CN102955031B

CN102955031B - 检测黄曲霉毒素b1药物的酶联免疫试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN102955031B
Application number: CN201110254665.1A
Authority: CN
Inventors: 韩黎; 何方洋; 吴鹏; 万宇平; 韩雪琳; 陈勇; 孙震; 赵正苗; 李勇; 冯才茂; 冯静; 罗晓琴
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2031-08-31
Also published as: CN102955031A

Abstract

本发明提供了一种检测黄曲霉毒素B1药物的酶联免疫试剂盒及其应用，它含有：包被有包被原的酶标板，酶标记物，黄曲霉毒素B1特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)，黄曲霉毒素B1标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液和浓缩复溶液。利用本发明所述试剂盒检测黄曲霉毒素B1包括如下步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测油、花生、谷物等样品中黄曲霉毒素B1的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测黄曲霉毒素B1药物的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1药物的酶联免疫试剂盒及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素B1(结构式见图1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)是一群结构相似，由黄曲霉、寄生曲霉和A.nomius产生的剧毒化合物，黄曲霉毒素可导致癌症，主要是引起肝脏、肠、肺和胸部的病变。这些真菌产生于热带和亚热带的食品、饲料以及他们的原料中，主要污染谷类、米、玉米、豆类、树坚果及花生等，给人类的健康造成严重的威胁，近年进出口商品中均有黄曲霉毒素超标现象，因此黄曲霉毒素已经成为出入境农产品安全卫生检验的重要对象。

欧盟规定用于动物饲料或人类直接食用产品的黄曲霉毒素的最高残留限量为2μg/L。对于儿童食品、婴幼儿加工谷物基础以及婴儿营养食品，最高残留限量设定为0.1μg/L；我国在饲料领域的检测限在4-40μg/L。

黄曲霉毒素B1的检测方法，主要有薄层色谱、高效液相色谱法、等多种检测方法。薄层色谱法是测定黄曲霉毒素的经典方法，也是我国测定食品及饲料中黄曲霉毒素B1的标准方法之一，但是，薄层色谱法样品前处理繁琐，实验过程复杂，所需时间长，准确性差，对实验人员危害较大；高效液相色谱法仪器设备昂贵，技术水平要求较高，样品还需要进行纯化处理，不利于现场筛查，本发明建立了一种高灵敏度，并且能够现场抽样快速筛选检验方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，本发明酶联免疫试剂盒操作简单，耗时少，可用于油、花生、谷物样本中黄曲霉毒素B1药物的快速检测，尤其适合现场大批量样品的筛选检测。

本发明检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，包括包被原和酶标记物，所述包被原选自黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物，黄曲霉毒素B1抗体和抗抗体；当所述包被原为黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为黄曲霉毒素B1抗体时，所述酶标记物为酶标半抗原与载体蛋白的偶联物；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物；所述黄曲霉毒素B1半抗原是将黄曲霉毒素B1和盐酸羟胺缩合反应，再与琥珀酸酐通过缩合反应得到的。

本发明的另外一个目的是提供一种黄曲霉毒素B1抗体和生产制备这种抗体的方法。所述的黄曲霉毒素B1抗体对游离或蛋白等结合黄曲霉毒素B1有结合特异性。所述的黄曲霉毒素B1抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

黄曲霉毒素B1是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答。为了制备特异性抗体，必须首先将其结构改造得到黄曲霉毒素B1半抗原，黄曲霉毒素B1半抗原的合成方法是针对黄曲霉毒素B1分子进行结构改造。黄曲霉毒素B1半抗原是用黄曲霉毒素B1与盐酸羟胺缩合反应，引入一个新的羟基，再与琥珀酸酐反应得到具有羧基的黄曲霉毒素B1半抗原(图2)，该黄曲霉毒素B1半抗原与大分子载体蛋白偶联得到黄曲霉毒素B1完全抗原(免疫原或包被原)，其最终制备的抗体效果在后述发明中可以体现。

前述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原常用载体蛋白。

本发明采用混合酸酐法或碳化二亚胺法将黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，突出了黄曲霉毒素B1的特征结构，增加了黄曲霉毒素B1半抗原的免疫原性。经测定本发明中黄曲霉毒素B1半抗原与牛血清白蛋白的结合摩尔比为14～18∶1，适合于抗体制备。

所述黄曲霉毒素B1特异性抗体可为黄曲霉毒素B1单克隆抗体或黄曲霉毒素B1多克隆抗体；它们均是前述黄曲霉毒素B1免疫原免疫动物制备得到的。

所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体优选为黄曲霉毒素B1鼠单克隆抗体。

所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体优选为杂交瘤细胞株D-2-2CGMCCNo.5130分泌的单克隆抗体。

所述黄曲霉毒素B1单克隆杂交瘤细胞株D-2-2CGMCC No.5130(分类命名：黄曲霉毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株)已于2011年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

所述黄曲霉毒素B1多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述黄曲霉毒素B1多克隆抗体优选为黄曲霉毒素B1兔多克隆抗体。

本发明过程中原材料制备过程：

1.半抗原的合成

黄曲霉毒素B1半抗原合成技术路线如图2。

2.黄曲霉毒素B1抗体的制备

(1)免疫原制备

将黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。

(2)黄曲霉毒素B1鼠单克隆抗体的制备

a)动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，待血清效价大于1∶8000后，取出脾脏进行细胞融合。

b)细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)黄曲霉毒素B1兔多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后，测定血清抗体效价。待效价较高后，处死兔子，采集血清，得到多克隆抗体。

3.抗抗体的制备

(1)羊抗鼠抗抗体是以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；

(2)羊抗兔抗抗体是以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。

4.本发明所提供的黄曲霉毒素B1检测方法及其检测试剂盒可以用于检测油、花生、谷物样品中的黄曲霉毒素B1药物。

所述试剂盒还包括黄曲霉毒素B1标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。

所述黄曲霉毒素B1标准品溶液：6瓶，浓度分别为0，0.05，0.1，0.2，0.6和1.8μg/L。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述浓缩洗涤液为pH值为7.2-7.5、含有0.8-1.2％吐温-20、0.3-0.6‰叠氮化钠，0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。

所述浓缩复溶液为pH7.5-7.8，含有2-4％酪蛋白，0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH值为9.2-9.6、0.1-0.2mol/L的碳酸盐缓冲液，所用封闭液为含有5-8％脱脂奶粉，pH值7.2-7.6、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将黄曲霉毒素B1偶联抗原、抗体或抗抗体稀释成0.15-0.25μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用稀释的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30秒，甩掉孔中液体，以吸水纸吸除残余水分后，向每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封，4℃干燥处保存备用。

5.本发明的检测原理为：

当在酶标板上预包被黄曲霉毒素B1偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入黄曲霉毒素B1特异性抗体溶液，样本中残留的黄曲霉毒素B1药物与酶标板上包被的黄曲霉毒素B1偶联抗原竞争黄曲霉毒素B1特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与黄曲霉毒素B1药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中黄曲霉毒素B1残留量的浓度范围。

当在酶标板上预包被黄曲霉毒素B1特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记黄曲霉毒素B1半抗原溶液，样本中残留的黄曲霉毒素B1药物与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的黄曲霉毒素B1特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与黄曲霉毒素B1药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中黄曲霉毒素B1残留量的浓度范围。

当在酶标板上预包被黄曲霉毒素B1偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记黄曲霉毒素B1特异性抗体溶液，样本中残留的黄曲霉毒素B1药物与酶标板上包被的黄曲霉毒素B1偶联抗原竞争黄曲霉毒素B1特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与黄曲霉毒素B1药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中黄曲霉毒素B1残留量的浓度范围。

当在酶标板上预包被抗抗体时，加入黄曲霉毒素B1抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记黄曲霉毒素B1偶联抗原溶液，样本中残留的黄曲霉毒素B1药物与酶标记黄曲霉毒素B1偶联抗原竞争黄曲霉毒素B1特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与黄曲霉毒素B1药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中黄曲霉毒素B1残留量的浓度范围。

6.本发明还提供了一种检测黄曲霉毒素B1药物的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用前述试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

样品的前处理主要是为了从样品中获得黄曲霉毒素B1溶液，从而用于后续的检测。

本发明中用试剂盒检测时：当包被原为黄曲霉毒素B1偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液，加入酶标二抗，再加入抗体，温育后洗涤后，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为黄曲霉毒素B1偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为黄曲霉毒素B1特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记黄曲霉毒素B1半抗原，温育后洗涤，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为抗抗体时，向酶标板微孔中加入黄曲霉毒素B1抗体，再加入标准品溶液或样品溶液后加入酶标黄曲霉毒素B1半抗原，温育后洗涤，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。

本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

以黄曲霉毒素B1标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中黄曲霉毒素B1的残留量。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

附图说明

图1：黄曲霉毒素B1结构式；

图2：黄曲霉毒素B1半抗原合成技术路线；

图3：试剂盒标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1试剂盒组分的制备

1.抗原的合成

a.半抗原的合成

将黄曲霉毒素B1与盐酸羟胺缩合反应，引入一个新的羟基，再与琥珀酸酐反应得到具有羧基官能团的半抗原。

半抗原的具体步骤：将156mg黄曲霉毒素B1和105mg盐酸羟胺置于5ml吡啶溶液中室温搅拌12-24小时，旋蒸去吡啶和未反应的盐酸羟胺，得到粗产物，将得到的粗产物加入5ml吡啶和100mg琥珀酸酐，60℃反应10-20小时，旋蒸出去吡啶，加入10ml水，乙酸乙酯萃取，蒸干后在乙醇和水混合体系中重结晶，得到黄曲霉毒素B1半抗原。

b.免疫原合成

将黄曲霉毒素B1半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到免疫原。

具体操如下：

称取100mg BSA溶于9.5ml PBS(0.01mol/L，pH5.0)溶液中，称取50mg EDC加入，得到I液；称取半抗原15mg用0.5mlDMF溶解后加入I液，室温搅拌反应1h，再加50mg EDC，暗处搅拌反应并过夜；用0.01mol/LPBS透析3d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

c.包被原黄曲霉毒素B1偶联抗原的制备

将黄曲霉毒素B1半抗原与卵清蛋白偶联得到包被原。

具体操作如下：

取半抗原15mg用1.0mlDMF溶解，取氯甲酸异丁酯15μl加入，10℃搅拌反应30min，即可得到反应液A；称取OVA50mg，使之充分溶解在6.0mL50mmol/L碳酸钠溶液中得B液；将反应液A逐滴缓慢滴加到反应液B中，10℃反应4h，然后4℃过夜；用0.01mol/LPBS透析3d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

2.单克隆抗体的制备

a.动物免疫

选取6-8周龄健康Balb/c小鼠，按照免疫剂量为100μg/只进行免疫。首次免疫时取等量弗氏完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5881)与免疫原均匀混合，后续免疫时与等量弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5506)混合。

b.细胞融合和克隆化

小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按9∶1比例(数量比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经筛选得到黄曲霉毒素B1的单克隆杂交瘤细胞株D-2-2CGMCC No.5130。其分泌的抗体特异性良好(如表1)，灵敏度能达到0.05μg/L。

表1D-2-2CGMCC No.5130分泌单克降抗体特异性测定结果

药物名称	交叉反应率(％)
		黄曲霉毒素B1	100％
黄曲霉毒素B2	193％
		黄曲霉毒素G1	73％
黄曲霉毒素G2	76％

c.细胞冻存和复苏

将黄曲霉毒素B1的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的生产与纯化

取6-8周龄Balb/c小鼠若干只，腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射黄曲霉毒素B1的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁷个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

2.多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以黄曲霉毒素B1半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐(来源同上)混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂(来源同上)混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用辛酸-饱和硫酸铵法纯化得到多克隆抗体。

3.羊抗鼠抗抗体的制备过程：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。

4.酶标板的制备

用包被缓冲液将黄曲霉毒素B1偶联抗原、抗体或抗抗体稀释成0.15-0.25μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用稀释的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30秒，甩掉孔中液体，以吸水纸吸除残余水分后，向每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封，4℃干燥处保存备用。

包被液为为pH值为9.6，0.1mol/L的碳酸盐缓冲液。

封闭液为含有8％脱脂奶粉，pH值7.4、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。

5.酶标记羊抗鼠抗抗体的制备

将抗抗体与辣根过氧化物酶(HR)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反映体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4∶1；由于辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体，为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。

2)降低了辣根过氧化物酶：抗抗体的摩尔浓度比率至2∶1，改良后的方法

比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。

实施例2检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被黄曲霉毒素B1偶联抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)黄曲霉毒素B1单克隆抗体工作液；

(4)黄曲霉毒素B1标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L，0.6μg/L、1.8μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L盐酸；

(7)浓缩洗涤液为pH值为7.4、含有1.0％吐温-20、0.4‰叠氮化钠的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。

(8)浓缩复溶液为pH7.6，含有4％酪蛋白，0.15mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。

实施例3实际样品中黄曲霉毒素B1的检测

样品前处理

(1)油(花生油，调和油，玉米油，豆油等样本)

称取2.0±0.05g食用油样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入4ml甲醇-水溶液，振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；移取2.0ml上层清液至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2.0ml去离子水，再加入6ml三氯甲烷，振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；去除上层液体，取3ml下层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，加入1ml复溶液工作液，用涡旋仪涡动30s，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层正己烷相，取下层水相50μl用于分析。

(2)花生(生花生、熟花生及盐花生等样本)

称取2.0±0.05g花生样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入3.0ml乙腈，再加入3.0ml去离子水，振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；移取3.0ml上层清液至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4.5ml三氯甲烷，振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；去除上层液体，取3ml下层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，加入1ml复溶液工作液，用涡旋仪涡动30s，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层正己烷相，取下层水相50μl用于分析。

(3)谷物(黄豆粉、大米粉、玉米粉、面粉等样本)

称取2.0±0.05g谷物样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入4.0ml乙腈，再加入2.0ml去离子水，振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；移取3.0ml上层清液至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml三氯甲烷，振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；去除上层液体，取4ml下层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，加入1ml复溶液工作液，用涡旋仪涡动30s，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心5min；除去上层正己烷相，取下层水相50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有黄曲霉毒素B1偶联抗原的酶标板微孔中加入黄曲霉毒素B1标准品溶液或样品溶液50μl，随机加入酶标二抗50μl，再加入黄曲霉毒素B1单克隆抗体工作液50μl，用盖板模封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板5次，最后用吸水纸除去残余水分，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液盐酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以黄曲霉毒素B1标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出黄曲霉毒素B1的残留量。

实施例4试剂盒质量的测定

1标准品精密度试验：

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定0.2μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。

表2标准可重复性试验(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各10次标准品变异系数在2.4％-8.1％之间，符合精密度小于或等于25％的规定。

2 样本精密度和准确度试验

a)样品精密度试验：

以0.2μg/L浓度的黄曲霉毒素B1对油、花生、谷物进行添加测定，分别取三个不同批次的试剂盒，每个浓度重复5次进行测定，分别计算变异系数，结果见表3。

表3油样本可重复性试验

表4花生样本可重复性试验

表5谷物样本可重复性试验

结果表明油、花生、谷物样本的变异系数均在7.3％-10.8％之间，符合了《《农业部文件》农医发【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第四点精密度标准。

b)样本准确度试验

取两个浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液分别为0.2μg/kg、0.4μg/kg，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，计算准确度。

表6试剂盒的准确度

结果表明油、花生、谷物样本添加回收率在76.9％-87.9％之间。符合了《农业部文件》农医发【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标准中准确度标准。

3 试剂盒保存实验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、黄曲霉毒素B1添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置12天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃可以保存12个月以上。

Claims

1.一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，包括包被原和酶标记物，所述包被原选自黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物、黄曲霉毒素B1抗体和抗抗体；当所述包被原为黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为黄曲霉毒素B1抗体时，所述酶标记物为酶标半抗原与载体蛋白的偶联物；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物；所述黄曲霉毒素B1半抗原是将黄曲霉毒素B1和盐酸羟胺缩合反应，再与琥珀酸酐通过缩合反应得到的，所述黄曲霉毒素B1抗体为黄曲霉毒素B1单克隆抗体，是以黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备得到的，所述载体蛋白为卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原，所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体由杂交瘤细胞株D-2-2CGMCC No.5130分泌产生。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括黄曲霉毒素B1标准溶液、显色液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、终止液；所述浓缩洗涤液为pH值为7.2-7.5、含有0.8-1.2％吐温-20、0.3-0.6‰叠氮化钠，0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为pH7.5-7.8，含有2-4％酪蛋白，0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1～2mol/L硫酸或盐酸溶液；所述包被缓冲液为pH值为9.2-9.6、0.1-0.2mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有5-8％脱脂奶粉，pH值7.2-7.6、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。

5.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L硫酸或盐酸溶液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色剂为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

6.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下步骤；

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1-5任一项所述的酶联免疫试剂盒检测；

(3)分析检测结果。

7.保藏号为CGMCC No.5130的黄曲霉毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株D-2-2。