[go: up one dir, main page]

CN102224259B - 核酸定量的产品和方法 - Google Patents

核酸定量的产品和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102224259B
CN102224259B CN200980148025.3A CN200980148025A CN102224259B CN 102224259 B CN102224259 B CN 102224259B CN 200980148025 A CN200980148025 A CN 200980148025A CN 102224259 B CN102224259 B CN 102224259B
Authority
CN
China
Prior art keywords
target
nucleic acid
counterpart
capture
nucleic acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200980148025.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102224259A (zh
Inventor
C·R·坎托
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sequenom Inc
Original Assignee
Sequenom Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sequenom Inc filed Critical Sequenom Inc
Publication of CN102224259A publication Critical patent/CN102224259A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102224259B publication Critical patent/CN102224259B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/159—Reduction of complexity, e.g. amplification of subsets, removing duplicated genomic regions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明所述为核酸定量的产品和方法，可部分用于检测和确定样品中稀少核酸(即低拷贝数核酸)的核苷酸序列。该产品和方法可用于降低不同核酸种类之间的动态范围。

Description

核酸定量的产品和方法
相关专利申请
本申请要求2008年11月24日提交的，题为“核酸定量产品和方法(NUCLEIC ACID QUANTIFICATION PRODUCTS AND PROCESSES)”，发明人为C.R.坎托(Charles R.Cantor)，代理人案卷号为SEQ-6021-PV的美国临时专利申请第61/117,474号的优先权。上述专利申请的全部内容(包括所有文字、表格和附图)通过引用纳入本文。
技术领域
本技术部分涉及可用于核酸定量的产品和方法。
背景技术
核酸测序已经成为现代分子生物学的一种主要分析技术。用于测序的可靠方法的发展推动了对于遗传信息组织的理解，并使遗传材料的操作(即基因工程)成为可能。有多种方法用于核酸分子测序。历史上，最常用的方法是基于化学(MG测序(Maxam and Gilbert sequencing))或酶(Sanger双脱氧测序和基于外切核酸酶的测序)反应，所述反应形成特定的截短核酸分子，然后通过电泳技术分离所述截短核酸分子以确定它们的相对长度。近来，已经开发出潜在的高通量技术，包括焦磷酸测序(pyro-sequencing)、纳米孔测序(nanoporesequencing)技术、基于杂交的测序技术、和基于非放射性技术在测序结果观察中的应用。还提出可将扫描隧道显微术用于直接观察核酸分子的序列。
此外，采用多种核酸检测技术，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于核酸序列的扩增、链置换扩增、Q复制酶扩增和多种杂交技术检测来自各种来源的不同丰度核酸的存在。一些策略将核酸检测技术与核酸测序方法相结合。
发明概述
本发明提供生物样品中目标核酸含量的定量方法，包括：(a)在目标与其对应物杂交的条件下，通过将(i)生物样品的多种目标核酸(目标)与(ii)已知量的各目标的对应核酸(对应物)接触来制备混合物，其中各对应物包含(i)与其目标基本相同的核苷酸序列和(ii)区分各对应物与其目标的特征；(b)压缩目标在混合物中的动态范围；(c)测定各目标和/或对应物的含量；以及(d)通过(c)中的含量定量分析各目标的含量。
本发明还提供鉴定生物样品中目标核酸的方法，包括：(a)在目标与其对应物杂交的条件下，通过将(i)生物样品的多种目标核酸(目标)与(ii)已知量的各目标的对应核酸(对应物)接触来制备混合物，其中各对应物包含(i)与其目标基本相同的核苷酸序列和(ii)区分各对应物与其目标的特征；(b)压缩目标在混合物中的动态范围；以及(c)鉴定各目标和/或对应物。
本发明还提供压缩生物样品中目标核酸的动态范围的方法，包括：(a)在目标与其对应物杂交的条件下，通过将(i)生物样品中的多种目标核酸(目标)与(ii)已知量的各目标的对应物核酸(对应物)来接触制备混合物，其中各对应物包含(i)与其目标基本相同的核苷酸序列和(ii)区分各对应物与其目标的特征；(b)将混合物与一组捕获核酸接触，其中(i)该组中的各捕获核酸与一种目标和对应物特异性杂交，(ii)该组中的各捕获核酸与其特异性杂交的目标和对应物的杂交强度基本相同，且(iii)各捕获核酸的量低于生物样品中目标的最高含量；从而目标的动态范围得到压缩。
上述方法中，在某些实施方式中在步骤(b)之前扩增目标及对应物，或在一些实施方式中在步骤(b)之后扩增目标及对应物。在某些实施方式中，对应物的特征是，在基本与目标相同的序列中存在单个核苷酸取代。在一些实施方式中，对应物的特征是，在基本与目标相同的序列上附加一个或多个额外核苷酸。在某些实施方式中，各目标的量与其对应物的量的比例在约1∶10到约10∶1之间。
在一些实施方式中，步骤(b)包括将混合物与一组捕获剂接触，其中：各捕获剂特异性地捕获各目标及其对应物，且各捕获剂的含量在能够压缩混合物中目标的动态范围的范围内。在具体的实施方式中，捕获剂的阵列位于固相载体上。在一些实施方式中，捕获剂以基本相同的亲和力与目标和对应物相互作用。在某些实施方式中，各捕获剂是包含与目标的核苷酸序列互补的多核苷酸序列的捕获核酸。
在一些实施方式中，目标-捕获剂的解链温度(Tm)与对应物-捕获剂的Tm的差异低于或等于1摄氏度。在某些实施方式中，阵列的任何两种捕获剂的含量间相差低于或等于50％。
在一些实施方式中，随后确定目标的序列。在某些实施方式中，目标的序列通过单分子测序技术(例如用纳米孔装置分析目标)来确定。在一些实施方式中，对应物在步骤(b)之后与目标分离。在具体的实施方式中，对应物或目标包含与捕获剂结合的捕获部分。
所述技术的某些方面在以下附图、发明详述和权利要求中作进一步描述。
附图简要说明
图1显示所述技术的非限制性实施方式。向含有目标核酸物质的组合物中加入对应物核酸，其中各对应物物质与特定的目标核酸物质杂交。在该具体实施方式中，向以1到100单位的动态范围存在的目标加入10单位的各对应物。随后通过将目标-对应物混合物捕获到含有与目标物质或对应物物质特异性杂交的捕获寡核苷酸的阵列的地址来压缩样品中目标的动态范围。在该具体实施方式中，阵列上的各个地址能结合最多10单位的各目标或对应物物质，这一结合减少了样品中目标核酸的动态范围。随后确定各对应物物质的存在和含量，并可确定该实施方式中各目标物质的含量。
发明详述
本文方法可用于确定样品中核酸物质的丰度(如相对丰度)。本文方法还可用于确定样品中核酸物质(如低拷贝数物质)的核苷酸序列和/或存在、不存在或含量。在某些核酸样品中，核酸物质可以一定范围的拷贝数存在，其中可存在最常见的核酸物质和最稀少的核酸物质。换言之，在样品中，某些核酸物质可大量存在，而一些核酸物质可以较小的量存在，且较稀少的核酸物质的核苷酸序列和含量可利用本文提供的方法确定。本文将样品中丰富物质和稀少物质的含量的范围称为核酸物质含量的“动态范围”。在某些实施方式中，方法包括针对样品中各感兴趣的目标核酸的不同对应物核酸的应用，并减小样品中核酸物质的动态范围。
因此，本文的方法具有检测核酸序列的混合群体(其中一些序列是丰富的)中低丰度、稀少或独特核酸序列的能力。本文的方法消除或降低了对于重复分析相同核苷酸序列的要求(如有时在评估较稀少核酸时的情况)，并因此减少了试剂、时间和其它资源的消耗。
检测和鉴定核酸的能力对许多领域中的诊断分析有重要作用，这些领域包括但不限于：医学、农业、军事、以及法医学应用。本文提供的核酸检测技术可用作诊断工具、疾病监控工具、以及作为例如确定某些疾病或症状的易感性的预示工具。在一些实施方式中，可以利用本文的核酸检测技术检测多种疾病状况下病毒或细菌病原体的存在或不存在。在某些实施方式中，还可以利用本文提供的核酸检测技术检测与某些癌症类型相关的特定基因的存在、不存在或含量。本文的方法还能用于监控例如食品加工厂或农业环境中土壤、水和作物的细菌污染。早期检测能够从生产线上除去受污染的食品，或者如果检测技术足够灵敏，在农业用的土壤或水中潜在病原体含量还很低的时候就能将其鉴定出，那么甚至可以避免污染。类似地，例如，这些同样的高灵敏度方法可用于军事或防御应用(即监控潜在的生物武器)或法医学应用(即检测非宿主核酸的存在以鉴定死亡的致病性原因的存在)。
目标核酸
本文使用的术语“目标核酸”是指待分析、检测、定量或测序的一种或多种核酸(也称为“样品核酸”)。目标核酸可以包含一个或多个感兴趣的区域。本文所用的术语“感兴趣的区域”和“感兴趣的核苷酸序列”是指本文所述方法所确定(如鉴别、定量、分析)的核酸序列或物质。感兴趣的区域的例子包括但不限于：突变、单核苷酸多态性、一个或多个毗连核苷酸的取代、一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、微卫星、重复核苷酸区域、杂合等位基因、纯合等位基因、基因序列或亚序列、非编码序列或亚序列等。
目标核酸可来自任何来源或组合物，如DNA(例如互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)等)、RNA(例如信使RNA(mRNA)、短抑制性RNA(siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA等)、和/或DNA或RNA类似物(例如，包含碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)。核酸可以是可用于进行本文所述方法的任何形式(例如线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。在某些实施方式中，核酸可以是，或者可来自，质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体或能够在体外或者在宿主细胞、细胞、细胞的细胞核或细胞质中复制或被复制的其它核酸。在一些实施方式中，目标核酸来自单个染色体(例如核酸样品可来自二倍体生物样品的一个染色体)。在需要时，可按本领域已知方法改变目标核酸，使密码子编码不同于正常的氨基酸，包括非常规或非天然氨基酸(包括可检测的标记氨基酸)。
目标核酸可包含可按照核酸所需用途选择的某些元件。目标核酸中可包括或排除任何以下元件。例如，目标核酸可包括一种或多种或所有以下核苷酸元件：一个或多个启动子元件、一个或多个5’非翻译区(5’UTR)、一个或多个可插入目标核苷酸序列的区域(“插入元件”)、一个或多个目标核苷酸序列、一个或多个3’非翻译区(3’UTR)和选择元件。目标核酸可提供有一种或多种此类元件。在一些实施方式中，所提供的目标核酸包含操作性连接的启动子、5’UTR、任选的3’UTR和供目标核苷酸序列插入(即克隆)模板中的插入元件。在某些实施方式中，所提供的目标核酸包含操作性连接的启动子、插入元件和任选的3’UTR，且5’UTR/目标核苷酸序列与任选的3’UTR一起插入。各元件可以适用于目标蛋白生产的任何顺序排列，且在一些实施方式中，目标核酸从5’到3’方向包含操作性连接的以下元件：(1)启动子元件、5’UTR和插入元件；(2)启动子元件、5’UTR和目标核苷酸序列；(3)启动子元件、5’UTR、插入元件和3’UTR ；以及(4)启动子元件、5’UTR、目标核苷酸序列和3’UTR。本文所用的术语“操作性连接”是指两个或两个以上核酸元件(启动子、5’UTR、3’UTR、插入元件等)相互连接而使各元件能发挥所需功能，元件之间的距离不计。也就是说，相互间操作性或功能性连接的核酸元件可以相互邻接或者远离，并发生功能性相互作用。
目标核酸内可包括启动子元件。启动子通常与RNA聚合酶相互作用，该酶利用预先存在的核酸催化核酸的合成。当模板是DNA模板时，在合成蛋白之前转录出RNA分子。某些可用的启动子来自病毒。某些启动子具有组织特异性，仅在特定组织内驱动目标序列的表达。本领域技术人员可例如通过检索一个或多个公共或私有数据库很容易地获得这些序列，且可很容易地改变这些序列使其适用于本文所述的目标核酸。
相对于目标核酸骨架或目标序列，5’UTR可包含一种或多种内源性元件并可包括一种或多种外源性元件。5’UTR可来自例如任何合适的生物(如病毒、细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物)的任何合适的核酸，如基因组DNA、质粒DNA、RNA或mRNA，。本领域技术人员可根据所用的转录和/或翻译系统选择合适的5’UTR元件。5’UTR有时可包含一种或多种本领域技术人员已知的以下元件：翻译增强子序列、转录起始位点、转录因子结合位点、转录因子结合位点、翻译调节位点、翻译起始位点、翻译因子结合位点、核糖体结合位点、复制子、增强子元件、内部核糖体进入位点(IRES)和沉默子元件。
相对于目标核酸骨架或目标序列，3’UTR可包含一种或多种内源性元件并可包括一种或多宗外源性元件。3’UTR可来自例如任何合适的生物(如病毒、细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物)的任何合适的核酸，如基因组DNA、质粒DNA、RNA或mRNA。本领域技术人员可根据所用的转录和/或翻译系统选择合适的3’UTR元件。3’UTR有时可包含一种或多种本领域技术人员已知的以下元件：转录调节位点、转录起始位点、转录终止位点、转录因子结合位点、翻译调节位点、翻译终止位点、翻译起始位点、翻译因子结合位点、核糖体结合位点、复制子、增强子元件、沉默子元件和多聚腺苷尾。3’UTR通常包括多聚腺苷尾，有时不包括，且若存在多聚腺苷尾，那么该尾上可添加或去除一个或多个腺苷部分(例如可添加或减去约5个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个或约50个腺苷部分)。
目标(或样品)核酸可来自一种或多种来源。包含目标核酸的来源可包含一种或多种目标核酸。本文所述的多种目标核酸是指至少两种目标核酸，且包括可相同或不同的核酸序列。也就是说，目标核酸可都代表相同的核酸序列，或可代表两种或两种以上不同的核酸序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、1000或更多的序列)。
例如，样品可采自生物、矿物或地质地点(例如土壤、岩石、矿藏、角斗场(combat theater))、法医学地点(例如罪案现场、走私品或疑似走私品)、或古生物学或考古学地点(如化石或骨头)。样品可以是“生物样品”，该术语是指获自活体或曾经为活体的来源，例如动物如人或其它哺乳动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒的任何材料。生物样品可采用任何形式，包括但不限于，固体材料如组织、细胞、细胞团块、细胞提取物、或活检样品，或者生物液体如尿液、血液、唾液、羊水、感染或炎症区域的渗出液、或含有口腔细胞的漱口水、尿液、脑脊液和关节液，以及器官。
可首先从样品来源(如细胞、土壤等)中用本领域已知方法分离出目标核酸。细胞裂解过程和试剂是本领域众所周知的，且一般可通过化学、物理或电解的裂解方法进行。例如，化学方法一般采用裂解剂来破坏细胞并从细胞中提取核酸，随后用离液盐处理。也可利用物理方法如冻/融后进行研磨、使用细胞压碎器等。高盐裂解过程也是常用的。例如，可采用碱性裂解过程。后者的过程通常包括使用苯酚-氯仿溶液，或可采用替代的包括三种溶液的无苯酚-氯仿过程。在后一种过程中，溶液1可包含15mM Tris，pH 8.0；10mM EDTA和100ug/ml Rnase A；溶液2可包含0.2N NaOH和1％SDS；以及溶液3可包含3MKOAc，pH 5.5。这些过程可参见纽约约翰韦利森公司(John Wiley & Sons，Inc.，New York)的《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in MolecularBiology)的6.3.1-6.3.6(1989)，其全文纳入本文。
样品还可以在与另一样品不同的时间点分离得到，其中各样品来自相同或不同的来源。目标核酸可来自核酸文库，如cDNA或RNA文库。目标核酸可以是样品中核酸纯化或分离和/或核酸分子扩增的产物。为本文所述方法提供的目标核酸可包含来自一个样品或来自两个或更多个样品的核酸(例如来自1个或1个以上、2个或2个以上、3个或3个以上、4个或4个以上、5个或5个以上、6个或6个以上、7个或7个以上、8个或8个以上、9个或9个以上、10个或10个以上、11个或11个以上、12个或12个以上、13个或13个以上、14个或14个以上、15个或15个以上、16个或16个以上、17个或17个以上、18个或18个以上、19个或19个以上、20个或20个以上的样品)。
目标核酸可包含适于本技术的方法使用的任何类型核酸，或基本由其组成。例如，目标核酸通常采用可与捕获核酸杂交的形式。本文所用术语“对应物核酸”是指包含的核苷酸序列与目标核酸基本相同，但具有区分对应物与其目标的特征的核酸。对应物核酸中的核苷酸序列与目标核苷酸序列或其部分相同或基本相同，这使得对应物核酸能与捕获核酸杂交的亲和力和目标核酸与捕获核酸杂交的亲和力基本相同。
本文使用的术语“捕获核酸”是指包含的核苷酸序列与对应物和目标核酸的核苷酸序列互补或基本互补的核酸。在某些实施方式中，捕获核酸可用来捕获目标和对应物核酸用于动态范围压缩。在一些实施方式中，捕获核酸可用来分离目标和对应物，用于进一步的测序分析如核苷酸测序或杂交分析。与目标和对应物核酸的核苷酸序列互补或基本互补的捕获核酸的核苷酸序列可邻接感兴趣的核苷酸序列，或可位于或部分位于感兴趣的核苷酸序列内。一些实施方式提供与固相载体上结合的捕获分子。一些实施方式提供在溶液中使用捕获核酸(例如，捕获核酸不与固相载体连接)，有时捕获核酸可以游离于溶液中，与目标和对应物核酸相互作用，然后与固相载体连接。
在某些实施方式中，含核酸样品可不经处理提供目标核酸用于进行本文所述方法。在一些实施方式中，可在处理含核酸的样品后提供目标核酸用于进行本文所述方法。例如，可从样品中提取、分离、纯化和/或扩增目标核酸。本文所用术语“分离”是指将核酸从其原始环境中取出(例如，天然发生的核酸的天然环境或外源表达的核酸的宿主细胞)，因此核酸从其原始环境“通过人工”而被改变。与来源样品中的组分含量相比，分离的核酸一般带有较少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质)。包含分离目标核酸的组合物可以是基本分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。本文所用术语“纯化”是指提供的目标核酸与其所衍生自的样品来源相比包含更少的核酸种类。包含目标核酸的组合物可以是基本纯化的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其它核酸种类)。本文所用术语“扩增”是指对样品中的核酸进行处理，线性或指数形式的产生与样品中核酸的核苷酸序列或其部分序列相同或基本相同的核苷酸序列的核酸扩增子。
在某些实施方式中，在提供目标核酸用于本文所述方法之前，还可通过将核酸用于产生核酸片段的方法来处理目标核酸。在一些实施方式中，经过片段化或切割的目标核酸，可具有约5到约10,000个碱基对、约100到约1,00个碱基对、约100到约500个碱基对、或约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对的标称平均长度。片段可通过本领域已知的任何合适方法产生，且核酸片段的平均或标称长度可由普通技术人员通过选择适当的片段产生过程而加以控制。在某些实施方式中，较短长度的目标核酸可用来分析含有很少序列变化和/或含有较大量的已知核苷酸序列信息的序列。在一些实施方式中，具有较长长度的目标核酸可用来分析含有更多序列变化和/或含有较少量的未知核苷酸序列信息的序列。
目标核酸片段可含有重叠的核苷酸序列，这样的重叠序列可促进构建此前未片段化的目标核酸或其部分的核苷酸序列。例如，一个片段可具有亚序列x和y，而另一个片段可具有亚序列y和z，其中x、y和z是核苷酸序列，其长度可以是5个核苷酸或更长。重叠序列y可用来促进构建样品中核酸的x-y-z核苷酸序列。在某些实施方式中，目标核酸可以是部分片段化的(例如来自未完全或中止的特异性切割反应)或完全片段化的。
目标核酸的片段化可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法进行，所述方法包括但不限于物理法、化学法和酶法。美国专利申请公开第20050112590号(2005年5月26日公开，题为“用于检测和发现序列变化的基于片段化的方法和系统(Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detectionand discovery)”，发明人为Van Den Boom等)中描述了这些方法的例子。本领域普通技术人员可选择某些方法来产生非特异性切割的片段或特异性切割的片段。可产生非特异性切割片段目标核酸的方法的例子包括但不限于：将目标核酸和使核酸暴露于剪切力的设备接触(例如使核酸通过注射器针头；使用法式压制器)；将目标核酸暴露于辐射(例如γ射线、x射线、紫外辐射；可以通过辐射强度控制片段的大小)；在水中煮沸核酸(例如产生约500碱基对的片段)和将核酸暴露于酸性和碱性水解过程。
可通过使目标核酸与一种或多种特异性切割剂接触来特异性切割所述核酸。本文所用术语“特异性切割剂”有时是指可在一个或多个特异性位点处切割核酸的化学品或酶。特异性切割剂通常能根据特定位点的特定核苷酸序列进行特异性切割。
特异性酶切割剂的例子包括但不限于：内切核酸酶(例如，DNase(例如DNase I、II)；RNase(例如RNase E、F、H、P)；CleavaseTM酶；Taq DNA聚合酶；E.coli DNA聚合酶I和真核结构特异性内切核酸酶；小鼠FEN-1内切核酸酶；I、II或III型限制性内切核酸酶如Acc I、Afl III、Alu I、Alw44I、Apa I、Asn I、Ava I、Ava II、BamH I、Ban II、Bcl I、Bgl I.Bgl II、Bln I、Bsm I、BssHII、BstE II、Cfo I、CIa I、Dde I、Dpn I、Dra I、EcIX I、EcoR I、EcoR I、EcoRII、EcoR V、Hae II、Hae II、Hind II、Hind III、Hpa I、Hpa II、Kpn I、Ksp I、Mlu I、MIuN I、Msp I、Nci I、Nco I、Nde I、Nde II、Nhe I、Not I、Nru I、Nsi I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Rsa I、Sac I、Sal I、Sau3A I、Sca I、ScrF I、Sfi I、Sma I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Swa I、Taq I、Xba I、Xho I。)；糖基化酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II、嘧啶水合DNA糖基化酶、FaPy-DNA糖基化酶、胸腺嘧啶错配DNA糖基化酶、次黄嘌呤-DNA糖基化酶、5-羟甲基尿嘧啶DNA糖基化酶(HmUDG)、5-羟甲基胞嘧啶DNA糖基化酶、或1，N6-亚乙烯基-腺嘌呤DNA糖基化酶)；外切核酸酶(例如外切核酸酶III)；核酶和DNA酶。可用化学试剂处理目标核酸，可切割修饰的核酸。在非限制性的例子中，可采用以下试剂处理目标核酸：(i)烷基化剂如甲基亚硝基脲，其产生若干烷基化的碱基，包括可被烷基嘌呤DNA糖基化酶识别并切割的N3-甲基腺嘌呤和N3-甲基鸟嘌呤；(ii)亚硫酸氢钠，其可造成DNA中的胞嘧啶残基脱氨形成可被尿嘧啶N-糖基化酶切割的尿嘧啶残基；以及(iii)将鸟嘌呤转化成其氧化形式8-羟基鸟嘌呤的化学试剂，8-羟基鸟嘌呤可被甲酰胺基嘧啶DNA N-糖基化酶切割。化学切割方法的例子包括但不限于：烷基化(例如硫代磷酸酯修饰核酸的烷基化)；含P3′-N5′-磷酰胺酯核酸的酸不稳定性切割；以及核酸的四氧化锇与哌啶处理。
本文所用的术语“互补切割反应”是指用不同切割试剂或者通过改变相同切割试剂的切割特异性在相同目标核酸上进行的切割反应，从而产生相同目标或参比核酸或蛋白质改变的切割模式。在某些实施方式中，目标核酸可以用一种或多种特异性切割剂(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种特异性切割剂)在一个或多个反应容器中处理(例如目标核酸用各种特异性切割剂在单独的容器内处理)。
在将目标核酸用于本文所述方法之前，目标核酸还可经过修饰核酸中某些核苷酸的处理。可对目标核酸施用根据核酸中核苷酸的甲基化状态选择性修饰核酸的方法。本文所用术语“甲基化状态”是指多核苷酸序列中的特定核苷酸为甲基化或未甲基化。按照反映目标核酸分子的甲基化模式的方式修饰目标核酸分子的方法是本领域已知的，其示例参见美国专利第5,786,146号以及美国专利公开第20030180779和20030082600号。例如，核酸中未甲基化的胞嘧啶核苷酸可通过亚硫酸氢盐处理转化成尿嘧啶，这一处理不改变甲基化的胞嘧啶。可修饰核酸的核苷酸序列的试剂的非限制性例子包括：甲基甲烷磺酸、乙基甲烷磺酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)、亚硝酸、二(2-氯乙基)硫醚、二(2-氯乙基)甲胺、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羟胺、亚硫酸氢钠、肼、甲酸、亚硝酸钠、5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶。此外，高温、紫外辐射、x-射线辐射等条件可诱导核酸分子序列中的变化。目标核酸可以任何可用于进行本文所述的序列分析或制备方法的形式提供，如固体或液体形式。在某些实施方式中，可以可任选地包含一种或多种其它组分，包括但不限于本领域普通技术人员选择的一种或多种缓冲液或盐的液体形式提供目标核酸。
对应物核酸
对应物核酸是样品群体中各感兴趣的目标的代表。也就是说，样品群体中各感兴趣的目标核酸种类都有相应的对应物核酸，该对应物核酸至少部分与其目标基本相同并包含区分对应物与其目标的特征。如上文就目标核酸而言，对应物核酸可以是任何类型的核酸，可以是天然产生或合成的，可来自任何来源或组合物，可采取任何形式。
对应物核酸的存在、不存在或含量可通过检测一种或多种区分对应物和目标核酸的特征的存在、不存在或含量来确定。在一些实施方式中，区分对应物及其目标的特征是相对于目标发生一个或多个核苷酸的取代，这样的取代可通过例如序列测定方法来检测。在一些实施方式中，区分对应物及其目标的特征是相对于目标发生一个或多个核苷酸的添加或缺失。在一些实施方式中，区分对应物及其目标的特征是互补序列(例如目标核酸或捕获核酸)中核苷酸的取代、缺失或添加。在一些实施方式中，区分对应物及其目标的特征是与互补序列相邻(例如在目标或捕获核酸中直接相连或由间隔序列隔开)的序列中核苷酸的存在、不存在或取代。
在一些实施方式中，对应物核酸还可以包括一种或多种捕获剂。可用于本文所述方法的捕获剂的非限制性例子包括但不限于结合对的任何成员，其中结合对中的成员之一与固相相连，而结合对的另一成员与对应物核酸相连。在一些实施方式中，目标核酸可包含捕获剂，有时对应物核酸包括一个类型的捕获剂而目标核酸包含另一类型的捕获剂(例如以便捕获到不同的固相上)。可使用任何合适的结合对来实现非共价相互作用，包括但不限于：抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白质A或蛋白质G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、维生素B12/特性因子、或核酸/互补核酸(如DNA、RNA、PNA)。可以使用任何合适的结合对来实现共价连接，包括但不限于：化学反应基团/互补化学反应基团(例如巯基/马来酰亚胺、巯基/卤化乙酰衍生物、胺/异硫氰酸、胺/琥珀酰亚胺酯、和胺/磺酰卤化物)。将这些结合对连接到试剂上以及实现结合的方法是已知的。
本文所用术语“固相载体”或“固相”是指包括固体、半固体、凝胶、薄膜、膜、网、毡、复合材料、颗粒等本领域技术人员常用来隔离分子的各种材料。该固相可以是无孔的或多孔的。合适的固相包括在固相结合试验中开发或用作固相的那些材料。参见例如，E.P.Diamandis和T.K.Christopoulos编著的《免疫测定(Immunoassay)》(纽约学术出版社，(Academic Press：New York)1996)第9章，其通过引用纳入本文。合适的固相的例子包括膜过滤器、基于纤维素的纸张、珠粒(包括聚合物的、胶乳的、和顺磁的颗粒)、玻璃、硅晶片、微粒、纳米颗粒、TentaGel凝胶、AgroGel凝胶、PEGA凝胶、SPOCC凝胶和多孔板。参见例如，Leon等，Bioorg.Med.Chem.Lett.8：2997(1998)；Kessler等，Agnew.Chem.Int.Ed.40：165(2001)；Smith等，J.Comb.Med.1：326(1999)；Orain等，Tetrahedron Lett.42：515(2001)；Papanikos等，J.Am.Chem.Soc.123：2176(2001)；Gottschling等，Bioorg.And Medicinal Chem.Lett.11：2997(2001)。在一些实施方式中，固相载体可以固相载体的集合的形式提供。固相载体的集合包含两种或两种以上不同的固相载体种类。本文所用术语“固相载体种类”是指与一种特定的固相核酸种类或者不同的固相核酸种类的特定组合物相结合的固相载体。在某些实施方式中，固相载体的集合包含2到10,000种固相载体种类、10到1,000种固相载体种类或者约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种独特的固相载体种类。固相载体集合中的固相载体(例如珠粒)可以是均一的(例如均为王氏树脂珠)或非均一的(例如一些为王氏树脂珠，一些为磁珠)。
例如，对应物核酸可来自核酸文库，例如cDNA或RNA文库，或可含有发现于核酸文库如cDNA或RNA文库的序列的代表序列。目标核酸可以是样品中核酸纯化或分离和/或核酸分子扩增的产物。为本文所述序列分析方法提供的对应物核酸可包含来自一个样品或来自两个或更多样品的核酸(例如，来自1个或1个以上、2个或2个以上、3个或3个以上、4个或4个以上、5个或5个以上、6个或6个以上、7个或7个以上、8个或8个以上、9个或9个以上、10个或10个以上、11个或11个以上、12个或12个以上、13个或13个以上、14个或14个以上、15个或15个以上、16个或16个以上、17个或17个以上、18个或18个以上、19个或19个以上、20个或20个以上的样品)。
在一些实施方式中，对应物核酸是合成的。合成的对应物核酸可通过本领域已知的任何方法制备，这些方法生成的核酸可用于本文所述实施方式。例如，对应物核酸可按固相亚磷酰胺三酯法，如Needham-VanDevanter等所述用自动合成仪化学合成(Nucleic Acids Res.12：6159-6168，1984)，该方法首先由Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letts.22：1859-1862(1981)中描述。例如，如Pearson和Reanier在J.Chrom.255：137-149(1983)中所述，寡核苷酸的纯化可通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换高效液相色谱(HPLC)实现。
对应物核酸，不论是天然产生的或是合成的，可利用任何本领域已知的任何合适方法来定量，例如在合成和纯化之后、在PCR扩增之后、或在本文所述方法的任何步骤中。例如，将DNA溶液在260nm和280nm波长下的吸光强度测定作为DNA纯度的一种度量。DNA吸收260和280nm的紫外(UV)光，而芳族蛋白质吸收280nm的UV光；纯DNA样品的260/280吸光比值为1.8并相对不含蛋白质污染。被蛋白质污染的DNA制品的260/280比值将会低于1.8。本领域已知定量PCR(Q-PCR)方法用来测定样品中特定DNA序列的含量。同样，可通过限制性酶切、使产物在琼脂糖凝胶中电泳、用溴乙啶或不同染料染色并将DNA的强度和已知浓度的DNA标记物相比较来定量DNA。核酸也可通过利用二苯胺(DPA)指示剂在600nm进行比色检测，并利用已知核酸浓度的标准曲线进行定量。
合成的对应物核酸可根据目标种类的核酸序列来设计。对应物核酸的部分或全部，不论是天然产生或合成的，可与其代表的目标核酸基本相同。在一些实施方式中，对应物核酸的部分或全部，不论是天然产生或合成的，可含有与捕获核酸基本互补的区域。本文所述涉及序列的“基本相同”是指相互例如对应物核酸和目标核酸之间享有一定量的序列相同性的核苷酸序列。包括对应物、目标和捕获核苷酸序列之间具有55％或更高的、56或更高的、57％或更高的、58％或更高的、59％或更高的、60％或更高的、61％或更高的、62％或更高的、63％或更高的、64％或更高的、65％或更高的、66％或更高的、67％或更高的、68％或更高的、69％或更高的、70％或更高的、71％或更高的、72％或更高的、73％或更高的、74％或更高的、75％或更高的、76％或更高的、77％或更高的、78％或更高的、79％或更高的、80％或更高的、81％或更高的、82％或更高的、83％或更高的、84％或更高的、85％或更高的、86％或更高的、87％或更高的、88％或更高的、89％或更高的、90％或更高的、91％或更高的、92％或更高的、93％或更高的、94％或更高的、95％或更高的、96％或更高的、97％或更高的、98％或更高的、或者99％或更高的相同性。确定两个核苷酸序列之间是否基本相同的一种测试是测定共享的相同核苷酸序列的百分比。
本文所述涉及序列的“基本互补”是指能够相互杂交的核苷酸序列。可改变杂交条件的严谨性以容许不同量的序列错配。包括对应物、目标和捕获核苷酸序列的区域之间具有55％或更高的、56或更高的、57％或更高的、58％或更高的、59％或更高的、60％或更高的、61％或更高的、62％或更高的、63％或更高的、64％或更高的、65％或更高的、66％或更高的、67％或更高的、68％或更高的、69％或更高的、70％或更高的、71％或更高的、72％或更高的、73％或更高的、74％或更高的、75％或更高的、76％或更高的、77％或更高的、78％或更高的、79％或更高的、80％或更高的、81％或更高的、82％或更高的、83％或更高的、84％或更高的、85％或更高的、86％或更高的、87％或更高的、88％或更高的、89％或更高的、90％或更高的、91％或更高的、92％或更高的、93％或更高的、94％或更高的、95％或更高的、96％或更高的、97％或更高的、98％或更高的、或者99％或更高的互补性。
序列相同性的计算可如下进行。为最优比较目的进行序列比对(例如，为最优比对，可在第一和第二核酸序列的一个或两个中引入缺口，且为比较目的可不考虑非同源序列)。用于比较目的的参比序列中比对的长度有时是参比序列长度的30％或更长、40％或更长、50％或更长、常为60％或更长、更常为70％或更长、80％或更长、90％或更长、或者100％。随后分别在两个序列之间比较相应位置的核苷酸。当第一序列中的某个位置被与第二序列中相应位置上相同的核苷酸残基占据时，则认为这个位置上的核苷酸相同。两个序列间的相同性百分数是序列间共享的相同位置数量的函数，并考虑到为两个序列的最优比对而引入的缺口数量和各缺口的长度。可采用数学算法在两个序列间进行序列比较并确定相同性百分数。可采用已纳入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller的算法(CABIOS 4：11-17(1989))，利用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4，来确定两个核苷酸序列之间的百分比相同性。可采用GCG软件包(可从网址URL gcg.com上获得)内的GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80以及长度权重1、2、3、4、5或6，来确定两个核苷酸序列之间的相同性百分数。常用的一组参数是Blossum 62计分矩阵，其中缺口开放罚分为12、缺口延伸罚分为4、框架移动缺口罚分为5。
确定两个核酸是否基本相同的另一种方式是评估在严谨条件下与一种核酸同源的多核苷酸是否能与另一种核酸杂交。严谨条件下的杂交也可以用来确定两个核酸是否彼此基本相同。本文所用术语“严谨条件”是指杂交和洗涤的条件。严谨条件是本领域技术人员已知的，可参见纽约约翰韦利森公司(JohnWiley & Sons，N.Y.)的《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)中6.3.1-6.3.6部分(1989)。该文献中所述的水性和非水性方法均可采用。严谨杂交条件的一个例子是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。严谨杂交条件的另一个例子是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在55℃下用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。严谨杂交条件的又一个例子是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在60℃下用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。严谨杂交条件有时是：约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在65℃下用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。通常，严谨条件是在65℃下用0.5M磷酸钠、7％SDS处理，然后在65℃下用0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或多次。严谨杂交温度也可通过添加某些有机溶剂(例如甲酰胺)来改变(即降低)。有机溶剂如甲酰胺降低双链多核苷酸的热稳定性，使得杂交可在较低的温度下进行而仍能保持严谨条件并延长可能不耐热的核酸的使用寿命。
在一些实施方式中，对应物核酸还可被修饰或制备成衍生物、由核苷酸类似物制得的RNA或DNA的变体和类似物、单链(正义或反义)和双链多核苷酸。应理解，术语“核酸”并非表示或暗示特定长度的多核苷酸链，因此也包括核苷酸、多核苷酸、和寡核苷酸。对应物核酸可以包含适于在本技术的方法中使用的任何类型的核酸，如可与目标核酸或捕获核酸杂交的对应物核酸，或基本由其组成。
在一些实施方式中，对应物核酸可包括可检测标记。在一些实施方式中，目标核酸可包括可检测标记，且有时目标核酸包括一种可检测标记而对应物核酸包括显著不同的可检测标记。在需要时，可利用本领域技术人员已知的任何方法修饰核酸以包括可检测标记。可将标记作为合成的部分加入，或在将对应物用于本文所述的任何方法之前加入。标记的加入可在液相或者固相中进行。在一些实施方式中，可检测标记可用于检测目标。在一些实施方式中，可检测标记可用于结合或未结合核酸(例如杂交或未杂交的对应物)的定量。在一些实施方式中，可用一个以上的可检测标记来标记对应物或目标。采用一个以上可检测标记(例如不同种类的标记)可促进检测和定量分析已结合的或溶液中的目标和对应物核酸。本领域技术人员可适当选择并利用适用于检测系统中的相互作用或者生物活性的任何可检测标记。可检测标记的例子有：荧光标记如荧光素、罗丹明及其它(例如，Anantha等，Biochemistry(1998)37：2709 2714；和Qu和Chaires，Methods Enzymol.(2000)321：353369)；放射性同位素(例如，125I、131I、35S、31P、32P、33P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd和127Xe)；光散射标记(例如，美国专利号6,214,560以及加州吉尼康科学公司(Genicon SciencesCorporation)的市售产品)；化学发光标记和酶底物(例如二氧杂环丁烷和吖啶酯)；酶或蛋白质标记(例如，绿色荧光蛋白(GFP)或其颜色变体、荧光素酶、过氧化物酶)；其它生色标记或染料(例如菁)和其它辅因子或生物分子如地高辛、链霉亲和素、生物素等。
在将对应物核酸用于本文所述方法之前，对应物核酸还可进行对核酸中某些核苷酸修饰的过程。在某些实施方式中，可将根据核酸中核苷酸的甲基化状态选择性修饰核酸的方法施用于对应物核酸。
在此参考图1对本发明的方法进行概述，并将在下文中进行更详细的描述。如图1步骤1所示，对应物核酸(也称为对应物)与含有感兴趣的目标核酸(也称为目标)的核酸样品接触。如图1步骤2所示，对应物与样品的组合物与捕获核酸接触。捕获核酸可如图1步骤2所示结合于固相载体上，或也可悬浮在溶液中。使对应物和目标与捕获核酸相互作用，随后进行分析，可例如如图1步骤3所示确定各目标的含量。任选地，目标还可通过测序或杂交研究进一步分析。
对应物和目标(样品)可采用本领域已知的任何合适方法进行接触。例如，对于小的样品组，本领域技术人员可使用单道或多道移液器人工混合目标和对应物。对于较大的样品组或利用DNA芯片或阵列的高通量应用，本文所述方法与高通量DNA分析中常用的机械化装置兼容。用于高通量分析并且和本文所述实施方式兼容的自动化或者机械化装置的一个非限制性例子是称为Oasis LM(美国加利福尼亚州萨尼维尔的泰利卡姆国际公司(Telechem International，Inc.Sunnyvale California 94089))的装置。该计算机驱动的生物工作站可设置有最多达4个具有进行1、8、96、384或1536个样品移液能力的独立移液器头。
通常向系统中引入已知的或者预定量的对应物核酸以进行本文所述的方法。如图1所示，在一些实施方式中，加入反应中的各对应物的单位(例如，含量(例如，重量/重量、重量/体积、克)；浓度)可保持为常数。反应中各对应物的单位数可保持为常数以使得能确定感兴趣的目标的相对丰度，还能压缩样品中核酸物质的动态范围(以下进一步讨论)。在一些实施方式中，可改变(即反应中各目标的单位数不保持为常数)加入的各对应物的量。本领域技术人员可通过使用不同量的对应物核酸进行分析来获得补充信息。为图1的说明目的加入的对应物的量为每个目标10单位。图1所示的例子有3个具有感兴趣区域的核酸种类，目标A、B、和C。为了说明的目的，所述3种目标的丰度范围在约1单位到约100单位之间。在实践中，样品可包含更多感兴趣的核酸，且其丰度也可显著变化。样品中目标的丰度范围可在约1单位到约10单位之间、约1单位到约50单位之间、约1单位到约100单位之间、约1单位到约500单位之间、约1单位到约1,000单位之间、约1单位到约5,000单位之间、约1单位到约10,000单位之间、约1单位到约50,000单位之间、约1单位到约100,000单位之间、约1单位到约500,000单位之间、约1单位到约1,000,000单位之间。本文所用的涉及目标的单位是指一种功能性标识，并可由本领域技术人员设定为任何实际的物理量。单位可以标识为序列的1个拷贝，或序列的10个拷贝。例如，单位可定义为含有低到1毫微微克(fg)的核酸或者多达1毫克(mg)的核酸，或任何两者之间的量。更具体地，单位可以包含约1fg、约2fg、约5fg、约10fg、约100fg、约500fg、约1纳克(ng)、约2ng、约5ng、约10ng、约100ng、约500ng、约1微克(μg)、约2μg、约5μg、约10μg、约100μg、约500μg或约1毫克等。在核酸种类间单位的类型可保持一致，或各核酸种类可具有各自的单位类型。
图1的表中还显示了加入各反应中的目标和对应物的比例以及核酸的总单位数的非限制性例子。例如，图1中表格所示的目标单位与对应物单位的比例在10∶1到1∶10之间。在某些实施方式中，可使用约1∶10到约10∶1之间的任何便利的目标与对应物比例。也就是说，进行本文所述方法所采用的目标与对应物的比例可以是约1∶10、约1∶9、约1∶8、约1∶7、约1∶6、约1∶5、约1∶4、约1∶3、约1∶2、约1∶1、约2∶9、约2∶7、约2∶5、约2∶3、约2∶1、约3∶10、约3∶8、约3∶7、约3∶5、约3∶4、约3∶2、约3∶1、约4∶9、约4∶7、约4∶5、约4∶3、约4∶1、约5∶9、约5∶8、约5∶7、约5∶6、约5∶4、约5∶3、约5∶2、约5∶1、约6∶7、约6∶5、约6∶1、约7∶10、约7∶9、约7∶8、约7∶6、约7∶5、约7∶4、约7∶3、约7∶2、约7∶1、约8∶9、约8∶7、约8∶5、约8∶3、约8∶1、约9∶10、约9∶8、约9∶7、约9∶5、约9∶4、约9∶2、约9∶1、约10∶9、约10∶7、约10∶3、和约10∶1。超出上述范围的目标与对应物的比例也可证明可用于定量分析目标种类的相对丰度或压缩混合群体中极为稀少或极为丰富的核酸的动态范围。
如上所述，并如图1所示，在一些实施方式中，可添加相同量的各对应物种类。在一些实施方式中，可确定目标种类的含量(例如大致含量)，并可加入与目标含量相应量的对应物。也就是说，如图1所示，可在步骤1加入针对计算所得(或大致确定)的目标的量所调整的量的对应物，且对应物种类的量各不相同。在一些实施方式中，各捕获核酸的量低于生物样品中目标的最高含量。
在一些实施方式中，目标可在与对应物接触前通过例如PCR扩增。在一些实施方式中，目标和对应物可在相互接触之后扩增。在一些实施方式中，目标和对应物可在动态范围压缩后扩增。也就是说，目标和对应物可在目标和对应物与捕获核酸，例如以能够实现动态范围压缩的量存在于阵列上的捕获核酸接触后扩增。
动态范围压缩
从样品来源分离得到的混合核酸样品中，某些核酸种类可大量存在，一些核酸种类可以较小的量存在，较稀少的核酸种类的核苷酸序列及其存在可能难以确定。本文将样品中丰富的种类和稀少的种类的含量的范围称为核酸物质含量的“动态范围”。本文所称的动态范围压缩是指降低具有最高丰度的核酸种类的拷贝数。在某些实施方式中，最高丰度核酸种类的拷贝数的降低比照具有较低或者最低丰度的核酸种类的拷贝数进行，而一些实施方式中，则保持是群体中各感兴趣的核酸种类的代表性样品。换言之，后一类实施方式中的动态范围压缩降低了一些实施方式中高丰度核酸种类与低丰度核酸种类之间的比例(高丰度∶低丰度)。在某些实施方式中，最高数量的种类与最低数量的种类之间的比例在动态范围压缩后保持不变，但各种类的相对含量降低。通常选择条件以保持各感兴趣的核酸种类的至少一个拷贝。在某些实施方式中，动态范围压缩还可用于降低中等丰度核酸种类相对于低丰度序列的比例。动态范围压缩的行为通常导致用于后续分析的样品中的总核酸减少。利用动态范围压缩的方法能够减少核酸分析和测序相关的时间和成本，因为分配用于曾是大量表示的核酸种类的分析和测序的资源较少。
使用本文所述实施方式实现的压缩量可根据手头的应用来调整。在一些实施方式中，在对核酸群体的了解有一定程度的确定性时，把所有序列压缩到最稀少序列的水平左右可实现快速序列分析，减少或者无需重复分析。在一些核酸群体未知的实施方式中，可将最高丰度核酸种类的比例降低至较低水平，任选地可确定样品中是否存在一些目标核酸(例如法医学应用)。因此，可将动态范围压缩的程度调整至本领域技术人员可要求的任何范围，以实现优化时间和试剂成本之间的平衡并满足任务的需要。
在一些实施方式中，动态范围压缩的程度可用动态范围比例的降低倍数来表示。动态范围比例(Rdr)可用(i)最高丰度序列的拷贝数(H)，除以(ii)组合物中较低、或最低拷贝数核酸的拷贝数(L)计算得到：
Rdr＝H/L.
动态范围压缩程度可通过使比例Rdr乘以约1x10-9到0.999之间的乘数来表达。因此，本领域技术人员可捕获几乎所有(例如数值高达约0.999)或显著更少(例如数值为约1x10-6)的特定目标/对应物混合物。乘数的例子包括但不限于，乘数为约1x10-7、约1x10-6、约5x10-5、约1x10-5、约5x10-4、约1x10-4、约5x10-3、约1x10-3、约5x10-2，、约1x10-2、约5x10-1和约1x10-1。
在一些实施方式中，上述压缩因子不等于归一化，因为并非各独立目标都相对于特定种类进行压缩。在某些实施方式中，当所有种类都相对于单一种类压缩时，压缩可相当于归一化。
在一些实施方式中，动态范围的压缩可利用连接在固相上的捕获核酸实现，所述捕获核酸包括但不限于核酸阵列或DNA芯片。在一些实施方式中，核酸动态范围的压缩可在溶液中进行。例如，当如图1步骤1所示的目标-对应物混合物与如图1步骤2所示的捕获核苷酸或核酸接触时，发生动态范围的压缩。捕获核酸可与固相载体相互作用。在一些实施方式中，捕获核酸可与固相载体以可逆方式相互作用，从而能够(例如在捕获后)分离目标和对应物用于另外的分析。
在一些实施方式中，捕获核酸以有限的含量存在，例如在溶液中或者与阵列结合。在一些实施方式中，捕获核酸以饱和含量存在，例如在溶液中或者与阵列结合时。在通过阵列实现动态范围压缩的实施方式中，捕获可位于阵列上含有与目标种类和对应物种类特异性杂交的捕获寡核苷酸种类的特定地址。
捕获核酸可以相对于目标核酸和对应物核酸的饱和量、或不饱和量存在(例如在溶液中或者在固相上)。在某些实施方式中，饱和度可以用比例(Rs)表示，其中捕获核酸单位的量(Cap)除以目标核酸单位和对应物核酸单位的量(T+Cpt)：
Rs＝Cap/T+Cpt。
在一些实施方式中，当Rs大于1、通常当Rs大于10时，对应物核酸处于饱和。因此，在一些实施方式中，Rs可以在1.001到约10之间(例如，部分饱和条件；Rs为约2、3、4、5、6、7、8或9)，还可以在约10到约1,000,000之间(例如Rs为约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、50000、100000、500000)。在一些实施方式中，当Rs小于1、通常当Rs等于或小于0.1时，对应物核酸为不饱和。因此，在一些实施方式中，Rs可以在0.999到10-6之间(例如，Rs为约0.1、0.05、0.001、5x10-4、1x10-4、5x10-5、1x10-5和5x10-6)。捕获剂的饱和量有时包括能够捕获75％或更多、76％或更多、77％或更多、78％或更多、79％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或者99％或更多可被捕获的目标和/或对应物的捕获剂的量。在一些实施方式中，不饱和量的捕获剂可结合在阵列上。捕获剂的不饱和量通常产生动态范围的压缩，因为捕获剂仅捕获了部分目标或复合物。
动态范围压缩通常取决于捕获核酸的有效量。本文所用术语“有效量”是指目标和对应物核酸接触到的捕获核酸的有效量。捕获核酸的有效量通常低于目标核酸种类及其对应物种类的总量，其中目标核酸种类是指样品中最高丰度的种类。捕获核酸的有效量可根据目标和对应物核酸在杂交条件下接触捕获核酸的时间量来调整。例如，在一些实施方式中，当杂交时间较长(例如24到48小时)时，捕获核酸的有效量可大约是阵列上特定地址处核酸的总量。例如，在一些实施方式中，当杂交时间较短(例如1分钟)时，捕获核酸的有效量可低于阵列上特定地址处核酸的总量。因此，当捕获核酸以饱和或不饱和量存在时，可通过选择时间量和条件压缩动态范围，在所选的条件下捕获核酸与目标和对应物核酸杂交。
因此，可以控制杂交时间范围以优化动态范围压缩。在一些实施方式中，有时当捕获核酸处于饱和时，可以使用较短的杂交时间(例如，约0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60分钟)。在一些实施方式中，有时当饱和核酸处于不饱和时，可进行较长时间的杂交(例如，约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100小时或更长)。当进行杂交的种类浓度高且不造成限速瓶颈时，杂交可以基本线性的速度进行。随时间推移，随着杂交伙伴中的其一或两者的浓度降至阈值水平以下，杂交速度下降并接近开/关平衡反应。利用杂交速度，可调节杂交时间的长度来选择性地消除高丰度种类，可容易地通过时程来优化杂交时间。
捕获核酸被用来与目标和对应物二者相互作用，并且在一些实施方式中，与捕获核酸杂交的对应物和目标种类的序列是相同的。采用相同序列造成与捕获寡核苷酸的基本相等的相互作用亲和力。本文所用的术语“基本相等的亲和力”涉及不同核苷酸种类与共同的捕获核酸的结合，是指各目标和对应物与捕获核酸以基本相同的频率相互作用的结合反应和条件。在图1步骤2所示的具体实施方式中，阵列上的各地址能结合最多10单位的各目标或对应物种类，这一结合减小了样品中目标核酸的动态范围。随后，确定各对应物种类的存在及其含量，并可确定各目标种类的含量。
根据相互杂交的捕获和目标核苷酸序列间的相同性百分数(％相同性)，可通过例如杂交条件优化捕获寡核苷酸与特定目标种类的特异性杂交。如本文所述，相同性百分数(％)是两种或两种以上核苷酸序列在最优比对和比较时相同碱基数量的一种度量。已描述确定序列相同性的方法。由捕获和目标核酸之间充分的百分数(％)序列相同性引起的序列的特异性杂交有时包括序列相同性为55％或更高、56％或更高、57％或更高、58％或更高、59％或更高、60％或更高、61％或更高、62％或更高、63％或更高、64％或更高、65％或更高、66％或更高、67％或更高、68％或更高、69％或更高、70％或更高、71％或更高、72％或更高、73％或更高、74％或更高、75％或更高、76％或更高、77％或更高、78％或更高、79％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或者99％或更高的核苷酸序列，只要组合中的各捕获核酸能以基本相同的强度、亲和力或杂交效率与其特异性杂交的目标和对应物进行杂交。杂交强度取决于可供杂交的序列和进行杂交的条件。最优杂交条件可取决于感兴趣的核酸的长度和序列，并可容易地选择(例如本文所述的某些杂交条件)。
在一些实施方式中，动态范围压缩可至少部分或者完全在溶液中进行。在一些实施方式中，目标和对应物核酸接触后，可将连接结合伙伴的有限有效量的捕获核酸加入到混合物中。杂交后，与目标和对应物核酸杂交的捕获核酸可与固相接触，该固相与结合伙伴的其它成员连接。
在一些实施方式中，目标核酸包括感兴趣的区域(如上所讨论)。在一些实施方式中，与目标核酸杂交的捕获核酸的核苷酸序列可邻接感兴趣区域的末端，在某些实施方式中，可包含感兴趣的区域或其部分。本文所用术语“邻接”是指两个序列末端之间的距离为0个核苷酸。本文所用术语“邻接”和“基本邻接”是指两个序列的末端之间的距离是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸。
在一些实施方式中，捕获核酸与目标-对应物混合物相互作用后，可用除去未杂交核酸的试剂处理核酸。在某些实施方式中，利用外切核酸酶，该酶可消化未与捕获核酸杂交的核酸分子。在某些实施方式中，若复合物未被捕获(例如通过与固相阵列的直接相互作用)，那么可通过固相捕获剂分离目标-捕获或对应物-捕获核酸复合物。
杂交条件包括但不限于目标-捕获复合物和对应物-捕获复合物的解链温度(Tm)，是优化动态范围压缩的考虑因素。此外，具有区分密切相关种类能力的捕获剂设计通过控制杂交条件和温度，赋予本领域技术人员以具有重要意义的能力和机动性来进行动态范围压缩、序列捕获、鉴定和分析。在一些实施方式中，目标-捕获剂的Tm与对应物-捕获剂的Tm的差异低于或等于1摄氏度。可用来区分目标和对应物种类的目标-捕获剂与对应物-捕获剂复合物之间的解链温度差异有时包括相差1摄氏度或更低、0.9摄氏度或更低、0.8摄氏度或更低、0.7摄氏度或更低、0.6摄氏度或更低、0.5摄氏度或更低、0.4摄氏度或更低、0.3摄氏度或更低、0.2摄氏度或更低、或0.1摄氏度或更低。该杂交效率差异使能根据目标-捕获剂和对应物-捕获剂复合物的Tm进行特定核酸种类的选择性结合及后续的捕获或动态范围压缩。
参考图1，对于涉及将目标和对应物捕获到阵列的实施方式，与在固相载体的整个表面和捕获剂相互作用形成对比，捕获剂可以与固相在离散的位置上相互作用。用与阵列上特定离散位置连接的捕获剂制得的阵列如图1步骤2所示。与特定、离散的位置相互作用的捕获剂可称为具有特定地址，且各位置的地址可以用行和列的位置定义。以这一方式制备固相使本领域技术人员能在相同的阵列上进行多个不同的范围压缩或目标和/或对应物的捕获，同时仍能鉴定各单独地址从而可保留并确定与特定地址相关的参数。
在一些实施方式中，系统中与目标和对应物核酸的亲和力基本相同的任何两种捕获核酸的量可不同。在某些实施方式中，阵列上捕获核酸的量相差50％或更低、49％或更低、48％或更低、47％或更低、46％或更低、45％或更低、44％或更低、43％或更低、42％或更低、41％或更低、40％或更低、39％或更低、38％或更低、37％或更低、36％或更低、35％或更低、34％或更低、33％或更低、32％或更低、31％或更低、30％或更低、29％或更低、28％或更低、27％或更低、26％或更低、25％或更低、24％或更低、23％或更低、22％或更低、21％或更低、20％或更低、19％或更低、18％或更低、17％或更低、16％或更低、15％或更低、14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低、10％或更低、9％或更低、8％或更低、7％或更低、6％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低、或者1％或更低。
在某些实施方式中，捕获目标和对应物之后，可将各地址上的对应物核酸与目标分离，且仅进一步处理目标或对应物，例如以便进行检测和/或测序。在一些实施方式中，目标或对应物可用通过目标或对应物上的捕获剂连接固相的捕获剂伙伴而捕获。这一方法的优势在于，鉴定和分析低丰度核酸目标所需的测序或检测事件较少，由于高丰度序列上浪费的测序反应较少而节约了时间和资源。
核酸序列的长度可影响目标/捕获复合物和对应物/捕获复合物的形成。根据天然序列长度和分离和制备过程中的核酸断裂/切割，从样品中分离并含有感兴趣区域的核酸可能含有不同长度的序列。通常，增加互补核苷酸序列长度可提高杂交的特异性。在一些实施方式中，各感兴趣的目标序列还可具有独特的或更适于杂交的亚区域。目标核酸的长度可根据序列组成和条件选择。在某些实施方式中，目标核酸的长度可以是约5个碱基对(bp)、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp或10,000bp。
类似地，对应物核酸的长度可根据序列组成和条件选择。在某些实施方式中，对应物核酸的长度可以是约5个碱基对(bp)、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp或10,000bp。
在某些实施方式中，捕获核酸具有足够的长度以包括与目标核酸和对应物核酸互补的核苷酸序列，并能进行捕获/目标和捕获/对应物复合物的固相捕获。在某些实施方式中，捕获核酸的长度可以是约5个碱基对(bp)、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp或10,000bp。捕获/目标和捕获/对应物复合物可不包含重叠区域，在一些实施方式中，可包括一个或两个重叠区域。在某些实施方式中，重叠区域的长度可以是约5个碱基对(bp)、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp或10,000bp。重叠区域可以是显著重叠(例如超过95或者甚至99％的重叠)、到部分重叠(在约10％到约90％之间的重叠)、到最低限度的重叠。
目标核酸种类的检测和定量
捕获目标和对应物后，可进一步分析目标核酸和对应物核酸，包括但不限于：检测、测序、杂交和定量。在一些实施方式中，目标核酸和/或对应物核酸种类可用直接结合在目标上或目标内或者通过杂交的捕获剂与目标组合的标记来检测。
在一些实施方式中，可在进一步分析之前将目标核酸与对应物核酸分离。在某些实施方式中，当杂交在阵列位置上的目标核酸的量较大而对应物核酸的量较小时，可以用更少的试剂和更低的成本确定对应物核酸的量。
本领域技术人员可适当选择并利用适用于检测系统中的相互作用或生物活性的任何可检测标记(例如本文所述的某些可检测标记)。在一些实施方式中，已知量的标记与目标核酸或对应物核酸连接(例如，标记有时是化学计量的)。例如，与对应物核酸连接的可检测标记的量可在阵列的某个位置上确定，并且对应物核酸的量可以根据检测到的标记量确定。
在一些实施方式中，目标核酸种类可用核苷酸测序进一步分析。可使用任何合适的测序方法。在一些实施方式中，可通过单核苷酸测序方法和过程进行核苷酸测序。单核苷酸测序方法包括将样品核酸与固相载体在能使单个样品核酸分子与单个固相载体分子杂交的条件下接触。所述条件可包括在“微反应器”中提供固相载体分子和单个样品核酸分子。所述条件还可以包括提供使样品核酸分子可在固相载体上与固相核酸杂交的混合物。可用于本文所述实施方式的单核苷酸测序方法见2009年1月15日递交，2009年7月23日以公开号WO2009/091934发表的国际PCT专利申请PCT/US2009/031169中所述，其全文通过引用纳入本文。
测序平台的例子包括但不限于：454平台(罗氏公司(Roche))，(Margulies，M.等，2005 Nature 437，376-380)、Illumina基因组分析仪(或Solexa平台)或SOLID系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems))或Helicos True单分子DNA测序技术(Harris TD等，2008 Science，320，106-109)、太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的单分子实时(SMRTTM)技术和纳米孔测序(SoniGV和Meller A.2007 Clin Chem 53：1996-2001)。这些平台能以高的多重性按平行方式对样本中分离的多种核酸分子进行测序(Dear Brief Funct GenomicProteomic 2003；1：397-416)。这些平台中的每个都能测序克隆扩增或未扩增单分子核酸片段。
在一些实施方式中，可用称为焦磷酸测序的单核苷酸测序技术分析目标核酸种类。焦磷酸测序是一种通过合成进行DNA测序的方法。合成测序包括取单链DNA并在反应中酶法合成互补链，其与化学发光酶偶联。碱基的成功结合释放出焦磷酸(PPi)，后者转化成ATP，随后通过与萤光素的反应产生可见光。相机检测可见光的产生。光的释放量与产生的ATP的量成比例。有多种焦磷酸测序方法和装置可供本领域技术人员使用，非限制性的例子包括：罗氏公司的454生命科学公司(454 Life Sciences)(康涅狄格州布兰福德(Branford，Connecticut))的基因组测序仪(Genome Sequencer)FLX和GS FLX Titanium系列试剂。
在一些实施方式中，单核苷酸测序可利用纳米孔装置。核酸分析技术的发展包括，例如，利用纳米孔技术确定核酸的序列。纳米孔是一种内径为1纳米数量级的，在硅片上或者以跨膜蛋白形式天然产生的孔。当将纳米孔浸入导电流体并对其施加电压时，可观察到由于内的离子通过纳米孔导电产生的电流。电流的量对纳米孔的大小敏感。DNA分子通过纳米孔时，DNA造成的部分阻塞可改变穿过纳米孔的电流的量级。因为各核苷酸尺寸不同，当DNA通过纳米孔时，可在任何给定时刻检测何种核苷酸正在通过孔。DNA分子通过纳米孔时流过纳米孔的电流的变化代表DNA测序的直接读数。在2009年1月15日递交，2009年7月23日以公开号WO 2009/091934发表的国际PCT专利申请PCT/US2009/031169中描述了一种这样的利用纳米孔装置的单核苷酸测序方法，其全文通过引用纳入本文。
在某些实施方式中，定量分析特定目标核酸的量。在一些实施方式中，被捕获的目标核酸的量可从加入样品中的对应物的量确定。当已知量的特定对应物种类与目标混合时，目标的量可从动态范围压缩后检测的对应物的量计算得到。例如，对应物可与目标混合，混合物可与阵列接触，该阵列上按地址组装的捕获核酸能特异性杂交对应物种类及其目标种类，且杂交在地址上的对应物种类的量可确定(例如，通过单分子核酸测序技术)。在一些实施方式中，确定目标种类和对应物种类的量并计算两者的比例。在某些实施方式中，目标种类的量可通过对应物种类的量或比例(对应物种类对目标种类，或目标种类对对应物种类)推导、外推或确定。
本技术的实施方式的例子
下文提供了本技术实施方式的非限制性例子。
1A.一种定量分析生物样品中目标核酸含量的方法，包括：
a.在目标与其对应物杂交的条件下，
通过将(i)生物样品中的多种目标核酸(目标)与(ii)已知量的各目标的对应物核酸(对应物)接触来制备混合物，
其中各对应物包含(i)与其目标基本相同的核苷酸序列和(ii)区分各对应物与其目标的特征；
b.压缩混合物中目标的动态范围；
c.测定各目标和对应物的量；以及
d.通过(c)所得的量定量各目标的含量。
1B.一种鉴定生物样品中目标核酸的方法，包括：
a.在目标与其对应物杂交的条件下，
通过将(i)生物样品中的多种目标核酸(目标)与(ii)已知量的各目标的对应物核酸(对应物)接触来制备混合物，
其中各对应物包含(i)与其目标基本相同的核苷酸序列和(ii)区分各对应物与其目标的特征；
b.压缩混合物中目标的动态范围；以及
c.鉴定各目标和对应物。
1C.一种压缩生物样品中目标核酸的动态范围的方法，包括：
a.在目标与其对应物杂交的条件下，
通过将(i)生物样品中的多种目标核酸(目标)与(ii)已知量的各目标的对应物核酸(对应物)接触来制备混合物，
其中各对应物包含(i)与其目标基本相同的核苷酸序列和(ii)区分各对应物与其目标的特征；
b.将混合物与一组捕获核酸接触，其中(i)该组中的各捕获核酸与一种目标与对应物特异性地杂交，(ii)该组中的各捕获核酸与其特异性杂交的目标和对应物的杂交强度基本相同，并且(iii)各捕获核酸的量低于生物样品中目标的最高含量；
从而目标的动态范围得到压缩。
2.如实施方式1A、1B和1C中任一个所述的方法，其中目标和对应物在(b)之前扩增。
3.如实施方式1A、1B和1C中任一个所述的方法，其中目标和对应物在(b)之后扩增。
4.如上述实施方式中任一个所述的方法，其中对应物的特征是，在与其目标基本相同的序列中有单个核苷酸取代。
5.如上述实施方式中任一个所述的方法，其中对应物的特征是，在与其目标基本相同的序列上附加一个或多个额外核苷酸。
6.如上述实施方式中任一个所述的方法，其中各目标的量与其对应物的量的比例在约1∶10到约10∶1之间。
7.如实施方式中1A或1B所述的方法，其中步骤(b)包括将混合物与一组捕获剂接触，其中：
各捕获剂特异性捕获各目标及其对应物，和
各捕获剂的含量在压缩混合物中目标的动态范围的范围内。
8.如实施方式7所述的方法，其中捕获剂的阵列位于固相载体上。
9.如实施方式7或8所述的方法，其中捕获剂以基本相同的亲和力与目标和对应物相互作用。
10.如实施方式7、8、或9中任一个所述的方法，其中各捕获剂是包含与目标的核苷酸序列互补的多核苷酸序列的捕获核酸。
11.如实施方式10所述的方法，其中目标-捕获剂的解链温度(Tm)与对应物-捕获剂的Tm的差异低于或等于1摄氏度。
12.如实施方式7-10中任一个所述的方法，其中阵列的任何两种捕获剂的含量相差低于或等于50％。
13.如实施方式1B或1C所述的方法，其中目标序列在随后确定。
14.如实施方式13所述的方法，其中目标序列通过用纳米孔装置分析目标确定。
15.如实施方式1A或1B所述的方法，其中在(b)之后将对应物与目标分离。
16.如实施方式15所述的方法，其中对应物或目标包含与捕获剂结合的捕获部分。
17.如实施方式1C所述的方法，其包括在(b)之后将对应物与目标分离。
18.如实施方式17所述的方法，其中对应物或目标包含与捕获剂结合的捕获部分。
本文中引用的各专利、专利申请、出版物和文献的全部内容均通过引用纳入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文献的引用并不表示承认上述任何内容是相关的现有技术，也并不表示承认这些出版物或文献的内容或日期。
在不背离本技术基本方面的情况下，可对上述内容进行改变。尽管参考一个或多个具体实施方式充分详细描述了本技术，但是本领域普通技术人员应认识到可对本申请中具体揭示的实施方式进行改变，只要这些改变和改进在本技术的范围和精神内。
本文中适当描述的技术可在无本文中具体揭示的任何元素存在下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包含”、“基本由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可用其它两个中的任何一个代替。已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，这些术语和表达的使用并不排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，以及在要求专利权的本技术范围内的各种可行的改变。术语“一个”或“一种”表示一个或一种或者多个或多种其修饰的元素(例如“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文清楚地表示所描述的是一种元素或是多种元素。本文所使用的术语“约”表示在基础参数的10％范围内的数值(即±10％)，在一列数值的开头处使用术语“约”表示修饰该列数值中的每个数值(即，“约1、2和3”是约1，约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括在90克到110克之间的重量。因此，应理解，尽管通过代表性实施方式和任选的特征具体描述了本技术，但是本领域技术人员能够想到本文所揭示的内容的改变和变化，应认为这些改变和变化落在本技术的范围内。
在所附权利要求书中陈述了本技术的实施方式。

Claims (14)

1.一种定量分析生物样品中目标核酸含量的方法，所述方法用于非诊断且非治疗目的，其包括：
a.通过将(i)生物样品中的多种目标核酸（目标）与(ii)已知量的各目标的对应物核酸（对应物）接触来制备混合物，
其中除了各对应物的核苷酸序列中区分各对应物与其目标的特征以外，各对应物的核苷酸序列与其目标相同；
b.将混合物与一组捕获核酸接触，其中(i)该组中的各捕获核酸与一种目标和对应物特异性地杂交，(ii)该组中的各捕获核酸以相同强度与其特异性杂交的目标和对应物杂交，(iii)各捕获核酸的量低于生物样品中目标的最高含量，且(iv)在该组中的各捕获核酸特异性杂交目标和对应物之前或之后，该组中的各捕获核酸被连接至固相，
从而混合物中目标的动态范围得到压缩；
c.测定各目标和对应物的量；和
d.通过(c)所得的量定量各目标的含量。
2.一种鉴定生物样品中目标核酸的方法，所述方法用于非诊断且非治疗目的，其包括：
a.通过将(i)生物样品中的多种目标核酸（目标）与(ii)已知量的各目标的对应物核酸（对应物）接触来制备混合物，
其中除了各对应物的核苷酸序列中(ii)区分各对应物与其目标的特征以外，各对应物的核苷酸序列与其目标相同；
b.将混合物与一组捕获核酸接触，其中(i)该组中的各捕获核酸与一种目标和对应物特异性地杂交，(ii)该组中的各捕获核酸以相同强度与其特异性杂交的目标和对应物杂交，(iii)各捕获核酸的量低于生物样品中目标的最高含量，且(iv)在该组中的各捕获核酸特异性杂交目标和对应物之前或之后，该组中的各捕获核酸被连接至固相，
从而混合物中目标的动态范围得到压缩；和
c.鉴定各目标和对应物。
3.一种压缩生物样品中目标核酸的动态范围的方法，所述方法用于非诊断且非治疗目的，其包括：
a.通过将(i)生物样品中的多种目标核酸（目标）与(ii)已知量的各目标的对应物核酸（对应物）接触来制备混合物，
其中除了各对应物的核苷酸序列中区分各对应物与其目标的特征以外，各对应物的核苷酸序列与其目标相同；
b.将混合物与一组捕获核酸接触，其中(i)该组中的各捕获核酸与一种目标与对应物特异性地杂交，(ii)该组中的各捕获核酸以相同强度与其特异性杂交的目标和对应物杂交，(iii)各捕获核酸的量低于生物样品中目标的最高含量，且(iv)在该组中的各捕获核酸特异性杂交目标和对应物之前或之后，该组中的各捕获核酸被连接至固相；
从而目标的动态范围得到压缩。
4.如权利要求1、2和3中任一项所述的方法，其特征在于，所述目标和对应物在(b)之前扩增。
5.如权利要求1、2和3中任一项所述的方法，其特征在于，所述目标和对应物在(b)之后扩增。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述对应物的特征是，所述对应物的序列中有单个核苷酸取代。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述对应物的特征是，所述对应物在与目标相同的核苷酸序列上附加一个或多个额外核苷酸。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述各目标的量与其对应物的量的比例在1:10到10:1之间。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获核酸位于固相载体上的阵列中。
10.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，目标-捕获核酸的解链温度（Tm）与对应物-捕获核酸的Tm的差异低于或等于1摄氏度。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述阵列的任何两种捕获核酸的含量相差低于或等于50%。
12.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述目标序列在随后确定。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述目标序列通过用纳米孔装置分析目标确定。
14.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在(b)之后将对应物与目标分离。
CN200980148025.3A 2008-11-24 2009-11-20 核酸定量的产品和方法 Expired - Fee Related CN102224259B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11747408P 2008-11-24 2008-11-24
US61/117,474 2008-11-24
PCT/US2009/065280 WO2010059914A2 (en) 2008-11-24 2009-11-20 Nucleic acid quantification products and processes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102224259A CN102224259A (zh) 2011-10-19
CN102224259B true CN102224259B (zh) 2014-08-27

Family

ID=42198816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980148025.3A Expired - Fee Related CN102224259B (zh) 2008-11-24 2009-11-20 核酸定量的产品和方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10533215B2 (zh)
EP (3) EP2358911B1 (zh)
CN (1) CN102224259B (zh)
CA (1) CA2743908A1 (zh)
WO (1) WO2010059914A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10533215B2 (en) 2008-11-24 2020-01-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid quantification products and processes
US20130196323A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-01 The University Of North Carolina At Greensboro Methods Of Nucleic Acid Analysis
DE102013211125A1 (de) * 2013-06-14 2014-12-18 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur kombinierten Quantifizierung und Sequenzierung von mindestens einer Ziel-Nukleinsäure
DE102013211113A1 (de) * 2013-06-14 2014-12-18 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur kombinierten Quantifizierung und Sequenzierung von mindestens einer Ziel-Nukleinsäure
US11486873B2 (en) 2016-03-31 2022-11-01 Ontera Inc. Multipore determination of fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample
EP3800469A1 (en) * 2016-10-24 2021-04-07 Ontera Inc. Fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003095680A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-20 Applera Corporation Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides
WO2007050990A2 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 Rosetta Inpharmatics Llc Nucleic acid amplification using non-random primers

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69620596T2 (de) 1995-05-19 2002-11-21 Abbott Laboratories, Abbott Park Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen
BR9710836A (pt) 1996-04-25 2000-10-24 Spectrametrix Inc Ensaio de analitos usando marcas em partìculas
US5786146A (en) 1996-06-03 1998-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
WO2001038585A2 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 The Regents Of The University Of California Polymer arrays and methods of using labeled probe molecules to identify and quantify target molecule expression
EP1164201A1 (en) * 2000-06-14 2001-12-19 Facultés Universitaires Notre-Dame de la Paix Reverse detection for identification and/or quantification of nucleotide target sequences on biochips
CA2433674A1 (en) 2001-01-05 2002-07-11 Invitrogen Corporation Method for relative quantification of attached nucleic acids
DE10112515B4 (de) 2001-03-09 2004-02-12 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität
US20040006033A1 (en) * 2001-08-06 2004-01-08 Zhu York Yuan-Yuan Methods for identifying low-abundance polynucleotides and related compositions
AU2003220291A1 (en) 2002-03-15 2003-09-29 Epigenomics Ag Discovery and diagnostic methods using 5-methylcytosine dna glycosylase
JP4683922B2 (ja) 2002-09-06 2011-05-18 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 遺伝子発現の定量方法
CA2507189C (en) 2002-11-27 2018-06-12 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
US7560232B2 (en) * 2002-12-19 2009-07-14 Promega Corporation Methods of capturing, detecting and quantifying RNA:DNA hybrids and a modified RNase H useful therein
EP4450642A3 (en) 2008-01-17 2025-01-08 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
US10533215B2 (en) 2008-11-24 2020-01-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid quantification products and processes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003095680A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-20 Applera Corporation Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides
WO2007050990A2 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 Rosetta Inpharmatics Llc Nucleic acid amplification using non-random primers

Also Published As

Publication number Publication date
US10533215B2 (en) 2020-01-14
EP2358911A2 (en) 2011-08-24
CA2743908A1 (en) 2010-05-27
CN102224259A (zh) 2011-10-19
US20110263453A1 (en) 2011-10-27
EP3181702B1 (en) 2019-04-17
US20200216885A1 (en) 2020-07-09
EP2358911A4 (en) 2013-01-23
WO2010059914A2 (en) 2010-05-27
WO2010059914A3 (en) 2010-09-30
EP2358911B1 (en) 2016-12-21
EP3181702A1 (en) 2017-06-21
EP3584324A1 (en) 2019-12-25
WO2010059914A8 (en) 2011-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12077752B2 (en) Nucleic acid preparation compositions and methods
RU2752700C2 (ru) Способы и композиции для днк-профилирования
EP3172321B1 (en) Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
US20200216885A1 (en) Nucleic acid quantification products and processes
HK40015512A (zh) 核酸定量的产品和方法
HK1240280A1 (zh) 通过压缩高丰度分子的动态范围提高核酸定量
HK1240280B (zh) 通过压缩高丰度分子的动态范围提高核酸定量
HK40007885B (zh) 核酸制备方法
HK1241938B (zh) 核酸制备组合物和方法
HK1241938A1 (zh) 核酸制备组合物和方法
HK1236561B (zh) 使用crispr-cas系統的多核苷酸富集
HK1236561A1 (zh) 使用crispr-cas系統的多核苷酸富集
HK1168386A (zh) 核酸制备组合物和方法
HK1168386B (zh) 核酸制备组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140827

Termination date: 20201120

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee