CN102016015B

CN102016015B - 对短链脂肪酸具有高度特异性的脂肪酶及其用途

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Publication number: CN102016015B
Application number: CN200980107049.4A
Authority: CN
Inventors: 简·米特斯卡·拉恩·范德; 尤利亚·M·艾菲莫瓦; 凯里恩·特克; 阿伯图斯·阿拉德·蒂克·范; 玛格特·伊丽莎白·弗兰克希斯·休恩瓦尔德-贝格曼斯; 阿利亚·格瑞特·特鲁; 阿里恩·塞恩
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2029-02-26
Also published as: DK2254996T3; IL207309A0; BRPI0908878A2; IL207309A; US20110262591A1; ZA201005962B; ES2429492T3; CA2716692A1; AR070717A1; MX2010009464A; EP2254996B1; US20140147552A1; CN102016015A; JP2011512809A; AU2009218457B2; WO2009106575A1; EP2254996A1; US8637101B2; EA201001393A1; AU2009218457A1

Abstract

本发明涉及新颖的多核苷酸序列，所述序列包括编码新颖脂肪酶的基因，以及所述基因的功能等同物，或与之具有高度同源性的氨基酸序列。本发明还涉及在工业工艺中，例如在乳制品或烘焙工业中使用这些脂肪酶的方法。

Description

对短链脂肪酸具有高度特异性的脂肪酶及其用途

发明领域

本发明涉及新鉴定的多核苷酸序列，包括编码新颖脂解酶的基因。本发明描述了新颖基因的全长编码序列以及全长功能蛋白质的氨基酸序列，和所述基因或氨基酸序列的功能等同物。本发明还涉及在工业工艺中，例如在食品工业(如乳制品工业)中使用这些蛋白质的方法。本发明还包括用根据本发明的多核苷酸转化的细胞，所述多核苷酸适用于生产这些蛋白质和细胞。

发明背景

脂肪酶是催化脂质底物中酯键水解，导致释放脂肪酸的酶。脂肪酶在乳制品应用中为了产生香味而使用，最重要地是在乳酪中使用。传统上，使用来自于山羊、幼山羊、小牛或羔羊的反刍动物脂肪酶制剂。这些制剂衍生自来自这些反刍动物的前胃(pregastric)组织，并且这些脂肪酶制剂也被称作前胃酯酶。市场上存在商业制剂，如C，L，KG and K(DSM Food Specialties，荷兰)。这些脂肪酶被用于多种意大利、西班牙、希腊和法国乳酪的制备中。这些类型乳酪熟化期间特定香味谱的产生很大程度上归因于脂肪酶对乳脂肪的作用。脂肪酶催化乳脂肪的水解，产生游离脂肪酸。所述脂肪酸可以具有短链(C4-C6脂肪酸，如含有4或6个碳原子，即丁酸、己酸)和中到长链(C12-C18脂肪酸)。随后游离脂肪酸可参与化学反应，例如香味化合物如乙酸乙酯、β-酮酸、甲基酮、酯和内酯的形成。香味组分中脂肪酸的转化可以由来自乳酪中微生物种群的酶催化。

已知乳酪中由脂肪酶释放的游离脂肪酸的类型可以受到使用的脂肪酶类型的影响。例如，主要释放短链脂肪酸(例如含C4和C6的脂肪酸)的脂肪酶导致产生辛辣(piquant，spicy)、尖锐、强烈的香味，而中到长链脂肪酸的释放可以导致肥皂样的口味。在除乳酪之外的其它乳制品应用中，脂肪酶具有越来越多的用途，如经酶修饰的乳酪(EMC；Wilkinson etal in Encyclopedia of Dairy Sciences，(2003；Fox et all eds，Academic Press)pp.434-438)或黄油脂肪和奶油的水解及其应用(Kilara in Enzyclopedia ofDairy Sciences，(2003；Fox et all eds，Academic Press)pp.914-918)。

反刍动物脂肪酶是超出微生物脂肪酶而被优选的，因为它们具有从乳脂肪中释放短链脂肪酸(含C4、C6的脂肪酸)的特异性。这些化合物是香味化合物自身，或者被转化成具有具体香味影响的挥发性酯(Liu et al，Int.Dairy J.2004，14，923-945)。一个有趣的问题是反刍动物脂肪酶的组合物，其为若干文献的主题(例如Addis et al Int.dairy J.(2005)15，1271-1278；Richardson et al，J.Dairy Sci.(1967)50，1061-1065；Addid et al Int.Dairy J.(2005)15，563-569；Hamosh Nutrition(1990)6，421-428；Calvo et al(2004)J.Dairy Sci.87，1132-1142)。所示数据导致结论：大多数反刍动物酶可能是两种或更多脂肪酶的混合物，并且组合物中改变的发生导致乳酪香味形成性能的改变。所述改变是工业上寻找具有改良的相容性的替代性酶来源的驱动力。动物疾病如绵羊瘙痒病和疯牛病的出现是工业上寻找替代方式的另一驱动力。其它支持来自于容易获得Kosher and Halal品质产品的期望。因此，工业上对于衍生自动物的脂肪酶的替代方式具有强烈的需求。

专利申请US2004/0001819描述了酵母Pichia pastoris中小山羊(kidpregastric esterase)的克隆和表达。尽管可能是感兴趣的，但是所述酶生产较差，除此之外，与原始小山羊酯酶相比游离脂肪酸释放谱迁移至更长的脂肪酸。这两方面使得所述酶在应用中由于不经济和缺乏性能而没有吸引力。一种优选的替代方式应当是微生物脂肪酶或由微生物重组生产的(微生物)脂肪酶。市场上有若干微生物脂肪酶(例如参阅Bjurlin et al，JAOCS(2001)78，153-160)。用于乳酪应用的微生物脂肪酶的最重要特征是它们来自乳脂肪的脂肪酸释放谱，其可尽可能接近地模拟衍生自动物的脂肪酶。然而，微生物脂肪酶在下述方面中表现较差，因为它们相对于短链脂肪酸(C4，C6)而言具有释放长链(C12-C18)脂肪酸的偏好。这通常导致肥皂样味道而不是期望的辛辣香味的形成。因此，尽管市场中存在大量商业微生物脂肪酶制剂，但是对于能够代替衍生自动物的脂肪酶(如反刍动物前胃脂肪酶)的非衍生自动物的脂肪酶仍然具有工业需求。

附图说明

图1：与Parmesan乳酪的FFA谱相比，Cheddar乳酪糊中由脂解酶L01、L03、L04和来自Rhizomucor miehei的商业微生物脂肪酶(R8000)生产的FFA谱。

发明目的

本发明的一个目的是提供适用于乳制品工业、更具体地适用于制造乳酪或乳酪样制品、适用于脂解黄油脂肪或奶油或生产经酶修饰的乳酪的新颖的脂解酶。另外，本发明的一个目的是提供编码新颖的脂解酶的新颖多核苷酸。另一个目的是提供重组生产的脂解酶以及生产所述脂解酶的重组菌株。融合多肽以及制造和使用根据本发明的多核苷酸和多肽的方法也是本发明的一部分。

发明内容

本发明提供了适用于乳制品工业中的新颖脂解酶(lipolyticenzyme)。令人惊讶地，新颖的脂解酶极度适用于通过含脂质食物成分(优选乳酪)的酶修饰来产生香味(flavour)。新颖的脂解酶还可有利地用于乳酪熟化、乳酪样制品的生产、奶油或黄油脂肪的修饰中。另外，也可以在其它食物应用中、如烘焙制品的制造中适当地使用所述酶。

本发明还提供了编码新颖脂解酶的新颖多核苷酸。

根据本发明的多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：

(a)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少90％同源性；

(b)核苷酸序列，其与是SEQ ID NO：1的互补序列的多核苷酸杂交，并且其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少90％同源；

(c)核苷酸序列，其编码根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90％的同源性；

(d)核苷酸序列，其编码具有脂解活性的经分离的多肽，所述多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，与所述成熟多肽至少60％同源，并且所述经分离的多肽具有至少0.7的针对甘油三酯的特异性程度R_spec；

(e)由于遗传密码子简并性，是(a)、(b)、(c)、(d)中任一所定义序列的简并序列的序列；

(f)核苷酸序列，其为(a)、(b)、(c)、(d)、(e)任一所定义序列的互补序列。

具体地，本发明提供了具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列优选地在高度严格条件下与是SEQ ID NO：1互补序列的多核苷酸杂交，并且其中所述序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少90％同源。因此，本发明提供了与根据SEQ ID NO：1的序列至少90％，优选地至少91％，更优选地至少92％、93％、94％、95％，进一步更优选地至少96％、97％、98％或99％同源的多核苷酸。

在一个实施方案中，可以例如通过固相合成，或通过本领域技术人员已知的其它方法，合成获得这类经分离的多核苷酸。

在另一实施方案中，本发明提供了根据SEQ ID NO：1的脂解酶基因或其仍然编码活性酶的功能等同物。

优选地，根据本发明的多核苷酸是DNA序列。

本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸序列的载体，和可用于扩增或检测根据本发明的DNA的引物、探针和片段。

在另一优选的实施方案中，提供了下述载体，其中根据本发明的多核苷酸与允许所述多核苷酸序列在合适宿主中表达的至少一种调节序列可操作地连接。优选地，所述合适的宿主细胞是丝状真菌，更优选地是Aspergillus的物种。合适的菌株属于Aspergillus niger、oryzae或nidulans。优选地，所述宿主细胞是Aspergillus niger。

本发明还涉及含有根据本发明的多核苷酸的重组生产的宿主细胞。

本发明还提供了制备根据本发明的多核苷酸和载体的方法。

在另一实施方案中，本发明提供了重组宿主细胞，其中根据本发明的多核苷酸的表达被显著提高，或者其中脂解活性的生产水平被显著提高。

在另一实施方案中，本发明提供了重组生产的宿主细胞，其含有根据本发明的异源或同源DNA，并且其中所述细胞能够生产根据本发明的功能脂解酶，即所述细胞能够表达或优选地过表达编码本发明脂解酶的多核苷酸，例如包含提高拷贝数本发明基因的Aspergillus菌株。

在本发明的另一方面中，提供了具有脂解活性的经分离的多肽。根据本发明的多肽包含选自以下的氨基酸序列：

(a)根据下述成熟多肽或其功能等同物的氨基酸序列，所述成熟多肽是根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽，所述功能等同物具有与根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽至少90％同源的氨基酸序列；

(b)是SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽功能等同物的多肽，所述多肽与所述成熟多肽至少60％同源，并且所述多肽具有至少0.7的针对甘油三酯的特异性程度R_spec；

(c)根据本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列。优选地，根据本发明的多肽具有至少0.7，优选地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的针对甘油三酯的特异性程度R_spec。

在一个实施方案中，本发明还涉及具有脂解活性的经分离的多肽，其是SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，与所述成熟多肽至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％同源，并且所述经分离的多肽具有至少0.7、优选地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的针对甘油三酯的特异性程度R_spec。本发明还涉及包含编码所述多肽的多核苷酸。R_spec在稍后的申请文件中定义。

包含本发明多肽的融合蛋白也在本发明的范围内。本发明还提供了制造根据本发明的多肽的方法。

本发明还涉及根据本发明的脂解酶在本文所述任何工业方法中、更具体地在食品工业中、例如乳制品或烘焙制品中的用途。

发明详述

多核苷酸

本发明在第一方面中提供了经分离的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：

(a)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少90％的同源性；

(b)核苷酸序列，其与是SEQ ID NO：1互补序列的多核苷酸杂交，并且其中所述序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少90％同源；

(e)由于遗传密码子简并性，是(a)、(b)、(c)、(d)任一所定义序列的简并序列的序列；

在一个实施方案中，本发明提供了编码脂解酶的多核苷酸，所述脂解酶具有对应于根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物与对应于根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的氨基酸序列具有至少90％的同源性。

在本发明的上下文中，“成熟多肽”被定义为在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式具有脂解活性的多肽。成熟过程可取决于使用的具体表达载体、表达宿主和生产工艺。优选地，成熟多肽是根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的氨基酸34到304。“编码成熟多肽的核苷酸序列”在本文中被定义为编码所述成熟多肽的多核苷酸序列。优选地，编码成熟多肽的核苷酸序列是SEQID NO：1中的核苷酸100到912。

在另一实施方案中，本发明涉及编码具有脂解活性的经分离的多肽的经分离的多核苷酸，所述多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，与所述成熟多肽至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％同源，并且所述经分离的多肽具有至少0.7，优选地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的针对甘油三酯的特异性程度R_spec。本发明还涉及包含编码所述多肽的多核苷酸。R_spec在申请文件下文中定义。

本发明提供了下述多核苷酸序列，其包含编码脂解酶的基因及其编码序列。因此，本发明涉及经分离的多核苷酸，包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其变体，如与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的功能等同物。

具体地，本发明涉及包含下述核苷酸序列的经分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与根据SEQ ID NO：1的多核苷酸的互补序列杂交，优选地在严格条件下杂交，更优选地在高度严格条件下杂交，并且其中优选地所述序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少90％同源。

更特定地，本发明涉及经分离的多核苷酸，包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列或基本由之组成。

这类经分离的多核苷酸可以用本领域技术人员已知的方法通过合成获得。

本文使用的术语“基因”和“重组基因”指可从染色体DNA中分离的、包含编码蛋白质(例如脂解酶)的开放读码框的核酸分子。基因可包含编码序列、非编码序列、内含子和调节序列。此外，基因是指本文定义的经分离的核酸分子或多核苷酸。

可以使用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息，来分离本发明的核酸分子(如具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子或其功能等同物)。例如，使用SEQ ID NO：1的所有或部分核酸序列作为杂交探针，能够使用标准杂交和克隆技术(例如描述于Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，andManiatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中)分离根据本发明的核酸分子。

另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应(PCR)，来分离包含SEQ ID NO：1所有或部分的核酸分子，所述引物以SEQ ID NO：1中含有的序列信息为基础设计。

可以使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并使用适当的寡核苷酸引物根据标准的PCR扩增技术，来扩增本发明的核酸。这样扩增的核酸可以被克隆进适当的载体中并通过DNA序列分析被表征。

另外，可以通过标准的合成技术(例如使用自动化DNA合成仪)制备下述寡核苷酸，所述寡核苷酸对应于本发明的核苷酸序列或能够与本发明的核苷酸序列的互补序列杂交。

在一个优选的实施方案中，本发明的经分离的核酸分子包含根据SEQID NO：1的核苷酸序列。SEQ ID NO：1的序列编码根据SEQ ID NO：2的多肽和根据SEQ ID NO：2中成熟多肽的脂解酶。根据根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的脂解酶被表示为L01。根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列被表示为DNA L01。

在另一优选的实施方案中，本发明的经分离的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列或这些核苷酸序列功能等同物的互补序列。

与另一核苷酸序列互补的核酸分子是与所述另一核苷酸序列足够互补，从而其能够与所述另一核苷酸序列杂交形成稳定双链体的核酸分子。

本发明的一个方面涉及经分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明的多肽或其变体如功能等同物(例如生物活性片段或结构域)，以及足够用作杂交探针(以鉴定编码本发明多肽的核酸分子)的核酸分子，和适合用作PCR引物(用于扩增或突变核酸分子)的这类核酸分子的片段。

“经分离的多核苷酸”或“经分离的核酸”是与所述DNA或RNA来源的天然存在的生物基因组中紧邻的两条编码序列(一个在5’端，一个在3’端)均不紧邻的DNA或RNA。因此，在一个实施方案中，经分离的核酸包含与编码序列紧邻的部分或所有5’非编码(例如启动子)序列。该术语因此包括例如被整合进载体、整合进自主复制的制粒或病毒、或整合进原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为不依赖于其它序列的独立分子(例如通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括编码下述额外多肽的杂交基因的一部分的重组DNA，所述额外多肽基本不含细胞材料、病毒材料或培养基(通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学品(化学合成时)。另外，“经分离的核酸片段”是天然不作为片段存在并且在天然状态下不被发现的核酸片段。

本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)来合成核酸。这类寡核苷酸可被用于例如制备核酸，所述核酸具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性。

本发明的另一实施方案提供了经分离的核酸分子，所述核酸分子与根据本发明的核酸分子(例如根据本发明的核酸分子的编码链)是反义的。

根据本发明的多核苷酸的互补链也包括在本发明范围内。

核酸片段、探针和引物

根据本发明的核酸分子可仅包含根据SEQ ID NO：1的核酸序列的部分或片段，例如可以用作探针或引物的片段或编码根据本发明的蛋白质的部分的片段。根据本发明的核苷酸序列允许生产探针和引物，所述探针和引物被设计为用于鉴定和/或克隆根据本发明的蛋白质的功能等同物，所述功能等同物与根据SEQ ID NO：2的蛋白质具有至少90％同源性。探针/引物典型地包含基本上被纯化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列优选地在高度严格的条件下与根据本发明的核苷酸序列的至少约12或15个、优选约18或20个、优选约22或25个、更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多个连续的核苷酸杂交。

以根据本发明的核苷酸序列为基础、更优选地以SEQ ID NO：1为基础的探针可以被用于检测转录本或基因组序列，所述转录本或基因组序列编码例如生物中的相同或同源蛋白质。在优选的实施方案中，探针还包含与之结合的标签基团，例如所述标签基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶，或酶辅因子。这类探针也可以被用作诊断测试试剂盒的部分，所述试剂盒用于鉴定表达根据本发明的蛋白质的细胞。

同一性&同源性

术语“同源性”或“同一性百分比”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，在本文中定义，为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比，将所述序列就最适比较的目的进行排列。为了优化两条序列之间的比对，可以在比较的两条序列的任一条中引入缺口。这类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可以在较短的长度上，例如约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。同一性是报告的比对区中两条序列之间相同匹配的百分比。

序列的比较和两条序列之间同一性百分比的测定可以使用数学算法完成。技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序来比对两条序列并测定两条序列之间的同源性(Kruskal，J.B.(1983)An overviewof squence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal，(ed.)，Time warps，string edits and macromolecules：the theory and practice of sequencecomparison，pp.1-44 Addison Wesley)。两条氨基酸序列之间或两条核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用用于比对两条序列的Needleman andWunsch算法测定(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。可以通过所述算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法在计算机程序NEEDLE中执行。就本发明的目的而言，使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(第2.8.0版或更高，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对蛋白质序列而言，使用EBLOSUM62作为取代矩阵(substitution matrix)。对核苷酸序列而言，使用EDNAFULL。使用的可选参数是10的缺口罚分和0.5的缺口延伸罚分。技术人员应当明白，所有这些不同的参数应当得到轻微差异的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体同一性百分比不被显著改变。

通过上述程序NEEDLE比对后，如下计算查询序列和本发明序列之间的同一性百分比：用两条序列中展示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中相应位置的数量除以比对总长度，所述比对总长度减去了比对中的缺口总数。本文定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序输出中被标记为“最长同一性”。

本发明的核酸和蛋白质序列还可以被用作“查询序列”，针对公开数据库进行搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。这类搜索可以使用Altschul，et al.(1990)J.MoI.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可以使用NBLAST程序(计分＝100，字长＝20)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(计分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得加缺口的比对用于比较的目的，可以如Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见国立生物信息中心(Nataional Center for Biotechniology Information)的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

杂交

本文使用术语“杂交”旨在描述用于下述杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此至少约60％、65％、80％、85％、90％，优选地至少93％，更优选地至少95％和最优选地至少98％同源的核苷酸序列保持与彼此的互补序列杂交。

这类杂交条件的一个优选的非限制性例子是：于约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后于50℃、优选55℃、优选60℃和进一步更优选65℃下，在1X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。

高度严格条件包括例如于68℃下在5x SSC/5x Denhardt′s溶液/1.0％SDS中杂交并于室温下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。或者，洗涤可以在42℃进行。

技术人员应当知道对于严格和高度严格的杂交条件而言应用何种条件。涉及这类条件的其它指示在该领域能够容易地获得，例如在Sambrooket al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in MolecularBiology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。

当然，仅与多聚A序列(例如mRNA的3’末端多聚(A))或互补的T(或U)残基段杂交的多核苷酸不应被包括于与本发明的核酸部分特异杂交的本发明多核苷酸中，因为这类多核苷酸会与含有多聚(A)段或其补体的任何核酸分子(例如尤其是任何双链cDNA克隆)杂交。

从其它生物获得全长DNA

可以以一种典型的途径，来筛选从其它生物(例如丝状真菌，尤其是来自Fusarium的种)构建的cDNA文库。

例如，可以通过Northern印迹针对SEQ ID NO：1的同源多核苷酸筛选Fusarium菌株。检测到与根据本发明的多核苷酸同源的转录物后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术从分离自适当菌株的RNA构建cDNA文库。或者，可以使用能够与根据本发明的多核苷酸杂交的探针来筛选总基因组DNA文库。

可以例如通过进行PCR分离同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列为基础设计的两个简并寡核苷酸引物池。

用于反应的模板可以是通过反转录mRNA获得的cDNA，所述mRNA从已知或怀疑表达本发明多核苷酸的菌株中制备。可以对PCR产物进行亚克隆和测序，以确保被扩增的序列代表了根据本发明的新核酸序列的序列或其功能等同物。

然后可以通过多种已知方法，使用PCR片段来分离全长cDNA克隆。例如，被扩增的片段可以被标记，并用于筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，被标记的片段可以被用于筛选基因组文库。

也可以用PCR技术来从其它生物中分离全长cDNA序列。例如，可以根据标准步骤从合适的细胞或组织来源中分离RNA。可以使用特异于被扩增片段最5’端的寡核苷酸引物，引导第一链合成，针对RNA进行反转录反应。

然后可以使用标准的末端转移酶反应将得到的RNA/DNA杂交体“加尾”(例如用鸟嘌呤)，可以用RNase H消化所述杂交体，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二链合成。因此，被扩增片段上游的cDNA序列可以容易地被分离。有用的克隆策略的综述，参阅例如上文Sambrook etal.；和上文的Ausubel et al.。

载体

本发明的另一方面涉及包含根据本发明的多核苷酸序列的载体，包括克隆和表达载体，所述多核苷酸序列编码根据本发明的具有脂解活性的多肽或其功能等同物。本发明还涉及在合适的宿主细胞中培养、转化或转染这类载体的方法，例如在发生本发明多肽表达的条件下。在本文中使用时，术语“载体”是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。

本发明的多核苷酸可以被掺入重组的可复制载体中，例如克隆或表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在另一实施方案中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。载体可以从宿主细胞中被回收。合适的宿主细胞在下文讨论。

其中插入本发明表达盒或多核苷酸的载体可以是能够便利地进行重组DNA操作的任何载体，并且所述载体的选择通常应取决于要引入它的宿主细胞。

根据本发明的载体可以是自主复制载体，即显示为染色体外实体的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者载体可以是被引入宿主细胞中后被整合进宿主细胞基因组中，并与整合了它的染色体一起复制的载体。

一种类型的载体是“质粒”，质粒是指其中可以连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可以被连接进病毒基因组中。某些载体在它们被引入的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞时被整合进宿主细胞的基因组中，从而随宿主细胞的基因组一起被复制。另外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中被称作“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体通常是以质粒的形式存在的。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这类表达载体的起等同作用的其它形式，如粘粒、病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)和噬菌体载体。

根据本发明的载体可以体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。

本发明的载体可包含两种或更多，例如三种、四种或五种本发明的多核苷酸，例如用于过表达。

本发明的重组表达载体以适合核酸在宿主细胞中表达的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体含有一个或多个与待表达的核酸序列可操作地连接的调节序列，以要用于表达的宿主细胞为基础选择所述调节序列。

在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译体系中或当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接，即术语“可操作地连接”是指一种连接，其中所述组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与编码序列“可操作地连接”的调节序列如启动子、增强子或其它表达调节信号以下述方式放置：在与所述控制序列相容的条件下实现所述编码序列的表达；或者所述调节序列被布置为使得它们与其预期目的一致地发挥功能，例如转录在启动子处开始并通过编码多肽的DNA序列继续。

术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如Goeddel；Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。

术语调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些序列和仅在某种宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异调节序列)。

针对指定宿主细胞的载体或表达构建体因此可包含以下元件，所述元件以相对于编码第一发明的多肽的序列的编码链从5’-端到3’-端的连续顺序彼此可操作地连接：(i)能够在给定的宿主细胞中指导编码多肽的核苷酸序列转录的启动子序列；(2)任选地，能够指导多肽从给定的宿主细胞分泌进培养基中的信号序列；(3)本发明的DNA序列，其编码成熟和优选地活性形式的、具有本发明脂解活性的多肽；和优选地还有(4)能够终止编码多肽的核苷酸序列下游转录的转录终止区(终止子)。

根据本发明的核苷酸序列的下游可以是含有一个或多个转录终止位点(例如终止子)的3’非翻译区。终止子的起点较不关键。终止子可以例如对编码多肽的DNA序列而言是天然的。然而，优选地在酵母宿主细胞中使用酵母终止子并在丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌终止子。更优选地，终止子对宿主细胞(其中要表达编码多肽的核苷酸序列)而言是内源的。在被转录的区域中，可存在用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达的成熟转录本的编码部分应当包括位于要翻译的多肽起点处的翻译起始AUG和适当地位于结尾处的终止密码子。

增强的本发明多核苷酸的表达也可以通过异源调节区(例如启动子、分泌前导肽和/或终止子区)的选择来实现，所述异源调节区可发挥以下作用：提高表达宿主对感兴趣的蛋白质的表达水平和需要时的分泌水平，和/或提供本发明多肽表达的诱导型控制。

本领域技术人员应当知道：对表达载体的设计可以以下述因素为基础，如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如具有本发明脂解活性的多肽、多肽的突变体形式，其任何的片段、变体或功能等同物，融合蛋白等)。

本发明的重组表达载体可以被设计，来用于在原核细胞或真核细胞中表达根据本发明的多肽。例如根据本发明的多肽可以在细菌细胞如E.coli和Bacilli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论。或者，可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶体外转录和翻译重组表达载体。

对大部分丝状真菌和酵母而言，载体或表达构建体优选地被整合进宿主细胞的基因组中，从而获得稳定的转化体。然而，对某些酵母而言还可获得合适的附加体载体，可以向其中并入表达构建体进行稳定和高水平的表达，其例子包括分别衍生自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKD1质粒的载体，或含有AMA序列(例如来自Aspergillus的AMA1)的载体。将表达构建体整合进宿主细胞基因组中的情况下，所述构建体被整合进基因组中随机基因座处，或者使用同源重组整合进预定的目标基因座处，在这种情况下目标基因座优选地包含高度表达的基因。

因此，可用于本发明的表达载体包括来自染色体、附加体和病毒的载体，例如来自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒)的载体和来自其组合的病毒，如来自质粒和噬菌体遗传元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。

核苷酸插入物应与合适的启动子可操作地连接。除了对编码本发明多肽的基因是天然的启动子以外，可以使用其它启动子来指导本发明多肽的表达。启动子可针对其在期望的表达宿主中指导本发明多肽表达的效率来选择。可用于本发明中的启动子的例子包括噬菌体λPL启动子，E.colilac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和反转录病毒LTR的启动子，但不限于这些。其它合适的启动子是技术人员应当知道的。在一个特定的实施方案中，能够在真菌或酵母中指导根据本发明的多肽高水平表达的启动子是优选的。这类启动子是本领域已知的。

可以使用能够在本发明的宿主细胞中指导转录的多种启动子。优选地，启动子序列衍生自高表达的基因。优选的高表达基因(启动子优选地从其中衍生和/或其包含在用于整合表达构建体的优选的预定目标基因座中)的例子包括但不限于编码糖解酶如丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK或PKI)、醇脱氢酶(ADH)的基因，以及编码淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白的基因。合适的高表达基因的特定例子包括例如来自Kluyveromyces sp.的LAC4基因、分别来自Hansenula和Pichia的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、来自A.niger和A.awamori的葡萄糖淀粉酶(glaA)基因、A.oryzae TAKA-淀粉酶基因、A.nidulans gpdA基因和T.reesei纤维二糖水解酶基因。

优选地用于真菌表达宿主中的强组成型和/或诱导型启动子的例子是可得自以下真菌基因的启动子：木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亚基9(oliC)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、a-淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(glaA基因的AG-形式)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子。

强酵母启动子的例子是可得自醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸酯激酶和丙糖磷酸异构酶基因的启动子。

强细菌启动子的例子是α-淀粉酶和启动子以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。

适用于植物细胞的启动子包括胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)、甘露碱合酶(mas)、核酮糖小亚基(核酮糖二膦酸羧化酶-加氧酶ssu)、组蛋白、水稻肌动蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花叶病毒(CMV)35S和19S和环病毒启动子。

所有上述启动子是本领域可容易获得的。

载体可还包括得到RNA的多核苷酸侧翼的序列，所侧翼的序列包含与真核基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这会允许将本发明的多核苷酸引入宿主细胞的基因组中。

载体可含有以反义方向本导向的发明的多核苷酸，以提供反义RNA的生产。

可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在表示用于向宿主细胞中引入外源核酸(例如DNA)的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd，ed.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其它实验室手册中。

对于哺乳动物细胞的稳定转染而言，已知取决于使用的表达载体和转染技术，只有非常小的细胞级分可以将外源DNA整合进它们的基因组中。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如抗性或抗生素)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。优选的可选择标记包括但不限于赋予药物抗性或补足宿主细胞缺陷的可选择标记。它们包括例如可用于转化大部分丝状真菌和酵母的通用标记基因，如乙酰胺酶基因或cDNA(来自A.nidulans、A.oryzae或A.niger的amdS、niaD、facA基因或cDNA)，或提供抗生素抗性如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、甲氨喋呤、腐草霉素或苯菌灵抗性(benA)的基因。或者，可以使用特异性选择标记，如需要相应突变体宿主菌株的营养缺陷型标记，例如URA3(来自S.cerevisiae或来自其它酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自A.nidulans或A.niger)、argB(来自A.nidulans或A.niger)或trpC。在一个优选的实施方案中，在引入表达构建体后从经转化的宿主细胞中缺失选择标记，从而获得能够生产下述多肽的经转化的宿主细胞，所述多肽不含选择标记基因。

其它标记包括ATP合成酶、亚基9(oliC)、乳清苷-5′-磷酸脱羧酶(pvrA)、细菌G418抗性基因(这也可在酵母中使用，但是不能在真菌中使用)、氨苄西林抗性基因(E.coli)、新霉素抗性基因(Bacillus)和编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的E.coli uidA基因。载体可以体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。

蛋白质在原核生物中的表达常在E.coli中用下述载体完成，所述载体含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体对其中编码的蛋白质、例如对重组蛋白的氨基端添加大量氨基酸。这类融合载体典型地具有三个目的：1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解度；3)通过在亲和层析中发挥配体作用来帮助纯化重组蛋白。通常在融合表达载体中，在融合片段和重组蛋白的接合处引入蛋白水解切割位点，使得能够在融合蛋白的纯化后将重组蛋白与融合片段分开。

如所指出的，表达载体优选地含有可选择标记。这类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，和用于在E.coli和其它细菌中培养的四环素或氨苄西林抗性。合适的宿主的代表性例子包括细菌细胞，如E.coli、Streptomyces、Salmonella typhimurium和某些Bacillus的物种；真菌细胞，如Aspergillus的物种，例如A.niger、A.oryzae和A.nidulans，如酵母如Kluyveromyces，例如K.lactis和/或Puchia，例如P.pastoris；昆虫细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO，COS和Bowes melanoma；和植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。

优选用于细菌的载体例如公开于WO-A1-2004/074468中，所述文献通过引用并入本文。其它合适的载体应是技术人员容易知道的。

适用于本发明的已知细菌启动子包括WO-A1-2004/074468中公开的启动子，所述文献通过引用并入本文。

可以通过向载体中插入增强子序列，来提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10到300bp，其作用于提高启动子在给定的宿主细胞类型中的转录活性。增强子的例子包括SV40增强子(其位于复制起点下游的bp 100到270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点下游的多瘤增强子和腺病毒增强子。

为了将翻译的蛋白质分泌进入内质网腔中、进入壁膜间隙中或进入细胞外环境中，可以向被表达的基因中整合进适当的分泌信号。所述信号对多肽可以是同源的或它们可以是异源信号。

根据本发明的多肽可以以经修饰的方式(例如作为融合蛋白)被生产，并可不仅含有分泌信号而且含有额外的异源功能区。因此，例如额外氨基酸区(尤其是带电荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促进纯化期间或随后的操作和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。还可向多肽添加肽基元，以便于纯化。

根据本发明的多肽

本发明提供了具有脂解活性的经分离的多肽，所述多肽包括：

(a)根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽或其功能等同物，所述功能等同物具有与根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽至少90％同源的氨基酸序列；

(c)根据本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列。

因此，本发明提供了具有脂解活性的经分离的多肽，包含根据SEQID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽，优选地包含SEQ ID NO：2的氨基酸34-304，和能够通过在合适宿主中表达SEQ ID NO：1的多核苷酸获得的氨基酸序列。本发明还包括下述肽或多肽，其是根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物并且与之至少90％同源。

在另一实施方案中，本发明还涉及具有脂解活性的经分离的多肽，其是SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，与所述成熟多肽至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％同源，并且所述经分离的多肽具有至少0.7、优选地至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3的针对甘油三酯的特异性程度R_spec。R_spec在稍后的申请文件中定义。

上述多肽集体包含在术语“本发明的多肽”中。

术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如其通常被认为的那样)，且当上下文需要表示通过肽键偶合的至少两个氨基酸链时，每个术语可以互换使用。词语“多肽”(或蛋白质)在本文中使用表示含有多于七个氨基酸残基的链。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中从左到右和从氨基端到羧基端的方向书写。本文使用的单字母氨基酸代码是本领域普遍已知的，并可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)。

“分离的”多肽或蛋白质表示被从其天然环境中取出的多肽或蛋白质。例如，就本发明的目的而言，在宿主细胞中生产的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，与通过任何合适的技术已基本纯化的天然或重组多肽一样，所述合适的技术例如Smith and Johnson，Gene 67：31-40(1988)中公开的单步骤纯化方法。

如本领域技术人员所已知的，由于成熟期间的加工错误，可能SEQID NO：2的N-端或根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的N-端以及SEQ ID NO：2的C-端或根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的C-端可以是异源的。具体地，这类加工错误可能发生于多肽的过表达后。另外，外切-蛋白酶活性可导致异质性。异质性发生的程度取决于使用的宿主和发酵方案。这类C-端加工制品(artefacts)可能导致SEQ ID NO：2所示或根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽所示的更短多肽或更长多肽。这类错误的结果是N-端也可以是异源的。

在另一实施方案中，本发明提供了经分离的多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO：2的多肽或根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的至少一个功能结构域，所述成熟多肽含有额外的残基并在-1或-2或-3位起始。或者其可缺乏某些残基并因此在2或3或4等位置起始。额外的残基还可存在于C-端，例如347、348等位置。或者，C-端可能缺乏某些残基，并因此在345或344等位置终止。

可以通过本领域已知的方法(Protein Purification Protocols，Methods inMolecular Biology series by Paul Cutler，Humana Press，2004)从重组细胞培养物中回收和纯化根据本发明的脂解酶。

本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产步骤中使用的宿主，可以将本发明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本发明的多肽也可以包含最初被修饰的残基(在一些情况下由宿主介导的过程产生)。

多肽片段

本发明还包括根据本发明的多肽的生物活性片段。

本发明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与根据本发明的蛋白质的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽)足够同一或来自后者，所述片段包含比全长蛋白质更少的氨基酸但是显示相应的全长蛋白质的至少一种生物活性，优选地所述片段显示脂解活性。典型地，生物活性片段包含具有根据本发明的蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本发明的蛋白质的生物活性片段可以是多肽，所述多肽长度为例如比SEQ ID NO：2的成熟多肽的长度短5、10、15、20、25或更多个氨基酸，并且与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％的同源性。另外，其它生物活性部分(其中蛋白质的其它区域被缺失)可以通过重组技术被制备，并针对本发明多肽的天然形式的一种或多种生物活性做出评价。

本发明还包括编码根据本发明的蛋白质的上述生物活性片段的核酸片段。

融合蛋白

根据本发明的多肽或其功能等同物，例如其生物活性部分，可以与并非根据本发明的多肽(例如异源氨基酸序列)可操作地连接，形成融合蛋白。“并非根据本发明的多肽”是指具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列对应于与根据本发明的蛋白质不大量同源的蛋白质。这类“并非根据本发明的非-多肽”可衍生自相同或不同的生物。在融合蛋白中，根据本发明的多肽可对应于根据本发明的脂解酶的全部或其生物活性片段。在一个优选的实施方案中，融合蛋白包含根据本发明的蛋白质的至少两个生物活性部分。在融合蛋白中，术语“可操作地连接”旨在表示根据本发明的多肽和并非根据本发明的多肽彼此按照读码框融合。并非根据本发明的多肽可以与多肽的N-端或C-端融合。

例如，在一个实施方案中，融合蛋白是其中氨基酸序列与GST序列C-端融合的融合蛋白。这类融合蛋白可有助于根据本发明的重组蛋白的纯化。在另一实施方案中，根据本发明的融合蛋白是其N-端含有异源信号序列的蛋白质。在某些宿主细胞(例如哺乳动物和酵母宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列提高根据本发明的蛋白质的表达和/或分泌。

在另一个例子中，可以使用杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列作为异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons，1992)。真核异源信号序列的其它例子包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。还在另一例子中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，上文)和A蛋白分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。

可以使用信号序列来协助本发明蛋白质或多肽的分泌和分离。信号序列的典型特征是疏水氨基酸核，其通常在分泌期间的一个或多个切割事件中从成熟蛋白质上被切割。这类信号肽含有加工位点，所述加工位点允许在经过分泌通路时从成熟蛋白质上切下信号序列。信号序列指导蛋白质如从转化了表达载体的真核宿主中分泌，并且随后或同时切割信号序列。然后可以通过已知方法，从细胞外介质中容易地纯化蛋白质。或者，可以使用简化纯化的序列(如具有GST结构域)，将信号序列与感兴趣的蛋白质连接。因此，例如编码多肽的序列可以与简化融合多肽纯化的标记序列(如编码肽的序列)融合。在本发明这一方面的某些优选的实施方案中，标记序列是六-组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标签，以及其它，其中许多可商业获得。例如如Gentz et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)中所述，六-组氨酸提供了融合蛋白的便利纯化。HA标签是可用于纯化的另一种肽，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位，由例如Wilson et al.，Cell 37：767(1984)描述。

优选地，通过标准重组DNA技术生产根据本发明的融合蛋白。例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段按照读码框连接在一起，所述常规技术例如通过使用平末端或交错末端(stagger-endedtermini)用于连接、使用限制性酶消化来提供适当的末端、适当时填平粘末端、使用碱性磷酸酶处理来避免不想要的接合，和酶促连接。在另一实施方案中，可以通过常规技术(包括自动化DNA合成仪)合成融合基因。或者，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两条相邻的基因片段之间产生互补性悬突，所述相邻基因片段可随后退火并被再扩增产生嵌合基因序列(参阅例如Current Protocols in MolecularBiology，eds.Ausubel et al.John Wiley & Sons：1992)。另外，可以商业获得已经编码融合片段(例如GST多肽)的许多表达载体。编码根据本发明的多肽的核酸可以被克隆进这样的表达载体中，从而将融合片段与根据本发明的蛋白质按照读码框连接。

功能等同物

术语“功能等同物”和“功能变体”在本文可互换使用。

根据本发明的多核苷酸的功能等同物是经分离的多核苷酸，其与SEQID NO：1的核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％，优选地至少90％的同源性，并且编码下述多肽，所述多肽至少展示根据本发明的脂解酶的一种具体功能，优选地是具有脂解活性的多肽。根据本发明的多肽的功能等同物是下述多肽，其与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％，优选地至少90％的同源性，并且至少展示根据本发明的脂解酶的一种功能，优选地是展示脂解活性的多肽。本文提到的功能等同物还包括具有上述脂解活性的生物活性片段。

根据本发明的多肽的功能等同物可含有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽的一个或多个氨基酸的取代，或不影响酶的具体功能的氨基酸取代、插入或缺失。因此，功能上中性的氨基酸取代是根据SEQ IDNO：2的氨基酸序列中的成熟多肽中的取代，所述取代不显著影响所述多肽的具体功能性。例如，在本发明的蛋白质之间保守的氨基酸残基被预测为尤其顺应于改变。另外，在根据本发明的蛋白质和其它脂解酶之间保守的氨基酸不可能顺应于改变。

典型地，根据本发明的多核苷酸的功能核酸等同物可含有沉默突变或不改变所编码的多肽生物功能的突变。因此，本发明提供了编码根据本发明的多肽的核酸分子，所述多肽含有对于具体生物活性并非必需的氨基酸残基改变。这类蛋白质在氨基酸序列上与根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽差异，但仍保留其至少一种生物活性，优选地保留脂解活性。在一个实施方案中，根据本发明的多核苷酸的功能等同物包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的基本同源的氨基酸序列。在一个实施方案中，与根据SEQ IDNO：2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90％同源性的功能等同物是下述多肽(下文表示为L02)，所述多肽的氨基酸序列根据氨基酸序列根据SEQ ID NO：4的成熟多肽，在另一实施方案中是下述多肽(下文表示为L03)，所述多肽的氨基酸序列根据氨基酸序列根据SEQ ID NO：6的成熟多肽，还在另一实施方案中是下述多肽(下文表示为L04)，所述多肽的氨基酸序列根据氨基酸序列根据SEQ ID NO：8的成熟多肽。在一个优选的实施方案中，分别根据SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的成熟多肽分别是根据SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的氨基酸序列34到304。

编码本发明多肽的本发明多核苷酸的功能等同物应当包含下述多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与根据SEQ ID NO：1的核酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源。

在一个实施方案中，与根据SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少90％同源性的功能等同物是具有根据SEQ ID NO：3的核苷酸序列的多核苷酸(表示为DNA L02)，在另一实施方案中是具有根据SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸(表示为DNA L03)，还在另一实施方案中是具有根据SEQ ID NO：7的核苷酸序列的多核苷酸(表示为DNA L04)。根据SEQ ID NO：3的多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO：4的多肽，根据SEQID NO：5的多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO：6的多肽，根据SEQ IDNO：7的多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO：8的多肽。在一个优选的实施方案中，位于SEQ ID NO：3、5、7中的多核苷酸100-912分别编码SEQID NO：4、6、8中的成熟多肽。

编码根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽同源蛋白质的经分离的多核苷酸可以如下产生：向根据SEQ ID NO：1的编码核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，使得所编码的蛋白质中被引入一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。这类突变可以通过标准技术如定点诱变和PCR-介导的诱变来引入。

因此，下述编码具有脂解活性的其它家族成员的核酸属于本发明的范围内，其具有与SEQ ID NO：1、3、5、7不同的核苷酸序列并且满足上述条件。另外，编码具有脂解活性的蛋白质的核酸属于本发明的范围内，所述蛋白质具有与氨基酸序列SEQ ID NO：2、4、6、8中成熟多肽不同的氨基酸序列并且满足上述条件。

根据本发明的多核苷酸可以优化其密码子使用，优选地根据WO2006/077258和/或WO2008/000632中所述方法进行。WO2008/000632涉及密码子对优化。密码子对优化是这样一种方法，其中在密码子使用方面修饰编码多肽的核苷酸序列，尤其是使用的密码子对，来获得编码多肽的核苷酸序列提高的表达和/或所编码多肽的提高的生产。密码子对被定义为编码序列中一组两个相继的三联体(密码子)。

可以根据它们与本文公开的核酸的同源性，使用本文公开的cDNA或其合适的片段作为杂交探针，根据标准的杂交技术，优选地在高度严格的杂交条件下，来分离对应于根据本发明的多核苷酸的变体(例如天然等位基因变体)或同源物的核酸分子。

在本发明的另一方面中，提供了经改进的蛋白质。经改进的蛋白质是与具有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的生物活性相比时，其中至少一种生物活性被改进的蛋白质。这类蛋白质可以如下获得：例如通过饱和诱变沿编码序列SEQ ID NO：1的全部或部分随机引入突变，并可重组表达得到的突变体并针对生物活性进行筛选。例如，本领域提供了测量脂解酶酶活性的标准测定法，从而可以容易地选择经改进的蛋白质。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的多肽具有根据SEQ ID NO：2中氨基酸34到304的氨基酸序列。在另一实施方案中，多肽与根据SEQID NO：2的氨基酸序列中的成熟多肽至少90％同源，并且保留根据SEQID NO：2的氨基酸序列中成熟多天的至少一种生物活性，优选地保留脂解活性，并且仍由于上述天然变异或诱变而在氨基酸序列上有所差异。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的蛋白质具有由下述经分离的核酸片段编码的氨基酸序列，所述核酸片段与是SEQ ID NO：1互补序列的多核苷酸杂交并且其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少90％同源，优选地在高度严格杂交条件下杂交。

因此，根据本发明的蛋白质优选地是下述蛋白质，所述蛋白质包含与根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中成熟多肽至少约90％、91％92％93％94％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的氨基酸序列，并且保留根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中成熟多肽的至少一种功能活性。

也可以如下文所述来鉴定根据本发明的蛋白质的功能等同物：例如，针对脂解酶活性，筛选本发明蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合文库。在一个实施方案中，通过核酸水平上的组合诱变产生有斑文库(variegated library)。可以通过例如将合成的寡核苷酸混合物酶连接为基因序列来产生变体的有斑文库，从而可能的蛋白质序列的简并集合(degenerate set)可作为个体多肽表达，或者作为一组更大的融合蛋白表达(例如用于噬菌体展示)。存在可用于从简并寡核苷酸生产本发明多肽的可能变体文库的多种方法。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(见例如Narang(1983)Tetrahedron 39：3；ltakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；ltakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。

另外，本发明多肽的编码序列的片段文库可以被用于产生有斑的多肽群，用于筛选随后的变体选择。例如，可以如下产生编码序列片段的文库：在每个分子仅发生约一次切割的条件下用核酸酶处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，将DNA复性形成双链DNA(其可包含来自被不同切割的产物的有义/反义对)，通过用S1核酸酶处理从再形成的双链体上去除单链部分，并将得到的片段文库连接进表达载体中。通过该方法，可以得到下述表达文库，所述表达文库编码感兴趣的蛋白质的不同大小的N-末端和内部片段。

本领域已知有若干种技术可用于筛选组合文库(其通过截短的点突变制造)的基因产物，和用于筛选cDNA文库以获得具有选定特性的基因产物。用于筛选大基因文库的、适用于高通量分析的、最广泛使用的技术典型地包括：将基因文库克隆进可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞，和在下述条件下表达组合基因，所述条件下想要的活性的检测简化编码基因(其产物被检测)的载体的分离。循环总体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)，一种增强文库中功能突变体频率的技术，可以与筛选实验组合使用以鉴定本发明蛋白质的变体(Arkinand Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。

根据本发明的多核苷酸的片段也可包括不编码功能多肽的多核苷酸。这类多核苷酸可作为PCR反应的探针或引物作用。

根据本发明的核酸无论是编码功能多肽还是无功能的多肽，均可被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有根据本发明的脂解活性的多肽的本发明核酸分子的用途尤其包括：(1)从cDNA文库分离编码蛋白质的基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体涂片原位杂交(例如FISH)以提供基因的精确染色体定位，如Verma et al.，HumanChromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)所述；(3)Northern印迹分析，用于检测mRNA在特定组织中的表达；和4)能够被用作诊断工具来分析给定的生物(例如组织)样品中核酸存在的探针和引物，所述核酸能与探针杂交。

本发明还包括获得根据本发明的基因的功能等同物的方法。这类方法需要获得被标记的含有被分离的核酸的探针，所述被分离的核酸编码根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列中成熟多肽的蛋白质序列或其中任何的变体的全部或部分；在允许探针与文库中的核酸片段杂交从而形成核酸双链体的条件下，用被标记的探针筛选核酸片段文库，和从任何被标记的双链体中的核酸片段制备全长的基因序列，以获得与根据本发明的基因基因相关的基因。

宿主细胞

在另一实施方案中，本发明包括包含根据本发明的多核苷酸或包含根据本发明的载体的细胞，例如经转化的宿主细胞或重组的宿主细胞。

“经转化的细胞”或“重组细胞”是其中(或其祖先中)已经借助于重组DNA技术引入了本发明核酸的细胞。原核和真核细胞均包括在内，例如细菌、真菌、酵母等等。宿主细胞还包括但不限于哺乳动物细胞系如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛细胞系。公众可获得适用于稳定转染哺乳动物细胞的大量载体，用于构件这类细胞系的方法也是公众在例如Ausubel et al.(上文)中已知的。特别优选的是来自丝状真菌(尤其是Aspergillus物种如Aspergillus niger或oryzae或awamori)的细胞。

可选用调控插入序列表达并以特异的、期望的方式加工基因产物的宿主细胞。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可促进蛋白质发挥最佳功能。

多种宿主细胞具有用于翻译前加工和修饰蛋白质和基因产物的特性和特异机制。可选用分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的适当细胞系或宿主系统，以确保对所生产的外源蛋白质的想要的和正确的修饰与加工。为此，可以使用具有下述细胞机制的真核宿主细胞，所述细胞机制用于适当地加工原始转录本、糖基化和磷酸化基因产物。这类宿主细胞是本领域公知的。

如果需要的话，可以在根据本发明的多肽制剂中使用上述细胞。这样的方法典型地包含在提供编码多肽的编码序列(的载体)表达的条件下培养重组宿主细胞(例如用上述表达载体转化或转染的)，并任选地从细胞或培养基中回收、更优选地回收和纯化产生的多肽。可以将本发明的多核苷酸并入重组可复制载体例如表达载体中。可以使用载体在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在又一个实施方案中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。可以从所述宿主细胞中回收载体。

优选地，多肽作为分泌型蛋白质被生产，在这种情况下，表达构建体中编码多肽成熟形式的核苷酸序列与编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接。优选地，信号序列对编码多肽的核苷酸序列而言是天然的(同源的)。或者，信号序列对编码多肽的核苷酸序列而言是外来的(异源的)，在这种情况下信号序列优选地对其中表达本发明核苷酸序列的宿主细胞而言是内源的。对酵母宿主细胞而言合适的信号序列的例子是衍生自酵母a-因子基因的信号序列。类似地，对丝状真菌宿主细胞而言合适的信号序列是例如衍生自丝状真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因例如A.niger glaA基因的信号序列。这可与淀粉糖苷酶(也称作(葡糖)淀粉酶)启动子自身组合使用，以及与其它启动子组合使用。在本发明上下文中也可以使用杂种信号序列。

优选的异源分泌前导序列是来自于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-例如来自Aspergillus的18和24个氨基酸版本)、α-因子基因(酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或α-淀粉酶基因(Bacillus)的分泌前导序列。

可如上文所述将载体转化或转染进合适的宿主细胞中，以提供本发明多肽的表达。该方法可包括在提供编码本发明多肽的编码序列的载体表达的条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞用如上所述的表达载体转化。

本发明因此提供了用本发明多核苷酸或载体转化或转染或包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。优选地，所述多核苷酸在用于复制和表达多核苷酸的载体中载有。应选择与所述载体相容的细胞，并且其可以是原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。

也可选择下述异源宿主，其中以基本不含可能干扰应用的酶活性(例如不含淀粉降解酶、纤维素降解酶或半纤维素降解酶)的形式生产本发明的多肽。这可通过选择通常不生产这类酶的宿主来实现。

本发明包括通过编码多肽的DNA序列的重组表达来生产本发明多肽的方法。就这一目的而言，本发明的DNA序列可用于基因扩增和/或改变表达信号如启动子、分泌信号序列，从而允许合适同源或异源宿主细胞中多肽的经济生产。同源宿主细胞是下述宿主细胞，其与DNA序列衍生自的物种是相同物种或是相同物种内的变体。

合适的宿主细胞优选地是原核微生物如细菌，或更优选地是真核生物，例如真菌，如酵母或丝状真菌，或植物细胞。通常，酵母细胞是超过真菌细胞优选的，因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质在酵母中分泌较差，或者在一些情况下不被正确加工(例如酵母中的超糖基化)。在这些情况下，应当选择真菌宿主生物。

宿主细胞可过表达多肽，并且用于进行过表达的技术是公知的。宿主细胞因此可具有两个或更多拷贝的编码多核苷酸(因此载体可相应地具有两个或更多拷贝)。

因此，在本发明的一个实施方案中，根据本发明的重组宿主细胞能够表达或过表达根据本发明的多核苷酸或载体。

根据本发明，可以通过在常规营养发酵培养基中培养根据本发明的宿主细胞来实现本发明的多肽的生产，所述宿主细胞已用本发明的一种或多种多核苷酸转化。

可以使用本领域已知的方案培养根据本发明的重组宿主细胞。对于启动子和宿主细胞的每种组合而言，可以获得有助于编码多肽的DNA序列表达的培养条件。达到期望的细胞密度或多肽滴度后，终止培养并使用已知方案回收多肽。

发酵培养基可包含含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等)、有机氮源(例如酵母提取物、麦芽提取物、胨等)和无机养分来源(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁等)的已知培养基。

对适当培养基的选择可基于表达宿主的选择和/或表达构建体的调节需求。这类培养基是本领域技术人员已知的。需要时，培养基可含有额外的成分，所述额外成分偏好经转化的表达宿主超过可能的污染性微生物。

发酵可以在0.5-30天的时间段中进行。其可以是分批、连续或进料-分批的过程，适当地在例如从约0℃到45℃的温度范围内和/或从约2到约10的pH下进行。优选的发酵条件是从约20℃到约37℃范围内的温度和/或从约3到约9的pH。适当的条件通常基于表达宿主的选择和要生产的蛋白质来选择。

发酵后，需要时可以通过离心或过滤从发酵液中去除细胞。发酵终止或去除细胞后，可以通过常规手段回收和需要时纯化与分离本发明的多肽。

脂解酶在工业过程中的用途

本发明还涉及根据本发明的脂解酶在大量工业过程中的用途。尽管用这些过程获得了长期的经验，但是根据本发明的脂解酶具有超出目前所用酶的大量显著优点。根据特定的应用，这些优点可包括下述方面，如更低的生产成本、更高的底物特异性、更低的抗原性、更少的不想要的副活性、在合适的微生物中生产时更高的产率、更合适的pH和温度范围、更好的最终产物味道以及食物级别和犹太教规方面(kosher aspect)。

优选地，根据本发明的具有脂解活性的经分离的多肽可用于食品工业，更优选地用于食品制造中。

乳制品应用

在一个优选的实施方案中，根据本发明的多肽可用于乳制品工业中。

在一个实施方案中，根据本发明的多肽用于乳制品(优选地乳酪、乳酪样制品、EMC)或乳脂肪衍生的无脂肪酸混合物的制造中，优选地用于产生和/或强化乳制品的香味。

在本发明的上下文中，“乳制品”是指任何种类的基于乳的制品，包括但不限于乳酪、黄油、EMC、奶油、乳制品类似物等。本发明上下文中特别感兴趣的是含乳脂肪的制品及其等同物，包括常规乳酪、乳酪类似物、经加工的乳酪、黄油、涂抹物、人造黄油、EMC等。

在一个优选的实施方案中，乳制品为乳酪。乳酪可以是任何变种，例如硬乳酪如Chester、Danbo、Manchego、Saint Paulin、Cheddar、Monterey、Colby、Edam、Gouda、Muenster、Swiss type、Gruyere、Emmenthaler、Parmesan、Pecorino、Provolone和Romano；凝乳乳酪如Feta、帕斯塔费拉塔乳酪(pasta filata cheese)如Mozzarella；经加工的乳酪；白霉乳酪(white mould cheese)如Brie和Camembert；或蓝霉乳酪(bluemould cheese)如Gorgonzola和Danish蓝乳酪，或新鲜乳酪如例如Ricotta、奶油乳酪、Neufchatel或Cottage乳酪。本发明上下文中优选的乳酪类型是Parmesan、Pecorin、Provolone、Romano、Feta。

术语“乳类似物”是指乳样制品，其含有脂肪(例如乳脂(例如奶油))作为组合物的部分，并且还含有非乳成分例如植物油作为组合物的部分。

本发明还涉及制备乳制品的方法，其中向用于生产乳制品的乳组合物中添加根据本发明的经分离的多肽。

在本发明的上下文中，乳组合物可以是包含乳和/或一种或多种乳组分和/或乳级分的组合物，所述组合物是根据本发明的乳制品生产中的起始组合物，其可以是乳制品生产中的中间产物(例如凝乳或乳清)。乳组合物是脂解酶的合适底物，因此乳组合物应包含至少一种乳脂肪和/或其它脂肪，例如衍生自植物的脂肪。根据本发明的脂解酶能够催化乳组合物中存在的甘油三酯的酯键水解，因此它们具有脂肪酶活性。甘油三酯是甘油和脂肪酸的酯。甘油三酯(也称作三酰基甘油或三酰基甘油酯)主要存在于植物油和动物脂肪中。脂肪酶(EC 3.1.1.3)在本文中定义为从脂质上水解一个或多个脂肪酸的酶，更特定地，它们水解脂肪酸和甘油羟基之间的酯键。

乳组分可以是乳的任何成分，如乳脂、乳蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、乳糖。乳级分可以是乳的任何级分，例如脱脂乳、酪乳、乳清、奶油、黄油、通过超滤处理的乳、乳粉、全乳粉、酪乳粉或脱脂乳粉。在本发明的上下文中，乳可以是任何哺乳动物的乳糜管分泌物。因此，可通过对例如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶获得乳。

用本发明这一方面方法生产的乳制品可以通过本领域已知的任何合适工艺生产，并且可以在足以使酶显示其直接活性的合适条件(例如酶浓度、温度和时间)下，在乳制品生产期间的任何合适步骤中，向乳制品中添加脂解酶。

在一个实施方案中，根据本发明的方法是用于乳酪生产的方法。在这种情况下，所述方法应包括下述步骤，其中通过使用粗制凝乳酶(rennet)的乳组合物的酶促凝固，或者通过食品级别酸或乳酸细菌生长产生的酸的酸性凝固，形成凝乳，并随后将凝乳与乳清分离。根据要生产的乳酪类型，乳酪的生产可还包含凝乳的加工和得到的乳酪的陈化(aging)。根据本发明的这一方面生产乳酪的方法应优选地包括得到的乳酪的陈化。可以在乳酪制备的多个阶段向乳组合物添加脂解酶。优选地，在添加凝固剂(例如凝乳酶)之前或一起对乳添加酶。在此时添加确保酶在乳酪各处均匀分布。或者可以在更晚的阶段添加酶，例如对凝乳添加，但是这引入了乳酪中酶不均匀分布的风险。因此，优选对乳添加酶。

在另一实施方案中，生产根据本发明的乳制品的方法是制造乳脂肪衍生的游离脂肪酸混合物，所述混合物通过乳脂肪(例如黄油脂肪或奶油)的水解获得，得到游离脂肪酸混合物，并可被用于例如在蓝色乳酪香味中调味。这些游离脂肪酸混合物可在其它制品例如涂抹物、汤、调味汁、点心、薯片、玉米片等的生产中用作香料。其它脂肪酶应用包括在经修饰的乳粉中的用途(Kilara in Encyclopedia of Dairy Sciences，(2003；Fox et alleds，Academic Press)pp.914-918)。

在又一实施方案中，生产根据本发明的乳制品的方法是生产EMC的方法。在这种情况下，所述方法典型地可以使用本领域技术人员已知的条件进行(参阅例如Ch.2.12 in Industrial Enzymology，2^nd Ed.，Godfrey，West，Eds，MacMillan Press，London，1996；Wilkinson et al in Encyclopedia of DairySciences，(2003；Fox et all eds，Academic Press)pp.434-438)。

在上述方法任一中要添加的酶量应取决于酶活性和最终产物中期望的香味作用。应用中要添加的量可以由本领域技术人员使用剂量应答曲线决定。在这一途径中，对乳组合物添加递增量的酶，随后由经过培训的品尝小组(trained taste panel)分析最终产物中香味谱的强度。

在根据本发明的用途或生产根据本发明的乳制品的方法的一个优选的实施方案中，根据本发明的脂解酶被用于产生和/或强化香味。乳制品生产中的香味发生归因于酶(无论由乳制品生产期间使用的微生物生产，或是在制造期间特定地添加)的作用以及其它，更特定地归因于脂解酶和蛋白水解酶。

脂解酶负责乳制品中存在的乳脂肪的水解，和随后制品中游离脂肪酸混合物(下文称作FFA)的释放。游离脂肪酸混合物的组成部分造成乳制品的最终香味。从含有乳脂肪的底物开始，脂解酶会生产含C4到C18的游离脂肪酸的特定FFA混合物，其中混合物中每种组分的相对量会取决于酶对下述特定甘油三酯酯键水解的特异性，所述酯键涉及甘油三酯中存在的含C4到C18脂肪酸。例如，对含C4脂肪酸具有高度特异性的脂解酶会优先水解具有含C4脂肪酸而不是含C6到C18脂肪酸的三甘油片段的甘油三酯键，并且与含C6到C18的游离脂肪酸的相对含量相比，混合物中含C4的游离脂肪酸的相对含量会更高。另外，混合物中每种成分的相对量也应取决于起始底物和其中存在的甘油三酯的组成。因为每种脂肪酸负责贡献给予产物特定的香味特征，所以在足以使酶反应的酶浓度、温度和时间条件下对含特定乳脂肪的底物进行脂解酶作用时，产生特定的FFA混合物，得到底物中特定的香味谱。可以在每种酶使用相同底物时，通过测定FFA谱将若干脂解酶对游离脂肪酸释放的特异性彼此比较，并且因此可将所产生的香味谱彼此比较。FFA谱给出相对于脂解酶对底物作用所释放的游离脂肪酸总量而言，每种含C4到C18的游离脂肪酸的相对量。FFA谱通常会取决于起始底物、脂解酶对脂质组合物中脂肪酸组分的特异性。

如下计算脂肪转化程度(D)(以％为单位表述)：

D＝[(用脂解酶处理过的组合物中FFA的总量)-(未经处理的组合物中FFA的总量)]/(组合物中存在的总脂肪酸)。FFA的总量和脂肪酸的总量以mol/kg底物为单位表述。

实施例中描述了从底物开始测定FFA谱的合适方法。

与更长链脂肪酸(即含C12到C18的游离脂肪酸)相比时，根据本发明的脂解酶优选地对短链游离脂肪酸(即含C4到C10的游离脂肪酸，优选地含C4的游离脂肪酸)的释放具有更高的特异性。在一个优选的实施方案中，与含C12到C18的游离脂肪酸相比，根据本发明的脂解酶对含C4到C10游离脂肪酸的特异性程度通过特异性比例(R_spec)表述时至少为0.7，优选地至少0.8、0.9、1、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3。通常R_spec应当尽可能高地获得。

可如下计算R_spec：

R_spec＝∑相对C4-C10含量/∑相对C12-C18含量。

其中“∑相对C4-C10含量”是用脂解酶处理过的组合物中存在的含C4、含C6、含C8和含C10的游离脂肪酸的相对含量的总和，并且其中“∑相对C12-C18含量”是用脂解酶处理过的组合物中存在的含C12、含C14、含C16和含C18的游离脂肪酸的相对含量的总和。

“相对Cx含量”(其中X可以是4、6、8、10、12、14、16、18任一)对应于用脂解酶处理过的组合物中含Cx的游离脂肪酸量相对于用脂解酶处理过的组合物中存在的游离脂肪酸总量的百分比(％)。上述式中FFA(或游离脂肪酸)量以mol/kg为单位表述。

在使用初期乳酪(优选地为Cheddar或Gouda乳酪，优选地熟化时间少于2周的初期乳酪)制造的下述乳制品组合物中测定R_spec，所述乳制品组合物在导致被孵育样品中包含的脂肪转化率程度在5％-25％之间的条件(如剂量、孵育时间和孵育温度)下用脂解酶孵育，其中所述脂肪转化程度如上文所述计算。

本发明还涉及能够通过根据本发明的方法获得的乳制品。

在根据本发明的任何经分离的多肽的用途或生产根据本发明的乳制品的方法的一个优选的实施方案中，∑相对C4-C10含量/∑相对C12-C18含量至少为0.7，优选地至少为0.8、0.9、1、1.1、1.5、1.7、2、2.5、3。在例如用反刍动物前胃酯酶处理的Parmesan乳酪中，该比例约为1.7(从来自D.T.Lai，A.D.Mackenzie，C.J.O’Connor，K.W.Turner J.Dairy Sci.80：2249-2257(1997)，page 2255的数据计算)。“相对C4-C10含量”和“∑相对C12-C18”具有与上文相同的含义。

本领域已知作用于含乳脂肪底物的脂解酶主要释放短链脂肪酸(例如含C4和C6的脂肪酸)，这导致产生辛辣(piquant，spicy)、尖锐、强烈的香味，而例如中链脂肪酸的释放可以导致肥皂样的口味。

因此在本发明的用途或生产根据本发明的乳制品的方法的一个优选的实施方案中，乳制品香味谱中尖锐、强烈、辛辣的香调被提高，优选地乳制品香味谱中的肥皂样香调被降低。

在另一方面中，本发明涉及能够通过制备根据本发明的乳制品的方法获得的乳制品。合适的乳制品的例子是本发明前述方面中提到的例子。

烘焙应用

根据本发明的脂解酶在食物中的工业应用的另一例子是其在烘焙应用中改进面团和/或烘焙制品品质的用途。

惊讶地发现根据本发明的脂解酶可作用于烘焙应用中的若干类型的脂质，包括甘油酯(例如甘油三酯)、磷脂或糖脂，如半乳糖脂。

更特定地，根据本发明的脂解酶在面团中使用时原位显示至少一种以下特性：

·对非极性脂质相对低的活性。

·对极性二酰基-脂质、至少对二酰基半乳糖脂相对高的活性

·对极性单酰基化合物如溶血半乳糖脂(lysogalactolipids)和溶血磷脂(lysophospholipids)相对低的活性。

发现作为面团中化学乳化剂的替代物使用时，这些出乎意料的特性极度有利。

甘油酯和脂肪酶已在上文定义。

糖脂(例如半乳糖脂)由甘油主链与外部(sn-1)和中间(sn-2)位置中两个经酯化的脂肪酸组成，同时第三个羟基与糖残基结合，如在半乳糖脂的情况下与半乳糖结合，例如为单半乳糖基甘油二酯或二半乳糖基甘油二酯。半乳糖脂肪酶(EC 3.1.1.26)催化sn-1和sn-2位置中一个或两个脂肪酰基分别从半乳糖基甘油二酯上水解。

磷脂由甘油主链与外部(sn-1)和中间(sn-2)位置中两个经酯化的脂肪酸组成，同时甘油的第三个羟基用磷酸酯化。磷酸可随后被酯化为例如氨基醇，如乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)、胆碱(磷脂酰胆碱)。磷脂酶在本文中被定义为参与磷脂中一个或多个键水解的酶。

可以区分若干类型的磷脂酶活性，它们水解连接脂肪酰基片段与甘油主链的酯键：

·磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)和A2(EC 3.1.1.4)分别催化来自二酰基甘油磷脂中sn-1和sn-2位置中的一个脂肪酰基的脱酰基作用，产生溶血磷脂。这是乳化剂替代物的期望活性。

·溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5，也被生物化学和分子生物学国际联盟命名协会称作磷脂酶B(Enzyme Nomenclature，Academic Press，New York，1992))催化溶血磷脂中剩余脂肪酰基的水解。已报道了来自Penicilliumnotatum(Saito et al.，1991，Methods in Enzymology 197：446-456)的磷脂酶B，其催化来自二酰基甘油磷脂中两个脂肪酸的脱酰基作用，并且本质上具有溶血磷脂酶活性。对于乳化剂替代而言较不期望使用溶血磷脂酶，因为这会导致极性头和非极性尾组合的缺失，使得到的产物不能够影响表面特性。惊讶地显示，根据本发明的脂解酶在面团中显示相对低的溶血磷脂酶活性。

小麦粉含有约2.2-2.9％的脂质。面粉脂质可以被分为淀粉脂质(0.8-0.9％)和非淀粉脂质(1.4-2.0％)。而淀粉脂质主要由极性溶血脂质组成，非淀粉脂质由约40％的中性甘油三酯和40％的极性磷脂和糖脂组成。为了优化面粉脂质级分，能够通过添加根据本发明的脂肪酶，使根据本发明的脂肪酶能够在面团中原位水解极性脂质，即磷脂和糖脂，更特定地为半乳糖脂。

可以在多种烘焙制品中使用烘焙酶。术语“烘焙制品”在本文中被定义为包括面包制品，如模制面包(tin bread)、面包块(loaves ofbread)、法式面包以及小型法式面包(French roll)、层压面团制品(laminated dough products)如丹麦糕饼(Danish pastry)、牛角面包(croissants)或酥饼制品(puff pastry products)、蛋糕、派、玛芬、酵母制成品(yeast raised)和蛋糕甜甜圈(cake doughnuts)等。

根据本发明的脂解酶可例如用于烘焙制品中。烘焙制品例如面包由面团制成。

因此在本发明的一个实施方案中提供了根据本发明的经分离的多肽在面团制备中的用途，和提供了包含根据本发明的多肽的面团。本发明还提供了面团的制备，包括对至少一种面团成分添加根据本发明的多肽的步骤。

面团通常由基本成分(小麦)粉、水和任选地盐制成。取决于烘焙制品，添加的其它成分为糖、香料等。对发酵剂制品而言，在化学发酵系统之后主要使用面包酵母(baker′s yeast)，所述化学发酵系统如酸(产酸化合物)和碳酸氢盐的组合。

酵母、酶和化学添加剂一般分别向面团中添加。

可以以干燥(例如颗粒形式)或液体形式添加酶。大部分情况下化学添加剂以粉末形式添加。另外，针对特定烘焙应用定制的加工助剂组合物可由化学添加剂和酶的专用混合物组成。

从上述成分和加工助剂制备面团是本领域公知的，并且包括将所述成分和加工助剂混合，和一个或多个成形和发酵步骤。

从这类面团制备烘焙制品也是本领域公知的，并可包括面团的成型和整形还有发酵，之后在需要的温度和烘焙时间下烘焙。在一个实施方案中，本发明提供了制备烘焙制品的方法，所述方法包括烘焙根据本发明的面团的步骤。本发明还提供了能够根据所述方法获得的烘焙制品。优选地，根据本发明的烘焙制品是面包。

本发明还涉及用于制备面团或烘焙制品的方法，所述方法包括向面团中掺入有效量的本发明的脂解酶，这相对于其中未掺入多肽的面团或烘焙制品而言促进面团或得自面团的烘焙制品的一种或多种特性。

短语“掺入面团中”在本文中定义为向面团中、要用于制造面团的任何成分中、和/或要制造面团的面团成分的混合物中添加根据本发明的脂解酶。换言之，根据本发明的脂解酶可以在面团制备的任何步骤中被添加，并可以在一个、两个或更多步骤中被添加。根据本发明的脂解酶被添加进面团的成分中，所述成分使用本领域公知的方法被揉捏和烘焙以制造烘焙制品。参阅例如U.S.专利No.4,567,046、EP-A-426，211、JP-A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。

术语“有效量”在本文中定义为根据本发明的脂解酶的下述量，所述量足够对面团和/或烘焙制品的至少一个感兴趣的特性提供可测量的作用。

术语“经改进的特性”在本文中定义为面团和/或得自面团的制品(尤其是烘焙制品)的任何特性，所述特性相对于其中未掺入本发明脂解酶的面团或产物而言被本发明的脂解酶的作用改进。经改进的特性可包括但不限于：提高的面团强度、提高的面团弹性、提高的面团稳定性、降低的面团粘稠度、提高的面团延展性、经改进的面团可加工性、提高的烘焙制品体积、经改进的烘焙制品香味、经改进的烘焙制品的碎屑结构、经改进的烘焙制品的碎屑柔软性、降低的烘焙制品起泡和/或经改进的烘焙制品抗腐性。

可以根据以下实施例中所述的本发明的方法，通过将添加和不添加本发明多肽而制备的面团和/或烘焙制品进行比较，来测定经改进的特性。感觉品质可以使用烘焙工业中明确的流程来评价，并可包括例如使用一组受过训练的口味测试人员(a panel of trained taste-testers)。

术语“提高的面团强度”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团一般具有更具弹性的特性和/或需要更多的劳动输入来用模具成形和造型。

术语“提高的面团弹性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团具有在经受过某些物理张力之后恢复其原始形状的更高趋势。

术语“提高的面团稳定性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团对机械损伤更不敏感，因此更好地维持其形状和体积，并且通过正常和/或延长的醒发后面包块横断面的高度∶宽度比例来评价。

术语“降低的面团粘稠度”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团具有更小的与表面(例如在面团生产机器中)粘附的趋势，并如本领域所已知的，由熟练的测试烘焙者根据经验评价或通过使用纹理分析仪(例如TAXT2)测量。

术语“经改进的面团延展性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团可以接受提高的张力或拉伸而不破裂。

术语“经改进的面团可加工性”在本文中定义为面团的下述特性，所述面团一般更不粘和/或更坚硬和/或更有弹性。

术语“提高的烘焙制品的体积”被测量为通过自动化面包体积分析仪(例如BVM-3，TexVol Instruments AB，Viken，瑞典)测定的给定的面包块的体积，所述测定使用本领域已知的超声或激光检测。

术语“降低的烘焙制品起泡”在本文中定义为目测的烘焙面包外皮上起泡的降低。

术语“经改进的烘焙制品面包屑结构”在本文中定义为烘焙制品的特性，所述烘焙制品的面包屑中具有更精细和/或更薄的细胞壁和/或细胞在面包屑中更均一/均匀的分布，并通常由烘焙者视觉评价或者通过本领域已知的数字成像分析(例如C-cell，Calibre Control International Ltd，Appleton，Warrington，UK)来评价。

术语“经改进的烘焙制品柔软性”是“硬度”的反义词，并在本文中定义为烘焙制品的特性，所述烘焙制品更容易被压缩，并且如本领域已知由熟练的测试烘焙者根据经验评价或通过使用纹理分析仪(例如TAXT2)测量。

术语“经改进的烘焙制品香味”由受过训练的测试组评价。

术语“经改进的烘焙制品抗腐性”在本文中被定义为烘焙制品的特性，所述烘焙制品储存期间具有降低的品质参数(例如柔软度和/或弹性)衰退速率。

术语“经改进的脆性”在本文中定义为烘焙制品的下述特性，所述特性给予比本领域已知的参照制品更脆的感觉，以及将该更脆的感觉维持比参照制品更长的时间。这一特性可以如下定量：使用例如纹理分析仪TA-XT Plus(Stable Micro Systems Ltd，Surrey，UK)在压缩实验中测量力比距离的曲线，并从该压缩曲线获得物理参数，即(i)第一峰的力，(ii)第一峰的距离，(iii)初始斜率，(iv)最高峰的力，(v)曲线下面积，和(vi)断裂事件量(力降低大于某一预定值)。经改进的脆性读数是第一峰的更高力，第一峰的更短距离，更高的初始斜率，更高的最高峰力，更高的曲线下面积和更大的断裂事件数。更脆的制品与参照制品相比时应当在至少两个这些参数上具有统计学显著的更好的评分。在本领域中，“脆性”还涉及脆性、易碎性(crunchiness)或硬性(crustiness)，表示具有松脆、易碎或硬性断裂行为的材料。

本发明提供了具有至少一种选自下组的经改进特性的根据本发明的面团，所述组由面团的提高的强度、提高的弹性、提高的稳定性、降低的粘稠度和/或经改进的延展性组成。

本发明还提供了具有提高的块体积的根据本发明的烘焙制品。本发明同样提供了具有至少一种选自下组的经改进特性的根据本发明的烘焙制品，所述组由提高的体积、经改进的香味、经改进的碎屑结构、经改进的碎屑柔软性、经改进的脆性、降低的起泡和/或经改进的抗腐性组成。

术语“面团”在本文中定义为面粉和其它成分的混合物，所述混合物足够坚硬到被揉捏或滚动。面团可以是新鲜的、冷冻的、预先暴露的(pre-bared)或预先烘焙的。冷冻面团的制备由KuIp and Lorenz在Frozen andRefrigerated Doughs and Batters中描述。

术语“烘焙制品”在本文中定义为从面团制备的、具有软或脆特征的任何制品。可有利地由本发明生产的烘焙制品(无论是白色、浅色或深色类型)的例子为面包(尤其是白面包、全麦面包或裸麦面包)，典型地以棍或卷(loaves or rolls)的形式，法棍面包，糕饼，牛角面包，意大利面，面条(煮或(炒)炸的)，皮塔(pita)面包，玉米饼(tortillas)，墨西哥玉米卷，蛋糕，煎饼，饼干，曲奇，甜甜圈，百吉饼(bagles)，馅饼皮(piecrust)，馒头和脆面包(crisp bread)等等。

本发明的脂解酶和/或本发明方法中要使用的其它酶可以是适用于所述用途的任何形式，例如干粉、凝聚的粉末、颗粒(尤其是无尘颗粒)、液体(尤其是经稳定的液体)或受保护的酶(如WO01/11974和WO02/26044中所述)的形式。可以通过常规方法制备颗粒和凝聚的粉末，例如通过将根据本发明的脂解酶喷雾在流动床颗粒剂上的运载体上。运载体可由颗粒核心组成，所述颗粒核心具有合适的颗粒大小。运载体可以是可溶的或不溶的，例如盐(例如NaCl或硫酸钠)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、米粉、小麦粉、玉米粒、麦芽糖糊精、大豆。根据本发明的脂解酶和/或其它酶可以含在缓释的配方中。用于制备缓释配方的方法是本领域公知的。添加营养学可接受的稳定剂(如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或根据已知方法的其它有机酸)可例如对液体酶制剂加以稳定。

根据本发明的脂解酶也可以被掺入包含酵母的组合物中，如EP-A-0619947、EP-A-0659344和WO02/49441中公开的组合物。

对于包含在面粉的预先混合物中而言，根据本发明的多肽是干燥制品(例如无尘颗粒)是有利的，而对于与液体一起被包含而言，液体形式是有利的。

也可以向面团中掺入一种或多种其它酶。因此，本发明提供了包含根据本发明的脂解酶和一种或多种其它酶的烘焙酶组合物。所述其它酶可以是任何来源，包括哺乳动物和植物来源，优选地为微生物(细菌、酵母或真菌)来源，并可通过本领域常用技术获得。

在一个优选的实施方案中，其它酶可以是淀粉酶如α-淀粉酶(适用于提供可被酵母发酵的糖并延缓腐败)，β-淀粉酶，麦芽糖淀粉酶或非麦芽糖淀粉酶，环糊精葡萄糖转位酶，蛋白酶，肽酶尤其是外肽酶(适用于增强香味)、转谷氨酰胺酶，脂肪酶(适用于修饰面团或面团组分中存在的脂质从而软化面团)，半乳糖脂肪酶，磷脂酶，纤维素酶，半纤维素酶，尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(适用于戊聚糖、更特定地是阿拉伯木聚糖的部分水解，这提高面团的延展性)，蛋白酶(适用于削弱谷蛋白，尤其是使用硬小麦粉时)，蛋白质二硫化物异构酶，例如WO 95/00636中公开的蛋白质二硫化物异构酶，糖基转移酶，过氧化物酶(适用于改进面团的稠度)，漆酶，氧化酶，己糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，醛糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，脂肪氧化酶或L-氨基酸氧化酶(适用于改进面团的稠度)。

当根据本发明的方法要添加一种或多种其它酶添加剂时，这些添加剂可以单独地或与根据本发明的多肽一起，任选地作为面包改进和/或面团改进组合物的组分被添加。其它酶活性可以是上述的任何酶，并可以根据已确立的烘焙实践确定剂量。

本发明还涉及用于制备烘焙制品的方法，包括烘焙通过本发明方法获得的面团，以生产烘焙制品。烘培面团以生产烘培制品可以通过本领域公知的方法进行。在本发明的一个实施方案中，使用本发明的脂解酶制备层压面团(laminated dough)，用于具有经改进的脆性的烘焙制品。

本发明还涉及分别通过本发明的方法生产的面团和烘焙制品。

本发明还涉及用于面团和/或由面团制成的烘焙制品的预混合物(例如为面粉组合物形式)，其中所述预混合物包含本发明的多肽。术语“预混合物”在本文定义为以其常规含义理解，即作为烘焙剂的混合物，一般包含面粉，其不仅可用于工业面包烘焙工厂/设施、而且也可用于零售面包房。可以通过将本发明的多肽或包含多肽的本发明的面包改进和/或面团改进组合物与合适的运载体(如面粉、淀粉、糖或盐)混合来制备预混合物。预混合物可含有其它面团改进和/或面包改进添加剂，例如包括上述酶的任何添加剂。

本发明还涉及颗粒或凝聚粉末形式的烘焙添加剂，所述添加剂包含本发明的多肽。烘焙添加剂优选地具有狭窄的颗粒大小分布，多于95％(按重量计)的颗粒在25到500μm的范围内。

在面团和面包制造中，本发明可与前文定义的加工助剂组合使用，所述加工助剂如化学加工助剂，如氧化剂(例如抗坏血酸)、还原剂(例如L-半胱氨酸)、和/或乳化剂(例如DATEM、SSL和/或CSL)和/或乳化剂的任何前体，其可以是本发明的脂解酶的底物，和/或酶加工助剂如氧化还原酶(例如葡萄糖氧化酶)、多糖修饰酶(例如α-淀粉酶、半纤维素酶、分支酶等)和/或蛋白质修饰酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等)。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的脂解酶可被用于完全或部分代替面团乳化剂DATEM。

在另一实施方案中，本发明提供了包含本发明脂解酶和DATEM的烘焙组合物。DATEM是甘油单酯和甘油二酯的二乙酰基酒石酸酯的首字母缩写。DATEM中的主要组分之一可以是1-硬脂酰-3-二乙酰基酒石酰基-甘油。在一个优选的实施方案中，烘焙组合物包含DATEM和选自L01、L02、L03和L04的根据本发明的脂解酶。优选地，脂解酶是L01或L02。惊讶地发现包含本发明脂解酶和DATEM的烘焙组合物对使用所述组合物制造的面团和/或可通过烘焙所述面团获得的烘焙制品具有协同效应。协同效应可以通过制造面团或烘焙制品，其中单独或组合地添加DATEM或本发明脂解酶来测量。可以比较在一方面使用烘焙组合物，在另一方面各自以双倍剂量单独使用DATEM或单独使用脂解酶，对面团或烘焙制品的至少一种特性所产生的影响。在组合的效果比以双倍剂量单独使用DATEM和以双倍剂量单独使用脂解酶所产生的两种效果更好时，存在协同作用。协同作用可以通过例如经改进的生面团稳定性、经改进的烘箱开裂(oven spring)、经改进的碎屑结构、经改进的碎屑颜色、经改进的烘焙制品体积来显示。例如，在例如通过使用包含0.15％w/w(以面粉为基础)DATEM和0.12ppm脂解酶(即每kg面粉0.12mg Bradford蛋白质的脂解酶)的组合物制造的面团的稳定性比单独使用0.3％w/w DATEM制造的面团稳定性更好，并且比单独使用0.24ppm脂解酶制造的面团的稳定性更好时，存在协同效益。

技术人员能够容易地确定要在根据本发明的烘焙组合物中使用的合适的脂解酶和DATEM量。可以首先确定DATEM或脂解酶各自的最适量，从而在与既不添加DATEM又不添加脂解酶而获得的面团或烘焙制品的特性相比时面团或用所述面团生产的烘焙制品的一种或多种特性被改进。然后可以在组合物中使用每种制品的30％到50％w/w的最适量，并且技术人员能够通过常规实验验证在组合物中使用何种DATEM和脂解酶比例时观察到协同效应。

在本发明的另一优选的实施方案中，包含DATEM和根据本发明的脂解酶的烘焙组合物在生产本发明的面团或烘焙制品的方法中使用。

根据本发明的烘焙组合物除根据本发明的脂解酶以外，可包含一种或多种用于烘焙中的加工助剂，如上文提到的那些，和/或一种或多种上述额外的酶。包含DATEM和根据本发明的脂解酶的烘焙组合物可以是适合在烘焙中使用的任何形式，如固体或液体形式。固体形式的组合物可以例如是粉末或颗粒。液体组合物可以例如是基于水或油的组合物，并任选地可以被稳定化。包含根据本发明的脂解酶和DATEM的烘焙组合物也可以是上文定义的预混物的部分。包含根据本发明的脂解酶和DATEM的烘焙组合物可以原样添加至用于制备面团的面粉。任选地，可以通过以适当量单独地对面团成分添加根据本发明的脂解酶和DATEM，在面团中脂解形成所述烘焙组合物。

在另一实施方案中，根据本发明的脂解酶可用于生产蛋糕，和用于生产可产生蛋糕的牛奶鸡蛋面糊(batter)。

根据本发明的脂解酶可用于任何类型的蛋糕中，包括缩短的蛋糕，如例如磅蛋糕(pound cake)和黄油蛋糕，并且包括泡沫蛋糕(foamcake)，如例如蛋白霜(meringues)、海绵蛋糕、饼干蛋糕(biscuitcake)、蛋糕卷(roulade)、杰诺瓦士蛋糕(genoise)和槭风蛋糕(chiffon cake)。海绵蛋糕是以小麦粉、糖、烘焙粉和蛋(和任选地烘焙粉)为基础的一种软蛋糕。存在的唯一脂肪来自于蛋黄，其有时与蛋白分开添加。蛋黄通常被用作其它类型蛋糕和甜点的基础。磅蛋糕传统上用面粉、黄油、蛋和糖各一磅制备，任选地补充烘焙粉。在槭风蛋糕中，黄油/人造黄油已用油代替。与磅蛋糕或海绵蛋糕相比，糖和蛋黄含量已经降低，并且蛋白含量提高。

根据本发明的脂解酶可用于常规蛋糕中，以及其中蛋和/或脂肪量降低的蛋糕中。蛋和/或脂肪量的降低可能对每种蛋糕而言不同。本领域技术人员已知通常存在于蛋糕配方中并且依赖于蛋糕类型的蛋和/或脂肪量。通常，可以达到至少5％w/w的蛋量减少。更优选地，可以实现至少10％w/w的蛋量减少，进一步更优选地可以实现至少15％w/w的减少。显示甚至可以实现使用的蛋量的至少20％w/w的减少。蛋量的减少可至少为30％w/w、40％w/w或甚至至少50％w/w。

通常，可以实现至少10％的脂肪量减少。更优选地，可以实现至少20％的脂肪量减少，进一步更优选地，可以实现至少30％的脂肪量减少。显示甚至可以实现至少50％的使用的脂肪量减少。

在国际专利申请号PCT/EP2008/051147中，公开了可以在蛋糕的生产中使用磷脂酶A来改进至少一种选自下组的特性，所述组由(i)牛奶鸡蛋面糊粘度、(ii)比重、(iii)初始碎屑柔软性、(iv)碎屑孔均匀性、(v)碎屑孔直径、(vi)储存后的碎屑柔软性、(vii)保质期和/或(viii)蛋糕体积组成。在相同申请中还公开了磷脂酶可用于蛋糕的生产中，使得能够减少蛋糕配方中使用的蛋和/或脂肪的量。具体地，显示使用磷脂酶A时可能减少配方中使用的蛋和/或脂肪的量，同时维持至少一种选自下组的特性，所述组由：(i)牛奶鸡蛋面糊粘度、(ii)比重、(iii)初始碎屑柔软性、(iv)碎屑孔均匀性、(v)碎屑孔直径、(vi)储存后的碎屑柔软性、(vii)保质期和/或(viii)蛋糕体积组成。术语至少维持在本文中用于表示一种特性被维持或改进。

目前已经发现，至少包含磷脂酶A和根据本发明的脂解酶的组合物可在蛋糕的生产中用于改进至少一种选自下组的特性，所述组由：(i)牛奶鸡蛋面糊粘度、(ii)比重、(iii)初始碎屑柔软性、(iv)碎屑孔均匀性、(v)碎屑孔直径、(vi)储存后的碎屑柔软性、(vii)保质期和/或(viii)蛋糕体积组成。还发现至少包含磷脂酶A和根据本发明的脂解酶的组合物可在蛋糕的生产中用于减少配方中使用的蛋和/或脂肪的量，优选地同时维持至少一种选自下组的特性，所述组由：(i)牛奶鸡蛋面糊粘度、(ii)比重、(iii)初始碎屑柔软性、(iv)碎屑孔均匀性、(v)碎屑孔直径、(vi)储存后的碎屑柔软性、(vii)保质期和/或(viii)蛋糕体积组成。具体地，在蛋糕配方中蛋和/或脂肪量减少的蛋糕中，或包含常规蛋和/或脂肪量的蛋糕中，使用至少包含磷脂酶A和根据本发明的脂解酶的组合物时，与单独使用磷脂酶A相比可进一步改进一种或多种上述特性。

在本文上下文中可以使用所有种类磷脂酶A，例如磷脂酶A1或磷脂酶A2。可以使用任何种类的磷脂酶A1。磷脂酶A1广泛分布于自然中，例如微生物E.coli中、蛇毒液中和哺乳动物脑、睾丸和肝中。合适的可商业获得的磷脂酶A1的一个例子是Lecitase Ultra^TM(Novozymes)。可以使用任何类型的磷脂酶A2。优选地使用磷脂酶A2。合适的可商业获得的磷脂酶A2的一个例子是Cakezyme^TM(DSM)或Lecitase 10L(Novozymes)。一种优选的磷脂酶A2是例如在Aspergillus niger中表达的猪胰腺磷脂酶A2(Cakezyme^TM，DSM)。

测量一种特性是否被维持、改进或削弱通常如下测量：按照不含任何磷脂酶A和任何根据本发明的脂解酶的原始配方制备牛奶鸡蛋面糊和/或蛋糕，和按照含有磷脂酶A、任选地含有更少蛋和/或脂肪和任选地含有根据本发明的脂解酶的配方制备其它牛奶鸡蛋面糊和/或蛋糕，并比较某些特性。在要比较的两种牛奶鸡蛋面糊或蛋糕的特性基本相同的情况下，所述特性被维持，在它们差异的情况下发生改进或削弱。对所有提到的特性而言，下文给出了测量方法以及一种特性可以被认为经改进的指征。

可以通过根据国际谷物化学协会(ICC)和美国谷物化学协会(AACC 54-2，ICC 115)的标准方法用Farinograph测量牛奶鸡蛋面糊粘度。相对于相同但是包含单独的磷脂酶A或既不包含磷脂酶A也不包含脂解酶的牛奶鸡蛋面糊而言，用减少的蛋和/或脂肪量制成并包含磷脂酶和本发明脂解酶的牛奶鸡蛋面糊的粘度是否被改进或削弱可以例如如下测量。在含有减少的蛋和/或脂肪量的牛奶鸡蛋面糊并用磷脂酶A和本发明脂解酶制备的牛奶鸡蛋面糊的粘度与例如相同但是不用磷脂酶A和不用脂解酶制备的牛奶鸡蛋面糊的粘度相同时，或与例如仅用磷脂酶A制备的相同牛奶鸡蛋面糊的粘度相同时，所述牛奶鸡蛋面糊粘度被维持。在牛奶鸡蛋面糊粘度提高的情况下，其被改进。

牛奶鸡蛋面糊比重可以通过称重预定体积的牛奶鸡蛋面糊来测量。如果其降低则其比重被改进。

蛋糕的碎屑柔软性由熟练的测试烘焙者凭经验评价或者使用本领域已知的纹理分析仪(TAXT)测量。实际上，如本领域技术人员所已知地测量蛋糕的碎屑硬度。在烘焙后24小时内测量的碎屑柔软性称作初始碎屑柔软性。烘焙后大于24小时的碎屑柔软性称作储存后碎屑柔软性，并且也是用于测定保质期的度量。初始碎屑柔软性提高的情况下，其被改进。在储存后碎屑柔软性提高的情况下，其被改进。

蛋糕的碎屑孔均匀性可以由熟练的测试烘焙者凭经验评价或者通过本领域已知的数字成像分析(例如C-cell，Calibre Control International Ltd，Appleton，Warrington，UK)来评价。当孔尺寸偏差小时，碎屑被称作更加均匀。当孔径偏差变得更小时，该特性被改进。

蛋糕的碎屑孔直径可以使用本领域已知的数字成像分析(例如C-cell，Calibre Control International Ltd，Appleton，Warrington，UK)来评价。当平均碎屑孔直径降低时，所述特性被改进。优选地，同时维持相同蛋糕体积时尤其是这样。

蛋糕的保质期可以通过测定蛋糕随时间的回弹来测量。如本领域技术人员所已知的，这是测量碎屑柔软性的方法的一部分，从而也可以使用本领域已知的纹理分析仪(例如TAXT2)来测量蛋糕的松弛。

可以使用本领域已知的超声或激光检测，通过自动化面包体积分析仪(例如BVM-3，TexVol Instruments AB，Viken，瑞典)测定给定蛋糕的体积。体积增加时特性被改进。或者相同尺寸罐中烘焙后的蛋糕高度是蛋糕体积的指征。蛋糕高度增加时蛋糕体积增加。

可以通过测定蛋糕高度和视觉分析蛋糕结构来测定牛奶鸡蛋面糊的乳液稳定性。蛋糕高度降低时牛奶鸡蛋面糊的乳液稳定性降低。蛋糕结构更密时牛奶鸡蛋面糊的乳液稳定性降低。

已经发现，例如在常规海绵蛋糕或含有减少的蛋量的海绵蛋糕中添加包含磷脂酶A和根据本发明的脂解酶时，与其中可仅使用磷脂酶A或者不使用磷脂酶A也不使用本发明脂解酶的相同蛋糕或牛奶鸡蛋面糊相比，可以至少观察到一种或多种以下特性，例如牛奶鸡蛋面糊经改进的乳液稳定性，牛奶鸡蛋面糊的更有效的乳化，蛋糕的经改进的弹性，蛋糕的经改进的碎屑柔软性，牛奶鸡蛋面糊的经改进的体积。

因此本发明提供了包含本发明脂解酶和磷脂酶A的组合物在蛋糕生产中用于改进至少一种选自下组的特性的用途，所述组由：(i)牛奶鸡蛋面糊粘度、(ii)比重、(iii)初始碎屑柔软性、(iv)碎屑孔均匀性、(v)碎屑孔直径、(vi)储存后的碎屑柔软性、(vii)保质期和/或(viii)蛋糕体积组成。本发明还提供了包含本发明脂解酶和磷脂酶A的组合物在蛋糕的生产中使得能够减少蛋糕配方中使用的蛋和/或脂肪量，优选地同时维持至少一种选自下组的特性的用途，所述组由：(i)牛奶鸡蛋面糊粘度、(ii)比重、(iii)初始碎屑柔软性、(iv)碎屑孔均匀性、(v)碎屑孔直径、(vi)储存后的碎屑柔软性、(vii)保质期和/或(viii)蛋糕体积组成。

技术人员能够取决于蛋糕配方和类型，容易地分别确定组合物中要使用的磷脂酶A和本发明脂解酶的合适量。

任选地，组合物中除磷脂酶A和本发明的脂解酶以外，可存在一种或多种其它成分，例如用于允许减少蛋糕中的蛋和/或脂肪，如例如替代性蛋白质来源、水胶体、改性淀粉、酵母提取物、钙。优选的成分是酵母提取物、改性淀粉、钙。

可使用下述酵母提取物，其包含以无氯化钠干重为基础至少30％w/w的5’-核糖核苷酸，优选地至少34％w/w、38％w/w、40％w/w或42％w/w，更优选地至少44％w/w、46％w/w、48％w/w或至少50％w/w的5’-核糖核苷酸。已发现使用这类酵母提取物不仅改进蛋糕的口味，而且也具有惊人的乳化作用，因为在其使用后牛奶鸡蛋面糊的粘度提高。

在本发明的上下文中，短语“5’-核糖核苷酸”是指在RNA降解期间形成的5’-单磷酸核糖核苷酸，即5’-单磷酸鸟嘌呤(5’-GMP)、5’-单磷酸尿嘧啶(5’-UMP)、5’-单磷酸胞嘧啶(5’-CMP)、5’-单磷酸腺嘌呤(5’-AMP)的总量，其中5’-AMP可被部分或全部转化为5’-单磷酸肌苷(5’-IMP)。例如，在包含以无氯化钠干物质为基础30％w/w 5’-核糖核苷酸的酵母提取物中，5’-GMP、5’-UMP、5’-CMP、5’-AMP和5’-IMP的总量以无氯化钠干物质为基础为30％w/w。在一个优选的实施方案中使用下述酵母提取物，其中5’-GMP加5’-IMP的总量以无氯化钠干物质为基础至少为15％w/w，优选地至少为17％w/w、19％w/w、20％w/w或21％w/w，更优选地至少为22％w/w、23％w/w、24％w/w或25％w/w。由于产生5’-核糖核苷酸的RNA的结构特点，该实施方案中5’-GMP和5’-IMP会始终以大致相等的量存在。在本发明的上下文中，除非另有说明，5’-核糖核苷酸的重量百分比计算以其二钠盐七水合物为基础。所有的百分比基于无氯化钠的干物质(sfdm)计算。在本发明中，短语“无氯化钠的干物质(sfdm)”是指下述事实：对重量百分比计算而言，从组合物中排除酵母提取物中存在的任何氯化钠的重量。可通过本领域技术人员已知的方法进行酵母提取物中氯化钠的测量和上述计算。包含40％w/w 5’-核糖核苷酸(其中20％w/w是5’-GMP加5’-IMP，重量百分比以无氯化钠的酵母提取物干物质为基础)的酵母提取物的一个例子以商标Delite(DSM Food Specialties，荷兰)出售。

可以使用改性淀粉甚至进一步减少蛋糕配方中使用的脂肪量。可以使用所有类型的改性淀粉，例如改性马铃薯淀粉或改性小麦淀粉。优选地使用如例如US 6,864,063中公开的改性马铃薯淀粉。最优选地使用通过用淀粉麦芽糖酶处理马铃薯淀粉获得的改性的马铃薯淀粉。优选的马铃薯淀粉的一个例子以商标(Avebe Food)出售。已经惊讶地发现在包含减少的脂肪量(例如低至30％w/w)并且使用磷脂酶A、本发明脂解酶和改性马铃薯淀粉的组合制备的蛋糕中，与通过使用30％w/w更少脂肪并且不添加磷脂酶、脂解酶和改性马铃薯淀粉来生产的蛋糕相比，如上文所述的期望的蛋糕特性(例如牛奶鸡蛋面糊粘度)被改进。

优选地添加钙来增强磷脂酶A的活性。已经发现对蛋糕配方添加每5,000CPU磷脂酶A(下文表示为PLA)约40-200mg CaCl₂.H₂O是特别有利的。优选地，对蛋糕配方添加每5,000CPU PLA在50和150mg之间CaCl₂.H₂O，最优选地每5,000CPU PLA至少90mg CaCl₂.H₂O。CPU(生色磷脂酶单位＝1EYU(蛋黄单位))在本文中被定义为40℃和pH 8.0下从蛋黄中每分钟释放1μmol酸的酶量。该方法中的底物：外消旋1，2-二辛酰二硫代磷脂酰胆碱，在405nm处分光光度计测量。已惊讶地发现蛋糕牛奶鸡蛋面糊不提供磷脂酶A有效工作所需的足够钙。本发明还提供了制备牛奶鸡蛋面糊的方法或制备蛋糕的方法，其中对蛋糕成分添加包含磷脂酶A和本发明脂解酶的组合物。

蛋糕的典型成分是小麦粉、蛋和糖。任选地，添加烘焙粉、盐、水、乳化剂(例如PEG和甘油单酯)、人造黄油、黄油和/或油(例如对磅蛋糕和玛芬而言)。

制备根据本发明的牛奶鸡蛋面糊的方法优选地包括步骤：

a.通过添加至少：

i.糖

ii.面粉

iii.磷脂酶A、根据本发明的脂解酶和蛋

来制备蛋糕的牛奶鸡蛋面糊。

制备根据本发明的蛋糕的方法还包括步骤：

b.烘焙所述牛奶鸡蛋面糊得到蛋糕。

根据上述方法，可以制备包含减少的蛋和/或脂肪量的蛋糕，以及不应用蛋和/或脂肪减少的蛋糕。

本领域技术人员已知如何从蛋糕成分开始制备牛奶鸡蛋面糊或蛋糕。任选地，组合物中可存在一种或多种其它成分，例如以允许减少蛋糕中的蛋和/或脂肪，例如蛋白质来源、水胶体、酵母提取物、改性淀粉、钙。优选的成分是上文定义的酵母提取物、改性淀粉、钙。

本发明还提供了能够通过上述方法获得的蛋糕或牛奶鸡蛋面糊，本发明还提供了可例如用于蛋糕或牛奶鸡蛋面糊生产中的烘焙组合物，其包含磷脂酶A和根据本发明的脂解酶。该烘焙组合物也可以用于面团制品和从这类面团获得的烘焙制品中。例如，其可以在还含有蛋的面团制品中和从其中衍生的烘焙制品(如奶油蛋卷(brioche)和潘那多尼(panettone))中使用，无论是常规的还是具有减少的蛋量。

所述烘焙组合物也可以是还包含面粉和任选地其它成分的蛋糕预混物的一部分。

根据本发明的脂解酶的上述工业应用仅包含少量例子，并且该列表不意图限制。

脂解酶可便利地在微生物中生产。在上述方法中，使用通过重组DNA技术获得的脂解酶是有利的。重组酶的生产可以具有低成本价格、高产量、无污染物质如细菌或病毒也无细菌毒素或污染性的其它酶活性。

下文中通过以下非限制性实施例阐述本发明。

实施例

实施例1

生产本发明的脂肪酶

如下获得由本文提供的核苷酸序列SEQ ID NO：1(DNA L01)、SEQ IDNO：3(DNA L02)、SEQ ID NO：5(DNA L03)、SEQ ID NO：7(DNA L04)编码的脂解酶L01、L02、L03、L04：构建含有所述DNA序列的表达质粒，用这类质粒转化Aspergillus niger菌株，并以下文的方式培养所述A.niger菌株。

将A.niger菌株的新鲜孢子(10⁶-10⁷)接种在20ml CSL-培养基(100ml烧瓶，挡板)中，并在34℃和170rpm下培养20-24小时。在100mlCSM培养基(500ml烧瓶，挡板)中接种5-10ml CSL预培养物后，将菌株在34℃和170rpm下发酵3-5天。

通过将发酵液在4℃下以5000xg离心获得无细胞的上清液。将无细胞上清液储存于-20℃下，直至使用。任选地可以将所述上清液在GF/AWhatmann玻璃微纤维滤器(150mm)上进一步过滤，以去除更大的颗粒。需要时，用4N KOH将上清液的pH调节至pH 5并在带有抽吸的0.2μm(瓶口)滤器上无菌过滤，以去除真菌材料。

CSL培养基由以下组成(以每升用量计)：100g玉米浸渍固体(Roquette)、1g NaH₂PO4*H₂O、0.5g MgSO₄*7H₂O、10g葡萄糖*H₂O和0.25g Basildon(消泡剂)。将所述成分溶于去矿物质水(demi-water)中，并用NaOH或H₂SO₄将pH调节至pH 5.8，用20ml发酵液填充具有挡板和起泡球的100ml烧瓶，在120℃下灭菌20分钟，之后在冷却至室温后向每个烧瓶中添加200μl含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的无菌溶液。

CSM培养基由以下物质组成(以每升用量计)：150g麦芽糖*H2O、60g Soytone(胨)、1g NaH₂PO4*H₂O、15g MgSO₄*7H₂O、0.08g Tween80、0.02g Basildon(消泡剂)、20g MES、1g L-精氨酸。将所述成分溶于去矿物质水中，并用NaOH或H₂SO₄将pH调节至pH 6.2；用100ml发酵液填充具有挡板和起泡球的500ml烧瓶，在120℃下灭菌20分钟，之后在冷却至室温后向每个烧瓶中添加1ml含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的无菌溶液。

实施例2

纯化本发明的脂解酶

将实施例1中获得的冷冻无细胞上清液解冻后，在4℃下彻底离心上清液，以去除任何固体。为了去除低分子量污染物，使用装有10kDa截断滤器的Millipore Labscale TFF系统对上清液进行超滤。将样品用40ml体积冷的100mM磷酸盐缓冲液pH 6.0(包括0.5mM CaCl₂)洗涤3-5次。酶溶液的最终体积为30ml，并且被进一步称作“超滤液”。

为了进一步纯化，可以将超滤液应用在MonoQ阴离子交换柱上。在20倍柱体积中将盐梯度设为1M NaCL。缓冲液是70mM Bis-TRIS和50mM TRIS的混合物。用0.1M HCl设定pH。惊讶地观察到在pH＝9时进行纯化时获得最好的结果，其中脂肪酶在35mS/cm的电导率下洗脱。

使用Bradford方法(The Protein Protocols Handbook，2^nd edition，Editedby J.M.Walker，Humana Press Inc，Totowa 2002，p15-21)测定样品的总蛋白质含量。

通过A280和HPSEC测定脂解酶浓度

或者，可以从脂解酶造成的280nm(A280)处的消光和所计算的脂解酶分子消光系数来计算脂解酶的浓度。A280的测量在Uvikon XLSecomam分光光度计(Beun de Ronde，Abcoude，荷兰)中进行。

酶的分子消光系数可以从每个酶分子的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基数来计算(S.C.Gill and P.H.von Hippel，Anal.Biochem.182，319-326(1989))。这些氨基酸的分子消光系数分别为1280、5690和120M^-1.cm^- ¹。本发明脂解酶中的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基可演绎自下述蛋白质序列，所述蛋白质序列选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8组成的组。针对包含氨基酸34-304的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8进行计算。由上述多核苷酸序列编码的脂解酶的摩尔消光系数是35560M^-1.cm^-1，对1mg/ml而言应于1.25cm^-1的280nm下的OD。计算出的成熟多肽的分子量对脂肪酶L01、L04、L03和L02而言分别为28.4、28.3、28.4、28.5kD，仅考虑氨基酸34-304。

脂解酶造成的280nm(A280)下的超滤液消光取决于酶样品的纯度。可以使用带有TSK SW-XL柱(300*7,8mm；MW范围10-300kDa)的HP-SEC(高效尺寸排除色谱)测定该特异性脂肪酶含量。洗脱缓冲液由25mM磷酸钠缓冲液pH 6.0组成，并以1ml/分钟的流速使用。注射5-100μl样品。测量280nm下的吸光度。

从色谱图中相应脂解酶峰的峰表面与280nm处吸收峰的总表面的比值，获得本发明脂解酶造成的A280。然后通过用样品的A280乘以上述比例并除以针对脂解酶计算的消光系数，来计算脂解酶浓度。

实施例3

测定法

通过使用发色底物对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP，Sigma N-2752)，用分光光度计测定脂肪酶活性。在该测定法中，将pNPP溶于2-丙醇(每10ml 2-丙醇40mg pNPP(Merck 1.09634))中，并悬浮于含1.0％Triton X-100(Merck 1.12298)的100mM乙酸盐缓冲液pH＝5.0中(45ml缓冲液中5ml底物)。最终的底物浓度是1.1mM。将脂肪酶与该底物在37℃下孵育10分钟。通过添加相对于反应混合物比例为1∶1的终止缓冲液2％TRIS(Merck 1.08387)+1％Triton X-100来终止反应，随后在405nm处测量形成的对硝基苯酚(pNP)。也可以在不同的pH值下应用该测定法，从而测定脂肪酶的pH依赖性。应当理解在不同的pH值下可能需要不同的缓冲液，或者可能需要不同的去污剂来乳化底物。一个脂肪酶单位被定义为在所述反应条件下每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚的酶量。应当理解在常规分析中以下是罕见的实践：使用具有在不同测定法中测定的已知活性的标准校准酶溶液，将给定测定法的活性与在校准测定法中将要测定的单位相关联。

或者，可以通过使用2，3-巯基-1-丙醇-三丁酸酯(TBDMP)作为底物来测定脂肪酶活性。脂肪酶水解TBDMP的硫酯键，从而释放丁酸和2，3-巯基-1-丙醇-二丁酸酯、2，3-巯基-1-丙醇-单丁酸酯或2，3-巯基-1-丙醇。在随后与4，4，-二硫代二吡啶(DTDP)的反应中滴定释放的硫醇基，形成4-硫代吡啶酮。后者处于和4-巯基吡啶的互变异构平衡中，所述4-巯基吡啶在334nm处吸收。反应在含0.2％Triton-X100、0.65mM TBDMP和0.2mMDTDP的0.1M乙酸盐缓冲液pH 5.0中于37℃下进行。一个脂肪酶单位被定义为在所述反应条件下每分钟释放1微摩尔4-硫代吡啶酮的酶量。

除了分光光度计测量以外，也可以使用滴定分析测量测定脂肪酶活性。例如，可以根据Food Chemical Codex，Forth Edition，National AcademyPress，1996，p803，在作为底物的三丁酸甘油酯上测量脂解酶的酯酶活性。

活性测量

表1：如实施例1中制备的无细胞上清液中的脂解酶活性(脂肪酶活性使用对硝基苯基棕榈酸酯作为底物在pH 5下测定。脂肪酶活性作为单位/mg总Bradford蛋白质给出)。

还应当注意，在该测定法中仅存在单一底物，并且活性数量不预示作为面包面团的底物混合物中的真实活性。

蛋白质表征

表2：生物化学特性脂肪酶L01、L02、L03、L04

用NuPage 4-12％MES Simply Blue Safe Stain在超滤液样品上进行SDS-PAGE分子量估计。为了对蛋白质去糖基化，用PNGase-F(ocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国)处理蛋白质样品。随后对经处理和未经处理的样品均进行SDS-PAGE凝胶电泳。糖蛋白的表征和操作详尽描述于The Protein Protocols Handbook，2^nd edition，Edited by J.M.Walker，Humana Press Inc，Totowa 2002，chapter VI中。

通过等电位聚焦凝胶电泳，与含有pI范围从3.5到10.7的标记物蛋白质的IEF Marker 3-10(erva Electrophoresis GmbH，Heidelberg，德国)相比，测定等电点(pI)。需要时可以通过例如使用蛋白质脱盐离心柱(产品编号89849，Pierce，Rockford，USA)，如制造商所述对样品脱盐。然后用IEF Sample Buffer pH 3-10将样品1∶1稀释，并使用针对IEF凝胶(Invitrogen Carlsbad，USA)的Xcell SureLockTM Mini-Cell电泳系统，如制造商所述进行等电位聚焦凝胶电泳。电泳后用12.5％TCA固定凝胶，洗涤并用SimplyBlue^TM SafeStain(Invitrogen，Carlsbad，USA)染色。

通过质谱法(MS)测定L01的分子量

在MW分析之前对脂肪酶L01去糖基化。去糖基化之前进行TCA沉淀。通过将样品1∶1稀释于20％TCA中进行TCA沉淀。将样品在4℃下孵育4小时。通过在4℃下以13000rpm离心10分钟使蛋白质沉淀。用-20℃丙酮洗涤沉淀物，再在4℃下以13000rpm离心10分钟。将该洗涤步骤重复三次。将沉淀物悬浮于100mM NH4HCO3中，并使用N-糖苷酶F(PNGase-F，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)在37℃下过夜进行去糖基化。使用10kDa截断离心装置(Pall)，通过超滤去除释放的糖链。

通过MS分析经去糖基化的脂肪酶L01。将样品直接灌注在LTQ-Orbitrap MS(Thermo)上。六个不同的蛋白质质量可以被计算为在28和29kDa之间。这些蛋白质质量、相应的脂肪酶L01残基和它们与丰度最大形式相比的相对丰度展示于表1中。

表3：计算出的去糖基化脂肪酶L01的完整质量。相对丰度与28435.7Da的最大丰度形式(设为100％)比较。

分子量(Da)	相对丰度(％)	L01的残基
			28435.7	100	34-304
28250.6	61	34-303-W C-端
			28707.8	32	31-304+AVT N-端
28520.7	28	31-303-W&+AVT
			28912.9	21	34-307+RRY C-端
28163.5	19	34-302-SW C-端
			29185.1	17	31-307+AVT&+RRY

分子量的小差异表明使用SDS PAGE时，这些形式会作为28-29kD处的单一条带被观察到。N-端和C-端均显示异质性，这可能由降低的加工特异性或初始成熟后生产过程中的进一步蛋白水解降解引起。因为去糖基化的脂肪酶L02、L03、L04在SDS-PAGE上显示最终被鉴定为L01迁移率的迁移率，所以得出结论：L02、L03和L04经历了与针对L01所观察到的相似的翻译后加工。

pH最适度

可以通过进行下述测定法来测定脂解酶的pH最适度依赖性，所述测定法在不同pH值下测量某一类型的脂解活性。观察到最大活性的pH是该具体酶的pH最适度。因为pH最适度可取决于底物类型和应用的测定条件，因此使用不同底物时或测定条件大幅改变时应当重新测定(reastablished)。

在磷酸盐缓冲液中于37℃下使用对硝基苯基棕榈酸酯作为底物时，L01具有6.5-9.5的宽pH最适度。

实施例4

乳制品应用-根据本发明的脂肪酶在乳酪样系统中产生的游离脂肪酸谱比较了用Cheddar乳酪孵育后根据本发明的L01、L03和L04多肽产生的FFA谱，和微生物脂肪酶(R8000，来自Rhizomucormiehei的微生物脂肪酶，来自DSM Food Specialties，荷兰)(本文中缩写为PicR8000)的FFA谱。作为黄金标准的Parmesan乳酪的FFA取自D.T.Lai，A.D.Mackenzie，C.J.O’Connor，K.W.Turner J.Dairy Sci.80：2249-2257(1997)，第2255页(本文中缩写为ParmChees)。在所有实验中，用水而不是脂肪酶孵育的Cheddar乳酪的FFA谱被用作阴性对照或空白，并且与从文献M.V.Arbige，P.R.Freund，S.C.Silver，J.T.Zelko，Food Technology1986，第91-98页已知的Cheddar乳酪的FFA谱差异不大。

通过磨碎并与水混合至46.4％w/w的最终水分含量(以干物质计脂肪含量为49.3％w/w)，从初期Cheddar乳酪(即熟化时间短于2周)制备Cheddar乳酪糊。将Cheddar乳酪糊在+80℃下巴氏消毒5分钟，分成小份并储存于+4℃，直至在该实验中用作脂解酶的底物。

将每种测试的脂肪酶(水溶液)添加至Cheddar乳酪糊温热的+40℃部分中，彻底混合并在+40℃下孵育1和4天。选择脂肪酶剂量，从而在Cheddar乳酪糊中得到5-25％.之间的脂肪转化率。为了终止Cheddar乳酪糊中的脂解活性，将样品立即冷冻于-20℃下，并冷冻储存直至分析。

用其FFA谱分析所有样品。Cheddar乳酪糊中释放的FFA的测定根据本领域描述的标准方法进行(Jong C.，de and Badings H.T.J.HighResolution Chromatography，13：84-98(1990))。简言之，从样品中萃取未反应的脂肪和FFA后，通过固相萃取方法分离每种FFA，并通过气相色谱在毛细管柱上分析经分离的FFA。通过将停留时间与含有相同FFA的标准混合物进行比较，鉴定色谱图上的峰值。使用添加至样品的内标，从个体FFA的峰面积计算多种样品中的FFA含量(进行检测器应答和萃取产率的校正)。

游离脂肪酸含量以mg每种游离脂肪酸/kg Cheddar乳酪糊为单位测量，还使用FFA的分子量以mmol/kg Cheddar乳酪糊为单位重新计算。

因此，使用以mmol/kg为单位给出的游离脂肪酸谱计算每种样品中的脂肪转化百分比，来验证其包括在5-25％之间。使用与水孵育的Cheddar乳酪糊的空白测量的FFA谱，针对背景进行校正，来测定脂肪转化程度。

因此，如说明书中所述测定每种样品中的脂肪转化程度，并且推测Cheddar乳酪糊含有1.19mol/kg的脂肪酸总量。

[1]

使用式[1]计算每种样品的D并将结果概括于表4中。

表4：转化程度

脂肪酶	1天D％	4天D％
			L01	14.8	15.8
L03	21.0	22.5
			L04	21.1	21.5
PicR8000	6.2	10.0

如表4所示，1天和4天的孵育时间后D未显著改变，并且酶剂量在适当的范围内。

为了与其剂量无关地比较脂肪酶释放某些FFA的特异性，计算每种FFA(以mmol/kg Cheddar乳酪糊为单位)比总FFA(以mmol/kg Cheddar乳酪糊为单位)的相对Cx含量并藉此以％为单位表述FFA谱是便利的。这一比较方法是本领域技术人员公知并且在文献中广泛使用的。因为发现所研究的样品的FFA谱在第1天和第4天未显著改变，所以仅第4天的数据被展示于表5和显示于图1中。

同样给出了Parmesan乳酪的FFA谱，参阅D.T.Lai，A.D.Mackenzie，C.J.O’Connor，K.W.Turner J.Dairy Sci.80：2249-2257(1997)，page 2255。

表5：每种样品中的相对Cx含量

从表5和图1中可以看出，Parmesan乳酪的FFA谱与通过微生物脂肪酶PicR8000产生的FFA谱非常不同，所述微生物脂肪酶PicR8000被出售用于生产尖锐和辛辣的意大利乳酪品种，如Provolone、Parmesan、Romano(Technical Bulletin，DSM，荷兰)。通常已知微生物脂肪酶不是短C4-C10FFA特异性的，并且本领域可获得包括商业制剂的若干例子。迄今为止，PicR8000被用作能够从乳脂肪中释放短FFA的微生物脂肪酶之一。

惊讶地发现，根据本发明的脂肪酶L01、L03和L04显示与PicR8000相比对含C4的游离脂肪酸释放的高度特异性。如果与PicR8000的FFA谱比较，通过这些多肽产生的FFA谱更接近Parmesan乳酪的FFA谱。

可以使用特异性比例R_spec比较脂肪酶的特异性，所述R_spec可如下计算：

R_{spec} = \frac{ΣC 4 - C 10}{ΣC 12 - C 18},

其中∑C4-C10和∑C12-C18在说明书中定义。针对使用初期乳酪(优选地熟化时间少于2周的Cheddar或Gouda乳酪)制造的下述乳制品组合物测定R_spec，所述乳制品组合物在导致被孵育样品中包含的脂肪转化率在5％-25％之间足够程度的剂量、孵育时间和孵育温度条件下用脂解酶孵育，其中所述转化率如上文所述计算。表6中给出L01、L03、L04和PicR8000的R_spec值。

表6.与微生物脂肪酶PicR8000和Parmesan乳酪相比，本发明脂肪酶L01、L03和L04的特异性比例R_spec。

由此可见，与特异性更低的微生物酶R8000相比，根据本发明的脂肪酶L01、L03和L04显示对含C4-到C10-的游离脂肪酸释放的高度特异性。

实施例5

烘焙实验-全尺寸巴塔德

还在全规模巴塔德中测试脂解酶L01-L04的烘焙性能。在Diosna混合器中将2000g面粉(Kolibri^TM)、47g压缩酵母、40g盐、50ppm抗坏血酸、2ppmP500(真菌α-淀粉酶)、15ppmHSP6000(真菌半纤维素酶)和25％ml水在Diosna混合仪中混合(速度1下2分钟，速度2下71Wh)至27℃的最终面团温度。将面团分为350g的6块，弄圆并在32℃和90％相对湿度下醒发20分钟。然后将面团块成型和整形，并在34℃和90％的相对湿度下醒发100分钟。切割完全醒发的面团块并在烘箱中于240℃下烘焙30分钟，最初添加蒸汽。

以范围从0.1到最大4ppm Bradford蛋白质(1ppm Bradford蛋白质等于每kg面粉1mg Bradford蛋白质)的剂量，对面粉添加分别含有L01、L02、L03或L04的无细胞上清液(具有至少2mg/ml总Bradford蛋白质)。作为额外的对照，测试不含L01-L04、含有0.3mg/ml Bradford蛋白质的A.niger宿主菌株的无细胞上清液，其计量体积(ml)等于添加无细胞上清液的最高体积，来得到测试的最高L01-L04剂量。

将不同剂量的脂肪分解酶对面团和对最终烘焙产物的多种作用与空白的、不含其它添加物的面包和含0.3％DATEM(80CP)的面包块比较。

冷却至室温后，通过自动化面包体积分析仪(BVM-3，TexVolInstruments)测定面包块的体积。空白面包的面包块体积被定义为100％。由有经验的烘焙者如下手工和视觉评价其它作用。

以1到5的标度，通过视觉判断面包横断面的高度/宽度比例来评价面团稳定性。1＝非常扁平(横断面的高度/宽度比接近0)，5＝非常高(面包横断面的高度/宽度比接近0.8)。

以1-5的标度，通过手工判断来评价面团延展性。

1＝非常短到5＝非常可延展

烘箱开裂：1＝切口完全闭合到5＝完全开放的切口；撕裂的

碎屑结构：1＝具有更厚细胞壁的开放/不规则的碎屑结构5＝具有更薄细胞壁的非常精细/均一的碎屑结构

碎屑颜色：1＝非常深到5＝非常浅的白色

结果在表7-11中给出。

表7：与对照和DATEM相比，A.niger宿主菌株(对照)的无细胞上清液

	空白	对照	DATEM
				体积(％)	100	101	116
面团延展性	3	3	3
				面团稳定性	2	2	3
烘箱开裂	2	2	4
				碎屑结构	2	2	4
碎屑颜色	2	2	4

与空白相比，如上文所述计量的A.niger宿主菌株(对照)的无细胞上清液既未显示对烘焙性能的正面影响，也未显示负面影响。

表8：不同剂量(mg总蛋白质/kg面粉(根据Bradford测定))下脂解酶L01的烘焙性能

	空白	0.1	0.25	0.5	1	2	4	DATEM
									体积(％)	100	104	113	117	117	115	107	116
面团延展性	3	3	3	4	4	4	4	3
									面团稳定性	2	3	4	5	5	5	3	3
烘箱开裂	2	3	5	5	5	5	3	4
									碎屑结构	2	2	3	4	5	4	4	4
碎屑颜色	2	2	3	3	4	4	4	4

表9：不同剂量(mg总蛋白质/kg面粉(根据Bradford测定))下脂解酶L02的烘焙性能

	空白(0)	0.1	0.25	0.5	1.0	2	4	DATEM
									体积(％)	100	97	112	114	114	115	110	116
面团延展性	3	3	3	3	4	4	4	3
									面团稳定性	2	3	4	4	5	5	3	3
烘箱开裂	2	2	3	4	5	5	3	4
									碎屑结构	2	2	4	5	5	5	4	4
碎屑颜色	2	2	3	3	4	4	4	4

表10：不同剂量(mg总蛋白质/kg面粉(根据Bradford测定))下脂解酶L03的烘焙性能

	空白(0)	0.1	0.25	0.5	1.0	2	DATEM
								体积(％)	100	101	113	117	113	111	116
面团延展性	3	3	3	3	3	5	3
								面团稳定性	2	2	3	4	4	2	3
烘箱开裂	2	2	3	5	5	3	4
								碎屑结构	2	2	3	5	3	3	4
碎屑颜色	2	2	3	5	4	3	4

表11：不同剂量(mg总蛋白质/kg面粉(根据Bradford测定))下脂解酶L04的烘焙性能

	空白(0)	0.1	0.25	0.5	1	2	4	DATEM
									体积(％)	100	110	117	116	116	116	112	116
面团延展性	3	3	3	3	3	3	4	3
									面团稳定性	2	3	5	4	4	5	3	3
烘箱开裂	2	4	5	5	5	4	3	4
									碎屑结构	2	3	3	4	5	5	5	4
碎屑颜色	2	2	4	3	4	5	4	4

与空白相比，脂肪酶L01到L04清楚地改进了面团稳定性、增强了面包块体积、改进了烘箱开裂并改进了碎屑规律性。L01到L04有效代替0.3％DATEM，有效剂量范围至少为：对L01、L02和L04而言0.25-2.0ppm，对L03而言0.25-1ppm。

与空白或DATEM对照相比脂肪酶L01到L04不影响面团粘稠度。在更高剂量的L01到L04下，面团变得轻微更具延展性，对面团操作无显著影响。

实施例6

测定迷你巴塔德面团中的脂质转化

烘焙实验-迷你巴塔德(Mini-batard)

从150克面团块烘焙迷你巴塔德，所述面团块通过将200g面粉(Kolibri^TM)、4.6g压缩酵母、4g盐、68ppm抗坏血酸、1ppmP500(真菌α-淀粉酶)、5ppmHSP6000(真菌半纤维素酶)和总计57％水(面粉重量设为100％)混合获得。分别以0.5、1.0和2.5ppm Bradford蛋白质添加含L01、L02、L03或L04的无细胞上清液(含至少2mg/mL)总蛋白质。作为额外的对照，以3ppm Bradford蛋白质测试不含L01到L04、含有0.3mg/ml Bradford蛋白质的A.niger宿主菌株的无细胞培养上清液。

在叶式搅拌机(pin mixer)中混合6分钟和15秒后，将面团分为150g的两块，弄圆并在环境温度和90％的相对湿度下醒发25分钟。然后将面团块制模和成形，并在32℃和85％的相对湿度下醒发100分钟。切割完全醒发的面团块并在烘箱中于240℃下烘焙20分钟，最初添加蒸汽。

迷你巴塔德烘焙实验的烘焙结果可以与如实施例5中所述以全规模获得的结果比较。

极性脂质

通过用水饱和的丁醇来剧烈摇动经冻干并磨碎的完全醒发的面团(见上文烘焙实验迷你巴塔德)，来萃取脂质。离心后，在LiChrospher 100DIOL 5mm(250x4.0mm)上用HPLC分析澄清的上清液，通过Evaporative Light Scattering(Alltech ELSD 2000ES)在1.5l/min的氮流、80℃的温度、压缩器打开时检测脂样组分。使用两个流动相在梯度程序中以1.0ml/min的流速进行洗脱：

A：庚烷/异丙醇/丁醇/四氢呋喃/异辛烷/水(64.5/17.5/7/5/5/1)

B：异丙醇/丁醇/四氢呋喃/异辛烷/水(73/7/5/5/10)。

为了两次溶液洗脱，每升添加77ml氨溶液(ammoniac solution)和77ml三氟醋酸。

梯度程序：在25分钟内从100％A到100％B的线性，然后100％B 5分钟，然后从100％B到100％A线性梯度0.5分钟，最终100％A5分钟，注射体积为20ml，柱温度为80℃。

使半乳糖脂，磷脂，例如单半乳糖甘油二酯、单半乳糖甘油单酯、双半乳糖甘油二酯、双半乳糖甘油单酯，磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱来指示多种化合物的洗脱顺序，并计算它们的反应因子和存在于面团中的量。

面团脂质组成在面粉收获物类型间变化。尽管所有实验使用一种面粉类型(Kolibry)，但是表12中所示数据使用来自与表13-16中所示数据不同的收获物的面粉获得。

分别含有A.niger宿主菌株背景对照样品(表12)或含有多种L01到L04量(表13-16)的完全醒发的面团中主要极性脂质的量与红白面团的相应脂质量比较展示。

表12中所示结果清楚地显示，在测试的高剂量下与空白相比，A.niger宿主菌株(对照)的无细胞培养上清液未对极性面团脂质组合物具有任何显著影响。

从表13-16中所示结果可以毫无疑义地得出结论：L01到L04有效地将半乳糖甘油二酯转化为已以测试的最低剂量存在的半乳糖甘油单酯，与单半乳糖甘油二酯相比以及与磷脂酰胆碱相比对二半乳糖甘油二酯具有偏好。

还明确了在L01到L04剂量为0.5-2.5ppm(Bradford蛋白质)的面团中，高半乳糖甘油单酯水平与实施例5中所述烘焙性能相关。

表12：含有A.niger宿主菌株无细胞上清液(对照)或无任何添加(空白)的完全醒发的面团中的极性脂质(表示为g/kg冻干的面团)。

MGDG＝单半乳糖甘油二酯；MGMG＝单半乳糖甘油单酯；DGDG＝二半乳糖甘油二酯；DGMG＝二半乳糖甘油单酯；PC＝磷脂酰胆碱；LPC＝溶血-磷脂酰胆碱

表13：含有多种量L01(表示为mg Bradford蛋白质/kg面粉)的完全醒发的面团中的极性脂质(表示为g/kg冻干的面团)。

L01剂量[ppm]	MGDG	MGMG	DGDG	DGMG	PC	LPC
							0(空白)	1.69	0.41	1.15	0.16	0.47	1.30
0.5	0.53	1.16	0.60	0.79	0.24	1.29
							1.0	0.46	1.04	0.32	0.85	0.19	1.08
2.5	0.54	0.91	0.16	0.99	0.14	1.07

表14：含有多种量L02(表示为mg Bradford蛋白质/kg面粉)的完全醒发的面团中的极性脂质(表示为g/kg冻干的面团)。

L02剂量[ppm]	MGDG	MGMG	DGDG	DGMG	PC	LPC
							0(空白)	1.69	0.41	1.15	0.16	0.47	1.3
0.5	0.57	1.15	0.62	0.75	0.24	1.34
							1.0	0.52	1.09	0.39	0.87	0.20	1.27
2.5	0.54	0.93	0.19	0.96	0.19	1.13

表15：含有多种量L03(表示为mg Bradford蛋白质/kg面粉)的完全醒发的面团中的极性脂质(表示为g/kg冻干的面团)。

L03剂量[ppm]	MGDG	MGMG	DGDG	DGMG	PC	LPC
							0(空白)	1.69	0.41	1.15	0.16	0.47	1.3
0.5	0.64	1.14	0.66	0.73	0.26	1.27
							1.0	0.52	1.10	0.36	0.87	0.21	1.23
2.5	0.51	0.94	0.16	0.95	0.20	1.11

表16：含有多种量L04(表示为mg Bradford蛋白质/kg面粉)的完全醒发的面团中的极性脂质(表示为g/kg冻干的面团)。

L04剂量[ppm]	MGDG	MGMG	DGDG	DGMG	PC	LPC
							0(空白)	1.69	0.41	1.15	0.16	0.47	1.3
0.5	0.69	1.05	0.78	0.61	0.31	1.22
							1.0	0.49	1.08	0.40	0.83	0.21	1.17
2.5	0.52	0.95	0.18	0.93	0.21	1.11

非极性脂质

通过用含1％醋酸的庚烷来剧烈摇动经冻干并磨碎的完全醒发的面团(见上文烘焙实验-迷你巴塔德)，来萃取非极性脂质。离心后，在Spherisorb S3CN(Phenomenex OOD-0097-EO；100x4.6mm)上用HPLC分析澄清的上清液，通过Evaporative Light Scattering(Alltech ELSD 2000ES)在1.5l/min的氮流、40℃的温度、压缩器关闭时检测脂样组分。使用两个流动相在以下的线性梯度程序中以1.0ml/min的流速、20ml的注射体积和环境柱温度进行洗脱：

时间(分钟)	A(％)	B(％)
			0	98	2
3	98	2
			15	80	20
27	0	100
			32	0	100
32.1	98	2
			40	98	2

使用甘油三、二、单酯和脂肪酸的参考，来指示多种化合物的洗脱顺序，并计算它们的反应因子和面团中存在的量。

实施例7

烘焙实验-全规模巴塔德中的部分DATEM替换

对一些烘焙应用而言，用根据本发明的脂解酶部分替换DATEM而不是如实施例5中所示完全替换DATEM可以是有益的。在这一实施例中，分析了包含DATEM和L01的组合物和包含DATEM和L02的组合物对面团和烘焙制品的特性的影响。

为了评价代替含0.3％DATEM的配方中一半DATEM所需的脂解酶量，研究了0.15％DATEM与多种用量的至少具有2mg/ml总Bradford蛋白质的无细胞上清液的组合在全规模巴塔德中的烘焙性能，所述上清液分别含有L01或L02。

将与0.15％DATEM组合的不同剂量脂解酶对面团和最终烘焙制品的多种影响与空白(即既不含有DATEM也不含有脂解酶的面包块)，和分别含有0.15％或0.3％的总DATEM浓度的面包块，或含有0.25ppm L01或L02的面包块比较。

使用以下的全规模巴塔德配方和工艺测试包含DATEM(Lametop 501)和L01的组合物：

在Diosna混合器中将2000g面粉(即1800g Kolibri^TM和200gIbis^TM)、47g压缩酵母、40g盐、88ppm抗坏血酸、3ppmP500(真菌α-淀粉酶)、15ppmHSP6000(真菌半纤维素酶)和57％水在Diosna混合仪中混合(速度1下2分钟，速度2下71Wh)至27℃的最终面团温度。将面团分为350g的6块，弄圆并在32℃和90％相对湿度下醒发20分钟。然后将面团块成型和整形，并在34℃和90％的相对湿度下醒发90分钟。切割完全醒发的面团块并在烘箱中于240℃下烘焙30分钟，最初添加蒸汽。

该试验中使用的面粉批次来自于与实施例5和6中使用的面粉批次相比不同的收获物。在该试验中根据这一批次Kolibri面粉的供应商的说明，使用更高的抗坏血酸浓度。

使用以下的全规模巴塔德配方和工艺测试包含DATEM(Lametop)和L02的组合物：

在Diosna混合器中将2000g面粉(即1800g Kolibri^TM和200gIbis^TM)、47g压缩酵母、40g盐、68ppm抗坏血酸、2ppmP500(真菌α-淀粉酶)、15ppmHSP6000(真菌半纤维素酶)和57％水在Diosna混合仪中混合(速度1下2分钟，速度2下71Wh)至27℃的最终面团温度。将面团分为350g的6块，弄圆并在32℃和90％相对湿度下醒发20分钟。然后将面团块成型和整形，并在34℃和90％的相对湿度下醒发100分钟。切割完全醒发的面团块并在烘箱中于240℃下烘焙30分钟，最初添加蒸汽。该试验中使用的面粉批次也来自于与用于包含L01的组合物的面粉批次和实施例5和6中使用的面粉批次相比不同的收获物。

表17中给出包含DATEM和L01的组合物的结果，表18中给出包含DATEM和L02的组合物的结果。如实施例5中所述评价面包和面团特征。

表17：脂解酶L01(作为ppm给出，即mg总蛋白质/kg面粉(根据Bradford测定))和DATEM(作为％给出，即g DATEM/100g面粉)的组合物的烘焙性能

L01[ppm]	0	0	0.04	0.08	0.12	0	0.25
								DATEM(％)	0	0.15	0.15	0.15	0.15	0.3	0
体积(％)	100	113	124	123	121	120	121
								面团延展性	3	3	4	4	4	4	4
面团稳定性	1	2	2	4	5	4	4
								烘箱开裂	1	2	2	4	5	3	4
碎屑结构	1	2	3	4	5	4	4
								碎屑颜色	2	2	3	4	5	4	4

表18：脂解酶L02(作为ppm给出，即mg总蛋白质/kg面粉(根据Bradford测定))和DATEM(作为％给出，即g DATEM/100g面粉)的组合物的烘焙性能

L02[ppm]	0	0	0.04	0.07	0.10	0	0.25
								DATEM(％)	0	0.15	0.15	0.15	0.15	0.3	0
体积(％)	100	118	125	123	130	127	124
								面团延展性	3	3	4	4	4	3	4
面团稳定性	1	2	2	4	5	3	4
								烘箱开裂	1	2	3	4	5	4	4
碎屑结构	1	2	3	4	5	4	4
								碎屑颜色	2	2	3	4	5	4	4

这些结果清楚地展示，包含0.15％DATEM并分别包含0.08ppm L01或0.07ppm L02的组合物能有效代替0.3％DATEM，导致可比较的面团稳定性、面包块体积、烘箱开裂、碎屑结构和碎屑颜色。L01或L02分别的0.25ppm的最小剂量可足以代替0.3％DATEM，如实施例5中所示。令人惊讶的是，约一半L01剂量(0.12ppm)或一半L02剂量(0.10ppm)分别与一半DATEM剂量(0.15％DATEM)的组合与单独的0.3％DATEM相比，并分别与单独的0.25ppm L01或单独的0.25ppm L02相比，显示面团稳定性、碎屑结构和烘箱开裂的改进。这表明包含DATEM和根据本发明的脂解酶L01或L02的组合物显示协同效应。

实施例8

本发明的脂解酶在维多利亚蛋糕(Victoria cake)中的影响

可在蛋糕配方中使用脂解酶改进例如牛奶鸡蛋面糊(batter)的乳液稳定性。此处测试L01对维多利亚蛋糕的影响。

使用提供平板打浆混合仪(flat beater mixer)的Hobart混合仪如下制备维多利亚蛋糕：

1.混合无盐黄油19％和糖21％

2.添加干燥成分：

-经热处理的蛋糕粉(Albatros，Meneba)，30％；烘焙粉(SAPP 15)，0.4％；碳酸氢钠，0.3％；乳粉，0.4％；盐，0.13％

和L01，如表19中所示

并混合

3.混合期间添加液体成分：

-全蛋，23％(w/w)，水，3.6％(w/w)，19％(w/w)，甘油，2.1％(w/w)，

4.摩擦(scape)碗并在最高速下混合2分钟

成分的百分比以％(w/w)最终牛奶鸡蛋面糊重量为单位给出。

L01的剂量以ppm为单位给出，即Bradford蛋白质(mg)相对于空白配方中全液体蛋(kg)的质量。

将牛奶鸡蛋面糊(最终牛奶鸡蛋面糊重量1496g)扩大规模至300克牛奶鸡蛋面糊重量/烤盘(直径13cm)，并在165/170℃下烘焙45分钟。

将L01对牛奶鸡蛋面糊和最终蛋糕的多种影响与空白(即不含有脂解酶L01的牛奶鸡蛋面糊/蛋糕)比较。

通过测定给定牛奶鸡蛋面糊体积(此处为300ml)的重量来测量牛奶鸡蛋面糊比重(specific batter density)，即每牛奶鸡蛋面糊体积的牛奶鸡蛋面糊重量(g/l)。

通过自动化面包体积分析仪(BVM-3，TexVol Instruments)测定蛋糕体积，计算蛋糕重量和蛋糕比体积(specific cake volume，ml/g)。空白蛋糕的蛋糕比体积被定义为100％。

将蛋糕一个挨一个储存于室温下聚乙烯袋子中。在烘焙后1天、8天和18天使用SMS TAX2纹理分析仪(Stable Microsystems)，使用4cm圆筒状探针测量碎屑硬度和弹性(crumb firmness and resilience)。对每个蛋糕而言，测量从蛋糕中心取下的四片。将探针推进蛋糕片内10mm，并立即和在30秒后记录阻力。相对值(降低百分比)代表弹性——制品对抗压力的能力。t＝0时的绝对值代表硬度。

由有经验的烘焙者按照1到10的相对标度视觉评价碎屑孔均一性。1＝异质的、不规则的碎屑结构到10＝均匀的、均一的碎屑结构。

由有经验的烘焙者按照1到10的相对标度视觉评价碎屑孔直径。1＝非常大(开放的碎屑结构)到10＝非常小(非常精细的碎屑结构)。

表19.维多利亚蛋糕中脂解酶L01的性能

L01的添加导致初始时以及保质期期间相对于空白蛋糕而言降低的牛奶鸡蛋面糊密度，提高的蛋糕体积，具有更小孔的更均质的碎屑，和降低的碎屑硬度。对测试的蛋糕而言，未观察到碎屑弹性的显著差异。

这些结果清楚地显示本发明的脂解酶改进了蛋糕牛奶鸡蛋面糊的乳液稳定性，得到总体经改进的蛋糕品质。

这些结果还显示本发明的脂解酶不仅在代替面包配方中的乳化剂例如DATEM或SSL/CSL中发挥功能，而且还在无乳化剂的蛋糕配方中发挥功能，因为添加本发明的脂解酶导致提高的蛋糕体积，这是能够通过添加乳化剂如单硬脂酸甘油酯而获得的效果，和提高的蛋糕柔软性，这是通常通过添加乳化剂如甘油单酯而获得的效果。

实施例9

本发明的脂解酶对牛奶鸡蛋面糊和蛋减少的海绵蛋糕中碎屑特性的影响

海绵蛋糕配方中蛋的减少导致具有差、开放的碎屑结构的硬且脆的蛋糕。可使用脂解酶在这类蛋减少的蛋糕配方中改进总体蛋糕品质。此处测试蛋减少的海绵蛋糕中单独和与磷脂酶A组合的L01的影响。

使用磷脂酶Cakezyme^TM(DSM Food Specialties，荷兰)时，在A.niger中生产的磷脂酶A2含5000CPU/g。使用外消旋1，2-二辛酰二硫代磷脂酰胆碱作为底物测定磷脂酶活性，反应在405nm处用分光光度计监测，并且活性以生色磷脂酶单位为单位表述：1CPU(生色磷脂酶单位)被标准化为1EYU(蛋黄单位)，所述EYU被定义为40℃和pH 8.0下从蛋黄中每分钟释放1μmol酸的酶量。

使用提供有线须混合仪(wire whisk mixer)的Hobart混合仪如下制备海绵蛋糕：

-以％(w/w)最终牛奶鸡蛋面糊重量为单位的成分：

糖，25％；经热处理的蛋糕粉(Albatros，Meneba)，21％；烘焙粉(SAPP28)，0.6％；小麦淀粉，8.3％；乳化剂(BV40)，3.3％；碳酸氢钠，0.4％；全蛋(对全蛋参照牛奶鸡蛋面糊而言：30％，对蛋减少的牛奶鸡蛋面糊而言：24％)；水(对全蛋参照牛奶鸡蛋面糊而言：11.4％，对蛋减少的牛奶鸡蛋面糊而言：17.4％)

1.在1速下将所有成分(如表20中所示包括相应量的L01和/或磷脂酶A)混合1分钟

2.在3速下混合5分钟

3.在1速下混合1分钟

将牛奶鸡蛋面糊(最终牛奶鸡蛋面糊重量848g)扩大规模至400克牛奶鸡蛋面糊重量/烤盘(直径28cm)，并在180/180℃下烘焙25分钟。

L01的剂量以ppm为单位给出，即Bradford蛋白质(mg)相对于全蛋参照牛奶鸡蛋面糊中全液体蛋(kg)的质量，磷脂酶A的剂量以相对于全蛋参照牛奶鸡蛋面糊中全液体蛋质量的％Cakezyme^TM(product)重量为单位给出。

由有经验的烘焙者按照1到10的相对标度视觉评价蛋糕碎屑结构。1＝具有更厚细胞壁的开放/不规则碎屑结构到10＝具有更薄细胞壁的非常精细/均一的碎屑结构

此处用相对评分1：非常坚硬到1：非常柔软，视觉判断碎屑柔软性。

用相对评分1：非常易碎到10：粘度，手工判断碎屑粘着性(Crumbcohesiveness)。

表20：与全蛋海绵蛋糕相比，蛋减少的海绵蛋糕中脂解酶L01、磷脂酶A及其组合的性能

*比全蛋对照减少20％全蛋

将蛋减少20％并用水弥补相应的牛奶鸡蛋面糊重量导致与全蛋参照相比降低的牛奶鸡蛋面糊粘度、降低的碎屑柔软性、更差的碎屑结构和降低的碎屑粘着性。

通过对蛋减少的牛奶鸡蛋面糊添加磷脂酶A，将牛奶鸡蛋面糊粘度恢复至全蛋牛奶鸡蛋面糊的水平，与蛋减少的蛋糕相比碎屑柔软性和粘着性可观地改善，并且与全蛋蛋糕相比碎屑结构甚至被轻微地改进。

对蛋减少的牛奶鸡蛋面糊添加L01导致与全蛋参照相比被轻微改进的牛奶鸡蛋面糊粘度和更精细的碎屑结构，以及与蛋减少的参照相比经改进的碎屑柔软性，特别是经改进的碎屑粘着性。

令人惊讶的是，对蛋减少的蛋糕牛奶鸡蛋面糊添加包含L01和磷脂酶A的组合物甚至与全蛋和其中添加L01或磷脂酶A任一蛋减少的配方相比进一步改进了牛奶鸡蛋面糊粘度、碎屑结构和碎屑柔软性，并将碎屑粘着性恢复至全蛋蛋糕的水平。

这些结果阐明，单独或与磷脂酶A组合地添加本发明的脂解酶改进蛋减少的蛋糕的总体特性。在蛋减少的蛋糕配方中，单独和特别是与磷脂酶组合添加本发明的脂解酶时，可以实现与全蛋蛋糕相比甚至更好的碎屑柔软性和结构。

实施例10

本发明的脂解酶对层压面团脆性的影响

用1000g Edelweiss面粉、430g水、100g蛋、50g酵母、20g盐、10g糖、15g面包改良剂和L01制成层压面团。L01的剂量为0.23ppm，即根据Bradford测定为每kg面粉0.23mg蛋白质。参照不含酶。适当的醒发后，将面团铺开成层。向面团片中折入一层层压人造黄油(Trio Korst，Unipro，Bergen op Zoom，荷兰)。然后将其按标准操作铺开成层压面团。从最终的面团上切下带状物(ribbons)，折成蝴蝶形的糕饼并在235℃烘箱中烘焙20分钟。在半封闭的橱柜中储存两天后测试制品。

使用纹理分析仪(TA-XT Plus，Stable Micro systems Ltd.，Surrey，UK)进行机械测试。在储存2天后，使用25mm楔形探针以1mm/sec的速度至少表征10个参照糕饼和添加L01的制品。

分析力比距离的压缩曲线，并使用来自纹理分析软件(TextureAnalysis Software)的macro从所述压缩曲线获得参数。从StatGraphics(统计学分析和建模软件)获得散点图(scatter plot)，来测定参照糕饼和含L01的糕饼之间的统计学显著性差异。表21中展示了在环境条件下储存2天后压缩实验的结果。根据五个纹理参数，发现在参照和用L01制备的制品之间存在显著差异。还发现含L01的制品比参照更容易成型。

表21：在环境条件下储存2天后层压烘焙制品的脆性特征。

	参照	L01
			距离(mm)	14.3±1.6	6.5±1.1
第一峰值力(g)	1390±273	1273±945
			斜率(g/s)	159±67	998±498
最高峰值力(g)	1419±285	4207±1207
			面积(g*s)	1416±3165	23908±8214
分级事件数量	0	9±5

这显示用根据本发明的脂解酶制备的层压烘焙制品在环境条件下储存2天后比不使用酶制备的制品更脆。

Claims

1.经分离的多核苷酸，其编码脂解酶并且由编码根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸34到304、根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸34到304或根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列的氨基酸34到304的核苷酸序列组成，并且与含C12到C18的游离脂肪酸的释放相比，所述脂解酶对从包含至少一种乳脂肪和／或其它脂肪的乳组合物释放含C4到C10的游离脂肪酸具有更高的特异性。

2.根据权利要求1的经分离的多核苷酸，其是合成生产的。

3.包含根据权利要求1到2中任一项的多核苷酸序列的载体。

4.根据权利要求3的载体，其为表达载体，其中根据权利要求1到2中任一项的多核苷酸序列与允许所述多核苷酸序列在合适宿主细胞中表达的至少一种调节序列可操作地连接。

5.根据权利要求4的载体，其中所述合适的宿主细胞是丝状真菌。

6.重组的宿主细胞，其包含根据权利要求1到2中任一项的多核苷酸或包含根据权利要求3到5中任一项的载体。

7.根据权利要求6的重组宿主细胞，其能够表达或过表达所述多核苷酸或载体。

8.用于制造根据权利要求1到2中任一项的多核苷酸或根据权利要求3到5中任一项的载体的方法，所述方法包括下述步骤：培养经所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞，以及从所述宿主细胞分离所述多核苷酸或所述载体。

9.具有脂解活性的经分离的多肽，其由：

(a)根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸34到304、根据SEQID NO：6的氨基酸序列的氨基酸34到304或根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列的氨基酸34到304的氨基酸序列，并且与含C12到C18的游离脂肪酸的释放相比，所述多肽对从包含至少一种乳脂肪和／或其它脂肪的乳组合物释放含C4到C10的游离脂肪酸具有更高的特异性；

(b)由根据权利要求1到2中任一项的多核苷酸编码的氨基酸序列；或

(c)根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸34到304的氨基酸序列

组成。

10.根据权利要求9的经分离的多肽，所述多肽能够通过在适当宿主细胞中表达根据权利要求1到2中任一项的多核苷酸或根据权利要求3到5中任一项的载体来获得。

11.用于制造根据权利要求9的经分离的多肽的方法，所述方法包括：在允许根据权利要求1到2中任一项的多核苷酸或根据权利要求3到5中任一项的载体表达的条件下，培养根据权利要求6或7的重组宿主细胞，以及任选地从所述细胞或培养基中回收被编码的多肽。

12.根据权利要求9或10的经分离的多肽在食物制造中的用途。

13.根据权利要求12的用途，所述用途是在乳制品制造中的用途。

14.根据权利要求13的用途，所述用途是在乳酪、乳酪样制品、经酶修饰的乳酪的制造中或在能够通过黄油脂肪或奶油的水解获得的游离脂肪酸混合物的制造中的用途。

15.用于制备乳制品的方法，其中在足以使酶反应的条件下，向乳制品生产中使用的乳组合物中添加根据权利要求9或10的经分离的多肽。

16.根据权利要求12到14中任一项的用途或根据权利要求15的方法，其中使用所述多肽来发展出香味。

17.根据权利要求16的用途，其中在乳制品香味谱中，尖锐、强烈、辛辣的香调比肥皂样香调更高。

18.根据权利要求13或14的用途，所述用途是烘焙制品制造中的用途。

19.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是淀粉酶。

20.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是环糊精葡萄糖转位酶。

21.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是肽酶。

22.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是外肽酶。

23.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是转谷氨酰胺酶。

24.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是脂肪酶。

25.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是半乳糖脂肪酶。

26.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是磷脂酶。

27.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是纤维素酶。

28.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是半纤维素酶。

29.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是戊聚糖酶。

30.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是木聚糖酶。

31.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是蛋白酶。

32.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是蛋白质二硫化物异构酶。

33.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是糖基转移酶。

34.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是过氧化物酶。

35.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是漆酶。

36.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是氧化酶。

37.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是己糖氧化酶。

38.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是葡萄糖氧化酶。

39.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是醛糖氧化酶。

40.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是吡喃糖氧化酶。

41.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是脂肪氧化酶。

42.烘焙酶组合物，其包含根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽和一种其它酶，所述其它酶是L-氨基酸氧化酶。

43.根据权利要求19所述的烘焙酶组合物，其中所述淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶和非产麦芽糖淀粉酶。

44.烘焙组合物，其包含DATEM和根据权利要求9或10的具有脂解活性的经分离的多肽。

45.制备面团的方法，所述方法包括下述步骤：向面团成分中的至少一种添加根据权利要求9或10的多肽或根据权利要求19到44中任一的组合物。

46.面团，其包含根据权利要求9或10的多肽，或根据权利要求19到44中任一的组合物。

47.根据权利要求46的面团，其具有经改进的面团稳定性。

48.根据权利要求46-47中任一项的面团，其具有选自由面团的提高的强度、提高的稳定性、提高的弹性、降低的粘稠度和经改进的延展性组成的组的至少一种经改进的特性。

49.制备烘焙制品的方法，所述方法包括烘焙根据权利要求46-47中任一项的面团的步骤。

50.根据权利要求49的制备烘焙制品的方法，其中的烘焙制品具有至少一种选自由提高的体积、经改进的香味、经改进的碎屑结构、经改进的碎屑柔软性、经改进的脆性、降低的起泡和经改进的抗腐性组成的组的经改进的特性。

51.根据权利要求50的制备烘焙制品的方法，其中所述制品是由层压面团制成的烘焙制品。

52.根据权利要求51的制备烘焙制品的方法，其中所述烘焙制品是无乳化剂的蛋糕或者蛋和／或脂肪减少的蛋糕。

53.生产蛋糕或可从其获得蛋糕的牛奶鸡蛋面糊的方法，其中使用根据权利要求9或10的脂解酶。

54.包含根据权利要求9或10的脂解酶和磷脂酶A的组合物在蛋糕生产中用于改进选自下组的特性中的至少一种的用途，所述组由：(i)牛奶鸡蛋面糊粘度、(ii)比重、(iii)蛋糕初始碎屑柔软性、(iv)蛋糕碎屑孔均匀性、(v)蛋糕碎屑孔直径、(vi)蛋糕储存后的碎屑柔软性、(vii)蛋糕保质期和／或(viii)蛋糕体积组成，或所述组合物在蛋糕生产中使得能够减少蛋糕配方中蛋和／或脂肪量。

55.制备牛奶鸡蛋面糊的方法，所述方法包括步骤：

a.通过添加至少：

i.糖

ii.面粉

iii.磷脂酶A、根据权利要求9或10的脂解酶和蛋

来制备用于蛋糕的牛奶鸡蛋面糊，

其中所述蛋糕包含减少的蛋和／或脂肪量，或其中所述蛋糕的蛋和／或脂肪量没有减少。

56.制备蛋糕的方法，所述方法包括步骤：

a.通过添加至少：

i.糖

ii.面粉

iii.磷脂酶A、根据权利要求9或10的脂解酶和蛋

来制备用于蛋糕的牛奶鸡蛋面糊，

b.烘焙所述牛奶鸡蛋面糊，产生蛋糕，其中所述蛋糕包含减少的蛋和／或脂肪量，或其中所述蛋糕的蛋和／或脂肪量没有减少。

57.牛奶鸡蛋面糊，其包含根据权利要求9或10的多肽或根据权利要求19到44中任一的组合物。