CN102937651B - 血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，步骤为：（1）采用MEMS工艺制作巨磁阻抗效应传感器；（2）在巨磁阻抗效应传感器上面制作绝缘层三氧化二铝，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀三氧化二铝、去胶，使传感器引脚暴露在外面；（3）溅射Cr/Au薄膜，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使传感器引脚和传感器敏感部分的Au膜暴露在外面；（4）Au膜上生物敏感膜的制备；（5）肿瘤标志物单克隆抗体的固定；（6）抗原点样；（7）生物素化抗体固定；（8）磁性标签固定。本发明将GMI效应传感器用于血清肿瘤标志物检测，检测速度快，易于批量生产，可以满足现有临床应用的需求。

Description

血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法

技术领域

本发明涉及医学检测方法与磁性传感技术领域，具体地，涉及血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法。

背景技术

恶性肿瘤是当今威胁人类健康和生命的主要疾病之一，且发病率有逐年上升的趋势。目前临床主要的肿瘤检测手段包括：

[1]实验室检查：主要包括血、尿、大便的常规检查、生化及免疫检查、病理学检查等。

[2]放射学检查：主要包括X光透视、X光摄片、X光造影检查、CT扫描、核磁共振成像等。

[3]放射性核素检查：即同位素检查，包括功能测定检查、扫描及伽玛照射检查、放射免疫分析等。

[4]超声波检查：包括A型、B型超声波检查。

[5]内窥镜检查：包括各种硬性或光学纤维镜。

在肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。目前常规的影像方法如X线、CT、核磁共振、B超等仅能发现0.5cm以上的肿块，这时部分肿瘤已经处于中晚期，有的肿瘤已经发生了转移，多数病人已经丧失了最佳的治疗时机。血清肿瘤标志物在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效等方面都具有较大的实用价值。血清肿瘤标志物检测已经成为早期发现肿瘤的方法之一，目前已经发展了多种血清肿瘤标志物检测技术并不断地应用于临床如免疫放射分析法、酶标记免疫分析技术、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、液体芯片检测技术等，这些方法各有其优点，如液体芯片一次能检查出多种肿瘤标志物，和多次检测相比降低了成本。但这些方法的不足之处在于缺乏灵活性，单项指标敏感性低、特异性较差。在检测速度、准确率和检测费用方面均存在缺陷，因此利用多学科交叉的优势研制新型肿瘤标志物检测的生物传感器技术显得尤为重要。

生物传感器是利用生物活性材料(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)与物理化学换能器(如电化学、光学、机械、电、磁等)有机结合构成的一种生物信息检测分析工具。由于生物传感器在医疗保健、疾病诊断、食品安全检测等具有广泛的用途，受到了世界各国科学家的深入研究和大力研发；然而仍存在一些因素限制了生物传感器的大规模应用和推广，如传统生物传感器的分析操作步骤太多、分析周期长、价格昂贵、体积大、昂贵的光学检测设备及需要训练有素的专业人员才能完成等。近年来，由于免疫磁珠技术的不断进展和微传感器技术的发展，科学家们提出了将微磁传感器并结合磁性标签研制用于生物学、医学、遗传学、毒物学等生物信息探测的新一代生物传感器。利用微磁传感器并结合磁性标签用于探测生物分子的理念最早是由美国海军实验室的Baselt等[Baselt D.R.,Lee G.U.,Natesan M.,Metzger S.W.,Sheehan P.E.,Colton R.,A biosensor based on magnetoresistance technology,Biosens.Bioelectr.17(1998)731.]于1998年提出的，由此开启了磁生物传感器研究的热潮。目前已报道的用于磁性纳米粒子(磁珠)检测的微磁传感器，主要有电磁感应式传感器、磁阻(AMR)传感器、霍尔传感器、巨磁电阻(GMR)传感器和巨磁阻抗(GMI)传感器等。巨磁阻抗(GMI)效应传感器是一种新型的磁场传感器，其原理是利用交流电流通过磁性材料时其阻抗(Z)随外磁场(H)灵敏变化的这一特征，GMI传感器具有磁场灵敏度高(4－100％/Oe)、功耗少、响应速度快，偏置磁场小等优点，非常适合于磁性纳米粒子的探测，其优势在于：1)GMI传感器具有较高的磁场灵敏度，适合于磁性纳米粒子(或磁珠)的检测；2)传感器的制造技术可与大规模集成电路技术相兼容，易于批量化生产，成本低、价格便宜；3)传感器的信号测评电路可通过CMOS集成电路处理得到，具有体积小、成本低等特点；4)GMI效应的产生不需要很大的驱动磁场。由于GMI效应是唯一的一种利用交流效应做检测的，并与传统的设备和检测手段相兼容，因此在磁场检测与生物医学检测方面展示出广阔的应用前景。

经对现有技术的文献检索发现，Kurlyandskaya等(Kurlyandskaya G.V.,Sanchez M.L.,Hernando B.)在《Appl.Phys.Lett.》(美国应用物理快报)《Vol.82，pp.3053，2003》首次提出使用GMI传感器来探测磁性纳米粒子，并利用CoFeMoSiB非晶带材制备了探测装置，成功实现了对商业液体中磁性纳米粒子以及M-450磁珠的探测。2007年，Kurlyandskaya等(A.Kμmar,S.Mohapatra,V.F.Miyar,A.Cerdeira,J.A.Garcia,H.Srikanth,J.Gass and G.V.Kurlyandskaya)在《Appl.Phys.Lett.》(美国应用物理快报)《Vol.91，pp.143902,2007》报道了利用GMI传感器对吞噬Fe₃O₄纳米粒子的人体胚肾细胞(HEK 293)进行检测，证明了GMI效应在生物医学检测领域的可行性，但该研究工作只是得到了GMI传感器对Fe₃O₄磁性纳米粒子的响应，没有实现对细胞样品的标记和分型检测。

随着微机电系统(MEMS)技术的发展，利用MEMS技术制备的微流控芯片已应用于生物与医学检测领域，而MEMS技术同样可用来制造小型化、集成化的GMI传感器。将生物信息的固定与小型化GMI传感器相结合构建新型血清肿瘤标志物检测系统，利用磁性纳米粒子标签对血清肿瘤标志物进行检测，具有重要的研究意义和临床价值。通过文献和专利检索，没有发现关于将GMI效应传感器用于血清肿瘤标志物检测的相关研究成果。

发明内容

本发明的目的在于针对现有血清肿瘤标志物检测技术的不足以及临床的实际需求，提供一种血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法。

为实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，包括如下步骤：

(1)采用MEMS工艺制作巨磁阻抗效应传感器，该巨磁阻抗效应传感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多层膜构成；

优选地，所述巨磁阻抗效应传感器外形呈曲折形结构，匝数为3-10匝，匝间距离为60μm。Cu膜的宽度小于NiFe薄膜的宽度，NiFe薄膜的宽度为120-160μm、厚度为2-6μm,Cu膜宽度为100-140μm、厚度为2-6μm。

(2)在巨磁阻抗效应传感器上面制作绝缘层三氧化二铝，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀三氧化二铝、去胶，使传感器引脚暴露在外面。

优选地，所述绝缘层三氧化二铝，其厚度为小于1μm。

(3)溅射Cr/Au薄膜，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使传感器引脚和传感器敏感部分的Au膜暴露在外面。

优选地，所述Cr/Au薄膜，其厚度为100-500nm。

(4)Au膜上生物敏感膜的制备：生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成的。

优选地，所述Au膜上生物敏感膜的制备，具体如下：

●Au清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，1M HCI水溶液清洗10分钟，水、无水乙醇各清洗2次，干燥，臭氧紫外杀菌。

●用10-30mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡，室温3小时。无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液(pH＝7.4)清洗样品2-5次，室温干燥。

(5)肿瘤标志物单克隆抗体的固定：将肿瘤标志物单克隆抗体溶液滴入传感器Au膜上面，进行培育；然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封闭，最后用PBS溶液清洗、室温干燥。

优选地，所述肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度在0.5-1mg/ml，用量为一次5-10μl。滴入传感器Au膜上面，然后放入冰箱4℃过夜；或在蒸汽浴37℃下培育30分钟，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)清洗2-5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)2-5次，室温干燥。

(6)抗原点样：将抗原溶液滴入传感器表面，培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥。

优选地，所述抗原点样，具体如下：

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为1-1000ng/ml，用量每次5-10μl，然后滴入传感器表面，室温下22℃培育1小时，或在蒸汽浴37℃下培育40分钟，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(7)生物素化抗体固定：将生物素化抗体溶液滴入传感器表面，室温培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥。

优选地，所述生物素化抗体固定，具体如下：

生物素化抗体浓度为0.5-1mg/ml的PBS溶液，每次取5-10μl，然后滴入传感器表面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS清洗5次，室温下干燥。

(8)磁性标签固定：将磁性标签滴入传感器表面，室温下培育，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

优选地，所述磁性标签固定，具体如下：

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10-100μg/ml磁性纳米粒子或磁珠标签20-40μl，滴入传感器表面，室温下培育20-40分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)磁传感器的制备技术可与半导体的CMOS技术兼容，从而可实现集成磁传感器阵列，成本低、价格便宜，易于批量生产；

(2)磁阻抗变化的信号可通过集成的CMOS电路得到处理，直接将生物信息转换为电信号，可实现即时分析，并具有很高的检测灵敏度；

(3)生物样品本身不带磁性，能提供一个很低噪声的磁测量环境，相对于荧光分子、放射性同位元素、酶等标签，磁性标签非常稳定；

(4)在单一化验中，阵列传感器可实现对多目标分析物的同时检测，具有快速、高灵敏探测的优势。

(5)本发明制备得到的血清肿瘤标志物检测系统具有检测速度快、可重复使用、无特殊环境和存放要求、体积小、灵敏度高等优点；不需要依赖于操作人员的生物学医学经验以及庞杂、昂贵的荧光检测设备，就可实现特定的生化分析或疾病诊断，这将有利于实现便携式、成本低廉、快速诊断的生物医学疾病检测系统。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：

整个制备过程分如下几步：

(1)巨磁阻抗效应传感器(简称GMI传感器)由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多层膜构成，外形呈曲折形结构，匝数为3匝，匝间距离为60μm。Cu膜的宽度小于NiFe薄膜的宽度，NiFe薄膜的宽度为160μm、厚度为6μm,Cu膜宽度为140μm、厚度为6μm。GMI传感器采用MEMS工艺制作，具体制作可以采用现有技术实现，如专利号为ZL200510026607.8中的记载方法，在此不再赘述。

(2)在GMI传感器上面采用溅射工艺制作绝缘层三氧化二铝，其厚度为0.5μm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀三氧化二铝、去胶，使传感器引脚暴露在外面。

(3)溅射Cr/Au薄膜，其厚度为300nm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使传感器的引脚和传感器敏感部分带有Au膜，并暴露在外面。

(4)Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC和NHS混合液活化形成的。具体如下：

●Au膜清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，然后用1M HCI水溶液清洗10分钟，最后用水、无水乙醇各清洗2次，室温干燥，臭氧紫外杀菌。

●用30mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡室温3小时，然后用无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液(pH＝7.4)清洗样品5次，室温干燥。

(5)肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度在0.5mg/ml，用量为一次10μl。滴入传感器Au膜上面，然后放入冰箱4℃过夜，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)溶液清洗5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(6)抗原点样

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为1000ng/ml，用量每次5μl,然后滴入传感器表面，室温下22℃培育1小时，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(7)生物素化抗体的固定

取浓度为0.5mg/ml生物素化抗体溶液，每次取10μl，然后滴入传感器表面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。

(8)磁性标签固定

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子标签20μl,滴入传感器表面，室温下培育20分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

实施例2：

(1)本发明的巨磁阻抗效应传感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多层膜构成，外形呈曲折形结构，匝数为5匝，匝间距离为60μm。Cu膜的宽度小于NiFe薄膜的宽度，NiFe薄膜的宽度为140μm、厚度为4μm,Cu膜宽度为120μm、厚度为4μm。GMI传感器采用MEMS工艺制作，制作详细说明可以参照已申请的专利，专利号为200510026607.8，在此不再赘述。

(2)在GMI传感器上面采用溅射工艺制作绝缘层三氧化二铝，其厚度为0.7μm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀三氧化二铝、去胶，使传感器引脚暴露在外面。

(3)溅射Cr/Au薄膜，其厚度为500nm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使传感器的引脚和传感器敏感部分带有Au膜，并暴露在外面。

(4)Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC和NHS混合液活化形成的。具体如下：

●Au膜清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，然后用1M HCI水溶液清洗10分钟，最后用水、无水乙醇各清洗2次，室温干燥，臭氧紫外杀菌。

●用20mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡室温3小时，然后用无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液清洗样品(pH＝7.4)4次，室温干燥。

(5)肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度在1mg/ml，用量为一次5μl。滴入传感器Au膜上面，然在蒸汽浴37℃下培育30分钟，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)溶液清洗5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(6)抗原点样

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为10ng/ml，用量每次10μl,然后滴入传感器表面，室温下22℃培育1小时，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(7)生物素化抗体的固定

取浓度为1mg/ml生物素化抗体溶液，每次取10μl，然后滴入传感器表面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。

(8)磁性标签固定

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子标签30μl,滴入传感器表面，室温下培育40分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

实施例3：

(1)本发明的巨磁阻抗效应传感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多层膜构成，外形呈曲折形结构，匝数为10匝，匝间距离为60μm。Cu膜的宽度小于NiFe薄膜的宽度，NiFe薄膜的宽度为120μm、厚度为2μm,Cu膜宽度为100μm、厚度为2μm。GMI传感器采用MEMS工艺制作，制作详细说明可以参照已申请的专利，专利号为200510026607.8，在此不再赘述。

(2)在GMI传感器上面采用溅射工艺制作绝缘层三氧化二铝，其厚度为1μm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀三氧化二铝、去胶，使传感器引脚暴露在外面。

(3)溅射Cr/Au薄膜，其厚度为100nm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使传感器的引脚和传感器敏感部分带有Au膜，并暴露在外面。

(4)Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC和NHS混合液活化形成的。具体如下：

●Au膜清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，然后用1M HCI水溶液清洗10分钟，最后用水、无水乙醇各清洗2次，室温干燥，臭氧紫外杀菌。

●用25mM11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液室温修饰3小时，然后用无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液清洗样品(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(5)肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度1mg/ml，用量为一次10μl。滴入传感器Au膜上面，在蒸汽浴37℃下培育30分钟，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)溶液清洗5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(6)抗原点样

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为1ng/ml，用量每次10μl,然后滴入传感器表面，室温下22℃培育1小时，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(7)生物素化抗体的固定

取浓度为1mg/ml生物素化抗体溶液，每次取10μl，然后滴入传感器表面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。

(8)磁性标签固定

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子标签30μl,滴入传感器表面，室温下培育30分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

以上实施例制备得到的一种血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器，该生物传感器由位于玻璃基片上的巨磁阻抗效应传感器、位于巨磁阻抗效应传感器上的绝缘层、位于绝缘层上的Au膜、位于Au膜上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性标签，以及与巨磁阻抗传感器连接的信号采集系统；其中：所述巨磁阻抗效应传感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多层膜构成。该生物传感器检测抗原的原理是采用双抗夹心法。采用自组装膜技术固定单克隆抗体，单克隆抗体与抗原结合，带有链酶亲和素的磁性标签与生物素化的多克隆抗体结合，由于抗原-抗体的免疫反应，磁性标签被标记到传感器的表面上。一旦有极微量的被检测生物分子(抗原)存在时，在外磁场作用下，磁性标签产生的弥散磁场将导致传感器的磁阻抗的变化，这种变化直接转变为电压信号，从而实现对相应生物分子的高灵敏度检测。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，包括如下步骤： 

(1)采用MEMS工艺制作巨磁阻抗效应传感器，该巨磁阻抗效应传感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多层膜构成； 

(2)在巨磁阻抗效应传感器上面制作绝缘层三氧化二铝，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀三氧化二铝、去胶，使传感器引脚暴露在外面； 

(3)溅射Cr/Au薄膜，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使传感器引脚和传感器敏感部分的Au膜暴露在外面； 

(4)Au膜上生物敏感膜的制备：生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成的； 

(5)肿瘤标志物单克隆抗体的固定：将肿瘤标志物单克隆抗体溶液滴入传感器Au膜上面，放入冰箱过夜；然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封闭，最后用PBS溶液清洗、室温干燥； 

(6)抗原点样：将抗原溶液滴入传感器表面，培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥； 

(7)生物素化抗体固定：将生物素化抗体溶液滴入传感器表面，室温培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥； 

(8)磁性标签固定：将磁性标签滴入传感器表面，室温下培育，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。 

2.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(1)中，所述巨磁阻抗效应传感器外形呈曲折形结构，匝数为3-10匝，匝间距离为60μm。 

3.根据权利要求1或2所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(1)中，所述NiFe/Cu/NiFe多层膜，其中Cu膜的宽度小于NiFe薄膜的宽度，NiFe薄膜的宽度为120-160μm、厚度为2-6μm，Cu膜宽度为100-140μm、厚度为2-6μm。 

4.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述绝缘层三氧化二铝，其厚度为小于1μm。 

5.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Cr/Au薄膜，其厚度为100-500μm。 

6.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Au膜上生物敏感膜的制备，具体如下： 

●Au清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，1M HCL水溶液清洗10分钟，水、无水乙醇各清洗2次，干燥，臭氧紫外杀菌； 

●用10-30mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡，室温3小时，无水乙醇清洗2次，N₂气干燥； 

●EDC+NHS活化，用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟； 

●用pH＝7.4的PBS溶液清洗样品2-5次，室温干燥。 

7.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(5)，所述肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下 

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于pH＝7.4的PBS溶液中，浓度在0.5-1mg/ml，用量为一次5-10μl，滴入传感器Au膜上面，然后放入冰箱4℃过夜；或在蒸汽浴37℃下修饰30分钟，然后用PBS溶液清洗2-5次，此处PBS溶液的pH＝7.4且含重量为1％的BSA； 

●封闭，用100μl BSA溶液封闭，冰箱4℃放置2小时，所述BSA溶液含重量为1％的BSA、体积为0.2％的tween 20； 

●用pH＝7.4的PBS溶液清洗2-5次，室温干燥。 

8.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(6)中，所述抗原点样，具体如下： 

抗原用pH＝7.4的PBS溶液稀释，浓度为1-1000ng/ml，用量每次5-10μl，然后滴入传感器表面，室温下22℃培育1小时，或在蒸汽浴37℃下培育40分钟，然后用含有重量为1％的BSA、体积为0.2％的tween 20的PBS溶液清洗2次，室温下干燥。 

9.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(7)中，所述生物素化抗体固定，具体如下： 

生物素化抗体浓度为0.5-1mg/ml的PBS溶液，每次取5-10μl，然后滴入传感器表面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。 

10.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的巨磁阻抗效应生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(8)中，所述磁性标签固定，具体如下： 

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠，取浓度为10-100μg/ml磁性纳米粒子或磁珠标签20-40μl，滴入传感器表面，室温下培育20-40分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。