CN103130893A - 己烯雌酚单链抗体筛选方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及己烯雌酚单链抗体的筛选方法及其应用，属于生物技术领域，该单链抗体是由核糖体展示鼠源天然抗体库中筛选出来的并进行了可溶性表达。本发明还涉及应用核糖体展示技术筛选己烯雌酚抗体的方法。本发明筛选出的己烯雌酚单链抗体可以应用于污染检测与研制快速检测己烯雌酚残留的免疫速测试剂盒及治疗相关疾病中的用途，为以后该物质的检测与研究奠定了基础。

Description

己烯雌酚单链抗体筛选方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种己烯雌酚单链抗体的筛选方法，属于生物技术领域，用于制备特异识别己烯雌酚的高效抗体与研制可以快速检测己烯雌酚残留的免疫速测试剂盒及治疗相关疾病的用途中。

背景技术

己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是第一个口服有活性的人工合成非甾体雌激素物质。目前在临床上主要用于治疗雌激素低下症及激素平衡失调引起的各种疾病以及用于治疗卵巢功能不全或垂体功能异常引起的各种疾病。在兽医临床上，DES主要用于治疗母猪乏情不孕、诱导母兔发情、治疗产蛋鸡停产、山羊育肥等。另外己烯雌酚在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显。但是，DES能够在动物源性食品如肝脏、肌肉、蛋、奶中残留，会在水源和土壤中富积，造成环境激素污染恶性循环，并通过食物链引发动物和人的癌变，引起少儿的发育早熟以及男性女性化等危害。现在国际癌症研究机构已经确认DES是经胎盘致癌的，并且把它列为人类致癌物质。针对上述情况，发展检测己烯雌酚残留的简便、快速、灵敏的方法是有效遏制滥用己烯雌酚的重要技术手段和维护法规制度的必要保障。免疫学分析方法检测DES具有快速简便的特点，而免疫分析方法检测需要有DES的特异性抗体。但是DES是小分子半抗原，免疫原性不强，通过传统的免疫动物的方法制备抗体较困难，制备的周期也较长。

基因工程抗体单链抗体(Singe chain variable fragment，ScFv)具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点。目前，主要应用核糖体展示技术和噬菌体展示技术来筛选和制备单链抗体。核糖体展示技术是一种完全不依赖于细胞的体外展示技术，文库库容量远远大于噬菌体单链抗体文库，此外核糖体展示技术还具有建库和筛选方法简便，便于引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点。天然抗体库的抗体基因来源于未经免疫的动物或人体B细胞。从理论上讲，能够代表所有初级B细胞含有的抗体基因的多样性，使用任何抗原都可能从中筛选到相应的抗体，具有较强的通用性。利用核糖体展示技术筛选针对小分子半抗原抗体的研究较少，尤其是从天然抗体文库中筛选更为少见。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种潜在的检测和医学用抗己烯雌酚单链抗体。

本发明的第二个目的提供一种抗己烯雌酚单链抗体的制备方法。

本发明的第三个目的提供抗己烯雌酚单链抗体在制备检测试剂盒中的用途。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提供的抗己烯雌酚单链抗体是从核糖体展示鼠源天然单链抗体库中筛选获得的并进行了可溶性功能表达。

本发明提供的抗己烯雌酚单链抗体的制备方法为：

1.核糖体展示鼠源天然单链抗体库的构建

从未经免疫的6-8周龄Balb/c、C57/BL6小鼠的脾细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA第一链后，扩增VH、VL基因片段，大小分别为380bp，350bp左右；合成(G4S)3linker，经序列测定，与理论序列完全一致。利用SOE-PCR构建单链抗体文库，大小为750bp，经序列比对，单链抗体的文库中有约80％的单链抗体都可以正确翻译，无移码突变和致死突变，无终止密码子；测序正确的单链抗体的互补决定区都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。

扩增出大小为102bp核糖体展示元件T(包括T7启动子，5’茎环，核糖体结合位点)和大小为298bp间隔序列P(噬菌体P蛋白部分序列)，含3’茎环，作为间隔序列，分别经序列测定，与理论序列完全一致。以重叠引物延伸法(splicing by overlap extension，SOE)将T片段与scfv文库连接，再将P片段与其拼接，构建成核糖体展示单链抗体文库，大小为1200bp左右。

其中小鼠可以是其他品系小鼠，优选几种品系小鼠的组合

其中连接VH、VL的链接linker为几个G4S的组合，优选(G4S)₃

其中核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子(T7启动、tac启动子等)，本发明优选原核启动子特别是T7启动子

2.抗己烯雌酚单链抗体的筛选

将构建的核糖体展示单链抗体文库进行体外转录翻译后，用己烯雌酚-BSA和己烯雌酚-磁珠作为抗原固相和液相交替筛选特异于己烯雌酚的单链抗体，通过改变Mg²⁺浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选儿轮的单链抗体DNA文库。经过七轮核糖体展示筛选后，RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加，说明筛选后的抗体文库中抗原阳性的抗体得到了富集。

可以采用己烯雌酚-BSA进行固相筛选，还可以采用己烯雌酚-磁珠进行固相筛选，优选交叉筛选。

Mg²⁺浓度根据筛选条件的严谨性不同进行调整。

3.抗己烯雌酚单链抗体的可溶性功能表达

将七轮筛选后单链抗体文库进行序列鉴定，其中有43株无致死突变，随机挑选26个克隆子，将单链抗体基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，在30KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中。

抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，优选pTIG-TRX。

标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。

4.抗己烯雌酚单链抗体的纯化与鉴定

将26株克隆子的表达上清液用间接ELISA和间接竞争ELISA分别鉴定，结果筛选出5株克隆子对DES有特异性的结合；对5株克隆子进行序列比对，结果表明CDR区有相似性，推断抗DES单链抗体的抗体识别位点相似。用SPR分析筛出的一株30-3的单链抗体的亲和力为3.79×10^-6M。利用Anti-His tag亲和层析柱对表达的单链抗体进行了纯化，使目的条带得到了明显的浓缩。

单链抗体的纯化可以采用离子交换层析、凝胶层析、金属螯合层析等，优选金属螯合层析法。

金属螯合层析发的金属可以选择Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺等，优选Ni²⁺离子。

本发明还可以提供一种测定环境和食品中己烯雌酚残留的检测试剂盒中的最关键检测试剂——抗体，尽管DES残留严重威胁着人体健康，但它在畜牧业上的应用，能带来一定的经济价值，这使得在社会上仍有非法使用现象。特别是，水产养殖中非法使用己烯雌酚的现象依然普遍存在。针对上述情况，发展检测己烯雌酚残留的简便、快速、灵敏的方法是非常必要的，本发明制备的己烯雌酚单链抗体可以部分取代测定食品和环境样品中己烯雌酚残留测定所需试剂。

本发明所制备的抗己烯雌酚单链抗体的优势在于：(1)利用己烯雌酚-BSA和己烯雌酚-磁珠作为抗原固相和液相交替筛选，可以克服BSA造成的干扰，可以获得DES高特异性的抗体；(2)所获得的单链抗体序列清楚，便于基因工程操作，易于在大肠杆菌中可以大量功能表达；(3)分子量小，免疫原性弱，为将来的临床应用奠定了基础。

附图说明

图1核糖体展示抗体库全长DNA电泳图.

M：分子量标准Marker  1-2：核糖体展示抗体库库DNA

图2PCR鉴定第四、五轮(A)、七轮(B)筛选后RT-PCR产物的阳性克隆子

A：1-10：第四轮筛选后PCR扩增获得的scfv DNA；13-22：第5轮筛选后PCR扩增获得的scfv DNA，11阳性对照，12为阴性对照，M为分子量标准

B.菌落PCR鉴定第七轮筛选后RT-PCR产物的阳性克隆子，1为阳性对照，2为阴性对照，M为分子量标准，3-24为：第四轮筛选后PCR扩增获得的scfv DNA

图3Western-blot分析表达的单链抗体

1，2：SDS-PAGE诱导后全细胞裂解物；3，4：Western blotting分析诱导后的全细胞裂解物5，6：Westernblotting分析诱导后的全细胞裂解物上清

图4七轮筛选后经测序得到的43株正确序列里随机挑选26株克隆子表达后ELISA测定单链抗体活性

图5单链抗体竞争结合DES的竞争ELISA分析.

图6SPR分析抗DES单链抗体30-1梯度稀释后与抗原结合

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。

实施例1核糖体展示鼠源单链抗体的构建

一.RNA提取与cDNA的合成

取6周龄健康BALB/c小鼠，C57/BL6小鼠各3只，雌雄各半。TRIZOL法提取脾细胞总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA。

二.VH、VL基因的扩增

1.引物设计：

VH/for扩增重链VH可变区上游引物：

VH/for 5’TATATCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAG 3’

VH/back扩增重链VH可变区下游引物：

VH/back 5’TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CC 3’

VL/for扩增重链VH可变区上游引物：

VL/for 5’GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA 3’

VL/back扩增重链VH可变区下游引物：

VL/back 5’CGCG GTTGCGGTCCG TTT BAK YTC CAR CTT KGT SCC 3’

简并引物中各种核苷的单字母表示法：M＝A or C R＝A or G；S＝G or C；W＝A or T；B＝T or C，G；K＝T or G；Y＝C or T。

Liner：

5‘ACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCTGACATCGAGCTCACTCAG-3’

扩增连接肽的上下游引物：

GS/for 5’ACGGTCACCGTCTCCTCA 3’

GS/back 5’CTGAGTGAGCTCGATGTC 3’

2.VH基因片段PCR扩增体系：

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸1min；30cycles；72℃延伸7min；4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，胶回收目的片段。

3.VL基因片段PCR扩增体系和扩增条件

VL基因片段PCR扩增体系

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；63℃退火30s；72℃延伸1min；30cycles；72℃延伸7min；4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，胶回收目的片段

4.linker连接片段PCR扩增体系

反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火20s；72℃延伸30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，胶回收目的片段。

三.scFv文库的构建

将回收的VH、VL基因片段与测序正确的linker片段利用SOE-PCR的方法构建成scfv文库，得到750bp大小的片段。SOE-PCR的反应体系和反应条件如下：

上述体系的反应条件是：94℃预变性5min；94℃变性30s；72℃退火延伸1min40s；15cycles；72℃延伸7min；向其中加入引物VH/back、VL/for各1μL，94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min20s；20cycles；72℃延伸7min；4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，可见到约1200bp的片段(图1)，胶回收目的片段。

实施例2己烯雌酚单链抗体的筛选

一.固相亲和筛选

这一步骤中所有的试剂瓶、试剂以及酶标板都要用DEPC水处理，以保证没有RNase污染。

(1)包被筛选孔：取DES-BSA包被原用灭菌的碳酸盐缓冲液稀释至20μg/mL，在酶标板上每孔加入100μL，于4℃包被过夜；

(2)倾去包被液，用灭菌PBS洗涤封闭孔3次，每次3min。然后用冷的WBT洗涤两次，每次3min。最后，用冷的WBT注满筛选孔，冰上放置至少20min；

(3)取冰上放置的翻译产物(采用promega Escherichia coli(E.coli)S30 Extract System体外翻译)转移到准备好的筛选孔中，在冰室中轻轻振摇1小时。使体外翻译产物和固相DES-BSA充分结合，捕获scfv-核糖体-mRNA复合物。

(4)倾去孔中残液，以冰预冷的WBT洗3次，每次1min。

(5)向孔中加入100μl冰预冷的洗脱缓冲液缓冲液EB(含有5U的Rnasin inhibitor)，继续冰上轻轻振摇10min，使核糖体大小亚基分离，释放mRNA。

(6)重复5步骤。

(7)将两次洗脱液都加入Dnase I，37℃孵育15min，以去除DNA模板。将得到的mRNA液氮保存或立即纯化。

二.液相亲和筛选

(1)取100μL的偶联好的磁珠，用灭菌PBS洗涤封闭孔3次，每次3min。然后用冷的WBT洗涤两次，每次3min，将磁珠放入冰室中若干分钟，使磁珠冰冷。

(2)将体外翻译产物溶液加入冰冷的磁珠中，在冰室中轻轻振摇1小时。

(3)使用磁力架将液体去掉，其余步骤同一.固相亲和筛选的(4)-(7)。

三.模板的重新构建与下一轮筛选

(1)采用Qiagen公司的RNeasy clean up kit纯化筛选得到的mRNA，用M-MLV First Strand Synthesis Systemfor RT-PCR(Invitrogen，USA)，进行反转录，并进一步PCR扩增获得scFv文库，并与T，P片段依次偶联，构建下一轮完整的核糖体展示文库。

将四轮，五轮和七轮筛选后得到的RT-PCR产物分别连接到克隆载体pMD18-T上，转化到大肠杆菌中，随机挑选阳性克隆子进行测序鉴定。测序结果可知随着筛选轮数的增加，突变率也增加。在第七轮筛选后，测序结果显示有60％的文库序列发生了突变，但是CDR区多样性变小，出现了较高的相似性。证明特异性的序列高度富集(图2)。

实施例3抗己烯雌酚单链抗体的功能表达、纯化与鉴定

一.抗己烯雌酚单链抗体的功能表达

1.筛选后单链抗体基因的扩增

将经测序翻译完全正确的26株单链抗体基因用重新设计的含有酶切位点的引物扩增。从pMD18-T-scfv克隆载体上扩增得到带有酶切位点的scfv基因。引物SF-Trx-EcoRI和SR-Xhol-1分别含有EcoRI、XhoI酶切位点。

SF-Trx-EcoRI(引入EcoI酶切位点)：CGCGAATTCTAAATGGCCCAGGT

SR-XhoI-1(引入XhoI酶切位点)：AATCTACTCGAGCGCGGTTGCGGTCCGTTT

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min20s；10cycles；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸1min20s；20cycles；72℃延伸7min；4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，胶回收目的片段。

2.重组scfv原核表达质粒构建：

用EcoRI、XhoI双酶切质粒pTIG-TRX。酶切体系50μL：EcoRI 2.5μL，XhoI 2.5μL，10×buffer 5μL，ddH₂O 10μL；质粒pTIG-TRX 30μL。37℃过夜酶切。1.5％琼脂糖凝胶电泳，将EcoRI、XhoI双酶切纯化的scfv片段和同样酶切的质粒pTIG-TRX用T4DNA连接酶连接，连接体系：pTIG-TRX 1μL，scfv 3μL，dd H₂O 4μL，混匀后45℃温浴5min，立即放入0℃。再加入T4连接酶(Takara)1μL，10×buffer 1μL，16℃连接3h。转化宿主菌BL21(DE3)。

3.单链抗体蛋白的诱导表达

将步骤二鉴定的阳性菌落接种于5ml含Amp的LB液体培养基，37℃，200r/min振荡培养过夜，次日将过夜培养的菌液按1∶100的比例重新转接于5mL含Amp的LB液体培养基，并设阴性对照，30℃振荡培养至A₆₀₀约为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，然后继续振荡培养，诱导4h。离心收集菌体，用稀释的结合缓冲液50mL吹打离心后菌体，用超声细胞破碎机进行破碎至菌液清亮，于冷冻离心机离心后，10000r/min离心20min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，并进行Western Blot的检测，如图3所示，目的表达产物抗DES单链抗体主要在上清中存在，可以与鼠抗6×His标签单克隆抗体结合。

二.抗己烯雌酚单链抗体的鉴定

1.单链抗体结合活性的检测

从测序完全正确的43株单链抗体中随机挑选26株用于大肠杆菌的表达，将表达上清都进行间接ELISA的测定，筛选出与DES有结合活性的表达菌株的上清液。使用DES-OVA包被酶联孔，并同时包被相同浓度的OVA，将上清液稀释四个梯度作为一抗溶液，抗his的单克隆抗体作为二抗，羊抗鼠-HRP作为酶标二抗，TMB显色后，酶标仪测定450nm，将DES-OVA的值减去OVA的值作为单链抗体与DES结合的吸光值。如图4所示，为26株表达上清液与DES结合的吸光值的柱形图，以空质粒的表达上清为对照。

2.筛选后单链抗体的竞争活性的检测

将经过间接ELISA分析的26株菌的表达上清液进行竞争ELISA分析，以DES-OVA为包被抗原，用10％的甲醇溶液稀释DES可溶性半抗原作为竞争小分子，浓度为0.5-500000ng/ml。经竞争ELISA分析，可知其中有五株有明显的OD值的变化。

3.单链抗体的纯化

经过竞争ELISA分析，将具有能与DES特异结合的单链抗体30-3进行亲和层析，将30-3上清液经Ni柱进行蛋白分离纯化，蛋白通过其带有的6x His·tag与Ni²⁺离子之间的螯合作用，特异性吸附于层析柱上，经洗脱后可见在目的蛋白大小出有明亮的条带。

4.SPR分析单链抗体的亲和力

30-3的上清液做5个梯度的稀释与芯片表面固定的DES-OVA反应30min，SPR分析抗体亲和力。图6为SPR分析单链抗体梯度稀释后与抗原作用情况。经过洗脱后，通过角度的变化可知单链抗体与包被抗原有结合。用数据采集软件Autolab ESPRIT Data Acquisition 4.3，数据分析软件Kinetic Evaluation5.0，测定其动力学常数。K_D经过计算是3.79×10^-6M。

Claims (8)

1.一种抗己烯雌酚单链抗体，其特征在于可以特异识别小分子物质己烯雌酚

2.权利要求1抗己烯雌酚单链抗体制备方法，由如下步骤组成：

(1)核糖体展示鼠源天然单链抗体库的构建

从未经免疫的6-8周龄Balb/c、C57/BL6小鼠的脾细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA第一链后，扩增VH、VL基因片段，大小分别为380bp，350bp左右；合成(G4S)3linker，经序列测定，与理论序列完全一致。利用SOE-PCR构建单链抗体文库，大小为750bp，经序列比对，单链抗体的文库中有约80％的单链抗体都可以正确翻译，无移码突变和致死突变，无终止密码子；测序正确的单链抗体的互补决定区都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。

扩增出大小为102bp核糖体展示元件T(包括T7启动子，5’茎环，核糖体结合位点)和大小为298bp间隔序列P(噬菌体P蛋白部分序列)，含3’茎环，作为间隔序列，分别经序列测定，与理论序列完全一致。以重叠引物延伸法(splicing by overlap extension，SOE)将T片段与scfv文库连接，再将P片段与其拼接，构建成核糖体展示单链抗体文库，大小为1200bp左右。

(2)抗己烯雌酚单链抗体的筛选

将构建的核糖体展示单链抗体文库进行体外转录翻译后，用己烯雌酚-BSA和己烯雌酚-磁珠作为抗原固相和液相交替筛选特异于己烯雌酚的单链抗体，通过改变Mg²⁺浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选儿轮的单链抗体DNA文库。经过七轮核糖体展示筛选后，RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加，说明筛选后的抗体文库中抗原阳性的抗体得到了富集。

可以采用己烯雌酚-BSA进行固相筛选，还可以采用己烯雌酚-磁珠进行固相筛选，优选交叉筛选。

Mg²⁺浓度根据筛选条件的严谨性不同进行调整。

(3)抗己烯雌酚单链抗体的可溶性功能表达

将单链抗体基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定，在30KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中。

抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，优选pTIG-TRX。

标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。

(4)抗己烯雌酚单链抗体的纯化与鉴定

将26株克隆子的表达上清液用间接ELISA和间接竞争ELISA分别鉴定，结果筛选出5株克隆子对DES有特异性的结合；用SPR分析筛出的一株30-3的单链抗体的亲和力为3.79×10^-6M。利用Anti-His tag亲和层析柱对表达的单链抗体进行了纯化。

3.权利要求2中所述小鼠可以是其他品系小鼠，优选几种品系小鼠的组合。

4.权利要求2中所述连接VH、VL的链接linker为几个G4S的组合，优选(G4S)₃。

5.权利要求2中所述核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子(T7启动、tac启动子等)，优选原核启动子特别是T7启动子。

6.权利要求2中所述筛选方法可以采用己烯雌酚-BSA进行固相筛选，还可以采用己烯雌酚-磁珠进行固相筛选，优选在不同筛选轮次中采用不同方法交叉筛选。

7.权利要求2中所述抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，并根据载体不同选择不同表达宿主，优选pTIG-TRX载体。

8.权利要求2中所述标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。

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