biotechnology，1：262，1983)和Hoekema等(Nature，303：179，1983)中所述。这样的双体系由于其在土壤杆菌属(Agrobacterium)中不需要整合入Ti质粒而更为优选。
使用土壤杆菌属(Agrobacterium)的方法包括，但不限于：(a)将分离培养的原生质体与土壤杆菌(Agrobacterium)混合培养；(b)用土壤杆菌(Agrobacterium)转化植物细胞或组织；(c)用土壤杆菌(Agrobacterium)转化种子、芽尖或分生组织；或(d)孕育植物，例如Bechtold等(1993)所述的花浸染法(floral-dip method)。此方法是基于悬浮的土壤杆菌细胞的真空侵入的，换句话说，可以使用土壤杆菌的根诱导(Ri)质粒作为载体导入嵌合的结构。
转化谷类植物如小麦和大麦，或其它单子叶植物如甘蔗的方法，其通过导入外源核酸将遗传变异导入植物中，用于植物从原生质体或未成熟的胚再生，在本领域中是熟知的。例如，Wan和Lemaux(1994)，Tingay等，(1997)，加拿大专利申请No.2,092,588，澳大利亚专利申请No 61781/94，澳大利亚专利No 667939，美国专利No.6,100,447，国际专利申请PCT/US97/10621，美国专利No.5,589,617，美国专利No.6,541,257，和专利说明书WO99/14314中描述的其它方法。优选的，通过根癌土壤杆菌介导的转化方法来生产转基因的小麦或大麦植物。载有所需核酸结构的载体可以导入组织培养的植物或外植体的再生的小麦细胞中，或是如原生质体的合适的植物体系中。再生的小麦细胞优选来自于未成熟胚的胚鳞，成熟的胚，来源于此的愈伤组织，或分生组织。
遗传结构还可以通过电转化导入植物细胞中，如Fromm等所述的(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A，82：5824，1985)和Shimamoto等。(Nature 338：274-276，1989)。在该技术中，在含有相关核酸序列的载体或核酸存在的情况下电转化植物原生质体。电脉冲的高磁能量反向透化膜(reversibly permeabilize membranes)导致了核酸的导入。电转化的植物原生质体重新形成了细胞壁、分裂和形成了植物愈伤组织。
将核酸结构导入植物细胞中的另一个方法是小颗粒高速弹道渗透(high velocity ballistic penetration by small particles)(也称为粒子轰击或基因枪法)，被导入的核酸包含在小珠或粒子基质内部，或其表面，如在Klein等(Nature 327：70，1987)中所描述的。尽管一般只需要单独导入一种新的核苷酸序列，这种方法尤其用于多倍导入。
可选择地，可以通过使用机械或化学的方法处理植物细胞以将核酸结构导入植物细胞，例如，可以利用微量吸液管通过微量注射直接将核酸机械地转送至植物细胞中。另外，可以利用聚乙二醇将核苷酸转送至植物细胞中，其形成带有遗传物质的沉淀复合物，被细胞吸收。
现已知多种单子叶植物的转化方法。目前，转化单子叶植物的方法是外植体或悬浮细胞的基因枪法，土壤杆菌介导的基因转化，和DNA直接提取或电转化，如，Shimamoto等(1989)所描述的。已经通过基因枪法将Streptomyces hygroscopicus bar基因导入玉米胚细胞的悬浮培养物中得到了转基因的玉米植物(Gordon-Kamm，1990)。小麦植物从胚发生的悬浮培养物中再生，其中的胚发生的悬浮培养物是通过选择老化压实的和节状的愈伤组织而得到的(Vasil，1990)。这些农作物的转化体系的联合使用获得本发明应用于单子叶植物。转基因的甘蔗植物已经从胚发生的愈伤组织中再生，如Bower等(1996)中所描述的。
可选择地，可以结合不同的技术来提高转化过程的效率，例如用包有微粒子(EP-A-486234)的土壤杆菌轰击或基因枪法形成伤口再与土壤杆菌混合共培养(EP-A-486233)。
本发明优选的植物是那些为其有价值的产物生长或收获的品种，其中有价值的产物包括淀粉，其可以用于食品，饲料，发酵或工业原料等其余用途。
诱变
本发明的植物在诱变后可种植和鉴定。可以在某些市场提供非转基因的植物。
突变既可天然发生(也就是说，从自然来源中筛分)，也可人为(如，通过核酸定点突变)或诱导。通常的，原植物细胞、组织、种子或植株易于诱变以产生单倍体或多倍体突变，例如核苷酸取代、缺失、添加和/或密码子修饰。在本申请中，“诱导突变”是人工诱导的遗传变异，其可能是基于化学的、辐射的或生物的诱变，例如转座子或插入T-DNA。优选的突变是无效的突变，如无义突变、移码突变、插入突变或切割位点突变体，其使基因完全丧失活性。插入核苷酸的衍生物包括5′和3′末端融合以及序列内插入单倍体或多倍体的核苷酸。插入核苷酸序列的突变体为在预定点的核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸，尽管随机插入也有可能筛分获得适合的结果产物。缺失的突变体定义为从序列中移除一个或多个核苷酸。优选的，突变基因相对于野生型基因来说，具有单个序列插入或缺失。取代的核苷酸突变体为在序列中有至少一个核苷酸移除或在该位置插入不同的核苷酸。相对于野生型基因来说，突变体基因被取代的核苷酸的数量最多为10个核苷酸，更优选最多为9、8、7、6、5、4、3或2个，最优选仅有一个。这样的取代可能是“沉默的”，因为其没有改变密码子确定的氨基酸。可选择地，保守取代基的目的是改变氨基酸为另一种类似活性的氨基酸。典型的保守取代基是与上述表中的“取代基示例”相一致的。
此处所用的术语“突变”不包括不影响基因的活性的“沉默的”核苷酸取代，因此包括影响基因活性的基因序列的改变。术语“多态性”指的是包括“沉默的”核苷酸取代在内的任一种核苷酸序列的改变。
在一个优选实施例子中，植物包含GWD基因的至少部分缺失。本领域可以理解的是，如面包小麦的六倍体小麦含有三个染色体组，其一般定义为A，B和D染色体组，而如硬粒小麦的四倍体小麦含有二个染色体组，其一般定义为A和B染色体组。每个染色体组含有7对染色体，其可以在减数分裂时通过细胞学的方法观察到并且采用本领域已知的方法鉴定。
可以通过化学的或辐射的方法获得诱变，例如用EMS或叠氮化钠(Zwar和Chandler，1995)处理种子，或γ射线照射，均是本领域已知的。通过筛分诱变植物或种子的方法分离获得突变体。例如，大量诱变的小麦通过其叶片或谷粒中淀粉的较低的磷酸含量来筛分，通过PCR或基于异源双链的试验检测GWD基因的突变体，或通过ELISA检测GWD蛋白缺失。在多倍体植物中，最好筛分一或二组GWD活性缺失的基因型，例如，在小麦植物的三个染色体组中有二个GWD基因突变，以便寻找缺失全部功能活性的突变体。可选择地，突变体可以使用如“tilling”的技术从大量的用如EMS的试剂诱变的诱变体中鉴别出来(Slade等，2005)。此突变体可以被导入至适合的遗传背景中，通过将突变株与所需遗传背景的植物杂交，并且实施适当次数的反交以去除原有的不需要的亲本背景。
使用本领域已知的任意技术制备突变(改变)的肽。例如，本发明的多聚核苷酸可以在体外诱变。体外诱变技术包括将多聚核苷酸亚克隆入合适的载体中，转化载体至“突变”菌株如E.coli XL-1red(Stratagene)并且进行适合代数的转化细菌的传代。在另一个例子中，本发明的多聚核苷酸用Harayama(1998)中广泛描述的DNA穿梭技术处理。此DNA穿梭技术可以涉及与本发明相关的基因，如除了小麦或大麦以外的植物品种中的GWD基因，和/或涉及相同植物中的编码类似蛋白的不同的基因。突变/改变的DNA的产物可以使用上述的技术筛分得到，并确定其是否具有，如GWD活性。
可以通过诱变直接将突变体导入植物，或通过使两种亲本植物杂交间接导入，其中一种亲本含有导入的突变体。改良的植物例如小麦植物可以是转基因的或非转基因的。采用诱变，可以得到缺失感兴趣的功能的非转基因植物。本发明也提供了产生自植物的谷粒或其它植物部分，以及可用于生产具有所需特性的植物的任意的植物传代材料，例如培养的组织或细胞。本发明清楚地提供了生产或鉴定这样的植物或由这样的植物产生的谷粒的方法。
可以采用已知的技术TILLING(点突变检测，Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)生产本发明的植物。第一步，通过用化学诱变剂处理种子(或花粉)将如新的单独碱基对改变的突变导入大量植物中，然后世代繁殖植物直至突变可以稳定地遗传。提取DNA，以及储存来自所有群体的种子，创建库，以便可以在将来重复取用。
为了TILLING试验，需要设计PCR引物，以特异扩增单独的感兴趣的目标基因。如果目标是基因家族的一员或多倍体染色体组的一部分，特异性是十分重要的。接着，可采用染料标记引物从多倍体个体的DNA库中扩增出PCR产物。这些PCR产物变性和退火以形成错配碱基对。错配，或异源双链，代表自然出现的单核苷酸多态性(SNPs)(即群体中的一些植物可能具有相同的多态性)，以及导入的SNPs(即仅少数个别植株显示出突变)。在形成异源双链后，利用核酸内切酶，如Cel I，识别和去掉错配的DNA是发现TILLING群体中新的SNPs的关键。
利用此方法，可以从数以千计的植物中筛分鉴别出具有单碱基对改变以及在任意基因或基因组的特殊区域插入或缺失较小片段(1-30bp)的个体。0.3-1.6kb大小范围内的基因片段可以检测得到。在8倍库中，1.4kb的片段(由于干扰造成的SNP检测困难使片段末端减弱)和每试验96泳道，该结合使得每一次试验可以筛分出基因组DNA的百万个碱基对，达到了TILLING高通量技术。
TILLING在Slade和Knauf(2005)，以及Henikoff等(2004)中有进一步描述。
为了更有效率的检测突变，高通量TILLING技术对于检测自然多态性比较理想。所以，通过异源双链根据已知序列查询未知的同源DNA，显示出多态性位点的数量和位置。核苷酸的改变和微小的插入和缺失可以被鉴别，包括至少一些重复数量的多态性。这已被称为Ecotilling(Comai等，2004)
各种SNP可以通过其在核苷酸内的大概位置记录下来。因此，单倍体可以基于其移动性被归库保存。利用用于错配剪切试验的相同扩增的DNA部分可以获得小的序列数据增量。通过其与多态性的相似性选择用于单个反应的左侧或右侧测序引物。测序软件进行大量比对并发现碱基的变化，其可以在凝胶带中得到证实。
Ecotilling比全序列检测更廉价，目前被用于发现大多数的SNP。可以从含有排好的生态型的DNA的平皿中筛选，而不是从诱变植株的DNA库中筛选。由于凝胶检测具有相近的碱基对分辨率和背景模式为统一的交叉泳道，相同大小的条带会配对，故而在一步中发现和确定SNPs的基因型。这样，SNP的最终测序是简单有效的，事实是用于筛选的相同PCR产物的部分易于进行DNA测序。
此处使用的术语“遗传连锁”指的是标记物基因座和第二基因座在染色体上的位置十分接近，其将在50％以上的减数分裂中共同遗传，例如并非随机。此定义包括标记物基因座和第二基因座形成相同基因的部分的位点。此外，还包括含有多态性的标记物基因座的位点，该多态性为感兴趣的特性(换句话说，标记物基因座直接与表型“连锁”)。如此，可以在每代中观察到的基因座之间的重组百分比(厘摩(cM))将小于50。在本发明的一个优选实施例中，染色体上遗传连锁基因座可能分别是45，35，25，15，10，5，4，3，2，或1或更少cM。优选的，标记物分别小于5cM或2cM，最优选为约0cM。
所使用的，“其它遗传标记”可以是可与谷类作物如小麦的所需特性连锁的任意分子。本领域技术人员已知这些标记，其包括与决定如抗病性、产率、植物形态、谷粒品质、其它潜在特性如谷粒颜色、种子中赤霉酸含量、株高、面粉颜色等特性的基因连锁的分子标记。小麦中这样的基因的例子是茎抗锈蚀性基因Sr2或Sr38，抗条锈病基因Yr10或Yr17，抗线虫性基因Cre1和Cre3，麦蛋白基因座上决定生面团韧性的等位基因如Ax、Bx、Dx、Ay、By和Dy，决定半矮性生长习性的基因，因此具有抗倒伏性Rht(Eagles等，2001；Langridge 等，2001；Sharp等，2001)。
辅助标记筛选是公认的方法，在标准育种方案中，当和回交亲本回交时选择所需的杂合植株。每回交世代的植物群体为杂合的，用于感兴趣基因，一般为回交群体的1∶1，分子标记可用于区别基因的二个等位基因。例如，通过从嫩枝中提取DNA，采用专门的标记检测所需的基因渗入的特性，早期筛选的植物进行进一步的杂交使得能量和资源集中于少数植物。
本发明可以使用本领域已知的能检测GWD等位基因或其它基因的任一种分子生物技术。这些方法包括但不限于，采用核酸扩增，核酸测序，采用合适的标记探针进行核酸杂交，单链构象分析(SSCA)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，异源双链分析(HET)，化学裂解分析(CCM)，催化核酸裂解或它们的组合(参见，如，Lemieux，2000；Langridge等，2001)。本发明还包括使用分子标记技术检测GWD的等位基因的连锁多态性，其导致改变的淀粉磷酸化和/或降解。这些方法包括多态性限制性片段长度多态性(RFLP)，RAPD，扩增片段长度多态性(AFLP)和微卫星(简单序列重复，SSR)多态性的检测或分析。可以通过本领域已知的方法容易地获得相近的连锁标记，如分组分析法，在Langridge等，2001中所述。
聚合酶链式反应(PCR)是采用含有“上游”和“下游”引物的“引物对”或“引物组”，聚合催化剂如DNA聚合酶和通常热稳定的聚合酶，在反应中生成靶多聚核苷酸的重复拷贝。PCR的方法是本领域已知的，如在“PCR”(Ed.M.J.McPherson和S.G Moller(2000)BIOS Scientific Publishers Ltd，牛津大学)中有所教导。可以PCR通过逆转录mRNA获得的cDNA，所述mRNA分离自表达ABA 8′-羟化酶基因的植物细胞。然而，通常使用从植物中分离的基因组DNA进行PCR更容易进行。
引物是能够以序列特异方式与靶序列进行杂交的寡核苷酸序列，并在PCR过程中延伸。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是含有引物和新合成的靶序列拷贝的延伸产物。多PCR体系包括多组引物，可以同时产生多于一个扩增子的产物。引物可以和靶序列十分相配，也可以含有内错配碱基，可以在专门把序列中引入限制性内切酶或催化核酸识别/剪切位点。引物还可以含有额外的序列和/或含有修饰的或标记的核苷酸以便于捕获或检测扩增子。DNA热变性的重复循环，引物和其互补序列的退火以及用聚合酶延伸退火引物使得靶序列指数扩增。术语“靶”或“靶序列”或“模板”指的是扩增的核酸序列。
核苷酸序列的直接测序的方法是本领域的技术人员所熟知的，也可在如Ausubel等和Sambrook等中查找到。采用适合的方法进行测序，例如双脱氧法测序，化学测序或它们的变化形式。直接测序可以确定特殊序列中的任一对碱基对的变化。
植物
本发明的名词术语“植物”作为名词指整株植物，但也用于形容词，指代存在于的、从其获得的、从其分离的或与植物相关的，例如，植物器官(如，叶，茎，根，花)，单细胞(如花粉)，种子，植物细胞等。“植物”的意思还包括出现了根和苗的植物幼苗和萌芽的种子。此处的术语“植物部分”指的是一种或多种植物组织或器官，其来源于含有淀粉的整株植物。植物部分包括营养结构(如叶、茎)，根，花器官/结构，种子(包括胚芽、胚乳和种皮)，植物组织(如，维管组织、基本组织等)，细胞和其后代。此处的术语“植物细胞”指的是来源于植物或此植物的细胞，其包括原生质体或从植物中分离的其它细胞，配子产生细胞，可再生为整株植物的细胞。植物细胞可以为培养的细胞。所述的“植物组织”意味着来源于植物的或从植物(“外植体”)中获得的分化组织，或未分化组织，其来源于未成熟或成熟的胚，种子，根，苗，果实，块茎，花粉，如冠瘿等瘤组织，和各种培养的植物细胞的集合体形式，如愈伤组织。种子中的典型的植物组织是胚乳、胚鳞、糊粉层和胚。
此处使用的，术语“谷粒”通常指的是成熟的、收获后的植物种子，但是也可以按照上下文内容指的是吸胀或萌芽后的谷粒。成熟的谷物颗粒如小麦通常有小于约18-20％的湿含量。
此处的“转基因植物”指的是含有构建的基因的植物，其在同种族、同品种或同品系的野生型植物中是不存在的。即，转基因植物(转化的植物)含有在转化之前没有的遗传物质。此处的“转基因”具有生物技术领域的通常意义，指的是通过重组DNA或RNA技术产生或改变的被导入植物细胞的基因序列。转入的基因可以包括来源于或分离自植物细胞，或其它植物细胞，或非植物来源，或合成序列的基因序列。一般地，通过人工操作导入转化的基因，如，通过本领域的技术人员已知的转化等任何能使用的方法。遗传物质优选可以稳定的整合入植物的基因组中。导入的遗传物质可以包含同种族中天然存在的序列，但是经过序列重组或序列重排，例如反义序列。含有此类序列的植物均包括在“转基因植物”中。“非转基因植物”是没有通过重组DNA技术导入遗传物质的未经过遗传修饰的植物。在一个优选实施例中，每个核每一种导入基因(转基因)的转基因植物是纯合的，以使其后代不会出现性状分离。
此处所用的，术语“相应的非转基因植物”指相对于转基因植株是同源的植物但没有转入感兴趣的基因。优选的，相应的非转基因植物是与感兴趣的转基因植物前体相同的品种或种类，或为结构缺失的同属植物谱系，通常称为“分离子”，或同品种或种类的转化有“空载体”结构的植物，其可能为非转基因植物。此处的“野生型”，指的是未根据本发明改造的细胞、组织或植物。野生型细胞、组织或植物可作为空白对照，以对比外源核酸的表达水平或本发明所述的改造的细胞、组织或植物的改造程度和性质。
本发明上下文中的转基因植物，包括利用重组技术进行遗传修饰的植物后代，其中后代含有感兴趣的转入基因。可通过初始转基因植物自交的方式或与其它同类的植物杂交的方式得到这样的后代。这通常可以用来调节至少一种在需要的植物或植物器官中蛋白/酶的生产。转基因植物部分包括所述含有转基因植物的所有部分和全部细胞，如培养的组织、愈伤组织和原生质体。
可以应用几种方法去确定在转化后的植物中的转基因的存在。例如，可以应用聚合酶链式反应(PCR)扩增转化植物中的独特序列，利用凝胶电泳或其它方法检测扩增产物。可以利用常规方法提取DNA，采用引物进行PCR反应以扩增专门的DNA，其存在用来区别转化和非转化的植物。例如，引物被设计用来扩增读入转化载体结构中的DNA片段，反向引物根据感兴趣的基因来设计。这些引物将只扩增已成功转化的植物的片段。一种确定阳性转化子的替换方法为本领域已知的Southern印迹杂交技术。转化的植物还可以通过其与非转化或野生型植物的表型来区分，如通过比较可选择标记基因的存在与否，或通过植物种子的淀粉的磷酸含量的减少的表型，或通过相关的表型，如生产潜力的增加。
在此使用的，“萌芽”指的是种皮吸胀后出现根尖，“发芽率”指的是在一定时期如7天或10天内有多少种子在吸胀后发芽，对大量种子在这些时期内进行每日评定以确定发芽率。
关于本发明的种子，此处使用的术语“发芽率基本相同”是指和同源的非转基因种子的发芽率至少为同源的非转基因种子发芽率的90％。发芽率可以通过本领域已知的技术计算。
本发明提供的或预期使用的植物包括被子植物和裸子植物，在被子植物里，包含单子叶植物和双子叶植物。在一个优选实施例中，本发明的植物是禾谷类作物(如，禾谷类和豆类，玉米，小麦，马铃薯，木薯，稻，高粱，粟，甜木薯，大麦，或豌豆)，或为其它的豆类作物。植物可为因为其可食用根、块茎、叶、茎、花或果实而种植的作物。
在一些实施例中，转基因植物是禾谷类作物。禾谷类作物的例子包括但不限于，小麦、大麦、稻、玉米、高粱、燕麦和黑麦。更优选的，禾谷类作物是小麦、大麦、玉米或高粱。例子包括小麦、稻和高粱。
此处的术语“小麦”指的是小麦属植物的任意品种，包括其前体，也包括其与其它品种杂交产生的后代。小麦包括染色体组构型为AABBDD的“六倍体小麦”，其包含42条染色体，和染色体组构型为AABB的“四倍体小麦”，其包含28条染色体。六倍体小麦包括T.aestivum，T.spelta，T.macha，T.compactum，T.sphaerococcum，T.vavilovii，和他们之间的种间杂交品种。四倍体小麦包括T.durum(此处也指硬质小麦或Triticum turgidum ssp.durum)，T.dicoccoides，T.dicoccum，T.polonicum，和他们之间的种间杂交品种。此外，术语“小麦”包括六倍体或四倍体潜在的前体，其中A染色体组来源于Triticum sp.如T.uartu，T.monococcum或T.boeoticum；B染色体组来源于Aegilops speltoides；D染色体组来源于T.tauschii(也称为Aegilops squarrosa或Aegilops tauschii)。本发明使用的小麦品种可以属于，但不限于，以上所列的任一种。还包括采用常规技术培育的植物，其采用Triticum sp.作为亲本与非Triticum属(如黑麦[Secale cereale]，包括但不限于Triticale)有性杂交获得。优选的，所述小麦植物适于商业种植收获谷粒，例如六倍体小麦的商业化品种或硬粒小麦，本领域技术人员已知其有适合的农业特性。
此处使用的术语“大麦”指的是大麦属的任意品种，包括其祖先，和与其它品种杂交产生的后代。优选的，植物是商业培育的大麦品种，如，Hordeum vulgare的品系或栽培品种或亚种或适于商业生产谷粒的品种。
食品生产
本发明提供了提高生产潜能的改良的植物。在一些实施例中，其可用于收获后食用。
显而易见的，食用植物包括水果、坚果或收获了叶、茎、果实、块茎、种子和豆荚的蔬菜。
另一方面，本发明提供了谷类植物和谷粒，优选小麦，其用于食品或饲料生产，其中所述谷粒含有改变磷酸含量的淀粉和改变的淀粉分解酶水平。从植物中获得的谷粒最好在发育的胚乳中具有降低的GWD活性水平。本发明的植物用于食品，最好用于商品食品产品。所述食品生产可以包括制作面粉、生面团或可作为商业食品生产成分的其它产品。在一个用于食品生产的实施例中，植物的种子或谷粒具有的磷酸含量相对野生型植物来说，基本相同，或升高；分解酶的水平，尤其是一种或多种淀粉酶，如α-淀粉酶或β-淀粉酶，因为转基因或引入的突变而降低；所述转基因或引入的突变是降低了编码谷粒中此分解酶的基因的表达量。获自此谷粒的面粉或生面团在烘焙或制作其它食品产品时具有可想的品质，其是基于淀粉改变的粘性和/或降低的淀粉酶水平。在一个替换实施例中，用于动物饲料或工业用途如生物乙醇生产的植物的种子或谷粒的磷酸含量相对于野生型植物来说降低，分解酶的活性水平，特别是一种或多种淀粉酶，如α-淀粉酶或β-淀粉酶，由于降低的磷酸盐含量而升高，如上例所示。由此获得的谷粒或淀粉产品当其用于饲料时，具有提高的消化性；当其用于乙醇生产时，具有提高的转化效率。
植物预期的遗传背景也要考虑农业产率和其它特性。这些特性包括是否期望有冬季型和春季型，农业性能，抗病性和抗非生物压力性。为了澳洲人的使用，可以使改变淀粉特性的小麦植物与小麦品种杂交，其中小麦品种如Baxter、Kennedy、Janz、Frame、Rosella、Cadoux、Diamondbird或其它常用品种。其它品种可能合适于其它生长区域。植物，尤其是小麦，本发明的品种在一些生长区域提供了相对于野生型的不低于105％的产率，甚至是不低于110％，更好是不低于115％。产率可以通过对照田试验容易地测定。
在另一个实施例中，谷粒的淀粉含量至少为25％，35％，45％，或55％-65％(w/w)，相对于野生型来说是增加的。商用的野生小麦一般具有55-65％的淀粉含量，根据不同的生长品种而不同。相对的，本发明的种子或谷粒相对于野生植物的谷粒来说，含有至少90％的淀粉含量，优选至少95％，100％，102％或105％。其余希望的特性包括磨碎谷粒的能力，特别是谷粒的硬度。另一个使小麦植物具有高产值的方面，是从谷粒中提取淀粉的程度，越高的提取率越有利。谷粒的形式是另一种影响植物商业用途的方面，谷粒的形式会影响到谷粒是否能被磨碎。
可以采用标准的方法从本发明的谷粒如小麦的谷粒中分离出淀粉，如采用Schulman等的方法(1991)。在工业量产上，可以运用湿磨或干磨。淀粉颗粒的大小对于在淀粉加工业中将较大的A颗粒与较小的B颗粒分离时是十分重要的。
食品产品
本发明还包含用此产品生产的食品、饮品或药物制剂，特别是那些包含从本发明的植物或谷粒中获得的淀粉。这些食品产品可以包含面粉、生面团或其它产品，其是商业食品产品的成分。本发明的谷粒或获得的含有淀粉的产品可以用于许多供人们消费的食品制品中，此处“人们”指的是现代人类(Homo sapiens)。
从改良的小麦植物中分离的谷粒可以容易地用于食品加工程序，因此本发明包括磨碎的、粉碎的、粗磨的、珠状的或碾轧的谷粒，或加工获得的产品，或本发明植物的全谷粒，包括面粉。这些产品可以用于各种食品产品中，如面包、蛋糕、饼干和类似的含淀粉的产品，或增稠剂或粘合剂等食品添加剂，或用于制作饮料、面条、意大利面食或速食汤。分离自本发明谷粒的谷粒或产品最好用于早餐谷类食品或作为挤压制品。本发明的淀粉还可以用于形成高强度的凝胶，其可用于糖果业或降低塑模和固化时间。其还可以用作包衣，例如，可以降低油炸马铃薯或其它食品的油的吸收。此淀粉还可以和脂肪或油产品一起使用，例如人造黄油或起酥油，色拉调味品，蛋制品如蛋黄酱，乳制品如冰淇淋、酸奶或乳酪，谷粒产品如玉米或小麦粉，果汁，其它食物或食物原料，或改变的淀粉可以加工成饮料或食物，如面包、蛋糕、饼干、早餐谷类食品、意大利面食、面条或沙司。
在面包中，面粉或粗面粉形式的淀粉产品可以替换10％(w/w)或更多的未改进的面粉或粗面粉，优选是替换至少30％甚至更多，至少50％的未改变的面粉或粗面粉。配方因此可以是，如，90份面粉，10份改进的小麦淀粉，2份脂肪，2份盐，1份改良剂，2.5份酵母。可以通过本领域的熟练技术人员已知的快速生面团技术活其它的技术来制作面包产品。
可选择地，本发明的淀粉产品可以掺入面糊产品的淀粉中。在面糊组合物中应用的本发明的淀粉产品的量可以在基于淀粉原料总量的基础上的10-100％(w/w)的范围内，优选在10-80％的范围内。本领域中的熟练技术人员可以容易地选择适合的其它淀粉原料。还可以向组合物中添加其它原料，如脱水的或液态的鸡蛋(蛋黄、蛋白或全蛋)或高蛋白物质，如乳蛋白或鱼蛋白。还可以添加维生素、矿物质、钙盐、氨基酸、缓冲剂如磷酸氢二钠、调味品、凝胶、麸质或单硬脂酸甘油酯等。
本发明的植物的其它可食用部分可以用于人类消费的食品或用于动物饲料。例如，来自含有本发明细胞的叶片，茎，根，块茎，果实，豆荚，或提取物或它们的部分可用于人类或动物的消费品。作为新鲜的或加工的水果或蔬菜的植物的使用是本领域熟知的，这些应用均包括在本发明中。本发明的提高了消化率的植物和其部分可以用于动物饲料的原料，如，猪饲料，牛饲料，马饲料，鸡等禽类饲料，和其它动物饲料等。特别是，可以预料到的好处是用于动物饲料的转化效率的和随后提高的生长率的提高淀粉消化率的产品。
食品或饮品或药物制剂可以包装好以出售或为大体积形式。本发明还提供基于本发明的食品、饮品或药物制剂的制备方法，以及制备这些食品或饮品的配方和用法。方法可以包括收获植物或植物部分的步骤，从其它植物部分中分离出谷粒，粉碎，提取，研磨，轧花，烹饪，制罐，包装，或其它现有的已知的加工步骤。方法或配方或用法可以包括处理本发明的植物产品的步骤和/或将它们与其它食品成分混合，比如加热或烘焙混合物或产品至，例如至少100℃。方法可以包括包装产品以出售的步骤。
饲料和动物用途
本发明的植物以及获得的产品或工业品，尤其是收获的产品，例如谷粒，可以用于动物饲料。不限于此，可以理解的是由于增加了产品中淀粉的消化性和生物利用度。在一个优选实施例中，此是和产品中淀粉酶水平的提高相关的。尽管产品中淀粉磷酸含量的减少可能引起消化率降低，但是升高的淀粉酶水平尤其是α-淀粉酶的水平会抵消这些，最后的结果是增加了消化率。对于饲料转化成动物产品的转化率，这也是有特别的优点的，其相对于没有改变的相应的野生型产品来说，可以增加至少2％，优选至少5％或至少7％。此优点既可以体现在如小鸡、小牛、小羊这类的小动物身上，也体现在一些成年动物身上。饲料的转化效率可以采用现有的已知的方法测定。
工业实用性
植物产品，尤其是谷粒，在工业产品如乙醇的生产上有特殊的优势。增加的产量参数，如上述提及的增加了的淀粉向糖的转化率，提供了特别的益处。例如，将本发明的可将淀粉转化为糖的产品用于发酵生产，其减少了需添加的外源淀粉酶的量，反应可在降低的温度下进行，故降低了能量消耗。本发明通过下述的实施例进一步描述，其不具有限定作用。
实施例1材料和方法
谷物中淀粉的提取
用Metefem(原型)的小型粉碎机粉碎成熟籽粒，将粉碎物过0.5mm筛。将得到的粗面粉称重，加入50％重量的水以软化所得物。通过机械地混合水和面粉得到面团。加入过量的水，从面筋中提取淀粉，然后将所述淀粉悬浮液通过100μm滤纸过滤以去除残渣。重复提取4次或直至面团中无淀粉残留。通过离心将淀粉制粒(5,000rpm，10分钟，4℃)。去掉覆盖的蛋白，将淀粉重悬于过量的水中。重复洗涤3次。将提取的淀粉在FTS冷冻干燥机(Model No.FD-3-55D-MP)中进行冷冻干燥。采用该方法，10g谷物大约产生6g面粉和3g淀粉。
叶片中淀粉的提取
采用Delvalle等(2005)中描述的方法从作物叶片中提取淀粉。将叶片样本进行冷冻干燥，然后将样本置于冰上用Polytron搅拌器于15-25ml提取缓冲液(MOPS 100mM，pH7.2，EDTA 5mM，乙二醇10％(w/v))中粉碎。将该混合物通过两层神奇滤布(Miracloth)进行过滤并离心，保留含淀粉的颗粒。然后于4℃通过90％Percoll梯度4,000rpm离心40分钟以纯化淀粉。
淀粉样本中磷酸盐及葡萄糖-6-磷酸水平的测定
淀粉中总磷酸盐含量的测定采用摘自Ekman和Jager，(1993)的孔雀绿(Malachite Green)方法。通过将10mg干淀粉重悬于500μl 10％的DMSO溶液中进行溶解，煮沸该混合物10分钟。将200μl溶液与200μl Clark和Lub缓冲液(0.054M KCl，0.145M HCl)；120μl H2O；80μL 4M HCl和200μL孔雀绿3∶1(0.2％孔雀绿溶液：4M HCl中(NH4)6Mo7O24(4H2O)10％溶液)混合。酸水解C6和C3的磷酸基团，通过孔雀绿试验测定游离的磷酸。用分光光度计测定660nm处的光学密度。用0.01-5mM的G1P溶液标准品绘制用于测定淀粉样本的标准曲线。通常用3份样本测定磷酸的含量，平均表达量以每mg淀粉毫摩尔计。
采用摘自Delrue等，(1992)的淀粉葡萄糖苷酶试验测定葡萄糖-6-磷酸(G6P)水平。如下所述，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶专门用于本试验。将5mg干淀粉溶解于500μl10％的DMSO水溶液中，煮沸10分钟以溶解淀粉。稀释双份样本。各样本中的淀粉通过70μl淀粉葡萄糖苷酶溶液(AGS，Enzytec的淀粉检测试剂盒)的作用，于55℃降解2小时。通过加入350μl水和350μl溶液1(TEA缓冲液pH 7.6，NADP，ATP(Enzytec的淀粉检测试剂盒))终止反应。加入下述试剂前测定340nm处的OD值(设定为ODo)。第一系列用于测定淀粉量，加入5μl溶液混合物(Hexokinase和G6PdH(200U/100U每0.7ml，Enzytec的淀粉检测试剂盒)。第二系列用于测定G6P量，加入5μl不含已糖激酶的G6PdH(G7877-2KU，Sigma，18单位/ml)。将该混合物于25℃孵育15分钟，测量340nm处的OD值。每隔10分钟重复测量直至OD值稳定(设定为ODf)。
用方程计算淀粉量或G6P量：
[淀粉或G6P][mg.ml-1]＝(ODf-ODo)x1.069/稀释因子
第一系列测定各样本中的淀粉浓度和淀粉量，第二系列测定淀粉中存在的G6P量。
淀粉粒大小分布
分离的淀粉样本的颗粒大小分布，制备成溶于水的淀粉泥浆，采用激光衍射粒子分析仪(2600c Droplet和Particle Sizer型，Malvern仪器，Malvern，UK)进行测定。“A颗粒”定义为通过分析仪测定直径大于10μm，“B颗粒”为直径小于10μm。此处描述的颗粒大小分布为B颗粒表达的频率占淀粉颗粒总体积的百分比(Stoddard，1999)。
淀粉性质
用异淀粉酶释放样本中支链淀粉的糖苷链对淀粉样本去分支后，分析淀粉中链长度的分布。进行如O′Shea等(1998)描述的荧光基团辅助的碳水化合物电泳(FACE)，采用P/ACE 5510毛细电泳系统(Beckman)用氩-LIF检测。
在Pyris 1差别扫描热量计(Perkin Elmer，Norwalk CT，USA)中测定各淀粉样本的凝胶温度。该分析直接测定淀粉凝胶化所需的能量。淀粉的制备是通过将淀粉与水以1∶2(干淀粉∶水)的比率预混合。将该混合物充满DSC盘并密封。对照为空盘。(凝胶化和直链淀粉-脂分解)每2个温度测定4次：起始(初始)温度、峰温度、终末温度和焓。
用快速粘度分析仪(RVA，Newport Scientific Pty Ltd，Warriewood，Sydney)测定淀粉溶液的粘度，例如采用Batey等，1997报道的条件。测定的参数包括峰粘度(最大热浆粘度)、保持强度、终末粘度和糊化温度。
根据Konik-Rose等(2001)的方法测定面粉或淀粉的膨胀体积。是通过在90℃下称重面粉或淀粉与水混合前和与水混合后的样本，测定吸收的水，然后收集凝胶化的材料。
通过凝胶渗透层析分级分离淀粉
琼脂糖凝胶渗透柱层析用于从淀粉中分离支链淀粉(大分子量)部分和直链淀粉(小分子量)部分，将1-2.5mg淀粉溶解于500μl 10mMNaOH中，用于琼脂糖CL2B柱(0.5cm内径x65cm长)，用10mMNaOH平衡层析柱并用该溶液进行层析。250-300μl部分的收集速率为1部分/1.5min。根据Banks等(Starch/die 
Figure BPA00001186587900721
23：118-124，1971)的碘-多糖相互作用或通过葡萄糖试验(Enzytec)测定每部分的葡聚糖。
采用Morrison和Laignelet(1983)的比色法(碘滴定)进行如下略微改进，测定淀粉样本的直链淀粉含量。精确称量约2mg淀粉(精确至0.1mg)至盖子上带有大小适宜的橡皮刷的2ml螺旋盖试管中。去除脂，将1ml 85％(v/v)甲醇与淀粉混合，于65℃水浴中加热该试管1小时并不时摇动。13,000g离心5分钟后，小心去掉上层悬浮物，重复提取步骤。然后于65℃干燥淀粉1小时并溶解于尿素二甲亚砜(UDMSO；9体积二甲亚砜比1体积6M尿素)，每2mg淀粉(上述称重的)用1ml UDMSO溶解。立即剧烈摇动该混合物，于95℃水浴中孵育1小时并间断性地摇动以完全溶解淀粉。淀粉-UDMSO溶液(50μl)部分用每ml水中含2mg碘和20mg碘化钾的20μlI2-KI试剂处理。将所述混合物用水补足至1ml。将200μl所述混合物转移至小平板，用Emax精确小平板读数器(分子装置，USA)测定所述混合物在650nm处的吸收值。从马铃薯直链淀粉和玉米(或马铃薯)支链淀粉(Sigma)中获得的含0-100％直链淀粉和100％-0％支链淀粉的标准样本用作试验样本。用由标准样本得到的回归方程中的吸收值测定直链淀粉含量(直链淀粉百分比)。
α-淀粉酶试验
采用Megazyme International Ireland Ltd的Ceralph淀粉酶检测试剂盒按照建议操作测定面粉或粗面粉样本中α-淀粉酶。基于α-淀粉酶对低聚糖的水解，混合物中过量的α-葡萄糖苷酶对该低聚糖进行水解以产生葡萄糖和游离的对硝基酚。必要地，将谷类提取物部分与底物混合物于40℃孵育20分钟，终止反应，加入弱碱溶液显色。测量400nm处的吸收值，与样本中α-淀粉酶的水平直接相关。结果以每g面粉或提取物CU(ceralpha单位)表示。
通过粒子轰击小麦未成熟胚芽进行小麦转化
包被两种质粒纯DNA的金粒：2μg编码选择标记基因(npt)的质粒DNA，本实施例中为pCMneoSTLS2(Maas等，Mol Breeding，3：15-28，1997)，和2μg编码感兴趣基因的质粒DNA，本实施例中为pBx17-GWD_IR，通过之前描述的Cao等(Plant Cell Reporter，11：586-591，1992)CaCl2/亚精胺沉淀。所述金粒/DNA混合物含平均大小为1.5-3.0μm的30mg/ml金粒。用于轰击的50个未成熟的胚芽，于开花期后12天约1.5-2mm长被分离出并去除胚轴。将它们置于含高渗MSM培养基的琼脂平板中心，其为含150g/l麦芽糖和0.1g/l内消旋肌醇的MS培养基，以形成约3cm直径的靶区。如Vain等(Plant Cell Reporter，12：84-88，1993)描述，靶胚芽在MSM平板上培养(预处理)4小时，然后在不完全真空下(约85kPa)采用PDS-1000/He生物传递系统，用5μl包被金粒的混合物进行轰击。负载DNA和靶胚芽之间的距离为9cm，所用压力位900kPa。
转化子的再生/筛选
用所述质粒混合物轰击24小时后，将胚芽转移至MSR培养基上(MSR培养基，pH5.9含30g/l蔗糖、0.1g/l内消旋肌醇和2.5mg/l2，4-D)于暗处24℃培养14天进行胚芽体细胞诱导。然后将培养物转移至选择培养基MSWG50(MS培养基，pH5.9含30g/l蔗糖、0.1g/l内消旋肌醇)上，用50mg/l遗传霉素(G418)作为选择试剂，置于16h光照(约25μE m-2s-1)和8h黑暗中。然后每隔3周将它们转移至选择培养基MSWG50的新平板上。形成的小作物置于新鲜MSWG50上进行一次次代培养以进一步生长。将约10-15cm高的小作物移植至misting台的土壤中2周，然后转移至温度为24℃(白天)和18℃(夜晚)的温室中。通过从组织样本中提取DNA并用转基因专用引物进行PCR反应确定再生作物中的转基因的存在。
作物样本RNA的提取和定量RT-PCR
按照供应商的技术说明书采用Rneasy作物迷你试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)提取叶片样本中的总RNA。以oligodT为引物，采用Invitrogen第一条链合成试剂盒合成cDNA。用Brilliant SYBR Green QPCR MasterMix(STRATAGENE)检测专一扩增。于520nm处检测到专门的荧光，用MX4000分析软件通过与特殊标准曲线比较进行分析。采用Qiagen一步RT-PCR试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)进行一步RT-PCRs。
实施例2小麦和其它谷物中GWD和PWD基因的鉴定
用于马铃薯R1蛋白序列的氨基酸序列(Accession No.AAK11735)和拟南芥PWD蛋白(NP_194176)作为query序列在NCBI数据库中，采用BLASTN程序，询问小麦EST序列。鉴定出17个ESTs(列举如下)，排列起来组合成2273个碱基对序列(SEQ ID NO：1)。
dbj|CJ626658.1|CJ626658 Y.Ogihara unpublished cDNA library.
gb|CV773056.1|FGAS067452 Triticum aestivum FGAS library.
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该序列用于在TIGr数据库(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tae1/)中询问小麦序列。产生3677个碱基对cDNA序列(SEQ ID NO：2)(TIGrAccession No.TA53350_4565)覆盖了3677个碱基对序列。这两个序列的覆盖区显示出99％的一致性。当预测的由这3677个核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与NCBI蛋白数据库中的蛋白序列相比较，可以看到它具有与马铃薯和拟南芥的R1蛋白序列高度相似的序列(分别为71％和67％一致性)。小麦序列还显示出与水稻基因组(Os06g0498400)高度相似的序列，推定与水稻同源。小麦cDNA序列与水稻核苷酸序列有87％序列一致性，氨基酸序列为88％序列一致性。小麦GWD序列假设为SEQ ID NO：2，氨基酸序列假设为SEQ IDNO：3。
当小麦cDNA序列与水稻(Os06g0498400)基因组序列相比较，可以确定水稻基因的外显子/内含子结构，假定的小麦cDNA外显子结构被确定(表8)。
大麦EST序列检测结果为663个核苷酸(SEQ ID NO：4)的大麦EST BU993423显示出与小麦和水稻外显子23和3’区的GWD序列具有相似性，这被认为与大麦基因同源。另一个小麦cDNA 4302个核苷酸(SEQ ID NO：5)被鉴定出，其编码的蛋白具有与马铃薯R1蛋白相似的淀粉结合域。
所述3677bp小麦cDNA序列含有从382-3409的3027bp开放阅读框(ORF)；当所述cDNA与水稻cDNA进行全长比对时，两个序列的相似区域覆盖了水稻全长cDNA。该ORF编码1009个氨基酸序列，分子量为112.8kD。该蛋白序列含有3该保守域，具有推定的功能：约100-200个氨基酸的淀粉结合域，约200-300个氨基酸的磷受体位点和约740-C末端的氨基酸的PEP/丙酮酸盐结合域，该结合域被认为可逆催化ATP至AMP的转化。
另外两个小麦ESTs，CA484881和CO347457，被鉴定出与编码PWD的拟南芥序列具有同源性。它们与2273bp序列不匹配，但编码的多肽显示出与淀粉结合域和拟南芥的PWD蛋白具有同源性。特别地，这两个PWD EST序列分别显示出与ATGWD2/GWD3/PWD(磷酸多糖水二激酶)[拟南芥](NP_194176)基因的氨基酸973-1153(82％一致性)和氨基酸1172-1196(88％一致性)具有相似性。它们还显示出与水稻(Os12g0297500)PWD具有同源性。基于EST序列的引物或本领域已知的其它方法，通过5’-和3’-RACE技术分离出小麦PWD基因全长序列。
进一步搜索到四个高粱ESTs，其与小麦GWD cDNA序列(SEQ IDNO：2)具有同源性，因此显示为部分高粱GWD基因。它们是：登录号：BI245998(SEQ ID NO：11)，其核苷酸序列与小麦GWD序列的第2057-2542位核苷酸(SEQ ID NO：2)具有83％一致性；登录号：CF074015，其具有与小麦GWD第874-1559位核苷酸具有89％序列一致性；登录号：EH406623，其具有与小麦GWD第1323-1885位核苷酸具有89％序列一致性；以及登录号：CD423248，其具有与小麦GWD第2517-3434位核苷酸具有85％序列一致性。基于EST序列的引物或本领域已知的其它方法，通过5’-和3’-RACE技术可分离出高粱GWD基因全长序列。
实施例3含有抑制GWD基因表达的结构的转化作物的生产
为检测抑制GWD基因表达的影响，设计能够表达用于抑制小麦GWD部分同源基因的双链RNA分子的基因结构，目标是与淀粉结合域相一致的保守区。
该结构含有小麦Bx17 HMW麦谷蛋白基因启动子以表达dsRNA，该启动子作为组织专门启动子，优选表达于谷类胚乳中。因此，预测基因表达的抑制可主要产生于胚乳。
该抑制基因结构组装于如下的pBx17IRcasNOT克隆载体中。该载体按顺序含有如下成分：来自小麦HMWG Bx17基因的，如Reddy等(1993)报道的，包括Bx17基因组序列的首个1897核苷酸的胚乳专门启动子，其正向序列attR(1447bp包括ccdB负选择基因)的5’端带有BamHI位点，3’端带有EcoRI位点，与所述启动子反向的水稻淀粉分支酶I内含子4(登录号.D10838从6201-6674位的507bp核苷酸)，正向的水稻分支酶I内含子9(登录号.D10838从9112-9605位的429bp核苷酸)，5’端带有SpeI位点，3’端带有KpnI位点的attR反向序列(1435bp包括ccdB的第二个拷贝)，以及nos3’转录终止序列(267bp，来自pEmu，Chamberlain等，1994)。该载体不含有选择标记基因，也不包括共转化的用于选择转化细胞的含有npt基因的第二个质粒。上述登录号的核苷酸序列通过引用并入于此。
在标准条件下，采用引物GWDF：5′-AAAAGGATCCGGTACCGCCTTCTGGCTCAACAGTTC-3′(SEQ ID NO：6)和GWDR：5′-AAAAGAATTCACTAGTATCACCTTCACCTCCACGAC-3′(SEQ ID NO：7)，退火温度62℃，从小麦胚乳cDNA中扩增与部分小麦GWD基因相一致的PCR片段。PCR反应扩增出小麦GWD cDNAs从581-1020位GWD的SEQ ID NO：2的597bp核苷酸片段。该小麦基因区，相对于转录序列的5’端，与马铃薯基因编码登录号AAK11735(该登录号通过引用并入与此)的氨基酸470-670的部分相一致。马铃薯多肽中的该区被认为与淀粉GWD蛋白结合域高度一致。
所述PCR片段用SpeI和KpnI酶切，与用相同限制酶酶切后的载体pIRBx17casNOT DNA连接，因而形成中间体pBx17-GWD_R结构。进一步地，PCR片段的DNA用BamI和EcoRI酶切，与用相同酶酶切后的pBx17-GWD R_DNA连接，以形成pBx17-GWD_IR。
使用实施例1描述的金粒，该结构的DNA用于小麦未成熟胚芽(Bob White品种)生物介导的转化。约1100个胚芽用该生物方法处理，其中25个小作物再生。18株在温室中生长至成熟。当它们用于测试对遗传霉素的抗性，表明选择标记基因的存在，或通过PCR筛选，鉴定出含有pBx17-GWD_IR的13个阳性小麦转基因作物(指定为T0代，rsGWD系)。用从叶片样本分离出的DNA进行所述PCR筛选，使用位于该结构启动子的引物ZLBx17pro和所述GWDR引物5′-AAAAGAATTCACTAGTATCACCTTCACCTCCACGAC-3′(SEQ IDNO：7)。从含有pBx17-GWD_IR的转化作物中，通过PCR扩增出713bp片段。
实施例4二激酶基因下游调控以及转化小麦作物的分析
T0作物种植于温室中，允许自体受精以产生T1种子。每个转基因系的T1种子进行播种以产生T1后代作物。确定存在转基因的阳性T1作物，进行自体受精以产生T2种子。该用于转基因的T1作物为纯合子或杂合子；可通过分析每个系的T2后代进行区分。保留存在转基因的阴性T1作物(分离子)，并允许自体受精以提供缺少转基因的T2后代作物，其可作为对照(野生型)用于比较表型特征。
从实施例1中描述的转基因系的干燥T2谷物中分离淀粉。该转基因谷物的淀粉含量与野生型谷物相似，没有观察到淀粉含量的明显不同。按照实施例1中描述的Enzytec淀粉检测试剂盒的操作，分析T2淀粉样本的葡萄糖-6-磷酸(G6P)含量。检测12rsGWD T1系的淀粉样本。这些系中的8个系含有RNAi结构，3个系为无效分离子用作(野生型)对照。8个转化的rsGWD系中，与野生型亲本(Bob White 品种)和它们的野生型分离子相比，7个系的谷物淀粉水平显示出明显下降。(见图1)。与Bob White相比，1个系(GWD5-9X)显示出下降的G6P水平，但与无效分离子(rsGWD5-9A).相比，G6P水平没有明显下降。这些数据表明靶基因表明小麦功能性GWD。
淀粉的结构和分子分析
还分析了这些转基因系的淀粉样本的链长度分布，直链淀粉含量和颗粒大小分布。链长度分布曲线是通过实施例1中描述的异淀粉酶分支淀粉后的毛细管电泳而获得。用于分析的12个系，没有观察到链长度分布的明显修饰。每个样本的主要峰的位置产生于相同的聚合度(DP)，当曲线重叠时，实际上曲线是一致的。当比较颗粒大小分布或谷物B颗粒的频率(％)时，没有观察到转基因系和非转基因系中存在明显的变化。大部分转基因系淀粉样本的直链淀粉含量(表示为谷物中提取淀粉的总百分比)比对照或Bob White亲本系略低(低2-3％)(图2)。转基因系rsGWD5-9X的直链淀粉含量与对照相比，在统计学上没有不同。
淀粉的生理化学性质
研究转基因系淀粉样本的生理化学性质包括糊化性质、粘度和膨胀系数。
转基因系淀粉的膨胀势检测如实施例1描述，将数据与对照样本数据进行比较(图3)。转基因谷物淀粉中含G6P的淀粉含量明显下降，即表型水平上最大程度的基因沉默，表现为在95℃膨胀系数明显下降(至少20％)，没有观察到其它系的显著修饰。
采用9％(w/v)淀粉悬浮液，由3g淀粉和25ml水制备，在α-淀粉酶抑制剂终浓度为4μg/ml的硝酸银的存在下或不添加抑制剂的情况下，用快速粘度分析仪(Newport Scientific，Sydney，Australia)分析淀粉的糊化性质。代表性的数据显示于图4和表4，其列出分离自5个转基因系和对照Bob White的淀粉粘度参数。G6P最大程度下降的系还显示出其谷物淀粉糊化值下降最大，特别是峰粘度值和峰值时间。然而，G6P含量影响较小的转基因系，其RVA曲线还显示出略微修饰或无修饰。观察到rsGWD4-1系粘度值下降至少30％。以相似模式对其它谷物淀粉进行分析，与对照相比，rsGWD5-9X显示出相同的粘度曲线。
与淀粉有关的酶活性的分析
未料到地，在无α-淀粉酶抑制剂存在下，对转基因谷物的粗面粉样本进行相同类型的分析，显示出强烈的、特殊的表型(图4)。本试验中加入淀粉酶抑制剂目的是获得较好的粘度参数分辨率以及避免由于淀粉分解酶对亲本系(BW26)的任何阈值。然而，我们惊奇地看到转基因谷物粗面粉的RVA曲线的粘度峰值和终粘度值完全塌陷。来自亲本系粗面粉的曲线通过在分析前向悬浮液中添加淀粉酶抑制剂硝酸银或EDTA而恢复，得到与分离的淀粉RVA曲线相似性状的曲线。
该结果表明转基因谷物中存在增加的α-淀粉酶池。为验证该假设，如实施例1描述测试了籽粒中α-淀粉酶活性水平。选择的系包括这些系的T3后代的数据显示于图5。对于rsGWD系进行分析，与对照亲本系或对照系相比，α-淀粉酶活性升高了至少2-5倍。对β-淀粉酶活性进行测定，与非转化对照相比，观察到面粉中β-淀粉酶活性升高了至少20％。可推论得出作物中减少的GWD与转基因谷物中增加的淀粉酶，α-淀粉酶和β-淀粉酶的累积有关。
还测定了转基因谷物淀粉分解中涉及的其它酶的水平，采用Zeeman等，Plant Journal 15：357-365(1998)描述的操作方法。与对照籽粒相比，转基因籽粒中α-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、D-酶、纤维素酶、地衣多糖酶和木糖酶存在相似的量，尽管一些籽粒个别酶的活性稍高。可推论得出对酶活性的主要影响是淀粉酶，特别是α-淀粉酶。
分解转基因和对照作物的萌发的种子(25DPA)和成熟谷物以分离糊粉层和皮层、胚乳和胚芽组织，测量这些组织的淀粉酶活性表明，增加的α-淀粉酶活性主要位于糊粉层和皮层。胚乳中仅观察到低的活性水平和胚芽中非常低的活性。
分离糊粉层并用碘化吡啶染色，碘化吡啶为荧光混合物，其不能进入具有完整细胞膜的活细胞中，或用羧基荧光素双乙酸盐(CFDA)染色，其能够跨过细胞膜并进入细胞，观察到与对照糊粉层相比，转基因谷物的糊粉层中有更多的细胞在程序细胞死亡中增值。
其它碳水化合物
分析25DPA的叶片，花冠和作物茎的几种碳水化合物水平。在两个独立试验中进行测试。分析表明，与野生型Bob White相比，转基因作物茎中的果糖、蔗糖和葡萄糖水平实质上增加。淀粉水平也增加，但茎中果聚糖水平下降。
改变的作物表型
令人惊讶地且未预料到地，观察到转化小麦系中GWD基因表达的下游调控导致种植于温室中的作物形态和发育的主要修饰。最重要的是，当种植于相同的环境条件包括光照、温度和水分，与对照作物相比，转基因作物表现出更大的活力、健壮和更多的生物产量包括叶片、花冠和穗。与亲本或对照作物相比，每株作物产生的谷物量基本上增加至少50％，见表5中的种子生产数据(每株作物种子g)和图6显示典型的花冠大小。
为确定这些观察结果，对选择的转基因系、对照和亲本作物进行进一步的生长研究以做出统计学分析。测定的参数包括发芽率、不同生长阶段的叶面积和每株作物的花冠数量。每个作物系重复5次这些分析。数据显示与表6。从数据中可推论得出转基因作物的生物产量从发芽后的早期阶段增加，例如在2-叶期直至花冠形成。生物量平均增加30％，在一些作物中增加高于40％。叶面积增加至少50％，在一些系中增加高于60％。每株作物的分蘖数目增加高于15％，有时高于20％。每株作物的花冠数量增加至少40％，在一些情况下增加至少50％。典型地，每株作物的种子产量增加至少40％或至少50％，每粒种子质量相似。
更令人惊讶地，转基因系rsGWD5-9X作物的生长和发育也基本上受到影响。如上所示，该系谷物淀粉的G6P或粘度值没有被明显修饰，因此该作物系的生长和发育应该受到影响的原因是不明显的。可以认为在这些观察之前，胚乳中用于产生RNAi抑制结构的HMW麦谷蛋白启动子的表达受到限制。然而，生长曲线强烈表明启动子的表达是“遗漏的”，特别是作物叶片中过渡淀粉代谢产生下面的光合作用。为测定可能的RNAi结构对过渡淀粉代谢的影响，在光周期结束时，测定选择的转基因系和对照系的叶片中存在的淀粉G6P水平。该时间点与GWD最大活性以及24小时的过渡淀粉累积向一致，选择该时间点因为酶活性显示出昼夜节律变化。
得到的数据示于图7。持续观察该系的生长和发育，与品种BobWhite或对照作物相比，叶片淀粉中G6P水平显著下降。该结果证实叶片中RNAi结构表达的水平足以打乱叶片中GWD的调控，因此影响到过渡淀粉代谢。
结论
由编码转基因小麦中GWD的编码基因表达抑制剂的结构引起的葡萄糖-水-二激酶活性的下降，使得贮藏淀粉(本例中为谷物淀粉)中葡萄糖-6-磷酸含量降低。这表明靶基因编码功能性GWD。单酯化磷酸水平的减低促使糊化性质的修饰以及淀粉膨胀系数的减低。在新的未料到的观察中，这些转基因作物的谷粒还显示出显著增加的α-淀粉酶水平和β-淀粉酶水平，还影响到粗面粉的自然糊化性质。这些淀粉酶通常主要表达于谷物的糊粉层中，特别是吸胀后以及谷粒发芽期间，因此可以认为大部分增加的淀粉酶可能表达于糊粉层中。当对纯化淀粉进行分析时(蛋白已去除)，这种影响仅是适度的。这种对面粉的影响在面包加工和其它食品应用中起作用。然而，最未料到的观察使RNAi结构极大地影响了作物生长和发育，导致基本上增加的生物产量和谷粒产量。生物量和籽粒产量增加30-40％或更多，同时过渡淀粉的葡萄糖-6-磷酸水平下降。基于转基因系rsGWD5-9X作物得到的结果，对生长和产量影响的介导主要通过修饰绿色组织如叶片而不是萌发的谷粒中基因的表达。这是为预料到的，因为用于驱动RNAi结构的启动子为胚乳专用，在其它组织中表达很低。此外，在桌子萌发之前，观察到对作物发育和形态的影响。
实施例5在不同遗传背景下抑制GWD基因表达的影响
为确定不同遗传背景下GWD基因下游调控的影响，将含pBx17-GWD_IR结构的转基因作物与市售面包小麦品种Westonia、Hume和Sunstate进行杂交。得到成熟F1代种子。将这些种子播种于可控条件下的温室中，将F1代作物与3个市售品种中的每一个进行杂交显示出增加的每株穗的数量，例如见图8中的数据，每个系用4或5株作物。可推论得出增加的产量参数可延伸至不同遗传背景。
从这些种子得到的作物以及进一步回交得到的作物按照上述方式对生长和发育以及淀粉性质进行进一步分析。将种子的发芽和作物的生长与对照亲本作物进行比较，以确定Bob White品种的遗传背景下转基因系观察到的表型。测定特征如发芽时间，早期生长率和叶面积，此外分蘖数量、花冠数量和产量。进行大田试验以评价大田中的效果。
实施例6GWD的表达调节
GWD的过表达
GWD在小麦或其它作物中的过表达需要用cDNA活基因组DNA编码GWD。为此，可使用小麦全长cDNA序列蛋白编码区(SEQ ID NO：2)，与启动子可操作连接，可以是GWD编码区的异源启动子。
不同组织和在作物生长中编码GWD和PWD基因的表达水平
对从作物生长过程中不同作物组织，特别是叶片和胚乳中分离的mRNA样本进行定量反转录-PCR(RT-PCR)试验，以测定GWD和PWD基因的表达模式。24小时周期中每3小时测定叶片中的表达水平以说明表达水平的昼夜节律变化，如C.reinhardtii模型(Ral等，2005)所述。磷酸含量，监控叶片中淀粉含量变化和α-淀粉酶活性以分析中间碳水化合物代谢。
收集不同生长阶段的野生型作物的胚乳，用于分离RNA以研究胚乳发育过程中GWD和PWD的表达，采用定量RT-PCR的方法。
选择具有相似支链淀粉/直链淀粉比率的大量基因型用于其特殊的物理-化学性质的研究。一些品种已知与烘烤和面条加工(Chara)有关。已知的一些对于亚洲蒸面包(Baxter)和其它的用于海绵(sponge)和面团面包(dough bread)的烘烤性质(AC Barrie和Alsen)是有益的。
实施例7GWD和PWD的表达调节
水稻中PWD的突变
拟南芥(NP_194176)PWD蛋白的氨基酸序列作为询问序列以询问水稻Tos17插入突变数据库。鉴定出3个不同Tos17系(NG0294，ND9050_0_701_1A and T29717T)并获得这些系的种子。带有标记的水稻基因组序列(SEQ ID Nos：8-10)与这3个插入连接，每个显示出与拟南芥PWD序列同源性(约75％一致性)，表明该插入在水稻PWD基因内。
NG0294
TGCTGGAGCAGCAGTATATGATAGGTTAGAGAAAGTCCGCCATAATTTTTGT
AGTTTGCTCAAGAATTTATTTGGCATTACAACTAAGCTGACTGCTTGTTTCA
GTGTCCCTATGGATGAGGAAGATGAAGTCGTACTCGACTACACCACAGACC
CCCTCATTACAGATCAGGGATCCAAAAATCAATCCTCTCGAGCATTGCACG
GGCTGGTCATGCCATTGAGGATTTCTATGGGTCACCACAGGGCACAGGATG
TTGAGGGTGCAGTGAAGGAAGGGAAGCTATAAGTAGTACAGACAAGACCA
CAAATGTAATCTATATGTATATTTTATAGCCAAGTCAATCAGGAAATGTTGTA
GAGTAAGATATACGGGCCGTGGGACATGTATAACACGTTATGCTCCTTTTTT
T(SEQ IDNO：8)
ND9050_0_701_1A
TCTACAACTACAACTTTTTAGAATCTGGACCAAAAGCTGGACTGTTTGAGG
GAGCTTCTGATTCTGAGAGAAGCTGCAGCAGCTAGAAGCTCCCCCAAACA
GGCCCTTAGGTAGCTGGTTACAAGTCTGATCACACTGTTTTAGGTTTGTCT
GTTGTTGTATATCAGATAGCTAAATGCATAGCTGTGAGCTAGAGTTGTGAT
AAACTGGAAATAGGTCAGGGAACGTCTTTTTTTGCCAAAGTATGGGTAAA
GATAAACTTGGTGAGCTCAGCTGGGGACAAAATCATCAGATTTTGTATTCT
CCCAGCAGAGCAAATAGGGATTTGCCTGTGAGTGCATGCCTGACTTGTCT
GTTGGTCTATGAAATGGGCCGTGAAGTGTGCTTCTATGGGCCTTGTCACTA
CTNACCAGGCGGTATTGCAGAGCAGATTTCTTGGCCCATTTTGTCCTTTTT
CTCTCT(SEQ ID NO：9)
T29717T
CTTGGGAAGACGGTGCGTGTTAGATTTGTGCTGAAGAGGGAATGCACGTT
CGGCCAGAGCTTCCACCTTGTCGGCGACGACCCGGCGCTCGGCCTCTGGG
ATCCGTCGAAGGCAGTGCCTTTGGATTGGTCAGAAGGACACGACTGGACT
GTGGAGAAAGTGAGCCTTGCATCGTGCGCATTGTTTGATGTACTCTCCTTT
TGAGGTAATCATCACCCCTTTTCTTCTGTACAGGACTTGCCAGCCAACAAG
TTGATTGAGTACAAGTTCGTGCTGCAAGATTTGTCGGGCAAGTTGCATTGG
CAGAATGGTCGTAATAGAAGCGTACAGACAGGTGAAACTGCAAACATTCT
AGTCGTATATGAAGATTGGGGTAATGCAAATAGTCAGACAGTAGAAGAG
GAGGGTAAAGTGTCCATTGGGATGGAGGAGGGTAAATTGTCCGTTGGGAT
GGAGGAGGCTGTAGTTCCAGATGATAGTGAAAGCAGAG(SEQ ID NO：10)
因为这些Tos17插入突变被期望为是退行性的，分离每个纯合突变。这首先需要开发筛选方法以区分每个野生型和突变等位基因的纯合子和杂合子，以鉴定作物野生型、杂合子或纯合子突变。通过如下方法来完成。
每个系设计并产生2个药物对，参见如下。Tos17引物用于每个引物对A，具有核苷酸序列与Tos17因子中的序列互补，因此该因子必须存在并用于扩增。用引物对A的阳性PCR结果，因此鉴定出作物具有突变等位基因，然而用引物对A的阴性PCR结果揭示了野生型作物用于PWD基因。每个引物对B从那些纯合子中区别杂合子突变系，并确定野生型状态。每个引物对B位于Tos17插入点的两侧。引物对B的PCR结果揭示了在Tos17存在下纯合子突变体作物预测的扩增产物很大，没有期望扩增。2个引物对的2个阳性PCR结果的结合区分出野生型和突变等位基因的杂合子作物。
Figure BPA00001186587900861
  引物   5′至3′序列
  Tos17primer   ATTGTTAGGTTGCAAGTTAGTT(SEQ ID NO：15)
  Tos17PWDI   CTTCCCTTCCTTCACTGCAC(SEQ ID NO：16)
  Tos17PWDII   GCAAGGCTCACTTTCTCCAC(SEQ ID NO：17)
  Tos17PWDIII   TCCATCCCAATGGACACTTT(SEQ ID NO：18)
  HomoPWDfor   TACGACATGGAAGCCG(SEQ ID NO：19)
采用该方法，鉴定出纯合子突变作物用于3个插入系的每个系。采用上述方法分析这些小麦作物的种子，在可控条件下播种已检测作物表型。与野生型品种Nipponbare相比，可以看到在一个插入突变体中淀粉磷酸含量的略微下降，但与缺少所述插入的系的分离子淀粉相比，由于分析中存在大量错误条(bars)，含量是否下降尚不清楚。与缺少插入或野生型的分离子相比，来自插入系谷粒的面粉样本在淀粉含量、膨胀系数、λmax、链长度分布或α-淀粉酶水平上没有明显不同。这些数据表明对水稻PWD单独作用的失活仅为轻微影响。然而，Baunsgaard等(2005)数据表明与GWD单独作用相比，拟南芥中GWD和PWD的结合显示出增加的影响。
在Origene数据库(http://orygenesdb.cirad.fr/index.html)中鉴定出其他几种水稻插入系，在水稻GWD基因中，它们显示出含有T-DNA插入。如下所示：
3A-51160 corresponding to the FST A29424
3A-07997 corresponding to the FST A16348
2A-40470 corresponding to the FST A07158
3A-17981 corresponding to the FST A27803
这些系可以从posTECH(Republic of Korea)获得。此外，鉴定出2个系在编码淀粉磷酸化酶的水稻SEX4基因中具有插入片段：对应于FST A3204的1B-06142以及对应于FST D08500的2D41347。按照上述方法分析它们相同的性质。
实施例8谷物中GWD的进一步突变
小麦GWD基因的基因组专用引物
设计基因组专用引物以扩增GWD基因片段，特别是来自A、B和D基因组的片段，由此区分六倍体小麦的3个同源基因。按照如下方法完成。六倍体小麦的GWD基因的几个内含子区通过PCR扩增，进行片段克隆并测序。在多数情况下，可确定3个序列的差异，与来自A、B和D基因组的GWD基因相一致，但不允许对特殊基因组每个变量的定位。为获得该定位，进行同样的PCR反应，采用来自特定染色体缺失系的基因组DNA作模板，扩增片段并进行克隆和测序。这些系中仅2个基因组含有GWD基因，第3个为缺失。例如，染色体缺失系N7At7B的染色体7A是无效的，因此缺少A基因组GWD基因，但具有2个拷贝的染色体7D GWD基因和4个拷贝的染色体7B GWD基因。因此，从N7AT7B、N7BT7D和N7DT7A缺失系中扩增内含子序列允许各特殊基因组的序列变量的定位。
对扩增的15个克隆片段进行测序，从而鉴定出与A、B和D基因组有关的独特的基因组专门修饰。例如，在缺失系中观察到C被替换为T，其存在于A基因组中但是不存在于A无效系中。这表明带有T的GWD序列变量为A基因组专有。然后这种多态性用于设计如下的专用引物对：
A基因组
引物GWD1ForA*  5′-GAAACACATAGTCTG-3′(SEQ ID NO：20)
引物IB_GWD2rev 5′-TTGCGGTGCCTTTACC-3′(SEQ ID NO：21)
B基因组
引物GWD1ForB*_HTM  5′-GAAAGAAACACATAGTCTG-3′(SEQ ID NO：22)
引物IB_GWD3rev   5′-ATCTGTAAACCTGTCTTGTG-3′(SEQ ID NO：23)
D基因组
引物GWD2for2    5′-TTGCGGTGCCTTTACC-3′(SEQ ID NO：24)
引物IB_GWD3rev  5′-ATCTGTAAACCTGTCTTGTG-3′(SEQ ID NO：25)
当这些引物对被用于小麦基因组DNA的PCR反应，采用下述PCR循环条件：94℃5分钟，然后94℃30秒，53℃30秒，72℃40秒，40个循环，接着是72℃5分钟，产物通过凝胶电泳分离，可以区分下述扩增产物：A基因组上的GWD基因，观察到产生约600bp的独特片段，B基因组上的GWD基因，观察到产生约1000bp的独特片段，而D基因组上的GWD基因，观察到产生约500bp的独特片段。使用3个引物对，3个PCR反应可以结合为一个多样PCR反应，允许诱变种子和作物群体的高通量筛选。
对小麦缺失系重复这些PCR反应，所述小麦缺失系带有更多限制的特定的染色体缺失，缺少专门的染色体分离子，缺少来自特定缺失系的扩增产物，表明小麦GWD基因位于7号染色体，即染色体7S短臂的末端。
小麦GWD基因的突变
Chara小麦品种的种子通过重离子轰击进行诱变，所用方法与Shitsukawa等，Genes Genet.Syst.82：167-170(2007)提供的方法基本相同。种植诱变后的种子以产生M1作物，收集并保存各作物的种子，由此产生8000个诱变系。
用上述基因组专用引物对筛选所述8000个系，鉴定缺少3个GWD基因之一的突变体。鉴定出2个缺少与B基因组GWD基因有关的基因区的突变体，以及1个缺少D基因组GWD基因区的突变体。这些突变作物，被假定为GWD基因的无效突变体，种植于温室中，显示出表型正常。将这些作物进行杂交以产生缺少B和D基因组GWD基因的二倍突变体。
进一步测试诱变系以鉴定A基因组上GWD基因的无效突变体。在鉴定时，这些作物可与B和D基因组二倍突变体杂交以产生A、B和D各基因组的三倍突变体。
本领域技术人员应理解可以在本发明详尽描述之外作一些修改或改进。本发明包括所有这些修改或改进。本发明还包括文中涉及的所有个别的或组合的步骤、特征、组合物和化合物，所述步骤或特征任意2个或多个的组合。
表1
序列测定概况
  SEQUENCE ID NO：  描述
  1  与R1(马铃薯)和PWD(拟南芥)相关的小麦基因序列
  2  小麦GWD的cDNA
  3  SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列
  4  大麦GWD的EST
  5  小麦GWD相似基因的cDNA
  6  GWD基因的正向引物
  7  GWD基因的反向引物
  8  部分水稻PWD插入序列
  9  部分水稻PWD插入序列
  10  部分水稻PWD插入序列
  11  高粱GWD基因的EST(Accession No BI245998)
  12  高粱GWD基因的EST(Accession No CF074015)
  13  高粱GWD基因的EST(Accession No EH406623)
  14  高粱GWD基因的EST(Accession No CD423248)
  15  水稻PWD基因用引物
  16  水稻PWD基因用引物
  17  水稻PWD基因用引物
  18  水稻PWD基因用引物
  19  水稻PWD基因用引物
  20  小麦GWD基因用引物
  21  小麦GWD基因用引物
  SEQUENCE ID NO：   描述
  22   小麦GWD基因用引物
  23   小麦GWD基因用引物
  24   小麦GWD基因用引物
  25   小麦GWD基因用引物
表2
氨基酸亚类
表3
示例及优选氨基酸替换
Figure BPA00001186587900921
表5
转基因和对照作物(wt)T2种子的种子参数
Figure BPA00001186587900931
表7
与水稻基因相比小麦GWD基因的外显子/内含子结构
Figure BPA00001186587900951
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Figure IPA00001186587400011
Figure IPA00001186587400021
Figure IPA00001186587400051
Figure IPA00001186587400061
Figure IPA00001186587400081
Figure IPA00001186587400101
Figure IPA00001186587400111
Figure IPA00001186587400121
Figure IPA00001186587400131
Figure IPA00001186587400141
Figure IPA00001186587400161
Figure IPA00001186587400171
Figure IPA00001186587400181
Figure IPA00001186587400191

Claims (71)

1.一种获取与对照作物相比，生产潜力提高的遗传修饰的作物的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定与对照作物相比、生产潜力提高且含有异源多聚核苷酸的作物，以及iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
2.一种获取与对照作物相比，内源转葡糖基酶提高的遗传修饰的作物的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定与对照作物相比、转葡糖基酶提高且含有异源多聚核苷酸的遗传修饰的作物，以及iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列连接的转录调控序列。
3.一种获取与对照作物相比，至少某一部位的消化率提高的遗传修饰的作物的方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，其中至少一株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)从大量作物中鉴定与对照作物相比、至少某一部位的消化率提高且含有异源多聚核苷酸的遗传修饰的作物，以及iii)筛选遗传修饰的作物，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
4.一种测定遗传修饰的作物的生产潜力，内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率与对照作物相比至少某一部位的消化率是否提高的方法，该方法包括步骤i)获取一株或多株基因组内含有异源多聚核苷酸的作物，以及ii)测定所述一株或多株作物的生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率与对照作物相比是否提高，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
5.一种与对照作物相比，使作物生产潜力提高的基因的鉴定方法，该方法包括步骤i)获取大量作物，每株基因组内含有异源多聚核苷酸，ii)测定与对照作物相比，每株的生产潜力以及任意地其内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率是否提高，iii)鉴定生产潜力提高的作物，以及iv)鉴定其中的异源多聚核苷酸，从而鉴定基因，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
6.一种与对照作物相比，能够提高作物生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率的多聚核苷酸的鉴定方法，该方法包括步骤i)获取一个或多个多聚核苷酸，每个核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，ii)将所述异源多聚核苷酸引入前体细胞、组织、器官、种子或作物，iii)繁殖大量上述作物，iv)测定与对照作物相比，至少一株含有异源多聚核苷酸的作物是否提高了生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率，以及v)筛选所述多聚核苷酸。
7.一种与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的遗传修饰的作物的繁殖方法，该方法包括步骤i)获取异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，ii)将所述异源多聚核苷酸引入前体细胞、组织、器官、种子或作物，iii)获取大量上述作物，至少其一基因组内含有所述异源多聚核苷酸，iv)从所述大量作物中鉴定与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的且含有所述异源多聚核苷酸的作物，以及v)筛选该作物，从而繁殖该遗传修饰的作物。
8.一种与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的遗传修饰的作物的繁殖方法，该方法包括步骤i)诱变前体细胞、组织、器官、种子或作物，ii)从中获取大量作物，至少其一基因组内含有异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，以及iii)从所述大量作物中鉴定与对照作物相比，其生产潜力、内源转葡糖基酶或至少某一部位的消化率提高的且含有所述异源多聚核苷酸的作物。
9.如权利要求1-5任一所述的方法，其中步骤ii)进一步包括测定表现型和/或鉴定作物，所述作物与对照作物相比，具有如淀粉磷酸化水平改变的淀粉含量或组成，提高的生产潜力，至少部分细胞或器官中提高的内源转葡糖基酶，或至少某一部位的消化率提高。
10.如权利要求1-9任一所述的方法，包括将所述异源多聚核苷酸引入前体细胞、组织、器官、种子或作物并繁殖所述大量作物的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中引入所述多聚核苷酸的步骤包括转化和/或诱变所述前体细胞、组织、器官、种子或作物。
12.如权利要求1-11任一所述的方法，其中所述因子下调在内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解中包含的酶的编码基因的表达或其功能活性。
13.如权利要求1-12任一所述的方法，其中所述因子在作物中下调内源淀粉磷酸化。
14.如权利要求1-13任一所述的方法，其中所述方法进一步包括检测来自作物的核酸样本以得到在淀粉分解和/或淀粉磷酸化中包含的多肽的编码基因的突变。
15.如权利要求1-14任一所述的方法，其中所述内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是通过改变选自下述组的一种或多种酶的表达或活性进行修饰的，所述组包括α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、淀粉磷酸化酶(EC2.4.1.1)、转葡糖基酶(EC3.1.33)、蔗糖酶-异麦芽糖酶(EC 3.2.10)、淀粉麦芽糖酶(EC 2.4.1.25)、麦芽糖酶(EC 3.2.1.20)、异淀粉酶和α-葡聚糖水二激酶(GWD，EC2.7.9.4)。
16.如权利要求15所述的方法，其中内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是通过提高α-淀粉酶或β-淀粉酶的表达活性，和/或降低GWD的表达活性进行修饰的。
17.如权利要求1-16任一所述的方法，进一步包括降低磷酸多糖水二激酶(PWD，EC 2.7.9.5)的表达活性。
18.如权利要求1-17任一所述的方法，其中所述因子表达于作物的贮藏器官，如发育的籽粒、根、块茎或茎中。
19.如权利要求1-17任一所述的方法，其中所述因子表达于作物的光合活性组织中。
20.如权利要求1-19任一所述的方法，其中所述内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解是过渡淀粉的。
21.如权利要求2和4-20任一所述的方法，其中所述转葡糖基酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或转葡糖基酶。
22.如权利要求1-21任一所述的方法，其中所述作物选自草、蔬菜、谷类、豆类和结实或开花作物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述谷类为小麦、谷物(玉米)、大麦、水稻、黑麦、燕麦、小米、高粱、黑小麦、荞麦、福尼奥米、茱藜、斯佩尔特小麦、硬粒小麦、面包小麦、单粒小麦、苋菜、野生稻或画眉草。
24.如权利要求1-23任一所述的方法，其中所述作物进一步含有异源多聚核苷酸，其编码的因子与转录调控序列连接，下调α-淀粉酶或β-淀粉酶的表达或活性，或调控α-淀粉酶或β-淀粉酶编码基因的突变，其中作物选自至少一种器官中的α-淀粉酶或β-淀粉酶的表达或活性降低的作物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述因子表达于贮藏器官中或所述α-淀粉酶或β-淀粉酶编码基因表达于贮藏器官中。
26.如权利要求1-25任一所述的方法，其中所述因子为下调二激酶表达的RNA分子。
27.如权利要求1-26任一所述的方法，其中所述提高的生产潜力为与对照作物相比，提高的或增加的生物量、活力、萌发、幼苗活力、生长率、高度、总叶面积、单位叶面积的光合速率、单株叶片数量、单株花冠数量、单株分蘖数量、单株籽粒数量、单一花冠籽粒数量、平均籽粒重量、单株籽粒总重、籽粒或块茎的淀粉含量或组成、茎厚度、节间数量、分枝数量、开花数量、花的大小或形状、花色、单株豆荚数量、豆荚大小、单一豆荚籽粒数量、单株结实数量、坐果、果实大小、果实形状、果实颜色、果实品质、抵御疾病、根系质量、生根量、根系长度和/或产率和/或延迟衰老。
28.根据权利要求1-27任一所述的方法获得的、繁殖的或鉴定的遗传修饰的作物。
29.一种遗传修饰的作物，其基因组内含有异源多聚核苷酸，其含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列，其中所述作物特征在于，与对照作物相比，其具有修饰的淀粉磷酸化和/或淀粉分解，此外其具有提高的生产潜力、提高的内源转葡糖基酶和/或至少某一部位提高的消化率。
30.一种遗传修饰的作物，其基因组内含有引入的突变，该突变基因编码内源淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶，其中所述作物特征在于，与对照作物相比，其具有提高的生产潜力、提高的内源转葡糖基酶和/或至少某一部位提高的消化率。
31.一种遗传修饰的作物，其基因组内含有一个或多个异源多聚核苷酸，各多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列连接的转录调控序列，其中所述作物特征在于，与对照作物相比，至少所述作物的某一部位具有降低的淀粉磷酸化和/或淀粉分解，转葡糖基酶优选淀粉酶在作物成熟籽粒中的表达和/或活性的提高或降低，以及提高的生产潜力。
32.如权利要求28-31任一所述的作物，其至少在作物的第一器官中显示出靶淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶降低的水平且任意地，至少在作物的第二器官中显示出靶淀粉磷酸化多肽和/或淀粉分解酶升高的水平，其中第一或第二器官为相同的或不同的器官。
33.如权利要求28-32任一所述的作物，其中所述因子下调在内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解中包含的酶的表达或功能活性。
34.如权利要求32-33任一所述的作物，其中所述靶多肽或酶选自由下述物质组成的组：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、淀粉磷酸化酶、转葡糖基酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶、淀粉麦芽糖酶、麦芽糖酶、异淀粉酶和α-葡聚糖水二激酶。
35.如权利要求28-34任一所述的作物，其中所述因子下调二激酶的水平或功能活性。
36.如权利要求35所述的作物，其中所述二激酶为GWD或GWD和PWD。
37.如权利要求28-36任一所述的作物，其中所述因子表达于贮藏器官中。
38.如权利要求28-36任一所述的作物，其中所述因子表达于作物的光合活性组织中。
39.如权利要求28-38任一所述的作物，其中所述淀粉磷酸化和/或淀粉分解是过渡淀粉的。
40.如权利要求28-39任一所述的作物，其中所述作物选自草、蔬菜、谷类、豆类和结实作物。
41.如权利要求40所述的作物，其中所述谷类为小麦、谷物(玉米)、大麦、水稻、黑麦、燕麦、小米、高粱、黑小麦、荞麦、福尼奥米、茱藜、斯佩尔特小麦、硬粒小麦、面包小麦、单粒小麦、苋菜、野生稻或画眉草。
42.如权利要求28-41任一所述的作物，其中所述转录调控序列优先调控贮藏器官和/或作物光合活性组织中多聚核苷酸的表达。
43.如权利要求28-42任一所述的作物，其中所述作物进一步含有多聚核苷酸，其可操作地与编码下调淀粉酶活性的因子的转录调控序列连接。
44.如权利要求28-43任一所述作物的一部位，所述作物部位为籽粒、叶片、茎、根、块茎、化、果实、豆荚或作物的插穗。
45.如权利要求44所述的作物部位，其特征在于相对于对照作物部位，其具有修饰的淀粉含量或组成，根据权利要求26提高的产量，提高的内源转葡糖基酶或消化率。
46.一种含有淀粉的籽粒，其中籽粒淀粉中的葡萄糖-6-磷酸水平低于10ng/mg淀粉，籽粒粉中淀粉酶活力水平至少为4个单位/g粉。
47.如权利要求28-43任一所述作物的产品，其为加工的谷物、面粉、全麦粉或至少部分纯化的淀粉，其中所述产品与对照作物的产品相比，具有修饰的淀粉含量或总淀粉组成。
48.一种生产产品的方法，包括作物生长和/或收获作物或权利要求28-43任一所述作物的部位。
49.一种生产加工的谷物、面粉、全麦粉或至少部分纯化的淀粉的方法，包括加工权利要求28-43任一所述作物的部位如谷物。
50.一种生产食物产品的方法，包括将权利要求28-43任一所述作物或部位或权利要求47的产品与另一食物成分混合，并任意烹调、烘烤、油煎、蒸煮、煮沸、挤压或其它加工所述混合物的方法。
51.一种生产发酵产品的方法，该方法包括发酵权利要求47所述的产品或由权利要求49所述方法生产面粉或淀粉。
52.一种提供给人或动物食物的方法，包括向人或动物提供权利要求28-43任一所述的作物，权利要求44-46任一所述的作物部位，权利要求47所述的产品或由权利要求48-51任一所述方法生产的产品。
53.由权利要求48-51任一所述方法生产的产品。
54.应用异源多聚核苷酸生产作物，所述作物与对照作物相比，其生产潜力提高、内源转葡糖基酶提高或籽粒或至少一部分器官的消化率提高，其中所述多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
55.应用权利要求28-43任一所述作物或其含有淀粉的部位生产食物产品或非食物产品。
56.权利要求51所述的方法或权利要求55所述的应用，其中产品为乙醇。
57.应用权利要求28-43任一所述作物或其含有淀粉的部位作为动物饲料以增强动物的生长或健康。
58.应用作物或其部位生产人类消耗的食物，其中作物或其部位通过引入至少两个异源多聚核苷酸进行遗传修饰，其中作物特征在于，其生产潜力提高，作物叶片中的淀粉磷酸化和/或淀粉分解降低，作物籽粒中的内源转葡糖基酶降低，其中各异源多聚核苷酸含有与编码修饰作物内源淀粉磷酸化和/或淀粉分解的因子的核酸序列可操作连接的转录调控序列。
59.一种鉴定或使用与对照作物相比，作物生产潜力、提高的内源转葡糖基酶或籽粒或至少作物的部分消化率提高的分子标记的方法，该方法包括获取作物的核酸样本，鉴定编码作物GWD基因的多态性或其遗传连接。
60.一种测定作物的方法，包括获取作物的核酸样本，处理样本以确定GWD基因中筛选核苷酸的特性，并鉴定任何与作物生产潜力有关的核苷酸。
61.一种含有编码α-葡聚糖水二激酶多肽或与其互补的核苷酸序列的分离的或嵌合的核酸分子，所述α-葡聚糖水二激酶多肽含有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其生物活性部分或至少具有SEQID NO：3序列90％同源性的变化形式。
62.含有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8或SEQID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14所示核苷酸序列或其编码蛋白或其生物活性部分或与SEQ IDNO：2(小麦GWD)或SEQ ID NO：5(小麦GWD)或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13或SEQ ID NO：14所示核苷酸序列或其蛋白编码区90％序列同源性的变化形式一致或互补的核苷酸序列的分离的或嵌合的核酸分子。
63.含有在严格条件下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示核苷酸序列或其编码蛋白或其生物活性部分或与SEQ ID NO：2(小麦GWD)或SEQ ID NO：5(小麦GWD)或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示核苷酸序列或其蛋白编码区90％序列同源性的变化形式杂交的核苷酸序列的分离的或嵌合的核酸分子。
64.含有与转录调控序列可操作连接的权利要求61、62或63所述的核酸分子的嵌合核酸构型。
65.能够降低谷类作物中编码具有GWD活性的多肽的基因表达的分离的或嵌合的核酸分子。
66.如权利要求62所述的核酸分子，其为或编码反义RNA、共抑制RNA、双链RNA、发夹RNA或核酶。
67.应用分离的或嵌合的核酸分子降低谷类作物中编码具有GWD活性的多肽的基因的表达。
68.含有20个连续核苷酸的单链核酸探针，其中所述20个核苷酸的核苷酸序列与权利要求58-60任一所述核酸分子的补体核苷酸序列相同。
69.附着于固体支持物的核酸分子阵列，该阵列含有的寡核苷酸选择性地与含有谷类作物中编码具有GWD活性的多肽的基因的核酸分子杂交。
70.含有权利要求61-63、权利要求65或66或权利要求64所述构型的任一所述核酸分子的表达载体、宿主细胞、作物细胞、作物或籽粒。
71.生产谷类GWD多肽或其变化形式的方法，或生产其生物活性片段或其变化形式的方法，包括在宿主细胞、作物细胞、作物、作物部位或籽粒中表达权利要求64所述的构型。
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