CN102084253A

CN102084253A - 小细胞肺癌生物标记物组

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Publication number: CN102084253A
Application number: CN2009801055600A
Authority: CN
Inventors: A·梵德博尔吉特; F·C·S·拉马克斯; S·M·梵登艾杰德; M·哈姆斯马; F·W·法尔肯贝格; K·斯图尔; G·普驰曼; H·E·梅尔; G·科洛普
Original assignee: Mubio Products BV
Current assignee: Mubio Products BV
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2011-06-01
Also published as: WO2009103542A1; EA201070834A1; BRPI0907938A2; AU2009216910A1; US20110053156A1; JP2011517341A; CA2712204A1; GB0803192D0; EP2274618A1; ZA201004946B; MX2010009103A

Abstract

本发明总体与癌症的检测、诊断、分型、分期、预后、治疗以及预防相关。更具体而言，本发明涉及对患者进行肺癌检测和/或诊断和/或分型和/或分期的方法。根据一组特定的生物标记物，本发明提供了在早期阶段检测、诊断和/或区分小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)以及在NSCLC中区分鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)，在SCC中辨别G2和G3期和在肺癌中区分带有或不带有神经内分泌根源的肺癌的方法。本发明还提供了上述生物标记物组在监控患者疾病进程中的用途，包括体外和体内成像技术。体外成像技术通常包括对取自上述患者的样本-如血清或组织样本-进行检测生物标记物蛋白质或抗体的免疫测定。体内成像技术通常包括用于分子成像和诊断的胸片(X光)、计算机断层扫描(CT)成像、螺旋CT、正电子放射断层造影术(PET)、PET-CT以及闪烁扫描术，并且监控患者的疾病进程和治疗反应。因此，本发明的另一个方面提供执行上述诊断和/或分型和/或分期和成像技术的试剂盒，包括用以确定上述生物标记物组的基因表达或蛋白质水平用于体外和体内应用的试剂。

Description

小细胞肺癌生物标记物组

发明领域

本发明总体与癌症诊断、预后、治疗以及预防领域相关。更具体而言，本发明涉及对患者的肺癌进行分型的方法。根据一组特殊的生物标记物，本发明提供了(早期)诊断肺癌的方法，区分小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，在NSCLC中区分鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)以及最终的大细胞癌的方法，辨别具有或不具有神经内分泌起源的肺癌的方法，辨别G2和G3期的SCC肿瘤的方法以及确定肺癌异质性程度的方法。

本发明还提供了上述生物标记物组在监控患者疾病进程中的应用，包括体外和体内成像技术。体外成像技术通常包括对取自该患者的样本-如血清或组织样本-进行的免疫检定。体内成像技术通常包括胸片(X光)、计算机断层扫描(CT)成像、螺旋CT、正电子放射断层造影术(PET)、PET-CT以及闪烁扫描术。

因此另一个方面提供一套执行上述成像技术的试剂盒，包括用以确定上述生物标记物组表达的试剂。此外，还特别包括特异于下文所确定的生物标记物组的抗体。

发明背景

肺癌是最多发的癌症类型之一，而且在欧洲和美国均属于癌症相关死亡率的主要导因。2004年，肺癌致死占欧洲所有癌症相关死亡病例的20％，在美国占29％(1，2)。

肺癌通常分成两大类，小细胞肺癌(SCLC)，占所有肺癌患者的15％到20％，和非小细胞肺癌(NSCLC)，占所有肺癌的80％到85％左右。此外，还可以继续细分为肺鳞状细胞癌(SCC)，肺腺癌(AC)以及大细胞肺癌(LC)。

上述主要的两大类在生长和治疗特征方面均存在区别。SCLC肿瘤表现出一种侵袭性的表型，便于使用化疗和放射疗法治疗，而NSCLC是非化学敏感的，通常使用手术治疗。然而，目前对于不同类型的肺癌尚无充分的治疗方案。使用传统疗法治疗时，SCLC类型在限制阶段病情的中位生存时间为15个月，而对于扩散阶段仅为9个月，而长期存活率非常低。鉴于两大类肺癌之间表现的不同，采取何种治疗方案的决定尤其是以SCLC和NSCLC的细分类为引导。

与其它类型的肺癌不同，SCLC对于化疗非常敏感。在大约75％的SCLC病例中，可以发现对化疗的初始响应，在所有病例中约有35％的存在临床上的完全响应(Johnson DH等人，1987；Am J Med Sci 293：377-389)。然而不幸的是，在大部分情况下，病情都会复发，从而使存活三年的比例仅为5-10％，而存活五年的比例约为1％(Minna JD等人.1985，Cancer of the lung.In Cancer.Principles and practice of oncology第2版)；在SCLC中，可以在典型的和变体的SCLC之间进行临床相关的细分。SCLC的变体类型对化学疗法和放射疗法表现出更低的敏感性，因此，患有变体类型SCLC的患者的中位生存时间大大短于那些患有典型类型的SCLC的患者(Radice PA等人.1982，Cancer；50：2894-2902)。此外，对于患有综合性SCLC的患者，观察到病情的预后也比患有典型SCLC的患者差(Hirsch FR等人，1983，Cancer；52：2144-2150)。大约75％到80％的病例属于NSCLC组织学病例，并且大部分患者表现出局部晚期病情(III阶段)或转移病情(IV阶段)。重要的是，因明显的局部病情而经历了治疗性外科切除手术的患者的存活率介于50％和80％之间，这表明需要有更好的系统性治疗方法以治疗隐蔽的微转移疾病。在NSCLC病例中，使用化学疗法进行的治疗基本上都是不成功的(Minna JD等人.1985，Cancer of the lung.In Cancer.Principles and practice of oncology第2版)。因此，除了真正局部疾病的手术治疗能够获得高治愈率以外，NSCLC患者的预后情况非常严峻(Mulshine JL等人.1986.，J Clin Oncol；4：1704-1715)。然而，在一小部分患者中可以观察到对化学疗法的响应。其中部分原因是因为这些病例可能属于具有SCLC成分的NSCLC，因为这种非均匀成分在肺癌中是非常常见的(见上所述)。

从这些数据中可以清楚的看出，寻找到其它的治疗形式对于这些患者而言至关重要，但成功治疗和根除肺癌的一个重大障碍就是病情诊断的延迟，而且在对不同类型的肺癌进行正确分类的技术方面也存在不足。

肺癌通常通过胸片(X光)、计算机断层扫描(CT)成像、螺旋CT、正电子放射断层造影术(PET)、闪烁扫描术、活组织检查、生物标记物分析或痰细胞检查进行诊断。与任何其它诊断测试一样，肺癌诊断测试使用对灵敏度(测试中正确确定的真阳性比例)和特异性(测试中正确确定的真阴性比例)的测量来评估。但由于灵敏度和特异性较低，诊断测试往往以失败告终。

胸部X光可以通过检测鳞状细胞癌形成的损伤或空洞对NSCLC进行诊断。但是，在一般情况下，在癌症已经转移并且无法进行完全的手术切除之前，胸部X光并不能检测到肺癌。CT用来跟踪癌细胞的扩散，对于肺癌的早期检测，可能比标准的胸部X光更有效。螺旋CT是CT的一种形式，可以在早期阶段更灵敏的对肺癌进行诊断，但是根据报告，在检测某些类型的肺癌时，其特异性和灵敏度都非常低。PET是一种灵敏的非损伤性的造影技术，能够检测已经扩散的肺癌，例如已经扩散到胸腔纵隔膜以及肺内的肺癌。但是，PET造影的高昂成本使其无法用于筛选目的。闪烁扫描术也是一种造影技术，在该技术应用过程中，患者服用与癌细胞结合的放射性试剂。活组织检查是获取肺部组织和细胞，用于诊断，并且可以通过胸腔镜检查、支气管镜检查(如通过支气管肺泡灌洗或BAL)或者细针程序等执行。

诸如pRb2/pl30、p53以及ras等生物标记物已经被视为肺癌的诊断剂，但目前尚缺乏适当的一组生物标记物，用于肺癌的早期诊断或对不同类型的肺癌进行分类(肺癌分型)。目前，肺癌主要使用神经元特异性烯醇酶(NSE)、细胞角蛋白片段抗原21.1(CYFRA 21-1)、细胞角蛋白组(CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19以及CK20)、癌胚抗原(CEA)、胃泌激素释放肽(GRP-ProGRP)、嗜铬粒蛋白(CHGA)、甲状腺转录因子1(TITF-1)、突触囊泡蛋白(SYPH)以及神经内分泌特异性蛋白质(NSP)等进行诊断。在这一方面，一组典型的用于肺癌神经内分泌区分的生物标记物组由NSE、SYPH以及CHGA组成。尽管上述已知肺癌标志物中每一种均具有一定的价值，但在肺癌抗原存在异质性的情况下，目前尚没有一组适用的肿瘤标志物，能够就非小细胞肺癌(NSCLC)的分型以及小细胞肺癌(SCLC)在早期疾病阶段的特异性检测提供满意的灵敏度和特异性。使用前述的肿瘤标志物或肿瘤标记组将会在患有非恶性肺部疾病(如慢性阻塞性肺病(COPD))的患者、患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者以及患有其它神经内分泌(NE)肿瘤的患者或患有脑瘤的患者的诊断中产生很高比例的假阳性。目前的标志物的另一个缺点是大部分仅能进行免疫组织化学染色法测试而无法进行血清学的确定。

在临床实践中，准确诊断各种子类型的癌症非常重要，因为治疗方法的选择、预后以及治疗反应的可能性均在很大程度上取决于诊断结果。准确的预后或确定未曾远程转移的患者存活率使肿瘤专家能够定制辅助化学疗法的实施，而预后较差的患者则会获得更具损害性的治疗。此外，对不良预后的准确预测将对新肺癌疗法的临床试验产生巨大的影响，因为潜在的研究患者可以根据预后进行分组。试验可以限定于具有不良预后的患者，从而能够更轻易的识别出实验疗法是否有效。迄今为止，尚未确定成套的能获得满意结果的单独以临床资料作为依据的预后预测剂。

因此，如果能够提供具体的方法和试剂，用于肺癌的(早期)诊断、分型、区分、分期、预后、监控以及治疗跟进，并进而克服目前诊断工具的缺点(如上所述)，将带来很大的利益。

在本发明中，我们展示使用经过特别挑选的单克隆抗体的组合对肿瘤特异性抗原进行血清学检测，为肺癌的诊断和分型提供了很高的灵敏度和特异性。由于肿瘤的生长超出肿瘤供血范围而导致的肿瘤部位坏死、由于免疫响应而导致的肿瘤排斥；超出噬菌细胞能力范围的细胞死亡或由于有效的肿瘤治疗等原因，这些肿瘤特异性抗原被释放到外周循环中。

发明概述

本发明的目的之一是提供用于对受试者肺癌进行(早期)诊断、分型以及分化确定的体外方法，该方法包括以下步骤：(a)从该受试者获取样本；以及(b)确定选自NCAM剪接变体NCAM 120、NCAM140和/或NCAM 180、细胞角蛋白(CK)、神经内分泌特异性蛋白质(NSP)-reticulon(RTN1)、突触囊泡蛋白(SYPH)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)、甲状腺转录因子1(TITF-1)、γ神经元特异性烯醇化酶(γNSE)以及热休克蛋白-47(HSP47)的至少两种肿瘤标记物基因的表达；其中所述基因的表达或所述蛋白质的存在允许检测和/或诊断和/或分型和/或确定所述受试者中肺癌的异质性程度或分期。

在一个具体的实施方案中，以及如下文其它实施方案所表现出的，上述方法中提到的至少两种基因中有一种由表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体的NCAM 180组成。

因此，本发明的目的之一是提供对受试者内肺癌进行(早期)诊断、分型以及确定分化或分期的体外方法，该方法包括以下步骤：(1)从该受试者获取样本；(2)确定NCAM 180或表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体的表达；以及(3)确定选自NCAM剪接变体NCAM 120或NCAM 140、细胞角蛋白(CK)、神经内分泌特异性蛋白质(NSP)-reticulon(RTN1)、突触囊泡蛋白(SYPH)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)、甲状腺转录因子1(TITF-1)、γ神经元特异性烯醇化酶(γNSE)以及热休克蛋白-47(HSP47)中的至少一种肿瘤标记基因的表达；其中上述基因的表达或上述蛋白质的存在允许检测和/或诊断和/或分型和/或确定所述受试者中肺癌的异质性程度或分期。

在本发明的一个特定实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)从该受试者获取样本；以及(b)确定选自NCAM、表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体、细胞角蛋白(CK)以及神经内分泌特异性蛋白质(NSP)-reticulon(RTN1)的肿瘤标记基因的表达；其中上述基因的表达或上述蛋白质的存在与否允许检测和/或诊断和/或分型和/或确定所述受试者中肺癌的异质性程度或分期。

本发明中所使用的细胞角蛋白(CK)通常选自CK4、CK5、CK6(有两种细胞角蛋白基因/蛋白质，CK6a和CK6b)、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19以及CK20。在依照本发明的方法的一个具体实施方案中，确定至少两种细胞角蛋白的表达。而在一个更进一步的实施方案中，使用上述CK基因/蛋白质中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种的表达/存在。如以下举例说明的，在本发明的一个实施方案中，所使用的细胞角蛋白选自CK6(有两种细胞角蛋白基因/蛋白质，CK6a和CK6b)、CK16以及CK17。

在对不同类型肺癌进行的分型或分期中，使用了2种或更多种上述基因的表达；在一个具体实施方案中，确定上述基因中至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种的表达。而在一个更进一步的实施方案中，在对受试者肺癌进行分型的方法中，使用了上述所有基因的表达。

在依照本发明的方法的一个实施方案中，NCAM 180的表达，尤其是表达NCAM外显子18-抗原的NCAM剪接变体的表达，与以上第(3)步中提到的一种或多种肿瘤标记配合使用，以对SCLC和NSCLC进行区分。在一个更具体的实施方案中，NCAM 180，尤其是表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体的表达与选自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17以及CK20中一种或多种(即2、3、4、5、6、7、8、9或所有)细胞角蛋白基因配合使用，以对SCLC和NSCLC进行区分。

在上述实施方案中：

SCLC的特点是缺少细胞角蛋白基因CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17以及CK20，而表达NCAM 180(即表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体)、CK8以及CK18。

并且

NSCLC的特点是缺少NCAM 180(即表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体)，而表达CK19、CK6/CK16/CK17(即CK6、CK16和CK17中的几个)和/或CK8/CK18(即CK8和CK18中的几个)；尤其是缺少NCAM 180(即表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体)，尤其是表达CK19、CK6/CK16/CK17或CK8/CK18。

在第二个实施方案中，NCAM 180(即表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体)的表达与细胞角蛋白基因CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19和/或CK20中的一种或多种(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有)共同使用，用于检测和/或诊断受试者中的NSCLC和/或确定或分型NSCLC(即区分腺癌和鳞状细胞癌亚型)。

在上述第二种实施方案的一个目标中，NSCLC的腺癌分化或定型的特点是表达至少CK7、CK8/CK18(即CK8和CK18对)以及CK19，并且缺少CK20、NCAM180(即表达NCAM外显子18的NCAM剪接变体)以及选自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16以及CK17中的一种或多种细胞角蛋白基因(即2、3、4、5、6、7、8或所有)。

在上述第二种实施方案的另一个目标中，NSCLC的鳞状细胞癌(SCC)的分化或定型的特点是表达选自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17以及CK19中的一种或多种(即2、3、4、5、6、7、8、9或所有)细胞角蛋白基因，同时缺少NCAM180、CK20以及CK7。而在此第二种实施方案的再另一个目标中，NSCLC的SCC亚型的G2和非G3期鳞状细胞癌的特点是表达细胞角蛋白基因CK17，缺少NCAM 180、CK20以及CK7。

在第三种实施方案中，NSP-reticulon(又名RTN1)、NCAM、NSE、SYPH和/或CHGA的表达还用于确定肺癌的神经内分泌分化。在该替代性实施方案中，神经内分泌分化的特点是表达选自NSE、SYPH和/或CHGA中的至少两种基因；尤其是表达NSE、SYPH和/或CHGA；更具体而言，NSP和/或NSE被用于区分具有和不具有神经内分泌分化的肺癌。这种具有和不具有神经内分泌起源的肺癌的亚分类可能具有很大的重要性，因为靶向疗法将会变得越来越常用。

与此相似，选自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17以及CK19、NSE和HSP47中的至少一种基因的额外表达以及CK20和NCAM 180的缺乏可以用来区分鳞状和非鳞状NSCLC(包括腺癌或其它亚型的NSCLC)。

在上述第三种实施方案的再另一个目的中，CK8、CK18以及CK20的表达可以用来检测和/或诊断神经内分泌的梅克尔细胞癌。

另外还有一个目标是提供一种用于对受试者的肺癌进行(早期)诊断、分型以及确定分化的体外方法，该方法包括以下步骤：(a)从该受试者获取样本；以及(b)确定选自NCAM、NCAM外显子18、NSP的肿瘤标记基因以及两项或更多项细胞角蛋白抗原(尤其是CK6、CK16以及CK17)的表达；其中所述基因的表达或所述蛋白质的存在或缺失可以检测和/或诊断和/或分型和/或确定该受试者所患肺癌的异质性程度或分期。

在上述任何一种方法中，样本选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊液、泪液、痰涎、黏液、淋巴液、胸腔积液、肿瘤组织以及支气管肺泡灌洗液等。

以上所提及的标记基因的表达水平使用本领域已知的操作确定，通常在蛋白质或核酸水平进行。

确定表达水平的方法包括：

-免疫测定法，其中表达水平使用特异性结合由该基因所编码的蛋白质的抗体确定；或者

-杂交测定法，其中表达水平使用与编码该基因的核酸分子杂交的探针确定。

-免疫组织化学法，其中描述的标记物组用于肿瘤组织中该肿瘤抗原的体外诊断/分型和分期。

-成像法，其中描述的标记物组用于体内诊断以及疾病进程或治疗反应的监控。

例如，对于NCAM 180而言，基因或基因产物的表达特别通过特异于NCAM外显子18区的抗体或DNA-探针检测。如此后实施例中所示，NCAM外显子18的特异性抗体包括但不限于单克隆抗体MUMI21B1、MUM1、MUM4以及MUM6。

在另一方面，本发明提供了将此前所鉴定的基因用于监控受试者对肺癌治疗的反应。

在一种实施方案中，所述基因用于肺癌的体内成像，更具体而言，选自NCAM、NCAM外显子18、CK6/16/CK17、RTN1、SYPH、CHGA以及NSE的基因被用于这些体内成像技术。

可以使用本领域已知的体内成像技术，例如使用计算机断层扫描(CT)、正电子放射断层造影术(PET)和/或PET-CT等。

本发明的又一个方面还涉及用于受试者肺癌分型或分期的试剂盒，其中包括用来确定本发明中确定的基因的表达的试剂。

在以下将更详细的说明本发明的这些及其它方面。

序列说明

SEQ ID NO：1是人类NCAM外显子18的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是人类NCAM外显子18的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是人类NCAM 180的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是人类NCAM 180的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是人类NCAM外显子18片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是由SEQ ID NO：5编码的人类NCAM外显子18片段的氨基酸序列。

附图简要说明

图1：差异表达PCR原理示意图。对于A组引物，正向引物设计在外显子17中，逆向引物在外显子19中。对于B组引物，正向以及逆向引物均设计在NCAM外显子18中。对表达NCAM 140的细胞的PCR扩增，采用A组引物得到了一个180bp的PCR产物，采用B组引物无扩增子。表达NCAM 180的细胞采用B组引物获得600bp的PCR扩增子。表达NCAM 140以及NCAM 180的细胞采用两组引物均得到PCR产物。

图2：作为NCAM 180一部分的NCAM外显子18，在源自小细胞肺癌(SCLC，N＝4)的细胞培养物中过度表达，在非小细胞肺癌(NSCLC，N＝5)和健康对照组的外周血单个核细胞(PBMC)中没有表达，而在源自神经内分泌肿瘤(SH-SYSY以及CCI)的细胞系中有低度到中度表达。表达NCAM外显子18的细胞在NCAM外显子18特异性PCR中产生了604bp的PCR产物。表达NCAM 140 kDa剪接变体的细胞在NCAM外显子17-19PCR扩增反应中产生180bp的产物。

图3：肺癌患者(N＝7，黑色条)和对照组(N＝7，灰色条)血清中的NCAM抗原检测。使用夹心式ELISA测量血清抗原水平。ELISA板使用NCAM特异性单克隆捕获抗体(123C3)包被并使用BSA封闭。以经过1∶4稀释的血清进行孵育并添加生物素标记的NCAM特异性检测抗体(RNL-1)。使用过氧化物酶偶联的链霉亲和素和TMB底物进行NCAM血清抗原水平检测。分别显示患者和对照组在血清样本中测得的代表NCAM抗原水平的OD₄₅₀值。

图4：在免疫组织化学法中显示的原发性人类肺部肿瘤的NSP表达。

图5：肺癌患者(N＝7，黑色条)和对照组(N＝7，灰色条)血清的NCAM外显子18-抗原检测。使用夹心式ELISA测量血清NCAM外显子18-抗原水平。ELISA板使用捕获抗体包被并使用BSA封闭。所使用的捕获抗体为A-C：MUMI21B2，以及D：RNL-1。将经过1∶4稀释的血清样品进行孵育并添加生物素标记的检测抗体。所使用的检测抗体为A：MUM1，B：MUM4，C：MUM6以及D：MUMI21B2。使用过氧化物酶偶联的链霉亲和素和TMB底物进行抗原检测。对于NCAM外显子18-抗原检测，我们使用了4对不同的抗体对。

图6：对组织阵列的免疫组织化学分析表明在鳞状细胞癌(SCC)中发现了蛋白质的过度表达。针对每一种抗体显示了支气管上皮、鳞状细胞癌、腺癌以及大细胞癌染色的代表性图片。

图7：使用肺癌亚型特异性生物标记物的诊断指引。阳性血清抗原滴度：黑色；无血清抗原滴度：白色；不同的抗体对之间可能有差异的疾病阶段特异性反应：浅灰色。Adeno：腺癌；NE：神经内分泌；LC：大细胞癌；COPD：慢性阻塞性肺病；SCLC：小细胞肺癌；NSCLC：非小细胞肺癌。

发明详述

本发明提供生物标记物，如核酸分子及其表达产物，其中与取自非癌症受试者的健康细胞相比，这些生物标记物在取自肺癌患者的健康细胞和/或恶性肺癌细胞中差异表达。这些生物标记物可以用于快速多因子测定中，以进行肺癌的早期检测，区分不同亚型的肺癌以及确定已知肺癌的异质性程度。

癌症

“癌症”或“瘤(neoplasm)”是指任何不具备生理功能的不需要的生长。一般情况下，瘤细胞已经脱离其正常的细胞分裂控制，即是生长不被细胞环境中一般生物化学和物理影响所调控的细胞。在大部分情况下，瘤细胞会增殖形成细胞克隆，该细胞克隆可以是恶性的。

癌症这一术语包括在技术上属于良性但也具有转为恶性风险的细胞生长。“恶性”是指任何细胞类型或组织的不正常生长。恶性这一术语包括恶性前的细胞生长。

该术语还包括任何癌症、癌(carcinoma)、瘤、瘤形成或肿瘤(tumor)。大部分癌症属于三种广义的组织学分类：癌(carcinoma)，其为最常见的癌症，是上皮细胞或覆盖器官、腺体或其它身体结构(如皮肤、子宫、肺、乳腺、前列腺、胃、肠)的外表面或内表面的细胞的癌症，而且往往会发生转移；肉瘤(sarcoma)，产生于结缔组织或支持组织(如骨骼、软骨、肌腱、韧带、脂肪和肌肉等)；以及血液系统肿瘤，其产生于骨髓和淋巴组织。癌可以是腺癌(一般在具备分泌功能的器官或腺体中生长，如乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱)或者鳞状细胞癌(产生于鳞状上皮并且通常在身体的大部分部位生长)。

癌症也可以根据其产生的器官(即“原发部位”)来命名，例如，乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、结肠直肠癌、宫颈癌以及子宫癌等等。即使当癌症转移到原发部位以外的其它身体部位时，这种命名方式仍然沿用。根据原发部位命名的癌症可能与组织学分类相关联。例如，肺癌或支气管肺癌通常发生在肺部上皮细胞，并且一般被归类为“小细胞肺癌”或“SCC”和“非小细胞肺癌”或“NSCLC”。NSCLC包括腺癌、鳞状细胞癌以及大细胞肺癌。如之前所概述的，本发明的生物标记物特别适用于对患者中不同类型的肺癌进行表征。

生物标记物

本发明提供生物标记物，如核酸分子及其表达产物，其中与取自非癌症受试者的正常细胞相比，这些生物标记物在取自肺癌患者的组织学正常细胞和/或恶性肺癌细胞中差异表达。

“生物标记物”是指具有特定生物属性的分子标记物，在本发明中所使用的是核酸分子(如基因或基因片段)或其表达产物(如多肽或肽片段或其变体)，该生物标记物在细胞或组织中的差异表达(存在、缺乏、相对于参照物的过量表达或表达不足等)可以表明是否存在肺癌。本发明中所使用的“表达产物”是经过转录的有义或反义RNA分子(如mRNA)，或者对应于或衍生自多核苷酸序列的翻译多肽。在一些实施方案中，表达产物可以指与转录自多核苷酸序列的RNA表达产物相对应的扩增产物(扩增子)或cDNA。“一组”生物标记物是指选择两项或更多项生物标记物的组合。

“差异表达(differential expression)”或“差异地表达(differentially expressed)”是指与参考细胞或组织或样本相比，取自肺癌患者的细胞或组织或样本中生物标记物的频率或数量或两者均有的差异，例如取自肺癌患者的恶性肺癌细胞和/或正常细胞(即具有与恶性肿瘤相关改变的细胞)与参照或正常细胞(例如取自未患癌症或患有不可检测的癌症的患者的细胞或取自已经经过成功切除肺癌手术的患者的正常细胞)相比。在一些实施方案中，对照或参照细胞可以是SCLC或NSCLC。在一些实施方案中，差异表达是指恶性肺癌细胞与参照细胞相比，生物标记物的频率或数量或两者皆有的差异。例如，生物标记物的差异表达可以指与参照受试者的样本相比，生物标记物在肺癌患者样本中的表达水平增加或减少，例如，取自肺癌患者的血液、尿液、唾液、血清、胸腔积液或支气管肺泡灌洗液样本中测得的蛋白质水平或抗体滴度与取自非肺癌对照组(包括健康受试者和患有支气管炎和毛细支气管炎等呼吸道感染的受试者)的血液、尿液、唾液、血清、胸腔积液或支气管肺泡灌洗液样本中测得的蛋白质水平或抗体滴度。或者或另外，生物标记物的差异表达可以指与参照受试者样本相比，在肺癌患者样本中以较高或较低频率检测到生物标记物。生物标记物可以在数量、频率或两者上均有差异地存在。在一些实施方案中，本发明所述的生物标记物差异表达可以在不同的时间点测量，例如在治疗之前和之后。“表达水平”是指细胞中由基因编码的mRNA以及pre-mRNA新生转录本、转录本处理中间体、成熟mRNA以及降解产物的水平，和/或细胞中蛋白质、蛋白质片段和降解产物的水平。

生物标记物在数量或频率或两者方面的差异可以使用任何适用的技术测量，如统计技术。例如：如果在肺癌样本中检测到生物标记物的频率显著高于或低于参考样本，则在肺癌样本和参考样本之间生物标记物可能是差异表达，如使用标准的统计分析测量的，例如Student-t检验，其中一般认为p＜0.05具有统计学的显著意义。在一些实施方案中，如果与参考样本相比，在肺癌中以至少大约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多或2-、5-、10倍或更多倍的更高或更低频率检测到，则该生物标记物是差异表达的。或者或另外，如果肺癌中生物标记物的数量在统计学上具有显著不同，例如与例如参考样本中生物标记物的数量相比有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多或者多2-、5-、10倍或更多倍不同，或者在一种样本中可检测，而在其它样本中无法检测，则该生物标记物是差异表达的。在一些实施方案中，差异表达是指：测试样本与参考样本相比，在表达增加或减少上达到至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多或者2-、5-、10倍或更多倍。

“样本”可以是分离自受试者的任何器官、组织、细胞或者细胞提取物，例如分离自患有肺癌或者具有患肺癌风险(如根据家族病史或者个人病史，如较重的吸烟习惯)的哺乳动物的样本。例如，样本可以包括但不限于取自患有肺癌的哺乳动物的肺实体肿瘤细胞或组织(如通过活组织检查或尸体解剖获得的)、痰涎、咳嗽物、支气管肺泡灌洗液、支气管刷洗液、口腔粘膜、外周血液、全血、红细胞浓缩物、血小板浓缩物、白细胞浓缩物、血液细胞蛋白、血浆、富含血小板的血浆、血浆浓缩物、血浆的任何分馏沉淀物、血浆的任何分馏上清液、血浆蛋白级分、纯化或部分纯化的血液蛋白或其它成分、血清、组织或细针活组织检查样本以及胸腔积液等，或取自患者(人类或动物)、测试受试者、健康志愿者或实验动物的任何其它样本或其任何提取物。受试者可以是人类、大鼠、小鼠、非人类灵长类动物等。样本还可以包括组织切片，如用于组织学用途的冷冻切片。“样本”还可以是依照实验条件创建的细胞或细胞系，其并非直接取自受试者。

“对照(组)”或“参照(组)”包括为确定基线表达或活性而获取的样本。因此，可以从许多不同的途径获取对照样本，包括从非癌症细胞或组织中获取，例如从受试者的肿瘤或癌症细胞周边细胞中获取；从无癌症的受试者中获取；从非怀疑具有癌症风险的受试者中获取；或者从源自这些受试者的细胞或细胞系中获取。对照组还包括预先确定的标准，例如预先表征的SCLC、NSCLC，包括SQC、AC以及具有或不具有神经内分泌起源的NSCLC。因此，依照本发明进行的任何测试或测定可以与确定的标准进行对比，并且并非每次都必须获取对照样本用于对比。

依照本发明用于不同类型的肺癌分型的生物标记物包括NCAM120、NCAM 140、NCAM 180、细胞角蛋白(CK)、神经内分泌特异性蛋白质(NSP)-teticulon(RTN1)、突触囊泡蛋白(SYPH)、嗜铬粒蛋白(CHGA)、甲状腺转录因子(TITF-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和HSP47。这些生物标记物中的两项或更多项，即2、3、4、5、6、7种生物标记物至所有生物标记物，可以以任何组合共同用于依照本发明进行的测定。在一些实施方案中，一种或多种生物标记物可以从测定中明确排除(如上)。在一些实施方案中，可以使用特定的组合，例如在区分SCLC和NSCLC时。在本发明的一个具体实施方案中，NCAM 180与选自NCAM 120、NCAM 140、细胞角蛋白(CK)、reticulon 1A(RTN1)、CD45、突触囊泡蛋白(SYPH)、嗜铬粒蛋白(CHGA)、甲状腺转录因子(TITF-1)、γ神经元特异性烯醇化酶(γNSE)和HSP47中的至少一种或多种生物标记物配合使用。在该实施方案中，NCAM 180 kDa剪接变体表达由针对NCAM外显子-18区的抗体或探针具体确定。

本发明所述的生物标记物包括核酸分子的基本上相同的同系物和变体以及如本文所述的表达产物，例如，包括编码在功能上与本发明所述生物标记物等同之多肽的核苷酸序列的分子，如具有一个或多个核苷酸置换、添加或缺失的序列的分子，例如等位基因变体或剪接变体或物种变体或由于遗传密码简并性而与本文表格所列的核酸分子和多肽不同的分子。物种变体是指在一种与另一种物种之间不同的核酸序列，但由其产生的多肽通常相互之间具有很高的氨基酸相同性和功能类似性。多态变体(如单核苷酸多态性或SNP)是在指定物种的受试者之间，特定基因的核酸序列的差异。

“基本相同”的序列是指氨基酸或核苷酸序列与参照序列的差别仅在于一个或多个保守型置换(如本文所述)或者一个或多个位于序列上不破坏氨基酸或核酸分子生物学功能的位置处的非保守型置换、缺失或插入。当使用例如比对程序(Myers and Miller，CABIOS，1989，4：11-17)或FASTA与用于比较的序列在氨基酸或核苷酸水平上进行最佳比对时，此类序列可以是10％至99％的任何整数百分比，或者更为一般的情况下是至少10％、20％、30％、40％、50、55％或60％，或至少是65％、75％、80％、85％、90％或95％，或达到96％、97％、98％或99％的同一性。对于多肽而言，对比序列的长度可以至少是2、5、10或15个氨基酸，或者至少是20、25或30个氨基酸。在另外的实施方案中，对比序列的长度可以至少是35、40或50个氨基酸，或者在60、80或100个氨基酸以上。对于核酸分子而言，对比序列的长度可以至少为5、10、15、20或25个核苷酸，或者至少30、40或50个核苷酸。在其它实施方案中，对比序列的长度可以是至少60、70、80或90个核苷酸，或者在100、200或500个核苷酸以上。序列相同性可以使用可公共获取的序列分析软件(如威斯康星大学生物科技中心的Genetics Computer Group提供的序列分析软件包，地址1710University Avenue，Madison，Wis.53705，或者国家医药图书馆提供的BLAST软件，或如本文所述的软件)容易地进行测量。有用的软件的例子包括Pile-up和PrettyBox程序。此类软件通过对各种缺失、置换及其它修饰指定同源性的程度来匹配相似的序列。或者或另外，如果两种核酸序列在高度严格的条件下杂交，则它们也可以是“基本相同”的。在一些实施方案中，高度严格的条件是例如能够允许发生在以下条件发生的杂交相当的杂交的条件：使用长度为至少500个核苷酸的DNA探针，在含有0.5M NaHPO4，pH 7.2，7％SDS，1mM EDTA和1％BSA(级分V)的缓冲液中，在60摄氏度的温度；或者在含有48％甲酰胺，4.8x SSC，0.2M Tris-Cl，pH 7.6，Ix Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖以及0.1％SDS的缓冲液中，在42摄氏度的温度。(这些是典型的高度严格的Northern或Southern杂交条件。)执行杂交的时间可以是大约20至30分钟，或大约2至6小时，或大约10至15小时，或24小时以上或更长。高度严格的杂交还依赖于分子生物学家日常执行的各种成功的技术，例如高度严格的PCR、DNA测序、单链构象多态分析以及原位杂交。与Northern和Southern杂交不同，这些技术通常使用相对较短的探针进行(如PCR的探针通常为16个核苷酸或更长，原位杂交的探针通常约为40个核苷酸或更长)。这些技术中所使用的高度严格的条件是分子生物学领域技术人员所熟知的，它们的实例也可以在诸如Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1998)中查找到，现将这些文献通过引用并入本文。

使用生物标记物制备试剂

本文所述的生物标记物可以用于制备寡核苷酸探针和抗体，这些探针和抗体与本文表格所列的生物标记物及其同系物和变体杂交或特异性结合。

抗体

“抗体”包括具有抗原结合区的分子，例如任何同种型的完整抗体(IgG、IgA、IgM、IgE等等)及其片段。抗体片段包括Fab′、Fab、F(ab′)2、单域抗体、Fv、scFv等。抗体可以使用标准的制备技术来制备，例如Harlow and Lane中所述的制备技术(Harlow and Lane Antibodies；A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)或本领域技术人员已知的制备技术。例如，本发明中的多肽生物标记物的编码序列可以纯化至兔子免疫所必需的程度。为尽力将抗血清潜在的低亲和力或特异性的问题降至最低，可以针对每一种蛋白质生成两种或三种多肽构建体，并且每一种构建体均可注射到至少两只兔子体内。抗血清可以通过一系列注射来产生，最好包括至少三次加强注射。初次免疫可以使用弗氏完全佐剂进行，而后续的免疫可以使用弗氏不完全佐剂进行。抗体滴度可以通过使用纯化蛋白质进行的Western印迹法以及免疫沉淀分析进行监控。可以使用CNBr-琼脂糖偶联的蛋白质对免疫血清进行亲和纯化。可以使用一组非相关蛋白确定抗血清的特异性。抗体片段可以重组制备，也可以通过蛋白水解切割制备。可以产生与本发明所述的多肽生物标记物的相对独特的免疫原区相对应的肽，并且通过引入的C末端赖氨酸与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联。针对这些肽中每一种的抗血清可以在与BSA缀合的肽上获得亲和力纯化，并且使用肽缀合物在ELISA和Western印迹中以及通过Western印迹法和免疫沉淀法进行特异性测试。

与本发明所述的任何一种多肽生物标记物特异性结合的单克隆抗体可以依照标准的杂交瘤技术进行制备(见，例如，Kohler等人，Nature 256：495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。或者可以使用本发明所述的多肽和噬菌体展示库(Vaughan等人，Nature Biotech 14：309-314，1996)制备单克隆抗体。一经产生，还可以使用Western印迹法或免疫沉淀反应法测试单克隆抗体的特异性识别。

在一些实施方案中，可以使用可能具有免疫原性的的多肽片段来制造抗体，所采用的标准如高频率的带电残基。抗体可以经过定制，例如通过使用含有来自一种物种的抗原结合结构域和来自另一种物种的Fc部分的嵌合抗体，或使用由适当物种的杂交瘤制成的抗体，从而将负面宿主免疫应答降至最低。例如，在使用NCAM 180时，抗体被定制成特异于NCAM外显子18区，也称为MUM蛋白质或NCAM-MUM(见PCT公开WO 2007-104511)。

当抗体识别并结合一种抗原(如本文所述的生物标记物)，但并非充分识别和结合样本中的其它分子时，该抗体“特异性结合”该抗原。这种抗体例如对于该抗原具有亲和性，比该抗体对于样本中其它参照分子的亲和性高出至少2、5、10、100、1000或10000倍。在此类条件下进行的抗体特异性结合可能要求该抗体是经选择对特定生物标记物具有特异性。例如，可以对针对来自特定物种例如大鼠、小鼠或人类的生物标记物而产生的多克隆抗体进行选择，以仅获得那些对该生物标记物具有特异免疫反应性而对其它蛋白质(除该生物标记物的多态变体和等位基因以外)没有特异免疫反应性的多克隆抗体。在一些实施方案中，可以对针对来自特定物种例如大鼠、小鼠或人类的生物标记物产生的多克隆抗体进行选择，以仅获得那些对来自该物种的生物标记物具有特异免疫反应性而对其它蛋白质(包括该生物标记物的多态变体和等位基因)没有特异免疫反应性的多克隆抗体。通过将样本与抗体接触并检测样本中是否存在与生物标记物结合的抗体复合体，特异性结合本文所述任何生物标记物的抗体可以用于免疫测定中。免疫测定中使用的抗体可以按本文所述的方法或本领域已知的方法制造，或者可以通过例如Dako Canada，Inc.，Mississauga，ON等供应商购买获得。在与样本接触之前，抗体可以固定在固体基质(如尼龙、玻璃、陶瓷、塑料等)上，从而方便后续的测定程序。抗体-生物标记物复合体可以使用各种标准程序进行可视化或检测，例如检测放射性、荧光性、发光、化学发光、吸光度或通过显微镜检查、医学成像等方法检测。免疫测定法包括免疫组织化学法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、western印迹法、免疫放射测定法(IRMA)、侧向流、消散法(evanescence)(DiaMed AG，Cressier sur Morat，Switzerland，如欧洲专利公开EP1371967，EP1079226以及EP1204856所述)、免疫组织/细胞化学法以及本领域技术人员所知的其它方法。可以使用免疫测定法来确定样本中是否存在生物标记物，以及该生物标记物在样本中的量。抗体-生物标记物复合体的量可以通过与参照物或标准(例如样本中存在的已知多肽)进行对比来确定。抗体-生物标记物复合体的量还可以通过与参照物或标准(例如参照或对照样本中生物标记物的量)进行对比来确定。因此，样本中生物标记物的量无需绝对量化，而是可以针对参照或对照组进行相对测量。

探针和引物

“探针”或“引物”是指具有确定序列的单链DNA或RNA分子，其能够与含有互补序列(靶标)的另一DNA或RNA分子碱基配对。形成的杂合分子的稳定性取决于发生的碱基配对的程度，并且受诸如探针和靶标分子间互补性程度以及杂交条件的严格性等参数的影响。杂交严格性的程度受诸如温度、盐浓度以及有机分子(如甲酰胺)浓度等参数的影响，并且可以使用本领域技术人员已知的方法确定。本文所述核酸生物标记物或其部分的特异性探针或引物的长度可以在至少8个核苷酸到超过500个核苷酸之间变化，可以是其中任何整数值，其长度取决于该探针或引物使用的目的和条件。例如，探针或引物的长度可以是8、10、15、20或25个核苷酸，或者可以至少有30、40、50或60个核苷酸，或者可以是100、200、500或1000个核苷酸以上。对于本文所述的核酸生物标记物具有特异性的探针或引物可以与本文所述的核酸生物标记物具有20-30％以上的序列一致性，或者至少55-75％的序列一致性，或者至少75-85％的序列一致性，或者至少85-99％的序列一致性，或者100％的序列一致性。探针或引物可以通过例如扩增从基因组DNA或cDNA中产生，或者从克隆DNA片段中产生，并且可以含有代表来自单一受试者的单个基因的全部或部分的基因组DNA或cDNA序列。探针可以拥有独特的序列(如与核酸生物标记物100％一致)和/或拥有已知的序列。探针或引物可以通过化学方式合成。探针或引物可以在如本文所述的高度严格的条件下与核酸生物标记物杂交。

探针或引物可以通过本领域技术人员已知的方法进行放射性或非放射性地可检测性标记。探针或引物可用于涉及核酸杂交的肺癌检测方法，例如核酸测序、通过聚合酶链反应(如RT-PCR)进行的核酸扩增、单链构象多态分析(SSCP)、限制性片段多态性分析(RFLP)、Southern杂交、northern杂交、原位杂交、电泳迁移率变动分析(EMSA)、荧光原位杂交(FISH)以及本领域技术人员所知的其它方法。

“可检测性地标记”是指任何标记或鉴别分子例如寡核苷酸探针或引物，基因或其片段，或者cDNA分子存在的方法。对分子进行可检测性地标记的方法为本领域技术人员所熟知，包括但不限于放射性标记(例如，使用如³²P或³⁵S等同位素)和非放射性标记如酶标记(例如，使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光标记、荧光标记(例如，使用荧光素)、生物发光标记或附着于探针的配体的抗体检测等。此外，本定义还包括使用间接途径进行可检测性地标记的分子，例如，与第一部分(如生物素)结合的分子，该第一部分进而与可观察或检测的第二部分(如使用荧光素标记的链霉亲和素)结合。标记还包括地高辛、萤光素酶以及发光蛋白质。

阵列和试剂盒

使用本发明中的生物标记物制备的抗体、探针、引物以及其它试剂可用于制备肺癌检测中所使用的阵列。“阵列”或“矩阵”是指可寻址位置或“地址”的模式或安排，每一个位置或地址代表表面上一个独立的点。阵列通常要求核酸分子、多肽、抗体、组织等以指定的空间排列在上面附着的固体支撑(如尼龙、玻璃、陶瓷、塑料等)，从而可以轻易的确定与探针的杂交模式。

一般而言，探针(如抗体、核酸探针或引物、多肽等等)被固定在阵列表面上，并且在适合结合的条件下与含有目标结合伴侣(如果是抗体，即指与该抗体特异性结合的多肽；或者，如果是探针，则为与该探针杂交的核酸分子)的样本接触。如果需要，可以清除样本中未结合的材料。结合的靶标接受检测，并且使用适当的统计或其它方法对结合结果进行分析。探针或靶标可以进行可检测的标记，以方便检测及以后的分析。可以使用与本发明所述的生物标记物相对应的多个探针。所述多个探针可以对应于本发明所述生物标记物中的一个或多个。除了能够结合本发明所述的生物标记物的探针以外，阵列还可以含有对照和参照核酸分子、多肽或抗体，以允许进行不同实验之间结果的标准化以及在定量水平上对多个实验进行对比。因此，本发明提供了使用核酸、多肽、抗体或细胞学阵列的生物学检定方法。

本发明还提供了用于检测肺癌的试剂盒。该试剂盒可以包括一种或多种与本发明所述的生物标记物相对应的试剂，如与体液中作为抗原分泌的生物标记物特异性结合的抗体、与生物标记物特异性抗体结合的重组蛋白、与生物标记物杂交的核酸探针或引物等。在一些实施方案中，该试剂盒还可以包括多种试剂，如在阵列上，对应于本发明所述生物标记物。该试剂盒还可以包括检测试剂，如被可检测性地标记的试剂。该试剂盒还可以包括用于肺癌(早期)检测和分型的书面说明书，并且也可以包括其它试剂和资料，如对照或参考标准、清洗溶液、分析软件等。

诊断及其它方法

可以通过免疫测定(如免疫组织化学法)、ELISA、western印迹法或本领域技术人员已知的任何其它方法检测本发明所述的一种或多种生物标记物的差异表达来进行肺癌的诊断。检测可以在体外或体内进行。

虽然单个的生物标记物是有用的诊断剂，但本发明所提议的生物标记物组合能够对肺癌进行精确的(早期)诊断和分型。

多种生物标记物在不同样本中差异表达的变化可以用来诊断或预测是否存在特定类型的肺癌、对于特定肺癌疗法的反应，或者更好的评估患上肺癌的风险。例如，NCAM 180和/或CK8以及CK18的表达，以及CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17和CK20的缺乏，可以用来检测样本中是否存在SCLC。NSCLC的特点是缺少NCAM 180，而存在CK19，CK6/CK16/CK17和/或CK8/CK18。可以使用适当的统计方法和算法，如逻辑回归算法，进行分析并且将多种生物标记物用于诊断、预后、治疗或其它目的。生物标记物(或生物标记物的特定组合)可以多次进行检测和测量，例如，在肺癌治疗之前、期间以及之后进行。

本文所述的生物标记物检测可以作为肺癌(早期)检测和分型的初步筛选和/或可以与传统的肺癌诊断方法配合使用，例如痰细胞检查、胸部X光、CT扫描、螺旋CT、PET、具有特定追踪剂(如⁸⁹Zr，¹¹C)的PET-CT、荧光染色、闪烁扫描术、活组织切片检查、传统形态学MAC分析等。本文所述的生物标记物检测还可以与预先认定的肺癌生物标记物(如pRb2/pl30、p53和/或ras)配合进行。本文所述的生物标记物的检测可以作为日常检查的一部分来进行，例如，对于特定年龄(如60岁以上)的重度吸烟者进行的检查；或者可以进行该检测以确定具有肺癌风险的受试者(如重度吸烟者)中生物标记物的基线水平。

一般情况下，本发明中的生物标记物组将用于分子成像(包括以上所述的体内成像技术)，用于分子诊断和/或检测和/或监控肺癌的治疗。

对本文所述生物标记物的检测使医师能够根据诊断结果为受试者确定适当的处理方案(如继续测试、手术、不采取措施等等)。对本文所述生物标记物的检测还可以帮助确定肺癌的存在或不存在、进行肺癌的早期诊断、肺癌的预后、肺癌的分型、对肺癌疗法的有效性进行评估、对受试者接受的肺癌治疗进行监控、或者检测经历肺癌治疗并且处于病情减退的受试者中，肺癌的复发。在其它方面，生物标记物以及使用生物标记物制备的试剂可以用来鉴定肺癌治疗剂。试剂盒和阵列可以用来衡量根据本发明的生物标记物，对肺癌进行诊断和分型。试剂盒还可以用来监控受试者对肺癌疗法的反应，使医师能够根据测试结果对治疗方法进行修改。试剂盒还可以用来鉴定并验证肺癌治疗剂，如小分子、肽等等。

通过参照以下所列的实验细节，将可以更好的理解本发明。但是，本领域技术人员将会轻易的发现，这些实验细节仅仅是本发明的举例说明，不应被解释为限制本发明的范围。此外，在本申请文件的全文中引用了各种出版物。这些出版物的公开内容现通过引用并入本申请文件中，从而更详尽的说明本发明所属技术领域的状态。

实施例

以下实施例对本发明进行了举例说明。所属技术领域的技术人员根据这些实施例将知晓其它实施方案。

实施例1：检查NCAM 180(NCAM外显子180)在各种细胞谱系中的差异表达的实验。

在不同的癌细胞系和健康对照组中对NCAM-180的差异表达进行评估，使用的已知技术流程包括：

-根据标准方案进行的RNA提取和cDNA合成；以及

-根据图1所示原理进行PCR扩增以评估NCAM外显子18的表达。

作为NCAM-180的一部分，在取自神经内分泌肿瘤(SH-SYSY和CCI)的细胞培养物中发现了NCAM外显子18的表达，尤其是在小细胞肺癌(SCLC)细胞系中发现了明显的过量表达(图2)。在健康对照组的外周血单个核细胞(PBMC)中没有发现NCAM 180 kDa剪接变体的表达。其它细胞系的结果如表1所示。

实施例2：用于肺部肿瘤神经内分泌区分的血清标记物

a.检测人体血清样本中的NCAM抗原。

NCAM，包括剪接变体NCAM 120、140以及180，是一种神经内分泌分化标记物。NCAM表达于所有小细胞肺癌(SCLC)和20％的非小细胞肺癌(NSCLC)中。此外，还对所有具有神经内分泌分化特征的肿瘤、占外周血单个核细胞(PBMC)总数10％的自然杀伤细胞(NK)以及在NSCLC基质中对NCAM表达进行了描述。另一方面，在正常的肺组织中，仅仅是偶尔发现NCAM表达。在本实验中，我们发现可以在表现出具有神经内分泌分化肿瘤的患者血清(SCLC血清(N＝7，PromedDx))中检测到NCAM抗原，而在健康对照组(N＝7，健康志愿者)的血清中没有发现NCAM抗原。我们使用了夹心式ELISA来测量作为神经内分泌肿瘤标志物的NCAM在患者和对照组血清中的水平。使用NCAM特异性单克隆抗体123C3(10ug/ml)进行抗原捕获，并且使用经过生物素化的NCAM特异性单克隆抗体RNL-1(20ug/ml)进行检测。RNL-1和123C3均可识别NCAM-蛋白质胞外区的表位，因此NCAM 120以及NCAM 140和NCAM 180kDa剪接变体可以检测到。使用夹心式ELISA测量NCAM的血清水平。因此，于4℃使用NCAM特异性单克隆捕获抗体(10ug/ml置于pH9.5的碳酸盐缓冲液中)将NUNC maxisorb 96微孔滴定板包被过夜。滴定板使用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤2次，并且在37℃在PBST中的4％BSA封闭2小时。将稀释(使用4％BSA/PBST稀释)后的血清样本在37℃孵育2小时，将滴定板洗涤3次，然后添加经过生物素化的NCAM抗原特异性单克隆检测抗体(RNL-1-生物素：20ug/ml，处于PBST+1％BSA中)。将滴定板洗涤6次，然后添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(DAKO，P0397)偶联物(使用PBST+1％BSA按1/1000比例稀释)。该偶联物在37℃孵育45分钟。将滴定板洗涤6次，添加3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Calbiochem，CL07)底物，并于37℃15分钟后使用0.5M H₂SO₄停止反应。

图3显示，使用单克隆抗体123C3作为捕获抗体，RNL-1作为检测抗体，除一个SCLC患者样品外，所有其他SCLC患者样本都表达明显的NCACM抗原滴度，在患者血清中测得的值显著高于健康对照组血清。在本实验中，我们使用了1∶4稀释的血清样本。如果使用未经稀释的血清样本，我们预期检测的灵敏度能够达到100％，即根据对NCAM抗原水平的血清检测，所有具有神经内分泌特征的肺部肿瘤均可在血清中通过对NCAM抗原滴度测量进行诊断。这些数据表明，2种具有不同表位特异性的NCAM特异性单克隆抗体可以用来在一种简单且高通量的实验室试验中用于测量人体血清中的NCAM抗原滴度(表2)。此外，这些数据表明，与健康对照组相比，SCLC患者组中的NCAM抗原滴度要高得多(图3：T-检验，p＝0.015)。这些数据表明NCAM抗原的血清水平可以用作神经内分泌肿瘤的诊断性生物标记物。NCAM的表达还可以与NSE、SYN、CHGA以及SYPH一起用作标记物，以区分具有或不具有神经内分泌起源的肺癌。

表2：用作肺部肿瘤神经内分泌区分的生物标记物组

NE区分标记

NE：神经内分泌；C：捕获抗体；D：检测抗体；Ext：延伸疾病状态；3a、3b、4：分别指3a期、3b期以及4期疾病阶段；黑色：阳性血清抗原滴度；白色：无血清抗原滴度

b.Reticulon检测作为神经内分泌区分的标志物

神经内分泌特异性蛋白(NSP)，也称为reticulon1(RTN1)，是内质网相关的蛋白质复合体，其被描述为正常和恶性细胞神经内分泌区分的标志物。NSP可以表达为135kDa变体(NSP-A/Rtn-1A)、45kDa变体(NSP-B/Rtn-1B)以及23kDa变体(NSP-C/Rtn-1C)¹。

早期研究已经表明，NSP表达是一种可用于对具有和不具有神经内分泌分化的肺部肿瘤进行诊断和分型的潜在生物标志²。使用NSP特异性单克隆抗体，通过免疫组织化学和Western blot分析对正常人体和大鼠组织、原发性人类肺部肿瘤如类癌、非典型类癌、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)以及腺癌肺细胞系中NSP的表达进行了研究^3，4。在正常人体和大鼠组织中，在神经系统和神经内分泌组织中发现有NSP-A表达，并且表明是这些细胞和组织的明显标志物³。除正常组织以外，还在肺癌细胞系中进行了NSP基因表达的研究。Northern印迹表明在18个接受测试的SCLC细胞系中，有17个表达NSP基因，其中有14个为NSP-A阳性。而另一方面，对于非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系，没有发现NSP-A表达(0/11)³。接下来，在原发性人体肿瘤中进行了NSP基因表达研究(图4)。使用对冷冻切片的免疫组织化学染色法，在所有肺类癌(8/8)和20个SCLC肿瘤组织中的14个显示了NSP-A表达^4，5。对于所研究的NSCLC肿瘤组织，没有发现NSP基因表达，除了具有神经内分泌特征的NSCLC组织(NSCLC-NE)以外。这些神经内分泌特征⁴由多种典型的神经内分泌标志物例如神经元特异性烯醇化酶、嗜铬粒蛋白A、突触囊泡蛋白和/或神经细胞粘附分子(NCAM)的表达所证明。在27个NSCLC-NE组织中有13个显示出明显的NSP-A表达。这些数据清楚地表明，NSP-reticulon表达仅限于具有神经内分泌表型的肺癌细胞³。对于所有肺类癌肿瘤以及SCLC而言，神经内分泌表型是一种非常明显的特征，但其仅在大约10％的NSCLC病例中有明显表达。与没有NE特征的NSCLC相比，具有神经内分泌表型的NSCLC可能会在肺癌患者的治疗反应方面产生差异⁵。这些差异之一就是对化学疗法的反应，表明NSCLC的神经内分泌分型对于确定最佳治疗方案是至关重要的。

这些数据表明NSP表达可以用作肺部肿瘤的神经内分泌区分以及差异诊断的一种生物标记物。

我们预期通过在适当的诊断检测试验中使用reticulon特异性RNL-2以及RNL-3单克隆抗体，可以将NSP蛋白质用作肺癌神经内分泌区分的一种血清生物标记物。我们认为结合典型的神经内分泌区分标志物(NCAM、SYN、NSE以及CHGA)使用NSP特异性单克隆抗体，将可以对具有神经内分泌特征的肿瘤实现高灵敏的诊断。据我们所知，这将是首个有关测量reticulon的血清水平用于具有神经内分泌特征的肺癌诊断的报告。

实施例3：测量NCAM 180/NCAM外显子18-抗原的血清水平的实验。

NCAM外显子18在NCAM蛋白质的NCAM 180 KDa剪接变体中特异表达。NCAM外显子18在跨膜糖蛋白NCAM的胞质尾区中特异表达。该NCAM剪接变体对于SCLC是特异性的(见PCT公开WO2007-104511)。通过本试验，我们证明可以在SCLC患者的血清中检测到NCAM外显子18-抗原，并且与健康对照(N＝7)相比，SCLC患者(N＝7)血清中的NCAM外显子18-抗原滴度要高得多。这些数据表明，NCAM外显子18血清抗原滴度可以用作SCLC诊断的生物标记物。使用夹心ELISA来测量血清样本中NCAM外显子18-肿瘤抗原水平。SCLC血清样本(N＝7，3a期(N＝2)、3b期(N＝1)、4期(N＝3)以及延伸疾病期(N＝1))从PromedDx获取，对照血清分离自从健康志愿者(吸烟者和非吸烟者)获取的凝结血。使用夹心式ELISA测量NCAM外显子18-抗原的血清水平。为进行本试验，于4℃使用NCAM外显子18-抗原特异性单克隆捕获抗体(10ug/ml置于pH 9.5的碳酸盐缓冲液中)将NUNC maxisorb 96微孔滴定板包被过夜。滴定板使用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤2次，并且在37℃以PBST中的4％BSA封闭2小时。稀释(使用PBST中的4％BSA稀释)后的血清样本在37℃孵育2小时，将滴定板洗涤3次，然后添加生物素化的NCAM外显子18-抗原特异性单克隆检测抗体(MUM1、MUM4或MUMI21B2：20ug/ml；MUM6：80ug/ml，处于PBST+1％BSA中)。滴定板洗涤6次，然后添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(DAKO，P0397)偶联物(使用PBST+1％BSA按1/1000比例稀释)。该偶联物在37℃孵育45分钟。将滴定板洗涤6次，添加3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Calbiochem，CL07)底物，并于15分钟后在37℃使用0.5M H₂SO₄停止反应。在检测NCAM外显子18-抗原血清水平时，我们使用了不同的捕获-检测抗体对。

SCLC血清(N＝7)和对照组(N＝7)中NCAM外显子18-抗原血清水平的检测结果如图5所示。血清中的NCAM外显子18-抗原的检测使用夹心式ELISA进行，其中使用4种不同的捕获/检测单克隆抗体对。用于血清诊断的MUMI21B2、MUM1、MUM4以及MUM6单克隆抗体是NCAM外显子18-抗原特异性抗体，它们均识别NCAM外显子18-抗原的不同表位。我们的数据表明，使用MUMI21B2作为捕获抗体，MUM1作为检测抗体，在7个SCLC患者血清中有3个(43％)的NCAM外显子18-抗原滴度明显高于健康对照组血清中的滴度。使用这一对捕获-检测抗体，SCLC患者组(N＝7)中的平均NCAM外显子18-抗原表达并没有显著高于健康对照组(N＝7)中的表达。使用MUMI21B2作为捕获抗体，MUM4作为检测抗体，我们发现在7个SCLC患者中有4个(57％)的血清中有明显的NCAM外显子18-抗原滴度，而使用MUMI21B2作为捕获抗体，MUM6作为检测抗体时，则在7个SCLC患者中有6个(86％)发现了更高的NCAM外显子18-抗原滴度。在这些情况下，SCLC患者组中的平均NCAM外显子18-抗原滴度显著高于健康对照组(T-检验，对于MUMI21B2-MUM4为p＝0.015；T-检验，对于MUMI21B2-MUM6为p＝0.018)。概括而言，可以使用NCAM外显子18-抗原特异性单克隆抗体MUMI21B2作为捕获抗体进行NCAM外显子18-抗原的检测。我们还使用RNL-1作为捕获抗体进行NCAM外显子18-抗原滴度的检测。RNL-1是一种NCAM特异性单克隆抗体，其识别此跨膜糖蛋白的胞外区中的表位。使用这种方法时，与7个对照相比，7个SCLC血清中有6个(86％)显示明显的NCAM外显子18-抗原滴度。只有SCLC-1血清中测得的NCAM外显子18-抗原滴度没有明显高于健康对照中的值。对于该患者而言，任何一种捕获检测抗体均未显示NCAM外显子18-抗原滴度与健康对照中的滴度明显不同。这些检测均在1∶4稀释的血清中进行，大大降低了检测限度。因此，如果在夹心式ELISA中使用未经稀释的血清，则可能获得更高的NCAM外显子18-抗原滴度。总体而言，在使用RNL-1作为捕获抗体，MUMI21B2作为检测抗体进行检测时，SCLC患者组中测得的NCAM外显子18-抗原表达的平均水平大大高于对照(p＝0.018)。

我们的数据表明，检测患者血清中的NCAM外显子18-抗原可以用作潜在的生物标记物，用以区分SCLC患者和健康对照(表3)。据我们所知，这是首次测量患者和对照血清中的NCAM外显子18-抗原水平，并且用于SCLC的诊断。我们的数据表明，配合CK8和CK18的表达以及CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17和CK20的缺乏，使用NCAM 180-抗原特异性单克隆抗体组可以提高SCLC诊断的灵敏度。通过使用标记物组合，可以将SCLC患者与健康对照、NSCLC患者以及患有慢性阻塞性肺病(COPD)的患者明确区分开。当存在CK19、CK6/CK16/CK17和/或CK8/CK18而没有发现任何NCAM 180的表达时，可以诊断为NSCLC。

表3：用于SCLC诊断的生物标记物组

SCLC生物标记物

SCLC：小细胞肺癌；C：捕获抗体；D：检测抗体；Ext：延伸疾病状态；3a、3b、4：分别表示3a期、3b期以及4期疾病阶段；黑色：阳性血清抗原滴度；灰色：中/低血清抗原滴度；白色：无血清抗原滴度

实施例4：特定的细胞角蛋白(CK6/CK16和CK17)用作鳞状细胞癌区分和分期的生物标记物

我们使用了蛋白质组学方法确定用于鳞状细胞癌(SCC)的潜在肺癌生物标记物6。鉴于肺癌组织中细胞类型的异质性，我们使用了显微解剖法从组织结构上确定的部位分离出细胞，从而获得尽可能均质的肿瘤细胞材料。可以使用综合了二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)和使用荧光花青染料(Cy3和Cy5)通过半胱氨酸的还原性硫醇基对蛋白质进行的高灵敏度标记的方法7，对通过显微解剖法获得的有限数量的样本材料进行蛋白质组分析。蛋白质组分析在取自正常人体支气管上皮(N＝7)以及G2(N＝7)和G3(N＝7)病理组织学分期的鳞状细胞癌肿瘤的显微解剖组织材料上进行。

通过对由鳞状细胞癌(N＝15)、腺癌(N＝9)、大细胞癌(N＝5)以及正常支气管上皮(N＝23)的代表性区域制成的组织阵列进行免疫组织化学分析来验证蛋白质组命中(proteome hit)数，从而验证所鉴定的蛋白质的表达。对显微切割材料的蛋白质组分析产生了2500个蛋白质点，其中有85个在支气管上皮和G2或G3期肿瘤之间具有显著性的差异表达。与支气管上皮中相比，大部分蛋白质点(88％)在肿瘤组织中更为丰富。通过在凝胶中使用胰蛋白酶消化产生的肽进行MALDI-MS和纳米-HPLC/ESI-MS/MS分析，确定了46种蛋白质点的身份。所鉴定的蛋白质中大部分涉及蛋白质代谢(25％)、代谢和能量途径(31％)、细胞生长和维持(28％)，均是在癌细胞中可能发生改变的途径。根据其可能涉及肿瘤生物学，我们选择了HSP-47、细胞角蛋白6、细胞角蛋白16以及细胞角蛋白17作为进行继续验证的蛋白质。因此，我们通过对组织阵列的免疫组织化学分析，在细胞水平上对表达进行了研究(图6)。免疫组织化学分析表明，与正常的支气管上皮相比，在SCC肿瘤组织中细胞角蛋白6a(CK6a)、细胞角蛋白16(CK16)以及细胞角蛋白17(CK17)的表达更高。在过度增殖性鳞状细胞上皮中，CK6a和CK16均显著地过度表达，因此在鳞状细胞癌中也是如此。在正常支气管、腺癌或大细胞癌中没有发现表达。在鳞状细胞癌中，CK17高度表达，而在腺癌或大细胞癌中没有发现表达。在支气管上皮基底细胞中发现了明显的表达。此外，在10个G2期和5个G3期SCC肿瘤样本中针对CK17进行了更为详细的免疫组织化学分析。与分化不良的G3期SCC肿瘤相比，这些染色结果显示在中度分化的G2期SCC肿瘤中CK17有较高的表达。与支气管上皮相比，HSP-47在SCC中显著过度表达，在腺癌和大细胞肺癌中也同样如此。我们得出结论，CK6a和CK16是SCC的潜在生物标记物，并且Ck17表达可以指示肿瘤负荷，同时也是潜在的SCC肿瘤分期标志物。

我们主张，使用特异性单克隆抗体，我们可以检测血清样本中的CK6a和CK16，并且可以使用滴度来区分SCC和其它NSCLC(腺癌和大细胞癌)以及健康对照组。NSCLC的SCC亚型的特点是，表达选自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17以及CK19中的至少一种细胞角蛋白，并且缺少NCAM 180、CK20和CK7。CK17血清滴度还可以用于指示肿瘤负荷以及用于区分G2和G3期SCC肿瘤阶段。

实施例5：选定的特异性生物标记物的组合可以用于血清测定中对肺癌进行分型和分期。

我们主张：使用针对抗原的特异性单克隆抗体的组合，可以检测NCAM外显子18-抗原、NCAM、NSP以及各种细胞因子的血清抗原水平。下表显示了各种抗原以及相应的特异性捕获抗体和检测抗体对：

我们主张：NCAM外显子18-抗原滴度的血清检测可以用来区分SCLC和NSCLC。

我们主张：对由NCAM、NCAM外显子18-抗原、NSP(尤其是NSP-A)以及两种或更多种细胞角蛋白抗原(尤其是CK6、CK16以及CK17)组成的肿瘤抗原组的血清检测可以用来区分肿瘤患者和COPD等非肿瘤患者，区分SCLC和NSCLC，以及在上述肿瘤中确定带有或不带有神经分泌(NE)起源的肿瘤和鳞状细胞癌(SCC)。在上述组中，NCAM外显子18-抗原组能够区分SCLC和NSCLC，以及区分SCLC和NE肿瘤患者。

在上述组中，NCAM和NSP抗原滴度的血清检测可以用来区分具有NE特征的肺部肿瘤和没有NE起源的肺部肿瘤。

在上述组中，对从CK6a、CK16以及Ck17中选定的特定细胞角蛋白抗原进行的检测可以用来在NSCLC中对SCC进行具体分型。

图7显示了有关如何使用本发明中的肺癌亚型特异性生物标记物的诊断性指引。

参考文献

¹ Senden NH et al，Cluster-10 lung-cancer antibodies recognize NSPs，novel neuroendocrine proteins associated with membranes of the endoplasmic reticulum.Int.J.Cancer Suppl.，8，84-88，1994

² van de Velde HJK et al，NSP-encoded reticulon，neuroendocrine proteins of a novel gene family associated with membranes of the endoplasmic reticulum.Journal of Cell Science，107，2403-2416，1994.

³ van de Velde HJK et al，NSP-encoded reticulons are neuroendocrine markers of a novel category in human lung cancer diagnosis.Cancer Research，54，4769-4776，1994.

⁴ Senden NHM et al，A comparison of NSP-reticulons with conventional neuroendocrine markers in immunophenotyping of lung cancers.Journal of Pathology，182，13-21，1997

⁵ Senden，NHM，Neuroendocrine-specific protein(NSP)-reticulons as independent markers for non-small cell lung cancer with neuroendocrine differentiation.An in vitro histochemicalstudy.Histochem Cell Biol，108，155-165，1997

⁶ Poschmann G et al，Identification of proteome differences between squamous cell carcinoma of the lung andbronchiale pithelium.Molecular and Cellular Proteomics，Jan 27，M800422-MCP200，2009.

⁷ Sitek B et al，Application of fluorescence difference gel electrophoresis saturation labelling for theanalysis of microdissected precursor lesions of pancreatic dnctal adenocarcinoma.Proteomics 5，2665-2679，2005.

Claims

1.一种检测和/或诊断和/或分型和/或分期和/或确定受试者中肺癌的异质性程度的方法，该方法包括以下步骤：(1)从该受试者获取样本；(2)确定NCAM 180或含有NCAM外显子18-抗原区的NCAM剪接变体的表达；以及(3)确定选自NCAM剪接变体NCAM 120或NCAM 140；细胞角蛋白(CK)；神经内分泌特异性蛋白(NSP)-reticulon(RTN1)；突触囊泡蛋白(SYPH)；嗜铬粒蛋白A(CHGA)；甲状腺转录因子-1(TITF-1)；γ神经元特异性烯醇化酶(γNSE)以及热休克蛋白-47(HSP47)中的至少一种肿瘤标志基因的表达；其中，所述基因的表达或所述蛋白质的存在可以检测和/或诊断和/或分型和/或分期和/或确定所述受试者中肺癌的异质性程度。

2.权利要求1所述的方法，其中细胞角蛋白(CK)选自下述组中：CK4、CK5、CK6(有两种细胞角蛋白基因/蛋白质，CK6a和CK6b)、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19以及CK20。

3.权利要求2所述的方法，其中确定至少两种细胞角蛋白基因/蛋白质的表达。

4.权利要求1或2所述的方法，其中确定所述CK基因/蛋白质中至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种的表达/存在情况。

5.权利要求1所述的方法，其中NCAM 180、表达NCAM外显子18(NCAM-MUM外显子，见PCT公开号WO 2007-104511)的NCAM剪接变体、CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17以及CK20的表达可以用来区分SCLC和NSCLC。

6.权利要求5所述的方法，其中SCLC的特征是缺少CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17以及CK20，而表达/检测到NCAM 180、CK8以及CK18。

7.权利要求5所述的方法，其中NSCLC的特征是存在CK19、CK6/CK16/CK17和/或CK8/CK18，而缺少NCAM 180。

8.权利要求1所述的方法，其中NCAM 180、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19和/或CK20的表达可以用来检测和/或诊断NSCLC和/或确定NSCLC的分化或分型(腺癌对鳞状细胞癌)。

9.权利要求8所述的方法，其中NSCLC的腺癌分化或分型的特点是缺少CK20、NCAM 180以及选自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16和CK17中的一种或多种细胞角蛋白基因，而表达CK7、CK8、CK18和CK19。

10.权利要求8所述的方法，其中NSCLC的鳞状细胞癌分化或分型和/或SCC分期的特征是缺少NCAM 180、CK20以及CK7，而表达选自CK4、CK5、CK6、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17和CK19中的至少一种细胞角蛋白基因。

11.权利要求1所述的方法，其中肺癌的神经内分泌分化的特征是表达NCAM以及选自NSE、SYPH以及CHGA中的至少一种基因；或者是表达NCAM、NSE以及CHGA；或者是表达NCAM、NSE、CHGA以及SYPH；或者是表达NSE。

12.权利要求5至11中任何一项所述的方法，其中NSP的表达还可以用来区分具有或不具有神经内分泌起源的肺癌。

13.一种(早期)诊断、分型以及确定受试者中肺癌的分化的体外方法，该方法包括以下步骤：(a)从该受试者获取样本；以及(b)确定选自NCAM、NCAM外显子18、NSP(尤其是NSP-A)的肿瘤标志基因以及两种或更多种细胞角蛋白抗原(尤其是CK6、CK16以及CK17)的表达；其中所述基因的表达或所述蛋白质的存在或缺乏可用于检测和/或诊断和/或分型和/或确定该受试者中肺癌的异质性程度或阶段。

14.权利要求5至13中任何一项所述的方法，其中HSP47的表达还可以用来区分鳞状细胞癌和非鳞状细胞癌，所述非鳞状细胞癌是指腺癌或其它NSCLC亚型。

15.权利要求7至11中任何一项所述的方法，其中CK8、CK18以及CK20的表达可用来诊断神经内分泌梅克尔细胞癌。

16.权利要求1至15中任何一项所述的方法，其中所述样本选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊液、泪液、痰涎、黏液、淋巴液、胸腔积液、肿瘤组织以及支气管肺泡灌洗液等。

17.权利要求1至16中任何一项所述的方法，其中所述基因的表达水平由使用特异性抗体或探针在蛋白质水平或核酸水平确定。

18.权利要求17所述的方法，其中表达水平由化学发光、吸光度、western印迹、显微镜检查、成像或任何类型的免疫测定法确定，包括ELISA、IRMA、消散法、侧向流、免疫组织细胞化学法或任何本领域技术人员进行的检验。

19.权利要求1至16中任何一项所述的方法，其中针对所述样本之一中至少一种所述基因/蛋白质的抗体滴度通过任何类型的免疫测定法确定。

20.权利要求19所述的方法，其中一种所述基因的表达水平使用与该基因编码的蛋白质特异性结合的抗体确定。

21.权利要求1至16中任何一项所述的方法，其中所述基因的表达水平通过杂交测定法确定。

22.权利要求19所述的方法，其中所述基因的表达水平使用与编码所述基因之一的核酸分子杂交的探针来确定。

23.权利要求1至16中任何一项所确定的基因用于监测受试者对肺癌治疗的反应的用途。

24.权利要求1至16中任何一项所确定的基因用于对受试者中肺癌进行诊断、分期和/或分型的用途。

25.权利要求1至16中任何一项所确定的基因用于对患者中肺癌进行成像的用途。

26.权利要求25所述的用途，其中所述基因选自NCAM 120、NCAM 140和/或NCAM 180、CK、NSP、SYPH、CHGA以及NSE。

27.权利要求25所述的用途，其中基因NCAM、尤其是NCAM外显子18；CK6/16/CK17；RTN1；SYPH；HSP47；CHGA；NSE和/或NSP的表达配合成像用于患者肺癌的分型和/或分期。

28.权利要求25至27中任何一项所述的用途，其中体内成像使用正电子放射断层造影术(PET)、计算机断层扫描(CT)或PET-CT进行。

29.用于检测受试者肺癌、包括SCLC及NSCLC的试剂盒，其包括用来确定如权利要求1至16任何一项所定义的基因的表达的一种或多种试剂。

30.用于对受试者进行肺癌分型的试剂盒，其包含用来确定如权利要求1至16任何一项所定义的基因的表达的一种或多种试剂。

31.用于确定受试者内肺癌异质性程度的试剂盒，其包含用来确定如权利要求1至16任何一项所定义的基因的表达的一种或多种试剂。

32.用于对受试者进行肺癌分期的试剂盒，其包含用来确定如权利要求1至16任何一项所定义的基因的表达的一种或多种试剂。