CN102271496A - 提高植物对环境应激的耐受性的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于产生或选择对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法、多核苷酸和多肽。本发明还提供了包含本发明多核苷酸的构建体、细胞、植物细胞和植物。本发明还提供了通过本发明的方法产生的植物。本发明还提供了通过本发明的方法选择的植物组。
Description
技术领域
本发明涉及用于生产具有提高的应激耐受性的植物的组合物和方法。
背景技术
环境非生物应激，包括干旱应激、寒冷应激、冰冻应激、热应激和盐度应激，是限制植物生长和生产力的主要因素。由这些应激引起的包括玉米、小麦和水稻的主要作物的作物损失和产量降低代表了意义重大的经济问题，并且还导致一些不发达国家的食物短缺。
应激耐受性植物的研发具有减少或解决这些问题中的至少一些问题的潜能。使用传统植物育种策略来产生新的呈现出对这些类型的应激的耐受性的植物系是缓慢的。缺乏足够的种质资源以及远缘相关植物物种之间的不相容性代表了常规育种中的重要问题。此外，导致对这些应激的耐受性的细胞过程是复杂的并且涉及细胞顺应的多重机理和各种代谢途径。这限制了传统育种和遗传工程方法开发应激耐受性植物的成功。鉴定涉及控制导致应激耐受性的复杂过程的基因和蛋白将是有益的。
涉及控制应激耐受性的基因表达的调控子，如转录因子，在植物的基因工程中特别有用，因为单个基因可以控制导致耐受性表型的基因的整个级联。此外，在上述不同类型的应激耐受性应答的许多方面中，有时候存在共同性。例如，提高冷或盐耐受性的基因也可以提高干旱应激耐受性。这在转录因子At CBF/DREB1(Kasuga等，1999 Nature Biotech 17：287-91)和空泡的焦磷酸酶AVP1(Gaxiola等，2001 PNAS 98：11444-19)的情况中已经得到了证实。
尽管已经鉴定了一些潜在有用的基因，但给予应激耐受性的植物基因的鉴定和克隆仍然是片段化的和不完整的。尽管推定应激诱导的蛋白在应激耐受性中具有一定的作用，但仍然缺乏证据，而且许多这样的应激应答基因的功能是未知的。
新西兰和其他国家夏季的干热天气条件对裸麦草的产量具有重要的影响。这一定是在乳场挤奶季的期间，并因此通过减少的奶产量或使用补充饲料和/或灌溉系统对乳制品生产的成本具有现实的影响。
在应激易感植物品种中鉴定出具有提供应激耐受性能力的基因将是有益的。应激耐受性作物的研发将提供许多优势，如提高产量和生产出可以在之前不合适的环境条件中栽培的植物。因此，对用于生产相对于栽培的对应物具有提高的应激耐受性的植物的组合物和方法存在着需求。
本发明的目的是提供用于研发如下植物品种的改进的组合物和方法，该植物品种对以下的至少一种应激(干旱、寒冷、冰冻、热和盐度)具有提高的耐受性，或至少给公众提供了一种有用的选择。
发明内容
在第一个方面中，本发明提供了用于生产对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括用遗传构建体转化植物，该遗传构建体包括：
a)编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体能够提高对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性；
b)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；或
c)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸。
在可替换的方面中，本发明提供了用于生产对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括用遗传构建体转化植物，该遗传构建体包括：
a)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽或多肽变体的多核苷酸；
b)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；或
c)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸。
优选，a)中的变体编码能够提高对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽。
在一个实施方案中，环境应激是干旱。
在进一步的实施方案中，环境应激是寒冷。
在进一步的实施方案中，环境应激是冰冻。
在进一步的实施方案中，环境应激是热。
在进一步的实施方案中，环境应激是盐度。
在进一步的实施方案中，变体与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽具有至少50％的序列同一性。
在进一步的实施方案中，变体包含氨基酸序列：
X1X2RGVRX3RPX4GRX5AAEIRDPX6X7KX8X9X10WLGTX11DX12X13X14X15AAX16AYDX17X18AX19X20X21RGX22X23AX24TNFX25其中：X1＝H或R，X2＝F或Y，X3＝K或R，X4＝S或W，X5＝F或Y，X6＝任何氨基酸，X7＝K或R或S，X8＝A或E或S或T，X9＝R或P，X10＝I或R或V，X11＝F或Y，X12＝S或T，X13＝A或P，X14＝E或Q或V，X15＝D或E或Q或V，X16＝C或L或K或R，X17＝任何氨基酸，X18＝A或K，X19＝R或V，X20＝A或D或E或H或N或S，X21＝F或L或M或Y，X22＝任何氨基酸，X23＝K或R或T，和X24＝K或R，X25＝A或G或P(SEQ ID NO：28)。
在优选的实施方案中，变体包含选自SEQ ID NO：2-27任一个的氨基酸序列。
在更优选的实施方案中，a)的多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽。
在进一步的方面中，本发明提供了用于生产对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括用遗传构建体转化植物细胞或植物，该遗传构建体包括：
a)包含核苷酸序列SEQ ID NO：29的多核苷酸，或其变体，其中变体编码能够提高对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽；
b)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；或
c)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸。
在可替换的方面中，本发明提供了用于生产对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括用遗传构建体转化植物细胞或植物，该遗传构建体包括：
a)包含核苷酸序列SEQ ID NO：29的多核苷酸，或其变体，
b)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；或
c)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸。
优选，a)中的变体编码能够提高对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽。
在一个实施方案中，环境应激是干旱。
在进一步的实施方案中，环境应激是寒冷。
在进一步的实施方案中，环境应激是冰冻。
在进一步的实施方案中，环境应激是热。
在进一步的实施方案中，环境应激是盐度。
在进一步的实施方案中，变体包含SEQ ID NO：30至55任一个的序列。
在进一步的实施方案中，a)的多肽包含SEQ ID NO：29的序列。
在进一步的方面中，本发明提供了通过本发明的方法产生的植物细胞或植物。
在进一步的方面中，本发明提供了分离的多核苷酸，其与编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列具有至少70％序列同一性，其中多核苷酸编码能够调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽。
在可替换的方面中，本发明提供了分离的多核苷酸，其与编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列具有至少50％序列同一性。
优选，多核苷酸编码能够调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽。
在一个实施方案中，环境应激是干旱。
在进一步的实施方案中，环境应激是寒冷。
在进一步的实施方案中，环境应激是冰冻。
在进一步的实施方案中，环境应激是热。
在进一步的实施方案中，环境应激是盐度。
在进一步的实施方案中，所述核苷酸序列包含来自SEQ ID NO：29的序列。
在进一步的实施方案中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：29的全长编码序列。
在进一步的方面中，本发明提供了编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽的分离多核苷酸。
在进一步的实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：29的序列。
在进一步的实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：29的全长编码序列。
在进一步的方面中，本发明提供包含SEQ ID NO：29的序列或其变体的多核苷酸，其中变体来自裸麦草或羊茅草，并且编码能够调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽。
在一个实施方案中，环境应激是干旱。
在进一步的实施方案中，环境应激是寒冷。
在进一步的实施方案中，环境应激是冰冻。
在进一步的实施方案中，环境应激是热。
在进一步的实施方案中，环境应激是盐度。
在进一步的实施方案中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：29的序列。
在进一步的方面中，本发明提供了与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少72％序列同一性的分离多肽，其中多肽能够调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性。
在一个实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在进一步的方面中，本发明提供了编码本发明的多肽的分离多核苷酸。
在进一步的方面中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含：
a)包含本发明多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；
b)包含本发明多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸；
c)包含能够与本发明的多核苷酸杂交的至少15个核苷酸长的序列的多核苷酸。
在进一步的方面中，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的遗传构建体。
在一个实施方案中，遗传构建体是表达构建体。
优选，构建体包含可操作地连接多核苷酸的启动子。
优选，启动子通常不是在自然状态下与多核苷酸相关的启动子。
在进一步的方面中，本发明提供了包含本发明的遗传构建体或表达构建体的载体。
在进一步的方面中，本发明提供了遗传修饰的宿主细胞，以表达本发明的多核苷酸或本发明的多肽。
在进一步的方面中，本发明提供包含本发明的遗传构建体或表达构建体的宿主细胞。
优选，宿主细胞没有形成活的人类的一部分。
在进一步的方面中，本发明提供了遗传修饰的植物细胞，以表达本发明的多核苷酸或本发明的多肽。
在进一步的方面中，本发明提供了包含本发明的遗传构建体或本发明的表达构建体的植物细胞。
在进一步的方面中，本发明提供了包含本发明的植物细胞的植物。
优选，包含本发明的植物细胞的植物与自然界中已经存在的植物不同。
在进一步的方面中，本发明提供了选择相对于合适的对照植物对至少一种选自干旱、寒冷冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括测试植物中本发明的多核苷酸表达的改变。
在进一步的方面中，本发明提供了选择相对于合适的植物对至少一种选自干旱、寒冷冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括测试植物中本发明的多核苷酸表达的改变。
在进一步的方面中，本发明提供了通过本发明的方法产生的植物细胞或植物。
优选，所产生的植物与自然界中已经存在的植物不同。
在进一步的方面中，本发明提供了通过本发明的方法选择的植物。
在进一步的方面中，本发明提供了一组通过本发明的方法选择的植物。
在进一步的方面中，本发明提供了对抗本发明的多肽的抗体。
本发明的多核苷酸和多核苷酸变体可以源自任何物种和/或可以通过合成或重组产生。
在一个实施方案中，多核苷酸或变体源自植物物种。
在进一步的实施方案中，多核苷酸或变体源自裸子植物物种。
在进一步的实施方案中，多核苷酸或变体源自被子植物物种。
在进一步的实施方案中，多核苷酸或变体源自双子叶植物物种。
在进一步的实施方案中，多核苷酸或变体源自单子叶植物物种。
本发明的多肽和多肽变体可以源自任何物种和/或可以通过合成或重组产生。
在一个实施方案中，多肽或变体源自植物物种。
在进一步的实施方案中，多肽或变体源自裸子植物物种。
在进一步的实施方案中，多肽或变体源自被子植物物种。
在进一步的实施方案中，多肽或变体源自双子叶植物物种。
在进一步的实施方案中，多肽或变体源自单子叶植物物种。
本发明的植物细胞和植物可以源自任何物种。
在一个实施方案中，植物细胞或植物源自裸子植物物种。
在进一步的实施方案中，植物细胞或植物源自被子植物物种。
在进一步的实施方案中，植物细胞或植物源自双子叶植物物种。
在进一步的实施方案中，植物细胞或植物源自单子叶植物物种。
优选的植物物种是饲料植物物种。优选，物种选自以下的属：裸麦草属(Lolium)、羊茅属(Festuca)、鸭茅属(Dactylis)、雀麦属(Bromus)、三叶草属(Trifolium)、苜蓿属(Medicago)、Pheleum、虉草属(Phalaris)、绒毛草属(Holcus)、莲属(Lotus)、车前草属(Plantago)和菊苣属(Cichorium)。
优选的属是裸麦草属或三叶草属。特别优选的是多年生裸麦草(LoliumPerenne)和白三叶草(Trifolium repens)物种。最优选的是多年生裸麦草物种。
术语“植物”旨在包括完整的植物，植物的任何部分，植物的繁殖体和子代。
术语“繁殖体”意思是可以用于再生或繁殖中的任何植物部分，有性或无性，包括种子和切片。
本发明的植物可以种植并自交或与不同的植株杂交，并且可以鉴定出所得到的具有所需表型特征的杂种。可以种植两代或更多代，以确保主体表型特征得到稳定维持和遗传。从这种标准育种方法得到的植物也形成本发明的一个方面。
详述
定义
术语“对干旱应激的耐受性或耐力”旨在描述在次最佳水合条件下比相同条件下的合适对照植物能更好地进行其生长和发育的任一方面的一种或多种植物。
术语“对寒冷应激的耐受性或耐力”旨在描述在次最佳降低降低的温度的条件下比相同条件下的合适对照植物能更好地进行其生长和发育的任一方面的一种或多种植物。
术语“对冰冻应激的耐受性或耐力”旨在描述在低于或等于0℃的温度条件下比相同条件下的合适对照植物能更好地进行其生长和发育的任一方面的一种或多种植物。
术语“对热应激的耐受性或耐力”旨在描述在次最佳升高温度的条件下比相同条件下的合适对照植物能更好地进行其生长和发育的任一方面的一种或多种植物。
术语“对盐度的耐受性或耐力”旨在描述在次最佳升高盐度的条件下比相同条件下的合适对照植物能更好地进行其生长和发育的任一方面的一种或多种植物。
合适的对照植物可以包括相同物种和品种的未转化植物，或用对照构建体转化的相同物种或品种的植物。
关于本发明的选择方法，对环境应激具有提高的耐受性的植物指的是选自在应激条件下比相同条件下的平均数的群体能更好地进行生长和发育的任一方面的植物群中的植物。
多核苷酸和片段
如在此所用的术语“多核苷酸”意思是任何长度的单链或双链脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，但优选至少15个核苷酸，并且作为非限制性的实例，包括基因的编码和非编码序列、正义和反义序列互补体、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离和纯化的天然产生的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。
在此提供的多核苷酸序列的“片段”是能够与感兴趣的目标特异性杂交的连续核苷酸的子序列，例如，至少15个核苷酸长的序列。本发明的片段包含本发明多核苷酸的连续核苷酸的15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，最优选至少60个核苷酸。多核苷酸序列的片段可以用于反义、基因沉默、三链螺旋或核酶技术中，或作为引物、探针、包括在微矩阵中，或用于本发明的基于多核苷酸的选择方法中。
术语“引物”指的是与模板杂交并用于引发与目标互补的多核苷酸的聚合的短多核苷酸，通常具有游离的3’OH基团。
术语“探针”指的是在基于杂交的试验中，用于检测与探针互补的多核苷酸序列的短多核苷酸，探针可以由在此限定的多核苷酸的“片段”组成。
多肽和片段
如在此所用的术语“多肽”包括任何长度的氨基酸链，优选至少5个氨基酸，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的多肽可以是纯化的天然产物，或可以使用重组或合成技术来部分或全部产生。术语可以指多肽、多肽的聚集物(如，二聚体或其他多聚体)、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。
多肽的“片段”是执行生物活性所需功能的和/或提供多肽三维结构的多肽的子序列。术语可以指能够执行以上酶活性的多肽、多肽的聚集物(如，二聚体或其他多聚体)、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。
用于在此公开的多核苷酸或多肽序列的术语“分离的”用于表示从其天然细胞环境中取出的序列。可以通过任一种方法或这些方法的结合来获得分离的分子，这些方法包括生化、重组和合成技术。
术语“重组”指的是从其天然内含物中围绕其的序列中取出和/或与不存在于其天然内含物中的序列重组的多核苷酸序列。
通过从“重组”多核苷酸序列翻译来产生“重组”多肽序列。
关于本发明的多核苷酸或多肽的术语“源自”是源自特定的属或种，意思是多核苷酸或多肽具有与该属或种中天然发现的多核苷酸或多肽相同的序列。因此，源自特定属或种的多核苷酸或多肽可以被合成或重组产生。
变体
如在此所用的，术语“变体”指的是不同于具体限定序列的多核苷酸或多肽序列，其中删除、置换或添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可以是天然产生的等位基因变体，或非天然产生的变体。变体可以来自相同或其他物种，并且可以包括同源物、旁系同源(paralogue)和直系同源(orthologue)。在特定的实施方案中，本发明多肽和多肽的变体具有与本发明的多肽或多肽相同或相似的生物活性。关于多肽和多肽的术语“变体”包括如在此限定的所有形式的多肽和多肽。
多核苷酸变体
变体多核苷酸序列优选呈现出与特定的多核苷酸序列至少50％，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性。在特定多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置，更优选至少100个核苷酸位置，最优选全长的比较窗口中发现同一性。
可以以以下方式来测定多核苷酸序列同一性。使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)可公开获得的bl2seq(Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)中的BLASTN(来自BLAST组程序(BLAST suite of programs)，版本2.2.5[2002年11月])，来比较主体多核苷酸序列与候选多核苷酸序列。除了应当关闭低复杂性部分的过滤外，使用bl2seq的缺省参数。
可以使用以下的unix命令行参数来检测多核苷酸序列的同一性：
bl2seq-i核苷酸序列1-j核苷酸序列2-F F-p blastn
参数-F F关闭低复杂性部分的过滤。参数-p选择用于序列对的合适算法。bl2seq程序将序列同一性记录为行“同一性＝”中的相同核苷酸的数量和百分比。
还可以使用通用序列比对程序(例如，Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)在候选和主体核苷酸序列之间的重叠的完整长度中计算多核苷酸序列同一性。在可以获自http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/的EMBOSS包(Rice，P.Longden，I.和Bleasby，A.EMBOSS：The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite，Trends in Genetics，2000年6月，vol 16，No.6pp.276-277)中的needle程序中找到了Needleman-Wunsch通用比对算法的全部执行。欧洲生物信息研究院服务器还提供了工具，以在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/在线进行两个序列之间的EMBOSS-needle通用比对。
可选择地，可以使用GAP程序，其计算两个序列的最佳通用比对，不需要处罚末端缺口。GAP描述于以下的论文中：Huang，X.(1994)On Global SequenceAlignment.Computer Application in the Biosciences 10，227-235。
本发明的多核苷酸变体还包括呈现出与一个或多个很可能保留那些序列等价功能的具体限定序列的相似性并且不能合理地预期通过随机机会出现的那些。可以使用公众可获得的来自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST组程序(版本2.2.5[2002年11月])的bl2seq程序来测定关于多肽的这种序列相似性。
可以使用以下的unix命令行参数来检测多核苷酸序列的相似性：
bl2seq-i核苷酸序列1-j核苷酸序列2-F F-p tblastx
参数-F F关闭低复杂性部分的过滤。参数-p选择用于序列对的合适算法。该程序发现了序列之间的相似性区域，并且对于每个这样的区域，记录了“E值”，这是预期的次数，可以预期在含有随机序列的固定参照大小的数据库中看到这样偶然的匹配。该数据库的大小通过bl2seq程序中的缺省来设定。
对于小的E值，比一小得多，E值大致是该随机匹配的可能性。
与任一个具体限定序列相比时，变体多核苷酸序列优选呈现出低于1x10-10的E值，更优选低于1x10-20，更优选低于1x10-30，更优选低于1x10-40，更优选低于1x10-50，更优选低于1x10-60，更优选低于1x10-70，更优选低于1x10-80，更优选低于1x10-90，更优选低于1x10-100，更优选低于1x10-110，最优选低于1x10-120。
可选择地，本发明的变体多核苷酸在严谨条件下与特定的多核苷酸序列或其互补体杂交。
术语“在严谨条件下杂交”及其语法等价体指的是多核苷酸分子在限定的温度和盐浓度条件下与目标多核苷酸分子(如，固定于DNA或RNA印迹上的目标多核苷酸分子，如Southern印迹或Northern印迹)杂交。可以通过最初在较低的严谨条件下杂交，然后将严谨度提高至所需的严谨度来测定严谨条件下的杂交能力。
对于大于约100个碱基长的多核苷酸分子，典型的严谨杂交条件为低于天然双链体的解链温度(Tm)不超过25至30℃(例如，10℃)(通常参见，Sambrook等，编辑，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborPress；Ausubel等，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing)。可以通过公式Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+)来计算超过约100个碱基的多核苷酸分子的Tm。(Sambrook等，编辑，1987，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press；Bolton和McCarthy，1962，PNAS 84：1390)。对于超过100个碱基长的多核苷酸的典型严谨条件将是如下的杂交条件，在6XSSC，0.2％SDS的溶液中预先洗涤；在65℃，6X SSC，0.2％SDS杂交过夜；接着两次在1X SSC，0.1％SDS中，65℃，30分钟的洗涤，两次在0.2X SSC，0.1％SDS中，65℃，30分钟的洗涤。
对于长度低于100个碱基的多核苷酸分子，示例性严谨杂交条件是低于Tm5至10℃。平均起来，长度低于100bp的多核苷酸分子的Tm大约降低(500/寡核苷酸长度)℃。
对于通常所说的肽核酸(PNAs)的DNA模拟物(Nielsen等，Science，1991年12月6日；254(5037)：1497-500)，Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交体的那些，并且可以使用Giesen等所述的公式来计算，Giesen等，Nucleic Acids Res.1998年11月1日；26(21)：5004-6。长度低于100个碱基的DNA-RNA杂交体的示例性严谨杂交条件为低于Tm 5至10℃。
本发明的变体多核苷酸还包括不同于本发明序列的多核苷酸，但其是作为遗传密码简并的结果，编码具有与由本发明的多核苷酸编码的多肽相似活性的多肽。没有改变多肽氨基酸序列的序列变化是“沉默变化”。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，对于相同氨基酸的其他密码子可以通过本领域已知的技术来改变，例如，以优化在特定宿主生物体中的密码子表达。
本发明中还包括导致所编码多肽序列中的一个或几个氨基酸的保守性置换但没有明显改变其生物活性的多核苷酸序列改变。本领域技术人员将了解进行表型沉默氨基酸置换的方法(参见，例如，Bowie等，1990，Science 247，1306)。
使用公众可获得的来自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST组程序(版本2.2.5[2002年11月])的bl2seq程序，通过之前所述的tblastx算法，可以测定所编码多肽序列中由于沉默改变和保守性置换产生的变体多核苷酸。
多肽变体
关于多肽的术语“变体”包括天然产生的、重组和合成产生的多肽。变体多肽序列优选呈现出与本发明的序列至少50％，更优选至少51％，更优选至少52％，更优选至少53％，更优选至少54％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少61％，更优选至少62％，更优选至少63％，更优选至少64％，更优选至少65％，更优选至少66％，更优选至少67％，更优选至少68％，更优选至少69％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性。在本发明多肽的至少20个氨基酸位置，优选至少50个氨基酸位置，更优选至少100个氨基酸位置，最优选全长的比较窗口中发现同一性。
可以以以下方式来测定多肽序列同一性。使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)可公开获得的bl2seq中的BLASTP(来自the BLAST组程序，版本2.2.5[2002年11月])，来比较主体多肽序列与候选多肽序列。除了应当关闭低复杂性部分的过滤外，使用bl2seq的缺省参数。
还可以使用通用序列比对程序在候选和主体多核苷酸序列之间的重叠的完整长度中计算多肽序列同一性。如以上讨论的EMBOSS-needle(在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/)和GAP(Huang，X.(1994)，On Global SequenceAlignment.Computer Applications in the Biosciences 10，227-235)也是合适的用于计算多肽序列同一性的通用序列比对程序。
优选使用如上所述的BLASTP，用于测定根据本发明的多肽变体。
本发明的多肽变体还包括呈现出与一个或多个很可能保留那些序列等价功能的具体限定序列的相似性并且不能合理地预期通过随机机会出现的那些。可以使用公众可获得的来自NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST组程序(版本2.2.5[2002年11月])的bl2seq程序来测定关于多肽的这种序列相似性。可以使用以下的unix命令行参数来检测多肽序列的相似性：
bl2seq-i肽序列1-j肽序列2-F F-p blastp
与任一个具体限定序列相比时，变体多肽序列优选呈现出低于1x10-10的E值，更优选低于1x10-20，更优选低于1x10-30，更优选低于1x10-40，更优选低于1x10-50，更优选低于1x10-60，更优选低于1x10-70，更优选低于1x10-80，更优选低于1x10-90，更优选低于1x10-100，更优选低于1x10-110，更优选低于1x10-120，最优选低于1x10-123。
参数-F F关闭低复杂性部分的过滤。参数-p选择用于序列对的合适算法。该程序发现了序列之间的相似性区域，并且对于每个这样的区域，记录了“E值”，这是预期的次数，可以预期在含有随机序列的固定参照大小的数据库中看到这样偶然的匹配。对于小的E值，比一小得多，这大致是该随机匹配的可能性。
本发明中还包括所述多肽序列的没有明显改变其生物活性的一个或几个氨基酸的保守性置换。本领域技术人员将了解进行表型沉默氨基酸置换的方法(参见，例如，Bowie等，1990，Science 247，1306)。
构建体、载体及其成分
术语“遗传构建体”指的是多核苷酸分子，通常是双链DNA，其可以具有插入其中的另一个多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)，如，但不局限于，cDNA分子。遗传构建体可以含有允许转录插入的多核苷酸分子和任选将转录产物翻译成多肽的必需元件。插入的多核苷酸分子可以源自宿主细胞，或可以源自不同的细胞或生物体和/或可以是重组多核苷酸。一旦在宿主细胞内，遗传构建体可以变得整合在宿主染色体DNA中。可以将遗传构建体连接至载体。
术语“载体”指的是多核苷酸分子，通常是双链DNA，将其用于将遗传构建体转运至宿主细胞中。载体能够在至少一种其他宿主系统(如，大肠杆菌)中复制。
术语“表达构建体”指的是包括允许转录插入的多核苷酸分子和任选将转录产物翻译成多肽的必需元件的遗传构建体。表达构建体在5’至3’方向通常包含：
a)在将要转化构建体的宿主细胞中的功能性启动子，
b)待表达的多核苷酸，和
c)在将要转化构建体的宿主细胞中的功能性终止子。
术语“编码区”或“开放阅读框”(ORF)指的是在合适的调控序列的控制下，能够产生转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的正义链。通过5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在来识别编码序列。插入遗传构建体时，与启动子和终止子序列可操作地连接时，“编码序列”能够得到表达。
“可操作地连接”意思是将待表达的序列置于调控元件的控制下，调控元件包括启动子、组织特异性调控元件、暂时的调控元件、增强子、抑制子和终止子。
术语“非编码区”指的是在翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。这些序列也各自指5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录启动和终止以及翻译效率调控需要的元件。
终止子是终止转录并且在翻译序列的基因下游的3’非翻译端发现的序列。终止子是mRNA稳定性的重要决定因子，并且在一些情况中，已经发现具有空间调控功能。
术语“启动子”指的是调控基因转录的编码区上游的非转录顺调控元件。启动子包含指定转录起始位点的顺-启动子元件和保守盒(如TATA盒)，以及由转录因子结合的基序。
“转基因”是取自一个生物体并通过转化引入不同生物体中的多核苷酸。转基因可以源自与其中引入转基因的生物体物种相同的物种或来自不同的物种。
“反向重复”是一种重复的序列，其中重复的后半部分在互补链中，例如：
(5’)GATCTA.......TAGATC(3’)
(3’)CTAGAT.......ATCTAG(5’)
通读转录将产生经受互补碱基配对的转录产物，以形成发夹结构，只要重复的区域之间存在3-5bp间隔物。
“转基因”植物指的是含有作为遗传操纵或转化结果的新遗传材料的植物。新遗传材料可以源自与所得到的转基因植物相同物种的植物或源自不同的物种。
术语“以改变本发明的多核苷酸或多肽的表达”和“本发明的多核苷酸或多肽改变的表达”旨在包括其中对应于本发明多核苷酸的基因组DNA被修饰，因此导致本发明的多核苷酸或多肽表达改变的情况。可以通过基因转化或本领域中的其他方法诱导突变进行基因组DNA的修饰。“改变的表达”可以与所产生的信使RNA和/或多肽的含量增加或降低相关，并且还可以由于多核苷酸和所产生多肽的序列的变化而导致改变的多肽活性。
申请人已经从裸麦草鉴定出多核苷酸(SEQ ID NO：29)，其编码调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽(SEQ IDNO：1)。申请人还鉴定出编码SEQ ID NO：1的多肽变体(SEQ ID NO：2-27)的SEQID NO：29的多核苷酸变体(SEQ ID NO：30-55)，这些多肽变体调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性。
本发明提供了相对于合适的对照植物，对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性改变了的植物。本发明提供了对以上特征性应激耐受性提高的植物和对以上特征性应激耐受性降低的植物。本发明还提供了生产或选择这些植物的方法。
分离或产生多核苷酸的方法
可以通过使用各种本领域普通技术人员已知的技术来分离本发明的多核苷酸分子。例如，可以通过使用Mullis等编辑，1994，The Polymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应)，Birkhauser中所述的聚合酶链式反应(PCR)来分离这些多核苷酸，在此引入作为参考。可以如在此限定的源自本发明多核苷酸序列的引物来扩增本发明的多肽。
用于分离本发明的多核苷酸或在本发明的方法中有用的更多方法包括使用在此作为杂交探针列出的所有或部分多核苷酸。将标记的多核苷酸探针与固定于固体支持物(如硝基纤维素滤纸或尼龙膜)上的多核苷酸杂交的技术可以用于筛选基因组或cDNA文库。示例性杂交和洗涤条件为：在65℃，在5.0X SSC，0.5％十二烷基硫酸钠，1XDenhardt’s溶液中杂交20小时；在1.0X SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤(三次洗涤，在55℃，每次二十分钟，)，任选在0.5X SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠中60℃一次洗涤(二十分钟)。可以在0.1X SSC，1％(w/v)十二烷基硫酸钠，60℃的条件下，进行任选的进一步洗涤(二十分钟)。
可以通过本领域公知的技术，如限制性核酸内切酶消化和寡核苷酸合成，来产生本发明的多核苷酸片段。
可以在本领域公知的方法中使用部分多核苷酸序列，以鉴定相应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法，5’RACE(Frohman MA，1993，MethodsEnzymol.218：340-56)和基于杂交的方法，基于计算机/数据库的方法。此外，例如，使用基于已知的区域的引物开始，逆向PCR允许获取在此公开的多核苷酸序列两侧的未知序列，(Triglia等，1998，Nucleic Acids Res 16，8186，在此引入作为参考)。该方法使用了几种限制性酶来产生基因已知区域中的合适片段。然后通过分子内连接将片段环化并用作PCR模板。从已知区域设计分叉的引物。为了在物理上装配全长克隆，可以使用标准分子生物学方法(Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring HarborPress，1987)。
从特定的物种产生转基因植物时，用源自该物种的一个或多个序列转化该植物将是有益的。益处是可以减少公众对产生转基因生物体中的交叉物种转化的关注。此外，基因下调是所需结果时，可能需要利用与植物中与希望表达降低的序列相同的序列(或至少高度相似)。出于其中这些原因，希望能够鉴定并分离出几种不同植物物种中特定基因的直系同源。通过所述的方法可以鉴定出变体(包括直系同源)。
鉴定变体的方法
物理方法
可以使用基于PCR的方法来鉴定变体多核苷酸(Mullis等，编辑，1994，ThePolymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应)，Birkhauser)。通常，用于扩增变体多核苷酸分子PCR引物的多核苷酸序列可以基于编码相应氨基酸序列的保守区的序列。
或者，可以使用本领域技术人员公知的文库筛选方法(Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring HarborPress，1987)。鉴定探针序列的变体时，相对于寻找精确序列的匹配时，通常降低杂交和/或洗涤严谨性。
也可以通过物理方法来鉴定多肽变体，例如，通过使用对抗本发明的多肽产生的抗体来筛选表达文库(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，1987)或通过借助于这样的抗体来鉴定来自天然来源的多肽。
基于计算机的方法
还可以使用公众结构域序列比对算法和序列相似性研究工具搜寻序列数据库(公众结构域数据库包括Genbank，EMBL，Swiss-Prot，PIR等)，通过本领域公知的基于计算机的方法来鉴定多核苷酸和多肽。参见，例如，Nucleic Acids Res.29：1-10和11-16，2001，例如，在线资源。相似性研究重新获得并比对目标序列，用于与待分析的序列(即，询问序列)比较。序列比较算法使用评分矩阵，将全部评分分配给各自的比对。
用于鉴定序列数据库中的变体的程序的示例性家族是BLAST组程序(版本2.2.5[2002年11月])，包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX，其从(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast)或从国家生物技术信息中心(NCBI)，国家医学实验室(National Library of Medicine)，Building 38A，Room 8N805，Bethesda，MD 20894 USA是公众可获得的。NCBI服务器还提供工具来使用程序以筛选各种公众可获得的序列数据库。BLASTN相对核苷酸序列数据库比较了核苷酸询问序列。BLASTP相对蛋白序列数据库比较了氨基酸询问序列。BLASTX相对蛋白序列数据库比较了在所有阅读框中翻译的核苷酸询问序列。tBLASTN相对所有阅读框中动态翻译的核苷酸序列数据库比较了蛋白询问序列。tBLASTX相对六-框翻译的核苷酸序列数据库比较了六-框翻译的核苷酸询问序列。BLAST程序可以与缺省参数一起使用，或参数可以按照需要而改变，以提炼筛选。
BLAST家族算法的使用，包括BLASTN、BLASTP和BLASTX，描述于Altschul等的出版物中，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997。
通过BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法产生的询问序列“击中(hit)”一个或多个数据库序列，比对并鉴定序列的相似部分。击中以相似性程度和序列重叠长度的次序来排列。数据库序列的击中通常表示仅有一部分询问序列的序列长度是重叠的。
BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX算法还产生比对的“预期”值。预期值(E)表示搜寻含有随机连续序列的相同大小的数据库时，“预期”偶然能看到的击中数。预期值用作显著性阈值，用于测定数据库的击中是否表示真实的相似性。例如，分配给多核苷酸击中的0.1的E值解释为表示在所筛选的数据库大小的数据库中，可以预期在具有相似评分的序列的比对部分中看到0.1匹配仅仅是偶然。对于比对和匹配部分中具有0.01或更低E值的序列，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法，该数据库中偶然发现匹配的可能性是1％或更低。
可以使用CLUSTALW(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTALW：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice(CLUSTALW：通过序列权重、位置特异性缺口惩罚和权重基质选择来提高渐进性多序列比对的灵敏度)，Nucleic Acids Research，22：4673-4680，http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(CedricNotredame，Desmond G.Higgins，Jaap Heringa，T-Coffee：A novel method for fast andaccurate multiple sequence alignment，J.Mol.Biol.(2000)302：205-217))或PILEUP进行相关序列组的多序列比对，其使用渐进性的成对比对(Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.25，351)。
模式识别软件应用可以用于发现基序或标志序列。例如，MEME(Multiple Emfor MotifElicitation)在一组序列中发现基序和标志序列，MAST(Motif Alignmentand Search Tool)使用这些基序来鉴定询问序列中相似或相同的基序。作为一系列与合适的统计数据的比对和所发现基序的直观概览来提供MAST结果。MEME和MAST发展于University of California，San Diego。
PROSITE(Bairoch和Bucher，1994，Nucleic Acids Res.22，3583；Hofmann等，1999，Nucleic Acids Res.27，215)是鉴定从基因组或cDNA序列翻译的未表征蛋白的功能的方法。PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)包含生物上重要的模式和剖析图，并且对其进行设计，使其可以与合适的计算机工具一起使用，以将新的序列分配给已知的蛋白家族或测定哪个已知的结构域存在于序列中(Falquet等，2002，Nucleic Acids Res.30，235)。Prosearch是可以搜寻具有已知序列模式或标志的SWISS-PROT和EMBL数据库的工具。
分离多肽的方法
可以使用本领域公知的肽合成方法，如使用固相技术的直接肽合成(例如，Stewart等，1969，见Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，San FranciscoCalifornia)或自动化合成，例如使用Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Foster City，California)，来制备本发明的多肽，包括变体多肽。在这样的合成过程中，也可以产生突变形式的多肽。
还可以使用各种本领域公知的技术(例如，Deutscher，1990，编辑，Methods inEnzymology，Vol.182，Guide to Protein Purification(蛋白纯化指南))，从天然来源纯化本发明的多肽和变体多肽。
或者，可以在合适的宿主细胞中重组表达本发明的多肽和变体多肽，并按照以下所讨论的从细胞中分离出来。
生产构建体和载体的方法
本发明的遗传构建体包含一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明多肽的多核苷酸，并且可以用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。本发明的遗传构建体旨在包括在此所限定的表达构建体。
生产和使用遗传构建体和载体的方法是本领域公知的，并且通常描述于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Press，1987；Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学通用实验方案)，Greene Publishing，1987)。
生产包含构建体和载体的宿主细胞的方法
本发明提供了包含本发明的遗传构建体或载体的宿主细胞。宿主细胞可以源自，例如，细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。优选，宿主细胞不是来自活人的一部分。
包含本发明的遗传构建体(如表达构建体)的宿主细胞可用于本领域公知的方法中(例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Press，1987；Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology(分子生物学通用实验方案)，Greene Publishing，1987)，用于本发明多肽的重组生产。这样的方法可以涉及在适于或有助于本发明多肽表达的条件下在合适的培养基中培养宿主细胞。然后可以通过本领域公知的方法(例如，Deutscher编辑，1990，Methods in Enzymology(酶学方法)，Vol 182，Guide toProtein Purification(蛋白纯化指南))从介质、宿主细胞或培养基中分离出所表达的重组多肽(其可以任选分泌至培养物中)。
本发明的宿主细胞还可以用于通过本发明的表达多肽产生的酶产物的生产中。这样的方法可以涉及在适于本发明的重组多肽表达的培养基中培养本发明的宿主细胞，任选在本发明的表达多肽的其他酶底物的存在下。然后可以通过各种本领域的标准方法从宿主细胞或培养基中分离出所产生的酶产物。
生产包含构建体和载体的植物细胞和植物的方法
本发明进一步提供了包含本发明的遗传构建体的植物细胞，并且植物细胞得到修饰，以改变本发明的多核苷酸或多肽的表达。包含这些细胞的植物也形成了本发明的一个方面。
通过本发明的方法可以实现种子产量改变的植物的生产。这样的方法可以涉及用构建体转化植物细胞和植物，该构建体被设计成改变能够调节这些植物细胞和植物的种子产量的多核苷酸或多肽的表达。这样的方法还包括用构建体的组合物转化植物细胞和植物，这些构建体被设计成改变能够调节这些植物细胞和植物的种子产量的一个或多个多核苷酸或多肽的表达。
用多核苷酸转化植物细胞、植物及其部分的方法描述于Draper等，1988，PlantGenetic Transformation and Gene Expression(植物遗传转化和基因表达)，ALaboratory Manual.Blackwell Sci.Pub.Oxford，p.365；Potrykus和Spangenburg，1995，Gene Transfer to Plants.Springer-Verlag，Berlin.；和Gelvin等，1993，PlantMolecular Biol.Manual.Kluwer Acad.Pub.Dordrecht。Galun和Breiman，1997，Transgenic Plants.Imperial College Press，London中提供了转基因植物的综述，包括转化技术。
植物遗传操纵方法
各种用于遗传操纵植物的策略是可获得的(例如，Birch，1997，Ann Rev PlantPhys Plant Mol Biol，48，297)。例如，可以设计策略，以提高正常表达的植物细胞、器官和/或特定发育阶段的多核苷酸/多肽的表达，或异位表达非正常表达的细胞、组织、器官和/或特定发育阶段的多核苷酸/多肽。所表达的多核苷酸/多肽可以源自待转化的植物物种或可以源自不同的植物物种。
可以设计转化策略来降低正常表达的植物细胞、组织、器官或特定发育阶段的多核苷酸/多肽的表达。这样的策略称为基因沉默策略。
用于在转基因植物中表达基因的遗传构建体通常包括用于驱动一个或多个克隆的多核苷酸的表达的启动子，终止子和用于测试转化植物中遗传构建体存在的选择标记序列。
适用于本发明构建体的启动子在单子叶或双子叶植物的细胞、组织或器官中是功能性的，并且包括在大部分植物组织中为活性的细胞-、组织-和器官-特异性启动子、细胞周期特异性启动子、临时性启动子、诱导型启动子、组成型启动子，以及重组启动子。启动子的选择将取决于所克隆的多核苷酸的时间和空间表达，因此按照需要选择。启动子可以是通常与目标转基因相关的那些，或源自其他植物、病毒以及植物致病细菌和真菌的基因的启动子。本领域技术人员不需要独特的实验，使用包含本发明的多核苷酸序列的遗传构建体，就能够选择适用于修饰和调节植物性状的启动子。组成型植物启动子的实例包括CaMV 35S启动子、胭脂碱合成酶启动子和真蛸碱合成酶启动子，以及来自玉米的Ubi 1启动子。在特定组织中活性的应答内部发育信号或外部非生物或生物应激的植物启动子在科学文献中有描述。示例性启动子描述于，例如，WO02/00894，在此将其引入作为参考。
植物转化遗传构建体中常用的示例性终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶或真蛸碱合成酶终止子、玉米zin基因终止子、水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯PI-II终止子。
植物转化中通常所用的选择标记包括给予了卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)、给予了壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因、用于Ignite(AgrEvo)和Basta(Hoechst)抗性的草胺膦乙酰转移酶(bar基因)和用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。
还考虑了使用包含报告基因(表达宿主外源的活性的编码序列，通常是酶活性和/或可见的信号(例如，荧光素酶、GUS、GFP))的遗传构建体，报告基因可以用于植物和植物组织中的启动子表达分析。报告基因文献综述于Herrera-Estrella等，1993，Nature 303，209，和Schrott，1995，见：Gene Transferto Plants(植物的基因转移)，(Potrykus，T.，Spangenbert.编辑)Springer Verlag.Berline，pp.325-336。
基因沉默策略可以聚焦于基因自身或影响所编码多肽表达的调控元件。“调控元件”在此以最宽的可能意思来使用，并且包括与目标基因相互作用的其他基因。
设计来降低或沉默本发明的多核苷酸/多肽表达的遗传构建体可以包括本发明多核苷酸的反义拷贝。在这样的构建体中，将多肽置于相对于启动子和终止子的反义方向。
通过颠倒多核苷酸或多核苷酸的片段获得“反义”多核苷酸，使得转录产物将与基因的mRNA转录产物互补，例如：
5’GATCTA 3’(编码链) 3’CTAGAT 5’(反义链)
3’CUAGAU 5’mRNA 5’GAUCUCG 3’反义RNA
为基因沉默设计的遗传构建体还可以包括反向重复。“反向重复”是其中重复的后半部分在互补链中的重复序列，例如：
5’GATCTA.........TAGATC-3’
3’CTAGAT.........ATCTAG-5’
所形成的转录产物可以经历互补碱基配对，以形成发夹结构。通常，需要重复区域之间的至少3-5bp的间隔物，使得可以形成发夹结构。
另一种沉默方法涉及使用靶向miRNA的转录产物等价物的小反义RNA(Llave等，2002，Science 297，2053)。特别考虑了对应于本发明多核苷酸的小反义RNA的使用。
如在此所用的术语遗传构建体还包括小反义RNA和其他这样的用于实现基因沉默的多核苷酸。
如在此限定的，用表达构建体转化也可以导致基因沉默，通过称为正义抑制的方法(例如，Napoli等，1990，Plant Cell 2，279；de Carvalho Niebel等，1995，PlantCell，7，347)。在一些情况中，正义抑制可能涉及完整或部分编码序列的过表达，但也可能涉及基因非编码区的表达，如内含子，或5’或3’未翻译区(UTR)。嵌合部分正义构建体可以用于配合地沉默多个基因(Abbott等，2002，Plant Physiol.128(3)：844-53；Jones等，1998，Planta 204：499-505)。还考虑了使用这样的正义抑制策略来沉默本发明的多核苷酸的表达。
设计用于基因沉默的遗传构建体中的多核苷酸插入片段可以对应于编码序列和/或非编码序列，如启动子和/或内含子和/或5’或3’UTR序列，或相应的基因。
其他基因沉默策略包括显性否定方法和使用核酶构建体(McIntyre，1996，Transgenic Res，5，257)。
转录前沉默可以通过基因自身或其调控元件的突变带来。这样的突变可以包括点突变、移码、插入、删除和置换。
以下是公开了可以用于遗传转化以下植物物种的遗传转化实验方案的代表性出版物：水稻(Alam等，1999，Plant Cell Rep.18，572)；玉米(US专利系列Nos.5,177,010和5,981,840)；小麦(Ortiz等，1996，Plant Cell Rep.15，1996，877)；西红柿(US专利系列No.5,159,135)；马铃薯(Kumar等，1996 Plant J.9，：821)；木薯(Li等，1996 Nat.Biotechnology 14，736)；生菜(Michelmore等，1987，Plant Cell Rep.6，439)；烟草(Horsch等，1985，Science 227，1229)；棉花(US专利系列Nos.5,846,797和5,004,863)；干草(US专利Nos.5,187,073和6,020,539)；胡椒薄荷(Niu等，1998，Plant Cell Rep.17，165)；柑桔类植物(Pena等，1995，Plant Sci.104，183)；香菜(Krens等，1997，Plant Cell Rep，17，39)；香蕉(US专利系列No.5,792,935)；大豆(US专利Nos.5,416,011；5,569,834；5,824,877；5,563,04455和5,968,830)；菠萝(US专利系列No.5,952,543)；白杨(US专利No.4,795,855)，一般的单子叶植物(US专利Nos.5,591,616和6,037,522)；芸苔(US Patent Nos.5,188,958；5,463,174和5,750,871)；和谷物(US专利No.6,074,877)。考虑了其他物种，并且在科学文献中可以获得合适的方法和实验方案，由本领域技术人员来使用。
本领域中已知的几种其他方法可以用来改变本发明的核苷酸和/或多肽的表达。这样的方法包括但不限于Tilling(Till等，2003，Methods Mol Biol，2％，205)，所谓的“Deletagene”技术(Li等，2001，Plant Journal 27(3)，235)和使用人工转录因子，如合成的锌指转录因子。(例如，Jouvenot等，2003，Gene Therapy 10，513)。此外，靶向特定多肽的抗体或其片段也可以在植物中表达，以调节该多肽的活性(Jobling等，2003，Nat.Biotechnol.，21(1)，35)。还可以使用转座子标记方法。此外，可以通过如噬菌体展示(Dyax Corporation)这样的技术来鉴定与本发明的多肽相互作用的肽。这种相互作用的肽可以在植物中表达或施加于植物，以影响本发明多肽的活性。特意考虑了在本发明的核苷酸和/或多肽表达的改变中使用上述的每一种方法。
用于选择植物的方法
还提供了用于选择种子产量改变的植物的方法。这样的方法包括测试植物中本发明的多核苷酸或多肽表达的改变。在改变的种子产量不一定可见时，可以在幼苗或早期发育阶段使用这些方法，以加速针对提高种子产量的育种计划。
多核苷酸(如信使RNA)的表达常常用做相应多肽表达的指示。测量多核苷酸表达的示例性方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和点印迹分析(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Press，1987)。因此，将本发明的多核苷酸或多核苷酸的一部分用作探针或引物，如在此限定的，用于鉴定花青素水平改变的植物的方法中。本发明的多肽可以用作杂交实验中的探针，或作为基于PCR实验中的引物，进行设计以鉴定这样的植物。
或者，可以对抗本发明的多肽来产生抗体。用于产生和使用抗体的方法是本领域中标准的(参见，例如：Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Harlow A Lane编辑，Cold Spring Harbour Laboratory，1998。这样的抗体可以用于检测调节植物中花大小的多肽的表达改变的方法中。这些方法包括ELISA(Kemeny，1991，A Practical Guide to ELISA，NY Pergamon Press)和Western印迹(Towbin & Gordon，1994，J Immunol Methods，72，313)。
这些用于分析多核苷酸或多肽表达和选择具有表达改变的植物的方法可用于设计产生具有改变的种子产量的栽培品种的常规育种计划中。
植物
可以种植本发明的植物并自交或与不同的植株杂交，并可以鉴定出具有所需表型特征的所得到的杂交体。种植两代或更多代，以确保目标表型特征得到稳定维持和遗传。从这些标准育种方法获得的植物也形成本发明的一部分。
还可以宽泛地说本发明单独地或集合地存在于本申请说明书中涉及或所示的部分、要素和特征，以及存在于任两个或多个所说部分、要素或特征的任何或全部组合，并且在此提及了特定的整体，其具有本发明所属领域已知的等价体，认为在此结合这些已知的等价体，如同将其单独列出一样。
附图说明
参照附图将更好地理解本发明，其中：
图1显示了两个载体(Dorf 88和Corf 88)的图谱，用于植物转化，其包含ORF88(SEQ ID NO：29)。
图2显示了本发明的ORF88多肽(SEQ ID NO：1)和来自几个物种的ORF88SEQ ID NO：1的变体的序列的比对(BAA76734.1＝SEQ ID NO：25；ERF3.ARATH＝SEQ ID NO：27；AAV85852.1＝SEQ ID NO：20；XP_464403.1＝SEQ ID NO：19；BAD45632.1＝SEQ ID NO：26；XP473848.1＝SEQ ID NO：11；XP_475484.1＝SEQID NO：2；NP915797＝SEQ ID NO：3；AAD09248.1＝SEQ ID NO：4；AAD00708.1＝SEQ ID NO：6；AAQ96341.1＝SEQ ID NO：8；AAV66332.1＝SEQ ID NO：10；AAP32202.1＝SEQ ID NO：16；AAO34705.1＝SEQ ID NO：17；AAQ96342.1＝SEQID NO：5；AAV51938.1＝SEQ ID NO 22；AAQ55276.1＝SEQ ID NO：9；AAC49771.1＝SEQ ID NO：14；AF499716.1＝SEQ ID NO：7；BAC42202.1＝SEQ IDNO：15；BAA97123.1＝SEQ ID NO：12；BAA07322.1＝SEQ ID NO：13；AAR84424.1＝SEQ ID NO：21；AAV43790.1＝SEQ ID NO：18；XP466509.1＝SEQID NO：23；XP475482.1＝SEQ ID NO：24)并说明了由申请人鉴定的一致性基序(SEQ ID NO：28)存在于所有这些序列中。
图3显示了非转基因对照裸麦草(I93WT)和不同的独立转基因裸麦草事件的实施；通过灌溉(直至8月5号)、干旱应激(8月5号至9月16日)和采收(9月16日至9月23日)方案下的生物量产生(作为干重g测量)证明的7AR6(ORF88-6)、7AR7(ORF88-7)、7AR9(ORF88-9)和7AR16(ORF88-16)。*＝5％水平的显著性(LSD)；用于处理效果的F测试也是显著的。
图4显示了通过一周灌溉间断的两次六周干旱应激的灌溉方案后植物的状况。与最佳实施的转基因事件ORF88-9(7AR9)(灰色箭头)相比较，非转基因对照(黑色箭头)受损。
具体实施方式
现在将参照以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例1：调节对环境应激的耐受性的多核苷酸的鉴定
简价
多年生裸麦草(Lolium perenne L.)是来自禾本科和Festucaceae族的冷温牧场植物。为了产生裸麦草中相对基因表达模式的剖析图，从获自秋天、夏天、春天和冬天期间放牧前和放牧后植物的环境温度生长、寒冷生长、水合、脱水和再水合或脱水的样品中提取RNA，并用于构建SAGE(基因表达的系列分析)(Velculescu等，1995，Science 270：484-487)文库。
材料和方法
在该研究中，全部使用了多年生裸麦草(Lolium perenne L.)cv.Bronsyn。在每个季节的高峰期间，在Dexcel，Hamilton，新西兰，从活动的小牧场收集田野生长的样品。从放牧前(放牧后15天)和放牧后(放牧后1天)的裸麦草草地收集草的样品。从3-6个随机选择的地点采收一丛草的样品，并在用液氮急冻后存储在干冰中。在春季，还采收了未成熟的草穗和初花(floral initials)。对于应激处理，对实验室生长的裸麦草使用了以下条件：成熟实验室生长多年生裸麦草，在85％RH，20℃/18℃和16h/8h白天/黑夜时段下，在生长室中生长了15个月；水合对照，在85％RH，20℃/18℃和16h/8h白天/黑夜时段下，生长55天；在70％RH，22℃/16℃和16h/8h白天/黑夜时段下，生长6天，在整个生命周期中保持秧苗的喷淋；脱水样品，仅在85％RH，20℃/18℃和16h/8h白天/黑夜时段下，喷淋55天；在70％RH，28℃/20℃和16h/8h白天/黑夜时段下，生长3天；在50％RH，28℃/20℃和16h/8h白天/黑夜时段下，生长3天；再水合样品来自喷淋了24小时并且在70％RH，22℃/16℃和16h/8h白天/黑夜时段下生长的脱水植物；将寒冷应激植物在85％RH，20℃/18℃和16h/8h白天/黑夜时段下，生长55天；在70％RH，22℃/16℃和16h/8h白天/黑夜时段下，生长7天；在70％RH，6℃/2℃和16h/8h白天/黑夜时段下，生长7天，在整个生命周期中，秧苗保持喷淋。
SAGE文库的构建
使用TRIZOL
试剂(Invitrogen，CA，USA)和制造商所述的实验方案，从液氮中研磨的组织提取RNA。对于每个SAGE文库，使用了100μg的总RNA，并使用I-SAGETM或I-SAGETM Long试剂盒(Invitrogen，CA，USA)，根据制造商的实验方案，形成了文库。从每个文库，将960-1,920个克隆进行了测序(AustralianGenome Research Facility，Brisbane，澳大利亚)并使用SAGE2000软件提取标记物。
SAGE生物信息
设计相关数据库来掌握SAGE实验的标记物、文库和表达数。相对整个裸麦草非重叠Gene thresher和EST组来搜寻每个标记物序列(包括酶序列)。在两个方向进行了搜寻，并且只使用精确的匹配。使用General Feature Format(GFF)方法(http://www3.ebi.ac.uk/Services/WebFeat)将结果装载于相关数据库中。
使用相对于以下公开的和适当的数据库中的一些或全部的同源性搜寻来注释所有裸麦草Gene thresher和EST序列：
AGI TIGR Gene Indices，拟南芥，2004年1月，发布11
OGI TIGR Gene Indices，水稻，2004年1月，发布14-1
GENESEQN Derwent专利DNA序列，2002年12月7日
GENESEQP Derwent专利氨基酸序列，2002年12月7日
Os_unigene水稻Unigene独特序列，2004年3月18日
est_others其他EST序列(哺乳动物，真菌，原核生物)，2003年3月11日
est_plant GenBank+EMBL+DDBJ EST分类的非冗余数据库的Viridiplantae子集，2004年3月15日
nr所有非冗余GenBank CDS翻译+PDB+SwissProt+PIR 2003年3月11日
nr_plant所有非冗余GenBank CDS翻译+PDB+SwissProt+PIR的BT子集的HS子集的植物子集，2003年8月8日
nt所有非冗余GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列(但没有EST、STS、GSS或HTGS序列)，2003年3月11日
nt_monocots所有非冗余GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列的单子叶植物子集(但没有EST、STS、GSS或HTGS序列)，2003年3月11日
swissprot SWISS-PROT蛋白序列数据库的最后的主要公布(没有更新)2003年3月28日
使用低于E-05的E值的截留，并且在相关数据库中存储最大10个目标/数据库。
标记物注释
通过形成所涉及序列的所有注释的概述来注释具有裸麦草组击中的标记物。使用计算注释中每个单词的出现频率并基于出现报数以降序排列的算法来产生概述。将概述限于10个单词，并且使用无效单词列表来过滤掉无关紧要的信息。将所得到的概述行用作标记物很可能是什么的表示。展示了实际数量；给予其他可以用于评价概述中每个单词重要性的信息。这种使用关键词计数的自动化注释方法与ProDom数据库用来注释自动生成的蛋白结构域家族的自动化评论(http://protein.toulouse.inra.fr/prodom/current/html/home/php)相似。
观察标记物数据时，显示了基于所涉及序列的最高击中的详细注释。
在以上分析中鉴定了特别感兴趣的多核苷酸序列。这是ORF88(对应于SEQ IDNO：29)。
ORF88显示出编码乙烯应答性元件结合因子样蛋白(SEQ ID NO：1)。对于该转录产物，已经记录了正义和反义SAGE标记物。对于转录产物的反义SAGE标记物在脱水组织中累积，而正义SAGE标记物在秋天放牧前的组织、冬天的根和春天的组织中累积。表1中显示了两个SAGE标记物的全部转录产物特征。
表1
实施例2：鉴定ORF88变体
将由ORF88编码的多肽序列用作种子序列来进行相对NR_PLANT数据库的BLASTP搜寻(发布日)。除了BLASTP以外，还相对NT_PLANT数据库(发布日01.01.05)进行了TBLASTN搜寻。为了鉴定变体，基于申请人评价相关分值，选择了高于9e-25的截留e值。
使用EMBOSS工具EMMA(其是通用多比对程序ClustalW的界面)(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.1994，CABIOS，10，19-29)对选定的变体序列进行了比对。使用另一种称为prettyplot的EMBOSS工具观察比对的序列，其展示了具有着色和加框的比对序列，如图2中所示。
实施例3：用于植物转化的包含本发明多核苷酸的载体的制备
包含ORF88的载体
通过标准分子生物技术来产生用于过表达ORF88的载体。载体(Dorf88和Corf88)的图谱显示于图1中。载体的序列各自显示于SEQ ID NO：56和SEQ IDNO：57中。
实施例4：为表达本发明的多核苷酸/多肽的植物转化
基本上按照Bajaj等(Plant Cell Reports，2006，25：651-659)所述的转化了多年生裸麦草(Lolium perenne L.cv.Impact表型I93)。将源自选定裸麦草系的分蘖(tiller)的分生(mersitematic)区域的胚胎发生愈伤组织和携带改进的双元载体(图1；Dorf88)的根癌土壤杆菌菌株EHA101用于转化实验。将胚胎发生愈伤组织用过夜生长的土壤杆菌培养物浸没30分钟，并伴随连续振荡。将它们在共同培养基上亚培养4周后，选择了对潮霉素抗性的愈伤组织。选择后，每2周将抗性愈伤组织在再生培养基上亚培养，直至植物再生。在两至三轮选择后继续生长的再生体证明是稳定的转化体。然后将每株再生的植物在维持培养基上繁殖，以产生无性繁殖的幼苗，并且随后在不含激素的MS培养基上生根。将来自每个克隆的生根植物转移至包含的温室条件，同时在组织培养物中保持无性繁殖的对应物作为备份。我们在控制气候的环境实验室中通过干旱筛选了获自一个非转基因对照和四个独立的转基因事件(7AR6、7AR7、7AR9和7AR16)的植物。
实施例5：表达本发明多核苷酸/多肽的转化植物的应激耐受性的证明
生长室中的干旱筛选
用于测试干旱耐受性的实验系统是连接自动化滴灌系统的120升盒子构造。将盒子置于移动托盘中并在侧面通过金属框来支持。将盒子在底部用石棉塞上并用洗涤过的灰泥用砂逐渐填满，使用水来获得均匀的填装。每个盒子含有15株实验植物，边缘为20株非实验植物。每株植物从12个分蘖开始并具有五个独立事件，每个重复七次，相对也是重复七次的非转基因亲代系进行比较。使用完全随机的分组设计排列植物，并在70％的相对湿度；16/8小时白天/黑夜循环和650μmol.m-2.s-1光强下生长。每天灌溉植物，一次在早晨，使用50mL Hoagland’s溶液(Hoagland和Arnon，1938)，再一次在下午，使用50mL淡水。最初将植物适应环境两周，然后将植物修整回50mm高度。在接下来的六周中使所有植物确立，并且每两周修整至50mm高度一次。在种植日后两个月，通过停止施用Hoagland’s溶液和水来施加干旱应激。在干旱筛选过程中，在头七天期间，将所有植物接受60％相对湿度，此后降至50％；16/8小时白天/黑夜循环和650μmol.m-2.s-1光强。干旱应激施加三周(图7)，并将植物修整回50mm高度。修整好的材料用于测量地面以上的生物量。将盒子灌溉水三分钟，然后将干旱方案再继续另一个三周。在干旱结束时，将植物修整回50mm高度。将所有植物再次连接灌溉系统，并且恢复至70％相对湿度；16/8小时白天/黑夜循环和650μmol.m-2.s-1光强。一周后，将植物修整至50mm高度，并接受另一轮干旱，持续超过六周。湿度水平、天数、光强等维持于和第一次干旱阶段中的相同水平。测试成对比较(最小显著差异测试)时，我们的地面以上生物量产生的分析表明转基因系没有与灌溉条件下的非转基因对照不同，尽管发现用于处理作用的F测试是显著的，直至第一次干旱方案结束。在干旱三周后，四个转基因事件之一(ORF88-9；7AR9)产生了明显高于非转基因对照的生物量，并且通过LSD测试来证实(图3)。尽管另一个系(ORF88-6；7AR6)产生了比非转基因对照更多的生物量，差异是统计学显著的(图3)。相似地，在干旱试验结束时，尽管这两个转基因事件比非转基因对照产生更多的生物量，差异没有计算为明显差异，可能是由于施加的干旱方案的严重程度杀灭了测试干旱耐受性的植物的主要部分(图4)。
地面以上的生物量
通过将所有植物修整为50mm修剪高度来测定叶子修剪干重。将叶子在80℃下干燥48h，并测量干重(DW)。作为转基因植物事件干重和非转基因对照干重之间的差异来计算在干旱应激下提高的生长能力。在进行F测试来证实处理作用是显著的并且处理数量不太大后，将涉及最小显著差异(LSD)测试的计划成对比较用于计算转基因事件和非转基因对照生物量产生的平均值之间的差异。
以上的实施例说明了本发明的实践。本领域技术人员将认识到可以形成各种变化和改变，而没有脱离本发明的精神和范围。
序列概述
Claims (36)
1.一种生产对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括用遗传构建体转化植物，所述遗传构建体包括：
a)编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体能够提高对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性；
b)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；或
c)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸。
2.如权利要求1的方法，其中环境应激是干旱。
3.如权利要求1或2的方法，其中变体与具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽具有至少50％的序列同一性。
4.如权利要求1至3任一项的方法，其中变体包含氨基酸序列SEQ ID NO：28。
5.如权利要求1至4任一项的方法，其中变体包含选自SEQ ID NO：2-27任一个的氨基酸序列。
6.如权利要求1的方法，其中a)的多核苷酸编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
7.一种生产对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括用遗传构建体转化植物细胞或植物，所述遗传构建体包括：
a)包含核苷酸序列SEQ ID NO：29的多核苷酸，或其变体，其中变体编码能够提高对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽；
b)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；或
c)包含a)的多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸。
8.如权利要求7的方法，其中环境应激是干旱。
9.如权利要求7或8的方法，其中变体包含与SEQ ID NO：29具有至少70％同一性的序列。
10.如权利要求7至9任一项的方法，其中变体包含SEQ ID NO：30至55任一个的序列。
11.如权利要求7的方法，其中a)的多核苷酸包含SEQ ID NO：29的序列。
12.通过权利要求1至11任一项的方法产生的植物。
13.一种分离的多核苷酸，其与编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列具有至少70％的序列同一性，其中多核苷酸编码能够调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽。
14.如权利要求13的分离多核苷酸，其中环境应激是干旱。
15.如权利要求13或14的分离多核苷酸，包含来自SEQ ID NO：29的序列。
16.如权利要求13或14的分离多核苷酸，包含SEQ ID NO：29的全长编码序列。
17.一种分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽。
18.如权利要求17的分离多核苷酸，包含SEQ ID NO：29的序列。
19.如权利要求17或18的分离多核苷酸，包含SEQ ID NO：29的全长编码序列。
20.一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：29的序列或其变体，其中变体来自裸麦草或羊茅草，并且编码能够调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性的多肽。
21.如权利要求20的分离多核苷酸，其中环境应激是干旱。
22.如权利要求20的分离多核苷酸，包含SEQ ID NO：29的序列。
23.一种分离的多肽，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少72％的序列同一性，其中多肽能够调节植物对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热和盐度的环境应激的耐受性。
24.如权利要求23的分离多肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
25.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求23或24的多肽。
26.一种分离的多核苷酸，其包含：
a)包含权利要求13至22和25任一项的多核苷酸的至少15个核苷酸长的片段的多核苷酸；
b)包含权利要求13至22和25任一项的多核苷酸的至少15个核苷酸长的互补体的多核苷酸；
c)包含能够与权利要求13至22和25任一项的多核苷酸杂交的至少15个核苷酸长的序列的多核苷酸。
27.一种遗传构建体，其包含权利要求13至22，25和26任一项的多核苷酸。
28.一种表达构建体，其包含权利要求13至22、25和26任一项的多核苷酸。
29.一种宿主细胞，其在遗传上修饰来表达权利要求13至22、25和26任一项的多核苷酸或权利要求23或24的多肽。
30.一种宿主细胞，其包含权利要求27的遗传构建体或权利要求28的表达构建体。
31.一种植物细胞，其在遗传上修饰来表达权利要求13至22、25和26任一项的多核苷酸或权利要求23或24的多肽。
32.一种植物细胞，其包含权利要求27的遗传构建体或权利要求28的表达构建体。
33.一种包含本发明植物细胞的植物。
34.一种用于选择对至少一种选自干旱、寒冷冰冻、热和盐度的环境应激相对于合适的对照植物具有提高的耐受性的植物的方法，该方法包括测试植物对权利要求13至22，25和26任一项的多核苷酸或权利要求23或24的多肽表达的改变。
35.一组通过权利要求34的方法选择的植物。
36.一种对抗权利要求23或24的多肽产生的抗体。
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