CN102719465B - 可诱导性组织特异性表达载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及可诱导性组织特异性表达载体及其用途。本可诱导性组织特异性表达载体，主要包括以下结构：EF1α启动子，EGFP荧光标记基因，两端连有同向LoxP序列的BGHpolyA加尾转录终止序列和内部引入酶切位点的内含子序列；所述载体为pEFGLPAL-MIR，其使用EF1alpha通用启动子驱动基因表达，EGFP荧光标记基因用于指示基因的表达，两段连有同向LoxP71和LoxP66的BDHpolyA加尾转录终止信号，可被Cre酶诱导；在所述的终止信号其后的是一段内含子序列，表达miRNA前体插入该内含子中。本发明中构建的microRNA表达载体可成功的表达特异的microRNA，并可通过多种方法确定microRNA的表达；所述的表达载体在ES细胞中，microRNA表达不容易被沉默，能成功的应用于转基因小鼠的制备。

Description

可诱导性组织特异性表达载体及其用途

技术领域

    本发明属生物技术领域，涉及可诱导性组织特异性表达载体及其用途。具体涉及microRNA可诱导性组织特异性表达载体及用途，尤其是一种Cre酶介导的、可诱导的、组织特异的miRNA表达载体pEFG LPAL-MIR，所述载体可用表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型。

背景技术

研究报道，microRNA是由21-25个核苷酸组成的小的内源性非编码的单链RNA分子，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生；所述前体在细胞之中被RNaseIII Dicer切割成约22个核苷酸的microRNA双链，其中一条链被降解，另外一条被加工成成熟的microRNA。在动物细胞实验中，microRNA一般通过部分序列同源性于靶基因mRNA的3’-UTR（3’端非编码区）结合，导致翻译阻止，在很少的情况下，导致mRNA的降解。microRNA的发现揭示了一种新的基因调节机制，在发育和细胞分化方面起具有重要的作用和意义。研究揭示，miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，如，早期发育，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡，脂肪代谢以及细胞分化等。有研究发现microRNA与许多疾病的发生有很大的关系，比如肿瘤，心脏病等等，可进一步指导疾病的诊断。由于microRNA存在的广泛性和多样性，并且很多miRNA的表达具有组织以及发育阶段表达的特异性，因此提示microRNA可能有更加广泛多样的生物功能。

目前有关疾病的研究需要可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型，但迄今为止，尚未见有专门用于构建转基因试验动物模型尤其是转基因试验小鼠的miRNA表达载体，加之普通的CMV启动子很容易在ES细胞中被沉默，这些都为microRNA的研究或者转基因试验动物模型的制备造成了很大的困难。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可诱导性组织特异性表达载体，具体涉及可诱导的、组织特异的miRNA表达载体，尤其是一种Cre酶介导的、可诱导的、组织特异的miRNA表达载体pEFG LPAL-MIR。所述载体可用于表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型。

本发明的进一步目的是提供所述的表达载体在用于表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型中的用途。

本发明以内含子方式表达miRNA，所述的载体在不影响标记基因EGFP表达的同时，还能实现miRNA的有效表达；该载体可用于体外实验以及转基因小鼠，所述的Cre酶对该载体的表达具有很好的可诱导性。

本发明的表达载体中，在pEGFP质粒的基础上，加入了EF1 alpha启动子。 

具体而言，本发明的可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，主要包括以下结构：EF1α启动子， EGFP荧光标记基因，两端连有同向LoxP序列的BGH polyA加尾转录终止序列和内部引入酶切位点的内含子序列；所述的载体为pEFG LPAL-MIR，具有序列1的结构。

本发明中，所述载体使用EF1 alpha通用启动子驱动基因表达；EGFP荧光标记基因用于指示基因的表达；然后是两段连有同向LoxP71和LoxP66的BDH polyA加尾转录终止信号，可以被Cre酶诱导；在所述的终止信号其后的是一段内含子序列，表达miRNA前体插入该内含子中；

本发明中，EF1α启动子具有较高水平表达且不容易被沉默；

本发明中， EGFP荧光标记基因便于将来转基因小鼠的鉴定及实时观测转基因的表达；

本发明中， Cre酶可有效介导该两端连有同向LoxP序列的BGH polyA加尾转录终止序列的切除，从而有效控制3’序列的转录与否；

本发明中，对内含子序列进行了改造，引入酶切位点，从而可将miRNA前体插入该位点，实现miRNA前体的有效剪切，并不干扰其前面的EGFP荧光基因表达。

本发明的实施例中，采用EF1α，实现miR424基因座位的高表达，并且为了防止在将来转基因动物中所转的基因被沉默；引入了EGFP荧光标记蛋白，便于鉴定转基因小鼠以及实时监控转基因的表达；c）在miRNA前体的两端分别加入了内含子供体和受体序列（可将miRNA前体从转录本中作为内含子切除，并加工形成成熟体），使miRNA的串联表达不影响EGFP的表达；在EGFP基因和miR424前体之间插入了一段PolyA加尾转录终止信号，并在加尾信号两端各加入一段LoxP序列，通过与心肌特异表达Cre的小鼠杂交，可将该PolyA加尾转录终止信号在心肌细胞中特异环化切除，实现在F1代小鼠心肌中特异上调特定miRNA的表达，实现miRNA组织特异的表达上调，并防止过表达导致第一代转基因小鼠死亡。

本发明的microRNA可诱导性组织特异性表达载体，经体外实验表明，Cre对该miRNA表达载体具有很好的可诱导性。

本发明中，在EGFP后加入了两个同向的LoxP71和LoxP66位点，这两个LoxP都具有突变的位点，保证在与cre重组后残留的LoxP与染色体上其他的LoxP发生重组。在这两个LoxP位点中间加入了BDH的polyA序列，使得在未与cre酶重组之前microRNA不能表达，避免了在转基因小鼠制备中出现F1代因为microRNA过表达而可能导致的胚胎死亡。

本发明载体具有以下特点：

1）可解决某些致死性miRNA转基因动物建立的困难：某些miRNA的表达上调具有严重的病症，例如miR-1过表达的引起心律异常，所以这些miRNA的表达上调对于动物来说可能是致死性的，所以这类miRNA不容易获得高表达转基因小鼠，而该载体转基因小鼠在未与Cre小鼠杂交前，是不表达miRNA的，所以解决了致死性miRNA转基因小鼠的建立难题；

2）可方便的实现特定miRNA的组织性特异表达以及发育阶段性表达：常规建立组织特异性表达转基因小鼠的建立是通过使用组织特异性启动子，这一方式有其局限性，即一旦转基因动物建立，将不能较为机动的实现其他组织的表达。而该载体建立转基因小鼠，可通过选择组织特异性以及发育阶段特异性Cre小鼠，机动的在不同组织及不同阶段上调目的miRNA。

3）EF1α启动子选用以及内含子表达miRNA的方式，也是实现miRNA有效表达的保证，并保证miRNA的表达不会干扰串联标记的表达；

4）与miRNA串联的EGFP基因可简化转基因动物筛选及实时监测。

本发明将获得的载体转染HEK293细胞通过荧光观察和RT-PCR方法确定了microRNA的表达。

本发明对构建的表达载体转染小鼠E14细胞，通过荧光观察和RT-PCR方法确定了microRNA在小鼠ES细胞的表达。

本发明用获得的表达载体制备转基因小鼠，在F1代中有存活的带有绿色荧光的小鼠。

本发明中构建的microRNA表达载体可以成功的表达特异的microRNA,并且可以通过多种方法确定microRNA的表达。本发明中的表达载体在ES细胞中，microRNA表达不容易被沉默，能成功的应用于转基因小鼠的制备。

附图说明

图1表明将pEFG LPAL-mir-363，pEFG LPAL-mir-363 cre后，pEFG LPAL-mir-424，pEFG LPAL-mir-424 cre 后质粒转染小鼠干细胞E14中（使用转染试剂LTX），24h后通过观察绿色荧光鉴别质粒表达。

图2表明本发明中细胞转染48h后抽提细胞RNA，经加尾法RT-PCR后检测miR-363和miR-424的表达，18s做内参，cre后miRNA可表达。

图3表明本发明中特定的内含子引物loxp71 BGH F/loxp66 BGH T PCR显示miRNA剪切加工后内含子变小。

具体实施方式

实施例1  构建pEFG LPAL-MIR

1）插入EF1 alpha启动子

根据pEBG质粒序列设计带有相应酶切位点的引物，将EF1 alpha启动子序列经过PCR-酶切-连接反应构建到pEGFP-c1质粒中，经测序比对EF1 alpha启动子序列无突变，并将此构建好的质粒命名为pEFG。

2）插入LoxP-polyA-LoxP序列

化学合成各35bp的LoxP71和LoxP66。polyA1序列来自于pcDNA3.1(+)中BGH polyA序列。将3段序列用重叠PCR的方法串联，顺序为LoxP71-polyA1-LoxP66，并且两个LoxP位点保持顺位方向，将此段DNA经过酶切-连接反应构建到pEFG载体中，经测序比对无突变，命名为pEFG LPAL。

3）插入intron序列

内含子（intron）序列来自于pRL-renilla质粒，将intron D和intron R通过重叠PCR方法中间依次引入Bgl II，EcoR V，Sall I酶切位点，并将获得的DNA插入到pEFGFP质粒SV40 polyA序列前，构建好的质粒命名为pEFG LPAL-MIR，全长为6287bp（具有如序列1的结构）。

实施例2 pEFG LPAL-MIR的应用

1)    构建pEFG LPAL-mir-363 和pEFG LPAL-mir-424

将mir-363和mir-424前体序列通过PCR反应获得，并插入到pEFG LPAL-MIR载体中，经测序无突变。

2)    质粒体外与cre酶（NEB）重组

反应体系（20ul）：

质粒           5-10ng

10×Buffer      2ul

Cre            0.5ul

ddH2O         to 20ul

37°C  30min，72°C 10min。

转化TOP10感受态，37°C 12h，克隆PCR鉴定（引物为loxp71 BGH F/loxp66 BGH T），无明显条带的为已经环化切除的质粒，并经测序确认。

3)    pEFG LPAL-MIR在小鼠胚胎干细胞中的表达

如图1所示，将pEFG LPAL-mir-363，pEFG LPAL-mir-363 cre后，pEFG LPAL-mir-424，pEFG LPAL-mir-424 cre 后质粒转染小鼠干细胞E14中（使用转染试剂LTX），24h后通过观察绿色荧光鉴别质粒表达。

如图2所示，细胞转染48h后抽提细胞RNA，经加尾法RT-PCR后检测miR-363和miR-424的表达，18s做内参，cre后miRNA可表达。

如图3所示，特定的内含子引物loxp71 BGH F/loxp66 BGH T PCR显示miRNA剪切加工后内含子变小。

实施例3 制备转基因小鼠

将pEFG LPAL-mir-363和pEFG LPAL-mir-424质粒线性化后（ApaL I）按常规方法转入小鼠的受精卵，将该受精卵植入雌性小鼠体内，结果显示，F1代小鼠经绿色荧光蛋白表达鉴定为转基因小鼠。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  复旦大学

 

<120>  可诱导性组织特异性表达载体及其用途

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  6287

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

 

<400>  1

tagttattat cgacattgat tattgactag ttattaatcc tcggcctctg agctattcca     60

 

gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttt gcaaagatgg    120

 

ataaagtttt aaacagagag gaatctttgc agctaatgga ccttctaggt cttgaaagga    180

 

gtgggaattg gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag    240

 

aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac    300

 

tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat    360

 

ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag    420

 

gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg    480

 

ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt    540

 

tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg    600

 

agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc    660

 

ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac    720

 

gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc    780

 

ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag    840

 

gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc    900

 

tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc    960

 

ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag   1020

 

ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa   1080

 

aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc   1140

 

caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg   1200

 

gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg   1260

 

gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct   1320

 

caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gaggaattcc   1380

 

tcgactagcg ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt   1440

 

ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg   1500

 

cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg   1560

 

caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt   1620

 

cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg   1680

 

ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga   1740

 

ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa   1800

 

ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta   1860

 

tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat   1920

 

cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg   1980

 

ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc   2040

 

caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct   2100

 

cggcatggac gagctgtaca agtccggata gaatagtacc gttcgtatag catacattat   2160

 

acgaagttat catcatcacc atcaccattg agtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt   2220

 

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga   2280

 

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag   2340

 

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga   2400

 

agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac   2460

 

cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg   2520

 

tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt   2580

 

cgctttcttc ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggtatccgga ctcagatcct   2640

 

agataacttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg tgaggcactg   2700

 

ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt   2760

 

cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcaccaag tagatctgat atcgtcgacg   2820

 

cactattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt   2880

 

caattacagc tcttaaggct agagtactta atacgactca ctatagctcg acggtaccgc   2940

 

gggcccgatc caccggatct agataactga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg   3000

 

ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg   3060

 

caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca   3120

 

tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac   3180

 

tcatcaatgt atcttaaggc gtaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta   3240

 

aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat   3300

 

aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca   3360

 

ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc   3420

 

ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta   3480

 

aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg   3540

 

gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg   3600

 

gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtca   3660

 

ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat   3720

 

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa   3780

 

aggaagagtc ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa   3840

 

agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa   3900

 

ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca   3960

 

attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca   4020

 

gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg   4080

 

ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct   4140

 

tttgcaaaga tcgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga   4200

 

ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa   4260

 

cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt   4320

 

ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg   4380

 

ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa   4440

 

gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac   4500

 

cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt   4560

 

gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact   4620

 

cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg   4680

 

ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg   4740

 

acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc   4800

 

atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt   4860

 

gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc   4920

 

gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg   4980

 

ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg   5040

 

attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct   5100

 

ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccaccct agggggaggc   5160

 

taactgaaac acggaaggag acaataccgg aaggaacccg cgctatgacg gcaataaaaa   5220

 

gacagaataa aacgcacggt gttgggtcgt ttgttcataa acgcggggtt cggtcccagg   5280

 

gctggcactc tgtcgatacc ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc cgcgtttctt   5340

 

ccttttcccc accccacccc ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca gccaacgtcg   5400

 

gggcggcagg ccctgccata gcctcaggtt actcatatat actttagatt gatttaaaac   5460

 

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa   5520

 

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat   5580

 

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc   5640

 

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg   5700

 

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc   5760

 

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg   5820

 

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg   5880

 

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa   5940

 

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg   6000

 

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga   6060

 

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct   6120

 

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca   6180

 

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc   6240

 

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc catgcat                 6287

 

Claims (5)

1.可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，主要包括以下结构：EF1α启动子，EGFP荧光标记基因，BGH polyA加尾转录终止序列和内含子序列；所述的载体为pEFGLPAL-MIR，具有序列1的结构。

2.按权利要求1所述的可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，所述的BGHpolyA加尾转录终止序列为两端连有同向LoxP序列的转录终止序列。

3.按权利要求1所述的可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，所述的内含子序列其内部引入酶切位点。

4.权利要求1的可诱导性组织特异性表达载体的构建方法，其特征在于，其包括步骤：

1）插入EF1 alpha启动子

将EF1alpha启动子序列插入到pEGFP-c1质粒中，得质粒pEFG；

2）插入LoxP-polyA-LoxP序列

将LoxP71和LoxP66和BGH polyA序列用重叠PCR的方法串联，得顺序为LoxP71-polyA1-LoxP66的DNA段，将其插入到pEFG载体中，得质粒pEFG LPAL；

3）插入intron序列

内含子序列intron D和intron R通过重叠PCR方法中间依次引入Bgl II，EcoR V，Sall I酶切位点，并将获得的DNA插入pEFG LPAL质粒SV40polyA序列前，构建得pEFG LPAL-MIR，全长为6287bp，具有如序列1的结构。

5.按权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤2的LoxP71和LoxP66为化学合成；所述的两个LoxP位点为顺位方向。

Images