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CN102460167B - 不含朊病毒的纳米颗粒组合物和方法 - Google Patents

不含朊病毒的纳米颗粒组合物和方法 Download PDF

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CN102460167B CN201080026604.3A CN201080026604A CN102460167B CN 102460167 B CN102460167 B CN 102460167B CN 201080026604 A CN201080026604 A CN 201080026604A CN 102460167 B CN102460167 B CN 102460167B
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Abstract

公开了不含朊病毒的组合物，其包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药物。还提供了制造不含朊病毒的组合物的方法和从该纳米颗粒组合物中除去朊病毒蛋白的方法。还提供了使用该组合物的方法，以及可用于进行该方法的试剂盒。

Description

不含朊病毒的纳米颗粒组合物和方法
相关申请
本申请要求于2009年4月15日递交的美国临时专利申请号61/169,665和于2009年8月28日递交的美国临时专利申请号61/238,052的优先权权益，其每一篇的内容以它们整体并入本文。
技术领域
本发明涉及包括纳米颗粒的不含朊病毒的组合物、制造所述组合物的方法和使用所述组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药物。
背景技术
朊病毒病，也被称为传染性海绵状脑病(TSE)，是一组致死性、传播性的神经退化性疾病。TSE的具体例子包括影响绵羊和山羊的瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)、传染性的水貂脑病、猫海绵状脑病和慢性消耗性疾病(CWD)。在人类中，TSE疾病本身可以作为库鲁病(kuru)、库贾氏症(Creutzfeldt-Jekobdisease)(CJD)、格斯特曼-施特劳斯纳(Gerstmann-Straussler-Scheinker)综合征(GSS)、致死性失眠症和库贾氏症变种(vCJD)存在。作为在英国BSE流行病的结果在人类中出现的vCJD最可能是由于消费源于感染BSE或“疯牛病”的牛的食品所造成的。(Will等(1996)Lancet 347：921-925)由于在人类中该经口感染的疾病的潜伏期可能超过20年，因此许多年来vCJD的真正发病率并不明显。
除了摄入感染的牛源产品，输血和器官移植代表人类之间vCJD传播的另一种模式(Brown等(1998)Transfusion 38：810-816；Diringer等(1984)Archives of Virology 82：105-109；Manuelidis等(1978)Nature271：778-779)。自从20世纪90年代中期，提出了主要关注vCJD可通过输血或来自感染TSE个体的其他血制品传播。这些个体在vCJD长时间的临床前和潜伏期期间可以是无症状的，来自这些捐赠人的血液可以能够传播该疾病到接受源于该捐赠人的血液或血制品的人。
迄今，在英国至少报道了4例人类输血获得vCJD的病例。接受来自22个捐赠人全血的64个人，4个人发展为vCJD。在第一个事件中，接受者在接受来自仍然无症状的捐赠人的红细胞7年后发病，而捐赠人直到捐赠3年后才出现vCJD的迹象(Llewely等(2004)Lancet363：417-421)。在第二个事件中，捐赠人在捐赠后2年死于vCJD，而接受者在捐赠后5年死于动脉瘤(不是vCJD)(Peden等(2004)Lancet364：527-529)。在接受者的尸检中，PrPsc存在于淋巴结和脾中，但脑中没有。在第三个事件中，接受者从捐赠者输血后7年半死于vCJD，捐赠者捐赠后20个月发展为vCJD(Wroe等(2006)Lancet368：2061-2067)。第四个事件出现在接受者从在第三个病例中的相同捐赠者输血8年半之后(Health Protection Agency-Health ProtectionReport，(2007)Vol 1，No 3,26.可得自：http://www.hpa.org.uk/hpr/archives/2007/news2007/news 0307.htm)。
所有朊病毒病的共同特征是正常的细胞朊病毒蛋白(PrPc)转变为异常的同种型(PrPsc)。PrPc和PrPsc之间的差异被认为是纯粹构象上的，PrPc主要具有α螺旋结构而PrPsc主要具有通常组装形成聚集体的β折叠。PrPsc作为模板诱导正常的蛋白质分子转化为相同的异常同种型，其接着又使更多的PrPc转化为PrPsc(Prusiner等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13363-13383)。该自身催化过程导致神经毒PrPsc聚集体的指数形成(Aguzzi等(2007)Nat Rev Mol.Cell Biol.8：552-561)。朊病毒蛋白配体及其使用描述在WO04/050851、WO06/010915、WO04/090102和WO06/044459中。
研究已经显示，在血液中最早的朊病毒传染性的出现可能发生在疾病潜伏期的早期阶段期间(Brown等(2006)Blood infectivity in thetransmissible spongiform encephalopathies(在传染性海绵状脑病中的血液传染性)在TurnerML，ed.95-118第4章)。由于在疾病症状开始之前可能要很长时间，隐性感染的个体可能仍被认为是健康的有效血液捐赠者。而且，一些个体可永久地感染或短时间感染而不形成疾病。因此，确保血液源产品的血液源不含朊病毒是困难的——如果可能的话。
已经开发了基于白蛋白的纳米颗粒组合物作为药物递送系统，用于输送基本上不溶于水的药物。见，例如美国专利号5,916,596；6,506,405；6,749,868和6,537,579以及还在美国专利公开号2005/0004002和2007/0082838。基于白蛋白的纳米颗粒技术利用蛋白质白蛋白独特的天然性质，以运输和递送基本上不溶于水的药物到疾病部位。这些纳米颗粒容易并入机体自身的运输过程并能够利用肿瘤对白蛋白的吸引，使更高浓度的活性药物能够递送到目标部位。另外，基于白蛋白的纳米颗粒技术在给药过程中通过避免对毒性化学品比如溶剂的需要提供改善药物溶解性的能力，从而潜在地通过消除溶剂相关的副作用改善安全性。
本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容在此通过引用以它们的整体并入本文。
发明简述
在一方面，本发明提供了不含朊病毒的纳米颗粒组合物(比如药学组合物)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物是无菌的。在一些实施方式中，组合物是可无菌过滤的。在一些实施方式中，组合物进一步包括药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，组合物具有小于大约100fg/ml的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约10IU-ic/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物具有小于大约1LD50/ml的朊病毒传染性。
在一些实施方式中，基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，基于IPCR试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约10IU-ic/ml的朊病毒传染性，并基于PMCA试验显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约10IU-ic/ml的朊病毒传染性，并基于IPRC试验显示不存在朊病毒蛋白。
本文描述的组合物一般基本上不含PrPsc。在一些实施方式中，组合物也基本上不含PrPc。在一些实施方式中，在组合物中PrPsc和PrPc的摩尔比不大于大约1∶1，比如不大于大约1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000或1∶100000的任何一个。
在一些实施方式中，本文描述的组合物包含一定量(例如痕量)的在朊病毒除去过程中引入的物质。例如，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量(例如痕量)的能够结合朊病毒蛋白的配体。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量(例如痕量)的支持材料(比如本文描述的支持材料，包括树脂)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量的PRDT树脂(例如痕量PRDT树脂)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含一定量的DVR树脂(例如痕量DVR树脂)。
在一些实施方式中，在组合物中白蛋白稳定剂的水平小于其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物的白蛋白稳定剂水平。这些白蛋白稳定剂包括，例如N-乙酰色氨酸酯和辛酸钠。
在一些实施方式中，组合物与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物生物等价。
在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物与能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过如此方法获得，所述方法包括：a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，和b)从初始组合物中除去复合物。
在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是血液源产品。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是从体液(比如血液)中制备的白蛋白组合物。在一些实施方式中，白蛋白是人血清白蛋白。
在一些实施方式中，配体是肽(比如在表1中提供的任何肽)。在一些实施方式中，配体是识别朊病毒蛋白的抗体。在一些实施方式中，配体是化合物(比如基于三嗪的化合物)。在一些实施方式中，配体包含氨基，比如在氨基树脂上的氨基。
配体可附着于支持材料，包括，例如柱、珠、基体、滤纸和膜。
另一方面，提供了产生不含朊病毒的纳米颗粒组合物的方法。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过如此方法获得，所述方法包括：a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和b)从初始组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白；b)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，b)从白蛋白初始组合物中除去复合物；和c)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使白蛋白溶液和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白溶液中除去配体和与其结合的蛋白质，和c)使包括所述白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
可在形成纳米颗粒期间除去朊病毒。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，方法进一步包括：b)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括c)使混合物经历高剪切条件。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
朊病毒蛋白还可在纳米颗粒组合物形成之后除去。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括有机相和白蛋白溶液的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中混合物在和配体接触之前已经经历高剪切条件。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，和b)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括：c)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
在一些实施方式中，提供了从怀疑包含朊病毒蛋白的包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括a)使纳米颗粒组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从纳米颗粒组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了从怀疑包含异常朊病毒蛋白的白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法，包括：a)使包括白蛋白的组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白组合物中除去配体和与其结合的蛋白质，其中所述白蛋白组合物用于产生包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。
在一些实施方式中，提供了从包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)确定在组合物中存在或不存在朊病毒蛋白，b)使组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和c)从组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。
还提供了在朊病毒除去过程期间制造的组合物。例如，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述组合物进一步包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒和能够与朊病毒蛋白结合的配体的混合物，所述纳米颗粒包含白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述配体附着于支持材料，比如本文描述的一种或多种支持材料。在一些实施方式中，提供了装载有包含纳米颗粒的组合物的柱，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中柱包含能够与朊病毒蛋白结合的配体。
还提供了通过本文所描述方法制造的组合物。还提供了使用本文描述的不含朊病毒组合物的方法。例如，在一些实施方式中，提供了施用包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，提供了治疗疾病(比如癌症)的方法，包括施用包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。
在一些实施方式中，提供了施用包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了治疗疾病(比如癌症)的方法，包括施用包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。
还提供了包括本文描述的不含朊病毒的纳米颗粒组合物的试剂盒和剂型(比如小瓶，例如密封小瓶)和可用于本文描述的方法的试剂盒。还提供了进行本文描述的一种或多种方法的系统(包括装置)。
本发明的这些和其他方面和优点将从随后的详细描述和所附的权利要求变得显而易见。应当理解，本文描述的各种实施方式的一种、一些或所有性质可结合，以形成本发明的其他实施方式。
附图简述
图1提供了在20％或25％白蛋白中用0.01％和0.005％瘙痒病仓鼠脑匀浆攻击的DVR树脂的蛋白质印迹和SDS-PAGE凝胶。AMN31是阳性对照树脂。观察到的信号是结合部分。“-PK”和“+PK”表示不存在或存在蛋白酶K消化。
图2提供了在20％或25％白蛋白中用0.01％和0.005％瘙痒病仓鼠脑匀浆攻击的YVHEA和SYA树脂的蛋白质印迹和SDS-PAGE凝胶。AMN31是阳性对照树脂。观察到的信号是结合部分。“-PK”和“+PK”表示不存在或存在蛋白酶K消化。
图3提供了在20％或25％白蛋白中用0.01％和0.005％瘙痒病仓鼠脑匀浆攻击的D4树脂的蛋白质印迹和SDS-PAGE凝胶。AMN31是阳性对照树脂。观察到的信号是结合部分。“-PK”和“+PK”表示不存在或存在蛋白酶K消化。
图4描绘了对于20％白蛋白通过朊病毒减少树脂柱(PRDT(病原体除去和诊断技术)柱)除去TSE的工艺流程图。
图5显示了在对于20％白蛋白通过PRDT柱除去TSE的研究中来自外加实验的色谱图。
图6显示了离心的20％白蛋白溶液(10倍浓缩或没有10倍浓缩)的蛋白印迹干扰试验。
图7描绘了对于25％白蛋白通过朊病毒减少树脂柱(PRDT柱)除去TSE的工艺流程图。
图8显示在对于25％白蛋白通过PRDT柱除去TSE的研究中来自外加实验的色谱图。
图9显示了离心的25％白蛋白溶液(10倍浓缩或没有10倍浓缩)的蛋白印迹干扰试验。
发明详述
本发明提供了不含朊病毒的包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂；和制造不含朊病毒组合物的方法。
一方面，本发明提供了包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。
另一方面，提供了制造不含朊病毒的包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。还提供了在制造过程的方法期间制造的组合。
另一方面，提供了使用不含朊病毒的包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。
还提供了包括本文描述的不含朊病毒的纳米颗粒组合物的试剂盒和剂型(比如小瓶，例如密封小瓶)和可用于本文描述方法的试剂盒和系统(包括装置)。
本文使用“不含朊病毒”是为了方便以及以便一般性地描述本发明组合物，并意图包括本文描述的所有实施方式。
本文提到“大约”数值或参数包括(和描述)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如描述提到“大约”X包括“X”的描述。
应该理解，本文所述的本发明的方面和实施方式包括“由各方面和实施方式组成(consisting)”和/或“基本上由各方面和实施方式组成(consisting essentially of)”。
不含朊病毒的纳米颗粒组合物
本发明提供了包括纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物是无菌的。在一些实施方式中，组合物是可无菌过滤的。在一些实施方式中，组合物进一步包括药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，在组合物中通过具有大约100fg/ml或更高检测灵敏度的检测方法检测不到朊病毒蛋白，就是说，在使用具有大约100fg/ml或更高检测灵敏度(例如大约50fg/ml，大约10fg/ml，大约1fg/ml，大约0.1fg/ml的检测灵敏度)的方法的试验中测试结果是阴性的。在组合物中的朊病毒含量可直接从组合物中确定。可选地，在测定之前可处理组合物，例如浓缩或富集以便促进在组合物中朊病毒蛋白的检测和量化。
测定组合物是否基本上不含朊病毒蛋白的一种方法是体内传染性试验。例如，体内传染性可由在小鼠、貂、仓鼠或山羊模型中接种测试组合物证明。传染性可通过致死剂量(LD50)来测定，所述致死剂量，即，当通过给定途径(比如通过大脑内途径)施用时诱导50％暴露动物发病的剂量。可选地，传染性可通过传染单位测定，所述传染单位即，能够使疾病通过给定途径从一种实验动物传播到另一种的最小传染剂量。一般地，100IU-ic/ml(通过大脑内途径测定的传染单位)相当于大约10LD50/ml和1pg/ml的朊病毒蛋白。
测定组合物中的朊病毒蛋白的另一种方法是免疫聚合酶链反应(IPCR)，其为如此技术，凭借该技术PCR的指数扩增能力与通过ELISA形式的抗体检测蛋白质相结合，并应用到修改的实时IPCR方法中以检测超低水平的朊病毒蛋白。见Barletta等，J.VirologyMethod，127(2005)：154-104。使用IPCR，重组仓鼠PrPc被检测一直为1fg/ml并用半定量剂量反应检测蛋白酶K(PK)消化的瘙痒病感染的稀释到10-8(大约10-100个传染单位)的仓鼠脑匀浆。
在一些实施方式中，通过蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)测定在组合物中的朊病毒蛋白。该方法已经用于在血液中检测PrPsc。适合检测组合物中朊病毒蛋白的其他方法包括，但不限于：使用时间分辨离解增强荧光技术的定量夹心ELISA；双色荧光共焦扫描(dual-colorfluorescent confocal scanning)；构象依赖性免疫测定方法(CDI)。蛋白质印迹、珠印迹(bead blot)、凝胶迁移率变动分析(gel-mobility shiftassays)、荧光原位杂交分析(FISH)、放射性标记或生物荧光标记追踪、核磁共振、电子顺磁共振、停流光谱(stopped-flow spectroscopy)、柱层析法、毛细管电泳法或其他方法也可被开发以检测组合物中的朊病毒蛋白。
在一些实施方式中，基于用于检测朊病毒蛋白的一种试验(比如上述试验的任何一种)，组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，两种或多种试验被用于分析组合物，且这些不同试验之间的关系用于测定组合物是否含有朊病毒蛋白。
因此，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约100fg/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物具有小于大约10IU-ic/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物具有小于大约1LD50/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，基于IPCR试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约10IU-ic/ml的朊病毒传染性，并基于PMCA试验，显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约10IU-ic/ml的朊病毒传染性，并基于IPRC试验显示不存咋朊病毒蛋白。在一些实施方式中，基于《就vCJD风险研究血浆源医药产品的制造过程的指南》(Guideline for the Investigation of Manufacturing Processes forPlasma-Derived Medicinal Products with Regard to vCJD Risk)中提供的标准(CPMP5136/03)——见http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/513603en.pdf，其内容以其整体并入本文，组合物不含朊病毒蛋白。
本文描述的组合物一般基本上不含PrPsc。在一些实施方式中，组合物也基本上不含PrPc。在一些实施方式中，在组合物中PrPsc和PrPc的摩尔比不大于大约1∶1，比如不大于大约1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000或1∶100000的任何一个。
在一些实施方式中，组合物基本上不含来自人类、牛、绵羊和啮齿类(比如仓鼠、小鼠和貂)的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物基本上不含H型朊病毒蛋白、L型朊病毒蛋白或二者。在一些实施方式中，组合物基本上不含细胞结合的朊病毒蛋白、游离的朊病毒蛋白或二者。
本使用的术语“PrPc”指在哺乳动物体内自然表达的天然朊病毒蛋白分子。本文所用的术语“PrPsc”指被认为具有传染性的构象改变形式的PrPc分子。
本文所用的“白蛋白”指天然存在的白蛋白，不包含重组产生的白蛋白。天然发生的白蛋白相对于重组白蛋白是有优势的，因为它是体内白蛋白受体的天然配体。在本文描述的方法中使用的白蛋白一般保留白蛋白的翻译后修饰并因此降低了免疫原性的风险。在一些实施方式中，白蛋白从血液源的组合物中获得。本文所用的“血液源的组合物”包括全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、血小板富集和血小板匮乏的馏分、血小板浓缩物、白细胞、血浆沉淀物、血浆分馏沉淀物和上清液、血浆分馏中间物、源于血液的各种其他物质等。在一些实施方式中，白蛋白来自人。在一些实施方式中，白蛋白来自动物比如牛、绵羊和啮齿类(比如小鼠、仓鼠和貂)。在一些实施方式中，白蛋白从一群至少一些已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。在一些实施方式中，白蛋白从一群至少一些被怀疑已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。在一些实施方式中，白蛋白从大批量群的个体中获得。
在一些实施方式中，本文描述的组合物包含在朊病毒除去过程期间引入的痕量物质。例如，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含痕量的能够结合朊病毒蛋白的配体。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含痕量的支持材料(比如来自本文描述的支持材料的材料，包括树脂)。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白，和其中组合物包含痕量的能够结合朊病毒蛋白的配体和痕量的支持材料(比如来自本文描述的支持材料的材料，包括树脂)。
“痕量”指例如在生物利用度和/或生物等效方面不影响组合物性质的可检测的量。
在一些实施方式中，组合物与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物生物等价。可建立生物等效，例如通过在Cmax和AUC二者的0.80和1.25之间的90％置信区间或在AUC的0.80和1.25之间的90％置信区间和在Cmax的0.70和1.43之间的90％置信区间。
在一些实施方式中，在组合物中白蛋白稳定剂的水平小于其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程被净化的组合物的白蛋白稳定剂水平。这些白蛋白稳定剂包括，例如N-乙酰色氨酸酯和辛酸钠。
本文描述的组合物一般包括纳米颗粒，所述纳米颗粒包括基本上不溶于水的药学活性剂和白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包括基本上不溶于水的药学活性剂和白蛋白。在一些实施方式中，本文描述的组合物中的纳米颗粒具有不大于大约1000nm，包括例如不大于大约900、800、700、600、500、400、300、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70或60nm的任何一个的平均直径。在一些实施方式中，在组合物中所有纳米颗粒的至少大约50％(例如至少大约60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一个)具有不大于大约1000nm，包括例如不大于大约900、800、700、600、500、400、300、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70或60nm的任何一个的直径。在一些实施方式中，在组合物中所有纳米颗粒的至少大约50％(例如至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的至少一个)落在大约20到大约200nm，包括例如大约30到大约180nm的任何一个，和大约40到大约150、大约50到大约120和大约60到大约100nm的任何一个的范围内。
在一些实施方式中，组合物的纳米颗粒部分中至少大约5％(包括例如至少大约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的任何一个)的白蛋白是交联的(例如通过一个或多个二硫键交联)。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括用白蛋白(例如人血清白蛋白)包被的基本上不溶于水的药学活性剂(比如紫杉醇)。在一些实施方式中，组合物包括纳米颗粒和非纳米颗粒形式二者的基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中至少大约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一个的基本上不溶于水的药学活性剂为纳米颗粒形式。在一些实施方式中，按重量计，在纳米颗粒中基本上不溶于水的药学活性剂构成纳米颗粒的大于大约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一个。在一些实施方式中，纳米颗粒具有非聚合基体。在一些实施方式中，纳米颗粒包括基本上不溶于水的药学活性剂的核心，其基本上不含聚合材料(比如聚合基体)。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物基本上不含(比如不含)表面活性剂或有机溶剂(比如Cremophor(克列莫佛)Tween80或用于施用基本上不溶于水的药学活性剂的其他有机溶剂)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含小于大约20％、15％、10％、7.5％、5％、2.5％、1％或更少的任何一个的有机溶剂。
从包含白蛋白的组合物中除去朊病毒使施用更大量的白蛋白成为可能，而无需担心朊病毒。本发明因此还考虑包含纳米颗粒的组合物(比如药学组合物)，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白与基本上不溶于水的药剂的重量比是大约20∶1或更高，比如大约30∶1或更高、大约40∶1或更高、或大约50∶1或更高的任何一个。示例性比率包括，例如大约20∶1到大约40∶1、大约40∶1到大约60∶1、大约60∶1到大约80∶1或大约90∶1到大约100∶1。在一些实施方式中，在纳米颗粒组合物中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是大约18∶1或更低，比如大约15∶1或更低，例如大约10∶1或更低。在一些实施方式中，在组合物中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比落在大约1∶1到大约18∶1、大约2∶1到大约15∶1、大约3∶1到大约13∶1、大约4∶1到大约12∶1、大约5∶1到大约10∶1的任何一个的范围内。在一些实施方式中，组合物的纳米颗粒部分中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是大约1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15或更低的任何一个。
在一些实施方式中，颗粒组合物包含一种或多种上面的特征。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物是AbraxaneTM。包括其他基本上不溶于水的药学活性剂(比如多西紫杉醇和沃塔紫杉醇(ortataxel))的纳米颗粒组合物也可包括一种或多种上面的特征。
在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过如此方法获得，所述方法包括：a)使初始包括白蛋白的组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，和b)从初始组合物中除去复合物。
下面更加详细地描述包括白蛋白和基本上不溶于水的药物的纳米颗粒。下面更加详细地描述从组合物(比如初始白蛋白组合物、纳米颗粒组合物——所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂、或在制造纳米颗粒过程中形成的中间组合物)中除去朊病毒的方法。本发明包括由本文描述的任何方法产生的组合物。
与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，本文描述的组合物一般已经降低了朊病毒蛋白水平。例如在一些实施方式中，与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，所述组合物具有小于大约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的任何一个的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，所述组合物具有小大约1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7或8个对数的任何一个的朊病毒蛋白。在一些实施方式中，与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物相比，所述组合物具有小大约1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7或8个对数的任何一个的传染性。在一些实施方式中，本发明的组合物与其中白蛋白没有通过朊病毒除去过程净化的组合物生物等价。
虽然本申请关注白蛋白，但是应当理解也考虑在血液或血浆中通常发现的其他蛋白质，其包括，但不限于，免疫球蛋白(包括IgA和IgG)、脂蛋白、载脂蛋白B、α酸糖蛋白、β-2-巨球蛋白、甲状腺球蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X等。本文提供的所有关于白蛋白的相关描述，就它们用于形成纳米颗粒的方面，同样适合这些其他蛋白质。
制造不含朊病毒的纳米颗粒组合物的方法
另一方面，提供了产生不含朊病毒的纳米颗粒组合物的方法。例如，在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触的方法获得。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中白蛋白通过如此方法获得，所述方法包括：a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和b)从初始组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白；b)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触以引起在配体和朊病毒蛋白之间形成复合物，和b)从白蛋白初始组合物除去复合物；c)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使白蛋白溶液和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白溶液中除去配体和与其结合的蛋白质，c)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
可在形成纳米颗粒期间除去朊病毒。例如在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，方法进一步包括：b)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括c)使混合物经历高剪切条件。在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去有机溶剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括白蛋白溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的基本上不溶于水的药学活性剂；和b)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括：c)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去有机溶剂。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括使包括有机相和白蛋白溶液的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，其中混合物在和配体接触之前已经经历高剪切条件。在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，和b)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括：c)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括：d)从混合物中除去水相。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，b)除去所述有机溶剂，和c)使除去有机溶剂的混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括：d)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括：d)从混合物中除去水相。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
在一些实施方式中，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂，b)除去所述有机溶剂，c)添加白蛋白到混合物，和d)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，方法进一步包括：e)从混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法进一步包括：f)从混合物中除去水相。在一些实施方式中，混合物基本上不含表面活性剂。
本文描述的方法一般包括使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括分散在有机溶剂中的基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，高剪切条件是高压匀浆作用，例如在大约3000到大约30,000psi，包括例如大约6000到大约25,000psi、大约9000到大约18,000psi、大约10,000到大约25,000psi、大约15,000到大约25,000psi范围内的压力下。在一些实施方式中，有机溶剂是基本上不能和水混合的有机溶剂(比如氯仿或二氯甲烷)和可溶于水的有机溶剂(比如可溶于水的醇，包括乙醇和叔丁醇)的混合物。在一些实施方式中，基本上不能和水混合的有机溶剂和可溶于水的有机溶剂的比例(v/v)(例如氯仿/乙醇或氯仿/丁醇的比例)大约为1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1的任何一个，或比例为大约3∶7、5∶7、4∶6、6∶4、5∶5、6∶5、8∶5、9∶5、9.5∶5、5∶3、7∶3、6∶4或9.5∶0.5的任何一个。
在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去有机相(比如在减压情况下通过蒸发除去)。在一些实施方式中，方法进一步包括从混合物中除去水相。在一些实施方式中，方法进一步包括无菌过滤通过上述方法形成的纳米颗粒。
在一些实施方式中，提供了从怀疑包含朊病毒蛋白的包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使纳米颗粒组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从纳米颗粒组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了从怀疑包含异常朊病毒蛋白的白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白的方法，包括：a)使包括白蛋白的组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从白蛋白组合物中除去配体和与其结合的蛋白质，其中所述白蛋白组合物用于产生包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。
在一些实施方式中，提供了从包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)确定在组合物中存在或不存在朊病毒蛋白，b)使组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，和c)从组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。
在一些实施方式中，本文描述方法的一个或多个步骤可以批式进行。在一些实施方式中，本文描述方法的一个或多个步骤可以以连续方式进行。
形成纳米颗粒之前除去朊病毒
在包含白蛋白的纳米颗粒组合物被制造之前，可从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白。一般地，方法包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，并从白蛋白组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。使用相同的或不同的配体，该过程可重复一次或多次。在朊病毒除去过程期间，还可同时使用两种或多种配体。
在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是血液源的组合物。例如在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、血小板富集和血小板匮乏馏分、血小板浓缩物、白细胞、血浆沉淀物、血浆分馏沉淀物和上清液、或血浆分馏中间物。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物从人中获得。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物来自动物比如牛、绵羊和啮齿类(比如小鼠、仓鼠和貂)。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物从一群至少一些已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物从一群至少一些被怀疑已经被朊病毒感染的个体中(比如人)获得。
在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是从体液(比如血液)中通过本领域常见的任何各种方法和/或通过示差沉淀制备的白蛋白组合物，所述各种方法包括离子交换层析、亲和层析、凝胶渗透层析和/或疏水层析。在一些实施方式中，初始组合物是从血液(比如人血液)中纯化的白蛋白组合物。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物是从血清(比如人血清)中纯化的白蛋白组合物。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物具有大约100IU-ic/ml、90IU-ic/ml、50IU-ic/ml或10IU-ic/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，初始白蛋白组合物中白蛋白的浓度为大约1％(w/v)，包括例如大约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或30％。
在朊病毒除去过程期间，使配体和初始白蛋白组合物接触并允许和在初始白蛋白组合物中的朊病毒蛋白结合。基于配体的性质和它的对朊病毒蛋白的结合特异性，可确定并优化适合结合的条件以促进配体和朊病毒蛋白的结合。在一些实施方式中，在大约0℃到大约39℃，包括例如大约20℃到大约25℃的温度下进行结合。在大约4到大约10、包括例如大约5到大约9、大约6到大约8、大约6.8到大约7.5、大约6.9到大约7.4或大约7的pH下进行结合。任选地，封闭剂(blocking agent)可用于减少与配体的非特异性结合。
接触步骤之后，从剩余的组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。本文所用的术语“除去”指从包含白蛋白的组合物中分离配体和与其结合的蛋白质。根据配体和用于促进分离的支持材料(如有的话)的性质，可以以多种方式进行分离。例如配体和与其结合的蛋白质可通过层析法(色谱法)分离出，比如，但不限于，薄层层析、柱层析和分批层析；固体支撑和膜分离；反应器分离；磁分离；免疫分离；胶体分离；沉降作用；沉淀作用；或离心。
在一些实施方式中，配体可附着于支持材料比如珠或膜，其又允许接触初始白蛋白组合物。在足够引起形成朊病毒-配体复合物的条件下，固定配体的支持物被允许接触初始白蛋白组合物。固相接着从组合物中分开，借此从样品中除去和配体结合的朊病毒蛋白。例如，在一种示例性实施方式中，配体被固定在柱中，比如色谱柱中，样品(比如初始白蛋白组合物)接着由于重力或在压力下，比如在高压液体色谱柱中经过柱。样品中的朊病毒蛋白将与固定在柱上的配体结合，可收集流过的样品。使用相同的或不同的配体，该方法可重复数次以获得期望的结果。
可调整柱中样品(比如初始白蛋白组合物)的流速，以使配体和样品中朊病毒蛋白的结合最大化。在一些实施方式中，以大约0.1ml每分钟到大约5.0ml每分钟、大约0.1ml每分钟到大约2.5ml每分钟、大约0.1ml每分钟到大约0.25ml每分钟、大约0.25每分钟到大约0.5ml每分钟、大约0.5ml每分钟到大约1.0ml每分钟、大约1.0ml每分钟到大约1.5ml每分钟、大约1.5ml每分钟到大约2.0ml每分钟、大约2.0ml每分钟到大约2.5ml每分钟、大约2.5ml每分钟到大约3.0ml每分钟、大约3.0ml每分钟到大约3.5ml每分钟、大约3.5ml每分钟到大约4.0ml每分钟、大约4.0ml每分钟到大约4.5ml每分钟或大约4.5ml每分钟到大约5.0ml每分钟，包括例如大约0.1ml每分钟、0.25ml每分钟、0.5ml每分钟、1.0ml每分钟、1.5ml每分钟、1.7ml每分钟、1.8ml每分钟、1.9ml每分钟、2.0ml每分钟、2.1ml每分钟、2.3ml每分钟、2.5ml每分钟、2.7ml每分钟、3.0ml每分钟、3.5ml每分钟、4.0ml每分钟、4.5ml每分钟或5.0ml每分钟的流速进行结合。在一些实施方式中，流速为至少大约10ml每分钟，比如至少大约20ml每分钟、30ml每分钟、40ml每分钟、50ml每分钟的任何一个。
在结合过程期间还可调整总流过体积或总流过时间以使配体和样品(比如初始白蛋白组合物)中的朊病毒蛋白结合最大化。在一些实施方式中，总流过体积是柱体积的大约1倍到大约1000倍，包括例如柱体积的大约2倍到大约10倍、柱体积的大约10倍到大约20倍、柱体积的大约20倍到大约30倍、柱体积的大约30倍到大约40倍、柱体积的大约40倍到大约50倍、柱体积的大约50倍到大约1000倍、柱体积的大约50倍到大约500倍、柱体积的大约100倍到大约600倍或柱体积的大约200倍到大约800倍。在一些实施方式中，总流过体积是柱体积的大约100倍。在其他实施方式中，总流过体积是柱体积的大约500倍。在一些实施方式中，总流过时间是大约1小时到大约30小时，包括例如大约2小时到大约25小时、大约3小时到大约20小时，或大约3小时到大约17小时。在一些实施方式中，总流过时间是大约3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时的任何一个。在一些实施方式中，总流过时间大于大约24小时。在一些实施方式中，总流过时间小于大约8小时，包括例如7、6、5、4、3、2、1或0.5小时的任何一个。
可选地，在足够引起形成朊病毒-配体复合物的条件下，配体可首先和初始白蛋白组合物接触。接着随后通过使用柱，比如基于亲和层析法除去朊病毒-配体复合物。为了促进分离，配体可与结合伴侣缀合，以便配体/朊病毒复合物可通过结合伴侣，例如由使用包含识别结合伴侣的分子的亲和柱除去。
除了分批层析或柱层析，也考虑使用结合朊病毒蛋白的配体的许多其他构造、修改和变化。这些变化和修改包括，但不限于：分批过程、连续过程、移动床层析过程(moving bed chromatography processes)；低压、中压或高压过程；或小规模、中规模或大规模过程。在一些实施方式中，配体在膜、纤维珠上，被浸渍入非丝织网中，或包含在过滤器罩(filter housing)中的涂布纤维上。
在一些实施方式中，除去步骤不显著导致产率损失和/或白蛋白性质和/或稳定性的改变。在一些实施方式中，在其初始生物状态的白蛋白的回收率基本上保持至少超过50％，包括例如80％、90％或更高水平。在一些实施方式中，从朊病毒除去过程中白蛋白的回收率高于大约80％、90％、95％或99％的任何一个。在一些实施方式中，在朊病毒除去步骤之前，调整或控制初始白蛋白组合物中白蛋白的浓度，以在该过程期间，使白蛋白的非特异性结合和损失最小化。例如白蛋白的浓度可在大约1％到大约50％、大约5％到大约25％、大约5％到大约30％、大约5％到大约40％、大约5％到大约10％、大约10％到大约15％、大约15％到大约20％、大约20％到大约25％、大约25％到大约30％等的范围内，包括例如大约5％、10％、15％、20％、25％或30％的白蛋白。
可分析所得白蛋白组合物以测定朊病毒除去过程的清除率。还可分析具有结合的朊病毒蛋白的配体(直接或洗脱后)以测定清除率。
基于朊病毒蛋白的减少或传染性的降低，评估朊病毒的除去。在一些实施方式中，至少大约50％，包括例如至少大约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的朊病毒蛋白被从初始白蛋白组合物中除去。在一些实施方式中，除去后白蛋白组合物的传染性比初始白蛋白组合物的传染性至少小大约10×、20×、30×、40×、50×、80×、100×、200×、500×、1000×、104×、105×、106×、107×、108×、109×。
在一些实施方式中，连续传染性用于测定朊病毒除去过程的清除率。制备样品的连续稀释物，且检查稀释物的传染活性，例如在实验动物中。其中一半动物被感染的稀释是感染效价。例如如果需要5倍稀释，那么样品可定义为具有5对数的传染性。通过比较初始白蛋白组合物的对数传染性和除去后白蛋白组合物的对数传染性，技术人员可测定朊病毒除去过程的清除率。在一些实施方式中，朊病毒除去方法产生1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4、5、6、7、8、9或10对数的任何一个的传染性降低。
在一些实施方式中，基于通过本文描述用于朊病毒除去方法的下列步骤利用传染性材料的外加实验(spiking experiments)，测定朊病毒除去过程的清除率。适合的外加剂包括，但不限于，脑匀浆、微粒体、细胞膜穴样结构域(caveolae-like domains)、纯化的PrPsc和朊病毒原纤维。在一些实施方式中，外加剂是清洁剂溶解的(比如肌氨酰溶解的)。在一些实施方式中，在组合物中外加比例在大约0.001％到大约5％、大约0.001％到大约0.25％、大约0.001％到大约0.1％、大约0.001％到大约0.005％、大约0.005％到大约0.075％、大约0.075％到大约0.01％、大约0.01％到大约0.1％、大约0.1％到大约0.5％、大约0.5％到大约0.75％、大约0.75％到大约1％、大约1％到大约2％、大约2％到大约3％或大约3％到大约5％的范围内，包括例如大约0.001％、0.005％、0.075％、0.01％、0.1％、0.5％、0.75％、1％、2％、3％或5％。
在一些实施方式中，减少系数(reduction factor，RF)用于测定朊病毒除去过程的清除率。可使用下列公式计算RF：
RF＝(V1×T1)/(V2×T2)
或
Log10[RF]＝[Log10(V1)+Log10(T1)]-[Log10(V2)+Log10(T2)]。
其中V1和T1分别是初始白蛋白组合物的体积和效价(titre)，和V2和T2是除去后白蛋白组合物的体积和效价。最终计算之后减少系数可四舍五入到1位小数。在一些实施方式中，减少系数至少大约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0log10传染性的朊病毒蛋白被从初始白蛋白组合物中除去。例如在外加20％白蛋白组合物的0.5％肌氨酰溶解的部分中朊病毒蛋白可被除去大于或等于2.5log10的减少系数。作为另一个实例，在外加25％白蛋白组合物的0.5％肌氨酰溶解的部分中朊病毒蛋白可被除去大于或等于2.0log10的减少系数。
可通过标准的蛋白质印迹分析评估朊病毒的除去。例如，结合后配体可首先用消化所有PrPc但不消化PrPsc的蛋白酶K处理。消化物接着在SDS凝胶上电泳并转移印迹到硝化纤维或PVDF膜的片上。分离的PrPsc带接着使用3F4或6H4可视化。3F4与来自人、仓鼠和猫科的氨基酸残基109-112PrP反应。在一种示例性实施方式中，以0.6ug/ml的浓度进行温育最少一个小时，其后，过量的抗体被冲洗掉并将膜与兔抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物(1∶1000稀释)温育最少一个小时。用TTBS大量冲洗之后，使用增强化学发光，使膜显影。在一些实施方式中，根据《就vCJD风险研究血浆源医药产品的制造过程的指南》中提供的标准(CPMP5136/03)，评估朊病毒蛋白的除去。
能够和朊病毒蛋白和支持材料结合的配体
本文使用的“配体”指和朊病毒蛋白或肽结合的分子。“能够与朊病毒蛋白结合的配体”指在适合的条件下和朊病毒蛋白特异性结合的配体。在一些实施方式中，配体和人朊病毒蛋白特异性结合。在一些实施方式中，配体和仓鼠朊病毒蛋白特异性结合。在一些实施方式中，配体和小鼠蛋白特异性结合。在一些实施方式中，配体和来自多物种的朊病毒蛋白结合。例如在一些实施方式中，配体和人朊病毒蛋白、仓鼠朊病毒蛋白和小鼠朊病毒蛋白结合。
在一些实施方式中，配体利用高结合亲和性和朊病毒蛋白(比如人朊病毒蛋白、仓鼠朊病毒蛋白和/或小鼠朊病毒蛋白)结合。例如，在一些实施方式中，配体具有大于大约107、108、109、1010或1011的任何一个的结合系数(Kassociation)。
已经识别许多可结合朊病毒蛋白的配体，并可因此用在本发明的方法中。见，例如WO04/090102、WO04/050851、WO06/010915和WO06/044459。这些包括，例如特异性识别朊病毒蛋白的肽、化合物和抗体。配体可被用于从组合物中除去所有形式的朊病毒蛋白或可被选择性地选择以检测或除去单一形式的朊病毒蛋白。
在一些实施方式中，用于除去朊病毒的配体是肽，比如在PCT公开申请号WO04/05051中描述的肽。例如在一些实施方式中，配体是具有在表1中显示的SEQ ID NOs：1-232任何一个的氨基酸的肽。在一些实施方式中，配体是三肽，比如具有SEQ ID NO：48、102、105、108、109、110、111、143、148、193、194、195、202、203、204或210任何一个的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，配体是具有6个氨基酸的肽，比如具有SEQ ID NO：152、153、180、181、182、183、185、186、187、188、189或190任何一个的氨基酸序列的六聚体(6-mers)。在一些实施方式中，配体具有SEQ ID NO：150或151的氨基酸序列。
表1-结合朊病毒序列的氨基酸序列
表1(继续)
  (na)HEIFPA(SEQ ID NO：164)   WEE(SEQ ID NO：207)
  aKWYHHRA(SEQ ID NO：165)   LLR(SEQ ID NO：208)
  HWWPHNA(SEQ ID NO：166)   SYF(SEQ ID NO：209)
  HWQVFYA(SEQ ID NO：167)   EYY(SEQ ID NO：210)
  FHE(na)EIA(SEQ ID NO：168)   DRDLTFA(SEQ ID NO：211)
  HADF(na)QA(SEQ ID NO：169)   HNWWIIA(SEQ ID NO：212)
  ALHFETA(SEQ ID NO：170)   EVKIGNA(SEQ ID NO：213)
  DDPTGFA(SEQ ID NO：171)   SIV(SEQ ID NO：214)
  VAPGLGA(SEQ ID NO：172)   AYP(SEQ ID NO：215)
  IFRLIEA(SEQ ID NO：173)   EVADEEA(SEQ ID NO：216)
  GLERPEA(SEQ ID NO：174)   EYYVDAA(SEQ ID NO：217)
  IVVRLWA(SEQ ID NO：175)   YDNPIDA(SEQ ID NO：218)
  WHNPHYA(SEQ ID NO：176)   YFNEHEA(SEQ ID NO：219)
  LIYKSDA(SEQ ID NO：177)   EWGADGA(SEQ ID NO：220)
  EKPIFNA(SEQ ID NO：178)   DVIYSHA(SEQ ID NO：221)
  HWSEPAA(SEQ ID NO：179)   WHILEEA(SEQ ID NO：222)
  GHNWKEA(SEQ ID NO：180)   NPHENFA(SEQ ID NO：223)
  YWHHDDA(SEQ ID NO：181)   HEDNGGA(SEQ ID NO：224)
  GYPKENA(SEQ ID NO：182)   SDSEGPA(SEQ ID NO：225)
  PVYWLYA(SEQ ID NO：183)   EFQEFTA(SEQ ID NO：226)
  FGEHTPA(SEQ ID NO：184)   QEGDEIA(SEQ ID NO：227)
  FQGTREA(SEQ ID NO：185)   DIYAETA(SEQ ID NO：228)
  TGTNRYA(SEQ ID NO：186)   DRVRETA(SEQ ID NO：229)
  KWATRYA(SEQ ID NO：187)   FEEPQWA(SEQ ID NO：230)
  NSTKFDA(SEQ ID NO：188)   FEGEEFA(SEQ ID NO：231)
  LIYKEEA(SEQ ID NO：189)   (T/L)FNIHA(SEQ ID NO：232)
  EHATYRA(SEQ ID NO：190)
  HND(SEQ ID NO：191)
  HER(SEQ ID NO：192)
  HGD(SEQ ID NO：193)
  HSD(SEQ ID NO：194)
  HFD(SEQ ID NO：195)
  WND(SEQ ID NO：196)
  YEH(SEQ ID NO：197)
  HWD(SEQ ID NO：198)
  YHD(SEQ ID NO：199)
  YDW(SEQ ID NO：200)
  WDY(SEQ ID NO：201)
HYD(SEQ ID NO：202)
HWD(SEQ ID NO：203)
在一些实施方式中，配体是DVR、SYA、AMN31、D4或YVHEA的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，配体是以与DVR、SYA、AMN31、D4或YVHEA相似或更高的亲和力结合朊病毒蛋白的肽。在一些实施方式中，配体是DVR。在其他实施方式中，配体是AMN31。在一些实施方式中，以树脂的形式(比如和树脂结合)提供肽配体。
在一些实施方式中，配体是识别朊病毒蛋白的抗体。在本领域中识别朊病毒蛋白的抗体是已知的。这些包括，但不限于，单克隆抗体3F4、6H4或16A18。在一些实施方式中，抗体是糖形特异性抗体，比如ICSM-4和ICSM-10。适合用于本文描述的方法的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体、单链抗体、Fab片段和Fv片段。
在一些实施方式中，配体结合朊病毒蛋白的特异性序列。例如，在一些实施方式中，配体(比如肽配体或抗体配体)结合列在表2中的朊病毒蛋白序列SEQ ID NOs：133-146的任何一个。
表2-朊病毒氨基酸序列
在一些实施方式中，配体是化合物。可发现能够和朊病毒蛋白结合的化合物，例如在PCT申请公开号WO06/010915中，以其整体并入本文。在一些实施方式中，配体是取代的三嗪。在一些实施方式中，配体是具有式(I)的化合物，用于亲和结合朊病毒蛋白：
其中R1和R2是相同的或不同的，并且每个为任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基基团；R3是氢或芳基取代基，或R3是通过间隔区任选连接的固体支持物；Z表示氧原子、硫原子或NR4；Y表示氧原子、硫原子或NR5；其中，可相同或不同的R4和R5表示氢、包含1到6个碳原子的任选取代的烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯甲基或任选取代的β-苯乙基；和X1和X2的一个表示氮原子以及X1和X2的另一个表示氮原子或CR6，其中R6表示氢或芳基取代基。
在一些实施方式中，配体是式(II)的化合物，用于亲和结合朊病毒蛋白，
其中R1表示基团-(CH2)m-Q1，其中m从0到7，和Q1表示-CR11R12R13或-NR11R12，其中R11、R12和R13独立地表示氢、烷基、环烷基或杂环烷基，或R11、R12和R13的两个连同与它们连接的碳原子或氮原子一起形成任选取代的环烷基或任选取代的杂环烷基基团；R2表示基团-(CH2)n-Q2，其中n从0到7，和Q2表示-CR21R22R23或-NR21R22，其中R21、R22和R23独立地表示氢、烷基、环烷基或杂环烷基，或R11、R12和R13的两个连同与它们连接的碳原子或氮原子一起形成任选取代的环烷基或任选取代的杂环烷基基团，和R3是氢或芳基取代基，或R3是通过间隔区任选连接的固体支持物；Z表示氧原子、硫原子或NR4；Y表示氧原子、硫原子或NR5；其中可相同或不同的R4和R5表示氢、包含1到6个碳原子的任选取代的烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯甲基或任选取代的β-苯乙基；和X1和X2的一个表示氮原子并且X1和X2的另一个表示氮原子或CR6，其中R6表示氢或芳基取代基。
在一些实施方式中，a)X1和X2二者都是氮；b)Z和Y二者都表示NR4，尤其是其中R4是氢；c)m从0到4，更优选地从0到3，和最优选地从1到3；d)Q1是-NR11R12；和R11和R12优选地连同它们连接的氮原子一起形成杂环烷基基团；e)n从0到4，更优选地从0到2，和最优选地是0；和f)R21和R22连同它们连接的碳原子或氮原子一起形成环烷基或杂环烷基基团。
在一些实施方式中，Q2表示疏水的环烷基或杂环烷基基团，特别是具有包含至少6个原子的环系统。
在一些实施方式中，Q1表示杂环烷基基团，特别是哌啶基，尤其是1-哌啶基，或哌嗪基，尤其是1-哌嗪基。
在一些实施方式中，配体是式(III)的化合物，用于亲和结合朊病毒蛋白，
其中R1表示亚烷基链-(CH2)p-CH3，其中p从0到6，被一个或多个羧基取代和任选地被一个或多个进一步的烷基取代基取代；R2表示基团-(CH2)q-Ar，其中q从0到7，和Ar表示任选取代的芳基；和R3是氢或芳基取代基，或R3是通过间隔区任选连接的固体支持物；Z表示氧原子、硫原子或NR4；Y表示氧原子、硫原子或NR5；其中可相同或不同的R4和R5表示氢、包含1到6个碳原子的任选取代的烷基、任选取代的苯基、任选取代的苯甲基或任选取代的β-苯乙基；和X1和X2的一个表示氮原子，并且X1和X2的另一个表示氮原子或CR6，其中R6表示氢或芳基取代基。
在一些实施方式中，a)X1和X2二者都是氮；b)Z和Y二者都表示NR4，尤其是其中R4是氢；c)p从0到4，更优选地从0到3；d)R1被一个或两个羧基取代，那些羧基的至少一个由亚烷基链-(CH2)p-CH3的末端碳原子携带；e)q从0到4，更优选地从0到3，和最优选地是1或2；和f)Ar是单环碳环基团或杂环芳香基团，任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自由苯基、苯氧基、甲苯基、氯苄基、甲氧基苄基、氟苄基、吡啶基和吲哚基。
在一些实施方式中，R1是羧甲基、4-羧丁基或1-(1，3-二羧基)丙基。
在一些实施方式中，Ar是苯基、4-羟苯基或吡啶基，尤其是2-吡啶基。
在一些实施方式中，R3是氢或芳基取代基，或R3是通过间隔取任选连接的固体支持物；X1和X2二者都是N；Y和Z二者都表示NH；m表示2；Q1表示哌啶基或哌嗪基；n表示0或2；和Q2表示1-哌啶基或金刚烷基。
在一些实施方式中，R3是氢或芳基取代基，或R3是通过间隔区任选连接的固体支持物；X1和X2二者都是N；Y和Z二者都表示NH；R1表示羧甲基、4-羧丁基和1-(1，3-二羧基)丙基；q表示2；和Ar表示苯基、2-吡啶基或4-羟苯基。
在一些实施方式中，配体是无机化合物或组分，比如，但不限于，铝(比如氧化铝)或硅(比如熔凝硅石)。在一些实施方式中，无机化合物是Al2O3或SiO2.
在一些实施方式中，配体包含一个或多个官能团。本文所用的术语“官能团”表示赋予分子或材料特征性化学、物理或物理化学行为的化学基团、亚基或亚结构。本文描述的官能团包括，但不限于，亲水的，比如带正电的、带负电的或不带电的或中性的或疏水的。也考虑两性的或多功能的官能团，并落在本发明的范围内。官能团包括有机官能团和无机官能团。优选的官能团包括胺、苯基或亚硫酸根基团。优选的胺基团是伯、仲、叔、季铵离子比如二甲基氨基乙基(DMAE)或三甲基氨基乙基(TMAE)。
其他示例性官能团包括，但不限于：-CH2-CHOH-CH2NH2；-C6H5；-(CH2)3-CH3；-CH2-CH2-NH(C2H5)2；-SO2-CH2-CF3′-CH2-CH2-H(CH3)2；-CH2-CH2-(CH3)3；-SO3 2-。其他有用的官能团包括磺酰基和三氟代乙烷磺酰基(tresyl)。应当理解官能团可固有地在配体中出现，或可通过化学改性，添加到配体。
在一些实施方式中，配体包含氨基。这些包括，例如氨基树脂，比如ToyopearlTMAmino-650M、ToyopearlTMAmino-AMN31、TSK-GELTM-Amino750C或其功能等同物。在一些实施方式中，配体包含苯基。这些包括，例如TSK-GELTMPhenyl-5PW或其功能等同物。
在一些实施方式中，配体是聚合材料，比如层析树脂(例如氨基树脂)，其和朊病毒蛋白选择性和特异性结合。层析树脂的例子是PRDT朊病毒减少树脂(Prion Reduction Resin)(ProMetic Biosciences，Ltd，211Cambridge SciencePark，MiltonRoad，Cambridge，CB40WA，UK)。在一些实施方式中，聚合材料包含一个或多个官能团，比如上述官能团。在一些实施方式中，配体是具有甲基丙烯酸酯骨架的聚合材料，比如，但不限于，商业上可得的TSK、TOYOPEARL或FACTOGEL树脂(TosohBioscience，Montgomeryville，PA)。
可在本发明方法中使用的其他配体包括，例如，与淀粉样蛋白斑相互作用的配体，例如Congo：E；Led(Ingrosso，L.，等，CongoRed：Prolongsthe Incubationin Scrapin-infected Hamsters.Virology 69：506-508(1995))；1，4-碘，4-脱氧阿霉素(Tagliavini，F.，等，Effectiveness of AnthracyclineAgainst Exprimental Prionin Syrian Hamsters.Science 276：1119-1122(1997))；两性霉素13、卟啉和酞菁(Priola，S.A.，等，Porphyrin andPhthalocyanine Antiscrapie Compounds，Science 287：1503-1506(2000))；金属(Stocker等，Biochemistry，37，7185-7193(1998))；与PrP相互作用形成复合物的肽(见Prusiner等和Solo，C.等美国专利5,750,361，Reversion of Prion Protien Conformational Changesin Syntheticp-sheetBreakerPeptides，Lances，355：192-197(2000))；肝素和其他聚硫酸化聚阴离子(Caughey，B.等，Binding of the Protease-sensitive Form ofPrionProtein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and CongoRed，J.Virology 68：2135-2141(1994))；抗体(Kascsak，R.J.，等，Immunodiagnosisof Prion Disease，Immunologicaln Invest.26：259-268(1997))；和其他蛋白质，例如，纤维蛋白溶酶原(Fischer，M.B.等，Binding ofDisease-associated Prion Protein to：Plasminogen.，Nature 408：479-483(2000))。
配体可附着于任何支持材料。本文所用的“支持材料”指可提供使配体和与其结合的蛋白质与组合物剩余部分分离的物理或化学手段的任何化合物或材料。支持材料可以是颗粒状或非颗粒状，可溶的或不可溶的，多孔的或非多孔的。
支持材料的例子包括，但不限于，天然存在的聚合物，例如多糖，比如琼脂糖、藻酸盐、角叉藻聚糖、壳多糖、纤维素、葡聚糖或淀粉；合成聚合物，比如聚丙烯酰胺、聚苯丙烯、聚丙烯醛、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、全氟碳；无机化合物，比如二氧化硅、玻璃、硅藻土、氧化铝、氧化铁或其他金属氧化物，或由两种或多种天然存在的聚合物、合成聚合物或无机化合物的任何组合组成的共聚物。还考虑的是可溶支持材料，其包括提供用于液体分配的亲和配体基体缀合物的聚合物，比如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇或水解淀粉。
在一些实施方式中，支持材料是固体支持物(载体)，比如柱、珠、膜、筒、滤纸、浸渍片、微量滴定板、试管、固体粉末、铸造或挤压成形模块、网、磁颗粒复合材料，或任何其他固体材料。固体材料可用物质比如聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯丙烯、聚丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、人造纤维、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏氟乙烯(PVDF)、硅氧烷、聚甲醛、纤维素、乙酸纤维素、硝酸纤维素等涂布。可选地，使用形成凝胶的物质，比如蛋白质(例如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。还可使用聚合物比如葡聚糖、聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)或表面活性剂，比如磷脂，长链(12-24个碳原子)烷基铵盐等。配体附着于或分散在整个支持材料中。
在一些实施方式中，支持材料是活化的琼脂糖、二氧化硅、纤维素、玻璃、甲基丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、苯乙烯二乙烯基苯、Hyper D或全氟碳。在一些实施方式中，支持材料是以商标名Toyopearl(从Tosoh BioscienceLLC，156 Keystone Drive，Montgomeryville，PAI18936，USA可得)出售的甲基丙烯酸酯类型的材料。WO97/10887描述了使亲和配体附着于支持基体的方法，例如使用活化方法，和使亲和配体通过间隔区例如通过缩合反应连接于(附着于)基体以形成亲和配体-基体缀合物的方法。
在一些实施方式中，配体和/或支持材料可重复使用。在一些实施方式中，配体和/或支持材料仅使用一次。
可通过测定配体中的感染效价评估配体的朊病毒结合能力。例如制备参照材料的系列稀释并在标准蛋白质印迹试验中测试。从参照材料中观察到的效价与在生物测定中观察到的相应效价比较。使用下式，可将蛋白质印迹效价随后转化为感染效价：效价[生物测定]＝效价[蛋白质印迹]+(线性回归分析的截距)/(线性回归分析的斜率)。计算出每ml的感染效价后，可测定结合在柱上的总的朊病毒蛋白。使用观察到的直接结合于配体的朊病毒蛋白的量，测定配体的朊病毒结合能力。在一些实施方式中，配体的朊病毒结合能力至少为大约每毫升配体2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.5或10.0log10ID50。在一些实施方式中，配体的朊病毒结合能力至少为每毫升配体大约102、103、104、105、106、107或108ID50。
制造纳米颗粒的方法
本领域中制造包含白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂的组合物的方法是已知的。例如可在高剪切力的条件下(例如超声处理、高压均浆或类似方法)制备包括基本上不溶于水的药学活性剂和白蛋白的纳米颗粒。这些方法在例如美国专利号5,916,596；6,506,405；6,749,868，和6,537,579中公开并且也在美国专利公开号2005/0004002和2007/0082838和PCT公开WO99/00113中公开，每一篇通过引用以它们的整体并入。
在一种示例性实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂(例如紫杉醇)被溶解在有机溶剂中。适合的有机溶剂包括，例如酮类、酯类、醚类、氯化的溶剂和其他本领域已知的溶剂。例如，有机溶剂可以是二氯甲烷。在一些实施方式中，有机溶剂可以是不能和水混合的溶剂(比如氯仿)和可溶于水的溶剂(比如可溶于水的醇溶剂，比如氯仿/甲醇、氯仿/乙醇、氯仿/丙醇，或氯仿/叔丁醇(例如以大约1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1的任何一个的比例(v/v)或以大约3∶7、5∶7、4∶6、5∶5、6∶5、8∶5、9∶5、9.5∶5、5∶3、7∶3、6∶4或9.5∶0.5的任何一个的比例(v/v))的混合物。添加该溶液到白蛋白(例如人血清白蛋白)。使混合物经历高压匀浆(例如使用标准的匀浆设备)。乳液可循环穿过高压匀化器进行大约2到大约100个循环，比如大约5到大约50个循环或大约8到大约20个循环(例如大约8、10、12、14、16、18或20个循环的任何一个)。然后，可利用用于该目的已知的合适设备，包括，但不限于，旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、刮膜蒸发器、喷雾干燥器等，通过蒸发作用除去有机溶剂。例如在减压(比如在大约5mmHg、10mmHg、15mmHg、20mmHg、25mmHg、30mmHg、40mmHg、50mmHg、100mmHg、200mmHg或300mmHg的任何一个)下除去溶剂。基于制剂的体积可调整用于在减压条件下除去溶剂的时间量。例如对于在300mL规模产生的制剂，可在大约1到大约300mmHg(例如大约5-100mmHg、10-50mmHg、20-40mmHg或25mmHg的任何一个)下持续大约1到大约120分钟，包括大约5到大约60分钟(例如大约7、8、9、10、11、12、13、14、1516、18、20、25或30分钟的任何一个)除去溶剂。
如果期望，白蛋白溶液(比如除去朊病毒的白蛋白溶液)可被添加到分散体以调整白蛋白和药物(例如紫杉醇)的比例或调整紫杉烷(例如紫杉醇)在分散体中的浓度。例如可添加白蛋白溶液(例如25％w/v)以调整白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂(例如紫杉醇)的比例到大约18∶1、15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7.5∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17或1∶18的任何一个。例如添加白蛋白溶液(例如25％w/v)或另一种溶液以调整基本上不溶于水的药学活性剂(例如紫杉醇)在分散体中的浓度到大约0.5mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml或50mg/ml的任何一个。可通过一个或多个滤纸，比如1.2μm、0.8μm、0.45μm和0.22μm滤纸；其两个或多个的组合，或与本领域已知的任何其他过滤器的组合，单独或连续过滤分散体。
如果期望，第二治疗(例如一种或多种可用于治疗癌症的化合物)、抗微生物剂(比如柠檬酸盐或乙二胺四乙酸盐)、糖(比如蔗糖)和/或稳定剂也可包括在组合物中。该额外的试剂可在制备组合物期间和基本上不溶于水的药学活性剂(例如紫杉醇)和/或白蛋白混合，或者在纳米颗粒组合物制备之后添加。在一些实施方式中，在冻干之前使该试剂与纳米颗粒组合物混合。在一些实施方式中，试剂添加到冻干的组合物中。在一些实施方式中，当试剂的添加改变组合物的pH时，组合物中的pH一般(但不是必须)被调整到期望的pH。组合物的示例性pH值包括，例如在大约5到大约8.5的范围内。在一些实施方式中，组合物的pH被调整到不小于大约6，包括例如不小于大约6.5、7或8(例如大约8)的任何一个。
如下面更详细的描述，朊病毒除去过程可以和制造过程同时进行。例如，朊病毒除去过程可在白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂的混合物形成之后且使混合物经历高剪切条件之前进行。在一些实施方式中，朊病毒除去过程可在混合物经历高剪切条件之后并且在有机溶剂除去之前进行。在一些实施方式中，朊病毒除去过程可在除去有机溶剂之后进行。在一些实施方式中，在朊病毒除去过程之前，添加额外的白蛋白到蒸发后的悬浮液中。在一些实施方式中，朊病毒除去过程在无菌条件下进行。在一些实施方式中，通过使用同时无菌过滤组合物的筒，进行朊病毒除去过程。
从纳米颗粒组合物或中间组合物中除去朊病毒的方法
一方面，本发明提供了包括从纳米颗粒组合物，比如通过上述方法形成的纳米颗粒组合物中除去朊病毒蛋白的方法。另一方面，提供了从在纳米颗粒制造过程期间产生的中间组合物(下文称为“中间组合物”)中除去朊病毒蛋白的方法。
一般地，方法包括使组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，所述组合物包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，和从纳米颗粒组合物中除去配体和与其结合的蛋白。使用相同的或不同的配体，该过程可重复一次或多次。在朊病毒除去过程中还可同时使用两种或多种配体。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物或中间组合物具有大约100IU-ic/ml、90IU-ic/ml、50IU-ic/ml或10IU-ic/ml的朊病毒传染性。
在朊病毒除去过程期间，使配体和纳米颗粒组合物或中间组合物接触并允许结合在纳米颗粒组合物或中间组合物中的朊病毒蛋白。基于配体的性质和它对朊病毒蛋白的结合特异性，可确定并优化适合结合的条件以促进配体和朊病毒蛋白的结合。在一些实施方式中，在大约0℃到大约39℃，包括例如大约20℃到大约25℃的温度下进行结合。可在大约4到大约10，包括例如大约5到大约9、大约6到大约8、大约6.8到大约7.5、大约6.9到大约7.4或大约7的pH下进行结合。任选地，封闭剂可用于减少非特异性结合配体。
接触步骤之后，使配体和与其结合的蛋白质与组合物剩余部分分离。根据配体和用于促进分离的支持材料(如有的话)的性质，可以以多种方式进行分离。例如，配体和与其结合的蛋白质可通过层析法分离出，比如，但不限于，薄层层析、柱层析和分批层析；固体支撑和膜分离；反应器分离；磁分离、免疫分离；和胶体分离。
在一些实施方式中，配体可被固定在支持物比如珠或膜上，其又允许接触纳米颗粒组合物或中间组合物。在足够引起形成朊病毒-配体复合物的条件下，固定配体的支持物被允许接触纳米颗粒组合物或中间组合物。固相接着从组合物中分离，从而从样品中除去和配体结合的朊病毒蛋白。例如，在一种示例性实施方式中，配体固定在柱中，比如层析柱中，样品(比如纳米颗粒组合物)接着由于重力或在压力下，比如在高压液体层析柱中经过柱。样品中的朊病毒蛋白将与固定在柱上的配体结合，并可收集流过的样品。该方法可重复数次以获得期望的结果。
可调整柱中样品(比如纳米颗粒组合物或中间组合物)的流速以使配体和在样品中的朊病毒蛋白的结合最大化。在一些实施方式中，以大约0.1ml每分钟到大约5.0ml每分钟、大约0.1ml每分钟到大约2.5ml每分钟、大约0.1ml每分钟到大约0.25ml每分钟、大约0.25每分钟到大约0.5ml每分钟、大约0.5ml每分钟到大约1.0ml每分钟、大约1.0ml每分钟到大约1.5ml每分钟、大约1.5ml每分钟到大约2.0ml每分钟、大约2.0ml每分钟到大约2.5ml每分钟、大约2.5ml每分钟到大约3.0ml每分钟、大约3.0ml每分钟到大约3.5ml每分钟、大约3.5ml每分钟到大约4.0ml每分钟、大约4.0ml每分钟到大约4.5ml每分钟或大约4.5ml每分钟到大约5.0ml每分钟，包括例如大约0.1ml每分钟、0.25ml每分钟、0.5ml每分钟、1.0ml每分钟、1.5ml每分钟、1.7ml每分钟、1.8ml每分钟、1.9ml每分钟、2.0ml每分钟、2.1ml每分钟、2.3ml每分钟、2.5ml每分钟、2.7ml每分钟、3.0ml每分钟、3.5ml每分钟、4.0ml每分钟、4.5ml每分钟或5.0ml每分钟的流速进行结合。在一些实施方式中，流速为至少大约10ml每分钟，比如至少大约20ml每分钟、30ml每分钟、40ml每分钟、50ml每分钟的任何一个。
在结合过程期间还可调整总流过体积或总流过时间以使配体和在样品(比如纳米颗粒组合物或中间组合物)中的朊病毒蛋白结合最大化。在一些实施方式中，总流过体积为柱体积的大约50倍到大约1000倍，包括例如柱体积的大约50倍到大约500倍、柱体积的大约100倍到大约600倍或柱体积的大约200倍到大约800倍。在一些实施方式中，总流过体积大约为柱体积的100倍。在其他实施方式中，总流过体积大约为柱体积的500倍。在一些实施方式中，总流过时间是大约1小时到大约30小时，包括例如大约2小时到大约25小时、大约3小时到大约20小时或大约3小时到大约17小时。在一些实施方式中，总流过时间是大约3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时的任何一个。在一些实施方式中，总流过时间大于大约24小时。在一些实施方式中，总流过时间小于大约8小时，包括例如7、6、5、4、3、2、1或0.5小时的任何一个。
可选地，在足够引起形成朊病毒-配体复合物的条件下，配体可首先和纳米颗粒组合物或中间组合物接触。接着随后通过使用柱，比如基于亲和性层析法除去朊病毒-配体复合物。为了促进分离，配体可与结合伴侣缀合，以便配体/朊病毒复合物可通过结合伴侣，例如由使用包含识别结合伴侣的分子的亲和柱除去。
除了分批层析或柱层析，也考虑使用结合朊病毒蛋白的配体的许多其他构造、修改和变化。这些变化和修改包括，但不限于：分批过程、连续过程、移动床层析过程；低压、中压或高压过程；或小规模、中规模或大规模过程。在一些实施方式中，配体在膜、纤维珠上，被浸渍入非丝织网中，或包含在过滤器罩中的涂布纤维上。
在一些实施方式中，除去步骤不显著导致产率损失和/或白蛋白性质和/或稳定性的改变。为了实践的目的，在其初始生物状态的白蛋白的回收率应该基本上保持在至少超过50％，包括例如80％、90％或更高水平。在一些实施方式中，从朊病毒除去过程中白蛋白的回收率高于大约80％、90％、95％或99％的任何一个。在一些实施方式中，在朊病毒除去步骤之前，调整或控制初始白蛋白组合物中白蛋白的浓度，以在该过程期间，使白蛋白的非特异性结合和损失最小化。例如白蛋白的浓度可在大约1％到大约50％、大约5％到大约25％、大约5％到大约30％、大约5％到大约40％、大约5％到大约10％、大约10％到大约15％、大约15％到大约20％、大约20％到大约25％、大约25％到大约30％等的范围内，包括例如大约5％、10％、15％、20％、25％或30％的白蛋白。
在一些实施方式中，除去步骤不显著导致产率损失和/或改变组合物中纳米颗粒的性质和/或稳定性。
在一些实施方式中，除去步骤不显著导致产率损失和/或改变组合物中基本上不溶于水的药剂药学活性剂的性质或装载量。
在一些实施方式中，除去步骤不显著导致改变组合物中白蛋白与基本上不溶于水的药剂的比例。
可分析已除去朊病毒的组合物以测定朊病毒除去过程的清除率。还可分析具有结合的朊病毒蛋白的配体(直接或洗脱后)以测定清除率。
基于朊病毒蛋白水平的减少和/或传染性的降低，测定朊病毒蛋白的除去。在一些实施方式中，至少大约50％，包括例如至少大约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的朊病毒蛋白被从纳米颗粒组合物中除去。在一些实施方式中，除去后白蛋白组合物的传染性比纳米颗粒组合物的传染性至少小大约10×、20×、30×、40×、50×、80×、100×、200×、500×、1000×、104×、105×、106×。
在一些实施方式中，连续传染性用于测定朊病毒除去过程的清除率。制备样品的连续稀释物，且检查稀释物的传染活性，例如在实验动物中。其中一半动物被感染的稀释是感染效价。例如如果需要5倍稀释，那么样品可定义为具有5对数的传染性。通过比较纳米颗粒组合物的对数传染性和除去后纳米颗粒组合物的对数传染性，可测定朊病毒除去过程的清除率。在一些实施方式中，朊病毒除去方法产生1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4、5、6、7、8、9或10对数的任何一个的传染性降低。
在一些实施方式中，基于通过本文描述用于朊病毒除去方法的下列步骤利用传染性材料的外加实验，测定朊病毒除去过程的清除率。适合的外加剂包括，但不限于，脑匀浆、微粒体、细胞膜穴样结构域、纯化的PrPsc和朊病毒原纤维。在一些实施方式中，外加剂是清洁剂溶解的(比如肌氨酰溶解的)。在一些实施方式中，在组合物中外加比例在大约0.001％到大约5％、大约0.001％到大约0.25％、大约0.001％到大约0.1％、大约0.001％到大约0.005％、大约0.005％到大约0.075％、大约0.075％到大约0.01％、大约0.01％到大约0.1％、大约0.1％到大约0.5％、大约0.5％到大约0.75％、大约0.75％到大约1％、大约1％到大约2％、大约2％到大约3％或大约3％到大约5％的范围内，包括例如大约0.001％、0.005％、0.075％、0.01％、0.1％、0.5％、0.75％、1％、2％、3％、或5％。
在一些实施方式中，减少系数(RF)用于测定朊病毒除去过程的清除率。可使用下列公式计算RF：
RF＝(V1×T1)/(V2×T2)
或
Log10[RF]＝[Log10(V1)+Log10(T1)]-[Log10(V2)+Log10(T2)]。
其中V1和T1分别是初始白蛋白组合物的体积和效价，和V2和T2是除去后白蛋白组合物的体积和效价。最终计算之后减少系数可四舍五入到1位小数。在一些实施方式中，减少系数至少大约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，或8.0log10传染性的朊病毒蛋白被从初始白蛋白组合物中除去。例如在外加20％白蛋白组合物的0.5％肌氨酰溶解的部分中朊病毒蛋白可被除去大于或等于2.5log10的减少系数。作为另一个实例，在外加25％白蛋白组合物的0.5％肌氨酰溶解的部分中朊病毒蛋白可被除去大于或等于2.0log10的减少系数。
可通过标准的蛋白质印迹分析评估朊病毒的除去。例如，结合后配体可首先用消化所有PrPc但不消化PrPsc的蛋白酶K处理。消化物接着在SDS凝胶上电泳并转移印迹到硝化纤维或PVDF膜片上。分离的PrPsc带接着使用3F4或6H4可视化。3F4与来自人、仓鼠和猫科的氨基酸残基109-112PrP反应。在一种示例性实施方式中，以0.6ug/ml的浓度进行温育最少一个小时，其后，过量的抗体被冲洗掉并将膜与兔抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物(1∶1000稀释)温育最少一个小时。用TTBS大量冲洗之后，使用增强化学发光，使膜显影。在一些实施方式中，根据《就vCJD风险研究血浆源医药产品的制造过程的指南》中提供的标准(CPMP5136/03)，评估朊病毒蛋白的除去。
本文还考虑在朊病毒除去过程期间制造的组合物。因此，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，进一步包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒和能够与朊病毒蛋白结合的配体的混合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述配体附着于支持材料，比如本文描述的一种或多种支持材料。在一些实施方式中，提供了装载有包含纳米颗粒的组合物的柱，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中柱包含能够与朊病毒蛋白结合的配体。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒和树脂的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述树脂包括能够结合朊病毒蛋白的配体。例如，在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒和DVR树脂的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，提供了包含纳米颗粒和PRDT树脂的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂。
在一些实施方式中，提供了包括水性白蛋白溶液和分散在有机溶剂中的基本上不溶于水的药学活性剂的混合物的组合物，进一步包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。在一些实施方式中，提供了包括水性白蛋白溶液和分散在有机溶剂中的基本上不溶于水的药学活性剂的混合物以及能够与朊病毒蛋白结合的附着于支持材料比如本文描述的一种或多种支持材料的配体的组合物。在一些实施方式中，提供了装载有包括水性白蛋白溶液和分散在有机溶剂中的基本上不溶于水的药学活性剂的混合物的组合物的柱，其中柱包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。
还提供了通过本文所描述方法制造的组合物。在一些实施方式中，该组合物与没有经历朊病毒除去过程的组合物生物等价。
纳米颗粒组合物
本文描述的纳米颗粒组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂(比如紫杉醇)(在多种实施方式中，基本上由它们组成)。难溶于水的药物(比如紫杉烷)的纳米颗粒已经被公开，例如在美国专利号5,916,596；6,506,405；6,749,868和6,537,579和也在美国专利公开号2005/0004002和2007/0082838，以及PCT专利申请WO08/137148中，每一篇的内容以它们的整体并入本文。
在一些实施方式中，组合物包含具有平均或中值直径不大于大约1000纳米(nm)，比如不大于大约900、800、700、600、500、400、300、200和100nm任何一个的纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或中值直径不大于大约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或中值直径不大于大约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或中值直径不大于大约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或中值直径是大约20到大约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或中值直径是大约40到大约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒是可无菌过滤的。
在一些实施方式中，在本文描述的组合物中纳米颗粒具有不大于大约200nm，包括例如不大于大约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70或60nm的任何一个的平均直径。在一些实施方式中，组合物中所有纳米颗粒的至少大约50％(例如至少大约60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一种)具有不大于大约200nm，包括例如不大于大约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70或60nm的任何一个的直径。在一些实施方式中，组合物中所有纳米颗粒的至少大约50％(例如至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一个)落在大约20到大约200nm，包括例如大约30到大约180nm的任何一个和大约40到大约150、大约50到大约120和大约60到大约100nm的任何一个的范围内。
在一些实施方式中，组合物的纳米颗粒部分中至少大约5％(包括例如至少大约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的任何一个)的白蛋白被交联(例如，通过一个或多个二硫键交联)。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括用白蛋白(例如人血清白蛋白)包被的基本上不溶于水的药学活性剂(比如紫杉醇)。在一些实施方式中，组合物包含非纳米颗粒形式的基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中至少大约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一个的基本上不溶于水的药学活性剂为纳米颗粒形式。在一些实施方式中，按重量计，在纳米颗粒中基本上不溶于水的药学活性剂构成纳米颗粒的大于大约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一个。在一些实施方式中，纳米颗粒具有非聚合基体。在一些实施方式中，纳米颗粒包括基本上不溶于水的药学活性剂的核心，其基本上不含聚合材料(比如聚合基体)。
在一些实施方式中，组合物包含在组合物的纳米颗粒部分和非纳米颗粒部分二者中的白蛋白，其中在组合物中至少大约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的任何一个的白蛋白在组合物的非纳米颗粒部分。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物基本上不含(比如不含)表面活性剂(比如CremophorTween80，或用于施用基本上不溶于水的药学活性剂的其他有机溶剂)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含小于大约20％、15％、10％、7.5％、5％、2.5％、1％的任何一个或更少的有机溶剂。在一些实施方式中，在纳米颗粒组合物中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是大约18∶1或更低，比如大约15∶1或更低，例如大约10∶1或更低。在一些实施方式中，在组合物中白蛋白与基本上不溶于水的药学活性剂的重量比落在大约1∶1到大约18∶1、大约2∶1到大约15∶1、大约3∶1到大约13∶1、大约4∶1到大约12∶1、大约5∶1到大约10∶1的任何一个的范围内。在一些实施方式中，在组合物的纳米颗粒部分中白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是大约1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶15或更小的任何一个。在一些实施方式中，组合物中白蛋白(比如人血清白蛋白)和基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是下列的任何一个：大约1∶1到大约18∶1、大约1∶1到大约15∶1、大约1∶1到大约12∶1、大约1∶1到大约10∶1、大约1∶1到大约9∶1、大约1∶1到大约8∶1、大约1∶1到大约7∶1、大约1∶1到大约6∶1、大约1∶1到大约5∶1、大约1∶1到大约4∶1、大约1∶1到大约3∶1、大约1∶1到大约2∶1或大约1∶1。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含一个或多个上面的特点。
本文描述的纳米颗粒可存在于干制剂(例如冻干组合物)中或悬浮在生物相容性介质中。合适的生物相容性介质包括但并不限于水、缓冲的水介质、盐水、缓冲的盐水、任选缓冲的氨基酸溶液、任选缓冲的蛋白溶液、任选缓冲的糖溶液、任选缓冲的维生素溶液、任选缓冲的合成聚合物的溶液、含有脂质的乳液和类似物。
在一些实施方式中，药学上可接受的载体包含人血清白蛋白。人血清白蛋白(HSA)是高度易溶的Mr 65K蛋白质并由585个氨基酸组成。HSA是血浆中最丰富的蛋白质，并占人血浆胶体渗透压的70-80％。HSA的氨基酸序列含有总共17个二硫桥、一个自由巯基(Cys 34)和一个色氨酸(Trp 214)。HSA溶液的静脉内使用已经被指示用于防止和治疗低血量性休克(hypovolumic shock)，并且在治疗新生儿高胆红素血症中与交换输血结合。考虑其他白蛋白，比如牛血清白蛋白。这样的非人类白蛋白的使用将是适当的，例如，在这些组合物在非人类哺乳动物中的使用的背景下，诸如兽医动物(包括家庭宠物和农业动物)。
人血清白蛋白(HSA)具有多个疏水性结合位点(总共八个用于HSA的内源性配体——脂肪酸)，并结合各种不同的基本上不溶于水的药学活性剂，尤其是中性的和带负电荷的疏水化合物。已经提出了在HSA的子域IIA和IIIA中的两个高亲和性结合位点，它们是在接近表面具有带电荷的赖氨酸和精氨酸残基的高度延长的疏水口袋，这些残基充当极性配体特征的连接点。
组合物中白蛋白一般用作基本上不溶于水的药学活性剂的载体，即，与不包括白蛋白的组合物相比，组合物中白蛋白使基本上不溶于水的药学活性剂更容易在水介质中悬浮或帮助保持悬浮。这可避免使用有毒溶剂(或表面活性剂)来溶解基本上不溶于水的药学活性剂，并从而可减少将基本上不溶于水的药学活性剂施用到个体(比如人)中的一种或多种副作用。因此，在一些实施方式中，本文描述的组合物基本上不含(比如不含)表面活性剂，比如Cremophor(包括CremophorEL(BASF))。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物基本上不含(比如不含)表面活性剂。如果当纳米颗粒组合物施用给个体时，组合物中Cremophor或表面活性剂的量不足以引起一种或多种副作用，那么组合物“基本上不含Cremophor”或“基本上不含表面活性剂”。
本文描述的组合物中的白蛋白的量将根据组合物中其他组分而变化。在一些实施方式中，组合物包含这样量的白蛋白——其足以在水悬浮中稳定基本上不溶于水的药学活性剂，例如以稳定的胶体悬液(比如稳定的纳米颗粒悬液)的形式。在一些实施方式中，白蛋白是这样的量——其降低基本上不溶于水的药学活性剂在水介质中的沉淀速率。对于包含颗粒的组合物，白蛋白的量还取决于基本上不溶于水的药学活性剂的纳米颗粒的大小和密度。
如果基本上不溶于水的药学活性剂在水介质中保持悬浮(比如没有可见的沉淀或沉降)持续一段延长的时间，诸如持续至少大约0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、60或72小时中的任何一个，那么它在水悬液中是“稳定的”。悬浮液通常但不是必须地适于施用给个体(例如人)。通常(但不是必须地)在储存温度，诸如室温(例如20-25℃)或冷藏条件(例如4℃)下，评价悬浮液的稳定性。例如，如果在悬浮液制备后大约15分钟，悬浮液显示没有肉眼可见的絮凝或颗粒凝聚，或在1000倍光学显微镜下观察时没有絮凝或颗粒凝聚，那么它在储存温度是稳定的。还能在加速测试条件下，诸如在高于约40℃的温度下评价稳定性。
在一些实施方式中，白蛋白以这样的量存在，其足够在水悬液中以某些浓度稳定基本上不溶于水的药学活性剂。例如组合物中基本上不溶于水的药学活性剂的浓度是大约0.1到大约100mg/ml，包括例如大约0.1到大约50mg/ml、大约0.1到大约20mg/ml、大约1到大约10mg/ml、大约2mg/ml到大约8mg/ml、大约4到大约6mg/ml、大约5mg/ml的任何一个。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂的浓度是至少大约1.3mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml和50mg/ml的任何一个。在一些实施方式中，白蛋白以这样的量存在，其避免使用表面活性剂(比如Cremophor)，以便组合物不含或基本上不含表面活性剂(比如Cremophor)。
在一些实施方式中，液体形式的组合物，包含从大约0.1％到大约50％(w/v)(例如大约0.5％(w/v)、大约5％(w/v)、大约10％(w/v)、大约15％(w/v)、大约20％(w/v)、大约25％(w/v)、大约30％(w/v)、大约40％(w/v)或大约50％(w/v))的白蛋白。在一些实施方式中，液体形式的组合物，包含大约0.5％到大约5％(w/v)的白蛋白。
在一些实施方式中，白蛋白的重量比，例如在纳米颗粒组合物中白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是这样的，以便足够量的基本上不溶于水的药学活性剂结合细胞或被细胞输送。对于不同的白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂组合，尽管必须优化白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂的重量比，但是一般地，白蛋白的重量比，例如白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂的重量比(w/w)是大约0.01∶1到大约100∶1、大约0.02∶1到大约50∶1、大约0.05∶1到大约20∶1、大约0.1∶1到大约20∶1、大约1∶1到大约18∶1、大约2∶1到大约15∶1、大约3∶1到大约12∶1、大约4∶1到大约10∶1、大约5∶1到大约9∶1或大约9∶1。在一些实施方式中，白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂的重量比是大约18∶1或更低、15∶1或更低、14∶1或更低、13∶1或更低、12∶1或更低、11∶1或更低、10∶1或更低、9∶1或更低、8∶1或更低、7∶1或更低、6∶1或更低、5∶1或更低、4∶1或更低和3∶1或更低的任何一个。
在一些实施方式中，白蛋白允许组合物被施用给个体(比如人)，而没有明显的副作用。在一些实施方式中，白蛋白为这样的量，其有效地减少施用基本上不溶于水的药学活性剂到人的一种或多种副作用。术语“减少施用基本上不溶于水的药学活性剂的一种或多种副作用”指减少、缓和、消除或避免由基本上不溶于水的药学活性剂引起的一种或多种不期望的作用，以及由用于递送基本上不溶于水的药学活性剂的递送载体(比如使基本上不溶于水的药学活性剂适合于注射的溶剂)引起的副作用。这些副作用包括，例如骨髓抑制、神经毒性、超敏性、炎症、静脉刺激、静脉炎、疼痛、皮肤刺激、周围神经病变、中性白细胞减少性发热、过敏性反应、静脉血栓形成、渗出和其组合。但是，这些副作用，仅仅是示例性的，且可减少与基本上不溶于水的药学活性剂有关的其他副作用，或副作用的组合。
在一些实施方式中，组合物包含Abraxane(或Nab-紫杉醇)。在一些实施方式中，组合物是Abraxane(或Nab-紫杉醇)。Abraxane是被人白蛋白USP稳定的紫杉醇制剂，其可被直接分散在可注射生理溶液中。当分散在适合的水介质比如0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液中时，AbraxaneTM形成稳定的紫杉醇胶体悬浮液。在胶体悬浮液中纳米颗粒的平均粒度是大约130纳米。由于HSA任意溶于水，可以各种各样浓度重新构成AbraxaneTM，从稀的(0.1mg/ml紫杉醇)到浓的(20mg/ml紫杉醇)，包括例如大约2mg/ml到大约8mg/ml、大约5mg/ml。
基本上不溶于水的药学活性剂
本文描述的组合物包括基本上不溶于水的药学活性剂。例如在20-25℃下，难溶于水的试剂在水中的溶解度可小于大约10mg/ml，包括例如小于大约5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02或0.01mg/ml的任何一个。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是固体。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是液体。本文描述的基本上不溶于水的药学活性剂可以是，例如药剂、诊断试剂或具有营养价值的试剂。
适合的药剂包括，但不限于，抗癌剂或抗肿瘤药、抗微管药、免疫抑制剂、麻醉药、激素、在心血管病中使用的药物、抗心律不齐药、抗生素、抗真菌药、抗高血压药、平喘药、抗炎药、抗关节炎药、血管活性药、镇痛药/解热药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗真菌药、抗炎药、抗焦虑药、免疫抑制剂、抗偏头痛药、镇静药、抗心绞痛药、抗精神病药、抗躁狂药、抗关节炎药、抗痛风药、抗凝剂、血栓溶解剂、抗纤溶药药、活血药、抗血小板药、抗惊厥药、抗帕金森病药、抗阻胺药/止痒药、对钙调节有益的药剂、抗病毒药、抗微生物剂、抗感染药、支气管扩张药、激素、降血糖药、降血脂药、抗溃疡/抗反流药、止恶心药/止吐药和油溶性维生素(例如维生素A、D、E、K和类似物)。
在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是下列任何一个：酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、hedgehog抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管组装抑制剂、AKT激酶通路抑制剂、蛋白酶体抑制剂、抗代谢药和基于钯的试剂。
在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是抗肿瘤药。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是化学治疗剂。
适合的基本上不溶于水的药学活性剂包括，但不限于，紫杉烷(诸如紫杉醇、多西紫杉醇、沃塔紫杉醇(ortataxel)和其它的紫杉烷)、埃博霉素(epothilones)、喜树碱、秋水仙碱、格尔德霉素、胺碘酮、甲状腺激素、两性霉素、皮质类固醇类、异丙酚、褪黑素、环孢菌素、雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))和衍生物、他克莫司、霉酚酸(mycophenolic acids)、异环磷酰胺、长春瑞滨、万古霉素、吉西他滨、SU5416、塞替派、博来霉素、诊断的放射性显影剂及其衍生物。例如，在美国专利号5,916,596、6,096,331、6,749,868和6,537,539中描述了在本发明的组合物中有用的其它基本上不溶于水的药学活性剂。基本上不溶于水的药学活性剂的另外的例子包括那些水溶性差的化合物和默克索引(Merck Index)(第12版，1996)的“治疗种类和生物活性索引(Therapeutic Category and Biological Activity Index)”中列出的化合物。
在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是(且在一些实施方式中，选自)紫杉醇、多西紫杉醇、CY196、沃塔紫杉醇或其它的紫杉烷或紫杉烷类似物、17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)、18-衍生的格尔德霉素、喜树碱、异丙酚、胺碘酮、环孢菌素、埃博霉素、根赤壳菌素、考布他汀(combretastatin)、雷帕霉素、两性霉素、三碘甲状腺氨酸、埃博霉素、秋水仙碱、硫代秋水仙碱和其二聚体、甲状腺激素、血管活性肠肽、皮质类固醇、褪黑素、他克莫司、霉酚酸、埃博霉素、根赤壳菌素、考布他汀、和其类似物或衍生物中的任何一个。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是(在一些实施方式中，选自)紫杉醇、多西紫杉醇、CY196、沃塔紫杉醇或其它的紫杉烷、格尔德霉素、17-烯丙基氨基格尔德霉素、硫代秋水仙碱和其二聚体、雷帕霉素、环孢菌素、埃博霉素、根赤壳菌素和考布他汀的任何一个。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是雷帕霉素。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是17-AAG。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是硫代秋水仙碱二聚体(比如IDN5404)。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是紫杉烷。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是紫杉醇。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是多西紫杉醇。在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是CY196。
在一些实施方式中，基本上不溶于水的药学活性剂是紫杉烷或其衍生物，其包括，但不限于，紫杉醇、多西紫杉醇和IDN5109(沃塔紫杉醇)或其衍生物。在一些实施方式中，组合物包含非结晶的和/或无定形紫杉烷(比如紫杉醇或其衍生物)。在一些实施方式中，通过使用无水紫杉烷(比如无水多西紫杉醇或其衍生物)制备组合物。无水多西紫杉醇已显示比水合多西紫杉醇诸如多西紫杉醇三水合物或半水合物产生更稳定的制剂。
纳米颗粒组合物中其他组分
本文描述的纳米颗粒可以组合物存在，其包括其他试剂、赋形剂或稳定剂。例如，为了通过增加纳米颗粒的负ζ电位而增加稳定性，可加入某些带负电荷的组分。这样的带负电荷的组分包括但并不限于胆汁酸的胆盐，所述胆汁酸由甘氨胆酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、石胆酸(litocholic acid)、熊去氧胆酸、去氢胆酸、以及其它组成；包括基于卵磷脂(蛋黄)的磷脂在内的磷脂，包括下面的磷脂酰胆碱：棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(palmitoyloleoylphosphatidylcholine)、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱(palmitoyllinoleoylphosphatidylcholine)、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱(stearoyllinoleoylphosphatidylcholine)、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱(stearoyloleoylphosphatidylcholine)、硬脂酰花生酰磷脂酰胆碱(stearoylarachidoylphosphatidylcholine)和二棕榈酰磷脂酰胆碱。其它的磷脂包括L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和其它相关的化合物。带负电荷的表面活性剂或乳化剂也适合用作添加剂，例如胆甾酰硫酸钠(sodium cholesterylsulfate)和类似物。
在一些实施方式中，组合物适合施用给人。在一些实施方式中，组合物适合施用给哺乳动物，比如，在兽医方面，家庭宠物和农业动物。具有各种各样的纳米颗粒组合物的适合制剂(见，例如美国专利号5,916,596和6,096,331)。下列制剂和方法仅仅是示例性的，绝非限制性的。适合口服的制剂可由下列组成：(a)液体溶液，比如溶解在稀释液，比如水、盐水和橘子汁中有效量的化合物，(b)胶囊、囊剂或片剂，每个包含预定量的活性成分，如固体或颗粒，(c)在合适的液体中的悬浮液，和(d)适合的乳液。片剂形式可包括下列的一种或多种：乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯树胶、凝胶、胶状二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸、和其他赋形剂、着色剂、稀释液、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂和药学上相容的赋形剂。糖锭形式可包括香味中的活性成分，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或西黄蓍胶，以及包括惰性碱中的活性成分的锭剂，诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶、乳液、凝胶和含有除了活性成分外本领域已知的这样的赋形剂的类似物。
适合的载体、赋形剂和稀释液的例子包括，但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯或羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂可另外包括润滑剂、湿润剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。
适于胃肠外给药的制剂包括水性的和非水性的、等渗的无菌注射溶液，它们可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使制剂与预期接受者的血液相容的溶质、和可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性的和非水性的无菌悬浮液。制剂可在单位剂量或多剂量密封容器诸如安瓿和小瓶中存在，并可储存在冷冻干燥的(冻干的)条件下，只需要在使用之前一刻添加用于注射的无菌液体赋形剂，例如水。可从前述种类的无菌粉剂、颗粒和片剂，制备即时注射溶液和悬浮液。可注射制剂是优选的。
在一些实施方式中，组合物被配制为具有大约4.5到大约9.0的pH范围，包括例如大约5.0到大约8.0、大约6.5到大约7.5和大约6.5到大约7.0的任何一个的pH范围。在一些实施方式中，组合物的pH配制为不小于大约6，包括例如不小于大约6.5、7或8(比如大约8)的任何一个。还可通过添加合适的张力改性剂，诸如甘油，将组合物制备成与血液等渗。
使用不含朊病毒纳米颗粒组合物的方法
还提供了使用本文描述的不含朊病毒组合物的方法。例如，在一些实施方式中，提供了施用包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，提供了治疗疾病(比如癌症)的方法，包括施用有效量的包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。
在一些实施方式中，提供了施用包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从所述白蛋白组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，提供了在个体中治疗疾病(比如癌症)的方法，包括向个体施用有效量的包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包含朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。
在一些实施方式中，个体具有vCJD。在一些实施方式中，个体已经被朊病毒蛋白感染。在一些实施方式中，个体被怀疑具有vCJD或被朊病毒蛋白感染。在一些实施方式中，个体是朊病毒蛋白的无症状携带者。在一些实施方式中，个体至少已经接受输血一次。在一些实施方式中，个体至少60岁，比如至少大约65、70或75岁。在一些实施方式中，个体是免疫性缺乏的。在一些实施方式中，个体是癌症患者。
本文所用的术语“有效量”指足够治疗特定病症、状况或疾病，比如改善、减轻、减少和/或延迟一种或多种它的症状的化合物或组合物的量。对于癌或其他不需要的细胞中增殖，有效量包括足够引起肿瘤萎缩和/或减少肿瘤生长速度(比如抑制肿瘤生长)的量。在一些实施方式中，有效量是足够延迟发展的量。在一些实施方式中，有效量是足够阻止出现和/或复发的量。有效量可在一次或多次给药中被施用。
被本文描述的组合物(比如包括抗肿瘤药比如紫杉烷、雷帕霉素和17-AAG的组合物)治疗的癌包括，但不限于，癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。可被本文描述的组合物治疗的癌的例子包括，但不限于，鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌，包括鳞状NSCLC)、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌(包括胃肠癌)、胰腺癌(比如晚期胰腺癌)、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)(比如肝细胞癌(hepatocellular carcinoma))、膀胱癌、肝细胞瘤(heptoma)、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾癌或肾脏癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌(比如晚期前列腺癌)、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、头颈癌、结直肠癌、直肠癌、软组织肉瘤、卡波济肉瘤、B细胞淋巴瘤(包括低度恶性/滤泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡NHL、中度弥散性NHL、重度成免疫细胞NHL、重度成淋巴细胞NHL、重度小非核裂细胞NHL、大包块病变(bulky disease)NHL、外套细胞淋巴瘤、AIDS相关的淋巴瘤、和沃尔登斯特伦巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、骨髓瘤、多毛细胞白血病、慢性成髓细胞白血病、和移植后淋巴组织增生疾病(PTLD)、以及和斑痣性错构瘤病有关的异常血管增生、水肿(比如与脑瘤有关的)、和Meigs′综合征。在一些实施方式中、提供了治疗转移癌(即，已经从原发性肿瘤转移的癌)的方法。在一些实施方式中，提供了降低细胞增殖和/或细胞迁移的方法。在一些实施方式中，提供了治疗过度增生的方法。
在一些实施方式中，提供了治疗晚期阶段癌的方法。在一些实施方式中，提供了治疗包括，例如晚期乳腺癌、IV阶段乳腺癌、局部晚期乳腺癌和转移性乳腺癌的乳腺癌(其可以是HER2阳性或HER2阴性)的方法。在一些实施方式中，癌是肺癌，包括，例如非小细胞肺癌(NSCLC，比如晚期NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC，比如晚期SCLC)和肺晚期实体瘤恶性肿瘤。在一些实施方式中，癌是卵巢癌、头颈癌、胃恶性肿瘤、黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤(比如晚期实体瘤)。在一些实施方式中，癌是(和在一些实施方式中，选自)下列任何一个：乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波济肉瘤、良性肿瘤、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤、成神经细胞瘤和多骨髓瘤。在一些实施方式中，癌是实体瘤。
适合接受这些组合物的个体取决于难溶于水的药剂的性质，以及待被治疗和/或防止的疾病/状况/病症。因此，术语个体包括脊椎动物、哺乳动物和人的任何一个。在一些实施方式中，个体是哺乳动物，包括但不限于，人、牛、马、猫科、犬、啮齿类或灵长类。在一些实施方式中，个体是人。
施用给个体(比如人)的本发明组合物的剂量可根据具体组合物、施用的方法和被治疗的具体疾病变化。剂量应当足够产生期望的响应，比如针对具体疾病的治疗性或预防性响应。例如，在组合物中紫杉醇的用量当给定3周计划时可在100-400mg/m2的范围，或当给定一周计划时在50-250mg/m2。另外，如果给定有规律计划(例如每天或每周数次)，用量可在大约5-75mg/m2的范围。
本文描述的组合物可通过各种途径施用给个体(比如人)，所述途径包括，例如静脉内、动脉内、肺内、门静脉、肝内、经口、吸入、囊内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内或经皮。例如本发明组合物可通过吸入给药以治疗呼吸道状况。组合物可用于治疗呼吸状况比如肺纤维化、闭塞性细支气管炎、肺癌、支气管肺泡癌等。
在一些实施方式中，结合朊病毒除去过滤器进行组合物施用。
本文还提供了减少与施用纳米颗粒组合物相关的副作用的方法。例如本发明提供了减少与施用难溶于水的药剂相关的各种副作用的方法，所述副作用包括，但不限于，骨髓抑制、神经毒性、超敏性、炎症、静脉刺激、静脉炎、疼痛、皮肤刺激、周围神经病变、中性白细胞减少性发热、过敏性反应、血液毒性和大脑或神经毒性和其组合。在一些实施方式中，提供了减少与施用难溶于水的药剂相关的超敏反应的方法，所述超敏反应包括，例如严重的皮疹、麻疹、潮红、呼吸困难、心动过速和其他。
试剂盒和系统
本发明还提供了用于本方法中的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个包括不含朊病毒的纳米颗粒组合物的容器，并在一些实施方式中，进一步包括根据本文描述的任何方法的使用说明书。本试剂盒还可以包括选择合适的个体或者治疗的说明。本发明试剂盒中提供的说明书典型地是标签或包装插件(例如包括在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但是机器可读的说明书(例如在磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
本发明的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于，小瓶、瓶、罐、软包装(例如，密封Mylar或塑料袋)和类似物。试剂盒可以任选地提供其它组分，如缓冲剂和说明信息。
涉及纳米颗粒组合物使用的说明书一般包括关于对于意图治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、大包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，试剂盒可被提供包含足够剂量的如本文公开的基本上不溶于水的药学活性剂(比如基本上不溶于水的药学活性剂)，以便为个体提供长时期的有效治疗，比如一周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长的任何一个。试剂盒还可包括多单位剂量的基本上不溶于水的药学活性剂和药学组合物和使用说明书，并且以足以储存和药房应用的量包装，所述药房例如医院药房和配药药房。
在一些实施方式中，提供了用于从纳米颗粒组合物中除去朊病毒蛋白的试剂盒，所述纳米颗粒组合物包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述试剂盒包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括支持材料。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括使用配体从纳米颗粒组合物中除去朊病毒的说明书。
还提供了用于进行本文描述的方法的系统。例如在一些实施方式中，提供了用于制造不含朊病毒的纳米颗粒组合物的系统，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述系统包括1)用于制造纳米颗粒组合物的装置；和2)用于从用于制造纳米颗粒组合物的白蛋白中除去朊病毒蛋白的装置。在一些实施方式中，用于从用于制造纳米颗粒组合物的所述白蛋白中除去朊病毒蛋白的装置被整合入用于制造纳米颗粒组合物的装置中。在一些实施方式中，用于制造纳米颗粒组合物的装置和用于从用于制造纳米颗粒组合物的白蛋白中除去朊病毒蛋白的装置分开。
在一些实施方式中，提供了用于制造不含朊病毒的纳米颗粒组合物的系统，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述系统包括1)用于制造纳米颗粒组合物的装置；和2)用于(例如从在制造纳米颗粒期间产生的中间组合物中或从产生的纳米颗粒组合物中)除去朊病毒蛋白的装置。在一些实施方式中，用于除去朊病毒蛋白的装置整合入用于制造纳米颗粒组合物的装置中。在一些实施方式中，用于制造纳米颗粒组合物的装置和用于除去朊病毒蛋白的装置分开。
本领域技术人员可意识到在本发明的范围和精神内许多实施方式是可能的。
本文引用的所有参考文件，包括出版物、专利申请和专利都通过引用并入本文，并入的程度如同单独和特定地表明每一参考文件通过引用被整体并入并且阐述一样。
本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人知道的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述后，这些优选实施方式的实施对于本领域普通技术人员是明显的。本发明人预期技术人员适当时应用这些实施方式，并且本发明人意图以不同于本文具体描述的其它方式实施本发明。因此，本发明包括所附权利要求书中陈述的主题的所有修改和等同物，如可适用的法律所允许的。而且，除非本文另外指明或除非上下文明确抵触，在所有可能变化中的上述要素的任何组合都包含在本发明中。
本申请的示例性实施方式
一方面，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中组合物基本上不含朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物具有小于大约100fg/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物是上述组合物的任何一种，其中组合物具有小于大约10IU-ic/ml的朊病毒传染性。在一些实施方式中，组合物是上述组合物的任何一种，其中基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)试验或根据IPCR试验，组合物显示不存在朊病毒蛋白。在一些实施方式中，组合物是上述组合物的任何一种，进一步包括痕量的能够结合朊病毒蛋白的配体。在一些实施方式中，组合物是上述组合物的任何一种，进一步包括痕量的支持材料。
另一方面，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，其中在组合物中的白蛋白通过包括朊病毒除去过程的方法获得，所述朊病毒除去过程包括使初始白蛋白组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，朊病毒除去过程进一步包括从白蛋白和组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，配体是肽。在一些实施方式中，配体是基于三嗪的化合物。
另一方面，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)从初始白蛋白组合物中除去朊病毒蛋白；b)使包括溶液和有机相的混合物经历高剪切条件，所述溶液包括除去朊病毒的白蛋白，所述有机相包括分散在有机溶剂中的所述基本上不溶于水的药学活性剂。在一些实施方式中，步骤a)包括：1)使初始白蛋白溶液和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触。在一些实施方式中，步骤a)进一步包括：2)从白蛋白溶液中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，方法是上述方法的任何一种，进一步包括从混合物中除去所述有机溶剂。在一些实施方式中，通过蒸发作用除去有机溶剂。在一些实施方式中，方法是上述方法的任何一种，其中所述配体是肽。在一些实施方式中，方法是上述方法的任何一种，其中配体是基于三嗪的化合物。在一些实施方式中，方法是上述方法的任何一种，其中初始白蛋白组合物是血液源产品。
另一方面，提供了产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括基本上不溶于水的药学活性剂，和b)从所述混合物中除去朊病毒蛋白。在一些实施方式中，步骤b)包括：1)使混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体结合。在一些实施方式中，步骤b)进一步包括：2)从所述混合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，配体是肽。在一些实施方式中，配体是基于三嗪的化合物。
还提供了通过权利要求11-23任一项产生的组合物。还提供了上述组合物的任何一个用于治疗疾病比如癌症的用途。
另一方面，提供了从怀疑包含朊病毒蛋白的包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从组合物中除去配体和与其结合的蛋白质。在一些实施方式中，配体是肽。在一些实施方式中，配体是基于三嗪的化合物。还提供了该方法之后获得的组合物。
另一方面，提供了包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述组合物进一步包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。在一些实施方式中，配体是肽。在一些实施方式中，配体是基于三嗪的化合物。
提供下列实施例以阐明但不限制本发明。应当理解，本文描述的实施例是仅为了说明的目的，且基于这些实施例，将向本领域技术人员建议多种修改或变化，并且包括在本申请的精神和范围内。
实施例
实施例1：开发用于从白蛋白制剂中除去朊病毒蛋白的亲和吸附剂
本研究通过用两种不同的商业上可得的白蛋白制剂(包含20％w/v或25％w/v白蛋白)攻击四-树脂板，筛选朊病毒结合配体的四-树脂板，所述白蛋白制剂外加两个不同浓度(0.01％或0.005％)的瘙痒病仓鼠脑匀浆。在之前，通过PRDT(Pathogen Removal and DiagnosticTechnologies Inc；ProMetic BiosciencesLtd.，Cambridge，UK)鉴定四-树脂板在25％白蛋白存在情况下为良好的朊病毒结合者(binder)。选择最佳树脂可在白蛋白纳米颗粒的生产中优化朊病毒-减少步骤的并入。
方法
6个Protein Isolation Kit for Sorbent Identification(用于吸附剂鉴定的蛋白质分离试剂盒)(PIKSITM，ProMetic Biosciences Ltd)试剂盒包装有四种PRDT树脂的每一种和对照树脂(Toyopearl Amino AMN31)的12个柱(大约0.5mL)。以三-柱串联方式，用外加0.01％或0.005％瘙痒病仓鼠脑匀浆(SBH)的包含20％和25％白蛋白的溶液攻击每种树脂，以试图评估每种树脂结合朊病毒蛋白的能力。树脂性能的比较基于朊病毒结合，如通过蛋白质印迹和光密度法测量的。通过SDS-PAGE凝胶，测定总蛋白质结合曲线(profile)。为了结合朊病毒蛋白和检测总蛋白质结合，从树脂中剥离(strip)结合的蛋白质。使用NanoDropND-1000分光光度计测量280nm下的吸光度，来测定白蛋白结合。在蛋白质印迹和SDS-PAGE凝胶中观察到的信号分别对应朊病毒蛋白的结合部分和总蛋白质。
在本发明中使用的商业白蛋白制剂是白蛋白(人)U.S.P.人白蛋白Grifols20％，编号IBAB8MJ001，和白蛋白(人)，USP，25％溶液Baxter，编号LA06D04AA。
结果
蛋白质印迹和SDS-PAGE
所获得的结果显示所有四种树脂结合了外加入20％或25％人白蛋白溶液的PrPsc。蛋白质印迹中PrPsc信号强度(图1-3)显示朊病毒结合最强的是DVR，接着YVHEA、SYA和D4树脂。对照树脂AMN31具有预期的强信号。通过使用DVR树脂获得的信号水平显示高浓度的白蛋白不干扰朊病毒结合。
当在各种测试条件下使用DVR时，即使当测试更长暴露时间时，在第二和第三柱中没有观察到检测信号(图1)，其表示所有可检测的PrPsc被第一DVR柱捕获。
在第一柱中其他树脂的信号强度较弱，在串联的第二柱中检测到朊病毒蛋白(图2和3)，显示白蛋白可能干扰朊病毒蛋白结合。所有三个配体显示在第三柱中没有朊病毒信号，表示树脂能够从外加SBH的白蛋白溶液中选择性地除去朊病毒。在仓鼠脑中PrPsc的浓度是大约50μg/g，等价于在外加入250mg/mL白蛋白溶液的0.01％SBH中大约5ng/mL的PrPsc，产生50,000,000-倍过量的白蛋白。
在Coomassie-染色的SDS-PAGE凝胶中观察到的总蛋白质图案(图1到3)显示DVR比剩余的朊病毒-结合树脂具有低得多水平的总蛋白质结合，这被认为是一个优势，尽管事实是在总蛋白质凝胶中大部分所观察到的带来自脑匀浆外加物。如预期的，在DVR凝胶中一条可见的蛋白质带具有和白蛋白相似的表观分子量(66.5KDa)。
光密度法
通过计算与树脂结合的PrPsc的密度计信号和在外加有SBH的白蛋白溶液中存在的信号的比例，也间接地评估朊病毒除去。DVR树脂结合朊病毒的能力和阳性对照树脂相当，在第一柱中吸收大约所有可得的PrPsc。使用感染剂量作为朊病毒结合的测量值，0.5mL DVR柱能够除去外加10mL SBH的白蛋白溶液中的朊病毒，考虑到0.1％的SBH包含大约106ID50/mL，其等价于大约106ID50。与在蛋白质印迹中所观察到的类似，DVR比YVHEA、D4和SYA具有最好的朊病毒结合性能。所有三种树脂需要每个串联的第二柱以进一步结合在外加SBH的白蛋白溶液中存在的任何可检测朊病毒蛋白。
白蛋白结合
使用NanoDropND-1000分光光度计在280nm的吸光度，测定白蛋白浓度，进行蛋白质量化。外加SBH的白蛋白溶液穿过四种树脂(DVR、YVHEA、SYA和D4)的每种和对照树脂(AMN31)之后，测量每个流过的白蛋白浓度。流过树脂柱之前，测量在不存在或存在0.01％或0.005％SBH外加物情况下，20％和25％的商业白蛋白溶液的蛋白质浓度。所获得的结果在表3中显示。
表3.测量外加有或未外加0.01％和0.005％瘙痒病仓鼠脑匀浆的商业白蛋白溶液(20％w/v或25％w/v)的白蛋白浓度。
测量的商业白蛋白溶液的浓度比商业标注的值更高，特别是包含20％w/v白蛋白溶液的制剂。但是，由于该研究处理相对值，所以所以这不必担心这点。获得三个值的平均，且当与在测定蛋白质浓度的溶液中存在的白蛋白的量相比时，可考虑忽略外加物的量。外加SBH的白蛋白溶液流过树脂后，获得白蛋白浓度，如在表4和5中所示。
表4.外加有或未外加0.01％和0.005％瘙痒病仓鼠脑匀浆的商业白蛋白溶液(20％w/v)流过不同树脂柱之后，测量白蛋白浓度。ND＝未检出。
表5.外加有或未外加0.01％和0.005％瘙痒病仓鼠脑匀浆的商业白蛋白溶液(25％w/v)流过不同树脂柱之后，测量白蛋白浓度。ND＝未检出。
没有一个所测试的树脂显示明显的白蛋白损失。实际上，对于大部分条件，没有检测到损失。发现的值表示大约±5％的变差(variation)。数据显示在所测试条件范围内，白蛋白损失不可能是用于在该规模选择一种树脂的因素。
结论
基于所获得的结果，DVR是4种所测试的用于从商业白蛋白溶液中除去朊病毒的树脂中最好的一种。在0.5-mL柱中，树脂能够除去大约106ID50。该值与之前其他攻击试验所获得的值相似。在用20或25％白蛋白/20树脂攻击的测试比例下，检测到有少量白蛋白损失。因为该比例可能增加，所以在处理条件下，白蛋白结合应该更低。
实施例2：配制的包含紫杉醇的悬浮液和人白蛋白溶液的朊病毒-除去可行性研究
使用配制的包含紫杉醇(例如AbraxaneTM)的悬浮液和使用包含各种百分比白蛋白(％w/v)的人白蛋白溶液，评估在纳米颗粒组合物中朊病毒-除去技术的应用。
实验条件
研究系统
评估配制的AbraxaneTM的悬浮液和糖-紫杉醇制剂的悬浮液。AbraxaneTM配制的悬浮液(FS)是用蒸发后的悬浮液(PE)配制的，所述蒸发后的悬浮液(PE)获自生产和人白蛋白溶液(25％，Baxter，Deerfield，IL)，其包含大约7mg/mL紫杉醇和56mg/mL人白蛋白。糖-紫杉醇制剂配制的悬浮液(FS)是用蒸发后的悬浮液(PE)配制的，所述蒸发后的悬浮液(PE)获自生产、人白蛋白溶液(25％，Baxter)、蔗糖、氯化钠和乙二胺四乙酸二钠二水合物，其包含大约7mg/ml紫杉醇、56mg/ml人白蛋白；32mg/ml蔗糖、8.4NaClmg/ml和0.07mg/ml EDTA(乙二胺四乙酸)。
也评估25％、20％和5％的人白蛋白溶液。25％或250mg/ml的人白蛋白溶液获自Baxter；20％或200mg/ml的人白蛋白溶液(例如Grifols)获自Grifols Biologicals，Inc.(LosAngeles，CA)。通过用注射用无菌水稀释25％的人白蛋白(Baxter)，制备5％的人白蛋白溶液。
朊病毒-除去柱
在该研究中使用的朊病毒除去柱(1-ml)是商业上可得的PIKSI(用于吸附剂鉴定的蛋白质分离试剂盒)试剂盒柱，其包含Toyopearl Amino650CU树脂(样品AMN31)，由ProMetic Biosciences，Ltd(Cambridge，UK)供应。
流过条件
对于对制剂悬浮液的研究，总流过体积是大约500mL，其是柱体积(1-ml)的500倍。流速是大约0.5ml/分钟。总流过时间超过16小时。每两个小时取样。没有观察到柱堵塞。
对于对白蛋白溶液的研究，总流过体积是至少100mL，其是柱体积(1-ml)的100倍。流速是大约0.5ml/分钟。总流过时间超过3小时。每小时取样。没有观察到柱堵塞。
结果和讨论
来自对配制的悬浮液的朊病毒-除去可行性研究的结果总结在表6和表7中。就颗粒大小、pH、紫杉醇测定和杂质、人白蛋白测定和人白蛋白组成而言，AbraxaneTM配制的悬浮液的物理和化学测试结果显示在柱前和柱后悬浮液之间没有显著性差异。同样，就颗粒大小、pH、紫杉醇测定和杂质、人白蛋白测定、人白蛋白组成、蔗糖和EDTA而言，糖-紫杉醇制剂配制的悬浮液的物理和化学测试结果显示在柱前和柱后悬浮液之间没有显著性差异。
表6-AbraxaneTM配制的悬浮液的朊病毒-除去可行性研究
*NA：数据不可得
表7-糖-EDTA-紫杉醇配制的悬浮液的朊病毒-除去可行性研究
*NA：数据不可得。
来自白蛋白溶液的朊病毒-除去可行性研究的结果总结在表8中。就人白蛋白测定和人白蛋白组成，在柱前和柱后溶液之间没有显著性差异。
表8-人白蛋白溶液朊病毒-除去可行性研究
该研究表明朊病毒-除去柱处理对人白蛋白溶液和AbraxaneTM和糖-紫杉醇制剂二者的配制悬浮液的物理和化学性质没有不利影响。
实施例3：通过朊病毒减少树脂对20％白蛋白除去TSE
在该研究中，评估在20％(w/v)白蛋白(Grifols)中通过朊病毒减少树脂(PRDT柱；ProMeticBiosciences，Ltd)除去潜在的TSE。用于TSE除去过程步骤的原材料外加有模型TSE试剂(model TSE agent)。该方法步骤在VirusSure实验室(Virusure Forschung und Entwicklung GmbH，Vienna，Austria)进行。在进行该过程步骤期间收集各种馏分，且基于使用检测PrPsc的蛋白质印迹试验测定的TSE试剂水平，计算该过程的TSE除去能力。
该研究按照并参考下列指南，包括1)CPMP/BWP/268/95(1996修订)，Note for Guidance on Virus Validation Studies：The Design，Contribution，and Interpretation of Studies Validating the Inactivation andRemoval of Viruses；2)CPMP/BWP/5136/03 Guideline on theInvestigation of Manufacturing processes for Plasma-Derived MedicinalProducts with Regardsto vCJDRisk；3)OECD Principles of GoodLaboratory Practice as outlined in ENV/MC/CHEM(98)17，1997修订；4)21CFRpart58，Good Laboratory Practice，USFDA；5)EU directive2004/9/EG，Inspection undder Guten Laborpraxis(GLP)；6)EU Directive 2004/10/EG，Anwendung derder gutenLaborpraxis und zur Kontrolleihrer Anwendungbei Versunchen mitchemischen Stoffen；7)Austrian BGBI.II，211.Verordnung，Chemikalien-GLP-Inspektionsverordnung，Jahrgang 2000；和8)AustrianBGBI.II，450.Verordnung，gute Laborpraxis 2006，Jahrgang 2006。
材料和方法
在该研究过程调查20％白蛋白(Grifols)通过朊病毒减少树脂(PRDT柱)除去TSE期间，使用下列测试物品、试剂和材料。
使用Grifols白蛋白(人)(USP 20％溶液(批号：IBAB7GX001/TA09/0122))进行外加试验和干扰测试。
包含5ml填充9％盐水的朊病毒除去树脂的一次性SepFastTM柱(ProMetic Biosciences Ltd.)用于过程试验。
制备各种缓冲液。它们包括下列：
1)制备0.9％NaCL(9g/l)作为朊病毒减少树脂的平衡缓冲液；
2)制备Tris缓冲盐水(TBS)作为在层析之后树脂的重悬浮液；
3)制备2M NaCl(116.88g/l)作为朊病毒减少树脂再生缓冲液；
4)制备NaOH(0.1M、0.5M和1.0M)缓冲液，用于外加研究样品的pH调节和感染物质的过程中间物失活；和
5)制备HCL(0.1M和1.0M)缓冲液，用于pH调节外加研究样品和过程中间物。
263瘙痒病
在该研究中使用仓鼠适应的瘙痒病的毒株263K(0.5％肌氨酰处理的)。仓鼠适应的瘙痒病的263K毒株提供了在仓鼠脑中高效价的优势。对于10％脑匀浆的典型效价在108-1010ID50单位每ml的范围内。被该试剂沉淀的PrPsc蛋白质对蛋白酶K消化具有相当的抗性，使可能区别于蛋白质PrPc的非疾病相关形式。仓鼠适应的瘙痒病的种263K毒株由Robert Rohwer博士的实验室(Baltimore Research and EducationFoundation，Mail Stop 151-A，10 North Greene Street，Baltimore，MD21201，USA)以10％的匀浆供应。对于该实验，选择0.5％肌氨酰处理的部分。通过用0.5％肌氨酰处理，接着差速离心除去大的聚集体，只留下在上清液中的清洁剂溶解的片段，该部分从粗脑匀浆(微粒体的/细胞溶质的263K部分已被从其除去)中制备。制备0.5％肌氨酰处理的部分以模拟清洁剂溶解的污染(即，如在包含溶剂清洁剂的过程中所发现的)，且该类型部分已经被广泛地用在人血浆和重组产品的朊病毒清除研究中。
用于检测PrPsc的蛋白质印迹试验
使用检测PrPsc的蛋白质印迹试验在各种样品中半定量测定TSE水平(PrPsc)。蛋白质印迹试验的动态范围一般在信号丢失之前的4-5log10稀释的区域内，并因此该试验不如仓鼠生物测定灵敏。但是，在评估通过生物制药制造过程除去朊病毒中，蛋白质印迹试验是有用的工具。
在蛋白质印迹试验中，样品首先用蛋白酶K进行消化以除去正常形式的蛋白质PrPc(所有处理样品使用83pg/ml浓度的蛋白酶K消化)。阻断蛋白水解反应之后，样品与SDS-缓冲液混合，并煮沸以使PrPsc从它的聚集形式变性。接着制备样品的0.5log10稀释，并和分子量标记一起上样到SDS-PAGE凝胶。电泳之后，凝胶被蛋白质印迹到PVDF膜上，接着阻断并用抗体探测，允许用抗体3F4检测结合的PrPsc蛋白质。瘙痒病263K毒株在25-33KDa区域中产生特征带图案，其帮助确认在样品中存在PrPsc蛋白。样品效价的终点定义为其中在蛋白质印迹中没有观察到信号的第一稀释。
减少系数计算
减少系数(RF)如下计算：
RF＝(V1×T1)/(V2×T2)
其中：
V1和T1分别是原材料的体积和效价，和
V2和T2分别是产品部分的体积和效价
以对数项，该等式可表达为：
Log10[RF]＝[Log10(V1)+Log10(T1)]-[Log10(V2)+Log10(T2)]。
最终计算之后，减少系数只四舍五入到1位小数。
干扰测试
测试未稀释的原材料并接着在TBSA中1.0log10预稀释。外加263K达到终浓度——其等于用于外加的瘙痒病原料终点的大约2log10内的效价——之后，未稀释的和预-稀释的原材料样品在室温下以15.558×g离心60分钟。离心之后，小心地倒出上清液并用1/10初始离心样品体积的TBSA重悬浮沉淀(不等于1.0log10预-稀释样品的有效浓度和等于未稀释样品的10-倍浓度)。接着按照标准方案进行蛋白酶K消化和蛋白质印迹。再生和柱样品分别被稀释0.5log10或未稀释测试，然后通过蛋白质印迹分析(即，不离心)。
调节pH
等分试样并储存在≤-60℃之前，检查样品在pH 6-8(不是任何样品都需要pH调节)。
器材
为了进行该研究使用下来主要器材。无菌II型Biohazard安全橱、Sanyo&Angelantoni≤-60℃冰箱、Angelantoni 2-8℃冰箱和≤-15℃冰箱、Sartorius或Kern(分析)天平和打印机、Hanna电子温度计、Mettler ToledopH计、Grant或Selecta水浴、Oregon实验室计时器、Hettich微量离心机、BioRad标准电泳池、BioRad Criterion Blotter、AKTA色谱系统、Wealtec电源、Agfa洗片机和Biotoolomics填充PRDT树脂的柱。
工艺流程
工艺流程方案和收集的样品一起描绘在图4中。各样品的体积可见于“结果”一节的表9中。
在工艺流程的准备中，Laminar Flow(LF)安全橱被清洁并打开至少10到15分钟以平衡。水浴被平衡到30±2℃且平衡原材料直到达到29.5℃温度。0.5％肌氨酰溶解的外加物在相同的水浴中解冻，并且其一被解冻，放置在冰上直到使用。PRDT柱平衡到环境温度(23.0±5.0℃)过夜。
柱进口管(上部)与的出口连接。来自柱出口的管(底部)被进到合适的收集器皿(烧杯或50ml一次性离心管)。所有的管已经用WFI(注射用水)填装，以便没有气泡被引入该系统。
柱首先用5柱体积(CV)的WFI平衡，并接着用10CV的平衡缓冲液平衡。整个过程中目标流速是2.0±0.1ml每分钟。
样品制备和朊病毒减少树脂层析
50.7ml平衡的原材料外加有0.51ml 0.5％肌氨酰溶解的263K匀浆。接着检查pH并发现在目标范围6.9-7.4内。随后，0.5ml等分试样被移出(样品SSM)，并等分试样和储存在≤-60℃。
被外加的样品接着以1.8±0.1ml每分钟的流速应用到上面平衡的PRDT柱，且流过液收集为下列馏分：
一旦吸收度(吸光度，absorbance)已经达到满刻度偏转的80％，开始收集E1。对于每轮实验，收集流过馏分(通过称重测定每次收集的洗脱液样品的体积)。上样被外加的白蛋白溶液之后，用10.0ml的平衡缓冲液冲洗柱。一旦吸收度下降低于满刻度偏转的80％，停止收集E5样品。平衡缓冲液冲洗之后，使用＞20.0ml的2M NaCl使柱再生(样品REG)，且再生之后移出树脂并重悬浮于5ml的TBS(样品COL)中。
结果
来自外加实验的样品
下面表9列出了从外加实验收集的样品连同每个样品的体积。在通过重量测定样品体积的情况，则假定密度为1.0g/ml，以允许计算每个样品的体积。所有样品被等分储存在-60℃直到分析。来自外加实验的色谱图形的扫描复印件在图5中示出。
表9：过程实验期间收集体积的总结
干扰结果
为了克服干扰，除再生和树脂样品之外，所有的样品用包含0.1％BSA的TBS稀释1.0log10，接着离心并1/10浓缩。以10×浓度测试未稀释样品的干扰，显示强烈的干扰。对于再生样品，测试之前制备0.5log10稀释以降低NaCl的浓度。对于树脂样品，因为树脂在TBS缓冲液中重悬浮，所以测试这些样品无需预稀释。
使用1.0Log10预稀释，通过离心和重悬浮在1/10th初始体积，制备克服白蛋白干扰需要的样品稀释。见图6。
朊病毒滴定数据和减少系数的计算
对于过程实验，朊病毒减少系数的计算显示在表10中。为了克服干扰而使用的样品稀释也显示在表10中。
表10：样品滴定数据和朊病毒减少系数总结
*校正因子用于最终的体积对数计算。适合每个样品的校正因子是各样品本身的校正因子和在该样品下面列出的样品的所有校正因子。
**为计算减少系数的目的，每个洗脱样品使用50ml的体积，以确保直接比较上样到柱的体积。
相对于被外加的原材料，从E1样品计算出2.5log10的减少系数，所述E1样品代表穿过PRDT柱的前2.0ml。在样品E2到E5中，观察到PrPsc突破进入流过馏分(样品E5的减少系数1.5log10)。在再生样品中没有检测到PrPsc，且和PRDT树脂结合的PrPsc的等价物在下面PRDT树脂的朊病毒结合能力的计算部分中更详细地讨论。
朊病毒减少树脂的朊病毒结合能力的计算
为了评估朊病毒减少树脂(PRDT树脂)对朊病毒蛋白的结合能力，将在蛋白质印迹测试中观察到的效价和感染效价相关联。蛋白质印迹试验使用已知效价的263K原料。制备参照原料的稀释系列并在蛋白质印迹试验中测试。绘制获得的效价和在仓鼠生物测定中观察到的各效价的图之后，进行线性回归分析以评估两个测试系统之间的关系。回归线的斜率和截距分别被计算为1.0667和-4.5867。使用下面的公式，回归参数被用于将蛋白质印迹效价转化为感染效价：
效价[生物测定]＝(效价[蛋白质印迹]+4.5867)/(1.0667)。
在计算每ml的感染效价之后，可测定与柱结合的总朊病毒。计算的朊病毒减少树脂的朊病毒蛋白结合能力在下面表11中显示。使用直接观察到的与朊病毒减少树脂结合的PrPsc的量测定该能力(样品Reg和Col)。
表11：朊病毒减少树脂(PRDT树脂)的朊病毒结合能力
#总PrPSc包括测试之前样品体积以及浓度/稀释的校正
总上样量基于50ml上样到PRDT柱的最终体积
*基于5.0ml柱大小
2M盐冲洗之后，PrPsc与PRDT树脂的总结合是7.4log10ID50/ml。通过蛋白质印迹在盐冲洗馏分中没有检测到PrPsc。还观察到明显的PrPsc除去(≥2.5log10)。
当进行干扰测试时，测试未稀释的原材料，离心并10-倍浓缩。进行这一步以允许评估浓缩样品并因此获得更高的减少系数的可能性。
实施例4：通过朊病毒减少树脂对25％白蛋白除去TSE
在该研究中，评估在25％白蛋白(Baxter，Deerfield，IL)中通过朊病毒减少树脂(PRDT柱)除去潜在的TSE。使用的材料和方法与在实施例3中描述的相同，不同的是来自Baxter(批号：LA07D051AB/TA09/0123)的白蛋白(人)USP25％溶液用作进行外加实验和干扰测试的原材料。
工艺流程
建立缩减规模的过程并在ViruSure设备中进行。工艺流程方案和收集的样品一起描绘在图7中。各样品的体积可见于“结果”一节的表12中。工艺流程制备使用的参数和过程，包括连接和柱、柱平衡，与在实施例3中描述相同。
样品制备和朊病毒减少树脂层析
50.1ml平衡的原材料外加有0.51ml的0.5％肌氨酰溶解的263K匀浆。接着用0.1M HCL或0.5M NaOH检查pH并发现在6.9-7.4的目标范围内。被外加的原材料的pH(6.85)在6.9-7.4的目标范围(见“偏离”一节)之外。添加65μL 0.1M NaOH和50μl 1M NaOH之后，pH值保持不变，所以决定以该pH上样原材料。随后，0.5ml等分试样被移出(样品SSM)，并等分试样和储存在≤-60℃。
被外加的样品接着以1.8±0.1ml每分钟的流速应用到上面平衡的PRDT柱，且流过液收集为下列馏分：
一旦吸收度已经达到满刻度偏转的80％，开始收集E1。对于每轮实验，收集流过馏分(通过称重测定每次收集的洗脱液样品的体积)。上样被外加的白蛋白溶液之后，用10.0ml的平衡缓冲液冲洗柱。一旦吸收度下降低于满刻度偏转的80％，停止收集E5样品。平衡缓冲液冲洗之后，使用＞20.0ml的2M NaCl使柱再生(样品REG)，且再生之后移出树脂并重悬浮于5ml的TBS(样品COL)中。
结果
来自外加实验的样品
下面表12列出了从外加实验收集的样品连同每个样品的体积。在通过重量测定样品体积的情况，则假定密度为1.0g/ml，以允许计算每个样品的体积。所有样品被等分储存在-60℃直到分析。来自外加实验的色谱图形的扫描复印件在图8中示出。
表12：过程实验期间收集体积的总结
干扰结果
为了克服白蛋白干扰，除再生和树脂样品之外，所有的样品用包含0.1％BSA的TBS稀释1.0log10，接着离心并1/10浓缩。以10倍浓度测试未稀释样品的干扰，显示强烈的干扰。对于再生样品，测试之前制备0.5log10稀释以降低NaCl的浓度。对于树脂样品，因为树脂在TBS缓冲液中重悬浮，所以测试这些样品无需预稀释。
使用1.0Log10预稀释通过离心和重悬浮在1/10th初始体积，制备为了克服干扰需要的样品稀释。见图9。
朊病毒滴定数据和减少系数的计算
对于过程实验，朊病毒减少系数的计算显示在表13中。为了克服干扰使用的样品稀释也显示在表13中。
表13：样品滴定数据和朊病毒减少系数总结
*校正因子用于最终的体积对数计算。适合每个样品的校正因子是各样品本身的校正因子和在该样品下面列出的样品的所有校正因子。
**为计算减少系数的目的，每个洗脱样品使用50ml的体积，以确保直接比较上样到柱的体积。
相对于被外加的原材料，从E1样品计算出≥2.5log10的减少系数，所述E1样品代表穿过PRDT柱的前2.0ml。在样品E2到E5中，观察到PrPsc突破进入流过馏分(样品E5的减少系数1.5log10)。在再生样品中没有检测到PrPsc，且与PRDT树脂结合的PrPsc的等价物在下面PRDT树脂的朊病毒结合能力的计算部分中更详细地讨论。
朊病毒减少树脂的朊病毒结合能力的计算
为了评估朊病毒减少树脂(PRDT树脂)对朊病毒蛋白的结合能力，将在蛋白质印迹测试中观察到的效价和感染效价相关联。蛋白质印迹试验使用已知效价的263K原料。制备参照原料的稀释系列并在蛋白质印迹试验中测试。绘制获得的效价和在仓鼠生物测定中观察到的各效价的图之后，进行线性回归分析以评估两个测试系统之间的关系。回归线的斜率和截距分别被计算为1.0667和-4.5867。使用下面的公式，回归参数用于将蛋白质印迹效价转化为感染效价：
效价[生物测定]＝(效价[蛋白质印迹]+4.5867)/(1.0667)。
在计算每ml的感染效价之后，可测定与柱结合的总朊病毒。计算的PRDT树脂的朊病毒蛋白结合能力在下面表14中显示。使用直接观察到的与PRDT树脂结合的PrPsc的量测定该能力(样品Reg和Col)。
表14：PRDT树脂的朊病毒结合能力
#总PrPSc包括测试之前样品体积以及浓度/稀释的校正
总上样量基于50ml上样到PRDT柱的最终体积
*基于5.0ml柱大小
2M盐冲洗之后，PrPsc与PRDT基体的总结合是7.4log10ID50/ml。通过蛋白质印迹在盐冲洗馏分中没有检测到PrPsc。还观察到明显的PrPsc除去(≥2.5log10)。
被外加的原材料的pH是6.85。添加65μl 0.1M NaOH和50μl 1MNaOH之后，pH值保持不变。效果可能源于25％白蛋白的显著的缓冲能力。
当进行干扰测试时，测试未稀释的原材料，离心并10-倍浓缩。除了干扰测试，在研究计划中对此也进行了描述，并进行以允许评估浓缩样品并因此获得更高减少系数的可能性。
实施例5.用朊病毒除去处理的人白蛋白的过程中分析和稳定性分析
在该实验中，评估朊病毒除去柱对人白蛋白浓度和组成的影响。在两个独立的实验中，一升白蛋白用PRIOCLEARTMB柱(50ml)(ProMeticBiosciences)处理。未处理的样品、在实验开始收集的样品和在实验最后收集的样品接着进行浓度和组成分析。结果在表15和16中显示。
表15.实验一中人白蛋白的结果
表16.实验二中人白蛋白的结果
在朊病毒除去过程之前和之后，没有观察到白蛋白的显著性差异。
我们进一步评估进行朊病毒除去处理的人白蛋白和使用朊病毒除去处理的人白蛋白制造的Abraxane悬浮液的过程中稳定性。结果在表17和18中显示。
表17.来自实验一的处理的HA溶液和使用处理的HA制造的Abraxane悬浮液的过程中稳定性
表18.来自实验二的处理的HA溶液和使用处理的HA制造的Abraxane悬浮液的过程中稳定性
我们进一步比较在使用朊病毒除去处理的人白蛋白制造的最终Abraxane产品(使用朊病毒除去处理的人白蛋白的试验批次)和使用未进行朊病毒除去处理的人白蛋白制造的最终Abraxane产品(AbraxaneExhibit lot，Abraxane Validation lot，和Abraxane试验批次)中人白蛋白的加速稳定性。结果在表19中显示。
表19.使用朊病毒除去处理的HA制造的Abraxane最终产品中HA的加速稳定性。与使用未处理的HA制造的最终产品作比较
稳定性数据的比较显示在55℃下储存2周等于在40℃下储存3个月。使用朊病毒除去处理的人白蛋白制造的试验批次和使用未处理的人白蛋白制造的试验批次之间，在制造过程期间和过程内测试期间，没有观察到显著性差异。使用朊病毒除去处理的人白蛋白制造的最终产品的性质和使用未处理的人白蛋白制造的最终产品的性质之间没有显著性差异。
实施例6：评估朊病毒除去柱对Abraxane过程中悬浮液的影响
该实验评估Abraxane过程中悬浮液，即，冻干之前Abtaxane悬浮液的朊病毒除去的影响。在该实验中，使用商业上可得的ProMeticBiosciences的包含Toyopearl Amino 650CU树脂的PIKSI试剂盒柱(1cc)。
在两个独立的实验中，0.5L包含人白蛋白的Abraxane过程悬浮液被处理通过柱。分析结果在表20中总结。
表20.朊病毒除去柱对Abraxane过程中悬浮液的影响
样品1：Abraxane过程中悬浮液，未处理的
样品2：Abraxane过程中悬浮液，朊病毒除去柱后，在实验开始时收集的样品
样品3：Abraxane过程中悬浮液，朊病毒除去柱后，在实验最后收集的样品(0.5L)。
如在表20中所示，就颗粒大小、pH、紫杉醇测定和杂质、人白蛋白(HA)测定和HA组成而言，未处理的和处理的悬浮液之间，朊病毒除去处理的Abraxane过程中悬浮液的物理和化学测试未显示显著性差异。

Claims (14)

1.产生包含纳米颗粒的组合物的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使包括有机相和白蛋白溶液的混合物经历高剪切条件，所述有机相包括所述基本上不溶于水的药学活性剂，和b)从所述混合物中除去朊病毒蛋白，其中步骤b)包括：1)使所述混合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触；和2)从所述混合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体是肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肽是DVR、YVHEA、SYA或D4。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
5.从怀疑包含朊病毒蛋白的包含纳米颗粒的组合物中除去朊病毒蛋白的方法，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述方法包括：a)使所述组合物和能够与朊病毒蛋白结合的配体接触，b)从所述组合物中除去所述配体和与其结合的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述配体是肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肽是DVR、YVHEA、SYA或D4。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
9.包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括白蛋白和基本上不溶于水的药学活性剂，所述组合物进一步包括能够与朊病毒蛋白结合的配体。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物中的所述纳米颗粒具有不大于200纳米的平均直径。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物中的所述纳米颗粒包括用所述白蛋白包被的基本上不溶于水的药学活性剂。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述配体是肽。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述肽是DVR、YVHEA、SYA或D4。
14.根据权利要求9所述组合物，其中所述配体是基于三嗪的化合物。
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