CN102414317A - 具有减少的金属肽酶表达、适于重组多肽产生的突变细胞 - Google Patents
具有减少的金属肽酶表达、适于重组多肽产生的突变细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102414317A CN102414317A CN2010800185987A CN201080018598A CN102414317A CN 102414317 A CN102414317 A CN 102414317A CN 2010800185987 A CN2010800185987 A CN 2010800185987A CN 201080018598 A CN201080018598 A CN 201080018598A CN 102414317 A CN102414317 A CN 102414317A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- cell
- seq
- polypeptide
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 134
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 132
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 130
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 163
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 62
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 50
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 50
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 50
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 50
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 49
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 39
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 29
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 19
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 8
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 241001328122 Bacillus clausii Species 0.000 claims description 7
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 claims description 7
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 claims description 7
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 claims description 6
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims description 6
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 6
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 6
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 6
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 6
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 4
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 claims description 4
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 claims description 4
- 241000194109 Paenibacillus lautus Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 32
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 16
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 15
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 15
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 101100055551 Bacillus licheniformis amyS gene Proteins 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 14
- -1 100 to 10 Chemical class 0.000 description 13
- 101100216056 Lactobacillus amylovorus amyL gene Proteins 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 10
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 10
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 10
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 10
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 9
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 9
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 7
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 7
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100025643 60S ribosomal protein L12 Human genes 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 6
- 101100063932 Micromonospora echinospora gacH gene Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N alpha-maltohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 101150092851 gntP gene Proteins 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N malto-hexaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 5
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 5
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 4
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 4
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 4
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 4
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 108010075550 termamyl Proteins 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 241000221779 Fusarium sambucinum Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 241001313536 Thermothelomyces thermophila Species 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 101150039703 amyL gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 101150102059 cry3Aa gene Proteins 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 101150067544 sigF gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 description 2
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 2
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 2
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 2
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 2
- 241000567163 Fusarium cerealis Species 0.000 description 2
- 241000146406 Fusarium heterosporum Species 0.000 description 2
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 241000589614 Pseudomonas stutzeri Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 2
- 241001494489 Thielavia Species 0.000 description 2
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940005348 bacillus firmus Drugs 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 2
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 101150070305 prsA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000019710 soybean protein Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBSUMVZKDLDAEK-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 IBSUMVZKDLDAEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 description 1
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 1
- 241000498991 Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580 Species 0.000 description 1
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 101100059011 Bacillus subtilis (strain 168) capB gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026883 Bacteria AprE Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 101710125870 Cell wall-associated protease Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016559 DNA Primase Human genes 0.000 description 1
- 108010092681 DNA Primase Proteins 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000145614 Fusarium bactridioides Species 0.000 description 1
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 1
- 241001112697 Fusarium reticulatum Species 0.000 description 1
- 241001014439 Fusarium sarcochroum Species 0.000 description 1
- 241000223192 Fusarium sporotrichioides Species 0.000 description 1
- 241001465753 Fusarium torulosum Species 0.000 description 1
- 241000567178 Fusarium venenatum Species 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000411968 Ilyobacter Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241001344133 Magnaporthe Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N Methoxyamine Chemical compound CON GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000233892 Neocallimastix Species 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001072230 Oceanobacillus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000235379 Piromyces Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000168225 Pseudomonas alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000589630 Pseudomonas pseudoalcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 241000577556 Pseudomonas wisconsinensis Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000001006 Saccharomyces cerevisiae var diastaticus Nutrition 0.000 description 1
- 244000206963 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Species 0.000 description 1
- 241000204893 Saccharomyces douglasii Species 0.000 description 1
- 241001407717 Saccharomyces norbensis Species 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000222480 Schizophyllum Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228341 Talaromyces Species 0.000 description 1
- 241001540751 Talaromyces ruber Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001468159 Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes Species 0.000 description 1
- 241000228178 Thermoascus Species 0.000 description 1
- 241000223257 Thermomyces Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 241000378866 Trichoderma koningii Species 0.000 description 1
- 241000223262 Trichoderma longibrachiatum Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N UNPD55895 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084631 acetolactate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 101150019439 aldB gene Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 108010004902 lactose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 101150103033 lpxB gene Proteins 0.000 description 1
- UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N malto-tetraose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N maltotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 101150108007 prs gene Proteins 0.000 description 1
- 101150086435 prs1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
产生至少一种目标异源多肽的突变的细菌细胞，其中所述细胞与其他为同基因的但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平；用于产生所述突变细胞的方法；和用于使用所述突变细胞产生目标多肽的方法。SEQ ID NO：2代表推定的金属蛋白酶。
Description
序列表
本发明包含序列表。
技术领域
本发明涉及产生至少一种目标异源多肽的突变的细菌细胞，其中所述细胞与其他为同基因的但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平；用于产生所述突变细胞的方法；和用于使用所述突变细胞产生目标多肽的方法。
背景技术
多肽，具体而言，酶的重组工业生产，是竞争激烈的领域，其中技术水平非常之高。芽孢杆菌属(Bacillus)中多肽的工业产生尤其受到完善的研究，且目前而言，在该领域甚至稳步改善多肽产率或生产力也是需要的。
长年以来已知在芽孢杆菌属中胞外和细胞壁相关蛋白酶的失活在许多情况下导致改善的产物稳定性并因此导致更佳的产率(WO 1992/016642)。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600株中失活了多至六种的蛋白酶(Wu等1991.Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a straindeficient in six extracellular proteases.J Bacteriol 173(16)：4952-4958)。
SEQ ID NO：1中所示的开读框(ORF)编码表示为BL00829的推定的金属蛋白酶，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2(NCBI“Entrez Protein”或“EntrezGene”登录号：YP_080660)，其为最初从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580的基因组测序中由Rey等在2004：Complete genome sequence ofthe industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closelyrelated Bacillus species，Genome Biol.(10)：R77所预测的。据我们所知，在此之后尚未公开任何关于该预测的ORF或推定的编码的金属蛋白酶活性的研究。
发明内容
在几种地衣芽孢杆菌酶产生株中SEQ ID NO：1中所示的推定开读框的失活导致显著改善的酶产率，如实施例中所示。宿主株已经失活了两个主要的胞外蛋白酶，即碱性和中性蛋白酶(apr，npr)，以及C-组分(BLC)。这些失活目前(by far)消除了胞外细胞膜活性的主要部分(＞90％)。
预期失活仍旧另一个蛋白酶会至多(at best)提供仅为非常次要的改善。鉴于此，如实施例中所见，失活本发明的推定的金属蛋白酶导致如此显著改善的产物产率是非常令人惊讶的。
相应地，在第一个方面，本发明涉及突变的细菌细胞，其产生至少一种目标异源多肽，其中所述细胞与其他为同基因但非突变的细胞(otherwise isogenicbut non-mutated cell)相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，或优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平。
本发明的第二个方面涉及用于构建突变的细菌细胞的方法，所述方法包括下述步骤：a)使细菌细胞突变；和b)选择突变细胞，其与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，或优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平。
本发明的最后一个方面涉及用于产生目标异源多肽的方法，所述方法包括下述步骤：a)培养产生至少一种目标异源多肽的突变细菌细胞，其中所述突变细胞与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ IDNO：2中所示序列至少70％相同，或优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平，和b)分离目标多肽。
附图说明
图1显示质粒pMDT081的概略图。
图2显示质粒pAN829的概略图。
图3显示质粒pMOL2598的概略图。
图4显示质粒pMOL2606的概略图。
图5显示质粒pAN369的概略图。
图6显示质粒pAN405的概略图。
定义
分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(substantially)纯的形式”，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过以下实现：通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)的Needle程序(优选3.0.0版或更高版本)中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上文)的Needle程序(优选3.0.0版或更高版本)中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计优选至多10％，更优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计优选至少90％纯，更优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
编码序列：当用于本文时术语“编码序列”或“开读框”意指直接指定其蛋白产物氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最低限度，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。
修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码此种多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。
杂交：就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的多肽编码序列；SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。在一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其至少100bp的亚序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在55℃(中严格性)，更优选至少在60℃(中-高严格性)，甚至更优选至少在65℃(高严格性)，并且最优选至少在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
突变：能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后进行相应的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。亦可采用通过移码或部分甚至完全缺失进行的标准基因破坏(gene disruption)。
本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，或由在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变的核苷酸组成，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ IDNO：2的成熟多肽。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，从而实现从此种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从芽孢杆菌属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可为例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。
可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。此种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。
可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变(其可为特异性的或随机的)可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过对所述DNA序列进行PCR产生的诱变来进行。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。
通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(几个)核苷酸或其转录或翻译所需的调控元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以完成此种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。
消除或减少核苷酸序列通过细胞的表达的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代内源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化体。在一个特别优选的方面，用选择性标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。
或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。由此在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，减少或消除翻译的蛋白质的量。
本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。
这样生成的多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及生产天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养所述突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。
表达载体：本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含编码目标多肽的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在构建表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而使得该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够实现核苷酸序列的表达。载体的选择通常取决于载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒，或者两个或更多个共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA)的载体或质粒，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。
本发明的载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制的元件。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或任何其它载体元件以通过同源或非同源重组整合入基因组。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，所述序列用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的目标序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
宿主细胞：本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，其有利地用于所述多肽的重组产生。将包含本发明多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。
产生方法：本发明还涉及用于产生重组多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养突变的细菌细胞，所述细胞产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是芽孢杆菌属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是地衣芽孢杆菌。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于确定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
发明的具体描述
微生物
本发明的微生物(微生物菌株或细胞)可获得自任何属的微生物，如那些下述列举的细菌来源。在一个优选实施方案中，本发明第一个方面的细胞是原核细胞，优选革兰氏阳性细胞，更优选枯草杆菌属细胞，且最优选嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。
突变细胞
在本发明的一个优选实施方案中，所述包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，或优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽是金属肽酶。
在另一个优选实施方案中，本发明的突变细胞在编码多肽的基因中突变，所述多肽包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列；优选本发明的突变细胞在具有与SEQ ID NO：1中所示序列至少70％相同，优选与SEQ ID NO：1至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸中突变。
优选地，本发明的细胞在至少一个多核苷酸中突变，其中所述至少一个多核苷酸具有至少100bp大小的亚序列在中等严格杂交条件下，优选在中-高严格条件下，或更优选在高严格条件与具有SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸或其相应互补序列杂交。
在一个优选实施方案中，本发明的突变细胞是其中编码多肽的基因部分或完全从染色体缺失，或包含至少一个移码突变或无义突变的突变细胞，所述多肽包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列。
这些突变的一个优选结果是，与其他为同基因但非突变的细胞相比，本发明的细胞具有至少两倍减少的多肽表达水平，所述多肽包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列；或所述细胞与其他为同基因但非突变的细胞相比，不具有可测量的该多肽表达。
目标多肽
在一个优选实施方案中，目标多肽可获得自细菌或真菌来源。
例如，目标多肽可获得自革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属菌株，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株；或链霉菌属菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)菌株；或来自革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌或假单胞菌属菌种。
目标多肽可获得自真菌来源，例如，来自酵母菌株如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)菌株，例如，卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces ovifoirmis)菌株。
目标多肽可获得自丝状真菌菌株，如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)菌株，具体而言目标多肽可获得自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
就本发明而言，用于本文与给定的来源相连的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。
目标多肽可为肽或蛋白质。本发明优选的肽包含2至100个氨基酸；优选10至80个氨基酸；更优选15至60个氨基酸；甚至更优选15至40个氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述蛋白质是酶，特别是水解酶(根据EnzymeNomenclature；Recommendations of the Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry为分类EC 3)。在一个具体的优选实施方案中，优选下述的水解酶：
蛋白酶
合适的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物来源的。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。所述蛋白酶可为酸性蛋白酶，丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来源于芽孢杆菌属的，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270和WO94/25583的镰孢属蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例为描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中的变体，特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的商业上可获得的蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM(Novozymes A/S)、MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OXPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶
合适的脂肪酶包括那些细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(Humicola)(同义词嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如描述于EP 258 068和EP 305 216的来自疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))或如描述于WO96/13580的来自特异腐质霉(H.insolens)的脂肪酶，或假单胞菌属脂肪酶，例如来自如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)的脂肪酶，芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。
其他的实例为脂肪酶变体，如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。
优选的商业上可获得的脂肪酶包括LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(Novozymes A/S)。
淀粉酶
合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如来自特定地衣芽孢杆菌菌株的淀粉酶，更加详细地描述于GB 1,296,839。
有用的淀粉酶的实例为WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、WO 97/43424和WO 01/66712中描述的变体，特别是在一个或多个下述位置有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商业上可获得的淀粉酶为DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYL LCTM、TERMAMYL SCTM、LIQUIZYME-XTM和BANTM(Novozymes A/S)、RAPIDASETM和PURASTARTM(来自Genencor International Inc.)。
纤维素酶
合适的纤维素酶包括那些细菌或真菌来源的。包括化学修饰的和蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如US 4,435,307、US5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中公开的产自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶为具有护色益处(colour care benefit)的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例为EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。
商业上可获得的纤维素酶包括CELLUZYMETM、CAREZYMETM和CAREZYME CORETM(Novozymes A/S)、CLAZINASETM和PURADAX HATM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
氧化还原酶
根据本发明可处理的氧化还原酶包括过氧化物酶和氧化酶如漆酶和过氧化氢酶。
其他优选的水解酶为糖水解酶(carbohydrolase)包括MANNAWAYTM。其他优选的酶为转移酶、裂合酶、异构酶和连接酶。
用于目标多肽的表达构建体
在一个优选实施方案中，本发明的细胞包含一个或多个编码所述至少一个异源多肽的多核苷酸的染色体整合的拷贝。
优选本发明所述至少一个异源多肽由从至少一个异源启动子转录的多核苷酸编码；优选所述至少一个启动子包含人工启动子。合适的启动子构建体描述于WO 93/10249，其通过提述以其整体并入本文。
此外，优选的人工启动子包含一个或多个mRNA稳定序列，优选来源于cryIIIa启动子。合适的构建体描述于WO 99/43835，其通过提述以其整体并入本文。
发酵
本发明可用于任何工业规模的发酵，例如用于任何具有至少50升，优选至少100升，更优选至少500升，甚至更优选至少1000升，特别是至少5000升的培养基的发酵。
所述细菌菌株或细胞可通过本领域任何已知方法发酵。发酵培养基可为包含复合氮源和/或碳源的复合培养基，如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米浆、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、马铃薯蛋白、马铃薯蛋白水解物、糖蜜等。所述发酵培养基可为化学限定的培养基，例如如WO 98/37179中所限定的。
所述发酵可作为分批、补料分批、重复补料分批(repeated fed-batch)或连续发酵工艺进行。
在分批补料工艺中，在发酵起始之前，将包含一种或多种结构和/或催化元件的化合物的部分添加至培养基，或不添加任何化合物，相应地，该包含一种或多种结构和/或催化元件的化合物剩余部分或全部在发酵工艺过程中补料。选用于补料的化合物可一同补料或彼此分开补料至发酵工艺。
在重复分批补料或连续发酵工艺中，在发酵过程中额外补料完全的起始培养基。所述起始培养基可以与所述结构元件补料一同或分开补料。在重复分批补料工艺中，按间隔去除包含生物质的发酵液部分，而在连续工艺中，发酵液的部分的去除连续进行。因此，发酵工艺是根据取出的发酵液的量补充部分新鲜培养基。
在本发明的一个优选实施方案中，优选补料分批、重复补料分批工艺或连续发酵工艺。
目标多肽的回收
本发明的进一步方面涉及发酵液的下游加工。在发酵工艺结束之后，可使用针对目标多肽开发的标准技术，从发酵液回收目标多肽。待施用的相关下游加工技术取决于目标多肽的特性。
用于从发酵液回收目标多肽的方法通常会涉及(但不限于)下述步骤中的一些或全部：
1)预处理发酵液(例如絮凝)
2)从发酵液去除细胞和其他固体材料(初次分离)
3)过滤
4)浓缩
5)过滤
6)稳定和标准化
除了上述列举的单元操作，可施用多种其他回收方法和步骤，例如pH调整，温度变化，结晶，用活性炭处理包含目标多肽的溶液，和使用多种吸附剂。
通过使用本发明的方法，当通过在发酵过程中添加例如MPG使晶体形成减少或消除时，目标多肽在回收中的产率更高。
本发明进一步在下述实施例中进行说明，其并不旨在以任何方式限制要求保护的本发明的范围。
实施例
培养基
LB琼脂，TY buillon培养基和BPX摇瓶培养基均描述于WO 94/14968。PS-1摇瓶培养基(10％蔗糖，4％大豆粉，1％Na2SO4·12H2O，0.5％I CaCO3和0.01％Pluronic Acid)描述于美国专利6,255,076号的实施例28。
菌株和供体生物
枯草芽孢杆菌PL1801
该菌株为具有破坏的apr和npr基因的枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990)Cloning of aldB，which encodes alpha-acetolactate decarboxylase，an exoenzymefrom i Bacillus brevis.J.Bacteriol.，172，4315-4321)。
地衣芽孢杆菌PP1962
该菌株是WO 2005/123915(Novozymes)中公开的菌株MDT223的衍生物，具有下述其他修饰，描述于三个步骤：
步骤1：插入地衣芽孢杆菌L-氨肽酶基因以替代MDT223中amyL基因座处存在的蛋白酶基因。如WO 1996/029418(Novozymes)中所述，通过接合导入整合载体，其携带来自地衣芽孢杆菌的L-氨肽酶基因，其侧翼为异源串联物(tandem)/蛋白酶基因上游的cryIIIa启动子5’区和3’amyL区，将其整合入并从染色体切出。
步骤2：将串联物/cryIIIA启动子，其公开于WO 1999/043835(Novozymes)，其后为大肠杆菌rrnB转录终止子，插入gntP基因座，从而构建了gntP缺失。使用质粒pMDT081(SEQ ID NO：3；图1)以供整合入地衣芽孢杆菌的染色体上的gntP基因座。
步骤3：修饰L12基因的核糖体结合位点(RBS)以提供L12蛋白表达的强减少。如WO 1996/029418(Novozymes)中所述，导入具有变体核糖体结合位点的整合载体质粒，并通过整合和切出将变体基因插入染色体，替代天然的L12基因。分离了所得的红霉素敏感菌株，其包含变体L12基因。L12 RBS的最终变化如下所述(下划线所示碱基为L12基因的起始密码子)：
(SEQ ID NO：4)野生型序列：atgaaagaggaggaatgaaataatg
(SEQ ID NO：5)突变的EF变体：atgaaagacgcgtaatgaaataatg
地衣芽孢杆菌PL4198
该菌株是描述于WO 2005/123915中的菌株MDT223的衍生物，具有下述逐步添加的修饰：
步骤1：将串联物/cryIIIA启动子，其公开于WO 1999/043835(Novozymes)，其后为大肠杆菌rrnB转录终止子，插入gntP基因座，从而构建gntP缺失。使用质粒pMDT081(SEQ ID NO：3)以供整合在地衣芽孢杆菌染色体上的gntP基因座。
步骤2：修饰L12基因的核糖体结合位点(RBS)以提供L12蛋白表达的强减少。如上所述，导入具有变体核糖体结合位点的整合载体质粒，并通过整合和切出将变体基因插入染色体，替代天然的L12基因。分离了所得的红霉素敏感菌株，其包含变体L12基因。对于PP1962菌株，L12 RBS的最终变化已示于步骤1)。
步骤3：插入地衣芽孢杆菌amyL基因以替代MDT223中amyL基因座处存在的JP170蛋白酶基因。如WO 1996/029418(Novozymes)中所述，通过接合导入整合载体质粒，其携带来自地衣芽孢杆菌的amyL基因，其侧翼为异源串联物/蛋白酶基因上游的cryIIIa启动子5’区和3’amyL区，将其整合入并从染色体切出。
步骤4：插入修饰的枯草芽孢杆菌aprE蛋白酶基因(SEQ ID NO：6)以替代在步骤3中插入的amyL基因。如上所述，通过结合导入整合载体质粒，其携带所述蛋白酶基因，该基因侧翼为5’串联物/cryIIIA和amyL3’区段，将其整合入并从染色体切出。
步骤5：通过缺失765bp spoIIAC基因的核苷酸70至436来使spoIIAC基因(sigF)失活。缺失是通过标准方法使用温度敏感性质粒和同源重组实施的。
步骤6：通过缺失从基因pgsB中的核苷酸607至pgsAA基因中的核苷酸180(两个核苷酸均包含在内)的染色体区来使pgsB-、pgsC-和pgsAA-基因失活。缺失是通过标准方法使用温度敏感性质粒和同源重组实施的。
质粒pAN829
编码地衣芽孢杆菌推定的金属肽酶BL00829的基因的缺失型式是使用通过重叠延伸的剪切(SOE)通过PCR来构建的(Horton等，1989，Gene77(1)：61-68)。将BL00829基因的5’和3’区从地衣芽孢杆菌SJ1904DNA通过对于5’BL00829片段使用引物AN354(其导入5’sacII限制位点)和引物AN355而对于BL008293’片段使用引物AN356和AN357(其导入NotI限制位点)进行PCR扩增。引物序列如下所示：
引物AN354(SEQ ID NO：7)：ttgcacccgcggatacgagggagtggcgatgt
引物AN355(SEQ ID NO：8)：gaatgaataaaagtgaagcccaagagaaggctttttcacaagatta
引物AN356(SEQ ID NO：9)：taatcttgtgaaaaagccttctcttgggcttcacttttattcattc
引物AN357(SEQ ID NO：10)：aagcatgcggccgcgatctttctgcatcatatgc
PCR扩增是在标准条件下运行，并使用1％琼脂糖-0.5X TBE凝胶显影具有预期大小639bp(5’片段)和648bp(3’片段)的产物。最终SOE片段命名为829Δ14(SEQ ID NO：11)，并根据Horton等，1989使用引物对AN354和AN357生成。存在于SOE产物829Δ14上的BL00829基因的截短型式编码14aa的多肽，其缺失了天然BL00829蛋白中间的138aa。质粒pAN829(SEQ ID NO：12；图2)是通过将用限制酶sacII和NotI切割的PCR产物829Δ14连接至包含pE194的温度敏感性起点的载体质粒来构建的。该质粒用于通过双交换事件从地衣芽孢杆菌染色体缺失BL00829基因。对于合适宿主菌株和整合步骤的进一步描述可见于WO 2005/123915。
实施例1.突变的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶宿主的构建
该实施例描述了包含两个拷贝的编码分泌的α-淀粉酶的基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建。然后通过在编码推定的金属蛋白酶BL00829的基因中导入缺失来构建该菌株的突变体。
用于该实施例的α-淀粉酶为最初由嗜碱的芽孢杆菌菌种JP170产生的JE1α-淀粉酶多肽。这是包含于质粒pTVB115，描述于WO99/23211的基因。该特定基因在下文中会称作“je1”。
MOL2650：二拷贝je1α-淀粉酶菌株
如WO2005/123915的实施例6中所述，将je1基因转移至设计以允许α-淀粉酶表达盒整合入地衣芽孢杆菌菌株染色体的整合载体，所述整合载体已经含有整合在amyL基因座和xylA基因座的人工串联物/cryIIIA启动子。这是通过在该启动子的cryIIIA稳定子区(stabilizer region)和在amyL和xylA的下游区段分别使用双重同源重组来完成的。对于合适宿主菌株和整合步骤的进一步描述可见于WO 2005/123915。
分别用于amyL和xylA基因座的整合载体pMOL2598(SEQ ID NO：13；图3)和pMOL2606(SEQ ID NO：14；图4)是通过将编码JE1淀粉酶的DNA片段插入pE194衍生载体来构建的。这些质粒亦可通过从已知的标准载体如pE194克隆PCR片段或连接合成的DNA片段来制备。
将载体pMOL2598转化入枯草芽孢杆菌PL1801感受态细胞，在30℃就红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。所得的转化体为MOL2598(PL1801/pMOL2598)。然后通过感受态(competence)、电穿孔或接合将该质粒重新转化入上述的地衣芽孢杆菌PP1962，并通过双重同源重组用je1淀粉酶基因替代L-氨肽酶基因。所得的菌株分离为MOL2614。
将载体pMOL2606亦转化入枯草芽孢杆菌PL1801感受态细胞，在30℃就红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。所得的质粒为MOL2608(PL1801/pMOL2606)。然后通过感受态、电穿孔或接合将该质粒重新转化入上述的地衣芽孢杆菌MOL2614，并通过双重同源重组将je1基因整合入xyl基因座。所得的菌株分离为MOL2650。
最终的MOL2650菌株具有从描述于WO2005/123915实施例6的强启动子P17表达的二拷贝的je1淀粉酶基因。该整合载体亦在下述位置含有来自地衣芽孢杆菌的prsA基因，所述位置将克隆的bmy1基因置于双顺反子操纵子中的prsA的上游。拷贝之一位于amyL基因座，而第二拷贝位于xyl基因座。如专利WO2005/123915中所述，该菌株进一步在编码蛋白酶AprE和C-组分的基因中有缺失。此外，L12基因的核糖体结合位点经修饰，从而导致L12蛋白表达的强减少(见上)。
AN407：突变的MOL2650菌株
通过接合将质粒pAN829转移至地衣芽孢杆菌MOL2650(如上所述)，并通过双重同源重组用截短的BL00829基因t829替代BL00829基因。所得的菌株分离为AN407。
除了编码推定的金属蛋白酶BL00829的基因通过缺失突变之外，AN407菌株与MOL2650菌株同基因。
实施例2突变的地衣芽孢杆菌β-淀粉酶宿主的构建
该实施例描述了两个包含编码分泌的β-淀粉酶的基因的地衣芽孢杆菌菌株；除了其一通过在编码推定的金属蛋白酶BL00829的基因中缺失而突变之外，这两个菌株是同基因的。用于该实施例的β-淀粉酶是最初由嗜热细菌热产硫磺梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)产生的β-淀粉酶，其用源自地衣芽孢杆菌amyL的异源分泌信号序列替代天然信号序列。该特定杂合基因在下文中会称作“bmy1”，且其核苷酸序列示于SEQ ID NO：15。
AN411：二拷贝bmy1β-淀粉酶菌株
如WO2005/123915的实施例6中所述，将bmy1基因(SEQ ID NO：15)转移至设计以允许β-淀粉酶表达盒整合入地衣芽孢杆菌菌株染色体的整合载体，所述染色体已经含有整合在amyL基因座和xylA基因座的人工串联物/cryIIIA启动子。这是通过在cryIIIA稳定子区和在amyL和xylA的下游区段分别使用双重同源重组来完成的。对于合适宿主菌株和整合步骤的进一步描述可见于WO 2005/123915。
分别用于amyL和xylA基因座的整合载体pAN369(SEQ ID NO：16；图5)和pAN405(SEQ ID NO：17；图6)是通过将编码bmy1β-淀粉酶的DNA片段插入pE194衍生载体来构建的。这些质粒亦可通过从已知的标准载体如pE194克隆PCR片段或连接合成DNA片段来制备。
将载体pAN369转化入枯草芽孢杆菌PL1801感受态细胞，在30℃就红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。所得的转化体为AN369(PL1801/pAN369)。然后通过感受态、电穿孔或接合将该质粒重新转化入上述的地衣芽孢杆菌PL4198菌株，并通过双重同源重组用bmy1β-淀粉酶基因替代蛋白酶基因。所得的菌株分离为AN374。
将载体pAN405亦转化入枯草芽孢杆菌PL1801感受态细胞，在30℃就红霉素抗性(2微克/ml)进行选择。所得的转化体为AN405(PL1801/pAN405)。然后通过感受态、电穿孔或接合将该质粒重新转化入上述的地衣芽孢杆菌AN374，并通过双重同源重组将bmy1基因整合入xyl基因座。所得的菌株分离为AN411。
最终的AN411菌株具有从描述于WO2005/123915实施例6的强启动子P17表达的二拷贝的bmy1β-淀粉酶基因。拷贝之一位于amyL基因座，而第二拷贝位于xyl基因座。此外，该菌株在编码蛋白酶AprE和C组分的基因中有缺失，如专利WO2005/123915中所述。此外，L12基因的核糖体结合位点经修饰，从而导致L12蛋白表达的强减少(见上)。
AN420：突变的AN411菌株
通过接合将质粒pAN829转移至地衣芽孢杆菌AN411(如上所述)，并通过双重同源重组用截短型式t829替代SEQ ID NO：1的推定的金属蛋白酶编码基因。所得的菌株分离为AN420。
除了编码推定的金属蛋白酶BL00829的基因通过缺失突变之外，AN420菌株与AN411菌株同基因。
实施例3.在来自实施例2的地衣芽孢杆菌菌株中的β-淀粉酶产生
如下所述进行来自实施例2的地衣芽孢杆菌菌株的补料分批发酵工艺。所有的培养基通过本领域已知方法灭菌。除非另行描述，使用自来水。在下述配方中提及的成分浓度是进行任何接种之前的浓度。
培养基
LB琼脂：10g/l来自酪蛋白的蛋白胨；5g/l酵母提取物；10g/l氯化钠；12g/l细菌琼脂，调整至pH 7.0+/-0.2。使用来自Merck的预混物(LB-琼脂(Miller)110283)。
M-9缓冲液：磷酸氢二钠，2H2O 8.8g/l；磷酸二氢钾3g/l；氯化钠4g/l；硫酸镁，7H2O 0.2g/l(在该缓冲液中使用去离子水)。
PRK-50：110g/l大豆粗粒(soy grits)；磷酸氢二钠，2H2O 5g/l；消泡剂(Struktol SB2121；Schill & Seilacher，Hamburg，Germany)1ml/l。在灭菌之前用NaOH/H3PO4将pH调整至8.0。
组成培养基(Make-up medium)：胰蛋白胨(来自Difco(BactoTM胰蛋白胨胰消化酪蛋白211699的酪蛋白水解物)30g/l；硫酸镁，7H2O 4g/l；磷酸氢二钾7g/l；磷酸氢二钠，2H2O 7g/l；硫酸铵4g/l；柠檬酸(盐)0.78g/l；维生素(硫胺素二氯化物34.2mg/l；核黄素2.9mg/l；烟酸23mg/l；D-泛酸钙28.5mg/l；吡哆醛-HCl 5.7mg/l；D-生物素1.1mg/l；叶酸2.9mg/l)；微量金属(MnSO4，H2O39.2mg/l；FeSO4，7H2O 157mg/l；CuSO4，5H2O 15.6mg/l；ZnCl2 15.6mg/l)；消泡剂(Struktol SB2121；Schill & Seilacher，Hamburg，Germany)1.25ml/l；在灭菌之前用NaOH/H3PO4将pH调整至6.0。
给料培养基；葡萄糖，1H2O 820g/l
发酵步骤：
将地衣芽孢杆菌菌株在37℃在LB琼脂斜面上生长一日。然后用M-9缓冲液洗涤琼脂，并测量所得的细胞悬液在650nm处的光密度(OD)。将接种摇瓶(含100ml PRK-50培养基)用OD(650nm)xml细胞悬液＝0.1的接种物来接种。将摇瓶在37℃以300rpm温育20小时。
使用的发酵器为配备有温度控制系统、使用氨水和磷酸的pH控制和在整个发酵过程中测量＞20％的氧饱和度的溶解氧电极的标准实验室发酵器。
在主发酵器(发酵罐)中的发酵是通过用来自烧瓶的生长培养物接种主发酵器来起始的。接种体积为10％(对于720ml组成培养基为80ml，在接种之后得到800ml起始液)。
发酵参数为：温度38℃；pH 6.8至7.2(使用氨水和磷酸，控制6.8(氨水)，7.2磷酸)。通气：1.5升/分钟，搅拌：1500rpm。
如下所述添加补料培养基：在发酵起始时起始补料速率为0.05g/分钟/kg，在8小时之后线性增加至0.16g/分钟/kg，并维持在0.16g/分钟/kg直至发酵结束，这些都是相对于发酵液恰在接种之后的起始重量。发酵在3日之后终止(大约70小时)。
β-淀粉酶测定
β-淀粉酶作用于麦芽六糖(G6)的非还原端以形成麦芽糖(G2)和麦芽四糖(G4)。产生的G4与G6相比在乳糖氧化酶和O2存在下形成H2O2的反应更强。形成的H2O2在过氧化物酶存在下激活4-氨基安替比林(AA)和N-乙基-N-磺丙基-间甲苯胺(TOPS)的氧化缩合以形成紫色产物，其可通过其在540处的吸光度加以量化。该反应是由麦芽六糖起始的。当除β-淀粉酶之外所有的组分均过剩时，吸光度上升速率与存在的β-淀粉酶活性成比例。该分析由Konelab自动进行的。
一个β-淀粉酶单元(BAMU)定义为在此文件中描述的条件下每分钟降解一μmol麦芽六糖的酶量。活性是相对于酶标样来确定的。
亚硫酸盐和Termamyl并不显著干扰BAMU结果。其他过氧化氢产生或消耗剂可显示假BAMU活性。
装置：
·Konelab Arena
30分析仪
·分析天平(例如Mettler AT200，Mettler AE100)
·稀释装置(例如Hamilton稀释器)
·磁力搅拌器
·pH计(例如Radiometer PHM 93)
·移液管
表1反应条件
表2特异性和敏感度。具有低于定量限度(quantification limit)的活性的样品的结果报道为＜2.075BAMU/g。
表3稀释剂Brij 85ppm，钙30mM。稳定性：在室温2周。
表4缓冲液，磷酸盐100mM，柠檬酸(盐)100mM，pH 5.5。稳定性：立即使用。
表5 BAMU试剂，TOPS 10mM，AA 4mM，4.8LOXU/mL。稳定性：在避光保护的冷冻箱中30日，或直至熔融之后可见紫色。
表6麦芽六糖底物3.668mM。稳定性：冷藏25日
| 步骤 | 作用 |
| 1 | 称量95±1mg麦芽六糖(例如Sigma M-9153)并转移至25mL容量瓶 |
| 2 | 添加柠檬酸(盐)磷酸盐缓冲液直至标记处 |
| 3 | 在磁力搅拌器上混合直至完全溶解 |
表7标准储液，1.66BAMU/mL
| 步骤 | 作用 |
| 1 | 称量0.7477±0.0005g的标样(222BAMU/g)并转移至100mL容量瓶 |
| 2 | 用稀释剂补至标记处 |
| 3 | 在磁力搅拌器上混合15分钟 |
表8标准稀释；在室温4小时内稳定
| 稀释号 | 作用 | BAMU/mL |
| 1 | 20 | 0.083 |
| 2 | 16 | 0.104 |
| 3 | 13 | 0.128 |
| 4 | 11 | 0.151 |
| 5 | 10 | 0.166 |
表9水平对照：水平对照稀释物在室温4小时内稳定。溶液在使用之前应搅拌。
表10样品稀释：在室温4小时内稳定。该溶液在使用前应搅拌
| 步骤 | 作用 |
| 1 | 称量并将样品在容量瓶中溶于稀释剂 |
| 2 | 在磁力搅拌器上混合15分钟 |
| 3 | 进一步用稀释剂稀释以达到0.0915BAMU/mL的目标浓度 |
如之前部分所述制备试剂、标样、水平对照和样品稀释。将试剂置于Konelab分析仪中。使用“麦芽六糖底物3.668mM”作为BAMU-SUB并使用“BAMU试剂，TOPS 10mM，AA 4mM，4.8LOXU/mL”作为BAMU-AAT(表12)。
表11试剂
将样品置于Konelab中，并以如下顺序分析所有的样品溶液(每次运行最多28个样品)：
1.空白
2.标样1
3.标样2
4.标样3
5.标样4
6.标样5
7.水平对照
8.样品
9.…
n.样品
通过将Abs对浓度的线性回归计算标准曲线或使用AnaAdm。对于水平对照和样品计算以BAMU/mL计的活性，或使用AnaAdm。对于稀释和称重校准以BAMU/mL计的活性，或使用AnaAdm。实例：将1.0000g样品溶解于100mL容量瓶，并进一步稀释10倍。从标准曲线计算的结果是0.140BAMU/mL。样品中的活性为0.140BAMU/mL*100mL*10/1.0000g＝140BAMU/g。
对于BAMU测定法的中间精度为：
·对于单次确定的CV％＝5.04％
·对于BAMU的CV％合格性(approval)计算为9.1％
β-淀粉酶结果
表12在实验室规模补料分批培养中在地衣芽孢杆菌菌株AN411和AN420(参见实施例2)中产生的bmy1β-淀粉酶的相对产率：
| 时间(小时) | AN411 | AN420 |
| 25.73 | 100 | 144 |
| 52.65 | 100 | 144 |
| 67.33 | 100 | 165 |
Claims (39)
1.一种突变的细菌细胞，所述细胞产生至少一种目标异源多肽，其中所述细胞与其他为同基因的但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ IDNO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平。
2.权利要求1的细胞，其为原核细胞，优选革兰氏阳性细胞。
3.权利要求2的细胞，其为芽孢杆菌属细胞。
4.权利要求3的细胞，其为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifprmis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
5.权利要求1-4任一项的细胞，其中所述包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽是金属肽酶。
6.权利要求1-5任一项的细胞，其在编码包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突变。
7.权利要求6的细胞，其中所述基因包含与SEQ ID NO：1中所示序列至少70％相同的核苷酸序列的多核苷酸。
8.权利要求1-7任一项的细胞，其在至少一个多核苷酸中有突变，其中所述至少一个多核苷酸的具有至少100bp大小的亚序列在中等严格杂交条件下与具有SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸或其相应互补序列杂交。
9.权利要求6-8任一项的细胞，其中所述基因部分或完全从染色体缺失，或包含至少一个移码突变或至少一个无义突变。
10.权利要求1-9任一项的细胞，与其他为同基因但非突变的细胞相比，不具有包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的可测量的表达。
11.权利要求1-10任一项的细胞，其中所述至少一种异源多肽包含酶。
12.权利要求11的细胞，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。
13.权利要求1-12任一项的细胞，其与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有目标异源多肽的改善的产生。
14.一种用于构建突变的细菌细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使细菌细胞突变；和
b)选择突变细胞，其与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞为原核细胞，优选革兰氏阳性细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞为芽孢杆菌属细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞为嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。
18.权利要求14-17任一项的方法，其中所述包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽是金属肽酶。
19.权利要求14-18任一项的方法，其中步骤(a)中的细胞在编码包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突变。
20.权利要求19的细胞，其中所述基因包含与SEQ ID NO：1中所示序列至少70％相同的核苷酸序列的多核苷酸。
21.权利要求14-20任一项的方法，其中步骤(a)中的细胞在至少一个多核苷酸中突变，其中所述至少一个多核苷酸的具有至少100bp大小的亚序列在中等严格杂交条件下与具有SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸或其相应互补序列杂交。
22.权利要求14-21任一项的细胞，其中步骤(a)中的细胞通过下述方法突变：使所述基因部分或完全从细胞的染色体缺失，或将至少一个移码突变或至少一个无义突变导入所述基因。
23.权利要求14-22任一项的方法，其中在步骤(b)中选择的细胞与其他为同基因但非突变的细胞相比，不具有包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的可测量的表达。
24.权利要求14-23任一项的方法，其中所述至少一种目标异源多肽包含酶。
25.权利要求24的方法，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。
26.权利要求14-25任一项的方法，其中所述细胞包含一个或多个染色体整合的多核苷酸拷贝，所述多核苷酸编码至少一种目标异源多肽。
27.一种用于产生目标异源多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)培养产生至少一种目标异源多肽的突变细菌细胞，其中所述突变细胞与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平，和
b)分离目标多肽。
28.权利要求27的方法，其中所述细胞为原核细胞，优选革兰氏阳性细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述细胞为芽孢杆菌属细胞。
30.权利要求29的方法，其中所述细胞为嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。
31.权利要求27-30任一项的方法，其中所述包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽是金属肽酶。
32.权利要求27-31任一项的方法，其中步骤(a)中的细胞在编码包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突变。
33.权利要求32的细胞，其中所述基因包含与SEQ ID NO：1中所示序列至少70％相同的核苷酸序列的多核苷酸。
34.权利要求27-33任一项的方法，其中步骤(a)中的细胞在至少一个多核苷酸中有突变，其中所述至少一个多核苷酸的具有至少100bp大小的亚序列在中等严格杂交条件下与具有SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸或其相应互补序列杂交。
35.权利要求27-34任一项的细胞，其中步骤(a)中的细胞通过下述方法突变：使所述基因部分或完全从细胞的染色体缺失，或将至少一个移码突变或至少一个无义突变导入所述基因。
36.权利要求27-35任一项的方法，其中在步骤(a)中的细胞与其他为同基因但非突变的细胞相比，不具有包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的可测量的表达。
37.权利要求27-36任一项的方法，其中所述至少一种目标异源多肽包含酶。
38.权利要求37的方法，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。
39.权利要求27-38任一项的方法，其中所述突变的细胞与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有目标异源多肽的改善的产生。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09153894.2 | 2009-02-27 | ||
| EP09153894 | 2009-02-27 | ||
| PCT/EP2010/052409 WO2010097436A1 (en) | 2009-02-27 | 2010-02-25 | Mutant cells having reduced expression of metallopeptidase, suitable for recombinant polypeptide production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102414317A true CN102414317A (zh) | 2012-04-11 |
| CN102414317B CN102414317B (zh) | 2014-11-05 |
Family
ID=42115479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201080018598.7A Expired - Fee Related CN102414317B (zh) | 2009-02-27 | 2010-02-25 | 具有减少的金属肽酶表达、适于重组多肽产生的突变细胞 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110306139A1 (zh) |
| EP (1) | EP2401371A1 (zh) |
| CN (1) | CN102414317B (zh) |
| WO (1) | WO2010097436A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110093336B (zh) * | 2018-01-29 | 2023-03-24 | 上海雅心生物技术有限公司 | 一种稳定的胰蛋白酶及其制备方法 |
| WO2025031865A1 (en) * | 2023-08-08 | 2025-02-13 | Basf Se | Improved bacillus cell with inactivated metalloprotease |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999034003A2 (en) * | 1997-12-30 | 1999-07-08 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
Family Cites Families (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1296839A (zh) | 1969-05-29 | 1972-11-22 | ||
| GB1372034A (en) | 1970-12-31 | 1974-10-30 | Unilever Ltd | Detergent compositions |
| DK187280A (da) | 1980-04-30 | 1981-10-31 | Novo Industri As | Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode |
| JPH0697997B2 (ja) | 1985-08-09 | 1994-12-07 | ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ | 新規の酵素的洗浄剤添加物 |
| US4810414A (en) | 1986-08-29 | 1989-03-07 | Novo Industri A/S | Enzymatic detergent additive |
| NZ221627A (en) | 1986-09-09 | 1993-04-28 | Genencor Inc | Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios |
| DE3854249T2 (de) | 1987-08-28 | 1996-02-29 | Novonordisk As | Rekombinante Humicola-Lipase und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Humicola-Lipasen. |
| JPS6474992A (en) | 1987-09-16 | 1989-03-20 | Fuji Oil Co Ltd | Dna sequence, plasmid and production of lipase |
| WO1989006270A1 (en) | 1988-01-07 | 1989-07-13 | Novo-Nordisk A/S | Enzymatic detergent |
| DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| JP3079276B2 (ja) | 1988-02-28 | 2000-08-21 | 天野製薬株式会社 | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 |
| US5648263A (en) | 1988-03-24 | 1997-07-15 | Novo Nordisk A/S | Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric |
| EP0406314B1 (en) | 1988-03-24 | 1993-12-01 | Novo Nordisk A/S | A cellulase preparation |
| US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| GB8915658D0 (en) | 1989-07-07 | 1989-08-23 | Unilever Plc | Enzymes,their production and use |
| DE59101948D1 (de) | 1990-04-14 | 1994-07-21 | Kali Chemie Ag | Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren. |
| DK115890D0 (da) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | Novo Nordisk As | Enzym |
| DE69107455T3 (de) | 1990-05-09 | 2004-09-23 | Novozymes A/S | Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung. |
| CA2092615A1 (en) | 1990-09-13 | 1992-03-14 | Allan Svendsen | Lipase variants |
| IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
| SG52693A1 (en) | 1991-01-16 | 1998-09-28 | Procter & Gamble | Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays |
| US5294542A (en) | 1991-03-19 | 1994-03-15 | Omnigene, Inc. | Residual protease-III |
| WO1992019729A1 (en) | 1991-05-01 | 1992-11-12 | Novo Nordisk A/S | Stabilized enzymes and detergent compositions |
| WO1993010249A1 (en) | 1991-11-14 | 1993-05-27 | Novo Nordisk A/S | A bacillus promoter derived from a variant of a bacillus licheniformis x-amylase promoter |
| DK88892D0 (da) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Novo Nordisk As | Forbindelse |
| ATE444356T1 (de) | 1992-07-23 | 2009-10-15 | Novozymes As | Mutierte -g(a)-amylase, waschmittel und geschirrspülmittel |
| EP0663950B1 (en) | 1992-10-06 | 2004-03-17 | Novozymes A/S | Cellulase variants |
| DK153992D0 (da) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | Novo Nordisk As | Metode |
| BR9405720A (pt) | 1993-02-11 | 1995-11-28 | Genencor Internacional Inc | Alfa-amilase mutante DNA vetores de expressão células hospedeiras composição detergente composição de liquefação de amido e processo para liquefazer uma suspensão de amido granular |
| EP0652946B1 (en) | 1993-04-27 | 2005-01-26 | Genencor International, Inc. | New lipase variants for use in detergent applications |
| DK52393D0 (zh) | 1993-05-05 | 1993-05-05 | Novo Nordisk As | |
| JP2859520B2 (ja) | 1993-08-30 | 1999-02-17 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物 |
| JPH07143883A (ja) | 1993-11-24 | 1995-06-06 | Showa Denko Kk | リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ |
| DE4343591A1 (de) | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| BR9506861A (pt) | 1994-02-22 | 1997-09-23 | Novo Nordisk As | Processo para preparar e produzir uma variante de uma enzima lipolítica originária variante de enzima liplítica construção de dna vetor célula hospedeira aditivo detergente e composição detergente |
| DE69536145D1 (de) | 1994-03-08 | 2011-04-07 | Novozymes As | Neuartige alkalische Zellulasen |
| EP0755442B1 (en) | 1994-05-04 | 2002-10-09 | Genencor International, Inc. | Lipases with improved surfactant resistance |
| AU2884595A (en) | 1994-06-20 | 1996-01-15 | Unilever Plc | Modified pseudomonas lipases and their use |
| WO1996000292A1 (en) | 1994-06-23 | 1996-01-04 | Unilever N.V. | Modified pseudomonas lipases and their use |
| EP0788541B1 (en) | 1994-10-06 | 2008-03-12 | Novozymes A/S | Enzyme preparation with endoglucanase activity |
| BE1008998A3 (fr) | 1994-10-14 | 1996-10-01 | Solvay | Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci. |
| US5827719A (en) | 1994-10-26 | 1998-10-27 | Novo Nordisk A/S | Enzyme with lipolytic activity |
| AR000862A1 (es) | 1995-02-03 | 1997-08-06 | Novozymes As | Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del |
| JPH08228778A (ja) | 1995-02-27 | 1996-09-10 | Showa Denko Kk | 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法 |
| WO1996029397A1 (en) | 1995-03-17 | 1996-09-26 | Novo Nordisk A/S | Novel endoglucanases |
| EP0817856A1 (en) | 1995-03-22 | 1998-01-14 | Novo Nordisk A/S | Introduction of dna into bacillus strains by conjugation |
| ATE282087T1 (de) | 1995-07-14 | 2004-11-15 | Novozymes As | Modifiziertes enzym mit lipolytischer aktivität |
| ATE267248T1 (de) | 1995-08-11 | 2004-06-15 | Novozymes As | Neuartige lipolytische enzyme |
| US5763385A (en) | 1996-05-14 | 1998-06-09 | Genencor International, Inc. | Modified α-amylases having altered calcium binding properties |
| AU3938997A (en) | 1996-08-26 | 1998-03-19 | Novo Nordisk A/S | A novel endoglucanase |
| CA2265914C (en) | 1996-09-17 | 2011-05-03 | Novo Nordisk A/S | Cellulase variants |
| CN1554750B (zh) | 1996-11-04 | 2011-05-18 | 诺维信公司 | 枯草酶变种及组合物 |
| AU4773197A (en) | 1996-11-04 | 1998-05-29 | Novo Nordisk A/S | Subtilase variants and compositions |
| WO1998034946A1 (en) | 1997-02-12 | 1998-08-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis |
| ATE327340T1 (de) | 1997-02-20 | 2006-06-15 | Dsm Ip Assets Bv | Fermentative herstellung von wertstoffen in industriellem umfang durch verwendung von chemisch definierten media |
| JP4426094B2 (ja) | 1997-10-30 | 2010-03-03 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | αアミラーゼ変異体 |
| GB9727470D0 (en) * | 1997-12-30 | 1998-02-25 | Genencor Int Bv | Proteases from gram positive organisms |
| US5955310A (en) | 1998-02-26 | 1999-09-21 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell |
| WO2001066712A2 (en) | 2000-03-08 | 2001-09-13 | Novozymes A/S | Variants with altered properties |
| EP2298797A3 (en) * | 2004-01-09 | 2011-05-18 | Novozymes Inc. | Increased bacillus YweA expression |
| WO2005123915A1 (en) | 2004-06-21 | 2005-12-29 | Novozymes A/S | Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation |
| DE602006018634D1 (de) * | 2005-08-03 | 2011-01-13 | Asahi Glass Co Ltd | Transformierte Hefezellen UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FREMDPROTEIN |
| EP2210898A1 (en) * | 2006-11-29 | 2010-07-28 | Novozymes Inc. | Bacillus Licheniformis chromosome |
-
2010
- 2010-02-25 WO PCT/EP2010/052409 patent/WO2010097436A1/en active Application Filing
- 2010-02-25 EP EP10705600A patent/EP2401371A1/en not_active Withdrawn
- 2010-02-25 US US13/203,050 patent/US20110306139A1/en not_active Abandoned
- 2010-02-25 CN CN201080018598.7A patent/CN102414317B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999034003A2 (en) * | 1997-12-30 | 1999-07-08 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| REY M.W., ET AL: "Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species", 《GENOME BIOLOGY》 * |
| WU XC, ET AL: "Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases", 《J. BACTERIOL》 * |
| 无: "Hypothetical protein （Putative metallopeptidase）", 《UNIPROTKB/SWISS-PROT》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2401371A1 (en) | 2012-01-04 |
| US20110306139A1 (en) | 2011-12-15 |
| WO2010097436A1 (en) | 2010-09-02 |
| CN102414317B (zh) | 2014-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103443278B (zh) | 生产分泌型多肽的方法 | |
| JP6606068B2 (ja) | シグナルペプチドを含まない天然で分泌性のポリペプチドの発現 | |
| CN106132995A (zh) | 蛋白质晶体在低pH下的再增溶 | |
| US20200181595A1 (en) | Bacillus Licheniformis Host Cell | |
| CN105324488A (zh) | 芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产 | |
| CN105339493B (zh) | 来自秋叶氏芽孢杆菌的密码子改性淀粉酶 | |
| CN102414317B (zh) | 具有减少的金属肽酶表达、适于重组多肽产生的突变细胞 | |
| US20120329090A1 (en) | Methods for Producing Heterologous Polypeptides in Thiol-Disulfide Oxidoreductase-Deficient Bacterial Mutant Cells | |
| CN101278044A (zh) | 适用于制备重组多肽的突变体细胞 | |
| US20250034535A1 (en) | Improved protein production in recombinant bacteria | |
| EP4630563A1 (en) | Modified rna polymerase activities | |
| US20200263156A1 (en) | Improving Expression Of A Protease By Co-Expression With Propeptide | |
| WO2020182552A1 (en) | Means and methods for improving protease expression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141105 Termination date: 20160225 |