[go: up one dir, main page]

CN101990573B - 具有改进的稳定性的脂肪分解酶变体及编码该变体的多核苷酸 - Google Patents

具有改进的稳定性的脂肪分解酶变体及编码该变体的多核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN101990573B
CN101990573B CN200980107002.8A CN200980107002A CN101990573B CN 101990573 B CN101990573 B CN 101990573B CN 200980107002 A CN200980107002 A CN 200980107002A CN 101990573 B CN101990573 B CN 101990573B
Authority
CN
China
Prior art keywords
variant
lipolytic enzyme
lipase
seq
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980107002.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101990573A (zh
Inventor
杰斯珀·文德
金·博施
阿伦·斯文德森
罗伯特·范德兰斯
利斯·M·米克尔森
克里斯琴·I·乔尔根森
沙姆坎特·A·帕特卡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN101990573A publication Critical patent/CN101990573A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101990573B publication Critical patent/CN101990573B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了具有改进的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体和对其进行编码的多核苷酸。具有改进的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体通过在亲本脂肪分解酶中取代某些指定氨基酸残基来获取。

Description

具有改进的稳定性的脂肪分解酶变体及编码该变体的多核苷酸
发明领域
本发明涉及具有改善的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体及制备它们的方法。本发明特别涉及细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的脂肪分解酶变体。
背景技术
已知使用真菌脂肪分解酶，例如，来自细毛嗜热霉(Thermomyceslanuginosus)(同物异名疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶，用于多种产业上的目的，例如，改善洗涤剂的功效。因此，来源于细毛嗜热霉(同物异名疏棉状腐质霉，EP258068和EP305216)的脂肪酶以商品名
Figure BPA00001212510200011
(Novozyme A/S的产品)出售用作洗涤剂用途。WO 0060063描述了在洗涤剂溶液中具有特别好的初次洗涤(first-wash)性能的细毛嗜热霉脂肪酶的变体。除了将脂肪酶用作洗涤剂酶从衣物或其它纺织品去除脂质或脂肪污迹之外，它们亦用作供面包和其它烘焙产品用的生面团的添加剂，并用于消除在纸浆和纸生产中的树脂(pitch)问题。在一些应用中，期望具有改善的热稳定性的脂肪分解酶(EP 374700，WO 9213130)，而在其他应用中期望其在洗涤剂中的稳定性。WO 92/05249，WO 92/19726和WO 97/07202公开了细毛嗜热霉(疏棉状腐质霉)脂肪酶的变体。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体：(a)具有与亲本脂肪分解酶比较包含对如下氨基酸残基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO：2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；和(b)与亲本脂肪分解酶比较在洗涤剂中更加稳定。
在进一步的方面，本发明涉及编码所述变体的分离的多核苷酸，包含该多核苷酸的核酸构建体，包含该核酸构建体的重组表达载体，以及包含该核酸构建体或该重组表达载体的转化的宿主细胞。
在进一步的方面，本发明涉及制备权利要求1-9任一所述的脂肪分解酶的方法，包括下述步骤：(a)将包含所述核酸构建体的转化宿主细胞或包含所述重组表达载体的转化宿主细胞在有益于产生所述变体的条件下进行培养，其中所述核酸构建体或重组表达载体包含所述多肽；和(b)回收所得变体。
在进一步的方面，本发明涉及所述脂肪分解酶变体在羧酸酯的水解，或酯的水解、合成或酯交换中的用途。
在进一步的方面，本发明涉及包含所述脂肪分解酶变体的配制物。
在进一步的方面，本发明涉及所述脂肪分解酶变体用于生产在洗涤剂中稳定的配制物的用途。
附图简述
图1显示脂肪酶的比对。
序列列表
SEQ ID NO：1显示编码来自细毛嗜热霉的脂肪酶的DNA序列。
SEQ ID NO：2显示来自细毛嗜热霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3显示来自反射犁头霉(Absidia reflexa)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4显示来自伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5显示来自曼赫根毛霉(Rhizmucor miehei)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6显示来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7显示来自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8显示来自塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9显示来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10显示来自异孢镰孢(Fusarium heterosporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11显示来自米曲霉(Aspergillus oryzea)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12显示来自沙门柏干酪青霉(Penicilium camembertii)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13显示来自臭曲霉(Aspergillus foetidus)的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14显示来自黑曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15显示来自米曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16显示来自Landerinapenisapora的脂肪酶的氨基酸序列。
发明详述
氨基酸修饰的命名法
为了易于参考，在描述本发明的脂肪酶变体时，采用以下命名法：
原始氨基酸：位置：取代氨基酸
根据这种命名法，例如，在位置195中用谷氨酸取代甘氨酸表示为G195E。在相同的位置缺失甘氨酸表示为G195*，而插入额外的氨基酸残基例如赖氨酸表示为G195GK。与其它脂肪酶相比，当特定脂肪酶含有“缺失”并且在该位置进行插入的情况，就在位置36插入天冬氨酸而言，将这种情况表示为*36D。
用加号分隔多个突变，即：R170Y+G195E，分别表示在位置170用酪氨酸取代精氨酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。
当应用所述排列方法时，X231表示在亲本脂肪分解酶中对应于位置231的氨基酸。X231R表示用R置换所述氨基酸。就SEQ ID NO：2而言，X是T，因此X231R表示用R取代位置231的T。当某个位置(例如231)中的氨基酸可以由选自一组氨基酸的另一个氨基酸取代的情况，例如由R和P和Y组成的组，将这种情况表示为X231R/P/Y。
在所有的情况下，采用公认的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
同一性：如本文所使用的的术语“同一性”指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性，由参数“同一性”来描述。
就本发明而言，通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)版本2.8.0的Needle程序来测定两个氨基酸序列之间的比对。Needle程序执行总体比对算法，其在Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口开启罚分(gap openingpenalty)是10，并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至269)和不同氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度如下计算：用两个序列比对中精确匹配的数目除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个。将结果表示为百分比同一性。
当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置中具有同一氨基酸残基时，发生精确匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO：2的长度是269)。
可以使用上述方法计算同一性和同源性，并用于比对。在本发明的上下文中，同源性和比对如下所述计算。
同源性和比对
就本发明而言，可以通过本领域已知的计算机程序的方法适当地测定同源性的程度，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP (Program Manual for theWisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，443-45)，按照以下用于多肽序列比较的设定来使用GAP：GAP产生罚分(GAP creation penalty)为3.0，和GAP延伸罚分(GAP extension penalty)为0.1。
在本发明中，通过图1中所示的比对来限定反射犁头酶、伞枝犁头酶、曼赫根毛霉、德氏根霉、黑曲霉、塔宾曲霉、尖镰孢、异孢镰孢、米曲霉、沙门柏干酪青霉、臭曲霉、黑曲霉、细毛嗜热霉(同物异名：疏棉状腐质霉)和Landerinapenisapora的脂肪酶序列中对应的(或同源的)位置。
为了查找比对中没有显示的脂肪酶序列中的同源位置，将目标序列与图1中所述序列进行比对。通过使用GAP比对将新序列与GAP程序发现的最同源的序列进行比对，将所述新序列排入图1中的现有比对。GAP在GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)中提供。对于多肽序列比较使用以下设定：GAP产生罚分为3.0且GAP延伸罚分为0.1。
亲本脂肪酶
任何合适的脂肪分解酶可用作亲本脂肪分解酶，又称亲本脂肪酶。在一些实施方案中，所述脂肪分解酶可以是真菌脂肪分解酶。
所述脂肪分解酶可以是起源于下述属的酵母脂肪分解酶，例如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)；或更优选是起源于下述属的丝状真菌脂肪分解酶，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filobasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、嗜热霉属(Thermomyces)或木霉属(Trichoderma)。
所述脂肪分解酶还可以是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)的脂肪分解酶。
或者，所述脂肪分解酶是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、细毛嗜热霉(同物异名：疏棉状腐质霉)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、严紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)脂肪分解酶。
在一些实施方案中，本发明涉及是嗜热霉属脂肪酶或细毛嗜热霉脂肪酶的脂肪分解酶变体。
在一些实施方案中，本发明涉及脂肪分解酶变体，其中所述变体与SEQID NO：2至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％相同。
具有改善的洗涤剂中稳定性的脂肪分解酶变体中的改变
下面提及的位置是SEQ ID NO：2中氨基酸残基的位置。在段落“同源性和比对”中，描述了如何在不同脂肪酶中寻找对应或同源位置的氨基酸残基的步骤。
所述脂肪分解酶变体，分解脂肪的变体或简称变体，根据本发明，令人惊讶的发现其与亲本脂肪分解酶相比在洗涤剂中更加稳定。洗涤剂中的稳定性定义为在洗涤剂存在下保留脂肪分解/脂肪酶活性的品质(quality)。所述脂肪酶活性可以全部或部分保留。因此本发明的变体在洗涤剂存在下，与其来源的亲本脂肪酶相比，显示了改善的或者全部或者部分保留其脂肪酶活性的能力。
本文所使用的术语“脂肪酶活性”指催化三酰基甘油水解形成二酰基甘油和羧酸的羧酸酯水解酶活性。就本发明而言，脂肪酶活性根据下述步骤确定：脂肪酶的底物通过使用阿拉伯胶作为乳化剂对三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)进行乳化来制备。随后在30℃下在pH7或9在pH恒定的滴定实验中水解三丁酸甘油酯。一个单位的脂肪酶活性(1LU)定义为能够在30℃，pH7下每分钟释出1微摩尔的丁酸的酶量。
在一些实施方案中，将根据本发明的变体与参照酶相比。除非另行指出，本文所使用的术语“参照酶”或“参照脂肪酶”指具有T231R+N233R的取代的SEQ ID NO：2的成熟部分。
在一些实施方案中，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体：(a)具有与亲本脂肪分解酶相比包含对如下氨基酸残基的取代的氨基酸序列，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO：2的氨基酸27、216、227、231、233和256中的任一；并(b)与所述亲本脂肪分解酶相比在洗涤剂中更加稳定。
在一些实施方案中，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体：(a)包含氨基酸残基231和233，并具有与亲本脂肪分解酶相比包含对至少一个对应于SEQ ID NO：2的氨基酸27、216、227和256中任一的氨基酸残基的取代的氨基酸序列；并(b)与所述亲本脂肪分解酶相比在洗涤剂中更加稳定。
在一些实施方案中，本发明涉及亲本脂肪分解酶的变体，其中所述变体具有在位置231+233和下述之一处的氨基酸改变：(a)27；(b)216；或(c)256；任选地所述变体进一步包含227；其位置对应于SEQ ID NO：2。
在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中氨基酸残基的取代是SEQID NO：2的27R，216P，227G，231R，233R或256K之一。
在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中氨基酸残基的取代是SEQID NO：2的D27R，S216P，L227G，T231R，N233R或P256K之一。
在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，该变体包含选自下组的取代：a)T231R+N233R+P256K；(b)L227G+T231R+N233R；(c)L227G+T231R+N233R+P256K；(d)D27R+T231R+N233R；(e)D27R+L227G+T231R+N233R；和(f)S216P+T231R+N233R。
在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中亲本脂肪分解酶与SEQID NO：2至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％相同。
在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中亲本脂肪分解酶是由细毛嗜热霉DSM4109产生，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的脂肪酶。
在一些实施方案中，本发明涉及下述变体，其中所述洗涤剂是液体洗涤剂。
表1：可能包含于脂肪分解酶变体中的变化
  变体   SEQ ID NO：2中的突变
  1   T231R+N233R+P256K
  2   L227G+T231R+N233R
  3   L227G+T231R+N233R+P256K
  4   D27R+T231R+N233R
  5   D27R+L227G+T231R+N233R
  6   S216P+T231R+N233R
在一些实施方案中，本发明涉及包含脂肪分解酶变体的配制物。
在一些实施方案中，本发明涉及下述配制物，其中所述配制物可为液体配制物。
脂肪分解酶变体的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、产生
在一些实施方案中，本发明涉及编码脂肪分解酶变体的分离的多核苷酸。多核苷酸在非常低严紧性条件下，优选低严紧性条件下，更优选中严紧性条件下，更优选中-高严紧性条件下，甚至更优选高严紧性条件下，并且最优选非常高严紧性条件下，可以与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸178至660，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸178至660中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有脂肪酶活性的多肽片段。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧性条件定义为：在42℃，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切和变性的鲑精DNA，以及对于非常低和低严紧性25％甲酰胺，或者对于中和中-高严紧性35％甲酰胺，或者对于高和非常高严紧性50％甲酰胺中，按照标准Southern印迹流程最佳进行12至24小时的预杂交和杂交。
对于长度至少为100个核苷酸的长探针，使用2×SSC、0.2％SDS，优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中等严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，和最优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终清洗三次，每次15分钟。
在一些实施方案中，本发明涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸可操作连接于至少一个在表达宿主中指导所述脂肪分解酶变体产生的调控序列。
在一些实施方案中，本发明涉及包含所述核酸构建体的重组表达载体。
在一些实施方案中，本发明涉及包含所述核酸构建体或所述重组表达载体的转化的宿主细胞。
编码所述脂肪分解酶变体的分离的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸构建体、包含所述核酸构建体的重组表达载体以及包含所述核酸构建体或所述重组表达载体的转化的宿主细胞均可通过本领域已知的方法获取。
获取在洗涤剂中稳定的脂肪分解酶变体的方法
脂肪分解酶的变体可通过本领域已知方法获取，例如定点诱变，随机诱变或局部诱变(localized mutagenesis)，例如，在WO 9522615或WO 0032758中所述。给定的亲本脂肪分解酶的在洗涤剂中稳定的变体可通过下述标准流程获取：
●诱变(易错，掺杂的寡聚物(doped oligo)，掺加的寡聚物(spiked oligo))
●初步筛选
●鉴定在洗涤剂中更加稳定的突变体
●维持(甘油培养物，LB-Amp平板，小量制备物(Mini-Prep))
●在另一个分析平板上划线接种-二次筛选
(比初步筛选高一度)
●DNA测序
●转化入宿主细胞，例如，曲霉(Aspergillus)
●以100ml规模培养，纯化，DSC
在一些实施方案中，本发明涉及制备脂肪分解酶变体的方法，包括下述步骤：(a)在有益于所述脂肪分解酶变体产生的条件下培养转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞包含所述核酸构建体或包含所述核酸构建体的重组表达载体；以及(b)回收该脂肪分解酶变体。本方法可根据本领域已知的原则加以实施。
在一些实施方案中，本发明涉及产生所述变体的方法，包括下述步骤：(a)选择亲本脂肪分解酶；(b)在所述亲本脂肪分解酶中取代至少一个对应于SEQ ID NO：2的27、216、227、231、233和256中任一的氨基酸残基；(c)任选地改变除了(b)中提及的之外的一个或多个氨基酸；(d)制备由步骤(a)-(c)所得的变体；(e)测试变体在洗涤剂中的稳定性；(f)选择具有增加的洗涤剂中稳定性的变体；和(g)产生所选的变体。
用途
根据本发明的变体可类比其亲本脂肪分解酶来使用，且为一些目的，所述变体由于其在洗涤剂中改善的稳定性可为优选的。因此，在一些实施方案中，本发明涉及所述变体在羧酸酯的水解或在酯的水解、合成或酯交换中的用途。
在一些实施方案中，本发明涉及所述变体用于生产在洗涤剂中稳定的配制物的用途。
实施例
本发明进一步通过下述实施例进行描述，不应将这些实施例理解为对本发明范围的限制。
用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂等级的商业产品。
实施例1-脂肪酶变体的表达
使用本领域的标准方法构建含有编码所述脂肪分解酶变体的基因的质粒，并且将所述质粒转化至合适的宿主细胞中。
实施例2-脂肪酶变体的产生
使用34℃的恒定培养基温度和1.2升的起始体积，按照补料分批发酵来进行发酵。将培养基的初始pH设为6.5。一旦pH增加至7.0，通过添加10％H3PO4来保持该值。通过改变搅拌速率和使用1.0升空气每升培养基每分钟的固定通气速率来控制培养基中的溶解氧水平。在整个补料分批阶段期间，将补料添加速率保持在恒定水平。
分批培养基含有麦芽糖糖浆作为碳源，尿素和酵母提取物作为氮源，以及痕量金属和盐的混合物。在补料分批阶段期间连续添加的补料含有麦芽糖糖浆作为碳源，并添加酵母提取物和尿素以确保氮的充足供应。
可以通过使用本领域已知的标准方法来进行所述脂肪分解酶变体的纯化，例如通过过滤发酵上清，继之以疏水层析和离子交换层析，例如如EP 0 851 913EP，实施例3中所述。
实施例3-脂肪分解酶变体在洗涤剂中的稳定性
测试下述脂肪分解酶变体在洗涤剂中的稳定性并将其与参照脂肪分解酶SEQ ID NO：2相比。
表2：受测试的脂肪分解酶变体
Figure BPA00001212510200111
脂肪分解酶变体及其参照的剂量设定为每克市售洗涤剂0.065mg酶蛋白质的浓度。
表3：洗涤剂的组成
Figure BPA00001212510200112
Figure BPA00001212510200121
包含洗涤剂和脂肪分解酶变体或参照酶的样品在pH＝7.7溶解于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液，并在-18℃和35℃分别储藏2和4周。残余的酶活性计算为在35℃下温育后的脂肪酶活性除以在-18℃下储藏的样品的脂肪酶活性。稳定性数据示于下面的表4。所有六个脂肪分解酶变体显示了与参照脂肪酶相比改进的洗涤剂中稳定性。
所述脂肪酶活性通过监测底物对硝基苯戊酸酯(pNp-Val)产生产物戊酸和pNp的水解来测定。检测波长＝405nm；pH＝7.7；且温度＝37℃。在此pH下所有具有酯酶活性的脂肪酶可用该方法分析。
表4：储藏后残余的脂肪分解活性。所示的数据为三次重复的平均值
Figure BPA00001212510200122
Figure IPA00001212510500011
Figure IPA00001212510500021
Figure IPA00001212510500031
Figure IPA00001212510500041
Figure IPA00001212510500051
Figure IPA00001212510500061
Figure IPA00001212510500071
Figure IPA00001212510500081
Figure IPA00001212510500091
Figure IPA00001212510500101
Figure IPA00001212510500111
Figure IPA00001212510500121
Figure IPA00001212510500141
Figure IPA00001212510500151
Figure IPA00001212510500161
Figure IPA00001212510500171

Claims (12)

1.一种亲本脂肪分解酶的变体，与亲本脂肪分解酶相比，其中所述变体由相对于SEQ ID NO：2仅具有选自：D27R+T231R+N233R、T231R+N233R+P256K、L227G+T231R+N233R、L227G+T231R+N233R+P256K、D27R+L227G+T231R+N233R或S216P+T231R+N233R的氨基酸残基的取代的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的变体，其中其亲本脂肪分解酶是由细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)DSM4109产生并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的脂肪酶。
3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1或2的变体。
4.一种包含权利要求3的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接于至少一个指导该变体在表达宿主中产生的调控序列。
5.一种重组表达载体，其包含权利要求4的核酸构建体。
6.一种转化的宿主细胞，其包含权利要求4的核酸构建体或权利要求5的重组表达载体。
7.一种制备权利要求1或2的脂肪分解酶变体的方法，包括下述步骤：
a)在有益于所述变体产生的条件下培养转化的宿主细胞，所述宿主细胞包含含有所述多肽的重组表达载体或核酸构建体；和
b)回收所述变体。
8.权利要求1或2所述的脂肪分解酶变体在羧酸酯水解中的用途。
9.权利要求1或2所述的脂肪分解酶变体在酯的水解、合成或酯交换中的用途。
10.一种配制物，其包含权利要求1或2所述的脂肪分解酶变体。
11.权利要求10的配制物，其中所述配制物可为液体配制物。
12.权利要求1或2所述的脂肪分解酶变体用于制备在洗涤剂中稳定的配制物的用途。
CN200980107002.8A 2008-02-29 2009-02-26 具有改进的稳定性的脂肪分解酶变体及编码该变体的多核苷酸 Active CN101990573B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08152164.3 2008-02-29
EP08152164 2008-02-29
US3309708P 2008-03-03 2008-03-03
US61/033,097 2008-03-03
PCT/EP2009/052247 WO2009106553A2 (en) 2008-02-29 2009-02-26 Lipolytic enzyme variant with improved stability and polynucleotides encoding same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101990573A CN101990573A (zh) 2011-03-23
CN101990573B true CN101990573B (zh) 2014-01-22

Family

ID=39301592

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980107002.8A Active CN101990573B (zh) 2008-02-29 2009-02-26 具有改进的稳定性的脂肪分解酶变体及编码该变体的多核苷酸

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9163203B2 (zh)
EP (1) EP2250258B1 (zh)
JP (1) JP2011514805A (zh)
CN (1) CN101990573B (zh)
AR (1) AR070491A1 (zh)
CA (1) CA2715521A1 (zh)
MX (2) MX337307B (zh)
WO (1) WO2009106553A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107969136A (zh) * 2015-07-06 2018-04-27 诺维信公司 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2561553T3 (es) 2010-07-22 2016-02-26 Unilever N.V. Combinaciones de ramnolípidos y enzimas para una limpieza mejorada
CN111187676A (zh) * 2011-12-29 2020-05-22 诺维信公司 具有脂肪酶变体的洗涤剂组合物
EP2906691B1 (en) * 2012-10-12 2021-01-27 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant
WO2014074352A1 (en) * 2012-11-06 2014-05-15 The Regents Of The University Of California Dieselzymes and methanol tolerant lipases
EP2997139B1 (en) 2013-05-14 2018-08-08 Novozymes A/S Detergent compositions
AR100606A1 (es) 2014-05-27 2016-10-19 Novozymes As Variantes de lipasas y polinucleótidos que las codifican
CN106661516A (zh) * 2014-07-08 2017-05-10 诺维信公司 从塑料物体去除有机膜
US11268076B2 (en) * 2014-12-09 2022-03-08 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN113862238A (zh) * 2014-12-22 2021-12-31 诺维信公司 洗涤剂组合物、脂肪酶变体以及编码其的多核苷酸
AU2023272468A1 (en) 2022-05-14 2024-11-14 Novonesis Plant Biosolutions A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN115927250A (zh) * 2022-08-26 2023-04-07 云南师范大学 第256位点突变的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992005249A1 (en) * 1990-09-13 1992-04-02 Novo Nordisk A/S Lipase variants
US5892013A (en) * 1990-09-13 1999-04-06 Novo Nordisk A/S Lipase variants
WO2002055679A2 (en) * 2001-01-10 2002-07-18 Novozymes A/S Thermostable lipolytic enzyme variant
WO2006084470A2 (en) * 2005-02-10 2006-08-17 Novozymes A/S Enzymatic enantioselective ester or amide hydrolysis or synthesis
WO2007087319A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
WO2007087242A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 The Procter & Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
WO2008079685A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Novozymes A/S Lipase variants for pharmaceutical use

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
DE3854249T2 (de) 1987-08-28 1996-02-29 Novonordisk As Rekombinante Humicola-Lipase und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Humicola-Lipasen.
US5176796A (en) 1988-12-13 1993-01-05 Jujo Paper Co., Ltd. Avoiding pitch troubles using acylgerol lipase
JPH04240286A (ja) 1991-01-25 1992-08-27 Novo Nordisk As 耐熱性リパーゼによるピッチトラブル防止法
DK0585285T3 (da) 1991-05-01 1999-05-10 Novo Nordisk As Stabiliserede enzymer
ATE267248T1 (de) 1995-08-11 2004-06-15 Novozymes As Neuartige lipolytische enzyme
US6939702B1 (en) 1999-03-31 2005-09-06 Novozymes A/S Lipase variant
CN1491278A (zh) * 2001-02-07 2004-04-21 ŵά�Ź�˾ 脂酶变体
EP1976967A2 (en) * 2006-01-23 2008-10-08 The Procter and Gamble Company Detergent compositions
US20090011462A1 (en) * 2006-01-23 2009-01-08 Novozymes A/S Polypeptides having Lipase Activity and Polynucleotides Encoding Same
US8187854B2 (en) * 2006-01-23 2012-05-29 Novozymes A/S Lipase variants
CN101960008B (zh) * 2008-02-29 2016-04-13 诺维信公司 具有脂肪酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992005249A1 (en) * 1990-09-13 1992-04-02 Novo Nordisk A/S Lipase variants
US5892013A (en) * 1990-09-13 1999-04-06 Novo Nordisk A/S Lipase variants
WO2002055679A2 (en) * 2001-01-10 2002-07-18 Novozymes A/S Thermostable lipolytic enzyme variant
WO2006084470A2 (en) * 2005-02-10 2006-08-17 Novozymes A/S Enzymatic enantioselective ester or amide hydrolysis or synthesis
WO2007087319A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
WO2007087242A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 The Procter & Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
WO2008079685A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Novozymes A/S Lipase variants for pharmaceutical use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RODRIGUEZ LARREA D ET AL.ROLE OF SOLVATION BARRIERS IN PROTEIN KINETIC STABILITY.《JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY》.2006, *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107969136A (zh) * 2015-07-06 2018-04-27 诺维信公司 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
US9163203B2 (en) 2015-10-20
WO2009106553A3 (en) 2009-12-10
WO2009106553A2 (en) 2009-09-03
MX337307B (es) 2016-02-25
JP2011514805A (ja) 2011-05-12
AR070491A1 (es) 2010-04-07
EP2250258B1 (en) 2017-01-04
CA2715521A1 (en) 2009-09-03
US20090221034A1 (en) 2009-09-03
EP2250258A2 (en) 2010-11-17
CN101990573A (zh) 2011-03-23
MX2010009077A (es) 2010-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101990573B (zh) 具有改进的稳定性的脂肪分解酶变体及编码该变体的多核苷酸
CN105296445B (zh) 脂肪酶变体
CN101960008B (zh) 具有脂肪酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US7172997B2 (en) Lipolytic enzyme variant
US8679813B2 (en) Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
CN112574974B (zh) 一种催化活性提高的脂肪酶突变体d163f及其应用
AU2002219020A1 (en) Thermostable lipolytic enzyme variant
CN111363734B (zh) 脂肪酶突变体、其组合物及应用
CN119410606B (zh) 一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用
CN119410606A (zh) 一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用
MX2008009207A (en) Lipase variants

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant