CN102260749B - H5、h7、h9亚型禽流感病毒检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，在GenBank中搜索三种亚型HA基因序列，设计特异性引物。经过大量的试验和实际检测，筛选、优化出3对引物及其反应体系，所扩增的cDNA片段大小分别为427、312、和826bp。结果表明，通过对多重RT-PCR扩增条件的优化，制成了同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒，最低检出量均为10pg。而对多种鸡传染病及正常组织不存在交叉反应，特异性强，对三种亚型检测敏感性一致。基层实验室就可以在短时间内确诊禽流感，定位到亚型，为禽流感的防控争取了时间，及时采取措施，使禽流感传播控制在尽可能小的范围内。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，确切地说是H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性传染病，除了可感染禽类外，还可感染人、猪和马等多种动物，被OIE列为A类传染病。禽流感病毒(AIV)属于A型流感病毒，禽流感病毒(AIV)变异频繁，血清亚型众多。根据HA抗原性差异分为16个HA亚型。抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疾病。
高致病性禽流感主要是由H5或H7亚型AIV引起的，潜伏期极短，突然爆发，多不见任何临床症状而突然死亡，发病率和死亡率可高达100％，给养禽业带来严重经济损失，另外还可感染人，甚至导致死亡。据世界卫生组织(WHO)报道，截止到2009年5月22日，全世界共有H5N1亚型禽流感病毒感染人429例，死亡262例；我国共有感染病例38例，死亡25例。目前，我国部分地区以H9亚型为主的中低致病力禽流感的流行，能造成鸡产蛋量下降，给我国养禽业造成很大的经济损失，这一点已引起国内各界的广泛关注。所以早期快速检测无疑是预防、控制禽流感的前提条件，尤其是针对H5、H7和H9亚型的AIV。病毒分离、血清学试验至今仍是诊断AI和对AIV进行定型普遍采用的方法。但这些方法操作繁琐复杂；难以对AI进行快速诊断；十分不利于AI的防治。自从美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外基因扩增技术，可以在数小时内对某段基因进行扩大数百万倍。该技术特异性强、敏感性高。为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。
多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)技术其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。但与多个单项PCR相比，多重PCR具有以下显著的优点：高效性，它可在同一PCR管内同时扩增多个靶基因，或对有多个型别的目的基因进行分型；系统性，多重PCR很适宜于多种病原体的同时检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌和无芽孢厌氧菌的同时检测；经济简便性，多个靶基因在同一反应管内同时扩增，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。自从1988年首次报道以来，作为一种临床和实验室快速筛选技术，多重PCR已经成功应用到很多领域，如基因缺失、突变和多态性的分析、RNA检测 和基因组测序分析。
各类PCR成功的关键在于设计出合理的引物，合适的引物是决定PCR扩增特异性和敏感性的关键。多重PCR对引物的要求更加严格，以便同时检测出多种病原微生物。
多重PCR的各对引物必须具有相近的退火温度，使得所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单个的反应中得到有效的扩增。而其之间不能形成稳定二聚体和发夹结构。同时保证了扩增产物的大小能够通过电泳分开。
虽然有很多能帮助设计引物的软件，例如“Premier Primer 5.0”、“Olio 6”、“V ector N TI Suit”、“DNAsis”和“DNAstar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果并不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上，还要各软件搭配使用。
尽管上述软件能够对帮助设计引物，但它毕竟是在科技人员大量研究成果的基础上，设计出的固定程序。人工分析、实际操作经验是必不可少的。可靠的多重PCR检测体系，还要通过科技人员大量试验验证、筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用多重RT-PCR可同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒。
H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，它是由RNA反转录体系，以及PCR反应体系组成，其中引物为：
P5-1：5′-CCAATCCAGCCAATGACC-3
P5-2：5′-TCTATGGCAACCCTTCTT-3
P7-1：5′-GAGTCAATGGACTTCACC-3′
P7-2：5′-AGGTTCGGTCTGCTCGCT-3′
P9-1：5′-TCTATGGCAACCCTTCTTGT-3′
P9-2：5′-TATAACCCTGACCAACCTCC-3；
所述的反转录体系还包括引物P5-1、P7-1和P9-1；
所述的引物还包括：
P9内-1：5′-ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3′
P9内-2：5′-ACAAGATAACATCCAAAGTA-3
所述的反转录体系为：双蒸水2.7μL、反转录酶缓冲液2.0μL、三磷酸脱氧核糖核苷1.0μL、反转录酶抑制剂0.3μL、反转录酶0.5μL及三种亚型上游引物各0.5μL的10μL反转录体系；
所述的PCR体系为：双蒸水29.7μL、10×PCR缓冲液5.0μL、三磷酸脱氧核糖核苷4.0μL、DNA聚合酶0.5μL及引物P5-2、P5-2、P7-1、P7-2、P9-1和P9-2各0.8μL的50μL的反应体系。
本发明提供的H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，在GenBank中搜索三种亚型HA基因序列，设计特异性引物。经过大量的试验和实际检测，筛选、优化出3对引物及其反应体系，所扩增的cDNA片段大小分别为427、312、和826bp。结果表明，通过对多重RT-PCR扩增条件的优化，制成了同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒，最低检出量均为10pg。而对鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡白痢沙门氏菌病原核酸及正常组织不存在交叉反应，特异性强，对三种亚型检测敏感性一致。基层实验室就可以在短时间内确诊禽流感，定位到亚型，为禽流感的防控争取了时间，及时采取措施，使禽流感传播控制在尽可能小的范围内。
附图说明
图1为H9亚型AIV RT-PCR扩增结果，其中，M：DNAMaker DL2000 1：外侧引物扩增条带 2：内侧引物扩增条带 3：水对照；
图2为三种亚型AIV的多重RT-PCR敏感性实验扩增结果，其中，M：DNA分子质量标准，1：为10ng，2：为1ng，3：为100pg，4：为10pg，5：为1pg
具体实施方式
实施例1
禽流感病毒H5、H7和H9亚型标准毒株由哈尔滨兽医生物技术国家重点实验室保存。鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)B87、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)疫苗株、鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株、鸡白痢沙门氏菌(SP)CVCC528，由吉林农业大学预防兽医教研室保存。
用Trizol提取病毒或疑似禽流感的病料(肺脏、淋巴结、脾脏)1～4g的总RNA，提取过程中所有的器皿及消耗品均用DEPC水处理。
(1)将收集好的尿囊液以4000rpm 4℃离心30min，弃沉淀，上清液移至新的Eppendorf管中4℃10000rpm超速离心2h，收集沉淀，以原尿囊液1/20体积的PBS(pH7.4)重悬毒液。
(2)抽取浓缩病毒液250μL至灭菌的2.0mLEppendorf管中，加入750μL Trizol裂解液，剧烈振荡15s，室温静置15min。
(3)加入200μL氯仿，振荡15s充分混匀，室温静置5min，12000rpm离心15min。
(4)取上清夜至新的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000rpm离心18min。
(5)小心弃去上清液，加入75％乙醇(用DEPC水配制)混匀，洗涤沉淀，12000rpm离心8min。
(6)弃去上清液，将Eppendorf管置于超净工作台中通风干燥沉淀5-10min。
(7)加入灭菌的DEPC水20μL溶解沉淀。
(8)将核酸分装成每管5μl，-70℃保存备用；
按下表反应体系：
表1反转录反应体系各组成成分
Tab1 Composition of reaction system for reverse transcription
注：三种亚型上游引物见表2
轻轻混匀，瞬离，按反应条件：42℃45min，99℃5min，4℃5min结束，在PCR仪上设定程序进行反转录；
人工合成表2中引物：
表2多重RT-PCR引物
Tab.2Multiplex RT-PCR primers
按表3反应体系：
表3H5、H7和H9亚型AIV多重PCR反应体系组成成分
Tab.3Composition of multiplex PCR reaction system for H5、H7 and H9 subtypes AIV
按反应条件：95℃预变性3min；然后进入95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸1min，共33个循环；72℃延伸10min，4℃保温；在PCR仪上设定程序进行扩增；
取5μL PCR反应产物以0.8％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察扩增片段。结果同时扩增出427bp、312bp、826bp大小的三条DNA片段。
实施例2
人工合成表4引物；
表4H9亚型禽流感病毒巢式PCR内侧引物
取H9亚型AIV按实施例1的PCR方法扩增，取反应产物，按表4反应体系；
表5H9亚型AIV巢式PCR反应体系各组成成分
按反应条件：94℃预变性3min后，进入94℃变性45s，53℃退火1min，72℃延伸1min，共循环30次，然后72℃再延伸10min，于4℃结束PCR扩增。取PCR产物5μL，用0.8kg/L琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果。电泳检测结果见图1。
实施例3特异性试验
将H5、H7和H9亚型AIV的RNA以及鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)B87、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)疫苗株、鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株、鸡白痢沙门氏菌(SP)CVCC528，及取健康禽类组织的RNA、DNA分别按实施例1、2方法，在相同条件下进行扩增。回收、纯化扩增片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，分析测序结果，检测RT-PCR的特异性。
H5、H7和H9亚型AIV的cDNA经PCR扩增，结果H5亚型AIV在427bp位置出现一条cDNA扩增带，H7亚型AIV则在312bp位置出现一条cDNA扩增带，H9亚型AIV在826bp位置出现一条cDNA扩增带，而鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡白痢沙门氏菌及正常组织，无论在427bp、312还是826bp处均无cDNA扩增带出现，即为阴性。对所回收的427、312和826bp cDNA扩增片段进行测序，并对测序结果经DNAStar基因分析软件分析，这些cDNA片段分别与AIV H5亚型HA基因、H7亚型HA基因和H9亚型HA基因有着高度同源性，表明这些扩增基因的序列与原参考序列的基因来源完全一致，分别来源于AIV H5亚型HA基因、H7亚型HA基因和H9亚型HA基因。
实施例4敏感性试验
将H5、H7和H9亚型AIV的反转录产物(10μg/mL)10倍梯度稀释，按照上述试验确定的PCR最适条件进行敏感性检测，测定该RT-PCR对三种亚型AIV cDNA的最低检测量。H5、H7、H9亚型AIV的多重RT-PCR检测的最低检出量均为10pg(见图2)，H9亚型AIV cDNA的巢式PCR的最低检测量为10fg。
实施例5 H5、H7和H9亚型AIV多重PCR检测方法
.取疑似禽流感的病料(肺脏、淋巴结、脾脏等)1～4g于无菌研钵，研磨并加入适量的RNAiso Reagent后匀浆，室温放置5～10分钟；加入250μL氯仿，漩涡振荡15秒混匀；室温下放置5分钟；12000r/min离心15分钟，取上层水相，转移到一个新的EP管中，再加入等体积的异丙醇混匀，室温放置10分钟。12000r/min离心10分钟，弃去上清，加入75％乙醇700μL，充分洗涤沉淀的RNA后，12000r/min离心5分钟，小心吸去上清。室温晾干或到置于超净工作台内风干15-30分钟。用10μL DEPC水中溶解，即为模板，即用或-70℃冻存备用；
按实施例1的反转录体系及反应条件反转录；
取反转录产物进行H5、H7和H9亚型AIV多重PCR检测，反应体系按表6
表6H5、H7和H9亚型AIV多重PCR反应体系组成成分
Tab.3Composition of multiplex PCR reaction system for H5、H7 and H9 subtypes AIV
按反应条件：95℃预变性3min；然后进入95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸1min， 共33个循环；72℃延伸10min，4℃保温；在PCR仪上设定程序进行扩增；取PCR产物5μL，用0.8kg/L琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果。
在312bp位置出现一条cDNA扩增带，H5亚型AIV阳性；无为阴性。
在427bp位置出现一条cDNA扩增带，H7亚型AIV阳性；无为阴性
在826bp位置出现一条cDNA扩增带；H9亚型AIV阳性；无为阴性
当H9亚型阴性时，取上述多重RT-PCR产物按实施例2的反应体系(表5)及反应条件，扩增出693bp条带，H9亚型为阳性；无为阴性。
该方法特别适合基层实验室使用，方便快捷，简单实用，经济节约，可以在较近的地点，最短时间内确诊禽流感，并可直接定位到亚型。使禽流感的传播锁定在一个较小的范围。
可同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒，最低检出量均为10pg。H5和H7毒力较强，感染后病毒浓度大，检出量10pg即可定性；而H9为中等毒力，特别是隐性感染时，症状不明显，病毒浓度低，对多重RT-PCR产物再进行内引物检测，以排除隐性感染。
Claims (2)
1.H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，它是由RNA反转录体系，以及PCR反应体系组成，所述的反转录体系为：双蒸水2.7 μL、反转录酶缓冲液2.0 μL、三磷酸脱氧核糖核苷1.0 μL、反转录酶抑制剂0.3 μL、反转录酶0.5 μL及三种亚型上游引物P5-1、P7-1和P9-1各0.5 μL；加上待检病料RNA模板2.0 μL的10μL反转录体系；
所述的PCR体系为：双蒸水29.7μL、 10×PCR缓冲液5.0μL、三磷酸脱氧核糖核苷4.0μL、DNA聚合酶0.5μL及引物P5-1、P5-2、P7-1、P7-2、P9-1和P9-2各0.8μL；加上待检的所述的RNA反转录体系的，病料RNA反转录产物cDNA 模板6.0μL的50μL反应体系；
所述的其中引物为：
P5-1：5′-CCAATCCAGCCAATGACC- 3
P5-2：5′-TCTATGGCAACCCTTCTT- 3
P7-1：5′- GAGTCAATGGACTTCACC - 3′
P7-2：5′- AGGTTCGGTCTGCTCGCT - 3′
P9-1：5′- TCTATGGCAACCCTTCTTGT - 3′
P9-2：5′- TATAACCCTGACCAACCTCC – 3。
2.根据权利要求1所述的H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括一个H9亚型AIV 巢式PCR反应体系：10×PCR 缓冲液2.5μL、三磷酸脱氧核糖核苷2.0μL、DNA聚合酶0.3μL、内引物P9-内1和 P9-内2各0.3μL、双蒸水18.1μL；加上权利要求1的50μL反应体系的PCR反应产物1.5μL的25μL反应体系；
所述内引物：
P9内-1：5′-ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3′
P9内-2：5′-ACAAGATAACATCCAAAGTA- 3。
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