CN102389435A

CN102389435A - 伪酸枣仁苷元在制备抗老年痴呆药物中的应用

Info

Publication number: CN102389435A
Application number: CN2011102828107A
Authority: CN
Inventors: 刘晓军; 单磊; 苏娟; 张卫东; 沈云亨; 柳润辉; 李慧梁; 徐希科
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2012-03-28

Abstract

本发明提供了伪酸枣仁苷元在制备制备抗老年痴呆药物中的应用，所述伪酸枣仁苷元如下列结构式：

Description

伪酸枣仁苷元在制备抗老年痴呆药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物，具体涉及假马齿苋提取物制备新型三萜类化合物在制备抗老年痴呆药物中的应用，尤其涉及伪酸枣仁苷元在制备抗老年痴呆药物中的应用。

背景技术

老年性痴呆是一组以认知功能缺失为核心症状的综合征，是一种慢性进行性神经退行性疾病，是当今危害人类健康最常见的精神疾病。其中以阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)最为常见。据不完全统计，到2020年世界范围内老年痴呆患者人口将达300万，另据2011年美国最新科学研究报告指出，中国作为一个即将进入老龄化的国家，其老年痴呆患者的数目正呈爆炸式增长，且痴呆患者年龄越来越年轻化。由于痴呆病的病程长，确诊检验复杂，确诊后平均生存期短，因此在未来一段时间内，老年性痴呆病的诊断和治疗上仍是全人类的一大挑战。老年痴呆患者通常会出现记忆、思维、定向、理解、计算、语言等多种高级皮层功能的渐进性损害，这些损害可不同程度地干扰患者的工作、日常生活及社交，最终使患者丧失自理能力。老年痴呆症根据其病因主要分为：脑变性疾病引起的痴呆(阿尔茨海默病)、脑血管病引起的痴呆和混合型痴呆三大类。其中阿尔茨海默病在老年痴呆症的发病中最为普遍，大约占痴呆病人的50％～56％。目前研究表明，痴呆的发病机制主要有：1、脑内蛋白成分异常沉积与神经变性性痴呆，包括Aβ沉积及引发的级联反应、tau蛋白(中文)和细胞骨架的改变、α-共核蛋白和变性性痴呆、泛素-蛋白酶体通路异常与变性性痴呆。2、神经递质异常，包括乙酰胆碱、多巴胺系统、其它神经递质：DA、5-羟色胺、去甲肾上腺素、谷氨酸等异常。3、脑血管病变和脑组织损害。4、脑损害级联反应等。尽管对AD研究的历史超过百年，但由于AD确切的病因尚未充分阐明，所以还没有有效的治疗手段来预防、阻止或逆转AD过程(Harris JA，DevidzeN，Halabisky B，etal.Many neuronal and behavioral impairments intransgenic mouse models of Alzheimer’s disease are independent ofcaspase cleavage of the amyloid precursor protein[J].J Neurosci，2010，30(1)：372-381)。目前的治疗手段主要是通过增强中枢神经系统的功能、减轻疾病出现的各种症状、延缓痴呆的发展等。美国食品药品监督管理局将AD治疗的药物分为胆碱酯酶抑制剂类和N-甲基-D-天门冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate，NMDA)受体拮抗剂类。应用较多，效果较明显的胆碱酯酶抑制剂是通过抑制胆碱酯酶的活性、减少乙酰胆碱的降解，从而增强胆碱能神经的功能来达到治疗目的的。目前，国内外应用比较多的此类药物有：他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利斯的明(revastigmine)、加兰他敏(galantamine)和中国研制的石杉碱甲(huperzing)。谷氨酸盐是中枢神经系统中主要的兴奋性递质，在神经元可塑性方面及学习和记忆的基础结构之一的长时程增强效应中，都有着重要的作用。NMDA受体是谷氨酸受体的一种，它的过度表达会引起兴奋性神经毒性，使钙离子迅速升高，并诱导一系列的级联反应，最终导致神经细胞的死亡。美金刚(memantine)是NMDA受体的非竞争性拮抗剂，与NMDA受体在特定位点结合，具中度亲和力。其只阻断病理状态下谷氨酸介导的兴奋性毒性，而保留NMDA受体的生理功能，是理想的NMDA受体拮抗剂。其它的药物。比如钙离子拮抗剂、非甾体抗炎药和他汀类药物等。但是，目前临床上应用的AD治疗的药物大多为改善症状的药物，并不能从根本上阻止或逆转AD的进展。而且有些药物疗效低，不良反应多，应用普遍不广泛。因此，寻找并开发高效低毒、价格低廉的抗老年痴呆症新药，是研究的重点。天然药物具有临床和民间应用和经验，疗效确切，其化学成分结构复杂、多样性高，可作为新药研发的先导化合物，对来源于植物的抗老年痴呆天然产物的寻找和活性筛选以及对天然产物的结构衍生化以发现高效、低毒、高特异性的抗老年痴呆药物是一条有效途径。中药预防和治疗老年痴呆的药物有石杉碱甲(胆碱酯酶抑制剂)、银杏叶提取物、儿茶酸、芹菜甲素、人参皂苷、绞股兰皂苷等。这些药物的疗效经过长期的临床验证，作用明确，疗效可靠。但传统中药也存在着成分复杂、制剂落后、机理不清、质量控制困难、服用不便等缺点。假马齿苋是玄参科植物假马齿苋Bacopamonnieri(L.)Wettst的全草，主要分布于福建，台湾，广东，云南及四川等省。采收于夏、秋季，全草入药。其味微甘、淡、性寒。中医医典记载具有解郁、益智、清热凉血，解毒消肿之功效。

印度阿育吠陀医药体系(Ayurvedic system of medicine)认为假马齿苋能增强智力和改善记忆，具有延缓衰老、预防痴呆，镇静、催眠，抗老年痴呆之功效。其标准提取物制成的制剂已在印度国内上市，作为治疗记忆损伤和抗老年痴呆的辅助药物。但至今，假马齿苋中尚未开发出任何形式的药物。本发明人前期通过神经保护活性指导下的化学成分系统分离方法对假马齿苋药材进行了系统的活性成分研究，从假马齿苋提取物中纯化得到一个神经保护活性非常强的新型三萜类化合物Bacopaside I，如下结构式表示：

药理研究结果表明，Bacopaside I对过氧化氢(H₂O₂)和谷氨酸(L-Glutamate)诱导的大鼠皮层神经元和嗜铬细胞瘤细胞(PC12cells)损伤具有显著的保护作用，且保护作用呈现剂量依赖关系，具有潜在的抗老年痴呆活性，可以开发新药。该发明已申请中国发明专利并已获授权(张卫东等，假马齿苋皂苷化合物、总皂苷及其在医药中的应用，专利号：ZL200410089312.0)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于进一步研究设计含有新的三萜类化合物的抗老年痴呆药物。

本发明提供了一种三萜类化合物伪酸枣仁苷元(pseudojujubogenin)在制备抗老年痴呆药物中的应用。

本发明人进行了伪酸枣仁苷元(Pseudojujubogenin)对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响，伪酸枣仁苷元对局灶性脑缺血再灌注损伤动物的保护作用，伪酸枣仁苷元对APP/PS1双转基因小鼠空间记忆障碍的影响实验，从老年痴呆动物水平评价伪酸枣仁苷元的药效。通过东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍实验，结果显示口服给药150mg/kg、50mg/kg、15mg/kg、5mg/kg剂量的伪酸枣仁苷元均有改善作用，其中15mg/kg对由东莨菪碱所造成的获得性记忆障碍小鼠的空间记忆障碍有改善作用与腹腔注射0.9mg/kg多奈哌齐相近。在研究伪酸枣仁苷元对局灶性脑缺血再灌注损伤动物保护作用中，通过神经功能评价、脑缺血体积的计算以及病理组织切片观察，说明伪酸枣仁苷元的35mg/kg、15mg/kg及5mg/kg剂量组对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定的保护作用，且中剂量15mg/kg作用最为有效。对伪酸枣仁苷元能否改善APP/PS1双转基因小鼠空间记忆障碍实验，结果50mg/kg、15mg/kg的伪酸枣仁苷元对APP/PS1双转基因小鼠的记忆障碍有明显的改善作用，在15mg/kg剂量时的改善作用强度更强。

因此，伪酸枣仁苷元可用于制备抗老年痴呆药物。

本发明所述药物为由伪酸枣仁苷元作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

本发明所述伪酸枣仁苷元通过下列方法制备得到：

假马齿苋药材，粉碎，水煎煮三次，合并提取液，过滤除去沉淀，上清液通过大孔吸附树脂柱，依次以去离子水、0.2％的氢氧化钠、40％乙醇、75％乙醇、95％乙醇洗脱；取75％乙醇洗脱液，蒸去乙醇得干燥提取物假马齿苋总皂苷；取假马齿苋总皂苷，加水浸泡，加热煮沸，冷却后，加入阿拉伯糖苷酶溶液，65℃搅拌酶解，酶解结束后加热回流提取，收集提取液，滤过回收溶剂，即得伪酸枣仁苷元粗品；酸枣仁苷元粗品过葡聚糖凝胶色谱，甲醇洗脱，得到精制伪酸枣仁苷元。通过测定制得的伪酸枣仁苷元苷元的核磁数据并与文献(Ken-IchiKawai，Shoji Shibata.Pseudojujubogenin，a new sapogenin from Bacopamonniera.Phytochemistry，1978，17(2)：287-289)比对，鉴定为“伪酸枣仁苷元”，HPLC检测纯度＞98％。

本发明由中药提取物得到的化合物制备药物，为研究开发抗老年痴呆药物提供了新的途径，有较大的临床应用价值。

附图说明

图1实施例2各组小鼠找到平台的潜伏期

横坐标：1为空白对照组，2为模型组，3为阳性对照组，4为伪酸枣仁苷元pseudojujubogenin 150mg/kg组，5为酸枣仁苷元pseudojujubogenin 50mg/kg组，6为酸枣仁苷元pseudojujubogenin15mg/kg组，7为酸枣仁苷元pseudojujubogenin 5mg/kg组；

纵坐标：小鼠找到平台的潜伏期，单位秒(s)

#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

图2实施例3伪酸枣仁苷元作用于脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血体积比率

的比较

横坐标：1为空白对照组，2为模型组，3为pseudojujubogenin50mg/kg组，4为pseudojujubogenin 15mg/kg组，5为pseudojujubogenin5mg/kg组；

纵坐标：脑缺血体积比率，单位：％

#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

图3实施例4各组小鼠撤台后穿越平台次数

横坐标：1为空白对照组，2为模型组，3为pseudojujubogenin50mg/kg组，4为pseudojujubogenin 15mg/kg组；

纵坐标：小鼠撤台后穿越平台次数，单位：次。

#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 与模型组比较

图4实施例4各组小鼠撤台后在IV象限的活动路程(mm)

纵坐标：活动路程，单位：毫米(mm)

#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

具体实施方式

实施例1伪酸枣仁苷元制备

假马齿苋药材市售购得。

取假马齿苋药材1Kg，粉碎成20目粗粉，水煎煮三次(每次12Kg)，合并提取液，过滤除去沉淀，上清液通过大孔吸附树脂柱(日本三菱化工，DIAION HP20苯乙烯型大孔吸附树脂，Φ∶h＝1∶10)，依次以去离子水、0.2％的氢氧化钠、40％乙醇、75％乙醇、95％乙醇洗脱(每种溶剂洗脱用量为10升)。取75％乙醇洗脱液，45℃蒸去乙醇至无醇味，得干燥提取物，经泡沫试验(吴立军，《天然药物化学》，北京，人民卫生出版社，2008年第五版，P287-288)和利伯曼-布夏德反应(Libermann-Burchard reaction)呈阳性，证明为假马齿苋总皂苷。取总皂苷10g，加入10倍量水浸泡2h，加热煮沸5min，冷却后置恒温水浴锅中，加入新鲜配制的阿拉伯糖苷酶溶液，酶用量为0.2g，搅拌酶解45min，酶解温度为65℃。酶解结束后加热回流提取2次，每次45min，收集提取液，滤过回收溶剂，即得伪酸枣仁苷元粗品。酸枣仁苷元粗品过葡聚糖凝胶色谱(Sephadex LH-20色谱柱)，甲醇洗脱，薄层色谱跟踪检测，得到精制苷元，通过测定苷元的核磁数据并与文献(Ken-Ichi Kawai，Shoji Shibata.Pseudojujubogenin，a newsapogenin from Bacopa monniera.Phytochemistry，1978，17(2)：287-289)比对，鉴定为“伪酸枣仁苷元”(pseudojujubogenin)，HPLC检测纯度＞98％。

实施例1制备得到的伪酸枣仁苷元用于下列实验。

实施例2观察伪酸枣仁苷元对记忆障碍获得的影响

本实验观察伪酸枣仁苷元对记忆障碍获得的影响。东莨菪碱是M-胆碱受体阻滞剂，可阻断乙酰胆碱对M-受体的激动作用，使大脑皮层和海马中的乙酰胆碱的传递发生障碍，会抑制条件反射的形成，影响学习和记忆等功能活动。在小鼠训练成熟后，最后一天训练前给予适量受试药物，并采用适当给予东莨菪碱可阻断小鼠的记忆获得过程，从而观察待测药物对记忆获得的影响。利用Morris水迷宫法可检测药物对模型小鼠的学习记忆获得效果。

2、实验材料

实验动物

品系：ICR小鼠

性别：雄性

体重：25～30g

来源：上海斯莱克实验动物有限责任公司

动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005

受试药物

名称：伪酸枣仁苷元

来源：实施例1制备

性状：白色粉末，溶于水

本实验根据目前临床用单体药物剂量设计了4个受试剂

量：150mg/kg、50mg/kg、15mg/kg、5mg/kg。

伪酸枣仁苷元的配置：

伪酸枣仁苷元Pseudojujubogenin高剂量(150mg/kg):45mg→生理盐水4.5ml

伪酸枣仁苷元Pseudojujubogenin中剂量(50mg/kg)-1:15mg→生理盐水4.5ml

伪酸枣仁苷元Pseudojujubogenin中剂量(15mg/kg)-2:4.5mg→生理盐水4.5ml

伪酸枣仁苷元Pseudojujubogenin低剂量(5mg/kg):1.5mg→生理盐水4.5ml

阳性对照药及配置

名称：多奈哌齐(donepezil)，又名安理申

性状：白色粉末

来源：上海阿拉丁试剂公司

批号：884740-09-04

多奈哌齐(donepezil)根据文献报道采用0.9mg/kg、腹腔注射。

配制：10.2mg→3.6ml生理盐水，每只0.3ml。

试剂

名称：盐酸酸东莨菪碱

性状：白色粉末

分子式：C₁₇H₂₁NO₄·HCl

来源：上海阿拉丁试剂公司

批号：22882

仪器

名称：DigBehv动物行为分析系统；Morris水迷宫视频分析系统

来源：上海吉量软件科技有限公司

Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)实验是一种强迫实验动物(大鼠、小鼠)游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置觉和方向觉(空间定位)的学习记忆能力。

(2)实验方法

动物分组及给药方案

70只雄性ICR小鼠随机分为7组，每组10只：

组1.空白对照组：生理盐水(N.S)

组2.模型组：生理盐水(N.S)

组3.阳性药对照组：多奈哌齐0.9mg/kg

组4.伪酸枣仁苷元高剂量组：150mg/kg

组5.伪酸枣仁苷元中1剂量组：50mg/kg

组6.伪酸枣仁苷元中2剂量组：15mg/kg

组7.伪酸枣仁苷元低剂量组：5mg/kg

方法

1)训练前一天将小鼠放入水迷宫中自由游泳2min以适应环境。

2)水迷宫中提前放入水中、使水温调节至室温(20-25℃)，加入黑色背景颜料。ICR小鼠伪酸枣仁苷元灌胃给药，空白与模型组给予相同体积的生理盐水。给药40分钟后进行适应性训练、每天训练2次：在两个象限的两个标记点将各小鼠鼻朝宫壁方向轻放入水中，70s内训练其找到平台的能力，连续训练6天、第7天正式实验。训练过程中，70s内找到平台者，取出小鼠擦干、放回；在70s内未找到平台者，引导其至平台，滞留30s后再捞出擦干、放回。训练至第5天剔除未学会的小鼠，训练期间也需记录训练结果包括爬上平台所需时间及路程。

3)正式实验时，提前40分钟分别给予生理盐水、阳性药物及伪酸枣仁苷元药物，给药40分钟后腹腔注射东莨菪碱0.2ml/每只(4.5mg/kg)，作用20分钟后进行测试。

4)记录小鼠找到平台所需要的时间(潜伏期)、路程。数据采用以平均值±标准差(MEAN±SD)表示，数据差异统计采用单因素方差分析ANOVA或X²检验，组间差异以P＜0.05或P＜0.01判断。

(3)实验结果

腹腔注射东莨菪碱(4.5mg/kg)20min后，模型组小鼠记忆获得受损，表现为在中心区域的活动路程和时间均增加而没有找到平台，在周围区域的活动路程和时间明显增加，在站台周围范围I活动的路程和时间明显缩短，以及找到平台的数目明显减少，且与空白对照相比P值＜0.01；阳性对照药物多奈哌齐显示了良好的改善动物空间记忆障碍的作用，与模型组动物比较上述指标的统计学检验P值＜0.01；受试化合物伪酸枣仁苷元150mg/kg、50mg/kg及5mg/kg均表现了一定得改善动物空间记忆障碍的作用，参数指标与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)；伪酸枣仁苷元15mg/kg剂量组表现非常有效的改善动物空间记忆障碍作用，找到平台的动物数目明显增加，在中心区域的活动路程和时间明显缩短，所有指标的统计学检验P值均＜0.01；伪酸枣仁苷元所有剂量组呈现了良好的量效关系。结果见表1、表2，图1

表1.第7天正式实验：小鼠在中心区域的活动路程和时间(MEAN±SD)

注：#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

表2.第7天正式实验：小鼠上平台只数和潜伏期(MEAN±SD)

注：#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

结论

口服15mg/kg的伪酸枣仁苷元对由东莨菪碱所造成的获得性记忆障碍小鼠的空间记忆障碍有改善作用，其作用与腹腔注射0.9mg/kg多奈哌齐相近；口服150mg/kg、50mg/kg、5mg/kg三个剂量也表现了一定的改善作用。

实施例3伪酸枣仁苷元对局灶性脑缺血再灌注损伤动物的保护作用

实验原理

采用线栓法阻断大鼠右侧大脑总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及其分支动脉及右侧颈内动脉(ICA)，阻断2小时后再灌注，可造成脑组织局部缺血损伤，特别是大鼠大脑海马区和大脑皮层CA1区的损伤，从而很好的模拟血管性痴呆症状。

2、实验材料

实验动物

品系：Sprague-Dawley rats

性别：雄性

体重：250～300g

来源：上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司

动物合格证号：SCXK(沪)2008-0016

受试药物

名称：伪酸枣仁苷元

来源：实施例1制备

性状：白色粉末，溶于水

本实验根据大小鼠换算剂量设计了3个预试剂量：35mg/kg、15mg/kg、5mg/kg。

伪酸枣仁苷元的配置：

伪酸枣仁苷元高剂量(35mg/kg):75mg→生理盐水16ml、每只2ml。

伪酸枣仁苷元中剂量(15mg/kg):30mg→生理盐水16ml、每只2ml。

伪酸枣仁苷元低剂量(5mg/kg):5mg→生理盐水16ml、每只2ml。

试剂与材料

材料

名称：MCAO栓线

来源：北京沙东生物科技有限公司

描述：直径0.26mm，线长30mm

Sony3000数码照相机

试剂

名称：2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride

分子式：C₁₉H₁₅CIN

来源：sigma公司

(2)方法

动物分组及给药方案

150只雄性SD大鼠随机分为5组，每组30只：

组1.假手术对照组：生理盐水(N.S)

组2.模型组：生理盐水(N.S)

组3.伪酸枣仁苷元高剂量组：35mg/kg

组4.伪酸枣仁苷元中剂量组：15mg/kg

组5.伪酸枣仁苷元低剂量组：5mg/kg

实验方案

按照分组提前给药3天，手术当天给药40分钟后，10％水合氯醛(350mg/kg)ip麻醉大鼠，仰卧位固定，行颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)并游离，向上分离颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，结扎ECA。在颈外动脉下方小心分离出颈内动脉的小分支(翼突腭动脉)，于分支下穿线、结扎。在已分离的CCA近心端用动脉夹阻断血流，远心端用一手术线轻轻拉起，于CCA上剪一小切口。将栓线由颈总动脉小口插入，向颈内动脉入颅方向推进。从颈总动脉分叉起向内推进17～20mm感到有阻力即停止，即达到大脑前动脉，此时供应大脑中动脉的所有血供均被阻断。用手术线结扎固定鱼线，最后近心端用另一根手术线结扎，缝合皮肤，完成大脑中动脉缺血模型的制备。2h后将栓塞线轻缓外抽，使其头端回到近心端的结扎处，实现再灌注。假手术组除不栓线外均同模型组。

手术完成后继续灌胃给药3天进行治疗，治疗完成后进行脑缺血程度及药效指标评价；评价指标及标准如下：

1)神经症状及体征的评价标准为：0分为未见神经症状；1分为不能完全伸展左侧前爪；2分为大鼠置于光滑平面上，推手术侧肩部向对侧移动时阻力降低；3分为大鼠自由行走时向左侧环转、转圈或倾倒；4分为软瘫，肢体无自由活动。积分越高，说明大鼠行为障碍越严重。

2)脑梗死体积测定

治疗结束后处死大鼠，取出大脑组织，做脑切片，采用2％TTC(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride)染色显色梗死面积(粉红色为正常区域，白色为梗死区)。梗死脑组织的测定方法是：采用sony3000数码相机将每片脑梗死区面积和全脑截面积拍照，输入电脑，用图像处理软件Image J计算梗死面积，再乘以每片全脑厚度，算出梗死体积占总脑体积比率作为指标。

3)形态学指标

HE染色观察：将大鼠大脑制成石蜡切片，HE染色，普通HE染色光镜下观测比较各组间梗死区或正常区细胞状态、血管情况等。

(4)实验结果

手术后模型组大鼠神经功能损伤比较严重，大鼠表现出明显的运动功能障碍，提鼠尾可见其左前肢内收，行走时偏向左侧，神经功能评分明显升高；与模型组比较，伪酸枣仁苷元的35mg/kg、15mg/kg、5mg/kg剂量组脑缺血再灌注损伤大鼠的行为障碍均能得到不同程度改善。模型组缺血程度比较严重，缺血面积明显比伪酸枣仁苷元的各剂量组大。病理组织切片发现手术造模后梗死区间质内大小不等的空泡、血管扩张、脑组织水肿、部分神经细胞核固缩、深染、部分神经细胞溶解、胞浆稀松、细胞界限不清；伪酸枣仁苷元治疗组显著改善这些现象，其中中剂量组(15mg/kg)作用最为明显。结果见表3、图2

表3、伪酸枣仁苷元对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

注：#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

结论

通过神经功能评价、脑缺血体积的计算以及病理组织切片观察，结果显示伪酸枣仁苷元各剂量组对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定得保护作用，且中剂量15mg/kg作用最为有效。

实施例4伪酸枣仁苷元对APP/PS1双转基因小鼠空间记忆障碍的影响

实验原理

采用足龄(24周龄)APP/PS1双转基因小鼠，每天给予伪酸枣仁苷元受试药物，连续灌胃给药60天，60天后采用Morris水迷宫(Morriswater maze)检测，观察伪酸枣仁苷元对APP/PS1双转基因老年痴呆小鼠空间记忆的效果。

2、实验材料

实验动物

品系：APP/PS1双转基因小鼠

性别：雌雄性各半

体重：25～30g

来源：北京维通利华动物有限责任公司

品系：C₅₇小鼠

性别：雌雄性各半

体重：25～30g

来源：上海斯莱克动物有限责任公司

受试药物

名称：伪酸枣仁苷元

来源：实施例1制备得到

性状：白色粉末，溶于水

本实验根据大小鼠换算剂量设计了2个预试剂量：50mg/kg、15mg/kg。

伪酸枣仁苷元的配置：

伪酸枣仁苷元高剂量(50mg/kg):15mg→生理盐水6ml、每只0.6ml。

伪酸枣仁苷元中剂量(15mg/kg):4.5mg→生理盐水6ml、每只0.6ml。

仪器

名称：DigBehv动物行为分析系统；Morris水迷宫视频分析系统

来源：上海吉量软件科技有限公司

(2)实验方法

动物分组及给药方案

APP/PS1双转基因小鼠雌雄各半随机分为3组，每组9只；10只C₅₇小鼠作为空白对照组；共4组。

组1.空白对照组：生理盐水(N.S)

组2.模型组：生理盐水(N.S)

组3.伪酸枣仁苷元高剂量组：50mg/kg

组4.伪酸枣仁苷元低剂量组：15mg/kg

实验方案

1)训练前一天将小鼠放入水迷宫中自由游泳2min以适应环境。

2)水迷宫中提前放入水中、使水温调节至室温(20-25℃)，加入白色背景颜料。ICR小鼠伪酸枣仁苷元灌胃给药，空白与模型组给予相同体积的生理盐水。给药40分钟后进行适应性训练、每天训练2次：在两个象限的两个标记点将各小鼠鼻朝宫壁方向轻放入水中，70s内训练其找到平台的能力，连续训练5天、第6天正式实验。训练过程中，70s内找到平台者，取出小鼠擦干、放回；在70s内未找到平台者，引导其至平台，滞留30s后再捞出擦干、放回。

训练至第5天剔除未学会的小鼠，训练期间也需记录训练结果包括爬上平台所需时间及路程。

3)正式实验时，撤离平台，提前40分钟分别给予生理盐水、伪酸枣仁苷元药物，给药40分钟后进行测试。

4)记录小鼠在平台所在象限(IV象限)所滞留的时间(潜伏期)、路程等指标。

最后一天的实验数据采用以平均值±标准差(MEAN±SD)表示，数据差异统计采用单因素方差分析ANOVA或X²检验，组间差异以P＜0.05或P＜0.01判断。

(3)结果

模型组APP/PS1双转基因小鼠与空白对照组的正常小鼠比较，在中心区域的活动路程和时间、小鼠在IV象限(平台所在区域)活动的路程和时间以及穿越平台的次数均有所缩短，而校正后站台接近估计平均值有所增加，说明APP/PS1双转基因小鼠的空间记忆障碍模型是非常成功的。而50mg/kg、15mg/kg的伪酸枣仁苷元显示了良好的改善APP/PS1双转基因小鼠的空间记忆障碍的作用，上述指标与模型组相比，有显著差异，且大多差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；两组剂量组之间显现了一定得剂量依赖关系。结果见表4、表5、表6及图3、图4。

表4.各组小鼠撤台后在中心区域的活动路程和时间(MEAN±SD)

注：#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

表5.各组小鼠撤台后在第IV象限(平台所在区域)的活动路程和时间(MEAN±SD)

注：#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

表6.各组小鼠撤台后穿越平台次数和站台接近平均值(MEAN±SD)

注：#P＜0.05，##P＜0.01 与空白对照组比较

*P＜0.05，**P＜0.01 与模型组比较

结论

50mg/kg、15mg/kg的伪酸枣仁苷元对APP/PS1双转基因小鼠的记忆障碍有明显的改善作用，其中15mg/kg的改善作用强度更佳。

Claims

1.伪酸枣仁苷元在制备制备抗老年痴呆药物中的应用，其特征在于，所述伪酸枣仁苷元以下列结构式表示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述伪酸枣仁苷元通过下列方法制备得到：

假马齿苋药材，粉碎，水煎煮三次，合并提取液，过滤除去沉淀，上清液通过大孔吸附树脂柱，依次以去离子水、0.2％的氢氧化钠、40％乙醇、75％乙醇、95％乙醇洗脱；取75％乙醇洗脱液，蒸去乙醇得干燥提取物假马齿苋总皂苷；取假马齿苋总皂苷，加水浸泡，加热煮沸，冷却后，加入阿拉伯糖苷酶溶液，65℃搅拌酶解，酶解结束后加热回流提取，收集提取液，滤过回收溶剂，即得伪酸枣仁苷元粗品；酸枣仁苷元粗品过葡聚糖凝胶色谱，甲醇洗脱，得到精制伪酸枣仁苷元。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为由伪酸枣仁苷元作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。