CN103096922B - 用于治疗流行性感冒的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所提供的组合物和方法基于包含有与脂质囊泡组合的流感病毒血凝素抗原的特定组合物的开发，所述脂质囊泡包含有非离子型表面活性剂(NISV)和任选的佐剂。在某些实施方案中，即使未储存在标准冷链系统中，所提供的组合物依然保持效力(即，它们是热稳定的)。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年7月6日提交的序列号61/361,898的美国临时专利申请和于2011年1月10日提交的序列号61/431,218的美国临时专利申请的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
流行性感冒是常见的呼吸系统传染病，其与正粘病毒(Orthomyxoviridae)科病毒有关。由于该病毒的高度变异性，通常需要每年用将毒株变异考虑在内的重新配制的疫苗进行疫苗接种。美国每年开发的疫苗的组成由食品和药物管理局疫苗及相关生物制品顾问委员会(the Department of Food and Drug Administration Vaccines and theRelated Biologicals Advisory Committee)确定。类似地，世界卫生组织(WHO)运作一个全球实验室监控网，用于检测新的流感变体(Lavanchy、Vaccine 1999；17：S24(1999))。基于最新分离的流感病毒的抗原性分析、抗原性变体的传播模式和最新接受疫苗接种个体的抗体应答来进行选择。
甲型流感和乙型流感是造成人流行疾病的两种流感病毒。甲型流感病毒基于两种表面抗原(血凝素(HA)和神经氨酸酶(N))而被进一步分成亚型。例如，甲型流感病毒的H1N1亚型具有血凝素1型抗原(H1)和神经氨酸酶1型抗原(N1)，而H3N2亚型具有血凝素3型抗原(H3)和神经氨酸酶2型抗原(N2)。乙型流感病毒未被分为亚型。自1977年以来，甲型流感(H1N1)病毒、甲型流感(H3N2)病毒和乙型流感病毒已经在全球传播。认为接种疫苗是在处于感染流行性感冒和相关并发症严重疾病高风险的人中对流感进行预防和削弱的惟一最有效方法。接种由灭活流感病毒制备的抗原能够刺激产生特异性抗体。保护仅针对制备疫苗的病毒毒株或密切相关的毒株。
每年的疫苗包含了来源于三种病毒毒株的抗原(称作三价疫苗，通常包含有来源于两种甲型毒株的抗原和一种乙型毒株的抗原)，其代表被认为在即将到来的冬天可能流行的流感病毒。当前的以及新出现的流感病毒毒株的抗原性特征为每年疫苗所包含的毒株的选择提供了基础。WHO综评每年的世界疫情并且在必要时根据当前的流行病学证据推荐新的毒株。
尽管流感疫苗成功降低了全世界流感的发生率，但是本领域依然需要稳定并且保持效力的改进的流感疫苗。
发明内容
本公开内容提供了可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所提供的组合物和方法基于包含有与脂质囊泡组合的流感病毒血凝素抗原的特定组合物的开发，所述脂质囊泡包含有非离子型表面活性剂(NISV)和任选的佐剂。在某些实施方案中，即使不储存在标准冷链系统中，所提供的组合物依然保持效力(即，它们是热稳定的)。
在一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的组合物，其中，脂质囊泡由脂质构成，其在组合物中的存在量使得脂质∶抗原的重量比为约50∶1至约400∶1，并且脂质包含有非离子型表面活性剂。在某些实施方案中，所提供的组合物是免疫原性的。
在另一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的免疫原性组合物，其中，脂质囊泡由脂质构成，其在组合物中的存在量使得脂质∶抗原的重量比为至少约50∶1，并且脂质包含有非离子型表面活性剂。
在某些实施方案中，前述组合物是液体。在某些实施方案中，前述组合物是干燥(例如，冻干)的。
在另一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的干燥(例如，冻干)组合物，其中，脂质囊泡由脂质构成，其在组合物中的存在量使得脂质∶抗原的重量比为至少约30∶1，并且脂质包含有非离子型表面活性剂，组合物的水分含量按重量计低于约2％。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为至少约40∶1或50∶1。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计低于约1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或0.4％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.4％至约2％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约1.9％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.6％至约1.8％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.7％至约1.7％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.8％至约1.6％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.9％至约1.5％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1％至约1.4％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约1％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约1.5％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约2％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1％至约1.5％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1％至约2％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1.5％至约2％。
在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为至少约60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1或300∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为至少约400∶1、390∶1、380∶1、370∶1、360∶1、350∶1、340∶1、330∶1、320∶1或310∶1。
在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比在约50∶1至约60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1、390∶1或400∶1的范围内。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比在约50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1或390∶1至约400∶1的范围内。
在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约50∶1至约100∶1、约50∶1至约150∶1、约50∶1至约200∶1、约50∶1至约250∶1、约50∶1至约300∶1、约50∶1至约350∶1或约50∶1至约400∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约100∶1至约150∶1、约100∶1至约200∶1、约100∶1至约250∶1、约100∶1至约300∶1、约100∶1至约350∶1或约100∶1至约400∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约150∶1至约200∶1、约150∶1至约250∶1、约150∶1至约300∶1、约150∶1至约350∶1或约150∶1至约400∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约200∶1至约250∶1、约200∶1至约300∶1、约200∶1至约350∶1或约200∶1至约400∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约250∶1至约300∶1、约250∶1至约350∶1或约250∶1至约400∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约300∶1至约350∶1或约300∶1至约400∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约350∶1至约400∶1。在某些实施方案中，一种前述组合物中脂质∶抗原的重量比为约200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1、390∶1或400∶1。
在某些实施方案中，当在40℃储存6个月后，前述组合物通过血凝素抑制(HAI)试验确定的免疫原性的改变低于50％。在某些实施方案中，所提供的组合物的免疫原性的改变低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％。
在某些实施方案中，当在40℃储存6个月后，前述组合物通过酶联免疫吸附试验(ELISA)确定的抗原含量的损失低于50％。在某些实施方案中，所提供的组合物的抗原含量的损失低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％。
在某些实施方案中，当在40℃储存6个月后，前述组合物比缺少脂质囊泡的参照组合物更稳定。在某些实施方案中，稳定性是基于通过HAI试验确定的免疫原性。在某些实施方案中，稳定性是基于通过ELISA确定的抗原含量。
在又一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的免疫原性组合物，其中，脂质囊泡由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成，并且当在40℃储存6个月后，所述组合物通过HAI试验确定的免疫原性的改变低于50％。在某些实施方案中，所提供的组合物的免疫原性的改变低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％。
在又一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的免疫原性组合物，其中，脂质囊泡由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成，并且当在40℃储存6个月后，所述组合物通过ELISA确定的抗原含量损失的低于50％。在某些实施方案中，所提供的组合物的抗原含量损失低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％。
在又一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的免疫原性组合物，其中，脂质囊泡由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成，并且当在40℃储存6个月后，所述组合物比缺少脂质囊泡的参照组合物更稳定。在某些实施方案中，稳定性是基于通过HAI试验确定的免疫原性。在某些实施方案中，稳定性是基于通过ELISA确定的抗原含量。
在某些实施方案中，前述组合物通过包括以下步骤的方法制备：熔化脂质以产生熔融脂质；将熔融脂质与包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和使所得产物均质化。
在某些实施方案中，以在所得产物中实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)的相对量合并脂质(熔融脂质)和水溶液。在某些实施方案中，将熔融脂质加入到包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液中。在某些实施方案中，将包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液加入到熔融脂质中。
在某些实施方案中，以在所得产物中实现至少约10mg/ml的脂质浓度的相对量和体积合并脂质(例如熔融脂质)和水溶液。在某些实施方案中，实现至少约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mg/ml的脂质浓度。在某些实施方案中，脂质浓度在约10mg/ml至约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/ml的范围内。在某些实施方案中，脂质浓度在约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mg/ml至约100mg/ml的范围内。在某些实施方案中，脂质浓度为约25mg/ml至约100mg/ml、约25mg/ml至约75mg/ml、约25mg/ml至约50mg/ml、约50mg/ml至约75mg/ml或约50mg/ml至约100mg/ml。
在某些实施方案中，以在所得产物中同时实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)和至少约10mg/ml的脂质浓度(或任一其他脂质浓度范围)的相对量和体积合并脂质(例如熔融脂质)和水溶液。
在某些实施方案中，以实现每单位剂量组合物(例如，在再水化前储存在密封容器中的干燥的单位剂量组合物)至少约5mg脂质含量的相对量合并脂质(例如熔融脂质)和水溶液。在某些实施方案中，实现每单位剂量组合物至少约6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg脂质含量。在某些实施方案中，脂质含量为约5mg至约50mg、约5mg至约40mg、约5mg至约30mg、约10mg至约50mg、约10mg至约40mg、约10mg至约30mg、约20mg至约50mg、约20mg至约40mg或约20mg至约30mg。
在某些实施方案中，以同时实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)和每单位剂量至少约5mg的脂质含量(或任一其他脂质含量范围)的相对量和体积合并脂质(例如熔融脂质)和水溶液。
在某些实施方案中，以在所得产物中实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)、每单位剂量至少约5mg的脂质含量(或任一其他脂质含量范围)和至少约10mg/ml的脂质浓度(或任一其他脂质浓度范围)的相对量和体积合并脂质(例如熔融脂质)和水溶液。
在又一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的组合物，其中，脂质囊泡由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成，并且所述组合物通过包括以下步骤的方法制备：熔化脂质以产生熔融脂质；将熔融脂质与包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和使所得产物均质化，其中，以在所得产物中实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)的相对量合并熔融脂质和水溶液。在某些实施方案中，将熔融脂质加入到包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液中。在某些实施方案中，将包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液加入到熔融脂质中。
在又一个方面，本公开内容提供了包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的组合物，其中，脂质囊泡由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成，并且所述组合物通过包括以下步骤的方法制备：熔化脂质以产生熔融脂质；将熔融脂质与包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和使所得产物均质化，其中，以在所得产物中实现至少约10mg/ml的脂质浓度(或任一其他脂质浓度范围)的相对量和体积合并熔融脂质和水溶液。在某些实施方案中，以在所得产物中实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)和至少约10mg/ml的脂质浓度(或任一其他脂质浓度范围)的相对量和体积合并熔融脂质和水溶液。在某些实施方案中，脂质含量还是每单位剂量至少约5mg(或任一其他脂质含量范围)。在某些实施方案中，将熔融脂质加入到包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液中。在某些实施方案中，将包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液加入到熔融脂质中。
在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原来源于甲型流感H1N1毒株。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原来源于甲型流感H3N2毒株。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原来源于乙型流感毒株。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原来源于甲型流感H1N1毒株、甲型流感H3N2毒株和乙型流感毒株中的两种或更多种。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原来源于甲型流感H1N1毒株、甲型流感H3N2毒株和乙型流感毒株。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有大致相同量的来源于每一种毒株的流感病毒凝血素抗原。
在某些实施方案中，所提供的组合物包含有一种或更多种含有流感病毒血凝素抗原的灭活流感病毒。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有一种或更多种含有流感病毒血凝素抗原的减毒流感病毒。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原作为裂解病毒抗原存在(split virus antigen)。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原作为亚单位抗原存在。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原的至少一部分与脂质囊泡联合。在某些实施方案中，流感病毒血凝素抗原的至少一部分包围在脂质囊泡中。
在某些实施方案中，所提供的组合物还包含有佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有TLR-4激动剂佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有弱化的脂质A衍生物。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有脂质A的单磷酰基衍生物。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有脂质A的3-脱酰基单磷酰基衍生物。在某些实施方案中，TLR-4激动剂佐剂的至少一部分与脂质囊泡联合。在某些实施方案中，在所提供的组合物的制备过程中，将TLR-4激动剂佐剂与脂质共熔。在某些实施方案中，在所提供的组合物的制备过程中，将TLR-4激动剂佐剂与熔融脂质和包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并(例如，在包含有流感病毒凝血素抗原的水溶液与熔融脂质合并前与之混合)。在某些实施方案中，在干燥(例如冻干)所提供的组合物前添加TLR-4激动剂佐剂。
在某些实施方案中，所提供的组合物通过不包括在温度受控的条件下储存的方法制备。在某些实施方案中，所提供的组合物通过包括在至少临时超过8℃、15℃、20℃、25℃、30℃或35℃的温度下储存的方法制备。
在某些实施方案中，所提供的组合物通过包括以干燥(例如，冻干)形式储存的方法制备。
在另一个方面，本公开内容提供了治疗受到流感感染或有流感感染风险的对象的方法，通过：提供干燥(例如冻干)形式的前述组合物之一；使所述组合物再水化；向所述对象施用治疗有效量的再水化组合物。在某些实施方案中，通过肌内注射施用再水化组合物。
而在另一个方面，本公开内容提供了制备包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的组合物的方法，其中，脂质囊泡由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成，所述方法包括：熔化脂质以产生熔融脂质；将熔融脂质与包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；使所得产物均质化，其中，以在所得产物中实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)的相对量合并熔融脂质和水溶液。在某些实施方案中，将熔融脂质加入到包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液中。在某些实施方案中，将包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液加入到熔融脂质中。
而在另一个方面，本公开内容提供了制备包含有流感病毒血凝素抗原和脂质囊泡的组合物的方法，其中，脂质囊泡由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成，所述方法包括：熔化脂质以产生熔融脂质；将熔融脂质与包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；使所得产物均质化，其中，以在所得产物中实现至少约10mg/ml的脂质浓度(或任一其他脂质浓度范围)的相对量和体积合并熔融脂质和水溶液。在某些实施方案中，以在所得产物中同时实现期望的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约50∶1或任一前述范围)和至少约10mg/ml的脂质浓度(或任一其他脂质浓度范围)的相对量和体积合并熔融脂质和水溶液。在某些实施方案中，将熔融脂质加入到包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液中。在某些实施方案中，将包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液加入到熔融脂质中。
附图说明
图1示出了示例性TLR-4激动剂佐剂磷酸化六酰基二糖(铵盐)或PHAD(来自Alabaster，AL的Avanti Polar Lipids公司)的化学结构。
图2示出了另一示例性TLR-4激动剂佐剂二[3-脱氧-D-甘露-辛酮糖基]-脂质A(铵盐)(来自Alabaster，AL的Avanti Polar Lipids公司)的化学结构。
图3示出了如实施例2表4所述小鼠中与NISV配制(组2)或未与NISV配制(组3)的具有示例性TLR-4激动剂佐剂PHAD的示例性已许可流感疫苗(1/30×标准人单位剂量的剂量节省型(dose sparing)，“标准小鼠单位剂量”是0.1×标准人单位剂量，即将人与小鼠之间的大小差异考虑在内)针对H1N1病毒的效力，将其与不与NISV或佐剂配制在一起的已许可流感疫苗(0.1×标准人单位剂量的剂量等同型，“标准小鼠单位剂量”是0.1×标准人单位剂量，即将人与小鼠之间的大小差异考虑在内)(组1)进行比较。
图4示出了如实施例2表4所述与NISV配制(组2)或未与NISV配制(组3)的具有示例性TLR-4激动剂佐剂PHAD的示例性已许可流感疫苗(1/30×标准人单位剂量的剂量节省型)对比于未与NISV或佐剂配制在一起的已许可流感疫苗(0.1×标准人单位剂量的剂量等同型)(组1)在小鼠体内对抗H3N2病毒的效力。
图5示出了未配制(即，“原样”使用)的已许可流感疫苗(0.1×标准人单位剂量的剂量等同型)在小鼠体内对抗H1N1病毒(A)和H3N2病毒(B)的效力，将其与NISV配制并且无佐剂或者与NISV配制并且具有量逐渐增加(1-50μg)的示例性TLR-4激动剂佐剂PHAD的已许可流感疫苗(1/30×标准人单位剂量的剂量节省型)进行比较。所有组合物肌内注射进小鼠并且在第二次免疫15天后检验血清。结果表示为对抗H1N1和H3N2的HAI效价和同一数据组的几何平均值。
图6示出了如实施例4表6所述与NISV配制或未与NISV配制的具有示例性TKR-4激动剂佐剂PHAD的示例性已许可流感疫苗(1/30×标准人单位剂量的剂量节省型)在小鼠体内对抗H1N1病毒(A)和H3N2病毒(B)的效力，将其与未与NISV或佐剂配制在一起的已许可流感疫苗(0.1×标准人单位剂量的剂量等同型)进行比较。所有组合物在4℃和40℃储存6个月然后肌内注射进小鼠并且在第二次免疫15天后检验血清。结果表示为对抗H1N1和H3N2的HAI效价。
图7示出了如实施例4表6所述与NISV配制的无佐剂的示例性已许可流感疫苗(0.1×标准人单位剂量的剂量等同型)对比已许可流感疫苗(0.1×标准人单位剂量的剂量等同型)在小鼠体内对抗H1N1病毒(A)和H3N2病毒(B)的效力。所有组合物在4℃和40℃储存6个月然后肌内注射进小鼠并且在第二次免疫15天后检验血清。结果表示为对抗H1N1和H3N2的HAI效价。
图8示出了(A)与NISV配制或(B)无NISV的商品化通过sELISA确定的HA抗原含量的体外数据；在4℃、25℃和40℃T＝0、1、3和6个月。两种组合物都是剂量节省型的并且加入有示例性TLR-4激动剂佐剂PHAD。
图9示出了未配制的商品化流感疫苗和对比与NISV配制的相同商品化流感疫苗的HA抗原含量的体外数据。通过sELISA分析重构样品的等份以确定在4℃和40℃T＝3个月的组合物的抗原含量(或“体外效力”)。
图10示出了与NISV配制且加入示例性TLR-4激动剂佐剂PHDA或者与NISV配制而无佐剂的示例性已许可流感疫苗(1/3×标准人单位剂量的剂量节省型，“标准猴单位剂量”是1×标准人单位剂量)在恒河猴体内对抗H3N2病毒的效力，将其与未与NISV或佐剂配制在一起的已许可流感疫苗(1×标准人单位剂量的剂量等同型，“标准猴单位剂量”是1×标准人单位剂量)。
图11示出了未配制的商品化(试验物品8)对比300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(试验物品3)、100∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(试验物品2)和30∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(试验物品1)的体外HA抗原含量。通过sELISA分析重构样品的等份以确定在4℃(A)T＝0和(B)T＝3个月的组合物的抗原含量(或“体外效力”)。
图12示出了如实施例7所述具有不同脂质∶抗原比、脂质浓度和脂质含量的多种NISV组合物对抗(A)H1N1病毒和(A)H3N2病毒的效力。在T＝0将组合物肌内注射进小鼠并且在第二次免疫15天后检验血清。结果表示为针对H1N1和H3N2的单独HAI效价和同一数据组的几何平均值。
图13示出了如实施例7所述具有不同脂质∶抗原比和不同脂质浓度(均质化和/或重构过程中)的多种NISV组合物对抗(A)H1N1病毒和(A)H3N2病毒的效力。所有组合物在4℃和40℃储存3个月然后肌内注射进小鼠并且在第二次免疫15天后检验血清。结果表示为针对H1N1和H3N2的HAI效价的几何平均值。
定义
在本公开内容全文中使用了许多术语，其在以下段落中进行了定义。
本文所使用的术语“抗原”是指包含有一种或更多种被抗体识别的表位(线性表位、构象表位或两者)的物质。在一些实施方案中，抗体是人抗体，在一些实施方案中，其在暴露于抗原的人体组织中产生，在一些实施方案中，该暴露发生于血流或包括血流暴露。在某些实施方案中，抗原可以是“免疫原”。
本文所使用的术语“免疫应答”是指在宿主动物体内引起的应答。免疫应答可以指细胞免疫、体液免疫或可以包括这两者。免疫应答可以局限于免疫系统的一部分。例如，在某些实施方案中，认为提高的IFN γ应答是免疫应答。在某些实施方案中，认为粘膜IgA应答(例如在鼻和/或直肠冲洗液中测量)是免疫应答。在某些实施方案中，认为系统性IgG应答(例如在血清中测量)是免疫应答。在某些实施方案中，认为宿主动物产生抑制凝血素的抗体(例如通过血凝素抑制(HAI)试验测量)是免疫应答。
本文所使用的术语“免疫原性”用来指代在宿主动物中产生针对非宿主实体(例如，流感病毒)的免疫应答的物质。在某些实施方案中，该免疫应答形成了由针对特定感染性生物(例如流感病毒)的疫苗引起的保护性免疫的基础。在某些实施方案中，免疫原性物质在人体内产生免疫应答。在某些实施方案中，免疫原性物质在与机体(例如人体)的血流接触时产生免疫应答。
本文所使用的术语“治疗有效量”是指当作为治疗性给药方案的一部分施用时，在治疗对象中足以表现出显著益处的量。本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，如果特定的组合物包含有适合在治疗性给药方案中以单位剂量形式施用的量时，可以认为其包含有治疗有效量，即使该量作为单次单位剂量施用时可能不足以获得显著益处。本领域技术人员还应当理解，对于接受组合物的不同对象，免疫原性组合物的治疗有效量可能不同，例如，其取决于这些因素：期望的生物学终点、组合物的性质、施用途径、治疗对象的健康状况、大小和/或年龄等。在一些实施方案中，治疗有效量是这样的量，当作为特定治疗性给药方案(例如单次施用，或多次施用，例如常规的“加强”方案)的一部分施用时，其与有益效果相关联。在一些实施方案中，治疗有效量是这样的量，其被治疗许可机构(例如，食品和药品管理局或欧洲药品管理局)批准作为特定治疗性剂量方案的一部分(例如，见食品和药品管理局针对许可的一价疫苗在www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ ApprovedProducts/ucml81950.htm和针对许可的三价疫苗在www.fda.gov/ BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm094045.htm给出的多种许可流感疫苗的说明书)。
本文所使用的术语“治疗”是指以减缓、减轻、改变、改善、提高或影响疾病、疾病症状或疾病素因为目的，向患有或易患疾病、疾病症状或疾病素因的对象施用所提供的组合物。在某些实施方案中，术语“治疗”是指向对象接种疫苗。一般而言，治疗可减轻疾病的一种或更多种症状或特征的严重程度和/或频率和/或可以推迟一种或更多种症状或特征的发作。
具体实施方式
所有疫苗都随着时间损失效力，并且效力损失的速率是温度依赖性的。因此，建立了冷链系统以确保通过将疫苗储存在冷藏条件下(大多数情况下为2℃至8℃)直至使用时，以保持疫苗的效力。建立用于疫苗储存和配送的冷链是重大工作并且其维持很困难。还很明显的是，尽管尽最大努力，但是因为若干问题冷链不一定总能如预期发挥功能，例如：维护不恰当或冷冻设备过时、断电导致的设备故障、不遵从冷链程序和监控不当。结果是冷链中的疫苗经常遭受温度漂移(即，温度处于目标范围之外)。
对于当前市场上的流感三价疫苗(其主要作为液体组合物可得)，重要的是理解冷链需求和正确疫苗管理的重要性，以确保对象接受稳定的有效力的流感疫苗。如果未恰当保存流感疫苗(例如，未保持在2℃至8℃的所需温度范围内)，疫苗可能变得不稳定，其进而显著影响效力，导致接种疫苗的对象在免疫后不能够发生血清学转化。接种疫苗的对象认为他们得到了保护，因为他们已经进行了免疫，但实际上他们依然易感染流行性感冒，因为疫苗由于温度漂移导致的不稳定而没有效力。
本公开内容提供了用于治疗流行性感冒的组合物和方法，其解决了这些问题的一些。如本文所述，所提供的组合物和方法基于包含有与脂质囊泡组合的流感病毒凝血素抗原的特定组合物的开发，所述脂质囊泡包含有非离子型表面活性剂(NISV)和任选的佐剂。在某些实施方案中，即使未储存在标准冷链系统中，所提供的组合物依然有效力(即，它们是热稳定的)。
I.流感病毒血凝素抗原
一般而言，本公开内容的组合物包含有流感病毒血凝素抗原。根据本发明使用的血凝素抗原不限于全长野生型血凝素抗原，因此本文所使用的术语“血凝素抗原”也包括全长野生型血凝素抗原的免疫原性片度和变体。术语“血凝素抗原”还包括包含有任意前述内容的融合蛋白和辍合物。可以利用本领域已知的任意方法确定所提供的组合物中的血凝素抗原的量。在一些实施方案中，可通过ELISA(例如，一种或更多种亚型特异性sELISA)确定血凝素抗原的量。该方法常用于裂解病毒疫苗中抗原的量的标准化。
对于所使用的血凝素抗原的类型没有限制。特别地，血凝素抗原可获自单种流感病毒毒株或流感病毒毒株的组合。如上所述，当前的流感疫苗通常是“三价”疫苗，其包含有来源于两种甲型流感病毒毒株(例如，H1NI和H3N2)和一种乙型流感毒株的抗原。因此，在某些实施方案中，本公开内容的三价组合物可包含有来源于甲型流感H1N1毒株、甲型流感H3N2毒株和乙型流感毒株的血凝素抗原。某些三价组合物可包含有大致等量的来源于每一种这些毒株的血凝素抗原。
一价疫苗在本领域也是已知的，并且包括在本发明中。在一些实施方案中，所提供的组合物是一价的。通常认为一价疫苗在例如大流行的情况下特别有用。一价的大流行流感疫苗最可能包含有源于单一种甲型毒株的血凝素抗原。在一些实施方案中，用于一价组合物的血凝素抗原来源于大流行流感毒株。例如，在一些实施方案中，用于一价组合物的血凝素抗原来源于甲型流感(猪源的H1N1)毒株。如在实施例中证明的，包含有来源于甲型流感H3N2毒株的血凝素抗原(单独或与其他抗原组合)的组合物特别能有意义，因为来源于该毒株的抗原似乎对高温特别敏感。
对于所使用的血凝素抗原的来源(即，天然的、重组的、合成的等)也没有限制。全世界主要使用三种疫苗来保护对抗流感：全病毒疫苗、包含有病毒的外部和内部组件的裂解病毒疫苗以及仅由病毒的外部组件(血凝素和神经氨酸酶)构成的亚单位疫苗。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含有一种或更多种含有血凝素抗原的全病毒。在某些实施方案中，流感疫苗是灭活的。应当理解，可以使用任何方法来制备灭活流感病毒。WO 09/029695描述了产生灭活全病毒疫苗的示例性方法。一般而言，这些方法包括：使流感病毒在宿主细胞中繁殖；任选地裂解宿主细胞以释放病毒；分离然后灭活病毒。通常使用化学处理(例如，福尔马林、甲醛等)灭活用于制备疫苗的病毒。但是，应理解也可以使用其他方法，例如氯处理，暴露于高温等。在这些处理中，通常使外部的病毒壳保持完整而破坏复制功能。在某些实施方案中，流感病毒是减毒的。如本领域所熟知的，使用减毒病毒制备疫苗的一个优点在于更高免疫原性的潜力，这导致其在体内稳定复制而不造成全感染。由弱化毒株制备的活病毒疫苗优选缺少致病性但是依然能够在宿主中复制。本领域使用制备减毒流感病毒的一个方法是病毒适应(viral adaptation)，其包括使病毒毒株以多个细胞培养物连续传代。随着时间，病毒发生突变，然后可鉴别出减毒的毒株。在某些实施方案中，可使病毒通过不同的细胞培养物传代。在某些实施方案中，在降低的温度下进行一步或更多步的细胞培养可能是有利的。
在某些实施方案中，根据本发明使用的流感病毒血凝素抗原基于裂解病毒疫苗技术。裂解病毒疫苗通常包含有较高浓度的病毒最具免疫原性的部分(例如，血凝素和神经氨酸酶)，而降低较低免疫原性的病毒蛋白和来源于(用于生产病毒)的卵的非病毒蛋白或外部试剂(例如，禽白血病病毒、其他微生物和细胞碎片)的浓度。一般地，裂解病毒疫苗通过物理方法制备，包括：通常使用有机溶剂或去污剂(例如Triton X-100)破坏病毒颗粒，以及通过蔗糖梯度离心或使尿囊液通过色谱柱来分离或纯化病毒蛋白质至不同程度。在一些实施方案中，在病毒破坏和分离后进行透析或超滤。本领域已知裂解病毒的方法和合适的裂解剂(例如，见美国专利公开No.20090155309)。
在某些实施方案中，根据本发明使用的流感病毒血凝素抗原基于亚单位疫苗技术。一般而言，亚单位疫苗仅包含有进行有效疫苗接种所需(例如，引起保护性免疫应答)的流感病毒部分。在一些实施方案中，亚单位流感抗原由病毒颗粒(例如，纯化的病毒特定组分)制备。在一些实施方案中，亚单位流感抗原通过重组方法(例如，在细胞培养物中表达)制备。例如，美国专利No.5,858,368描述了利用DNA技术制备重组流感疫苗的方法。所得三价流感疫苗基于克隆自具有流行潜力的流感病毒的重组血凝素抗原的混合物。重组血凝素抗原是由培养的昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生并且在非变性条件下纯化的全长未切割糖蛋白。在一些实施方案中，亚单位抗原通过合成方法(例如肽合成)产生。亚单位疫苗还可包含有由WHO确定的选定毒株制备的纯化血凝素抗原。
在某些实施方案中，血凝素抗原可来源于一种或更多种已许可流感疫苗。在某些实施方案中，血凝素抗原(任选地与其他抗原，例如神经氨酸酶抗原)可纯化自已许可流感疫苗，然后使用在所提供的组合物中。在某些实施方案中，已许可流感疫苗可“原样”使用而不需要任何纯化。表1是已许可流感疫苗非限制性列表。可以从制造商或供应商和/或食品和药品管理局(例如，参见针对许可的一价疫苗的www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/ Vaccines/ApprovedProducts/ucml81950.htm和针对许可的三价疫苗的www.fda.gov/ BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm094045.htm)为疫苗本身提供的说明书中得到有关这些许可疫苗全部的处方信息和详情。这些说明书的全部内容通过引用并入本文。
表1
在接下来的部分中，我们将讨论这些以及其他可在本发明的组合物和方法中使用的示例性流感抗原。
一种灭活三价裂解流感疫苗，由Sanofi Pasteur公司开发和生产，并且可根据本公开内容使用。包含有由在鸡胚中繁殖的流感病毒制备的无菌悬液。获取含病毒液体并且用甲醛灭活。使用连续流离心机将流感病毒在线性蔗糖密度梯度溶液中浓缩和纯化。然后使用非离子型表面活性剂octoxino1-9(X-100)对病毒进行化学破坏以产生裂解病毒抗原。然后将裂解病毒通过化学方法进一步纯化并且悬浮在用磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。然后根据流感季节的需要对流感疫苗进行标准化并且配制成每0.5ml单位剂量包含有45μg血凝素抗原(HA)，代表三种原型毒株每一种的HA的推荐比为15μg HA(例如，利用来源于A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)毒株、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)毒株和B/Malaysia/2506/2004毒株的HA制备2007-2008疫苗)。将配制成用于肌内(IM)注射。
可根据本公开内容使用的已许可流感疫苗的另一例子是其也是由Sanofi Pasteur公司开发和生产的灭活三价裂解流感疫苗。以与上述的方法类似的方式制备并且类似配制成用于肌内注射。
可根据本公开内容使用的已许可流感疫苗的另一例子是 是用于通过鼻腔喷雾施用的活减毒三价疫苗。中的流感病毒具有三处基因突变，其导致受温度限制的生长和减毒表型。抗原特性和流感病毒基因改变的累积效果是它们能够在鼻咽内复制以产生保护性免疫。为了生产用每一种合适的病毒毒株接种特定的无病原体(SPF)卵并且孵育使得病毒毒株能够复制。获取这些卵的尿囊液、合并然后通过过滤使其澄清。通过超速离心浓缩病毒并且用稳定化缓冲剂稀释以得到最终的蔗糖和磷酸钾浓度。获取病毒然后进行无菌过滤，产生一价散料。随后将来源于三种毒株的一价散料混合，并且根据获得期望效力的需要用稳定化缓冲剂稀释，产生三价散装疫苗。然后将散装疫苗直接填充到用于鼻施用的单独喷雾器中。每一预填充的冷冻喷雾器包含有单个0.2ml单位剂量。每个0.2ml单位剂量包含有106.5-7.5FFU的代表合适的三种病毒毒株中每一种的活减毒流感病毒。
如上所述，当前许可了若干种流感疫苗。应当理解，这些已许可流感疫苗中的任一种或组合可与本文所述脂质囊泡组合。例如，商品可以以这种方式组合来产生组合物。在一些实施方案中，首先纯化已许可流感疫苗(例如，以除去疫苗中的佐剂或其他试剂)。在一些实施方案中，已许可流感疫苗在与本文所述脂质囊泡配制前未纯化(即它们“原样”使用)。
II.佐剂
本公开内容的组合物可包含有佐剂。如本领域所熟知的，佐剂是增强免疫应答的试剂(例如，见″Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach″，PharmaceuticalBiotechnology，第6卷，Powell和Newman编辑，Plenum Press，New York and London，1995)。
Toll样受体(TLR)是与果蝇Toll受体同源的蛋白质家族，其识别病原体相关分子模式，因此有利于机体区分自体和异体分子。TLR以病原体相关分子模式识别病毒病原体中常见的物质。例如，不受限制，认为TLR-4识别脂多糖模式(TLR-4也被称为CD284或分化284聚类)；而认为TLR-7/8识别单链RNA和小的合成分子；认为TLR-9识别未甲基化的细菌DNA或合成的寡核苷酸。当TLR被这些模式识别触发时，就发生一系列的信号传递事件，导致炎症以及先天和适应性免疫应答的激活。
在一些实施方案中，所提供的组合物包含有TLR-4激动剂佐剂。已经开发了若干包含有被TLR-4识别的分子模式的合成配体(TLR-4激动剂)作为佐剂并且可包含在所提供的组合物中。弱化脂质A衍生物(ALD)例如单磷酰基脂质A(MPL)和3-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MPL)是作为TLR-4的激动剂的示例性佐剂。ALD是已经被改变或构建成减轻或改变了脂质A的不利影响的脂质A样分子。这些不利影响包括在鸡胚50％致死剂量试验(CELD50)中评估的发热性、局部Shwarzman反应性和毒性。美国专利No.4,436,727和No.4,912,094分别描述了MPL和3D-MPL。MPL最初衍生自脂质A，脂质A是肠道菌脂多糖(LPS)的组分，是有效但是高毒性的免疫系统调节物。PCT公开No.WO95/14026以及美国专利公开No.20080131466和No.20090181078描述了MPL的示例性合成衍生物。3D-MPL不同于MPL之处在于与3位的还原性末端葡萄糖胺酯联(ester linked)的酰基残基已经被选择性除去(例如，见美国专利No.4,877,611、No.4,866,034和No.4,912,094)。应当理解MPL、3D-MPL及其衍生物可包括多种具有各种脂肪酸链长的脂肪酸取代模式(即，七酰基、六酰基、五酰基等)的混合物。因此，本公开内容包括MPL和3D-MPL的多种形式，包括其混合物。
MPL作为PHAD或磷酸化的六酰基二糖(铵盐)可获自Alabaster，AL的Avanti PolarLipids公司。图1示出了PHAD的化学结构。图2示出了另一示例性TLR-4激动剂佐剂二[3-脱氧-D-甘露-辛酮糖基]-脂质A(铵盐)(也来自Alabaster，AL的Avanti Polar Lipids公司)的结构。在一些实施方案中，这些或其他ALD可与海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)在例如2％鲨烯/TweenTM80乳液中组合(例如，见英国专利No.2122204)。
本领域技术人员能够确定其他合适的TLR-4激动剂佐剂。例如，可使用在例如PCT公开No.WO98/50399或美国专利No.6,303,347和No.6,764,840公开的烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)。PCT公开No.WO03/011223和WO03/099195描述了另一些合适的TLR-4激动剂(例如，WO03/011223第4至5页或WO03/099195第3至4页公开的化合物I至III，特别是在WO03/011223中以ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764公开的那些化合物)。
在一些实施方案中，所提供的组合物包含有约1至50μg TLR-4激动剂佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有约1-40、1-30、1-20、1-10或1-5μg TLR-4激动剂佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有约10-40、10-30或10-20μg TLR-4激动剂佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有约1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10μg TLR-4激动剂佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物包含有约5-20、5-18、5-16、5-14、5-12、5-10、5-9、5-8或5-7μg TLR-4激动剂佐剂。
在一些实施方案中，所提供的组合物包含有TLR-7/8激动剂佐剂。已经开发了多种包含有被TLR-7/8识别的分子模式的合成配体(TLR-7/8激动剂)作为佐剂并且可包含在所提供的组合物中。示例性TLR-7/8配体包括但不限于CL075(噻唑并喹诺酮衍生物)、CL097(高水溶性咪唑并喹啉化合物)和R848(低分子量合成咪唑并喹啉化合物)，其均可获自SanDiego，CA的InvivoGen。在一些情况下，聚(dT)(胸苷均聚物硫代磷酸寡脱氧核苷酸)可用于与咪唑并喹啉组合以提高TLR-8介导的信号转导和/或降低TLR-7介导的信号转导(例如，见Jurk等人，Eur J Immunol.36(7)：1815-26，2006)。本领域技术人员能够确定根据本发明使用的TLR-7/8激动剂佐剂的合适量和/或衍生物。
在一些实施方案中，所提供的组合物包含有TLR-9激动剂佐剂。一般而言，细菌DNA富含未甲基化的2′-脱氧核糖(胞苷-磷酸鸟苷)(CpG)二核苷酸，相比之下，哺乳动物DNA通常包含低频率的CpG二核苷酸，它们大部分是甲基化的。处于特定碱基背景的未甲基化CpG(称作CpG基序)已显示通过TLR-9激活免疫系统。在一些情况下，CpG DNA的TLR-9识别导致产生促炎细胞因子(例如，IL-6、IL-12)。CpG基序可包含有保守的核心基序，其导致在特定物种中高水平刺激TLR-9。例如，GACGTT表现为高度刺激小鼠TLR-9，而包含有多于1个CpG和核心序列GACGTT的CpG基序已显示刺激人TLR-9。已经开发了若干包含有被TLR-9识别的分子模式的合成配体(TLR-9激动剂)作为佐剂并且可包含在所提供的组合物中。本领域技术人员能够确定根据本发明使用的TLR-9激动剂佐剂的合适量和/或衍生物。
在某些情况下，佐剂的至少一部分与脂质囊泡联合。在某些实施方案中，佐剂的至少一部分未与囊泡联合。在某些实施方案中，在所提供的组合物的制备过程中将佐剂与脂质共融。在某些实施方案中，在所提供的组合物的制备过程中将佐剂与熔融脂质和包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并(例如，在包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液与熔融脂质合并前与之混合)。在某些实施方案中，在所提供的组合物干燥(例如冻干)之前加入佐剂。
III.脂质囊泡
一般而言，本公开内容的组合物包含有由包含有非离子型表面活性剂的脂质构成的脂质囊泡。在本文中，这些脂质囊泡也称为“非离子型表面活性剂囊泡”或“NISV”。如本领域已知的，囊泡一般具有由一层或更多层脂双层包封的水性腔室。
非离子型表面活性剂
任何具有合适两亲性质的非离子型表面活性剂都可用于形成根据本发明使用的囊泡。不受限制，合适表面活性剂的例子包括基于甘油的酯联表面活性剂(ester-linkedsurfactant)。这样的甘油酯可包含有一个或两个高级脂肪酰基，例如，每一酰基部分包含有至少10个碳原子。基于这样的甘油酯的表面活性剂可包含多于一个的甘油单元，例如多至5个甘油单元。可使用甘油一酯，例如，包含有C12-C20烷酰基或烯酰基部分的那些，例如包含有己酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、油烯基或硬脂酰基。一种示例性酯联表面活性剂是1-棕榈酸单甘油酯。
作为替代或补充，可作为根据本发明的非离子型表面活性剂使用或包含醚联表面活性剂(ether-linked surfactant)。例如，合适的是基于甘油或具有至多4个碳原子的低级脂肪族二醇(如乙二醇)的醚联表面活性剂。基于这样的二醇的表面活性剂可包含有一个或更多个二醇单元，例如多至5个二醇单元(例如，二甘醇十六基醚(diglycolcetylether))和/或聚氧乙烯-3-月桂醚(polyoxyethylene-3-lauryl ether))。可使用甘醇单醚(glycolmonoether)或甘油单醚(glycerol monoether)，包括包含有C12-C20链烷基或链烯基部分的那些，例如包含有辛基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、油烯基或十八烷基。可以使用的环氧乙烷缩合物包括PCT公开No.WO88/06882中公开的那些(例如，聚氧乙烯高级脂肪醚和胺表面活性剂)。示例性醚联表面活性剂包括1-单十六烷基甘油醚和二甘醇十六醚。离子两亲物
应当理解，用于制作根据本发明使用的脂质囊泡的脂质可掺入离子两亲物，从而使得例如囊泡带负电荷。例如，这样可有利于稳定囊泡并且提供有效分散。
不受限制，为了该目的，可使用酸性物质，例如高级链烷酸或链烯酸(例如，棕榈酸、油酸)或包含有具有磷酸的酸基团的其他化合物，例如二烷基磷酸(例如，双十六烷基磷酸或磷脂酸或磷脂酰丝氨酸)和硫酸一酯，例如高级烷基硫酸酯(例如，十六烷基硫酸酯)。离子两亲物(如果存在)通常按重量计为非离子型表面活性剂的1％至50％(例如，1-5％、1-10％、1-15％、1-20、1-25％、1-30％、1-35％、1-40％、1-45％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、10-15％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、15-20％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、20-25％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、25-30％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、30-35％、30-40％、30-45％、30-50％、35-40％、35-45％、35-50％、40-45％、40-50％或45-50％)。
疏水物质
为了形成根据本发明的囊泡，脂质还可掺入能够形成双层的合适的高分子量疏水物质(例如，类固醇，例如固醇，如胆固醇)。这些能够形成双层的高分子量疏水物质(例如，类固醇，例如固醇，如胆固醇)的存在有利于形成囊泡的物理特性所依赖的双层。该物质(如果存在)通常按重量计为非离子型表面活性剂的20％至120％(例如，20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-110％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-100％、30-110％、30-120％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-100％、40-110％、40-120％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％、50-110％、50-120％、60-70％、60-80％、60-90％、60-100％、60-110％、60-120％、70-80％、70-90％、70-100％、70-110％、70-120％、80-90％、80-100％、80-110％、80-120％、90-100％、90-110％、90-120％、100-110％、100-120％或110-120％)。
示例性脂质囊泡
在某些实施方案中，根据本发明使用的脂质囊泡包含有非离子型表面活性剂、离子两亲物和类固醇。在某些实施方案中，脂质囊泡包含有1-棕榈酸单甘油酯、磷酸二鲸蜡酯和胆固醇。
在某些实施方案中，根据本发明使用的脂质囊泡基本上由非离子型表面活性剂、离子两亲物和类固醇组成。在某些实施方案中，脂质囊泡基本上由1-棕榈酸单甘油酯、磷酸二鲸蜡酯和胆固醇组成。
在某些实施方案中，根据本发明使用的脂质囊泡不包含或基本不包含转运增强分子。在一些实施方案中，根据本发明使用的脂质囊泡不包含或基本不包含“胆汁酸”(例如胆酸和鹅去氧胆酸)、它们与甘氨酸或牛磺酸的辍合产物(例如，甘氨胆酸和牛磺胆酸)、包含有去氧胆酸和熊去氧胆酸的衍生物及这些酸的盐。在一些实施方案中，根据本发明使用的脂质囊泡不包含或基本不包含酰氧化氨基酸，例如酰基肉毒碱及其盐和棕榈酰肉毒碱。
脂质∶抗原的重量比
本发明提供了以下意料之外的发现：所提供的组合物的免疫原性和热稳定性至少部分受组合物中存在的脂质和血凝素抗原的相对量的控制。
例如，通过实验，我们发现脂质含量高(例如，脂质∶抗原的重量比为约450∶1)的组合物的免疫原性远不如脂质含量稍低(例如，脂质∶抗原的重量比为约300∶1)的组合物。尽管脂质含量更低的组合物一般免疫原性更高，但我们还发现它们的热稳定性较差(例如，我们观察到脂质∶抗原的重量比为约30∶1时热稳定性非常差)。通过这些实验发现(在实施例中将更详细讨论)，我们现在能够定义和提供同时具有免疫原性和热稳定性的新的组合物组。在某些实施方案中，所提供的组合物脂质:抗原的重量比至少为约50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1或300∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比低于约400∶1、390∶1、380∶1、370∶1、360∶1、350∶1、340∶1、330∶1、320∶1或310∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比在约50∶1至约60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1、390∶1或400∶1的范围内。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比在50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、160∶1、170∶1、180∶1、190∶1、200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1、or 390∶1至约400∶1的范围内。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约50∶1至约100∶1、约50∶1至约150∶1、约50∶1至约200∶1、约50∶1至约250∶1、约50∶1至约300∶1、约50∶1至约350∶1或约50∶1至约400∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约100∶1至约150∶1、约100∶1至约200∶1、约100∶1至约250∶1、约100∶1至约300∶1、约100∶1至约350∶1或约100∶1至约400∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约150∶1至约200∶1、约150∶1至约250∶1、约150∶1至约300∶1、约150∶1至约350∶1或约150∶1至约400∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约200∶1至约250∶1、约200∶1至约300∶1、约200∶1至约350∶1或约200∶1至约400∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约250∶1至约300∶1、约250∶1至约350∶1或约250∶1至约400∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约300∶1至约350∶1或约300∶1至约400∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约350∶1至约400∶1。在某些实施方案中，脂质∶抗原的重量比为约200∶1、210∶1、220∶1、230∶1、240∶1、250∶1、260∶1、270∶1、280∶1、290∶1、300∶1、310∶1、320∶1、330∶1、340∶1、350∶1、360∶1、370∶1、380∶1、390∶1或400∶1。
制作脂质囊泡的方法
已知许多制备包含有非离子型表面活性剂的脂质囊泡的方法，例如PCT公开No.W093/19781中提到的那些。一个示例性技术是旋转膜蒸发方法，其中通过旋转蒸发由有机溶剂(例如烃或氯代烃溶剂，如氯仿)来制备非离子型表面活性剂(和其他任何组分脂质)的膜(例如，见Russell和Alexander，J.Immunol.140：1274，1988)。然后将所得薄膜在含水缓冲剂中再水合。
产生脂质囊泡的另一个方法是Collins等人，J.Pharm.Pharmacol.42：53，1990所公开的。该方法包括熔化非离子型表面活性剂(和任何其他组分脂质)以及通过在水缓冲剂的存在下充分混合来水合。
另一方法包括在剪切力的存在下水合脂质。可用于提供这样的剪切力的设备是熟知的(例如，见PCT公开No.WO88/06882)。声处理和超声处理也是形成脂质囊泡或改变其大小的有效方法。
在某些实施方案中，血凝素抗原的至少一部分与脂质囊泡联合(本文使用的术语“联合”包括任何形式的物理相互作用)。在某些实施方案中，血凝素抗原的至少一部分包围在脂质囊泡中。可通过任何方式实现联合和包围。例如，在旋转膜蒸发技术中，可以在抗原(任选的还有佐剂)的存在下使膜水合。在另一些方法中，可使用脱水-再水合方法，其中水相中的抗原与预形成的囊泡合并并在速冻后冻干，例如见Kirby和Gregoriadis，Biotechnology 2：979，1984。作为替代或补充，可使用冻融技术，其中预形成的囊泡与抗原混合并且反复地在液氮中快速冷冻和将温度升高至相关脂的转变温度之上，例如，见Pick，Arch.Biochem.Biophys.212：195，1981。除了联合抗原外，脱水-再水合方法和冻融技术还能够顺带使佐剂与脂质囊泡联合。
在某些实施方案中，根据本发明使用的脂质囊泡通过包括以下步骤的方法制备：熔化脂质以产生熔融脂质；将熔融脂质与包含有血凝素抗原的水溶液合并；使所得产物均质化。在某些实施方案中，将熔融脂质加入到包含有血凝素抗原的水溶液中。在某些实施方案中，将包含有血凝素抗原的水溶液加入到熔融脂质中。
在某些实施方案，以在所得产物中实现至少约10mg/ml脂质浓度的相对量和体积合并熔融脂质和水溶液。实际上，通过实验并且如实施例所述，我们发现当脂质和抗原均质化且脂质浓度超过10mg/ml时，所得组合物趋于比使用较低脂质浓度时的热稳定性更好(见实施例)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含有抗原和脂质囊泡的期望组合物(特别包括热稳定组合物)，这些组合物包含有本文确立的所示脂质浓度，以赋予组合物特定性质(例如，高的热稳定性)。
在某些实施方案中，实现了至少约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mg/ml的脂质浓度。在某些实施方案中，脂质浓度在约10mg/ml至约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/ml的范围内。在某些实施方案中，脂质浓度在约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mg/ml至约100mg/ml的范围内。在某些实施方案中，脂质浓度为约25mg/ml至约100mg/ml、约25mg/ml至约75mg/ml、约25mg/ml至约50mg/ml、约50mg/ml至约75mg/ml或约50mg/ml至约100mg/m。
在某些实施方案中，以在所得产物中同时实现期望的脂质∶抗原质量比(例如，至少约50∶1或以上引用的任一前述脂质∶抗原质量比范围)和至少约10mg/ml脂质浓度(或以上引出的任一其他脂质浓度)的相对量和体积合并熔融脂质和水溶液。
在某些实施方案中，在所提供的组合的制备过程中将佐剂与脂质共融。在某些实施方案中，在所提供的组合的制备过程中将佐剂与熔融脂质和包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液合并(例如，在包含有流感病毒血凝素抗原的水溶液与熔融脂质合并前与之混合)。在某些实施方案中，在所提供的组合物干燥(例如，冻干)前添加佐剂。
在一些实施方案中，在120℃至150℃(例如，120℃至125℃、120℃至130℃、120℃至140℃、130℃至140℃、135℃至145℃或140℃至145℃)的温度熔化非离子型表面活性剂(任选地和其他脂质组分)。在某些实施方案中，在约120℃、约125℃、约130℃、约135℃、约140℃、约145℃或约150℃溶化非离子型表面活性剂(任选地和其他脂质组分)。在一些实施方案中，控制包含有血凝素抗原的水溶液的温度。在一些实施方案中，在添加的过程中包含有血凝素抗原的水溶液保持在低于约50℃的温度(例如，低于约45℃、低于约40℃、低于约35℃、低于约30℃、低于约25℃等)。在一些实施方案中，包含有血凝素抗原的水溶液保持在约25℃至约50℃之间。在一些实施方案中，包含有血凝素抗原的水溶液保持在室温。
在某些实施方案中，通过包括提供干燥(例如，冻干)形式的脂质组分和用包含有血凝素抗原的水溶液水合所述干燥物质的步骤的方法制作囊泡。干燥物质可通过例如熔化脂质组分然后冻干熔融产物来制备。
如下面将详细描述的，在一些实施方案中，所提供的组合物可以在储存前先干燥(例如，冻干)并且随后在使用前水合。
囊泡大小和处理
所提供的组合物通常包含具有多种尺寸的囊泡混合物。在一些实施方案中，＞90％的囊泡的直径处于最频遇值(most frequent value)的50％范围内(例如，1000±500nm)。在一些实施方案中，分布可能更窄，例如，＞90％的囊泡的直径处于最频遇值的40、30、20、10或5％范围内。在一些实施方案中，可使用声处理或超声处理来促进囊泡形成和/或改变囊泡大小。在一些实施方案中，可使用过滤、透析和/或离心来调节囊泡的大小分布。
一般而言，根据本公开内容产生的囊泡可具有任何尺寸。在某些实施方案中，所提供的组合物可包含有最频遇直径(most frequent diameter)为约0.1μm至约10μm的囊泡，例如，为约0.1μm至约5μm、约0.5μm至约2μm或约0.8μm至约1.5μm。在某些实施方案中，最频遇直径可大于10μm。例如为约10μm至约20μm或约15μm至约25μm。在某些实施方案中，最频遇直径可以为约0.1μm至约20μm、约0.1μm至约15μm、约0.1μm至约10μm、约0.5μm至约20μm、约0.5μm至约15μm、约0.5μm至约10μm、约1μm至约20μm、约1μm至约15μm或约1μm至约10μm。
冻干
自从引入疫苗以来，液体疫苗组合物就是默认的存在形式。大多数现有液体疫苗已经被开发为在冷藏下储存而不是较高温度储存，因此，其稳定性可能并非最佳。全部已许可疫苗目前都作为液体配制和储存。在水环境中，流感抗原受到物理和化学降解，可导致失活和效力损失。
如以上所讨论的，在某些实施方案中，提供了干燥(例如，冻干)的组合物。在一些实施方案中，本公开内容的方法包括干燥(例如，冻干)步骤。
一般而言，冻干包括冷冻目的制剂和然后降低周围压力(和任选地加热制剂)，使得冰冻溶剂能够直接从固相升华成气体(即，干燥阶段)。干燥阶段可分为初次干燥阶段和二次干燥阶段。
冷冻阶段可通过将制剂放置在容器(例如，烧瓶、微量离心管等)中和任选地在通过机械冷冻(例如，使用干冰和甲醇、液氮等)冷却的水浴中离心容器来进行。在一些实施方案中，冷冻步骤包括将制剂冷却至低于制剂的共熔点的温度。因为共熔点出现于制剂的固相和液相可共存的最低温度，所以将材料保持在低于这个点的温度下能够确保在随后步骤中发生升华而不是蒸发。
干燥阶段(或使用两步干燥阶段时的初次干燥阶段)包括降低压力和任选地将制剂加热至溶剂可升华的温度。干燥阶段通常从制剂中除去大部分溶剂。冷冻阶段和干燥阶段未必是明显区分的阶段而是可能以任意方式组合。例如，在某些实施方案中，冷冻阶段和干燥阶段可重合。
可任选地使用二次干燥阶段以除去在冷冻阶段吸附的残余溶剂。一旦干燥阶段完成，可用惰性气体(例如，氮气或氦气)打破真空，之后任选地密封冻干的脂质产物。
可使用赋形剂如蔗糖、氨基酸或蛋白质(如明胶或血清白蛋白)以在干燥处理和储存的过程中保护抗原。在一些实施方案中，可使用冻干保护剂(1yoprotectant)。在一些实施方案中，可将冻干保护剂与佐剂一起添加。示例性冻干保护剂包括蔗糖、海藻糖、聚乙二醇(PEG)、二甲基-琥珀酸缓冲剂(DMS)、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇和右旋糖酐。
本公开内容确定，所提供组合物的某些优选实施方案是水分含量特别低(例如，按重量计低于约2％)的那些。通过实验(如在实施例中将详细描述)，我们确定脂质含量较高的干燥(例如，冻干)组合物的残余水分含量趋于更低(例如，按重量计低于约2％)。如以上所提到的，脂质含量较高的组合物趋于更耐热。不希望受到任何理论的约束，我们猜测较高脂质含量组合物的一些或全部热稳定性质可能部分来源于其较低的残余水分含量。因此，在某些实施方案中，本公开内容的组合物限定为或具有低的水分含量(例如，按重量计低于约2％)。在某些实施方案中，所提供的组合物的脂质∶抗原的重量比为至少约50∶1(或上文提到的任一前述脂质∶抗原的重量比范围)。在某些实施方案中，这些组合物可具有较低的脂质∶抗原的重量比(例如，至少约40∶1或30∶1)。基于我们的水分含量结果，这些脂质含量较低的组合物在冻干处理中可能需要更广泛的干燥步骤。
在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计低于约1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或0.4％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.4％至约2％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约1.9％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.6％至约1.8％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.7％至约1.7％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.8％至约1.6％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.9％至约1.5％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1％至约1.4％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约1.0％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约1.5％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约0.5％至约2.0％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1％至约1.5％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1％至约2.0％。在某些实施方案中，所提供的组合物的水分含量按重量计为约1.5％至约2.0％。
干燥组合物的再水合
在向有此需要的对象施用前使干燥(例如，冻干)组合物再水合。在一些实施方案中，通过使干燥(例如，冻干)组合物与水溶液混合来实现该再水合。在一些实施方案中，水溶液包括缓冲剂。例如，不受限制，可使用PCB缓冲剂、Na2HPO4/NaH2PO4缓冲剂、PBS缓冲剂、bicine缓冲剂、Tris缓冲剂、HEPES缓冲剂、MOPS缓冲剂等。PCB缓冲剂通过以摩尔比2∶1∶2混合丙酸钠、二甲胂酸钠和bis-Tris丙烷来制备。加入不同量的HCl使得能够在4-9的pH范围缓冲。在一些实施方案中，可使用碳酸盐缓冲剂。
干燥组合物的储存
在某些实施方案中，干燥(例如，冻干)组合物可储存一段时间(例如，数天、数周或数月)，之后再水合并且向有此需要的对象施用。在某些实施方案中，干燥(例如，冻干)组合物在非温控条件下储存。在某些实施方案中，干燥(例如，冻干)组合物在储存过程中至少临时暴露于超过8℃的温度(例如超过15℃、20℃或25℃的温度)。在某些实施方案中，干燥(例如，冻干)组合物在储存过程中至少临时暴露于10℃至40℃的温度、20℃至30℃的温度、室温等。
在某些实施方案中，干燥(例如，冻干)组合物是热稳定的。在某些实施方案中，在40℃储存6个月后，干燥(例如，冻干)组合物比缺少脂质囊泡的参照干燥组合物更稳定。在某些实施方案中，稳定性是基于通过AHI试验确定的免疫原性。在某些实施方案中，稳定性是基于通过ELISA确定的抗原含量。
在某些实施方案中，在40℃储存6个月后，干燥(例如，冻干)组合物通过HAI试验确定的免疫原性的改变低于50％。在某些实施方案中，干燥(例如，冻干)组合物的免疫原性的改变低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％。
在某些实施方案中，在40℃储存6个月后，干燥(例如，冻干)组合物通过ELISA确定的抗原含量的损失低于50％。在某些实施方案中，干燥(例如，冻干)组合物的抗原含量的损失低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％。
在某些实施方案中，在干燥组合物储存仅1、2或3个月观察到这些效果，而不是6个月后。在某些实施方案中，在干燥组合物储存在15℃、20℃、25℃、30℃或35℃后观察到这些效果，而不是在40℃。
在某些实施方案中，在储存过程中尽管暴露于超过8℃的温度(例如，10℃至40℃的温度、20℃至30℃的温度、室温等)1至6个月，但是干燥组合物的抗原性和/或免疫原性保持基本无变化。
在某些实施方案中，与在2℃至8℃储存相同时间的等效干燥组合物相比，干燥组合物在这些升高的温度下的储存对抗原通过ELISA测量的抗原性的破坏低于20％(例如，低于15％、低于10％、低于5％、低于1％)。
在某些实施方案中，与在2℃至8℃储存相同时间的等效干燥组合物相比，干燥组合物在这些升高的温度下的储存对抗原基于HAI效价测量的免疫原性的破坏低于20％(例如，低于15％、低于10％、低于5％、低于1％)。
在某些实施方案中，储存后干燥组合物的抗原性和/或免疫原性是在相同的高温下储存但是未与脂质囊泡配制的等效干燥组合物的至少1.5倍(例如，至少约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍或5倍)。在一些实施方案中，抗原性的水平是基于通过ELISA获得的测量结果。在一些实施方案中，免疫原性的水平是基于HAI效价测量结果。
在一些实施方案中，当干燥组合物在25℃储存1、2、3或4个月后，得到这些抗原性和/或免疫原性结果中的一个或更多个。在一些实施方案中，当干燥组合物在15℃、20℃、30℃、35℃或40℃储存1个月后，得到这些结果。在一些实施方案中，当干燥组合物在15℃、20℃、30℃、35℃或40℃储存2个月后，得到这些结果。在一些实施方案中，当干燥组合物在15℃、20℃、30℃、35℃或40℃储存3个月后，得到这些结果。在一些实施方案中，当干燥组合物在15℃、20℃、30℃、35℃或40℃储存4个月后，得到这些结果。在一些实施方案中，当干燥组合物在15℃、20℃、30℃、35℃或40℃储存6个月后，得到这些结果。
示例性组合物
在某些实施方案中，所提供的组合物不包含或基本不包含佐剂性质的添加剂(即，所提供的组合物是无佐剂的)。在某些实施方案中，所提供的组合物不包含或基本不包含TLR激动剂佐剂(即，TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7/8、TLR-9等激动剂佐剂)。在某些实施方案中，所提供的组合物不包含或基本不包含TLR-3激动剂佐剂，例如聚(I∶C)或聚(IC∶LC)。在某些实施方案中，所提供的组合物不包含或基本不包含TLR-4激动剂佐剂，例如MPL或3D-MPL。在某些实施方案中，所提供的组合物不包含或基本不包含TLR-5激动剂佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物不包含或基本不包含TLR-7/8激动剂佐剂。在某些实施方案中，所提供的组合物不包含或基本不包含TLR-9激动剂佐剂。
IV.剂量和施用
本公开内容的方法可用于治疗人流感传染，包括成人和小孩。但是，一般而言，它们也可用于任何动物。在某些实施方案中，本文的方法用于兽医应用，例如犬科和猫科应用。如果期望，本文的方法还可用于家畜，例如羊、禽类、牛、猪和马品种。
本文所述组合物一般以诱导免疫反应所必要或充分的量和时间施用。给药方案可由单个单位剂量或一段时间中的多个单位剂量构成。所提供的组合物的确切量在不同对象之间可能不同，并且可能取决于若干因素。因此，应当理解，一般而言，所使用的精确剂量由处方医师确定，并且可能不仅取决于对象的体重和施用途径，还取决于对象的年龄和症状的严重程度和/或感染风险。在某些实施方案中，所提供的组合物包含的血凝素抗原的剂量在约1至100μg的范围内。例如，在某些实施方案中，范围可以为约2至50μg、5至50μg、2至20μg、5至20μg等。在某些实施方案中，血凝素抗原的剂量可以为约5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg等。在某些实施方案中，这些剂量作为单个单位剂量施用。在某些实施方案中，单位剂量分几次施用(例如1至3次，间隔1至12个月)。在某些实施方案中，血凝素抗原获自已许可的人流感疫苗，并且向人施用组合物以使得血凝素抗原的单位剂量低于标准人单位剂量(例如，为标准人单位剂量的10-90％、10-80％、10-70％、10-60％、10-50％、10-40％、10-30％、10-20％、20-90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、20-30％、30-90％、30-80％、30-70％、30-60％、30-50％、30-40％、40-90％、40-80％、40-70％、40-60％、40-50％、50-90％、50-80％、50-70％、50-60％、60-90％、60-80％、60-70％、70-90％、70-80％或80-90％)。例如，如果标准人单位剂量需要单次施用包含有45μg血凝素抗原的组合物(例如，见或)，那么，在某些实施方案中，本公开内容的方法可包括给对象单次施用包含有少于45μg血凝素抗原的所提供组合物，例如40μg、35μg、30μg、25μg、20μg或15μg血凝素抗原。
在一些实施方案中，所提供组合物中血凝素抗原和TRL-4激动剂佐剂(例如，MPL或3D-MPL)的量为使得每单位剂量包含有约1-100μg(例如，约2-80μg、5-70μg或约10-50μg)血凝素抗原和约1-100μg(例如，约1-50μg、约1.5-50μg、约2.5-50μg、约2.5-50μg、约2.5-40μg、约2.5-30μg、约2.5-20μg或约2.5-10μg)TRL-4激动剂佐剂(例如，MPL或3D-MPL)。
在某些实施方案中，所提供组合物被配制成用于胃肠外递送，例如，通过注射。在这些实施方案中，施用可以是例如静脉内、肌肉内、真皮内或皮下，或通过灌输或无针注射技术。在某些实施方案中，组合物可被配制成用于肌肉递送。对于这样的胃肠外递送，组合物可以如以上的讨论被制备并且保持为干燥形式并且在施用前再水合。如本领域已知的，可利用可药用酸(例如甲磺酸)调节注射组合物的pH。可以使用的另一些可接受载体和溶剂包括林格液和U.S.P。另外，可常规使用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为了该目的，可使用任意温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，在可注射制剂的制备中使用脂肪酸，例如油酸。可以在使用前对可注射组合物进行灭菌，例如，通过用截留细菌的滤器过滤、或通过掺入可在无菌水或其他无菌可注射介质中溶解或分散的无菌固体形式的杀菌剂。
实施例
以下实施例描述了制作和实践本文描述的某些组合物一些示例性方法。应当理解，这些实施例仅为举例说明之目的，而不是意在限制本文所述组合物和方法的范围。
实施例1：热稳定冻干免疫原性组合物
本实施例描述了制备用于肌内(IM)注射的热稳定冻干免疫原性组合物的方法。通过反向熔化法(inverted melt method)制备全部非离子型表面活性剂囊泡(NISV)组合物。使用以下脂质：1-棕榈酸单甘油酯(非离子型表面活性剂)、胆固醇(类固醇)和磷酸二鲸蜡酯(离子两亲物)。具体地，将5∶4∶1的摩尔比的脂质(496mg 1-棕榈酸单甘油酯(MPG)、464mg胆固醇(CHO)和164mg磷酸二鲸蜡酯(DCP))置于平底玻璃烧杯中，确保没有粉末粘附在玻璃烧杯侧壁上。在该示例性组合物中，任选地加入12mg(对于剂量节省型组合物)或4mg(对于剂量等同型组合物)磷酸化六酰基二糖(铵盐)(PHAD，图1所示示例性TLR-4激动剂佐剂，可获自Alabaster，AL的Avanti Polar Lipids公司)，并且与其他脂质共融。夹紧烧杯并且用铝箔覆盖，在120-125℃的热油浴中熔化脂质，并且偶尔用玻璃棒进行搅拌。在脂质熔化的同时，如下制备浓磷酸缓冲剂：将5.980g Na2HPO4和1.363g NaH2PO4溶解在20ml无菌水中，测量pH，通过0.45μm无菌滤器过滤溶液，在层流净化罩将0.796ml该缓冲剂加入到40ml流感疫苗(2009-2010season；Sanofi Pasteur)中。流感疫苗(2009-2010season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗，其包含有浓度45μg/0.5ml的流感HA抗原(每0.5ml包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/Brisbane/59/2007；H3N2，A/Brisbane/10/2007和B/Brisbane/60/2008)。在30-35℃下以8，000rpm使缓冲的抗原储备溶液均质化，在溶液均质化的同时快速(以防止结晶)将熔融脂质转移到烧杯中，届时，均质化过程在30-35℃下以8，000rpm持续10分钟。将所得脂质-抗原悬液在30-35℃下以220±10rpm摇动1-2小时。这一步进行在线取样以确定pH和粒径分布(PSD)。最后，向40ml NISV-抗原溶液中加入40ml 400mM蔗糖水溶液，在30-35℃下以220±10rpm摇动5分钟。取等份(剂量节省型组合物为0.5ml/瓶，剂量等同型组合物为1.5ml/瓶)，在-80℃冷冻过夜或更久，随后根据下表2概括的冻干循环中的目标冻干参数和下表3给出的针对不同填充体积的主要干燥时间设定点进行冻干。
表2
| 步骤 | 类型 | 温度(℃) | 时间(小时±0.3) | 压力(mTorr) |
| 1* | 保持 | 室温 | 1.0 | N/A |
| 2 | 逐渐改变 | -45 | 1.0 | N/A |
| 3** | 保持 | -45 | ≥8.0*** | N/A |
| 4 | 逐渐改变 | -30 | 1.0 | N/A |
| 5 | 抽真空 | -30 | N/A | 100 |
| 6 | 保持 | -30 | 见表3 | 100 |
| 7 | 逐渐改变 | 0 | 1.0 | 100 |
| 8 | 保持 | 0 | 3.0 | 100 |
| 9 | 逐渐改变 | 20 | 1.0 | 50 |
| 10 | 保持 | 20 | 10.0 | 50 |
| 11 | 终止 | 室温 | N/A | N/A |
＊如果未预先冷冻样品，样品进入的步骤。
＊＊如果预先冷冻样品，样品进入的步骤。
＊＊＊如果预先冷冻样品，最小时间为1小时。
表3
| 填充体积(ml) | 时间(小时，±0.3) |
| 0.1-1.0 | 21 |
| 1.1-2.0 | 35 |
| 2.1-3.0 | 43 |
| 3.1-5.0 | 50 |
| 5.1-7.0 | 55 |
| 7.1-10.0 | 60 |
根据以下程序制备未与NISV配制但是包含有抗原和佐剂的对照样品：将12mg(对于剂量节省型组合物)或4mg(对于剂量等同型组合物)PHAD重悬在40ml 400mM蔗糖溶液中，随后将该悬液与40ml流感疫苗(2009-2010season；Sanofi Pasteur)混合并且在30-35℃下以220±10rpm摇动5分钟。将该未配制的抗原-佐剂溶液在小瓶中取等份(剂量节省型组合物为0.5ml/瓶，剂量等同型组合物为1.5ml/瓶)，在-80℃冷冻过夜或更久，随后根据下表2概括的冻干循环中的目标冻干参数和下表3给出的针对不同填充体积的主要干燥时间设定点进行冻干。
全部冻干组合物在施用前在0.75ml WFI中再水合。如以下将详细讨论的，一些研究使用以液体形式提供的流感疫苗作为对照(即，未进行包括冻干在内的任何配制步骤)。
实施例2：利用免疫原性组合物对小鼠进行流感免疫
在6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(每测试组最少8只动物)测试按照实施例1所述制备的组合物。利用50μl对照或再水合组合物通过肌内免疫小鼠两次，一次在第0天，一次在第14天。在免疫前以及第一次免疫后和第二次免疫后，从研究组的全部小鼠体内采集血液以评估体液免疫应答。如以下表4所总结的，动物接受：(1)等于0.1×标准人单位剂量(“标准小鼠单位剂量”是0.1×标准人单位剂量，即考虑了人与小鼠之间的大小差异)的剂量等同型(阳性对照；未配制且无佐剂)(组/试验物品1)；(2)与NISV和佐剂PHAD(0.005mg)配制的等于1/30×标准人单位剂量的剂量节省型(组/试验物品2)；或(3)与佐剂PHAD(0.005mg)配制但是无NISV的等于1/30×标准人单位剂量的剂量节省型(组/试验物品3)。
表4
＊(2009-2010season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗。每0.5ml单位剂量(2009-2010season；Sanofi Pasteur)包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/Brisbane/59/2007；H3N2，A/Brisbane/10/2007和B/Brisbane/60/2008)。
＊＊小鼠接受0.1×标准人剂量的当从人换算成小鼠时，其大体相当于1×剂量等同或“标准人单位剂量”。
＊＊＊使用商品对照而无配制步骤。
＊＊＊＊每0.05ml小鼠单位剂量的含量
实施例3：免疫原性组合物的效力的血凝素抑制试验
对于效力测试，使用HAI试验测量动物体内的免疫应答。HAI试验是血清学技术，其用于检测由于感染或接种流感病毒而在血清中产生的HA抗体。HAI效价与保护人免受流感相关。HAI抗体效价表示为显示使用4单位血凝时的完整血凝的最大血清稀释度的倒数。认为1：40或更多的HAI效价是血清保护的，认为在接种疫苗后和接种疫苗前取得的样品中HAI效价增加4倍是归类为血清转化所必需的。结果表示为HAI效价和几何平均HAl效价的倒数。如下进行HAI试验。简言之，在96孔V底板中制备免疫小鼠血清在PBS中的二倍连续稀释，与50μl4血凝素单位(HAU)的A/Brisbane/59/07(H1N1)或A/Brisbane/10/2007(H3N2)一起在室温孵育30分钟。之后向平板上的全部孔中加入50μl鸡红细胞(稀释0.5％v/v)(CanadianFood Inspection Agency，Ottawa，Canada)，在室温孵育1.5小时。然后确定能够使鸡红细胞凝集的最高稀释度。
确定几何平均值、中值和平均值的标准误。利用Software GraphPad Prism 5进行统计学分析。通过配对t检验分析成对样品，利用student t检验分析未成对样品。认为p值≤0.05是统计学显著的。最后一次免疫后接种疫苗14天后的反应比免疫前得到的值增加≥2倍指示为阳性应答。以下描述这些试验的结果。
在本小鼠研究中，我们评估了实施例2表4所述三种组合物的效力。在研究第13天(P1Vd13)和第29天(P2Vd15)从小鼠体内得到的血液中进行HAI试验。
图3示出了第一次免疫后13天(P1Vd13)针对H1N1A/Brisbane/59/07的平均HAI效价。可以发现，组2动物(表4；加入佐剂的剂量节省型NISV组合物)针对H1N1的平均HAI效价显著高于组3动物(表4；无NISV的加入佐剂的剂量节省型组合物)，也高于对照组1动物(表4；无佐剂且未配制的剂量等同型)。还观察到在三分之一单位剂量下，加入佐剂的剂量节省型NISV组合物(组2)比对照无佐剂且未配制的剂量等同型(组1)效力更高，而无NISV的加入佐剂的剂量节省型组合物(组3)则不然。
图4示出了第一次免疫后13天(P1Vd13)针对H3N2A/Brisbane/10/07的平均HAI效价。可以发现，组2动物(表4；加入佐剂的剂量节省型NISV组合物)针对H3N2的平均HAI效价显著高于组3动物(表4；无NISV的加入佐剂的剂量节省型组合物)，也高于对照组1动物(表4；无佐剂且未配制的剂量等同型)。同样还观察到在三分之一单位剂量下，加入佐剂的剂量节省型NISV组合物(组2)比对照无佐剂且未配制的剂量等同型(组1)效力更高，而无NISV的加入佐剂的剂量节省型组合物(组3)则不然。在第二次免疫后(P2Vd15)，在各个组动物的免疫应答中观察到了类似的趋势。一般而言，第二次免疫后15天(P2Vd15)测量的HAI效价大约为第一次免疫后13天(P1Vd13)观察到的HAI效价的4至5倍
为了确定示例性TLR-4激动剂佐剂PHAD在免疫应答上的剂量依赖性，在6-8周龄的雌性BALB/C小鼠体内(每一测试组最少8只动物)测试利用实施例1所述方法(不同之处在于逐渐增加的与其他脂质共融的PHAD的量)制备的阳性对照和5种不同的NISV组合物。表5总结了这6个测试组。利用50μl对照或再水合组合物通过肌肉免疫小鼠两次，一次在第0天，一次在第14天。在免疫前以及第一次免疫后和第二次免疫后，从研究组的全部小鼠体内采集血清样品并且利用实施例3所述HAI试验进行分析。
表5
＊(2009-2010season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗。每0.5ml单位剂量(2009-2010season；Sanofi Pasteur)包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/Brisbane/59/2007；H3N2，A/Brisbane/10/2007和B/Brisbane/60/2008)。
＊＊小鼠接受0.1×标准人剂量的当从人换算成小鼠时，其大体相当于1×剂量等同或“标准人单位剂量”。
＊＊＊使用商业对照而无配制步骤。
＊＊＊＊每0.05ml鼠单位剂量的含量
图5示出了使用实施例3的HAI效价试验利用在第二次接种疫苗后15天取得的血清样品确定的小鼠中的效力剂量应答。从图5可见，5μgPHAD(组5)使得剂量节省型NISV组合物的效力提高至大体相当于对照无佐剂且未配制的剂量等同型(组1)，而更高剂量PHAD(15μg和50μg)(分别为组4和组3)使得效力提高为对照的大约3倍。图5A和图5B表明，示例性TLR-4激动剂佐剂PHAD佐剂以剂量依赖方式提高针对H1N1和H3N2的效力。
实施例4：冻干免疫原性组合物的热稳定性试验
通过在三种储存温度条件下(5℃±3℃、25℃±2℃、40℃±2℃)多至6个月来评估根据实施例1制备的冻干免疫原性组合物(NISV)的稳定性。没有描述生物制品的稳定性特征的单个稳定性指示性测定或参数。如FDA所定义的(FDA Guidance forIndustry.Content and Format of Chemistry，Manufacturing and ControlsInformation and Establishment Description Information for a Vaccine orRelated Product)，生物制品的稳定性研究一般需要对以下进行测试：效力；指示稳定性的物理化学度量；水分含量(如果冻干)；pH；无菌性或生物负荷的控制；热原性和一般安全性。因此，利用多种测定进行的稳定性指示谱能够确保通常能够检测到生物产品特性、纯度和效力的改变。
本文所使用的术语“效力”是指产品实现其预期效果的特定能力，其通过合适的体内或体外定量方法确定。利用体内小鼠效力试验评估在三种不同储存温度下储存组合物效力随时间的变化。如下表6所示，对照和冻干组合物被在不同温度下储存多至6个月，在该时间后被再水合(在冻干组合物的情况下)并且通过IM施用给小鼠(如实施例2所述)。然后利用实施例3的HAI试验确定免疫应答。
表6
＊(2009-2010season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗。每0.5ml单位剂量(2009-2010season；Sanofi Pasteur)包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/Brisbane/59/2007；H3N2，A/Brisbane/10/2007和B/Brisbane/60/2008)。
＊＊小鼠接受0.1×标准人剂量的当从人换算成小鼠时，其大体相对于1×剂量等同或“标准人单位剂量”。
＊＊＊使用商业对照而无任何配制步骤。
＊＊＊＊每0.05ml小鼠单位剂量的含量。
#囊泡形成脂质∶HA抗原的重量比
还分析了组合物的外观(颜色和不透明度)，并且在再水合后分析了粒径分布(PSD)和pH。将再水合样品的等份在超速离心机中于4℃以24,000rpm离心20分钟，取出上清液和沉淀部分，萃取并且通过sELISA分析来确定抗原含量(也描述为“体外效力”)。再水合后测试再水合物质的稳定性4-6小时。在所示时间点，利用HPLC分析冻干组合物中脂质的纯度和降解产物。利用Karl Fischer试验评估冻干组合物中的水分含量。用于稳定性研究的组合物不是无菌的。但是，配制方法包括：加热脂质至＞100℃和将熔融脂质加入到含有无菌均无菌过滤的缓冲溶液中。在低微生物含量(生物负荷)条件下实施配制方法，例如，在层流罩中、在冻干过程中使用Tyvek无菌包以及利用无菌氮气进行回填。通过将样品涂板在Tryptic Soy Agar(TSA)上并且在30-35℃孵育3-5天的好氧微生物总数(每克CFU)以及通过将样品涂板在Sabouraud Agar(SDA)上并且在20-25℃孵育5-7天的酵母和霉菌总数(每克CFU)来评估生物负荷。
在完成稳定性研究的过程中，遵从ICH Harmonized Tripartite Guideline：Stability Testing of New Drug Substances and Products.Q1A(R2)给出的一般建议。提出的稳定性指示测试列在下表7中，其中一个“月”大约为4周，X代表必需试验，O代表任选的试验。
表7
图6示出了剂量节省型有佐剂NISV组合物(组2：NISV，TLR-4激动剂佐剂)对比剂量节省型有佐剂组合物(组3：无NISV，TLR-4激动剂佐剂)和剂量等同型无佐剂且未配制的对照(组1：无NISV，无TLR-4激动剂佐剂)在小鼠中的体内效力(如实施例3所示利用第二次接种疫苗15天后取得的血清样品进行HAI效价分析)。将对照和冻干组合物在4℃或40℃储存6个月，之后如实施例2所述通过IM注射进小鼠体内。由图6可见，针对H1N1和H3N2的HAI效价表明，剂量节省型有佐剂NISV组合物(组2)在4℃或40℃储存多至6个月后效力相同，而剂量等同型无佐剂且未配制的对照(组1)和剂量节省型有佐剂组合物(组3)在4℃或40℃同样储存6个月都损失效力。
图7示出了剂量等同型无佐剂NISV组合物(组7：NISV，无TLR-4激动剂佐剂)对比剂量等同型无佐剂且未配制的对照(组1：无NISV，无TLR-4激动剂佐剂)在小鼠中的体内效力(如实施例3所示利用第二次接种疫苗15天后取得的血清样品进行HAI效价分析)。将对照和冻干组合物在4℃或40℃储存6个月，之后如实施例2所述通过IM注射进小鼠体内。由图7可见，针对H1N1和H3N2的HAI效价表明，剂量等同型无佐剂NISV组合物(组7)在4℃或40℃储存多至6个月后效力相同，而剂量等同型无佐剂且未配制的对照(组1)在4℃或40℃同样储存6个月损失效力。
图8示出了在不同储存温度(4℃、25℃和40℃)下不同储存时间(时间点T＝0、1、3和6个月)后以下组合物的体外HA抗原含量：(A)剂量节省型有佐剂NISV组合物(组2)和(B)剂量节省型有佐剂组合物(组3)。如上所述通过sELISA确定HA抗原含量值。将组合物进行离心并且分别如所示测量沉淀和上清中HA抗原的量。由图8可见，结果表明当与NISV配制并且在40℃储存多至6个月(组2，图8A)时HA抗原含量损失最小，而当未与NISV配制并且在40℃储存(组3，图8B)时HA含量稳定下降。
外观：外观中最明显的时间和温度依赖性变化是冻干饼块的熔化，其在全部储存于40℃的冻干无NISV组合物(包括对照)中发现，而储存在25℃的程度较轻。不期望受到任何理论的约束，在这些无NISV的冻干组合物中观察到的冻干饼块的熔化似乎不是由于在开始二次干燥前饼块干燥不完全造成的。在冻干后，冻干饼块全部都是令人满意的，但是在逐渐升高的温度下经过储存时间后缩小和液化。
残余水分：通过Karl Fischer试验确定冻干饼块中的残余水分，并且以按重量计水分百分比表示。不期望受到任何理论的约束，冻干饼块中的残余水分含量似乎与组合物的稳定性负相关。观察到，在零时刻(刚刚冻干后)，未包含NISV的冻干组合物组中总残余水分比包含有NISV的冻干组合物高：分别为约2-4％和约1-2％残余水分。一般而言，冻干过程中NISV的存在导致残余水分含量较低。在包含有NISV的冻干组合物在升高的温度下(例如，25℃、40℃)储存长时间(例如多至6个月)后，残余水分的可见变化非常小至没有(未示出数据)。
粒径分布：在40℃包含有NISV的冻干组合物和未包含NISV的冻干组合物两者的粒径分布和平均粒径都有明显变化(在25℃的程度较轻)(未示出数据)。在4℃任何包含有NISV的组合物都未观察到粒径分布和平均粒径的这种变化。
pH：在储存于4℃、25℃或40℃时全部组合物的pH大致相同，在六个月的研究过程中未表现出可见的趋势。
实施例5：具有其他佐剂和抗原的冻干免疫原性组合物的热稳定性
本研究的目的是确定，当不同类型的佐剂和抗原与NIVS配制在一起时，其是否是热稳定的。值得注意的是，并没有为了测试这些替代性佐剂和抗原而对各种组合物进行优化(例如，优化佐剂浓度等)。
不同的佐剂：利用实施例1所述反向熔化方法制备具有不同佐剂的非离子型表面活性剂囊泡(NISV)组合物。具体地，对于每一种组合物，将5∶4∶1摩尔比的脂质(147.59mgMPG、138.25mg CHO和49.66mgDCP)置于平底玻璃烧杯中。夹紧并且覆盖烧杯，在120-125℃的热油浴中熔化脂质，偶尔用玻璃棒进行搅拌。在层流净化罩中将如实施例1所述制备的浓磷酸盐缓冲剂(0.224ml)加入到11.67ml流感疫苗(2010-2011season；SanofiPasteur)中。在30-35℃下以8,000rpm使缓冲的抗原储备溶液均质化，在使溶液均质化的同时快速(以防止结晶)将熔融脂质转移到烧杯中。使均质化过程在30-35℃下以8,000rpm持续10分钟。将所得脂质-抗原悬液在30-35℃下以220±10rpm摇动1-2小时。向每一种NISV-抗原溶液中加入等体积400mM蔗糖水溶液和每一种佐剂(3.5mg佐剂)，在30-35℃下以220±10rpm摇动5分钟。取等份(0.5ml/瓶)，在-80℃冷冻过夜或更久，随后根据表2总结的冻干循环中的目标冻干参数和表3给出的针对不同填充体积的初次干燥时间设定点进行冻干。
将冻干的加佐剂组合物在4℃或40℃储存3个月，然后在0.75ml WFI中再水合，之后如实施例2所述通过IM注射到小鼠体内，利用在第二次接种疫苗后15天从接疫苗小鼠体内取得的血清样品分析(如实施例3所述测量针对H1N1的HAI效价)再水合组合物的体内效力。结果在下表8示出。这些结果表明，无论佐剂类型如何，剂量节省型有佐剂组合物(组1和组2)在4℃或40℃储存多至3个月后效力相同。这些剂量节省型有佐剂NISV组合物(组1和组2)的总效力低于剂量等同型有佐剂NISV组合物(组3)的总效力。还利用鞭毛蛋白(TLR-5激动剂佐剂)进行了研究，但是剂量试验对于小鼠有毒性。
表8
＊(2010-2011season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗。每0.5ml单位剂量(2010-2011season；Sanofi Pasteur)包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/California/07/2009X-179A；H3N2，A/Victoria/210/2009X-187和B/Brisbane/60/2008)。
＊＊TLR 7/8激动剂佐剂。
＊＊＊TLR 9激动剂佐剂。
不同抗原：利用实施例1所述反向熔化方法制备不同流感抗原的非离子型表面活性剂囊泡(NISV)组合物。具体地，对于每一种组合物，将5∶4∶1摩尔比的脂质(404mg MPG、378mg CHO和134mg DCP)置于平底玻璃烧杯中。夹紧并且覆盖烧杯，在120-125℃的热油浴中熔化脂质，偶尔用玻璃棒进行搅拌。在层流净化罩中将如实施例1所述制备的浓磷酸盐缓冲剂(0.615ml)加入到32ml流感疫苗(2010-2011season；Sanofi Pasteur)、流感疫苗(2010-2011season；Novartis)或流感疫苗(2010-2011season；GSK)中。流感疫苗(2010-2011season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗，其包含有浓度45μg/0.5ml的流感HA抗原(每0.5ml包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/California/07/2009X-179A；H3N2，A/Victoria/210/2009X-187；和B/Brisbane/60/2008)。流感疫苗(2010-2011season；Novartis)是灭活三价裂解流感疫苗，其包含有浓度45μg/0.5ml的流感HA抗原(每0.5ml包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/California/07/2009X-181；H3N2，A/Victoria/210/2009X-187；和B/Brisbane/60/2008)。流感疫苗(2010-2011season；GSK)也是灭活三价裂解流感疫苗，其包含有浓度45μg/0.5ml的流感HA抗原(每0.5ml包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，HlNl，A/California/07/2009X-181；H3N2，A/Victoria/210/2009X-187；和B/Brisbane/60/2008)。在30-35℃下以8,000rpm使缓冲的抗原储备溶液均质化，在溶液均质化的同时快速(以防止结晶)将熔融脂质转移到烧杯中。届时，均质化过程在30-35℃下以8,000rpm持续10分钟。将所得脂质-抗原悬液在30-35℃下以220±10rpm摇动1-2小时。向每一种NISV/抗原溶液中加入等体积400mM蔗糖水溶液并且在30-35℃下以220±10rpm摇动5分钟。取等份(1.5ml/瓶)，在-80℃冷冻过夜或更久，随后根据表2概括的冻干循环中的目标冻干参数和表3给出的针对不同填充体积的初次干燥时间设定点进行冻干。
将组合物在4℃和40℃储存3个月然后在0.75ml WFI中再水合，之后如实施例2所述通过IM注射到小鼠体内。图9示出了在4℃或40℃3个月后组合物的“体外效力”(如实施例4所述通过sELISA确定HA抗原含量)。结果表明，当流感抗原(或)与NISV一起配制时，在40℃储存多至3个月后HA抗原含量的损失极小，而当流感抗原(或)未与NISV一起配制时，HA抗原含量稳定下降。
实施例6：利用免疫原性组合物对猴进行流感免疫
为了检验在非人灵长类动物模型中的免疫原性，还在恒河猴(rhesusmacaques)体内测试了已经证明在4℃、25℃和45℃储存多至6个月后具有体外和小鼠体内热稳定性的组合物。猴子两次注射(0、28天)：(a)剂量等同(1×标准人单位剂量或45μg)无佐剂且未配制的阳性对照或(b)剂量节省量(1/3×标准人单位剂量或15μg)与NISV配制且加入或未加入示例性TLR-4激动剂佐剂PHAD(50μg)的在注射前和注射后(第二次注射后多至10周)采集血清样品并且如实施例3所述通过HAI试验进行分析。进行针对H1N1和H3N2的HAI试验，图10给出了3个处理组的H3N2的数据。如图10所示，第二次IM施用后在恒河猴中多至十周，加入或未加入PHAD佐剂的剂量节省型NISV组合物比无佐剂且未配制的阳性对照的免疫原性更高。
实施例7：脂质∶抗原比、脂质浓度和脂质含量在热稳定性中的作用
为了检验脂质在热稳定性中的作用，利用反向熔化方法(如实施例1所述)将免疫原性组合物配制成具有不同脂质∶抗原比、每单位剂量不同脂质含量和在均质化和重构过程中具有不同脂质浓度。下表9描述了所测试的多种组合物。该研究的目的是确定NISV组合物在4℃和40℃储存3个月后的热稳定性。
表9
＊(2009-2010season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗。每0.5ml单位剂量(2009-2010season；Sanofi Pasteur)包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/Brisbane/59/2007；H3N2，A/Brisbane/10/2007；和B/Brisbane/60/2008)(即，0.5ml中45μg总HA抗原)。
＊＊用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)将抗原储液稀释2倍(即，0.5ml中22.5μg总HA抗原)
＊＊＊利用Amicon超滤管使抗原储液浓缩2倍(即，0.5ml中90μg总HA抗原)。
＊＊＊＊囊泡形成脂质∶HA抗原的重量比。
NISV囊泡由以下脂质构成：1-棕榈酸单甘油酯(MPG，一种非离子型表面活性剂)、胆固醇(CHO，一种类固醇)和磷酸二鲸蜡酯(DCP，一种离子两亲物)。为了保持5∶4∶1的摩尔比，称取表9给定的量的脂质并且置于平底玻璃烧杯中，如实施例1所述在120℃-125℃的热油浴中熔化并且偶尔用玻璃棒搅拌。在脂质熔化的同时，将表9给定体积的浓磷酸盐缓冲液加入到表9给定的合适体积中。然后在30-35℃下以8,000rpm使缓冲的抗原储备溶液均质化，在溶液均质化的同时快速(以防止结晶)将熔融脂质转移到烧杯中，届时，均质化过程在30-35℃下以8,000rpm持续10分钟。将所得NISV-抗原悬液在30-35℃下以220±10rDm摇动1-2小时。最后，向NISV抗原溶液中加入等体积400mM蔗糖水溶液，在30-35℃下以220±10rpm摇动5分钟。取等份(1ml/瓶)，在-80℃冷冻过夜或更久，随后根据表2概括的冻干周期中的目标冻干参数和表3给出的针对不同填充体积的主要干燥时间设定点进行冻干。
将组合物(表10所述)在4℃或40℃储存多至3个月，然后通过IM施用给小鼠(如实施例2所述)。利用实施例3所述HAI试验确定接种疫苗的小鼠体内的免疫应答。除了体内效力外，还对组合物进行了实施例4所述一些额外稳定性测试，包括：目测检测冻干饼块；通过sELISA测量抗原含量；和测量冻干饼块的水分含量。
表10
＊(2009-2010season；Sanofi Pasteur)是灭活三价裂解流感疫苗。每0.5ml单位剂量(2009-2010season；Sanofi Pasteur)包含有来源于以下每一种流感病毒毒株的HA抗原15μg：H1N1，A/Brisbane/59/2007；H3N2，A/Brisbane/10/2007和B/Brisbane/60/2008)(即，0.5ml中45μg总HA抗原)。
＊＊均质化后大概脂质浓度。
＊＊＊重构后大概脂质浓度。
＊＊＊＊囊泡形成脂质∶HA抗原的重量比。
#将抗原储液稀释两倍。
##使抗原储液浓缩两倍
###使用商品对照而无任何配制步骤
利用Karl Fischer试验确定组合物中的残余水分并且以按重量计水分百分比表示在表11中。在将较低脂质：抗原比的NISV组合物(30∶1和100∶1)的残余水分与较高脂质：抗原比的NISV组合物(300∶1)的残余水分进行比较时，存在显著差异。一般而言，较低脂质∶抗原比的NISV组合物(30∶1为2.87％，100∶1为1.81％)比较高脂质∶抗原比的NISV组合物(300∶1为1.53％或更低)具有更高的水分含量。我们还观察到300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物依赖于均质化过程中的脂质浓度的残余水分的差异。因此，以在均质化过程中较低脂质浓度制备的组合物具有1.21％至1.53％的残余水分含量(试验物品3、4、6)，而以均质化过程中较高脂质浓度制备的组合物具有0.54％至0.66％的较低残余水分含量(试验物品5和7)。不同的脂质∶抗原比和脂质浓度还可以表示为冻干饼块中的总脂质含量。利用这种脂质含量度量允许将脂质含量与残余水分关联起来，即低脂质含量冻干饼块具有高残余水分含量，而高脂质含量冻干饼块具有低残余水分含量。还将冻干饼块中的脂质含量与在4℃T＝0、T＝3个月和在40℃T＝3个月后饼块的外观进行比较。在T＝0，无论脂质含量如何，全部NISV组合物冻干饼块表现为白色、成形良好并且无微小崩解。在4℃T＝3个月，全部NISV组合物冻干饼块具有同样的观察结果。但是，在40℃T＝3个月，并非全部NISV组合物冻干饼块都表现完整，两种较低脂质含量的冻干饼块(即，试验物品1(1.35mg)和试验物品2(4.5mg))表现为有崩解和回熔，而即使是在该升高的温度下储存3个月后，全部较高脂质含量的冻干饼块(即，试验物品3-7(6.75mg或更多))依然表现为很完整。当使用均质化过程中的脂质浓度而不是脂质含量进行比较时观察到了相同的相关性：将试验物品1(2.7mg/ml)和试验物品2(9mg/ml)与试验物品3-7(13.5mg/ml或更高)进行比较。
表11
＊通过均质化过程中的脂质浓度并且减半计算，因为在冻干前加入了等体积蔗糖。
＊＊均质化后的大致脂质浓度
＊＊＊囊泡形成脂质：HA抗原的重量比
图11示出了未配制的商品(试验物品8)与300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(试验物品3)、100∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(试验物品2)和30∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(试验物品1)对比的体外HA抗原含量。如实施例4所述，将再水合组合物的等份在超速离心机中于4℃以24,000rpm离心20分钟，取出上清液和沉淀部分，萃取并且通过sELISA分析来确定抗原含量(或“体外效力，，)。确定四种组合物在T＝0和在40℃储存3个月后(40℃T＝3个月)的抗原含量。在40℃储存3个月后，未配制的商品对照(试验物品8)和最低脂质∶抗原比(30∶1)的NISV组合物(试验物品1)两者都通过sELISA检测到了显著的HA抗原损失。在40℃储存3个月后，商品仅保留了最初HA含量的70％，而最低脂质:抗原比(30∶1)的NISV组合物(试验物品1)仅保留了最初HA含量的40％。相比之下，尽管在40℃储存了3个月，但是较高脂质∶抗原比(100∶1和300∶1)的NISV组合物表现出HA抗原含量随时间非常低的损失。
图12示出了表10描述的全部NISV组合物(组1-7)对比未配制的对照(组8)在小鼠中的体内效力(如实施例3所述利用在第二次接种疫苗15天后取得的血清样品分析HAI效价)。示出的结果是(A)H1N1和(B)H3N2的，表明在T＝0时NISV组合物和未配制的对照全部具有相同的效率(H1N1的平均HAI效价：189.9，H3N2的平均HAI效价：177.5)。
图13示出了未配制的对照(组8)与300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(组3)、100∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(组2)和30∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(组1)对比在小鼠中的体内效力(如实施例3所述利用在第二次接种疫苗15天后取得的血清样品分析HAI效价)。全部组合物在4℃或40℃储存3个月后通过IM注射到小鼠体内。示出的结果是(A)H1N1和(B)H3N2的，表现为300∶1和100∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(组2和组3)在4℃或40℃储存多至3个月后同样有效，而未配制的对照(组8)和30∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(组1)在40℃储存相同的3个月后效力损失。
图13还示出了在均质化和重构过程中具有不同脂质浓度(低范围脂质浓度(组4)、中范围脂质浓度(组3)和高范围脂质浓度(组5))的300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物在小鼠中的体内效力(如实施例3所述利用在第二次接种疫苗15天后取得的血清样品分析HAI效价)。全部组合物在4℃或40℃储存3个月后通过IM注射到小鼠体内。示出的结果是(A)H1N1和(B)H3N2的，表现为中范围和高范围的NISV组合物(组3和组5)在4℃或40℃储存多至3个月后同样有效，而低范围脂质浓度的NISV组合物(组4)表现为在40℃储存相同的3个月时间后有很小的效力损失。低范围脂质浓度300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(均质化过程中13.5mg/ml脂质浓度)的脂质浓度比30∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(均质化过程中2.7mg/ml脂质浓度)高。
图13还示出了在均质化过程中具有不同脂质浓度而在重构过程中具有相同脂质浓度(低范围脂质浓度(组6)、中范围脂质浓度(组3)和高范围脂质浓度(组7))的300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物在小鼠中的体内效力(如实施例3所述利用在第二次接种疫苗15天后取得的血清样品分析HAI效价)。全部组合物在4℃或40℃储存3个月后通过IM注射到小鼠体内。示出的结果是(A)H1N1和(B)H3N2的，表现为中范围和高范围的NISV组合物(组3和组7)在4℃或40℃储存多至3个月后同样有效，而低范围脂质浓度的NISV组合物(组6)表现为在40℃储存相同的3个月时间后具有很小的效力损失。低范围脂质浓度300∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(均质化过程中13.5mg/ml脂质浓度)的脂质浓度比30∶1脂质∶抗原比的NISV组合物(均质化过程中2.7mg/ml脂质浓度)高。
其他实施方案
通过对本文公开的说明内容的理解或公开内容的实践，本公开内容的其他实施方案对于本领域技术人员将是很明显的。说明内容和实施例旨在仅用于举例，本公开内容的真实范围由所附的权利要求限制。本文所引用的全部引用内容都整体通过引用并入本文。
Claims (40)
1.一种免疫原性组合物，其包含：
流感病毒血凝素抗原，所述抗原选自甲型流感H1N1毒株、甲型流感H3N2毒株和乙型流感毒株中的至少一种；和
脂质囊泡，其中所述脂质囊泡由脂质构成，所述脂质在所述组合物中的存在量使得脂质：抗原的重量比为200∶1至400∶1，并且所述脂质包含5∶4∶1的摩尔比的1-棕榈酸单甘油酯、胆固醇和磷酸二鲸蜡酯，并且其中当在40℃储存6个月后，所述组合物比缺少所述脂质囊泡的参照组合物更稳定，并且
(i)其中所述组合物包含有一种或更多种含有所述流感病毒血凝素抗原的灭活流感病毒，
(ii)其中所述组合物包含有一种或更多种含有所述流感病毒血凝素抗原的减毒流感病毒，或者
(iii)其中所述流感病毒血凝素抗原作为裂解病毒抗原存在于所述组合物中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是液体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是干燥的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述脂质∶抗原的重量比为250∶1至350∶1。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述脂质：抗原的重量比为300∶1。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物在40℃储存6个月后其通过HAI试验确定的免疫原性改变低于50％。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物的免疫原性改变低于10％。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物在40℃储存6个月后其通过ELISA确定的抗原含量损失低于50％。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物的抗原含量损失低于10％。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物通过包括以下步骤的方法制备：
熔化所述脂质以产生熔融脂质；
将所述熔融脂质与包含所述流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和
使所得产物均质化，其中以在所得产物中实现200∶1至400∶1的脂质：抗原重量比的相对量合并所述熔融脂质和所述水溶液。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，将所述熔融脂质加入到包含所述流感病毒血凝素抗原的所述水溶液中。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中，将包含所述流感病毒血凝素抗原的所述水溶液加入到所述熔融脂质中。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述流感病毒血凝素抗原来自甲型流感H1N1毒株。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述流感病毒血凝素抗原来自甲型流感H3N2毒株。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述流感病毒血凝素抗原来自乙型流感毒株。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述流感病毒血凝素抗原来自甲型流感H1N1毒株、甲型流感H3N2毒株和乙型流感毒株中的两种或更多种。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述流感病毒血凝素抗原来自甲型流感H1N1毒株、甲型流感H3N2毒株和乙型流感毒株。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物包含等量的来自每一种毒株的流感病毒血凝素抗原。
19.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或更多种含有所述流感病毒血凝素抗原的灭活流感病毒。
20.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或更多种含有所述流感病毒血凝素抗原的减毒流感病毒。
21.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述流感病毒血凝素抗原作为裂解病毒抗原存在于所述组合物中。
22.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中存在的所述流感病毒血凝素抗原的至少一部分与所述脂质囊泡联合。
23.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中存在的所述流感病毒血凝素抗原的至少一部分包裹在所述脂质囊泡中。
24.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述佐剂包含TLR-4激动剂。
26.根据权利要求24所述的组合物，其中所述佐剂包含弱化的脂质A衍生物。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述佐剂包含脂质A的单磷酰基衍生物。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述佐剂包含脂质A的3-脱酰基单磷酰基衍生物。
29.根据权利要求24所述的组合物，其中所述佐剂包含TLR-7/8激动剂。
30.根据权利要求24所述的组合物，其中所述佐剂包含TLR-9激动剂。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物中存在的所述佐剂的至少一部分与所述脂质囊泡联合。
32.根据权利要求24至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物中存在的所述佐剂的至少一部分不与所述脂质囊泡联合。
33.根据权利要求24至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物通过包括以下步骤的方法制备：
熔化所述脂质和佐剂以产生熔融脂质；
将所述熔融脂质与包含所述流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和
使所得产物均质化，并且其中以在所得产物中实现200∶1至400∶1的脂质∶抗原重量比的相对量合并所述熔融脂质和所述水溶液。
34.根据权利要求24至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物通过包括以下步骤的方法制备：
熔化所述脂质以产生熔融脂质；
将所述熔融脂质与包含所述流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和
使所得产物均质化，其中将所述佐剂与所述脂质和包含所述流感病毒血凝素抗原的水溶液合并，并且其中以在所得产物中实现200∶1至400∶1的脂质∶抗原重量比的相对量合并所述熔融脂质和所述水溶液。
35.根据权利要求24至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物通过包括以下步骤的方法制备：
熔化所述脂质以产生熔融脂质；
将所述熔融脂质与包含所述流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和
均质化然后干燥所得产物，其中，在干燥前将所述佐剂加入到所得产物中，并且其中以在所得产物中实现200∶1至400∶1的脂质∶抗原重量比的相对量合并所述熔融脂质和所述水溶液。
36.一种制备权利要求1所述组合物的方法，所述方法包括：
熔化所述脂质以产生熔融脂质；
将所述熔融脂质与包含所述流感病毒血凝素抗原的水溶液合并；和
使所得产物均质化，其中以在所得产物中实现200∶1至400∶1的脂质：抗原重量比的相对量合并所述熔融脂质和所述水溶液。
37.根据权利要求36所述的方法，其中以在所得产物中实现250∶1至350∶1的脂质∶抗原重量比的相对量合并所述熔融脂质和所述水溶液。
38.根据权利要求36所述的方法，其中以在所得产物中实现300∶1的脂质∶抗原重量比的相对量合并所述熔融脂质和所述水溶液。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中将所述熔融脂质加入到包含所述流感病毒血凝素抗原的所述水溶液中。
40.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中将包含所述流感病毒血凝素抗原的所述水溶液加入到所述熔融脂质中。
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