CN102372768B - 大豆磷转运蛋白GmPHT15及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大豆磷转运蛋白GmPHT15，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及编码该蛋白的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明提供的编码大豆磷转运蛋白GmPHT15的基因可用于提高各种植物对磷的利用率，提高植物在磷胁迫下的抗逆能力，从而提高植物的产量。

Description

大豆磷转运蛋白GmPHT15及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大豆磷转运蛋白GmPHT15及应用。

背景技术

磷是生物生长发育的重要营养元素之一，是蛋白质、核酸、脂类以及各种重要的小分子(如能源供应者ATP)的重要组成成分，是各种代谢(如糖降解)必须的中介物，是生长发育的调节物(如磷酸化)。因此，施加磷肥对提高农产量起着关键作用。但是，磷是一种不可再生的资源，由于长期以来的过度利用，使得磷正在逐步成为一种地球上即将消失的矿产资源，在不远的将来，磷将制约各国的经济和政治命脉，磷也将成为许多国家的战略物资(Steven Van Kauwenbergh)。

然而，为了提高作物的产量，农业上还在不断增加磷的施用量。据报道，我国小麦产区的磷施用量是小麦生长发育所需的两倍(Vitousek，等，2009)；另外，人和动物粪中含有大量的磷也被直接释放到环境中。结果导致土壤和水体中磷含量大量增加，引起环境污染。同时，在水体和土壤中的磷大多数是植物不可利用的有机磷。这样，导致了土壤中的有效磷含量低。因此，提高植物对磷的利用率对于减少农业磷的施用量，维护生态安全，提高作物的产量，保障国家磷的战略安全等方面具有重要和关键的意义。

大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源，其产量与土壤磷的供应量和植株对磷的吸收能力直接相关。本发明通过基因工程的方法，首次发现与提高大豆对磷的利用率有关的大豆磷转运基因GmPHT15及其编码蛋白，该基因可用于提高各种植物对磷的利用率，提高植物在磷胁迫下的抗逆能力，从而提高作物的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆磷转运蛋白GmPHT15。

本发明的另一目的是提供编码上述大豆磷转运蛋白GmPHT15的基因。

本发明的再一目的是提供上述编码大豆磷转运蛋白GmPHT15的基因在提高植物对磷的利用率以及提高植物在磷胁迫下的抗逆能力中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种大豆磷转运蛋白GmPHT15，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。如61位上缺失K，或在281位添加E，或在157位的R替换为K，或在464位缺失PQDKTKTDAGYPP，或在521位增加TAATRESAMEAGLEVRPSV对蛋白的功能没有影响。

本发明还提供编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有编码大豆磷转运蛋白GmPHT15基因的载体及含有该载体的宿主细胞。

本发明还提供含有编码大豆磷转运蛋白GmPHT15基因的转化植物细胞及转基因植物。

本发明进一步提供编码大豆磷转运蛋白GmPHT15的基因在提高植物对磷的利用率以及提高植物在磷胁迫下的抗逆能力中的应用。优选地，所述植物为拟南芥、大豆等。

本发明提供的GmPHT15基因(全称为Glycine max phosphatetransporter 15)是从大豆垦农18(由黑龙江省八一农垦大学科学研究所提供)中克隆到的基因，基因的开发阅读框为1584bp，它编码527个氨基酸；大豆磷转运蛋白GmPHT15与拟南芥AtPHT1；3高度同源，具有11个跨膜域和PHT1特征域GGDYPLSATIxSE(图1)；大豆磷转运蛋白GmPHT15在大豆各个组织、器官中都表达(图2)；GmPHT15蛋白在大豆种子中的表达随种子的发育逐渐减少(图3)，GmPHT15蛋白的表达受低磷胁迫的诱导(图4)；GmPHT15蛋白在细胞中定位于细胞膜(图5)；GmPHT15基因能恢复酵母双突变PAM2(即Δpho84/Δpho89)的表现型，可以在磷胁迫的条件下正常生长(图6)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明提供了大豆磷转运蛋白GmPHT15(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)及编码该蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)。

(2)过表达GmPHT15基因可以提高酵母对磷的利用率。

(3)本发明提供的编码大豆磷转运蛋白GmPHT15的基因可用于提高各种植物对磷的利用率，提高植物在磷胁迫下的抗逆能力，从而提高植物的产量。

附图说明

图1示例表明大豆磷转运蛋白GmPHT15与拟南芥AtPHT1；3高度同源，其中GmPHT15的TM1～11代表11个潜在的跨膜域用黑实线标示，AtPHT1；3的用黑虚线标示，PHT1特征域以黑框标示。

图2显示了本发明大豆磷转运蛋白GmPHT15在不同组织中的表达水平，其中，R：根；U：单叶；T1：第一复叶；T2：第二复叶；T3：第三复叶；T4：第四复叶；S：茎；F：花。

图3表明大豆磷转运蛋白GmPHT15在种子中的表达与种子的发育水平呈负相关，其中，S1：开花后第7天；S2：开花后第14天；S3：开花后第21天；S4：成熟种子。

图4为在不同磷浓度下处理7天后根中GmPHT15蛋白的表达量，其中，Ps0000R：0μM Pi；Ps0010R：10μM Pi；Ps0100R：100μM Pi；Ps0500R：500μM Pi；Ps1000R：1000μM Pi；Ps2000R：2000μM Pi；Ps5000R：5000μM Pi。

图5表明大豆磷转运蛋白GmPHT15定位于细胞膜上(YFP：在514nm的激发光下观察的结果；明场：无激发光时观察到的结果；叠加：表示2种条件下观察结果的重叠)。

图6为本发明GmPHT15基因在酵母中的异源表达，其中，第一列为空载体对照；第二列为野生型酵母菌对照；第三列(PAM2-GmPHT15)为实验组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 GmPHT15基因的克隆

以大豆品种垦农18(KN18)为试验材料，在低磷胁迫(

100μM)下的液体培养基中培养至真叶张开，取根、茎和叶，利用Trizol试剂盒提取总mRNA(Invitrogen公司)，并利用反转录试剂盒(Takara公司)对总mRNA进行反转录，得到cDNA。

液体培养基成份：

以大豆品种垦农18(KN18)为试验材料，通过RT-PCR(其程序为：95℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，26循环；72℃5min。反应体系：0.3μL LA Taq DNA聚合酶，1μL引物F，1μL引物R，5μL 10X缓冲液，4μL dNTP mix，2μL cDNA，36.7μL H₂O；总体系为50μL。其中，引物F：5’-CAGGTTAAGGCACCTGGGAGAC-3’；引物R：5’-TGACAAGGGAGATGCAAAAAAG-3’。扩增得到GmPHT15。将其重组到Gateway克隆体系的入门载体pGWC上。并送三博远志生物公司测序，检测GmPHT15的正确性。

实施例2 GmPHT15基因在酵母中的表达

通过Gateway克隆体系将GmPHT15重组到pYES-DEST52载体(购自Invitrogen公司)上，并将重组质粒转化到缺失两个高亲和磷转运基因(PHO89和PHO84)的酵母突变体PAM2(Δpho89::TRP1Δpho84::HIS3 ade2 leu2 his3 trp1 ura3。Martinez，P.，Zvyagilskaya，R.，Allard，P和Persson，B.1998.Physiological regulation of thederepressible phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae.J.Bacteriol.180，2253-2256.)中。在GAL(半乳糖)启动子的作用下，GmPHT15可以互补PHO84和PHO89的功能，即PAM2可以在低磷(＜50μM)条件下正常生长(如图6所示)。

实施例3 GmPHT15基因在大豆中的表达及其在提高大豆对磷的利用率中的应用

选用籽粒饱满且一致的大豆KN18作为测试材料；将其播种于新的蛭石中保湿催芽，待出土2-3天后，移入

为500μM的液体培养基中，培养至真叶张开。移至的浓度梯度为0μM，10μM，100μM，500μM，1000μM，2000μM和5000μM的培养基中培养。培养7天后取样，同实施例1中的操作。

利用Real-Time PCR检测GmPHT15受磷胁迫的调控影响。引物F：5’-CAGGTTAAGGCACCTGGGAGAC-3’；引物R：5’-TGACAAGGGAGATGCAAAAAAG-3’。扩增的长度为：191bp。

PCR程序：

ABI StepOne进行，用SYBR Green I检测荧光信号。采用15μl反应体系，体系配制如下：

qRT-PCR参数如下：

两步法：95℃10S，热启动；95℃5S，60℃1min，40个循环。

从检查结果来看，GmPHT15受低磷的强调控。磷浓度为0μM时基因的表达量分别是10μM、100μM、500μM、1000μM、2000μM和5000μM的7.9、2.1、1.9、1.6、0.9和1.8倍。但在有磷的条件下，GmPHT15的表达与磷的供给浓度成正相关。

实施例4 GmPHT15基因在拟南芥中的表达及其在提高拟南芥对磷的利用率中的应用

将GmPHT15基因构建在由35S启动子驱动的双元载体上，过表达到拟南芥中检测该基因的功能，已获得转基因植株。并用测定了3棵独立转基因植株在低磷(浓度为10μM)胁迫的条件下植物体内总磷含量的变化。取生长14天的幼苗，用超纯水清洗干净，放入60℃烘箱中过夜烘干，将称量后的样品(100～300mg)直接放入消化罐中，加入7ml 68％的HNO₃和2ml 30％的H₂O₂(优级纯)，用Microwavelaboratory system(Milestone，Italy)在180℃，1KPa条件下消化15min。冷却后，将消化液转入25ml用超纯水洗净并烘干的容量瓶中，用超纯水定容至25ml。用Inductively Coupled Plasma Optical EmissionSpectrometer(ICP-OES，Perkin Elmer，USA)，以磷的标准溶液做标准曲线测定磷含量，每个样品重复测量2次。从测定结果来看，转基因拟南芥比野生型的总磷含量提高了2.30％-5.52％。由此可见，基因GmPHT15过表达于植物中，增强了转基因植物在低磷胁迫条件下吸收磷的能力，进而有效地提高了植物抗低磷胁迫的能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.大豆磷转运蛋白GmPHT15，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。

7.权利要求2或3所述的基因在提高植物对磷的利用率以及提高植物在磷胁迫下的抗逆能力中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述的植物为拟南芥。

9.如权利要求7所述的应用，其中所述的植物为大豆。

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