CN102375040A - 一种测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定人或动物的全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，该方法包括对人或动物的全血进行预处理后，分离血浆，再采用分离检测方法对血浆中喜明替康和吉咪替康进行分离和检测，其特征在于，在预处理过程中，将人或动物的全血与一种或多种羧酸酯酶抑制剂接触。本发明的方法通过采用羧酸酯酶抑制剂阻断喜明替康在体外继续水解生成吉咪替康，从而保证了前药喜明替康和代谢产物吉咪替康体内暴露水平考察以及前药转化为代谢产物的转化效率结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及一种测定喜明替康和吉咪替康含量的方法。更具体而言，涉及一种测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法。
背景技术
喜明替康(9-烯丙基-10-(4-哌啶基哌啶)甲酰氧基喜树碱)是新研制的喜树碱类衍生物，用于治疗恶性肿瘤。该化合物可在体内经羧酸酯酶水解成活性代谢产物-吉咪替康(反应式1)而产生抗肿瘤的疗效。在进行临床前和临床药代动力学研究中，需要对动物和人体血浆样品中的喜明替康和吉咪替康进行定量分析来考察其体内暴露水平。
根据文献查阅结果，现有分析方法中无论在处理给予喜明替康的大鼠、小鼠等动物血样，还是在处理给予喜明替康的人血样时，均未采取任何阻断羧酸酯酶活性的方法。其中，有些文献报道采用采血后立即离心分离血浆并低温保存直至分析的方法[1-7]，有些文献报道采用全血采集后置冰上保存的方法[2，4，7]，有些文献在采集全血样品时未提及相关措施[8-11]。
喜明替康在大鼠血浆中极不稳定，即使在体外也可被血浆中的羧酸酯酶水解生成吉咪替康。如果在动物实验采血时没有及时有效地抑制喜明替康继续水解为吉咪替康，会造成喜明替康体内暴露水平偏低和吉咪替康体内暴露水平偏高的假象，导致实验结果的不准确性。
本发明旨在针对当前喜树碱类抗癌药物吉咪替康体内暴露水平以及前药喜明替康转化为活性代谢产物的转化率普遍存在的假阳性结果提出合理的解决方案：即在分析方法中采用选择性的羧酸酯酶抑制剂-BNPP，在体外对全血中的羧酸酯酶进行抑制，使前药喜明替康不再在体外继续转化为吉咪替康，从而有效地保证了分析方法的准确性。
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发明内容
为了提高动物和人体全血/血浆样品中喜明替康和吉咪替康定量分析的准确性，本发明通过采用羧酸酯酶抑制剂阻断喜明替康在体外继续水解生成吉咪替康，从而保证了前药喜明替康和代谢产物吉咪替康体内暴露水平考察以及前药转化为代谢产物的转化效率结果的可靠性。该技术方案同样适用于其他喜树碱类化合物(成酯前药)的血浆样品分析。
因此，本发明的目的是提供一种测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法。
根据本发明的目的提供的一种测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，该方法包括对人或动物的全血进行预处理后，分离血浆，再采用分离检测方法对血浆中喜明替康和吉咪替康进行分离和检测，其中，在对人或动物的全血进行预处理过程中，将人或动物的全血与一种或多种羧酸酯酶抑制剂接触。
由于即使在体外，人或动物全血中的喜明替康也可被其中的羧酸酯酶水解生成吉咪替康。因此，为了更早的抑制喜明替康的水解，采集的人或动物的全血应当尽可能早地与一种或多种羧酸酯酶抑制剂接触。例如，一种或多种羧酸酯酶抑制剂可以预先存在于采血管中；或者采血后向人或动物的全血中迅速加入羧酸酯酶抑制剂。
优选地，所述一种或多种羧酸酯酶抑制剂可以预先存在于采血管中。由此，采集的人或动物的全血会及时地与该一种或多种羧酸酯酶抑制剂接触，从而更加有效地抑制喜明替康水解为吉咪替康。
为了使得采集的人或动物的全血与一种或多种羧酸酯酶抑制剂充分地接触，最好将该一种或多种羧酸酯酶抑制剂以粉末的形式加入在采血管中，并在接触时迅速摇匀。
所述的羧酸酯酶抑制剂可以是双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP，bis-p-nitrophenyl-phosphate)、噻吩甲酰三氟丙酮(thenoyltrifluoroacetone)或二苯甲酰(benzil)。
优选地，所述的羧酸酯酶抑制剂是BNPP。BNPP是一种特异性的羧酸酯酶抑制剂，其对羧酸酯酶的抑制为不可逆性。Wadkins等在进行人小肠羧酸酯酶抑制剂合成和活性鉴定时以BNPP作为阳性对照化合物[12]。本发明人对BNPP的大鼠血浆中羧酸酯酶抑制作用进行了考察，其羧酸酯酶活性抑制率可达98％以上，因此选用BNPP作为大鼠血样的羧酸酯酶抑制剂。
所述人或动物的全血与所述羧酸酯酶抑制剂(例如，BNPP)的ml∶mg的比例为1∶5～1∶10，优选为1∶5，这样可以基本完全抑制喜明替康的水解。
为了防止人或动物的全血迅速凝血，所述采血管的内壁可以涂布有抗凝药物，例如肝素钠。
在所述测定方法中，分离血浆的过程包括将与一种或多种羧酸酯酶抑制剂充分接触后的人或动物的全血离心(例如，3000rpm)得到血浆。进一步用乙腈对血浆进行蛋白沉淀并离心(例如，13000rpm)，得到上清液用于分离检测。
所述的分离检测方法可以采用本领域技术人员已知的可以达到对喜明替康和吉咪替康进行分离和检测目的的任何方法。
优选地，所述的分离方法为高效液相色谱法。
所述高效液相色谱法使用高效液相色谱系统，该系统的具体条件本领域技术人员通过简单的实验就可以得到。也可参见文献1-11。
优选地，所述高效液相色谱系统的条件为：
色谱柱：C18(50mm×2.1mm；5μm)；
柱温：室温；
流动相：溶剂A：CH3CN-H2O(v/v，1∶99；0.4‰ HCOOH；0.05‰HCOONH4)；溶剂B：CH3CN-H2O(v/v，99∶1；0.4‰HCOOH；0.05‰HCOONH4)；
梯度洗脱条件：0～0.5min以4％溶剂B洗脱，0.5～2min溶剂B从4％匀速增加至100％，2～3min以100％溶剂B洗脱，3～4min以4％溶剂B进行柱平衡；
流速：0.40mL/min；
进样量：5μL。
所述检测方法为(串联)质谱检测，具体为：采用正离子电喷雾电离模式(ESI+)，在MRM模式及49V的碰撞能量下，检测喜明替康的m/z 599→124离子对；35V的碰撞能量下，检测吉咪替康的m/z 405→361离子对。
本领域技术人员可以理解，对于喜明替康和吉咪替康含量的测定，可以采用不同条件下的分离或检测方法进行，只要这些方法适合喜明替康或吉咪替康。
当然，为了方便，优选使用相同条件下的分离或检测方法，这样可以达到快速测定的目的。
本发明的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法具体为：在预先内壁涂布有肝素钠并加入羧酸酯酶抑制剂的采血管中加入人或动物的全血，轻轻摇匀，离心分离得到血浆，向该血浆中加入乙腈进行蛋白沉淀，离心后得到上清液；将所述上清液在液质联用仪中进行分离和检测。
本领域技术人员可以理解，在含量测定中，还需要制备标准曲线。
在本发明的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法中，在进行定量分析的标准曲线制作时，采取与上述相同的预处理方法制备喜明替康标准血浆溶液：即在预先存有羧酸酯酶抑制剂的采血管中加入空白血浆或者向空白血浆中加入一定量的羧酸酯酶抑制剂(例如，BNPP)粉末后，再加入喜明替康和吉咪替康标准品配制成含一定浓度喜明替康和吉咪替康的标准血浆溶液，并用含羧酸酯酶抑制剂的空白血浆进行稀释，配制成一系列浓度的喜明替康和吉咪替康标准血浆溶液。然后向该喜明替康和吉咪替康标准血浆溶液中加入乙腈进行蛋白沉淀，离心后得到的上清液用于液质联用分离和检测。
本发明的测定方法中，采用特异性的羧酸酯酶抑制剂(例如，BNPP)对血浆中的羧酸酯酶进行有效地抑制，从而阻断喜明替康在体外的继续水解成吉咪替康。从而保证了前药喜明替康和代谢产物吉咪替康体内暴露水平考察以及前药转化为代谢产物的转化效率结果的可靠性。
可以理解，本发明的测定方法可以应用到可被羧酸酯酶水解的任何化合物的含量测定中。只要测定的化合物与羧酸酯酶同时存在于介质(例如，血浆或血清)中即可。
附图说明
图1为大鼠静脉给予(剂量为2.0mg/kg)喜明替康后，采用现有技术的方法测定喜明替康(左标尺，)以及代谢产物吉咪替康(右标尺，)的血药浓度-时间曲线图。
图2为大鼠(雌性)静脉(i.v.)给予(剂量为3.75mg/kg、7.5mg/kg、15mg/kg)喜明替康后，采用本发明的方法测定喜明替康和吉咪替康的血药浓度-时间曲线图。
图3为体外室温不同条件下大鼠血浆中加入羧酸酯酶抑制剂与否对喜明替康血浆标准曲线结果的影响。(A)加入羧酸酯酶抑制剂BNPP得到的喜明替康血浆标准曲线；(B)不加入羧酸酯酶抑制剂BNPP得到的喜明替康血浆标准曲线。
图4液质联用检测法一同测定大鼠血浆中喜明替康和吉咪替康的色谱图。A，空白大鼠血浆样品；B，空白大鼠血浆样品中添加了喜明替康和吉咪替康的标准品；C，大鼠静脉给药后血浆样品。
具体实施方式
液质联用系统：液相-质谱联用分析系统(LC/MS/MS)由美国Waters公司生产的AcQuityTM UPLC系列液相色谱仪以及Applied Biosystems公司生产的API4000 Qtrap质谱仪组成，系统工作软件为EMPOWER Pro(美国)和Analysis1.4.2(美国)，分别控制液相和质谱系统。
HPLC级乙腈(CH3CN)、甲醇(MeOH)、甲酸(HCOOH)和甲酸铵(HCOONH4)为美国Merck公司生产的试剂。实验用水由Millipore Direct-Q制备。其它有机试剂由中国医药(集团)上海化学试剂公司提供，分析纯。
实施例1测定大鼠静脉给予喜明替康后，采用不同方法处理的大鼠血浆中喜明替康和吉咪替康的浓度
实验方法：
1、动物血样采集：在动物采血后迅速加入羧酸酯酶抑制剂BNPP(每1mL血液约加入5mg)，摇匀后离心取血浆，血浆于-70℃保存待测。
2、大鼠血浆样品前处理：将-70℃冷冻保存的血浆样品(50μL)室温解冻，加入含100ng/mL的内标化合物的酸性乙腈溶液(含0.5％甲酸)150μL振摇提取(1600rpm，5min)，离心(13,000rpm，5min，4℃)后，取上清液用于分析。
3、液质联用分析条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(50mm×2.1mm；5μm，Agilent，USA)；柱温：室温；流动相：溶剂A：CH3CN-H2O(v/v，1∶99；0.4‰HCOOH；0.05‰HCOONH4)；溶剂B：CH3CN-H2O(v/v，99∶1；0.4‰HCOOH；0.05‰HCOONH4)；梯度洗脱条件：0～0.5min以4％溶剂B洗脱，0.5～2min溶剂B从4％匀速增加至100％，2～3min以100％溶剂B洗脱，3～4min以4％溶剂B进行柱平衡；流速：0.40mL/min；进样量：5μL。质谱检测采用正离子电喷雾电离模式(ESI+)，在MRM模式及49V的碰撞能量下，检测喜明替康m/z 599→124离子对；35V的碰撞能量下，检测吉咪替康的m/z 405→361离子对，质谱工作参数见表1。
表1应用液质联用技术同时定量分析喜明替康和吉咪替康的质谱工作参数
4、标准曲线的制备：向含BNPP的空白大鼠血浆(血浆(ml)∶BNPP(mg)＝1∶5)中加入喜明替康和吉咪替康的乙腈标准储备液(浓度为100μg/mL)，配成相当于含喜明替康和吉咪替康浓度为1000ng/mL的血浆样品，然后按3倍间隔用含BNPP的空白大鼠血浆稀释，配制喜明替康和吉咪替康浓度范围为1.37～1000ng/mL的一系列标准样品。用“实验方法2”所述的方法处理标准样品(50μL)后，再按“实验方法3”的方法获得样品检测响应(被测化合物和内标色谱峰峰面积之比值)。以上述标准血样的标示浓度(X，ng/mL)为自变量，以检测响应(Y)为因变量，用最小二乘法进行线性回归，并以1/X为权重系数，求得测定效应与浓度的回归方程。
采用文献报道[2]的方法(即：全血采集后立即离心分离血浆并低温保存，分析过程中将样品置冰浴中，而没有在采血后立即阻断羧酸酯酶活性)测定了静脉给予喜明替康(2mg/kg)后大鼠血浆中喜明替康和吉咪替康的浓度，所得到它们的血药浓度-时间曲线见图1。其中，AUC喜明替康为170±6ng·h/mL，AUC吉咪替康为105±4ng·h/mL，AUC吉咪替康/AUC喜明替康的比值为61.8％。
当采用本发明的采血后立即加入羧酸酯酶抑制剂BNPP阻断羧酸酯酶活性的方法，对大鼠(雌性)静脉(i.v.)给予(剂量为3.75mg/kg、7.5mg/kg、15mg/kg)喜明替康后的血样进行分析时，喜明替康体外继续转化为吉咪替康得到了很好的抑制，所得到喜明替康和吉咪替康的血药浓度-时间曲线见图2。三个剂量下AUC吉咪替康/AUC喜明替康的比值分别为6.74％(3.75mg/kg剂量组)、4.51％(7.5mg/kg剂量组)和3.74％(15mg/kg剂量组)。
实施例2体外室温不同条件下大鼠血浆中加入羧酸酯酶抑制剂与否对喜明替康转化为吉咪替康的影响
实验方法：
1、样品制备：向含BNPP的空白大鼠血浆(血浆(ml)∶BNPP(mg)＝1∶5)或不含BNPP的空白大鼠血浆中加入喜明替康的乙腈标准储备液(浓度为100μg/mL)，配成相当于含喜明替康浓度为333ng/mL和37.1ng/mL的血浆样品。
2、大鼠血浆样品前处理：同实施例1。
3、液质联用分析条件：同实施例1。
结果见表2。
表2体外室温不同条件下大鼠血浆中加入羧酸酯酶抑制剂BNPP与否对喜明替康转化为吉咪替康的影响
表2的结果表明，在采血管中预先加入一定量的羧酸酯酶抑制剂BNPP后，喜明替康在体外继续转化为吉咪替康得到了完全的抑制，喜明替康无转化，样品中测不到吉咪替康；而在采血管中不加入羧酸酯酶抑制剂，喜明替康的转化率为63.4-66.0％。
实施例3体外室温不同条件下大鼠血浆中加入羧酸酯酶抑制剂与否对喜明替康血浆标准曲线结果的影响
实验方法：
1、标准曲线的制备：向含BNPP的空白大鼠血浆(血浆(ml)∶BNPP(mg)＝1∶5)和不含BNPP的空白大鼠血浆中加入喜明替康的乙腈标准储备液(浓度为100μg/mL)，配成相当于含喜明替康浓度为6000ng/mL的血浆样品，然后按3倍间隔用含BNPP的空白大鼠血浆稀释，配制喜明替康浓度范围为1.37～6000ng/mL的一系列标准样品。
2、大鼠血浆样品前处理：同实施例1。
3、液质联用分析条件：同实施例1。
在血浆中加入羧酸酯酶抑制剂BNPP后制作的喜明替康标准曲线在1.37-6000ng/mL的浓度范围内线性良好(r＝0.9941)；血浆中未加入羧酸酯酶抑制剂后制作的喜明替康标准曲线在同样浓度范围内线性较差(r＝0.9447)，表明在标准曲线制作过程中喜明替康不稳定，存在一定的转化(图3)。
图4为液质联用检测法一同测定大鼠血浆中喜明替康和吉咪替康的色谱图。A，空白大鼠血浆样品；B，空白大鼠血浆样品中添加了喜明替康和吉咪替康的标准品；C，大鼠静脉给药后血浆样品。该图为进行上述3种实施例所得的代表性色谱图。
综上所述，采用本发明的在对人或动物的全血进行预处理过程中，将人或动物的全血与一种或多种羧酸酯酶抑制剂接触，即一种或多种羧酸酯酶抑制剂可以预先存在于采血管中；或者采血后向人或动物的全血中立即加入羧酸酯酶抑制剂阻断羧酸酯酶活性的方法后，喜明替康在体外继续转化为吉咪替康得到了完全抑制，所得到喜明替康和吉咪替康的血药浓度能够较好地反映其在体内的实际情况，保证了喜树碱类化合物前药转化为代谢产物的转化效率结果的可靠性。
Claims (9)
1.一种测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，该方法包括对人或动物的全血进行预处理后，分离血浆，再采用分离检测方法对血浆中喜明替康和吉咪替康进行分离和检测，其特征在于，在对人或动物的全血进行预处理过程中，将人或动物的全血与一种或多种羧酸酯酶抑制剂接触。
2.根据权利要求1所述的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，其特征在于，所述一种或多种羧酸酯酶抑制剂预先存在于采血管中。
3.根据权利要求1或2所述的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，其特征在于，所述羧酸酯酶抑制剂为双(对硝基苯基)磷酸酯、噻吩甲酰三氟丙酮或二苯甲酰。
4.根据权利要求3所述的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，其特征在于，人或动物的全血与所述羧酸酯酶抑制剂的ml∶mg的比例为1∶5～1∶10。
5.根据权利要求4所述的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，其特征在于，人或动物的全血与所述羧酸酯酶抑制剂的ml∶mg的比例为1∶5。
6.根据权利要求2所述的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，其特征在于，所述采血管的内壁涂布有肝素钠。
7.根据权利要求1所述的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，其特征在于，分离血浆过程包括将与一种或多种羧酸酯酶抑制剂接触后的人或动物的全血离心得到血浆。
8.根据权利要求1所述的测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，其特征在于，所述的分离方法为高效液相色谱法；所用的检测方法为质谱检测。
9.一种测定人或动物全血中喜明替康和吉咪替康含量的方法，该方法具体为：在预先内壁涂布有肝素钠并加入羧酸酯酶抑制剂的采血管中加入人或动物的全血，摇匀，离心分离得到血浆，向该血浆中加入乙腈进行蛋白沉淀，离心后得到上清液；将所述上清液在液质联用仪中进行分离和检测。
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