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CN102191227B - 一种二氢吡啶二羧酸合成酶 - Google Patents

一种二氢吡啶二羧酸合成酶 Download PDF

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CN102191227B CN201010117533XA CN201010117533A CN102191227B CN 102191227 B CN102191227 B CN 102191227B CN 201010117533X A CN201010117533X A CN 201010117533XA CN 201010117533 A CN201010117533 A CN 201010117533A CN 102191227 B CN102191227 B CN 102191227B
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Abstract

本发明公开了一种二氢吡啶二羧酸合成酶，以及表达该酶的重组质粒和重组菌株。本发明的二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列如SEQ IDNO：2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，本发明的重组质粒包含该二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列，所述重组菌株包含上述重组质粒。本发明的二氢吡啶二羧酸合成酶具有高比活和高抗L-赖氨酸反馈抑制能力，可用于高效生产L-赖氨酸。

Description

一种二氢吡啶二羧酸合成酶
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种沙门氏菌(Salmonella typhimu-rium)来源的二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)。
背景技术
L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能。由于谷物食品中的L-赖氨酸含量甚低，在加工过程中易被破坏，而人体及动物不能自己合成L-赖氨酸，只能从食物中获取，故称为限制性氨基酸。L-赖氨酸主要用于饲料添加剂以补充限制性氨基酸提高饲料的吸收利用率，食品添加剂，医药，化学制剂等。以年产量比较，L-赖氨酸目前是仅次于谷氨酸的世界第二大氨基酸品种，并且以5％-10％的年增长率增加。
国际上生产L-赖氨酸主要通过微生物发酵法。许多种类野生型或者诱变微生物都能够生产L-赖氨酸。基因工程大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是主要的生产L-赖氨酸的微生物。
L-赖氨酸的合成途径在许多微生物中都是从天冬氨酸起始的，包括两步和甲硫氨酸和苏氨酸共用的步骤，经过九步的酶催化过程，最终产生L-赖氨酸。其中，天冬氨酸激酶(aspartate kinase)是天冬氨酸起始的第一个酶，二氢吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase，DHDPS)是L-赖氨酸合成分支途径的第一个酶，它们的活力在微生物体内受复杂的调控，在一些革兰氏阴性菌中，天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶都受终产物L-赖氨酸的负反馈抑制。而在一些革兰氏阳性菌，这两种酶都对L-赖氨酸却不敏感。
DHDPS是L-赖氨酸合成分支途径的一个重要的酶，它的活力决定着代谢流流向L-赖氨酸合成途径的比例，因此，DHDPS的活力和其对L-赖氨酸反馈抑制的敏感性直接决定着L-赖氨酸合成的量。而专利号为6,040,160的美国专利所保护的大肠杆菌DHDPS正是经过突变增强了其对于终产物L-赖氨酸的抗反馈抑制能力。
利用基因工程大肠杆菌表达异源DHDPS，如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)和甲醇芽孢杆菌(B.Methanolicus)来源的DHDPS，生产L-赖氨酸均有见诸报道。由于异源的DHDPS在大肠杆菌体内受到了和本来源微生物体内不同的调控，或者在不同的催化环境中表现了不同的活力性质，如不同的发酵温度和pH，因此异源表达不同种类的DHDPS对于L-赖氨酸的产量有着不同的影响，寻找具有高比活和高抗L-赖氨酸反馈抑制能力的DHDPS需要进行大量工作，且存在很多困难。
发明内容
本发明的第一个目的，在于提供一种二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)，具有高比活和高抗L-赖氨酸反馈抑制能力。
本发明的第二个目的，在于提供一种所述二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列。
本发明的第三个目的，在于提供一种用于表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组质粒。
本发明的第四个目的，在于提供一种表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组菌株。
根据一个具体实施例，本发明的二氢吡啶二羧酸合成酶来源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
根据一个优选实施例，所述二氢吡啶二羧酸合成酶经过了定点突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
根据另一个优选实施例，所述定点突变的二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
根据一个优选实施例，本发明的用于表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组质粒包括上述二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列以及一种合适的载体。
根据本发明，所述合适的载体优选的是pDCtet，或pDCkan。
根据一个具体实施例，本发明的表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组菌株转化有所述表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组质粒。
经验证，本发明的二氢吡啶二羧酸合成酶具有高比活和高抗L-赖氨酸反馈抑制能力，可用于高效生产L-赖氨酸，且相比野生型L-赖氨酸生产菌株，在发酵成本和生产效率方面具有明显的优势。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例中使用的菌株和质粒如下：
大肠杆菌BL21(DE3(Novagen))，质粒pET24a(Novagen)，pTRC99a(Pharmacia)，大肠杆菌DH5α(TaKaRa)。
质粒pDCtet、pDCkan，菌株DC209：长春大成生化集团；
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)：长春大成生化集团。
沙门氏菌(Salmonella typhimurium LT2)：Nature 2001，413：852-6。
以下实施例中使用的酶和试剂如下：
Kod plusDNA聚合酶：Toyobo公司；
限制性内切酶NdeI，XhoI，EcoRI，HindIII，Tth111I，SpeI，DpnI，DraI等：TaKaRa公司或Fermentas公司；
pMD18-T simple载体，T4DNA连接酶：TaKaRa公司；
Axygen gel纯化试剂盒和DNA胶回收试剂盒：Axygen公司；
Taq DNA聚合酶，改良型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒：生工生物工程有限公司；
其它常规试剂均为国产或进口分装。
以下实施例中，二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS的检测方法如下：
1、酶活力测定：
1)溶液配制：
L-赖氨酸溶液(pH7.0)的配制：0.146g L-赖氨酸加800ul双蒸水溶解，以盐酸调节pH值至7.0左右，定容到1ml；
重组DHDPS酶液缓冲液的配制：20mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM丙酮酸钠，100mM KCl；
DL-ASA(天冬氨酸-β-半醛)底物溶液的配制：酶液缓冲液730μl中加入1M咪唑(pH7.4)100μl，100mM K2HPO4100μl，丙酮酸钠(100mM)50μl，DL-ASA(200mM)10μl。
2)活力测定方法：
预热至30℃底物溶液990ul加入石英比色皿(光程1cm，狭缝宽度3mm)中，根据酶液活力将粗酶液适当稀释，加入稀释后的酶液10μl，颠倒混匀，立刻读取0分钟空白对照，以0.5分钟时间为间隔，读取OD270吸光值。绘制OD270与时间(min)的曲线图，以酶活迟滞期之后的数据点模拟线性方程。
本实验DHDPS酶活定义为：30℃，以AOD270/min增加值为1定义为1单位DHDPS酶活。
2、蛋白浓度测定(改良型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒)：
1)标准曲线制备：在十个1.5ml的离心管中分别加入0、12、24、36、48、60、72、84、96、108μl的BSA(100μg/ml)，加入超纯水，补足至120μl；
2)取120μl溶液B(试剂盒自带)和6ml溶液C(试剂盒自带)，混匀，各管加入0.6ml混合液，混匀，室温下静置10min。各管加入60μl Folin酚试剂，迅速混匀，室温下静置30min；
3)在分光光度计测定A750值，并制作标准曲线；
4)样品的蛋白浓度可以根据标准曲线得到稀释后样品的浓度，乘以稀释倍数，得到蛋白浓度。
本实验重组DHDPS比活定义为：30℃，1μg蛋白使得AOD270/min增加值为1定义为DHDPS比活为1AOD270/min/μg。
3、重组DHDPS抗L-赖氨酸反馈抑制能力测定：
在底物溶液中加入不同终浓度的L-赖氨酸(1mM，5mM，10mM等)，按照酶活测定方法测定在不同浓度L-赖氨酸存在情况下稀释酶液的活力，与底物溶液中L-赖氨酸浓度为零时的活力相比较，酶活力降低百分比较高的为抗L-赖氨酸反馈抑制能力较差的DHDPS。
以下通过具体实施例作进一步详细描述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1、蛋白质同源性搜索
大肠杆菌DHDPS同源性相近的微生物的DHDPS
经过同源性搜索，大肠杆菌的DHDPS的活力比较高，肠杆菌属、埃希氏杆菌等属种微生物来源的DHDPS与其氨基酸序列同源性较高；此外，枯草芽孢杆菌的DHDPS具有天然的抗L-赖氨酸反馈抑制能力，芽孢杆菌等属种的微生物来源的DHDPS与其氨基酸序列同源性较高。因此，本发明选取表1所列的各微生物作为待选微生物。
实施例2、选定微生物的二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA基因)的克隆
2.1、引物设计
根据NCBI数据库中的核酸序列，设计克隆引物，具体如以下表1所示。
表1、引物序列
  微生物   克隆引物(5′-3′)
沙门氏菌(Salmonella typhimurium LT2)   CCATATGTTCACGGGAAGTATTGTCCCTCGAGTTACAGCAGGCCAGCATG
大肠杆菌(Escherichia coli W3110)   CATATGTTCACGGGAAGTATTCTCGAGTTACAGCAAACCGGCATG
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)   CATATGAATTTCGGAAATGTGCTCGAGTTACAGTTCGCTGATCGT
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)   CATATGAACTTCGGAAATATCCTCGAGTTACAGGCCGTTCATCAG
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)   CATATGAATGTCGGAAATATACTCGAGTTACAGTTCGCTGATGAC
  芽孢杆菌(Bacillus.sp.NRRL-B-14911)   CATATGGTTCTATTTGGAAGA
  CTCGAGTTATTAGTTTTGGAACAA
  球形芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericusDSM28)   CATATGAATTTAGGTCGAATTCTCGAGTTATCTAAAACTTCTCGC
  谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)   CATATGAGCACAGGTTTAACACTCGAGTTATAGAACTCCAGCTTT
2.2、重组质粒pET24a-dapA的构建
2.2.1、PCR扩增dapA基因
以各种微生物的基因组为模板，以相应的克隆引物利用KOD plus Taq DNA聚合酶扩增相应的dapA基因，具体如下：
1)反应体系(50μl)：
10×KOD plus缓冲液    5μl
25mM MgCl2            3μl
2.5mmol/L dNTP溶液    1.5μl
上游引物              30pmoles
下游引物              30pmoles
KOD plus DNA聚合酶    1U
基因组                50ng
加双蒸水至50μl
2)PCR条件：
95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环，72℃10min。
2.2.2、克隆dapA基因到pMD18-T simple载体
使用Axygen gel纯化试剂盒回收扩增的dapA片段，利用Taq DNA聚合酶末端加核苷酸A：
1)反应体系(10μl)：
10×Taq缓冲液      1μl
25mM MgCl2         0.6μl
2.5mmol/L dNTP溶液 0.3μl
Taq DNA聚合酶      0.1U
纯化的dapA片段    200-400ng
加双蒸水至10μl
2)PCR程序：72℃ 20min。
3)连接体系(10μl)：
末端加A样品          4μl
pMD18simple T载体    1μl
T4DNA连接酶          1μl
10×T4DNA连接酶      1μl
加双蒸水至10μl
于16℃连接过夜，获得连接产物pMD18-T-dapA。
取2-5μl连接液(pMD18-T-dapA)转化大肠杆菌DH5α，筛选(挑取克隆在LB培养基上培养，抽提质粒进行酶切验证，下同)获得正确的重组菌株。
2.3、转化大肠杆菌BL21(DE3)
挑取成功克隆的菌株，抽提质粒pMD18-T-dapA，以NdeI和XhoI酶切，并回收dapA片段；
质粒pET24a也以同样的两种酶酶切，并回收载体片段。
酶切的载体片段和dapA片段以摩尔比1∶3的比例进行连接，连接产物(重组质粒pET24a-dapA)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选正确的重组菌株。
实施例3、重组菌株的DHDPS酶的获得以及活力测定
3.1、重组菌株的DHDPS酶的获得
31.1、发酵
按1％的接种量，将过夜种子菌液接种到装有30ml LB培养基的三角瓶中，加入卡那霉素50μg/ml，37℃摇床培养，培养至OD600达到0.8时，加入终浓度1mM的IPTG，于30℃诱导培养4小时。
3.1.2、超声破壁
取诱导后的菌液1ml，于10000rpm、4℃离心1min，弃上清，加入400μl悬菌液重悬菌体，超声破碎(超声5s，停10s，20cycle)。破壁后的悬浊液以10000rpm离心5min，取上清，即为重组表达的DHDPS粗酶液。
3.2、重组菌株的DHDPS酶的活力测定
以前述DHDPS的检测方法，测定各种微生物来源的重组DHDPS的活力和蛋白浓度，计算比活，结果如以下表2所示：
表2、DHDPS酶的活力测定结果
  DHDPS来源   比活
  谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)   0.0182
  枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)   0.11
  沙门氏菌(Salmonella typhimurium LT2)   0.203
  地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)   0.167
  解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)   0.137
  大肠杆菌(Escherichia coli W3110)   0.179
  球形芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus DSM28)   0.11
  芽孢杆菌(Bacillus.sp.NRRL-B-14911)   0.1
根据表2的测定结果，沙门氏菌(Salmonella typhimurium LT2)来源的DHDPS的活性较高，因此选取沙门氏菌DHDPS作进一步的筛选。
实施例4、沙门氏菌DHDPS基因的定点突变
根据筛选的结果，选取实施例2获得的沙门氏菌来源的dapA基因进行测序，其序列如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
为了提高沙门氏菌来源的DHDPS的抗L-赖氨酸反馈抑制能力，利用定点突变方法将SEQ ID NO：3所示氨基酸序列第118位氨基酸的组氨酸突变为酪氨酸，具体过程如下：
4.1、突变引物设计
根据沙门氏菌来源的DHDPS的DNA序列，设计用于将118位氨基酸组氨酸突变为酪氨酸的突变引物，其序列如下：
突变引物(5′-3′)：
GGAAGGTTTGTTCCAGTATTTTAAAGCCATCGCGGAAC
GTTCCGCGATGGCTTTAAAATACTGGAACAAACCTTCC
4.2、定点突变
以实施例2获得的克隆有野生型沙门氏菌dapA基因的pMD18-T-dapA质粒为模板，以4.1设计的突变引物为引物对，利用KOD plus Taq DNA聚合酶扩增整个质粒，具体如下：
反应体系(50μl)：
10×KOD plus缓冲液        5μl；
25mM MgCl2                3μl；
2.5mmol/L dNTP溶液        1.5μl；
上游突变引物              30pmoles；
下游突变引物              30pmoles；
Kod plus DNA聚合酶        1U；
质粒                      5ng；
加双蒸水至50μl。
PCR程序：95℃5min；94℃30s，56℃60s，72℃300s，30个循环；72℃10min。
向获得的PCR产物中加入1μl DpnI酶，于37℃消化2-4小时，然后取5μl消化的溶液转化大肠杆菌DH5α，筛选获得克隆正确的突变株。
对克隆正确的突变株进行培养获得DHDPS，并测序验证，结果显示获得的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其118位的氨基酸(组氨酸)已突变为酪氨酸，突变后的蛋白对应的DNA序列(即表达突变后的蛋白的核苷酸序列)如SEQ ID NO：2所示。
实施例5、突变抗DHDPS的抗L-赖氨酸反馈抑制能力实验
5.1、重组质粒的构建
取实施例4获得的克隆正确的突变株，按实施例2中步骤2.3的方法，构建重组质粒pET24a-dapA，并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选正确的重组菌株。
5.2、抗L-赖氨酸反馈抑制能力测定
培养步骤5.1获得的突变株、收集所产的DHDPS，并检测其对L-赖氨酸的抗反馈抑制能力，其中，以未突变的野生型菌株作为对照，结果如表3所示。
表3、野生株和突变株表达的DHDPS的比活变化检测结果
Figure GSA00000047879400101
根据表3的结果，突变株的DHDPS的比活下降约41％，而野生株的比活下降达91％，可见本发明获得的突变株所产的定点突变的DHDPS对L-赖氨酸的抗反馈抑制能力远高于野生株。
实施例6、重组质粒构建
6.1、PCR扩增沙门氏菌dapA基因
根据实施例5的抗L-赖氨酸反馈抑制能力测定结果，以实施例4获得的克隆正确的突变株的基因组为模板，以克隆引物ST(EcoRI)和ST(HindIII)为引物对，PCR扩增沙门氏菌dapA基因，具体如下：
1)引物序列(5′-3′)：
ST(EcoRI)：GAATTCATGTTCACGGGAAGTATT
ST(HindIII)：AAGCTTTTACAGCAGGCCAGCATG
反应体系和PCR程序同实施例2。
6.2、克隆dapA基因到pMD18-T simple载体
通过Axygen gel纯化试剂盒回收步骤6.1获得的dapA基因片段，然后利用Taq DNA聚合酶通过PCR操作在获得的dapA片段的末端加核苷酸A，具体条件同实施例2。
获得的PCR加尾产物使用T4DNA连接酶与质粒pMD18-T simple载体连接，具体条件同实施例2。
取2-5μl连接液(pMD18-T-dapA质粒)转化大肠杆菌DH5α，筛选获得正确的重组菌株。
6.3、重组质粒pTRC99aSTdapA的构建
抽提步骤6.2获得的正确的重组菌株的pMD18-T-dapA质粒，使用EcoRI和HindIII双酶切并回收dapA片段；回收的dapA片段以摩尔比为1∶3的比例与同样经EcoRI和HindIII双酶切的pTRC99a质粒连接，连接产物pTRC99aSTdapA转化大肠杆菌DH5α，筛选获得正确的重组菌株。
6.4、重组质粒pDCtetSTdapA的构建
按前述6.1的方法，抽提步骤6.3获得的重组正确的菌株的pTRC99aSTdapA质粒作为模板，以引物STdapAF-tet和STdapAR-tet(序列分别如SEQ ID No.：7和8所示)为引物对，PCR扩增含有trc启动子的dapA基因。
引物序列(5′-3′)：
STdapAF-tet：GGACACTGTCTAATGTGAGTTAGCGCG
STdapAR-tet：CACTAGTATTGAAGCATTTATCAGGGT
获得的基因片段连接至pMD18-T simple载体，得到重组质粒pMD18-T-trcSTdapA，质粒pMD18-T-trcSTdapA再转化大肠杆菌DH5α，筛选获得正确的重组菌株。
按步骤6.3的方法，抽提重组正确的菌株的pMD18-T-trcSTdapA质粒，以Tth111I和SpeI进行部分酶切，得到trc-dapA-tet片段，回收trc-dapA-tet片段，并以摩尔比为1∶3的比例与同样经Tth111I和SpeI酶切的pDCtet质粒连接，连接产物pDCtetSTdapA转化大肠杆菌DH5α，筛选获得正确的重组菌株。
6.5、重组质粒pDCkanSTdapA的构建
按前述6.1的方法，抽提步骤6.3获得的重组正确的菌株的pTRC99aSTdapA质粒作为模板，以引物STdapAF-kan和STdapAR-kan(序列分别如SEQ ID No.：9和10所示)为引物对，通过PCR扩增含有trc启动子的dapA基因。
引物序列(5′-3′)：
STdapAF-kan：GCGGCCGCTGTGGAGGTC
STdapAR-kan：GACCACTGTCAGGGTTATTGTCTCAT
获得的基因片段连接至pMD18-T simple载体，得到重组质粒pMD18-T-trcSTdapA，质粒pMD18-T-trcSTdapA再转化大肠杆菌DH5α，筛选获得正确的重组菌株。
按步骤6.3的方法，抽提重组正确的重组菌株的pMD18-T-trcSTdapA质粒，以PshAI和NotI进行部分酶切，得到trc-dapA-kan片段，然后将回收的trc-dapA-kan片段以摩尔比为1∶3的比例与同样经PshAI和NotI酶切的pDCtet质粒进行连接，连接产物pDCkanSTdapA转化大肠杆菌DH5α，筛选获得正确的重组菌株。
实施例7、重组菌株构建
取实施例6获得的重组质粒pDCtetSTdapA和pDCkanSTdapA，同时转化宿主菌DC209，筛选获得含有突变沙门氏菌dapA重组质粒的L-赖氨酸产生菌(突变株)。
实施例8、重组菌株的发酵及糖酸转化速度和糖酸转化率实验
8.1、培养基配方
1、斜面培养基(g/l)
葡萄糖2.0、NH4Cl 1.0、KH2PO4 1.5、Na2HPO4 3.5、MgSO4·7H2O0.1、琼脂20.0。加蒸馏水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，于0.8kg/cm2灭菌30分钟，冷却至50℃左右加入卡那霉素，四环素溶液，最终浓度分别为50μg/ml，15μg/ml。
2、摇瓶种子培养基(g/l)
葡萄糖40.0、KH2PO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、(NH4)2SO4 10.0、玉米浆20、CaCO3 15。加自来水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8kg/cm2灭菌30分钟，接种前加入CaCO3(121℃，60分钟灭菌，烘干)和卡那霉素，四环素溶液，最终浓度分别为50μg/ml，15μg/ml。
3、摇瓶发酵培养基(g/l)
葡萄糖80.0、(NH4)2SO4 25.0、KH2PO4 2.0、MgSO4·7H2O 1.0、MnSO4·5H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.5、CaCO3 30.0。加自来水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8kg/cm2灭菌30分钟，接种前加入CaCO3(121℃，60分钟灭菌，烘干)。
4、种子罐培养基
葡萄糖4％、(NH4)2SO4 1％、KH2PO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％、玉米浆2％、泡敌0.01％。加水溶解，pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容400L。接种前加入卡那霉素，四环素溶液，最终浓度分别为50μg/ml，15μg/ml。
5、发酵罐培养基
葡萄糖8％、(NH4)2SO4 2.5％、KH2PO4 0.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、玉米浆4％、FeSO4·5H2O 0.05％、MnSO4·5H2O 0.05％、泡敌0.01％。加自来水溶解，pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容5.1m3，1.0kg/cm2灭菌20分钟。
8.2、培养方法
8.2.1、斜面培养：斜面培养基上划线接种，37℃培养1-2天。
8.2.2、摇瓶培养：37℃，往复式摇床，冲程89cm，转速120r/m，种子培养24小时，接种量5％，发酵摇瓶培养48小时。
8.2.3、种子罐培养方法：将成熟摇瓶种无菌状态收集于接种瓶中，用压差法接入500L种子罐。用液氨将pH调至6.8～7.2。中间控制温度37℃罐压0.05MPa，转速260rpm，初始风量10m3/hr。起始溶氧100％，培养过程中溶氧控制不低于15％。一般培养时间在13～15小时。
将成熟种子接入10m3发酵罐，初始控制：温度37±1℃，罐压0.05MPa，转速140-240rpm，风量120-540m3/hr，pH6.4～6.5，溶氧控制不低于10％。当还原糖低于4％时，开始流加50％葡萄糖溶液。理论上流加糖度与消耗糖度相当，一般使发酵液糖度在2～4％之间。后期停止流加，使发酵糖度小于0.5％。
8.3、还原糖测定：
采用常规菲林试剂滴定法测定。
8.4、L-赖氨酸测定：
采用高效液相色谱法测定，具体如下：
8.4.1、溶液制备
1)对照品溶液制备。精密称取L-赖氨酸盐酸盐对照品25mg。置50mL量瓶中，加流动相适量，置超声波水浴发生器中助溶10min。冷却至室温。用流动相稀释至刻度，充分摇匀。经0.45um滤膜滤过，滤液作为对照品溶液。
2)试样溶液制备。精密称取L-赖氨酸盐酸盐试样25mg。置50mL量瓶中，加流动相适量，置超声波水浴发生器中助溶10min。冷却至室温。用流动相稀释至刻度，充分摇匀；经0.45um滤膜滤过，滤液作为样品溶液。
8.4.2、色谱条件
色谱柱：Venusil ABS-C18柱(长：250mm，内径：4.6mm，粒径：5μm)；流动相：水(pH＝1.5±0.2)；检测波长：195nm：流速：10mL/min：柱温：30±2℃；进样量：20μL。在上述色谱条件下，空白、L-赖氨酸盐酸盐对照品溶液(0.5mg/mL)、L-赖氨酸盐酸盐样品溶液(0.5mg/mL)进行色谱系统适用性试验。理论板数按L-赖氨酸盐酸盐峰计算不低于1200。取对照品溶液和样品溶液适量。分别注入液相色谱仪.得到对照品溶液和试样溶液中L-赖氨酸盐酸盐的峰面积。按外标法计算试样中L-赖氨酸盐酸盐含量。
培养实施例7获得的突变株，并发酵生产L-赖氨酸，检测其糖酸转化速度和糖酸转化率，同时以含有枯草芽孢杆菌DHDPS的生产菌(大成生化科技集团)作为对照，检测结果如表4所示。其中在本发明中，
糖酸转化率的定义为：每单位重量葡萄糖转化为赖氨酸的重量百分数。
糖酸转化速度的定义为：发酵罐中单位体积发酵液在单位时间内把葡萄糖转化为赖氨酸的重量。
表4、糖酸转化速度和糖酸转化率检测结果
  对照   重组菌
  糖酸转化速度g/hr*L   2.49   3.26
  糖酸转化率   60.5％   63％
根据表4的结果，本发明构建的含有沙门氏菌突变DHDPS的生产菌株，在生产赖氨酸的发酵表现上，糖酸转化速度和转化率都高于对照菌株。
序列表
<110>上海工业生物技术研发中心
<120>一种二氢吡啶二羧酸合成酶
<130>20101001
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>879
<212>DNA
<213>Salmonella enterica
<220>
<221>gene
<222>(1)..(879)
<400>1
atgttcacgg gaagtattgt cgcgcttgtt acgccgatgg atgagaaagg taacgtcagt     60
aggtcttgcc tgaaaaaact cattgattat catgtcgcca acggtacctc ggcgattgtt    120
tcggttggca ctaccggcga gtctgccacg ctaagccatg atgaacatgg cgatgtcgtg    180
atgatgacgc tggaactggc tgacggacgt attccggtta tcgccggcac gggcgcaaac    240
gcgaccgcgg aagcgattag cctgacgcag cgttttaacg atagcggtat tgtaggctgc    300
ctgacggtaa cgccgtacta caatcgcccc acgcaggaag gtttgttcca gcatttcaaa    360
gccatcgcgg aacacactga cttgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtaccggt    420
tgcgatatgt tgccggaaac cgtgggtcgt ctggcggaaa taaaaaatat tatcgctatc    480
aaagaggcga cagggaactt aacccgcgtt caccagatca aagagctggt ttcagacgat    540
tttattctgc ttagcggcga tgacgcgtct gcgctggact ttatgcaact gggtggtcat    600
ggcgtgattt ccgttacggc taacgtagcg gcgcgcgaga tggctgacat gtgcaaactg    660
gcggcggaag ggcaatttgc cgaggcgcgc gctatcaacc agcgtctgat gccgttacac    720
aacaaactat ttgtcgaacc caatcctatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggcattgggt    780
cttgtggcga ccgacacgct gcgcctgcca atgacgccta tcacggacca tggtcgtgac    840
atcgtcaaag cagcgcttca gcatgctggc ctgctgtaa                           879
<210>2
<211>879
<212>DNA
<213>Salmonella enterica
<220>
<221>gene
<222>(1)..(879)
<400>2
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<210>3
<211>292
<212>PRT
<213>Salmonella enterica
<220>
<221>peptide
<222>(1)..(292)
<400>3
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Leu Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Asn Val Ser Arg Ser Cys Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val
            20                  25                  30
Ala Asn Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
        35                  40                  45
Ala Thr Leu Ser His Asp Glu His Gly Asp Val Val Met Met Thr Leu
    50                  55                  60
Glu Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn
65                  70                  75                  80
Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly
                85                  90                 95
Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Thr Gln
            100                 105                 110
Glu Gly Leu Phe Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu
        115                 120                 125
Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Met Leu
    130                 135                 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Glu Ile Lys Asn Ile Ile Ala Ile
145                 150                 155                 160
Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val His Gln Ile Lys Glu Leu
                165                 170                 175
Val Ser Asp Asp Phe Ile Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
            180                 185                 190
Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn
        195                 200                 205
Val Ala Ala Arg Glu Met Ala Asp Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly
    210                 215                 220
Gln Phe Ala Glu Ala Arg Ala Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His
225                 230                 235                 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys
                245                 250                 255
Lys Ala Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
            260                 265                 270
Pro Ile Thr Asp His Gly Arg Asp Ile Val Lys Ala Ala Leu Gln His
        275                 280                 285
Ala Gly Leu Leu
    290
<210>4
<211>292
<212>PRT
<213>Salmonella enterica
<220>
<221>peptide
<222>(1)..(292)
<400>4
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Leu Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Asn Val Ser Arg Ser Cys Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val
            20                  25                  30
Ala Asn Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
        35                  40                  45
Ala Thr Leu Ser His Asp Glu His Gly Asp Val Val Met Met Thr Leu
    50                  55                  60
Glu Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn
65                  70                  75                  80
Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly
                85                  90                  95
Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Thr Gln
            100                 105                 110
Glu Gly Leu Phe Gln Tyr Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu
        115                 120                 125
Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Met Leu
    130                 135                 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Glu Ile Lys Asn Ile Ile Ala Ile
145                 150                 155                 160
Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val His Gln Ile Lys Glu Leu
                165                 170                 175
Val Ser Asp Asp Phe Ile Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
            180                 185                 190
Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn
        195                 200                 205
Val Ala Ala Arg Glu Met Ala Asp Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly
    210                 215                 220
Gln Phe Ala Glu Ala Arg Ala Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His
225                 230                 235                 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro IIe Pro Val Lys Trp Ala Cys
                245                 250                 255
Lys Ala Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
            260                 265                 270
Pro Ile Thr Asp His Gly Arg Asp Ile Val Lys Ala Ala Leu Gln His
        275                 280                 285
Ala Gly Leu Leu
    290

Claims (7)

1.一种二氢吡啶二羧酸合成酶，其特征在于，所述二氢吡啶二羧酸合成酶来源于沙门氏菌（Salmonella typhimurium），其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。 
2.一种二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。 
3.根据权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列如SEQ ID NO:2所示。 
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括权利要求2或3所述的DNA序列。 
5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株转化有权利要求4所述的重组质粒。 
6.权利要求1所述的二氢吡啶二羧酸合成酶的应用，其特征在于，用于生产L-赖氨酸。 
7.权利要求5所述的重组菌株的应用，其特征在于，用于发酵法生产L-赖氨酸。 
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二氢吡啶二羧酸合成酶基因在棒杆菌中的克隆与表达;王成华 等;《山东化工》;20050630;第34卷;18-20，43 *
王成华 等.二氢吡啶二羧酸合成酶基因在棒杆菌中的克隆与表达.《山东化工》.2005,第34卷18-20，43.

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