CN102843904B - 在经遗传修饰的生物体中切除转基因 - Google Patents
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Abstract
一种用于删除植物中的DNA区的方法。在一些实施方案中，该方法包括用核酸分子转化植物，其中所述核酸分子编码与一种或多种组织特异性启动子，例如花粉特异性启动子可操作连接的一种或多种锌指核酸酶(ZFN)。方法包括切除植物中的天然基因。因而，在一些实施方案中，工程化改造识别在天然植物基因侧翼的序列的ZFN。在又一些实施方案中，将ZFN在发育阶段特异性启动子的控制下表达，使得例如在相对晚期的发育阶段期间在植物中特异性切除核酸序列。包括可用于实施公开的方法的核酸分子和由该方法生成的植物。
Description
优先权要求
本申请要求2010年1月22日提交的题目为“Excision of Transgenes inGenetically Modified Organisms”的美国临时专利申请流水号61/297,628的权益。
发明领域
一般而言，本发明涉及用于生成转基因植物的组合物和方法。在某些实施方案中，转基因植物包含一种或多种感兴趣的转基因。在某些实施方案中，在花粉和/或种子中指导转基因的切除，使得由本发明的转基因植物生成的花粉和/或种子基本上没有转基因。在一些实施方案中，例如，本发明的转基因植物可用于实现感兴趣的转基因在转基因植物中的生物限制(bioconfinement)。在其它实施方案中，转基因的切除针对特定表达盒，诸如选择标志，使得仅自转基因植物和/或转基因植物后代除去此表达盒。
发明背景
许多植物用来自其它物种的基因遗传转化以导入期望的性状，诸如以经由例如改善营养价值质量、提高产量、赋予有害物或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量诸如色素沉着和生长、和/或赋予除草剂抗性；实现自植物生成工业上有用的化合物和/或材料；和/或实现药物的生成来改善农业价值。克隆基因对植物细胞的导入和稳定的能育转基因植物的回收可以用于进行植物的此类修饰，并且已经容许经由遗传工程(例如作物改良)将期望的感兴趣的性状或质量掺入植物中。在这些方法中，通常将外来DNA导入真核植物细胞的核或质体DNA中，接着分离含有整合入细胞的DNA中的外来DNA的细胞，以生成经稳定转化的植物细胞。
关于使用转基因植物出现的一项缺点是转基因逃脱至野生物种和非转化物种的可能性。这些性状可以增加异型杂交、持久性、和转基因对邻近群体的基因渗入(introgression)的风险。转基因自遗传改良(GM)作物的逃脱通常经由基因流动，主要通过异花传粉发生(Lu(2003)Eviron.Biosafety Res.2:3-8)，但是也可以经由基因渗入发生。Stewart Jr.等(2003)Nat.Reviews Gen.4:806-17。作物间基因流动会导致对非GM品种(variety)的污染，影响给定农业系统中转基因和非转基因作物品种的策略开发。用转基因材料对非GM作物的显著污染由于许多国家对转基因产品进口的法律限制而在国际贸易中造成困难。若转基因赋予多种抗性(例如，针对除草剂、有害物和/或疾病)，则作物间基因流动可以引起转基因在可能潜在地变为自生杂草的杂种中叠加。另外，作物间基因流动会导致转基因逃脱至杂草似的群体或相关野生物种中，若转基因经由有性生殖和/或无性繁殖在杂草似的/野生的群体中持续并建立，则这会造成严重的杂草问题和其它生态学风险。这在逃脱的基因增强杂草似的/野生的物种的生态学适合度时是一项特别的忧虑。作物转基因的基因渗入在牵涉几个连续杂种世代的步骤中发生。基因渗入是一种动态过程，其在转基因在接受物种的遗传背景中固定前可能花费多年和多代，并且如此呈现检测和监测的困难。然而，若选择是强的和/或群体大小较小，则可以快速发生基因渗入基因的固定。
遗传修饰植物内特定表达盒，尤其是选择标志表达盒的污染是一项易忘的目的。选择标志基因通常抗生素抗性或除草剂耐受性基因，但是可以包括报告基因(即，β-葡糖醛酸糖苷酶(Graham等(1989)Plant Cell Tiss.Org.20(1):35-39)。共转移入植物的基因组中的选择标志提供选择优势，并且容许鉴定经稳定转化的转基因植物。可以用于转化植物的功能性选择标志基因的利用度稍微受到限制。发表的关于转基因作物植物的科学文献的综述揭示了抗生素抗性的最广泛使用的选择剂是卡那霉素(由新霉素磷酸转移酶II型基因编码(Bevan等(1983)Nature 304:184-187))或潮霉素(由潮霉素磷酸转移酶基因编码(Waldron等,Plant Mol.Biol.5:103-108))，并且除草剂耐受性是草胺膦(phosphinothricin)抗性(由pat(Wohlleben等(1988)Gene 70:25-37)或bar基因(DeBlock等(1987),EMBO J.6(9):2513-2518)编码)。见Sundar等(2008)J.Plant Physiol.165:1698-1716。鉴于有限数目的选择标志基因和通常使用这些性状的亚组，容许切除并再使用转基因植物内的选择标志的解决办法会消除在对同一植物的基因转移或基因叠加的后续轮次中对其它选择标志的需要。此外，切除选择标志的能力可以克服对植物转录物组(transcriptome)的无意改变，其通过表达标志物引起(Abdeen等(2009)Plant Biotechnol.J.7(3):211-218)。
目前用于阻止GM作物与其它物种和品种间的基因流动或使其最小化的策略包括：(1)物理分离转基因作物；(2)转基因的叶绿体工程化；(3)缓解基因(mitigation gene)及转基因的共工程化改造；(4)遗传用途限制技术(geneticuse restriction technology,GURT)；(5)CRE/loxP和FLP/FRT重组酶介导的基因删除。见例如Lee和Natesan(2006)TRENDS Biotech.24(3):10914;Lu(2003),见上文；及Luo等(2007),Plant Biotech.J.5:263-74；和(6)大范围核酸酶介导的基因删除。见例如美国专利申请No.11/910,515；和美国专利申请No.12/600,902。
已经利用CRE、FLP、和R重组酶自植物切除不想要的遗传物质。Hare和Chua(2002)Nat.Biotech.20:575-80。Luo等(2007)，见上文报告了花粉和种子特异性“GM基因删除物(deletor)”系统，其中使用loxP FRT融合序列作为CRE或FLP重组酶切除转基因的识别位点导致转基因自转基因烟草植物的花粉或自花粉和种子两者的删除。显示在植物中发挥功能的所有这些位点特异性重组酶系统是整合酶家族的成员。至少部分由于其它重组酶可能需要辅助蛋白和可以对重组效率赋予拓扑学限制的更复杂的识别位点的实情，已经选择这些系统进行使用。同上文。这些系统具有几个重大的缺点：整合酶型重组酶也可以识别“假序列”，其可以与特定的靶序列高度趋异，并且因此导致不想要的非特异性DNA删除；并且靶序列的切除留下残留的识别序列，其可以是后续暴露于重组酶后染色体重排的位点，或者激活基因沉默机制。同上文。此外，这些系统进一步受到限制，因为必须存在功能性重组酶，并且其在亲本植物之一中表达，其存在需要花粉和/或种子内删除的其它策略。尽管有这些限制，CRE/loxP系统被认为是用于优化植物中的基因删除的最合适的策略。同上文。
定制设计的锌指核酸酶(ZFN)是为了递送DNA中靶定位点特异性双链断裂，随后重组切割末端设计的蛋白质。ZFN组合FokI限制性内切核酸酶的非特异性切割域与锌指DNA结合蛋白。见例如Huang等(1996)J.Protein Chem.15:481-9;Kim等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616-20;Kim等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-60;Kim等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-7;Kim等(1997b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12875-9;Kim等(1997c)Gene 203:43-9;Kim等(1998)Biol.Chem.379:489-95;Nahon和Raveh(1998)Nucleic Acids Res.26:1233-9;Smith等(1999)Nucleic Acids Res.27:674-81。各个锌指基序可以设计为靶向并结合大范围的DNA位点。Cys2His2锌指蛋白通过将α-螺旋插入双螺旋的大沟中结合DNA。锌指对DNA的识别是模块的：每个指主要接触靶物中的三个连续的碱基对，并且蛋白质中的几个关键残基介导识别。已经显示了FokI限制性内切核酸酶必须经由核酸酶域二聚化以切割DNA，诱导双链断裂。类似地，ZFN也需要核酸酶域的二聚化以切割DNA。Mani等(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.334:1191-7;Smith等(2000)Nucleic Acids Res.28:3361-9。ZFN的二聚化由两个相邻的、相反取向的结合位点促进。同上文。另外，由锌指核酸酶引起的双链断裂通过植物DNA修复机器经由非同源末端连接(NHEJ)或同源性指导的修复(HDR)解决，由此生成没有残留识别序列的植物。
发明概述
依照本发明的一个实施方案，提供了一种用于删除植物中的DNA区的方法，其中能活植物(viable plant)含有基因组DNA，所述基因组DNA包含DNA区；在含有所述基因组DNA的所述能活植物中导入或表达工程化改造成在识别序列处切割所述基因组DNA的锌指核酸酶；由此导致在识别序列处对所述基因组DNA的切割，导致所述基因组DNA的切除，其中所述DNA区不存在于所述基因组DNA。
在另一个实施方案中，一种用于删除植物中的DNA区的方法包括提供含有基因组DNA的第一能活植物，所述基因组DNA包含所述DNA区及在所述DNA区的3’端侧翼的第一识别序列和在5’端侧翼的第二识别序列。提供含有基因组DNA的第二能活植物，所述基因组DNA包含编码工程化改造为在所述识别序列处切割所述基因组DNA的锌指核酸酶的DNA。将所述第一和第二能活植物杂交，使得在所述第一或所述第二能活植物上生成F1种子。种植含有基因组DNA的所得F1植物，其中所述DNA区不存在于所述基因组DNA。在某些实施方案中，所述第一识别序列和所述第二识别序列是相同的。
在一个具体的实施方案中，分离的核酸分子包含：由锌指核酸酶识别的第一核酸序列；感兴趣的基因；和由锌指核酸酶识别的第二核酸序列，其中所述感兴趣的基因侧翼有由锌指核酸酶识别的所述第一和第二核酸序列。在另一个实施方案中，第一识别序列和第二识别序列侧翼可以有同源序列。在又一个实施方案中，生成转基因植物的方法包括用分离的核酸分子转化植物细胞或植物组织，并再生全植物。
在又一个实施方案中，用于降低感兴趣的基因对其它植物传播的方法包括将全植物与自用分离的核酸分子转化的植物细胞或组织再生的植物杂交，所述分离的核酸分子包含与锌指核酸酶可操作连接的花粉特异性启动子，其中在源自所述杂交的后代的花粉中特异性切除所述感兴趣的基因。栽培源自所述杂交的后代。在此实施方案中，分离的核酸分子包含启动子和编码锌指核酸酶的核酸序列，其中所述启动子与所述编码锌指核酸酶的核酸序列可操作连接，且生成转基因植物的方法包括用分离的核酸分子转化植物细胞或植物组织，并再生全植物。
在一个实施方案中，一种用于在含有核酸分子的植物中删除DNA区的方法，所述核酸分子包含：由锌指核酸酶识别的第一核酸序列；选择标志基因表达盒；和由锌指核酸酶识别的第二核酸序列，其中所述选择标志侧翼有由锌指核酸酶识别的所述第一和第二核酸序列。在另一个实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列侧翼有同源序列。另外，在能活植物细胞中表达或导入工程化改造成在识别序列处切割基因组DNA的锌指核酸酶，由此导致在识别序列处对所述基因组DNA的切割，导致所述基因组DNA的切除，其中所述选择标志不存在于所述基因组DNA。
在另一个实施方案中，锌指核酸酶单体的每一半分开表达，并且在彼此联合配对时形成功能性复合物。例如，将表达一个锌指核酸酶单体(其由与FokI内切核酸酶可操作连接的锌指结合基序组成)的植物转录单元稳定整合入一个亲本P1中，并将表达第二单体的植物转录单元稳定整合入第二亲本P2中。P1x P2的有性杂交生成含有这两个锌指单体的后代植物。所得的锌指核酸酶二聚体能够结合锌指结合位点，并且形成具有切割活性的复合物。鉴于FokI内切核酸酶作为二聚体是有活性的(Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570 10,575)，切割活性仅能够在含有这两个功能性表达单体的后代内出现。
在另一个实施方案中，锌指核酸酶在识别序列处的切除导致形成切割连接，其没有残留的识别序列。切割连接可以不被初始锌指核酸酶结合并切割。另外，切割连接可以是非同源末端连接(NHEJ)的结果或位于5’识别序列上游和3’识别序列下游的两个DNA同源区间的同源性指导的修复的结果或另一种未描述的DNA修复机制的结果。可以将同源序列放置到结合位点外部，使得在切割后，可以发生同源性指导的修复。这是重组酶系统的改善，所述重组酶系统总是留下用于得到切除的位点的残留。
在又一个实施方案中，切除植物中感兴趣的天然基因的方法包括用包含编码锌指核酸酶的核酸序列的分离的核酸分子或编码锌指核酸酶的分离的蛋白质序列转化包含感兴趣的基因的植物细胞或组织，其中所述锌指核酸酶识别在所述感兴趣的天然基因侧翼的核酸序列，并特异性切除感兴趣的天然基因。然后，再生全植物。在一个备选的实施方案中，可以通过将表达锌指核酸酶的植物与靶植物杂交实现内源基因切除。
附图简述
图1包括质粒pDAS5380的质粒图。
图2包括质粒pDAS5381的质粒图。
图3a是T-DNA插入物的示意图和限制图。图3b包括几幅小图，其描绘了用于鉴定含有来自依照本发明的实施方案的质粒pDAS5380的全长完整PTU的事件的T0 Southern印迹分析。T0 Southern印迹分析图像使用限制酶MfeI和NsiI消化pDAS5380事件，通过GUS和PAT的共杂交显示显示完整的T-DNA插入物。
图4A是T-DNA插入物的示意图和限制图。图4b包括几幅小图，其描绘了用于鉴定含有来自依照本发明的实施方案的质粒pDAS5381的全长完整PTU的事件的T0 Southern印迹分析。T0 Southern印迹分析图像使用限制酶MfeI和NsiI消化pDAS5381事件，通过HptII杂交显示显示完整的T-DNA插入物。
图5包括对代表依照本发明的实施方案的较大样品的选择组的事件的Southern印迹分析。选择这些样品以例示切除的片段(即，较低分子片段)、非切除片段(即，较高分子量片段)、和含有切除的和非切除的片段两者的嵌合事件。另外，包括野生型基因组DNA对照和100pg pDAS5380质粒。此数据与GUS表达数据相关联。经由组织化学染色在GUS方面不呈阳性染色的事件不含全长的完整的GUS PTU表达盒。
图6包括含有依照本发明的实施方案的Southern印迹实验中使用的基因组DNA样品的PCR扩增片段的琼脂糖凝胶的图像。这些PCR扩增子显示切除的片段(即，较低分子量片段)、非切除片段(即，较高分子量片段)、和含有切除的和非切除的片段两者的嵌合事件。另外，包括野生T0植物对照；这些反应中扩增较大的完整GUS PTU表达盒。还包括阴性对照，其中使用野生型基因组DNA和无DNA(H2O)进行PCR反应。此数据与GUS表达数据和Southern印迹数据相关联。
图7a和7b包括2.4kb条带的序列分析的比对，其显示依照本发明的实施方案的GUS表达盒的删除。粗体序列标示At肌动蛋白启动子和MAR基因元件。用下划线和斜体鉴定CCR5结合位点。虽然每种事件将多种扩增子生成并测序，但是在图中仅比对一种扩增子。
图8包括对依照本发明的实施方案的“完整”F1杂种的F2后代的PCR分析。
图9包括对依照本发明的实施方案的“完整”F1杂种的F2后代的Southern分析。
图10包括对依照本发明的实施方案的“切除”F1杂种的F2后代的PCR分析。
图11包括对依照本发明的实施方案的“切除”F1杂种的F2后代的Southern分析。
图12包括对依照本发明的实施方案的“嵌合”F1杂种的F2后代的PCR分析。
图13包括对依照本发明的实施方案的“嵌合”F1杂种的F2后代的Southern分析。
序列表
使用核苷酸碱基的标准字母缩写显示所附序列表中所列的核酸序列。仅显示每种核酸序列的一条链，但是互补链理解为通过任意参考展示链而包括在内。在所附序列表中：
SEQ ID NO:1显示了CCR5ZFN结合位点。
SEQ ID NO:2显示了CCR5锌指核酸酶基因序列。
SEQ ID NO:3显示了TQPATS引物。
SEQ ID NO:4显示了TQPATA引物。
SEQ ID NO:5显示了TQPATFQ引物。
SEQ ID NO:6显示了TQPALS引物。
SEQ ID NO:7显示了TQPALA引物。
SEQ ID NO:8显示了TQPALFQ引物。
SEQ ID NO:9显示了HPT2S引物。
SEQ ID NO:10显示了HPT2A引物。
SEQ ID NO:11显示了HPTFQ引物。
SEQ ID NO:12显示了Fok1_UPL_F引物。
SEQ ID NO:13显示了Fok1_UPL_R引物。
SEQ ID NO:14显示了BY2ACT89S引物。
SEQ ID NO:15显示了BY2ACT89A引物。
SEQ ID NO:16显示了用于PTU PCR分析的正向PCR引物。
SEQ ID NO:17显示了用于PTU PCR分析的反向PCR引物。
SEQ ID NO:18显示了BYACTFQ引物。
发明详述
本文中公开了一种自经遗传修饰的生物体中的特定植物组织切除基因的方法。在一些实施方案中，使用一种或多种ZFN(锌指核酸酶)自特定植物组织除去转基因作为降低基因对非GM作物流动的手段。在一些实施方案中，除去的转基因是选择标志基因盒。在某些实施方案中，特定的植物组织是花粉。
在一些实施方案中，一种或多种ZFN可以与不同组织特异性启动子可操作连接。在这些和其它实施方案中，可以将与组织特异性启动子可操作连接的所述一种或多种ZFN之一转化入一个亲本植物系中，并可以将与不同组织特异性启动子可操作连接的所述一种或多种ZFN之另一种转化入第二亲本植物系中。含有一种或多种ZFN之每种的亲本系间杂交可以生成F1系，其含有在识别序列处切割DNA的功能性ZFN。识别序列可以在植物DNA中转基因侧翼(flank)。
组织特异性基因切除可以通过组织特异性植物启动子与ZFN的可操作连接实现。在一些实施方案中，组织特异性启动子与一种或多种ZFN的可操作连接导致组织特异性一种或多种ZFN的表达，由此切除位于特定组织中识别序列间的ZFN、选择标志、和/或任何基因或核酸序列。
在具体的实施方案中，在同一植物内表达一种或多种ZFN。ZFN可以与在植物的较晚发育阶段期间驱动ZFN表达的启动子可操作连接。在这些和其它实施方案中，一种或多种功能性ZFN可以切割在一种或多种转基因侧翼的特异性识别序列，由此在植物发育的较晚阶段期间自植物组织除去一种或多种转基因。
缩写
GM经遗传修饰的
PTU植物转录单元
ZF锌指
ZFN锌指核酸酶
ZFP锌指蛋白
术语
基因表达：将核酸转录单元(包括例如，基因组DNA或cDNA)的编码信息转化成细胞的操作的、非操作的、或结构的部分的过程，经常包括蛋白质的合成。基因表达可以受到外部信号影响；例如，将细胞、组织、或生物体暴露于提高或降低基因表达的媒介物。基因表达也可以在从DNA至RNA至蛋白质的途径中的任何地方受到调节。例如经由对转录、翻译、RNA转运和加工、对中间分子诸如mRNA的降解起作用的控制，或者经由特定蛋白质分子在它们生成后的活化、灭活、区室化(compartmentalization)、或降解，或者通过其组合发生基因表达的调节。基因表达可以通过本领域中已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达，包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹、或体外、原位、或体内蛋白质活性测定法。
杂交：寡核苷酸及其类似物通过互补碱基间的氢键合(其包括沃森-克里克(Watson Crick)、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键合)杂交。一般地，核酸分子由作为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))的含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地，A或与T或U氢键合，而G会与C键合。“互补的”指两种独特的核酸序列或相同核酸序列的两个独特区间发生的碱基配对。
“可特异性杂交的”和“特异性互补的”是指足够的互补性程度，使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶物间发生稳定的且特异性的结合的术语。寡核苷酸与要可特异性杂交的其靶序列不需要是100%互补的。在寡核苷酸对靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且有足够的互补性程度以避免寡核苷酸在期望特异性结合的条件下，例如，在体内测定法或系统的情况中在生理学条件下与非靶序列的非特异性结合时，寡核苷酸是可特异性杂交的。此类结合称为特异性杂交。
导致特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和程度而有所变化。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg2+浓度)会促成杂交的严格性，尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定的严格性程度需要的杂交条件的计算在Sambrook等(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989,第9章和第11章中讨论。
出于本公开内容的目的，“严格条件”涵盖若杂交分子与靶序列间存在有小于25%错配会发生杂交的条件。“严格条件”可以进一步限定成特定的严格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等严格性”条件是具有超过25%错配的分子不会杂交的条件；“中间严格性”条件是具有超过15%错配的分子不会杂交的条件，而“高严格性”条件是具有超过10%错配的分子不会杂交的条件。“极高严格性”条件是具有超过6%错配的分子不会杂交的条件。
在具体的实施方案中，严格条件是于65°C杂交，接着于65°C用0.1xSSC/0.1%SDS连续清洗40分钟。
分离的：“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已经与该组分天然存在的生物体细胞中的其它生物组分，即，其它染色体和染色体外DNA和RNA及蛋白质基本上分开、离开其生成、远离其纯化。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过宿主细胞中的重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链两者，和上述物质的合成形式和混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一类核苷酸的修饰形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。该术语包括单和双链形式的DNA。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸中的任一种或两种。
核酸分子可以是经化学或生物化学修饰的，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员会容易领会的。此类修饰包括例如，标记、甲基化、用类似物替代一种或多种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，诸如不带电荷的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂的模块(例如，肽)、插入剂(例如，吖啶、补骨脂素(psoralen)等)、螯合剂、烷化剂、和经修饰的连接(例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体的、三链体的、发夹的、环状、和挂锁的构象。
可操作连接的：在第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可存在连接。例如，在启动子影响编码序列的转录或表达时，启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区的情况中，处于相同阅读框中。然而，元件不需要为了是可操作连接的而是连续的。
启动子：转录需要的一般位于上游(朝向基因的5’区)的DNA区。启动子容许其控制的基因的正确活化或阻抑。启动子含有转录因子识别的特定序列。这些因子结合启动子DNA序列，并且导致RNA聚合酶，即自基因的编码区合成RNA的酶的募集。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用组织特异性启动子，例如，花粉特异性启动子。组织特异性启动子是在相对于生物体的其它组织而言启动子是特异性的组织中指导关联基因的较高水平转录的DNA序列。组织特异性启动子的例子包括绒毡层特异性启动子；花药特异性启动子；花粉特异性启动子(见例如美国专利No.7,141,424和国际PCT公开文本No.WO 99/042587)；胚珠特异性启动子(见例如美国专利申请No.2001/047525 A1)；果实特异性启动子(见例如美国专利No.4,943,674和5,753,475)；和种子特异性启动子(见例如，美国专利No.5,420,034和5,608,152)。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用发育阶段特异性启动子，例如，在较晚的发育阶段有活性的启动子。
转化的：在病毒或载体将核酸分子转移入细胞中时其“转化”或“转导”细胞。在核酸分子通过将核酸分子整合入细胞基因组中，或者通过附加体复制被细胞稳定复制时，细胞被转导入细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可以将核酸分子导入此类细胞中的所有技术。例子包括但不限于用病毒载体转染、用质粒载体转化、电穿孔(Fromm等(1986)Nature 319:791-3)、脂转染(Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7)、微注射(Mueller等(1978)Cell 15:579-85)、土壤杆菌属介导的转移(Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)、直接的DNA摄取、和微粒轰击(Klein等(1987)Nature 327:70)。
转基因：外源核酸序列。在一个例子中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因。在又一个实施方案中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达展现出靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子)。
载体：如导入细胞中，由此生成经转化的细胞的核酸分子。载体可以包括容许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。例子包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、或将外源DNA携带到细胞中的病毒。载体还可以包含一种或多种基因、反义分子、和/或选择标志基因和本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化、或感染细胞，由此引起细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。任选地，载体包含帮助实现核酸分子进入细胞中的材料(例如，脂质体、蛋白质编码等)。
Zn指核酸酶介导的自植物切除转基因
本文中公开了用于生成具有降低的转基因逃脱的植物的方法以及通过此类方法生成的植物，和自其衍生的植物材料，例如种子。在一个实施方案中，所述方法包括使植物与载体接触，其中所述载体包含与一种或多种组织特异性启动子(例如花粉特异性启动子)可操作连接的一种或多种锌指核酸酶(ZFN)。此载体的表达导致ZFN在特定组织中的生成，其中其可操作连接的启动子是有活性的。可以将ZFN设计或工程化改造为识别在期望切割的核酸序列侧翼的切割序列。然后，ZFN在启动子有活性的特定组织中生成，导致在由ZFN识别的切割序列间的核酸序列的切除，由此生成含有没有残留识别序列的切割连接的核酸序列。
在另一个实施方案中，所述方法包括：使植物与载体接触，其中载体包含与组织特异性启动子可操作连接的一种或多种ZFN；感兴趣的基因；任选地，可以与感兴趣的基因可操作连接的一种或多种调节元件；和在感兴趣的基因和一种或多种调节元件侧翼的由ZFN识别的一种或多种切割序列。此载体的表达导致ZFN在其可操作连接的启动子有活性的特定组织中的生成。然后，ZFN在启动子有活性的特定组织中生成，导致切割在由ZFN识别的切割序列间的核酸序列，其包含感兴趣的基因和任选地，一种或多种调节元件。
在又一些实施方案中，所述方法包括使植物与载体接触，其中载体包含与在植物发育的特定时期有活性的启动子(例如，在相对晚期的发育阶段驱动表达的启动子)可操作连接的一种或多种锌指核酸酶(ZFN)。此载体的表达导致ZFN在特定发育期期间的生成，其中其可操作连接的启动子是有活性的。可以将ZFN设计并工程化改造为识别在期望切除的核酸序列侧翼的切割序列。ZFN在启动子有活性的发育阶段的生成导致切除由ZFN识别的切割序列间的核酸序列。
在又一些实施方案中，所述方法包括：使植物与载体接触，其中所述载体包含与在植物发育的特定时期有活性的启动子可操作连接的一种或多种ZFN；感兴趣的基因；任选地，可以与感兴趣的基因可操作连接的一种或多种调节元件；和在感兴趣的基因和一种或多种调节元件侧翼的由ZFN识别的一种或多种切割序列。此载体的表达导致ZFN在特定发育期期间的生成，其中其可操作连接的启动子是有活性的。ZFN在其可操作连接的启动子有活性的特定发育期期间的生成导致切除由ZFN识别的切割序列间的核酸序列，其包含感兴趣的基因和一种或多种调节元件。
ZFN核酸酶
在具体的实施方案中，自经转化植物中的核酸分子表达ZFN以指导经转化植物中的核酸序列切除。可以使用靶向工程化改造为在特定核酸序列(例如，转基因、感兴趣的基因、或选择标志基因)侧翼的识别序列的ZFN或者ZFN可以设计为靶向在要切割的特定核酸序列侧翼的天然存在的核酸序列。ZFN系统的精致的柔性和特异性提供先前通过已知的重组酶介导的基因切除策略不可实现的控制水平。
可以容易地凭实验操作ZFN的识别特异性。Wu等(2007)Cell.Mol.LifeSci.64:2933-44。锌指识别残基的密码子的随机化容许选择对任意选择的DNA序列具有高亲和力的新指。此外，已经显示了锌指和天然的DNA结合分子及经工程化改造的锌指对活细胞中其设计的靶物起作用。如此，基于锌指的核酸酶可靶向特异性的但任意的识别位点。
对嵌合锌指核酸酶的切割域的二聚化的需要赋予高水平的序列特异性。因为三个指的每组结合9个连续的碱基对，所以若每个锌指域具有完全的特异性，则两个嵌合核酸酶有效要求18bp靶物。此长度的任何给定序列预测为在单一基因组内是独特的(假设约109bp)。Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21(1):289-97;Wu等(2007),见上文。此外，其它指提供增强的特异性，Beerli等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14628-33;Kim和Pabo(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2812-7;Liu等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:5525-30，因此可以增加每个DNA结合域中的锌指数目以提供甚至进一步的特异性。例如，可以通过使用识别24bp序列的一对4指ZFN来进一步提高特异性。Urnov等(2005)Nature 435:646-51。
相对于α-螺旋的起始在ZFN中第1位、第2位、第3位和第6位的关键氨基酸通过锌指基序贡献大多数特异性相互作用。Pavletich和Pabo(1991)Science252:80917;Shi和Berg(1995)Chem.Biol.2:83 9。可以改变这些氨基酸，而将剩余的氨基酸作为共有主链维持，以生成具有不同和/或新型序列特异性的ZFP。见例如Choo和Klug(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11163-7;Desjarlais和Berg(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7345-9;Desjarlais和Berg(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2256-60;Greisman和Pabo(1997)Science275:657-61;Isalan等(1998)Biochemistry 37:12026-33;Jamieson等(1994)Biochemistry 33:5689-95;Rebar和Pabo(1994)Science 263:671-3;Segal等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:2758-63;Wolfe等(1999)J.Mol.Biol.285:1917-34;Wu等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:344-8。此外，可以设计至少两个具有不同序列特异性的3指ZFN，使得它们协作以产生切割。Smith等(2000),见上文。
可以通过确定一种或多种合适于识别特定核酸序列的ZF基序开始用于构建本发明的ZFN的设计和选择方法。或者，可以使用识别特定核酸序列的ZFN来构建核酸分子，其包含特定核酸序列(例如，其中特定核酸序列在感兴趣的基因侧翼)和其它元件(在需要时)。已经综述了ZFP的设计和各种选择方法，包括噬菌体展示方法。Mani等(2005),见上文;Durai等(2005)NucleicAcids Res.33:5978-90;Isalan等(2001)Nat.Biotechnol.19:65660;Kandavelou等(2005)Nat.Biotechnol.23:686-87;Pabo等(2001)Annu.Rev.Biochem.70:313-40;Segal等(2003)Biochemistry 42:2137-48。可以使用本领域中已知的任何设计和/或选择方法来得到ZFN以在本发明的实施方案中使用。例如，使用细菌单杂交和双杂交系统的基于细胞的选择策略可以用于生成高度特异性ZFP。Durai等(2006)Comb.Chem.High Throughput Screen.9:301-11;Hurt等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:12271-6;Joung等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:7382-7。也可以通过定向域改组和基于细胞的选择(其提供用于优化多指ZFP的通用方法)获得高度特异性ZFP。Hurt等(2003),见上文。
基于设计和噬菌体展示方法的大量数据可用于特异性识别5’GNN 3’和5’ANN 3’三联体的ZF模块，并且较小程度上，5’CNN 3’和5’TNN 3’三联体的ZF基序偏爱是已知的。见例如Durai等(2005),见上文;Dreier等(2001)J.Biol.Chem.276:29466-78;Dreier等(2005)J.Biol.Chem.280:35588-97;Dreier等(2000)J.Mol.Biol.303:489-502;Liu等(2002)J.Biol.Chem.277:3850-6。目前，两种基于网络的ZF设计软件包是可获得的(例如于zincfingertools.org)。前述物使基因组中编码的几乎所有基因可适应于ZFN介导的基因靶向。Katada和Komiyama(2009)Chembiochem.10(8):1279-88。
在具体的实施方案中，使用结合HIV共受体CCR5的ZFN。Perez等(2008)Nat.Biotechnol.26:808-16。此ZFN称作“CCR5ZFN”。在具体的实施方案中，CCR5ZFN编码区包含：不透明2核定位序列(Maddaloni等(1989)NucleicAcids Res.17(18):7532)；r162y11锌指结合域、FokI核酸酶域(Looney等(1989)Gene 80:193 208)；源自Thesoa assigna病毒的T2A stutter序列(Mattion等(1996)J.Virol.70:8124-7)；第二不透明2核定位序列、168FA vE锌指结合域；和第二FokI核酸酶域。
核酸分子
在一些实施方案中，所述方法包括具有一种或多种感兴趣的基因(其可以赋予期望的性状或表型)，诸如两种或更多种感兴趣的基因的第一植物与第二植物杂交。第二植物也可以具有一种或多种感兴趣的基因。第一植物可以包含载体，其中该载体包含与一种或多种感兴趣的基因可操作连接的启动子。启动子可以是组成性或诱导型启动子。编码感兴趣的基因的核酸序列侧翼可以有ZFN识别位点。任选地，与感兴趣的基因可操作连接的启动子和任何其它核酸序列(例如，调节序列)侧翼也可以有ZFN识别位点。第二植物可以包含另一种载体，其可以包含与编码ZFN的核酸序列可操作连接的组织特异性或发育特异性启动子。可以将载体稳定整合入这两个植物的基因组中。在杂交第一和第二植物后，组织特异性或发育特异性启动子特异性驱动ZFN在此类杂交的所得后代中的表达。ZFN在这些后代中的表达导致切除侧翼有ZFN识别位点的核酸序列，由此减少或消除后代的特定组织和/或发育阶段中感兴趣的基因和任选地其它序列(诸如选择标志基因)。在一些实施方案中，ZFN识别位点侧翼可以进一步有同源核酸序列以进一步促进同源DNA重组。
感兴趣的基因通常会以足够的量与驱动基因表达的一种或多种植物启动子可操作连接以赋予期望的性状或表型。适合于这种和其它用途的启动子是本领域中公知的。描述此类启动子的非限制性例子包括美国专利No.6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成性玉米启动子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(35S启动子)；6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)；6,429,357(稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子)；5,837,848(根特异性启动子)；6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原性诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(gamma-薏苡辛(coixin)启动子)；和美国专利申请流水号09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。其它启动子包括胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子(Ebert等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9)；章鱼碱合酶(OCS)启动子(其在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒(caulimovirus)启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-2；玄参花叶病毒35S启动子(Walker等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；R基因复合物启动子(Chandler等(1989)Plant Cell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV35S(美国专利No.5,322,938,5,352,605,5,359,142和5,530,196)；FMV35S(美国专利No.6,051,753和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利No.5,850,019)；SCP1启动子(美国专利No.6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(GenBank登录号V00087;Depicker等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:56173;Bevan等(1983)Nature 304:184-7)等。
可以任选地与感兴趣的基因可操作连接的其它遗传元件包括编码转运肽的序列。例如，已经显示了合适的叶绿体转运肽，诸如拟南芥(A.thaliana)EPSPS CTP(Klee等(1987)Mol.Gen.Genet.210:437-42)和矮牵牛(Petuniahybrida)EPSPS CTP(della Cioppa等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:6873-7)的掺入将异源EPSPS蛋白序列靶向至转基因植物中的叶绿体。也可以将麦草畏单加氧酶(Dicamba monooxygenase,DMO)靶向至叶绿体，如记载于国际PCT公开文本No.WO 2008/105890的。
可以任选地与感兴趣的基因可操作连接的其它遗传元件还包括位于启动子序列和功能为翻译前导序列的编码序列间的5’UTR。翻译前导序列存在于在翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响前转录物(primary transcript)加工成mRNA、mRNA稳定、和/或翻译效率。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导物(美国专利No.5,362,865)、植物病毒壳体蛋白前导物、植物rubisco前导物等。见例如Turner和Foster(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5’UTR的非限制性例子包括GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利No.5,362,865)；AtAntl；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GenBank登录号V00087；和Bevan等(1983)Nature 304:184-7)。
可以任选地与感兴趣的基因可操作连接的其它遗传元件还包括3’非翻译序列、3’转录终止区、或多腺苷酸化区。这些是位于多核苷酸分子下游的遗传元件，并且包括提供多腺苷酸化信号的多核苷酸、和/或能够影响转录、mRNA加工、或基因表达的其它调节信号。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能以引起多腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前体的3’端。多腺苷酸化序列可以源自天然基因、多种植物基因、或T-DNA基因。3’转录终止区的非限制性例子是胭脂氨酸合成酶3’区(nos 3’;Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)。在Ingelbrecht等,(1989)植物细胞1:671-80中提供使用不同3’非翻译区的例子。多腺苷酸化信号的非限制性例子包括来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2E9;Coruzzi等(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(GenBank登录号E01312)的。
植物转化
可以使用用于将转基因导入植物中的本领域中已知的任何技术来生成依照本发明的转化植物。认为适合于转化植物的方法实质上包括可以将DNA导入细胞中的任何方法，诸如：通过电穿孔，如美国专利No.5,384,253中例示的；通过微粒轰击，如美国专利No.5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865中例示的；通过土壤杆菌属介导的转化，如美国专利No.5,635,055,5,824,877,5,591,616;5,981,840和6,384,301中例示的；及通过原生质体转化，如美国专利No.5,508,184中列出的，等等。经由应用诸如这些技术，可以将实际上任何植物物种的细胞稳定转化，并且可以通过本领域技术人员已知的技术将这些细胞开发成转基因植物。可以在棉转化背景中特别有用的技术披露于美国专利No.5,846,797,5,159,135,5,004,863和6,624,344；特别地，用于转化芸苔属(Brassica)植物的技术披露于例如美国专利No.5,750,871；用于转化大豆的技术披露于例如美国专利No.6,384,301；并且用于转化玉米的技术披露于例如美国专利No.7,060,876、美国专利No.5,591,616和国际PCT公开文本WO 95/06722。
在实现外源DNA对接受细胞的投递后，一般地，下一步关注鉴定经转化的细胞以进一步培养和植物再生。为了改善鉴定转化体的能力，可以期望与用于生成转化体的转化载体一起采用选择或筛选标志基因。在此情况中，可以通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来测定潜在转化细胞群体，或者可以对细胞筛选期望的标志基因性状。
可以将幸免于对选择剂暴露的细胞，或在筛选测定法中得分为正的细胞在支持植物再生的培养基中培养。在一些实施方案中，可以通过包含其它物质，诸如生长调节物修饰任何合适的植物组织培养基(例如，MS和N6培养基)。可以将组织在具有生长调节物的基础培养基上维持，直至足够的组织可用于开始植物再生努力，或者在手工选择的重复轮次后，直至组织的形态学适合于再生(例如，至少2周)，然后转移至进行枝条形成的培养基。周期性转移培养物，直至已经发生足够的枝条形成。一旦形成枝条，便将它们转移至进行根形成的培养基。一旦形成足够的根，可以将植物转移至土壤以进一步生长和成熟。
为了确认感兴趣的基因(例如，转基因)在再生植物中的存在，可以实施多种测定法。此类测定法包括例如：分子生物学测定法，诸如Southern和Northern印迹和PCR；生物化学测定法，诸如检测蛋白质产物的存在，例如，通过免疫学手段(ELISA和/或Western印迹)或者通过酶功能；植物部分测定法，诸如叶或根测定法；和分析再生的全植物的表型。
转基因植物的培养和使用
依照本发明的展现出核酸切除的植物可以具有一种或多种期望的性状，诸如两种或更多种期望的性状。此类性状可以包括例如：对昆虫和其它有害物和引起疾病的媒介物的抗性；对除草剂的耐受性；增强的稳定性、产量、或货架期；环境耐受性；药物生成；工业产品生成；和营养增强。期望的性状可以由侧翼有由展现出期望性状的植物中表达的ZFN识别的核酸序列的基因赋予，使得ZFN在植物中的表达经由限制其根本的基因降低或消除性状转送至其它植物或植物的后续世代。如此，在一个实施方案中，期望的性状可以是由于植物中存在转基因所致，所述转基因侧翼可以有ZFN识别序列。在又一个实施方案中，可以经由常规育种获得期望的性状，该性状可以由侧翼有ZFN识别序列的一种或多种基因赋予。
依照本发明的展现出核酸切除的植物可以是能够用本发明的核酸分子转化的任何植物。因而，植物可以是双子叶植物或单子叶植物。在本方法中可用的双子叶植物的非限制性例子包括苜蓿、豆、花茎甘蓝(broccoli)、甘蓝(cabbage)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、白菜(Chinese cabbage)、棉、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜(melon)、豌豆、胡椒、花生、马铃薯、南瓜、萝卜、油菜籽、菠菜、大豆、南瓜、甜菜、向日葵、烟草、番茄和西瓜。本方法中可用的单子叶植物的非限制性例子包括玉米、洋葱、稻、高粱、小麦、黑麦、黍(millet)、甘蔗、燕麦、黑小麦、柳枝稷和草地草(turfgrass)。
可以以任何方式使用或栽培依照本发明的展现出核酸切除的植物，其中切除的核酸序列对其它植物的转送是不想要的。因而，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将已经工程化改造为具有一种或多种期望的性状等的GM植物用依照本发明的核酸分子转化，种植并栽培。
实施例
包括以下实施例以例示本发明的实施方案。本领域技术人员应当领会，实施例中公开的技术代表发明人发现的在实施本发明中运行良好的技术。然而，根据本公开内容，本领域技术人员可以领会可以在不偏离本发明范围的前提下对公开的具体实施方案做出许多变化，并且仍获得相似或类似的结果。更具体地，会显而易见的是，可以用化学和生理学相关的某些药剂本文中描述的药剂，同时会实现相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有此类相似替代和修改视为在本发明的范围内，如所附权利要求书限定的。
实施例I：质粒设计和构建。
设计并构建含有侧翼有锌指结合位点的靶报告基因表达盒的靶构建体(pDAS5380)和含有锌指核酸酶基因表达盒的切除构建体(pDAS5381)。构建体设计为分开转化入烟草中。通过杂交两种烟草系实施靶报告基因切除，其中功能性锌指核酸酶识别在靶报告基因盒侧翼的锌指结合位点，并且切割基因组DNA。将含有靶报告基因构建体的植物系与含有切除构建体的植物系杂交导致自植物基因组除去/删除报告基因。
靶构建体pDAS5380的构建和设计
构建pDAS5380(图1)作为二元质粒载体。此构建体含有下列植物转录单元(PTU)表达盒和遗传元件：RB7-MAR((基质附着区(Thompson等(1997)WO9727207))::CCR5结合位点重复4x(Perez等(2008)Nat.Biotechnol.26:808-16)::AtuORF1 3’UTR(根癌土壤杆菌读码框1,3’非翻译区(Huang等(1990)J.Bacteriol.172:1814-22))/GUS(β-D-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson(1989)Nature 342:837-8))/AtUbi10(拟南芥泛素10启动子(Callis等(1990)J.Biol.Chem.265:12486-93))::CCR5结合位点重复4x::AtAct2(拟南芥肌动蛋白2启动子(An等(1996)Plant J.10:107-21))/Turbo GFP(turbo绿色荧光蛋白(Evdokimov等(2006)EMBO Rep.7(10):1006-12))/Atu ORF23 3’UTR(根癌土壤杆菌读码框23,3’非翻译区(Gelvin等(1987)EP222493))::AtUbi10/PAT(草胺膦乙酰基转移酶(Wohlleben等(1988)Gene 70:25-37))/Atu ORF1 3’UTR。将GUS PTU表达盒与GFP和PAT PTU表达盒以反式放置。另外，GUSPTU表达盒侧翼有CCR5锌指核酸酶结合位点。此序列(SEQ ID NO:1)直接在GUS PTU表达盒的上游和下游重复4x。锌指结合位点的位置在图1中鉴定为“CCR5结合位点”。由切除物(excisor)构建体pDAS5381编码的锌指核酸酶蛋白识别并结合这些位点。使用标准分子生物学技术完成此二元载体的装配。经由限制酶消化和DNA测序确认最终的质粒。
切除物构建体pDAS5381的构建和设计。
设计并构建含有特异性设计为结合CCR5结合位点(SEQ ID NO:2)的锌指核酸酶基因的二元质粒，如记载于Perez等,(2008)Nature Biotechnol.26:808-16的。pDAS5381(图2)含有下列PTU表达盒：CsVMV(木薯叶脉花叶病毒启动子(Verdaguer等(1996)Plant Mol.Biol.31:1129-39))/CCR5锌指核酸酶编码区(含有：不透明2核定位序列(Maddaloni等(1989)Nucleic AcidsRes.17(18):7532)；r162y11锌指结合域；FokI核酸酶域(Looney等(1989)Gene80:193-208)；源自Thesoa assigna病毒的T2A stutter序列(Mattion等(1996)J.Virol.70:8124-7)；第二不透明2核定位序列；168FA vE锌指结合域；和第二FokI核酸酶域/Atu ORF23 3’UTR::AtUbi3启动子(拟南芥泛素3启动子(Callis等(1995)Genetics 139(2):921-39))/HPTII(潮霉素磷酸转移酶II(Gritz等(1983)Gene 25(2-3):179-88))/Atu ORF24 3’UTR(根癌土壤杆菌读码框24,3’非翻译区(Gelvin等(1987)EP222493))。使用标准分子生物学技术完成此二元载体的装配。经由限制酶消化和DNA测序确认最终的质粒。
实施例II：土壤杆菌属介导的植物转化。
用pDAS5380和pDAS5381转化土壤杆菌属。
电感受态根癌土壤杆菌(菌株LBA4404)细胞获自Invitrogen(Carlsbad,CA)，并使用自Weigel和Glazebrook(2002)“How to Transform Arabidopsis,”于Arabidopsis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,U.S.A改编的电穿孔方法转化。将经转化的菌落在含有壮观霉素(50μg/mL)和链霉素(125μg/mL)的酵母提取物蛋白胨培养基(YEP)上获得，并经由限制酶消化确认。将展现出正确的限制酶显带样式的克隆于-80°C作为甘油储液贮存。
土壤杆菌属介导的烟草(Nicotiana tabacum)转化。
使用含有pDAS5381和pDAS5380的根癌土壤杆菌(菌株LBA4404)转化烟草(Petit Havana栽培种)叶盘(leaf disc)。将含有这些质粒的土壤杆菌属的单一菌落接种入4mL含有壮观霉素(50μg/mL)和链霉素(125μg/mL)的YEP中，并于28°C在摇动器上以190rpm温育过夜。随后，使用4mL种子培养物接种在125mL带挡板的锥形瓶中培养的含有壮观霉素(50μg/mL)和链霉素(125μg/mL)的YEP培养基的25mL培养物。将此培养物于28°C在以190rpm摇动的情况中温育，直至它达到OD600为约1.2。将10mL土壤杆菌属悬浮液放入无菌60x20mm培养皿中。
将自在具有PhytaTraysTM(Sigma,St.Louis,MO)中的30g/L蔗糖的MS培养基(Phytotechnology Labs,Shawnee Mission,KS,#M524)上无菌培养的植物切出的25个新鲜切出的叶盘(0.5cm2)在10mL土壤杆菌属的过夜培养物中浸泡几分钟，在无菌滤纸上干印迹，然后放到具有添加的1mg/L吲哚乙酸和1mg/L苄氨基腺嘌呤的相同培养基上。在共培养48小时后，将与含有pDAS5380的土壤杆菌共培养的叶盘转移至具有5mg/L和250mg/L头孢噻肟的相同培养基上。将与含有pDAS5381的土壤杆菌共培养的叶盘转移至具有10mg/L潮霉素和250mg/L头孢噻肟的相同培养基上。在3周后，将各个T0小植物转移至具有10mg/L和250mg/L头孢噻肟(对于pDAS5380)，或具有10mg/L潮霉素和250mg/L头孢噻肟(对于pDAS5381)的MS培养基，再3周后，移植到土壤，并转移至温室。
拷贝数、全长PTU和对T0植物的表达分析。
拷贝数测定法。
实施和水解探针测定法以筛选抗性植物的样品，从而鉴定那些含有pDAS5380和pDAS5381中T-DNA的单拷贝整合的。使用对基因表达盒特异性的引物和探针进行详细分析。鉴定单一拷贝事件以进行别的分析。
将组织样品在96孔板中收集，并且冻干2天。用KlecoTM组织粉碎机和钨珠(Visalia,CA)实施组织浸渍。在组织浸渍后，使用DNeasy 96植物试剂盒TM(Qiagen,Germantown,MD)依照制造商提示的方案以高通量形式分离基因组DNA。通过Quant-IT Pico Green DNA测定试剂盒TM(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)量化基因组DNA。使用Biorobot3000TM自动化液体处理器(Qiagen,Germantown,MD)将量化的基因组DNA调节至9ng/μL(对于测定法)或5ng/μL(对于水解探针测定法)。
Hologic(Madison,WI)开发出定制的测定法以在烟草中进行PAT基因分析。首先，通过于95°C温育10分钟将基因组DNA样品(于9ng/μL为7.5μL)在96孔板形式中变性，然后在冰上冷却。接着，将7.5μL Master混合物(3μL针对pat和内部参照基因(苯丙氨酸铵裂合酶(palA)；GenBank ID:AB008199)的探针混合物、3.5μLXI FRET混合物、和1μLXI Enzyme/MgCl2溶液)添加至每孔，并用矿物油覆盖样品。将板密封，并于63°C在BioRad热循环仪中温育1小时。将板冷却至周围温度，之后在荧光读板仪上阅读。所有板都含有1个拷贝、2个拷贝和4个拷贝的标准品及野生型对照样品和不含样品的空白孔。对FAM(λ485-528nm)和RED(λ560-620nm)通道两者收集读数，并通过这些，通过用样品原始信号(raw signal)除以无模板原始信号对每份样品测定每个通道的相对于零(即，背景)的倍增(fold over zero)。通过此数据，构建标准曲线，并通过线性回归分析确定最佳拟合。使用自此拟合鉴定的参数，然后，对每份样品评估表观pat拷贝数。
使用480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)通过实时PCR实施通过与测定法类似的水解探针测定法进行的转基因拷贝测定。使用探针设计软件2.0对HPTII、PAT和内部参照基因苯丙氨酸铵裂合酶(palA)设计测定法。对于扩增，在含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针(表1)的10μL体积多重反应中以1x终浓度制备480探针Master混合物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)。在荧光采集的情况中实施两步扩增反应，其中于58°C延伸38秒。将所有样品一式三份运行，并使用平均循环阈值(Ct)数值来分析每份样品。使用软件第1.5版使用相对定量模块实施对实时PCR数据的分析，并且其基于ΔΔCt方法。对于这点，来自单拷贝校准物和已知的2个拷贝检验(check)的基因组DNA的样品包含在每次运行(与用于上述测定法的那些运行相同)中。
表1：关于PAT、HPTII和内部参照(palA)的水解探针测定法的引物和探针信息。
经由Southern印迹分析的全长PTU测定法。
使用Southern印迹分析建立插入DNA片段的整合样式，并鉴定含有全长PTU的pDAS5380和pDAS5381事件。产生数据以表明插入烟草基因组中的转基因的整合和完整性。使用Southern印迹数据鉴定来自pDAS5380和pDAS5381的T-DNA的完整拷贝的简单整合。使用对基因表达盒特异性的探针进行详细的Southern印迹分析。这些探针与已经用特定限制酶消化的基因组DNA的杂交鉴定出某些分子量的基因组DNA片段，其样式可以进行分析以鉴定推进到T1的事件。这些分析还显示已经在未重排PTU的情况中将质粒片段插入烟草基因组DNA中。
将组织样品在50mL圆锥管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中收集，并且冻干2天。用油漆混合器(paint mixer)组织粉碎机和钨珠实施组织浸渍。在组织浸渍后，使用DNeasyTM植物Maxi试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)依照制造商提示的方案分离基因组DNA。将纯化的基因组DNA沉淀，并在500μL TE缓冲液中重悬。使用Qiagen基因组TipsTM试剂盒进一步纯化基因组DNA。通过Quant-IT Pico GreenTM DNA测定试剂盒(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)量化基因组DNA。将量化的基因组DNA以一致的体积调节至8μg。
对于每份样品，用限制酶MfeI和NsiI(New England Biolabs,Beverley,MA)彻底消化8μg基因组DNA。将样品于37°C温育过夜。通过用快速沉淀溶液(Quick Precipitation Solution)TM(Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)依照制造商提示的方案的沉淀浓缩消化的DNA。然后，将基因组DNA在25μL水中于65°C重悬1小时。将重悬的样品加载到在1x TAE中制备的0.8%琼脂糖凝胶上，并以1.1V/cm在1x TAE缓冲液中电泳过夜。将凝胶连续序贯变性(0.2MNaOH/0.6M NaCl)30分钟和中和(0.5M Tris HCl(pH 7.5)/1.5M NaCl)30分钟。
通过使用层析纸芯和纸巾将20x SSC溶液过夜通过凝胶被动芯吸到经处理的ImmobilonTM NY+转移膜(Millipore,Billerica,MA)上来实施DNA片段的转移。转移后，将膜用2x SSC短暂清洗，与StratalinkerTM 1800(Stratagene,LaJolla,CA)交联，并于80°C真空烘焙3小时。
使用400型杂交培养箱(Robbins Scientific,Sunnyvale,CA)将印迹于65°C在玻璃滚瓶中与预杂交溶液(Perfect Hyb plusTM,Sigma,St.Louis,MO)一起温育1小时。自含有整个编码序列的PCR片段制备探针。将PCR扩增子使用QIAEX IITM凝胶提取试剂盒纯化，并经由随机RT Prime ITTM标记试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)用α32P-dCTP标记。将印迹于65°C与对杂交缓冲液直接添加的变性探针杂交过夜至每mL每个印迹约200万次计数。杂交后，将印迹于65°C用0.1x SSC/0.1%SDS序贯清洗40分钟。最终，将印迹暴露于化学发光膜(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)，并使用Molecular Dynamics Storm860TM成像系统成像。
图3和4中标示基于pDAS5380或pDAS5381片段的已知限制酶位点的在特定消化和探针情况中预期的和观察到的片段大小。使用此研究中完成的Southern印迹分析鉴定如下事件，其含有插入烟草基因组中的来自质粒pDAS5380或pDAS5381的全长完整PTU(分别是图3和4)。
GUS表达测定法。
为了测试pDAS5380转基因植物是否含有功能性GUS PTU表达盒，将叶样品收获，并在GUS表达方面组织化学染色。将叶盘(约0.25cm2)切出，并在含有250μL GUS测定溶液(Jefferson(1989)Nature 342:837-8)的24孔盘(每孔1个叶盘)中放置。将24孔盘用(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)包裹，并于37°C温育24小时。在24小时后，自每孔除去GUS测定溶液，并用250μL100%乙醇更换。将该盘用包裹，并于室温温育2-3小时。将乙醇除去，并用新鲜乙醇替换。然后，在解剖显微镜下观察叶盘。将染色为蓝色的叶盘评分为含有功能性GUS PTU表达盒。
GFP表达测定法。
使用ELISA对烟草叶样品分析GFP表达。用纯化的兔抗GFP抗体将板于4°C包被过夜。分析当天，将板用PBST中的0.5%BSA封闭。通过在KlecoTM组织研磨机(grinder)中用2个不锈钢珠以最大速度用珠打击冷冻的叶块达3分钟来提取重复的叶样品。将样品以3000rcf离心10分钟，并收集上清液。将提取样品以1:5和1:50稀释加载到ELISA板上。将大肠杆菌(E.coli)重组GFP标准曲线以12.5ng/mL至0.195ng/mL的浓度在每块板上运行。将标准品和样品在ELISA板上温育1小时。将板清洗，并添加辣根过氧化物酶缀合的兔抗GFP抗体。1小时温育后，将板清洗，并添加底物。容许显色，之后用H2SO4停止反应。在读板仪上于450nm用650nm参照滤器阅读吸光度。通过相对于OD拟合大肠杆菌标准品的浓度产生二次标准曲线。通过线性回归测定未知样品的浓度。
选择T
0
植物以进行靶T1生成。
再生总共68个抗性GUS+/GFP+植物，并且基于PAT测定法，发现38个植物具有1-2个转基因拷贝。Southern分析鉴定出14个单拷贝事件，其中8个展现出与完整的PAT、GUS和GFP PTU一致的条带。将展示单拷贝全长PTU并表达GUS和GFP的三个pDAS5380事件，即pDAS5380-3、pDAS5380-18和pDAS5380-46自花传粉以生成T1种子。
FokI表达测定法。
使用定量实时PCR(qRT-PCR)量化用pDAS5381转化的T0烟草植物中锌指核酸酶的mRNA表达。开发测定法以通过相对于来自输入mRNA的mRNA表达标准化这些水平量化来自烟草叶样品的相对FokI mRNA表达。相对于总mRNA标准化FokI mRNA容许比较不同样品间的FokI表达，并且可以用于鉴定表现为高度表达的事件。表1.1中列出了相对ZFN表达。
表1.1：量化用pDAS5381转化的T0烟草植物中锌指核酸酶的mRNA表达。*相对于总RNA标准化的Fok1mRNA的qRT-PCR。4份重复样品的均值。
| T0事件 | 相对ZFN表达* | 标准差 | %CV |
| pDAS5381-14 | 3.21 | 1.56 | 36.0 |
| pDAS5381-18 | 41.30 | 1.56 | 3.8 |
| pDAS5381-30 | 8.39 | 0.86 | 10.3 |
| pDAS5381-39 | 17.70 | 1.92 | 10.8 |
| pDAS5381-49 | 47.55 | 1.79 | 3.8 |
| pDAS5381-54 | 4.45 | 0.57 | 12.8 |
| pDAS5381-56 | 11.73 | 2.5 | 21.3 |
将来自已经用pDAS5381转化的T0烟草植物的叶材料收集，并在冰上放置。使用Qiagen的植物微型试剂盒(Plant Mini kit)(Qiagen,Germantown,MD)分离总RNA。用无RNA酶的DNA酶按制造商的推荐处理总mRNA以除去可能在定量RT-PCR期间扩增的任何污染性DNA。依照Superscript IIITM逆转录酶酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)制造商的用法说明书建立第一条链合成，并使用随机六聚体引发。将合成的cDNA链在水中以1:10和1:50的比率稀释。将每份等分试样于20°C贮存。
如下完成qRT-PCR反应：15μL反应中的正向引物Fok1 UPL F(SEQ IDNO:12)、反向引物Fok1UPL R(SEQ ID NO:13)、探针UPL#130(产品目录编号04693663001,Roche,Indianapolis,IN)、1x LC480探针Master缓冲液(RocheDiagnostic,Indianapolis,IN)、和1.5μL合成的cDNA。将合成的cDNA的连续稀释液生成并重复测定。使用480探针Master试剂盒#04707494001(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)扩增混合物。将96孔微量板划分并标记，每孔添加13.5μL Master混合物。将密封箔温和附着于微量板。将板以3,000rpm在Qiagen微量板离心机中离心1分钟。除去密封箔，并添加1.5μL融化的、稀释的合成的cDNA链。将箔封条稳固地附于板并离心，如先前所描述的。如下运行PCR程序：i)95°C活化5分钟；ii)95°C变性10秒(以4.8°C/秒)；iii)60°C退火/延伸25秒(以2.5°C/秒)；iv)72°C获得1秒(以4.8°C/秒)；将步骤ii-iv再重复45次；vi)冷却至38°C达5秒。
完成用于量化内部参照基因的mRNA表达的qRT-PCR测定法作为另一种标准化锌指核酸酶mRNA表达的方法。如下完成肌动蛋白qRT-PCR反应：10μL反应中的正向引物BY2ACT89S(SEQ ID NO:14)、反向引物BY2ACT89A(SEQ ID NO:15)、探针BYACTFQ(SEQ ID NO:18)、1x LC480探针Master缓冲液、和2.0μL合成的cDNA。将合成的cDNA的连续稀释液生成并重复测定。另外，将2μL质粒DNA拷贝数标准品以最低至最高浓度的稀释系列添加至不同孔，并且比较这些标准品与肌动蛋白cDNA(自总mRNA合成)以量化拷贝数。通过将靶扩增子克隆入pCR2.1质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并生成在稀释缓冲液(10mM Tris HCl[pH 8.0],100μg/mL酵母tRNA)中制备的稀释系列生成肌动蛋白DNA拷贝数标准品系列，用于量化拷贝数。使用480探针Master试剂盒#04707494001(Roche Diagnostics,USA)扩增混合物。将96孔微量板划分并标记，每孔添加8.0μL Master混合物。将密封箔温和附着于微量板。将板以3,000rpm在Qiagen微量板离心机中离心1分钟。除去密封箔，并添加2.0μL融化的、稀释的合成的cDNA链或质粒DNA。将箔封条稳固地附于板并离心，如先前所描述的。如下运行PCR程序：i)95°C活化10分钟；ii)95°C变性10秒(以4.8°C/秒)；iii)56°C退火/延伸40秒(以2.5°C/秒)；iv)72°C获得1秒(以4.8°C/秒)；将步骤ii-iv再重复45次；vi)冷却至38°C达5秒。
选择T
0
植物以进行切除物T
1
生成。
再生总共54个潮霉素抗性植物，并且基于水解探针测定法，发现34个植物具有1-2个转基因拷贝。Southern分析鉴定出12个单拷贝事件，其中7个展现出与完整的HPT和ZFN PTU一致的条带。将展现出单拷贝转基因全长PTU并表达Fok1的T0pDAS5381事件，即pDAS5381-18、pDAS5381-49和pDAS5381-56自花传粉以生成T1种子。
实施例III：T1植物的生成和选择。
T
0
植物的自交以生成纯合子T
1
植物。
将下列T0植物事件：pDAS5380-3；pDAS5380-18；pDAS5380-46；pDAS5381-18；pDAS5381-49；和pDAS5381-56种植至成熟，并自花传粉以生成T1种子。萌发后，使用在pDAS5380和pDAS5381构建体方面纯合的T1植物进行转基因删除。依照孟德尔遗传，将pDAS5381纯合子单拷贝T1植物与pDAS5380纯合子单拷贝T1植物的杂交生成含有杂合子单拷贝pDAS5381和pDAS5380构建体两者的F1群体。此杂交的后代含有一个拷贝的GUS报告基因。因此，不表达GUS的F1植物指示已经切除GUS PTU表达盒。
将T0植物在16:8小时光周期下以22-24°C的白天和夜间温度种植。在初生开花茎开始伸长并形成花芽时，用自交袋覆盖整个植物以阻止异型杂交。在移植后约8周收获源自自花传粉的种子。将来自自花传粉的植物的种子收集并播种到土壤中。将所得的T1群体在上文所描述的条件下在温室中种植。
T
1
植物的分子筛选。
接合性测定法。
使用所描述的水解探针方法，见上文(拷贝数测定法)完成量化T1植物的接合性的测定法。实施对实时PCR数据的分析，并通过与拷贝数对照比较测定T1植物中含有的转基因拷贝数目。对此，包括来自先前显示为含有单拷贝校准物的亲本T0植物的基因组DNA的样品。鉴定纯合子pDAS5380和pDAS5381 T1植物。
GUS表达测定法。
重要的是鉴定表达事件以进行杂交实验。使用所描述的方案，见上文(GUS表达测定法)测定pDAS5380 T1植物。测试pDAS5380植物，其自接合性测定法，见上文作为pDAS5380构建体纯合选择。所有植物染色为蓝色。
GFP表达测定法。
使用所描述的方案，见上文(GFP表达测定法)测定pDAS5380 T1植物。测试pDAS5380植物，其自接合性测定法，见上文作为pDAS5380构建体纯合选择。所有测试植物在GFP表达方面呈阳性。
FokI表达测定法。
使用定量实时PCR(qRT-PCR)量化用pDAS5381转化的纯合子pDAS5381T1烟草植物中锌指核酸酶的mRNA表达。使用所描述的方案，见上文(FokI表达测定法)筛选T1植物以确认锌指核酸酶在表达，并且鉴定会生成稳健量的锌指核酸酶以切除GUS PTU表达盒的事件。
T
1
植物的选择。
对T1 pDAS5380事件筛选接合性和GUS和GFP的表达。对T1 pDAS5381事件筛选接合性和Fok1的表达。基于这些结果，选择T1事件以进行杂交。这些事件鉴定为最佳的，因为它们是纯合子的、单拷贝、全长转基因表达事件。另外，保留同胞空pDAS5381植物以用作对照。这些事件不含锌指核酸酶PTU表达盒。转基因由于转基因分离而不被这些T1植物遗传。将选定的事件培养至成熟，并杂交以生成F1植物，从而测试经由锌指核酸酶的转基因切除。下列列出杂交策略。
杂交纯合子T
1
植物以生成F
1
。
将选定的pDAS5380植物与选择pDAS5381植物杂交。另外，进行反交，使得亲本是雄性和雌性两者(表2)。用手杂交植物；将来自成熟雄性亲本的花粉囊(anther)的花粉(pollen)引入成熟雌性亲本的柱头。自其它植物除去准备好杂交的植物以降低无意花粉会使雌性烟草植物受精的可能性。使用镊子将雌性植物去雄(在裂开前除去花粉囊)，之后约15-30分钟，由雄花授粉。通过观察花粉囊和花色选择花进行去雄。最近打开的花在边缘周围是亮粉红色的，并且花粉囊仍然是关闭的。不使用含有打开或部分打开的花粉囊的花。将来自烟草植物茎的多个花去雄并受精。用镊子除去茎上的其它花(例如，已经受精的荚、老花、非常幼龄的芽，等等)以确保仅在枝上形成的荚来自受控制的杂交。用列出进行的杂交、进行多少次杂交、和传粉日期的传粉标签标记枝。使用镊子自雄性植物完全除去来自雄性亲本的花粉囊，并用于使去雄的雌性受精。将裂开的雄性花粉囊擦到粘性接受雌性柱头上，直至柱头被花粉包被。将柱头包被几次以降低可以对雌性柱头传粉的任何无意花粉的机会。将来自受精植物的种子收集并播种到土壤中。将所得的F2后代植物在上文所描述的条件下在温室中培养。
表2：杂交实验矩阵。
实施例IV：对F1植物分析ZFN介导的转基因删除。
GUS测定法。
通过对叶材料组织化学染色对F1植物测试GUS表达。GUS筛选是鉴定已经经历ZFN介导的转基因删除的事件的初步测试。GUS筛选的结果并不意图是决定性的，而是鉴定用于进一步分子分析的植物的指标。使用所描述的方案，见上文(GUS表达测定法)测定F1植物。表3中列出结果。
表3：F1杂种中的GUS表达。
Southern印迹分析。
使用Southern印迹分析提供对锌指核酸酶切除GUS PTU表达盒的分子表征。此数据表明事件亚组中GUS PTU表达盒的切除、事件的另一亚组中GUSPTU表达盒的未切除、和含有切除的和非切除的GUS PTU表达盒两者的嵌合事件亚组。使用对GFP PTU表达盒特异性的探针进行详细的Southern印迹分析。探针与已经用特定限制酶消化的基因组DNA的杂交鉴定特定分子量的DNA片段。可以分析这些样式以鉴定含有切除的GUS PTU表达盒、含有完整的GUS PTU表达盒、或者嵌合的且含有切除的和完整的GUS PTU表达盒两者的事件。
在350μL终体积中在1x缓冲液4和100个单位的NdeI(New EnglandBioLabs,Ipswich,MA)中对10μg每种样品完成限制性消化，过度消化10倍。将样品于37°C温育过夜。依照制造商提示的方案通过用快速沉淀溶液(QuickPrecipitation Solution)TM(Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)再沉淀浓缩消化的DNA。将回收的消化物在30μL 1x上样缓冲液中重悬，并于65°C温育30分钟。将重悬的样品上样到1x TAE(0.8M Tris乙酸[pH 8.0]/0.04mM EDTA)中制备的0.8%琼脂糖凝胶中，并以1.1V/cm在1x TAE缓冲液中电泳过夜。将凝胶序贯进行变性(0.2M NaOH/0.6M NaCl)30分钟，及中和(0.5M Tris HCl[pH7.5]/1.5M NaCl)30分钟。通过使用层析纸芯和纸巾将20x SSC溶液过夜通过凝胶被动芯吸到经处理的ImmobilonTM NY+(Millipore,Billerica,MA)上来实施DNA片段的转移。转移后，将膜用2x SSC短暂清洗，与StratalinkerTM 1800(Stratagene,LaJolla,CA)交联，并于80°C真空烘焙3小时。使用杂交培养箱将印迹于65°C在玻璃滚瓶中与预杂交溶液一起温育1小时。自使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化的含有gfp编码序列的PCR片段制备探针，并使用标记试剂盒用50μCi α32P dCTP标记。将印迹于65°C与对杂交缓冲液直接添加的变性探针杂交过夜至每mL每个印迹约200万次计数。杂交后，将印迹于65°C用0.1xSSC/0.1%SDS序贯清洗40分钟。使用磷成像仪屏暴露印迹，并使用MolecularDynamics Storm 860TM成像系统成像。图5中显示了印迹的结果。
植物转录单元PCR分析。
实施PCR反应以表征GUS PTU表达盒的切除。设计引物，其结合MAR序列和ORF 233’UTR序列(对于GFP PTU表达盒为3’UTR)。此PCR扩增子跨越预期有待切除的GUS PTU表达盒区。因此，这些PCR引物的使用可以检测切除GUS PTU表达盒的事件、不发生切除的事件、和在事件内没有一致除去GUS PTU表达盒的嵌合事件。6.7kb片段的扩增指示没有切除，而2.4kb片段的扩增提示已经切除GUS PTU表达盒。含有这两个大小的片段的扩增子指示不完全除去GUS PTU表达盒。
使用DNeasyTM植物Maxi试剂盒自烟草叶组织分离基因组DNA，并使用Quant-ITTM Pico Green DNA测定试剂盒量化，如所描述的，见上文。使用Tetrad2TM热循环仪(BioRad,Hercules,CA)实施植物转录单元PCR(PTUPCR)。使用VectorNTITM软件将寡核苷酸引物设计为扩增PTU。对于扩增，在使用4ng gDNA模板的含有1.2μM每种引物(SEQ ID NO:16和17)、0.2mMdNTP、2%DMSO、1.25个单位的TAQ的25μL体积一重反应中以1x终浓度准备好Ex Taq聚合酶TM(TaKara,Otsu,Shiga,Japan)。如下实施三步扩增反应：于94°C的3分钟初始变性和94°C持续30秒、65.5°C持续6分钟、72°C持续30秒的33个循环，于72°C最终延伸10分钟。使用1Kb+标志物(Invitrogen,Carlsbad,CA)在具有溴化乙啶的1%凝胶上运行PCR产物的等分式样以测定产物大小。图6中显示了PTU PCR反应的结果。
PTU PCR产物的测序。
自凝胶切出来自PTU PCR的2.4kb条带，并使用Qiagen Qiaex IITM凝胶提取试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)纯化DNA。将纯化的片段连接入pCR2.1TOPO TATM克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。经由限制酶消化确认pCR2.1载体内克隆的PCR扩增子的存在。将含有扩增条带的克隆测序。图7a和7b中列出了源自除去GUS PTU表达盒的连接的序列。除去整个PTU表达盒。仅剩余的序列是重排的锌指结合位点，其在GUS PTU表达盒侧翼。另外，几种PCR扩增子含有延伸到GFP PTU表达盒的肌动蛋白2启动子中的删除。
对6.7kb条带的限制酶分析。
经由限制酶消化分析较大的6.7kb条带的PCR扩增子。用EcoRI，并用NcoI/SacI限制酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)消化这些片段。分析所得条带的大小以确认扩增的片段跨越非切除的pDAS5380转基因基因组插入物。
F
1
植物的自花受精以生成F
2
后代。
将上文所描述的代表组的F1植物自花受精以生成F2后代。表5列出了选择的植物及其F1表型和基因型。将选定的F1植物在温室中在16:8小时光周期下在22-24°C的白天和夜间温度的情况中种植。在初生开花茎开始伸长并形成花芽时，用自交袋覆盖整个植物以阻止异型杂交。在移植后约8周收获源自自花传粉的种子。将来自自花传粉的植物的种子收集并播种到土壤中。将所得的F2群体在上文所描述的条件下在温室中种植。分析F2植物以进一步转基因删除和删除的遗传力，其已经在F1植物内表征。
实施例V：T1植物的生成和选择。
对F2后代分析转基因和删除的遗传力。
GUS分析。
通过对叶材料组织化学染色对F2植物测试GUS表达。使用所描述的方案，见上文(GUS表达测定法)测定植物。表5中列出了结果。来自F2植物的GUS表达数据如预期的。鉴定为含有切除的GUS PTU表达盒的F1植物生成100%GUS阴性的F2植物，如通过免疫组织染色确认的。这些F2植物内GUS表达的缺乏确认F1数据，其提示了经由锌指核酸酶介导的转基因删除切除GUS PTU表达盒。此外，此数据例示删除的转基因进入后续世代的遗传力。
同胞空对照植物在约75%的F2世代中表达GUS。经由组织化学染色检测不到GUS的剩余植物(约25%)是预期的。GUS PTU表达盒在F2群体内以预期的3:1比率分离。F1中含有切除的和非切除的GUS PTU表达盒两者的嵌合事件在F2内分离。大多数植物表达GUS。
表5：F2后代中的GUS表达。
绿色荧光蛋白ELISA分析。
使用所描述的方案，见上文(GFP表达测定法)通过ELISA对选定的F2植物测试GFP表达。来自F2植物的GFP表达数据如预期的。F1植物在约75%的F2世代中表达GFP。预期如下的剩余植物(约25%)，其中经由ELISA检测不到GFP。预期GFP PTU表达盒以预期的3:1比率在F2世代内分离。在F1中含有切除的和非切除的GFP PTU表达盒两者的嵌合事件在F2内分离。大多数植物表达GFP。
对F2后代的PCR、Southern印迹和GFP分析。
保持来自表5中所列的三种杂交的16个植物(代表切除的、完整的、和嵌合后代)以供进一步分子分析。这16个植物由同胞空对照和嵌合植物的GUS阳性的8个植物和GUS阴性的8个植物组成。用来自F2植物的基因组DNA重组所描述的方案，见上文(Southern印迹分析；和植物转录单元PCR分析)。使用所描述的方案，见上文(GFP表达测定法)通过ELISA对选定的F2植物测试GFP表达。分子数据确认不表达GUS的植物不含完整的GUS PTU表达盒。GFP表达如预期的那样分离。图8-13中汇总了结果
虽然上文已经讨论了许多例示性的方面和实施方案，但是本领域技术人员应当认可其某些修改、置换、添加和亚组合。因此，意图引入的所附权利要求书和权利要求解读为包括如在其实际精神和范围内的所有此类修改、置换、添加和亚组合。
本文中讨论的参考文献仅提供其在本申请提交日前的公开内容。凭借在先发明，本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格早于所述公开。
Claims (4)
1.一种用于删除植物中的多核苷酸的方法，该方法包括：
提供含有基因组DNA的第一能活植物，所述基因组DNA在5’到3’方向包含用于锌指核酸酶(ZFN)的第一识别序列，感兴趣的基因，和用于ZFN的第二识别序列，其中所述第一识别序列和所述第二识别序列是相同的；
提供第二能活植物，其中第二能活植物包含基因组DNA，所述基因组DNA包含花粉特异性启动子，所述花粉特异性启动子与编码ZFN的核酸可操作地连接，其中编码锌指核酸酶的核酸侧翼有ZFN切割位点；
将所述第一和第二能活植物杂交，使得在所述第一或所述第二能活植物上生成F1种子；并
种植所得转基因F1植物，其中所述感兴趣的基因在所述转基因F1植物的花粉中特异性切除。
2.权利要求1的方法，其中所述感兴趣的基因是天然基因。
3.权利要求1的方法，其中所述感兴趣的基因是选择标志基因表达盒。
4.权利要求1的方法，其中所述第一和第二识别序列侧翼有能相互同源重组的多核苷酸。
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