CN103153334B - 包含pga的新的emd制剂 - Google Patents
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Abstract
釉基质衍生物(EMD)蛋白和釉基质蛋白因其促进软组织和硬组织再生并降低炎症和感染而广泛用于临床牙科。本发明涉及意料不到的发现，即包含纯化的釉基质衍生物(EMD)蛋白和/或釉基质蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂随时间推移更稳定，尤其pH随时间推移更稳定，其中所述已灭菌PGA获自重量平均分子量(MW0)介于250‑500 kDa的未灭菌PGA。
Description
发明的技术领域
本发明涉及包含纯化的釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白的药物、牙科和/或美容制剂。具体地讲，本发明涉及稳定制剂，所述制剂包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和重量平均分子量为至少130 kDa的已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)。
背景技术
存在于釉基质中的釉基质蛋白，作为釉质的前体最为人所熟知。在牙骨质形成之前，釉基质蛋白在发育中的牙根顶端的齿根表面上沉积。有证据显示，沉积的釉基质是牙骨质形成的引发因素。此外，牙骨质的形成在本质上与牙周韧带和牙槽骨的发育有关。釉基质蛋白因此可通过模拟牙的天然附着发育而促进牙周再生(Gestrelius S, LyngstadaasSP, Hammarström L. Emdogain - periodontal regeneration based on biomimicry(Emdogain——基于仿生学的牙周再生). Clin Oral Invest 4:120-125 (2000))。
分离的釉基质蛋白不仅能够诱导在釉基质附近发育的组织中天然存在的一个因子，而且能够诱导精心安排的因子级联。它们模拟发育组织的天然环境，因此模拟组织再生、细胞分化和/或成熟的天然刺激。
来自猪釉基质蛋白质的纯化的酸提取物形式的釉基质衍生物(EMD)，以前曾成功用于恢复患有严重牙附着丧失的患者的功能性牙周韧带、牙骨质和牙槽骨(Hammarström等，1997，Journal of Clinical Periodontology 24，658-668)。
已经表明釉基质衍生物(EMD)制剂促进牙周再生(Hammarström等，1997，Journalof Clinical Periodontology 24，669-677)。在该研究中使用不同的制剂，目的是为了弄清楚结果是否会因所用的制剂而不同。该研究表明，当将EMD溶于PGA时，得到最令人满意的结果。
例如，US 5098891首次描述了用于通过在含有来源于牙釉质前体(所谓的釉基质)的蛋白质部分作为活性组分的至少一个部分上再生出矿化组织，而用于诱导矿化组织部分之间的结合的组合物。
此外，在对培养的牙周韧带细胞(PDL)的研究中，表明了当EMD存在于培养物中时，这些细胞的附着率、生长和代谢显著增加。此外，暴露于EMD的细胞显示当与对照相比时，胞内cAMP信号转导和生长因子的自分泌产生增加。另一方面，虽然当EMD存在时，cAMP信号转导和生长因子分泌增加，但是上皮细胞的增殖和生长两者被抑制(Lyngstadaas等, 2001,Journal of Clinical Periodontology 28, 181-188)。
以前在专利文献中描述了釉基质蛋白和釉基质衍生物(EMD)蛋白能够诱导硬组织形成(即釉质形成，美国专利号4,672,032 (Slavkin))；支持硬组织间的结合(EP-B-0 337967和EP-B-0 263 086)；促进开放性创伤(例如皮肤和粘膜的开放性创伤)愈合；对感染和炎性疾病的治疗具有有益作用(EP-B-1059934和EP-B-1153610)；诱导牙质再生(WO 01/97834)；促进移植物的接纳(take) (WO 00/53197)；在肿瘤治疗中诱导细胞凋亡(WO 00/53196)；调节对全身感染或炎症的免疫应答中的失衡(WO 03/024479)，并且有助于填充手术(procedure)和/或创伤(例如细胞减少性手术)后的创伤腔和/或组织缺陷(WO 02/080994)。
EMD由多种蛋白质组成，例如珐琅蛋白、釉蛋白(enamelin)、tuft蛋白、蛋白酶和白蛋白。珐琅蛋白，一种EMD的主要组分，至少高达60%-90%，例如70-90%，是通过可变剪接和受控分泌后加工而可来源于单个基因的疏水蛋白质的家族。它们在整个脊椎动物进化中是高度保守的，在所有已研究的高等脊椎动物(80%)中显示高的序列同源性整体水平。实际上，猪和人珐琅蛋白基因转录物的序列仅在4%的碱基中不同。因此，釉基质蛋白和/或EMD蛋白虽然来源于猪，但当在人体中遇到时仍被视为是“自身”的，可在不引发变态反应或其它不良反应的情况下促进人的牙再生。釉基质衍生物蛋白(EMD)是最有名的釉质的前体。其用PGA增稠的水溶液以商品名Straumann® Emdogain市售。在Straumann® Emdogain Plus中还可找到用PGA增稠的釉基质衍生物蛋白(EMD)水溶液。
为了将EMD保持在水溶液中，该溶液应具有充分低于蛋白质等电点(IEP)的pH，对于EMD，IEP为pH 6.5，因此，更优选的是溶液的pH <5.0。为了易以应用，该溶液用PGA增稠。
在化学上，PGA是海藻酸的酯，海藻酸来源于海藻(海草)。一些羧基被丙二醇酯化，一些被合适的碱中和，而一些保持游离。PGA本身是酸性的，在将PGA溶于EMD溶液后pH下降。在酸性条件下，由于PGA降解所致pH继续下降。混合物的耐久性取决于EMD能够沉淀在牙齿表面上的pH值。认为沉淀发生在生理条件下，即接近IEP的pH下。牙根环境和EMD-PGA混合物两者的pH和缓冲能力影响EMD蛋白的沉淀行为，用PGA配制的EMD溶液的接近IEP的pH和较低的缓冲能力有利于沉淀。
D.J. McHugh在HYPERLINK http://www.fao.org/docrep/x5822e/x5822e04.htm中描述了藻酸酯的聚合度(DP)是分子的平均分子量的衡量，并且是每平均链中糖醛酸单元的数目。DP和分子量与藻酸酯溶液的粘度直接有关；贮存时粘度的损失是藻酸酯解聚程度的衡量。
PGA以不同等级产生，等级通常描述为低、中和高粘度藻酸酯(是指2%水溶液中的粘度)。PGA藻酸酯的分子量越高，其溶液的粘度越大。生产商可通过改变提取条件的严格性来控制分子量(聚合度，DP)，他们提供范围为10-1000 mPa.s (1%溶液)，DP范围为100-1000单位的产品。粘度200-400 mPa.s (“中等粘度”)的PGA，可能得到最广泛的应用。已知比起具有低DP的PGA，具有高DP的PGA较不稳定。将低粘度PGA (至多约50 mPa.s)贮存在10-20℃下，3年无可观察得到的变化。中等粘度藻酸钠(至多约400 mPa.s)显示在25℃下1年后损失10%，在33℃下在一年后损失45%，较高粘度藻酸酯甚至更不稳定。
丙二醇藻酸酯显示在25℃下在一年后粘度损失约40%，并且还变得较不稳定。藻酸铵一般比上述任一种都较不稳定。海藻酸是所述产品中最不稳定的，且在环境温度下在几个月内，任何长链材料都降解成较短的链。然而，包含短链材料的藻酸酯是稳定的，且DP为约40单位糖醛酸/链的海藻酸在20℃温度下一年内将显示极少的变化。然而，海藻酸的主要用途，作为药物片剂中的崩解剂，取决于当浸湿时其膨胀的能力，并且这不受DP变化的影响。市售藻酸酯应保存在阴凉处，即在25℃或更低的温度下，因为高温可引起显著解聚，影响商业上的有益性质，例如粘度和胶凝强度。所述藻酸酯通常含有10-13%水分，解聚速率随水分比例增加而增加，因此贮存区应是干燥的。
如上所述，预先将EMD蛋白在具有PGA的水溶液中配制，其中PGA的降解提供酸性产品，其进而随时间推移而降低pH。在高温下，降解加快。为了避免产品酸化加快并因此限制该作用，不得不将产品在低温下即在2-8℃的温度范围内运输和保存。虽然如此，已知市售可获得的具有PGA的Straumann® Emdogain制剂中EMD的稳定性仍随时间推移而快速下降。
发明概述
釉基质衍生物(EMD)蛋白和釉基质蛋白因其促进软组织和硬组织再生并减少炎症和感染的能力而广泛用于临床牙科。
Straumann® Emdogain是市售可获得的产品，其由藻酸酯载体、丙二醇藻酸酯(PGA)和猪釉基质衍生物(EMD)蛋白组成，并用于治疗牙周病，而且已被再三证实促进硬组织和软组织再生，并减少牙周手术后炎症。用于制造Straumann® Emdogain的PGA的粘度为50-175 mPa.s (在2%水溶液中，22℃ Brookfield粘度)，即“较低粘度”。由于pH随时间推移快速降低所致，该制剂遭受稳定性的缺乏。
因此，为了避免制剂酸化加快，该制剂不得不在在低温下即2-8℃范围的温度贮存和运输。
本发明涉及出人意料的发现，即包含纯化的釉基质衍生物(EMD)蛋白和/或釉基质蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂随时间推移更稳定，尤其制剂的pH随时间推移更稳定，其中所述已灭菌PGA可由对重量平均分子量(MW0)介于250-500kDa的未灭菌PGA进行电子束灭菌而获得。
附图
图1. 自2002到2009以来未加工PGA和Kelcoloid® O (PGA)的重量平均分子量(MW)
图2. PGA的酸催化水解的反应流程
图3. Straumann® Emdogain的pH对比在2-8℃下的贮存时间
图4. Straumann® Emdogain的pH对比在不同温度下的贮存时间
图5. 在2-5℃范围内准一级反应速率常数对PGA浓度的依赖性。
图6. 通过Pollulan校准标准的GPC所测量的，PGA的重量平均分子量的阈值可超过135 kDa (图6A)和超过140 kDa (图6B)。
图7. 作为灭菌电子束剂量的函数的比较性Manucol® ester B - Kelcoloid® O.摩尔质量(MW)。
图8. 该图显示PGA浓度和Straumann® Emdogain的耐久性之间的关系—pH规格(spec) (3.5)决定的Emdogain的保存期限相对已灭菌PGA (即电子束灭菌的PGA)浓度。
图9. 该图显示当已灭菌PGA的MW大小135 kDa例如185 kDa时已灭菌PGA的分子量(MW)与Emdogain的贮存稳定性之间的关系。使用MW为117 kDa的已灭菌PGA作为参比。
图10. 该图显示当已灭菌PGA的MW为135 kDa时已灭菌PGA的MW与Emdogain的贮存稳定性之间的关系。
定义
ALG在本文中用作未灭菌PGA的缩写。
ALGS在本文中用作已灭菌PGA的缩写，所述已灭菌PGA已通过使用电子束灭菌。
在本文情况下，“受试者”涉及任何脊椎动物，例如鸟、爬行动物、哺乳动物、灵长类动物和人。
PGA有几个不同的名称：丙二醇藻酸酯、藻酸羟丙酯、丙烷1,2-二醇藻酸酯或E405。
在本文情况下，“制剂”可用“组合物”替换。
在本文情况下，“e-束”意指电子束，亦称阴极射线，其为电子流。电子束灭菌用作灭病媒法。
在本文情况下，术语未灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)欲包括食品级PGA、未加工PGA、医用级PGA和工业级PGA。
已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)在本文中优选获自对重量平均分子量(MW0)为至少250kDa、例如介于250-500 kDa之间的未灭菌PGA进行电子束灭菌。已灭菌PGA可备选地和可替换地获自对起始重量平均分子量(MW0)为至少250 kDa的未灭菌PGA进行电子束灭菌。所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如介于130-500 kDa之间。
在本文情况下，可通过制备未灭菌PGA，并使用范围为约25-30 kGy的剂量进行灭菌，来实现灭菌，所述剂量应至少为25 kGy。灭菌方法包括以下步骤：1)选择无菌保证水平(sterility assurance level，SAL) (10-6)，2)计算待灭菌样品的总生物负荷(bioburden)，3)使用电子束对样品进行灭菌。电子束剂量的选择根据步骤2)的计算。该方法按照ISO 11137-2 (2006)的建议。术语“无菌保证水平”是在灭菌后制品中出现单个活的微生物的概率，而术语“生物负荷”是产品上或产品中活的微生物数目。所述PGA作为粉末被灭菌，并且在无菌环境下将所得产品与赋形剂混合。或者，在无菌环境下将未灭菌PGA粉与赋形剂混合，然后灭菌。然而，如本领域技术人员所了解的一样，可采用其它普遍已知的灭菌方法对未灭菌PGA或包含未灭菌PGA的混合物进行灭菌。
在本文整篇中要了解的是，即使给出了确切的值，这些值还包括这些值的推导值(derivations)。
在本发明中，采用Pollulan摩尔质量标准，通过尺寸排阻色谱法测定PGA (已灭菌和未灭菌的两者)的重量平均分子量，然而，如本领域技术人员所了解的一样，当采用其它方法(例如普适标定、特性粘度测定等)测定时，重量平均分子量可用其它术语指定，并具有其它值。
发明详述
本发明涉及出人意料的发现，即包含纯化的釉基质衍生物(EMD)蛋白和/或釉基质蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂随时间推移更稳定，尤其pH随时间推移更稳定，其中所述已灭菌PGA获自起始重量平均分子量(MW0)介于250-500 kDa之间的未灭菌PGA。所述已灭菌PGA的重量平均分子量大于130 kDa，例如介于130-500 kDa之间。已灭菌PGA可获自电子束灭菌。
用于制造之前已知的包含纯化的釉基质衍生物(EMD)蛋白和/或釉基质蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的制剂的PGA的粘度为50-175 mPa.s (2%水溶液，22℃Brookfield粘度)，即它具有“较低粘度”。甚至在低温下，由于pH随时间推移快速降低所致，这些制剂遭受稳定性的缺乏。因此，为了避免产品酸化加快，产品不得不在低温即2-8℃范围的温度下贮存和运输。
此外，所述PGA的起始重量平均分子量介于210至245 kDa之间，意味着约230 kDa或不超过245 kDa (参见表1)。
现已出人意料地发现，包含具有高的重量平均分子量的已灭菌丙二醇藻酸酯分子(PGA)的制剂更稳定且具有较少温度敏感性的pH。这导致随时间推移贮存更稳定的制剂。具有高的重量平均分子量的丙二醇藻酸酯的实例是以商品名Kelcoloid® O、Kelcoloid® NF和Manucol® Ester M销售的丙二醇藻酸酯。Kelcoloid® O批号9B02535是具有高的重量平均分子量的丙二醇藻酸酯分子的另一实例。
除Kelcoloid® O以外，还有可获得的不同等级的Kelcoloid®:s例如具有以下产品名称的Kelcoloid®：Kelcoloid® HVF、Kelcoloid® LVF和Kelcoloid® S。按照其产品清单，等级主要因在水溶液中彼此的粘度、酯化度和pH而不同。所述PGA的酯化度高，例如超过70，例如超过80。
本发明基于这样的出人意料的发现，即满足所有药典要求且具有相同的粘度、相同的起始pH和大致相同的羧基酯化程度的不同PGA(其在Straumann®Emdogain制剂和Straumann® Emdogain Plus制剂中被使用或将被使用)可导致随时间推移的不同贮存稳定性。这种出人意料的发现是由于(owns to)：最终产品的pH稳定性取决于所用与PGA的重量平均分子量有关的PGA的品质。因此，出人意料地发现了酸催化的PGA的水解速率与载体PGA的重量平均摩尔量之间的关系。
因此本发明基于这样出人意料的发现，即可通过仔细选择用于所述制剂的PGA等级来获自较稳定和较长保存期限的制剂。此外，本发明基于这样的发现，即包含纯化的釉基质衍生物(EMD)蛋白和/或釉基质蛋白和具有比以前所用PGA高的起始重量平均分子量的PGA的制剂将较稳定并具有较长久的耐久性。
因此，可通过本发明的制剂和使用特定品质的PGA而避免的一个问题是可保证所述制剂的贮存期和耐久性。从经济观点来看，指定和测量用于制剂的PGA的分子量是有利的，从而使制剂包装的有效期限保持长久。
现已发现，具有较高重量平均分子量(MW)，即当灭菌时重量平均分子量超过130kDa、例如重量平均分子量为130-500 kDa、130-450 kDa、130-420 kDa、200-450 kDa或130-250 kDa范围的PGA的品质，在包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白的制剂中是合乎需要的。所述重量平均分子量还可为130-550 kDa的范围。重量平均分子量也可超过130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。
pH稳定性是包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和PGA的制剂最重要的参数，并且影响产品的耐久性，而且还对运输有重大影响，即考虑温度和时间如何运输制剂。pH随时间推移而降低，而且降低的速度将如何影响制剂的耐久性，pH降低得越快，制剂降低其稳定性也就越快。
此外，还出人意料地发现，在包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白的制剂中使用具有较高重量平均分子量的PGA，将为所述制剂提供更好的增稠(凝胶形成)性能。此外，使用具有较高重量平均分子量的PGA将为所述制剂提供更好的pH稳定性，因为需要较低浓度的PGA。按照本发明，在所要求保护的制剂中，已灭菌PGA的浓度不超过6重量/体积% (w/v%)。此外，已灭菌PGA的浓度范围为3-6% w/v，例如3-5% w/v、例如3-4% w/v。此外，已灭菌PGA的浓度为例如3、3.5、4、4.5、5、5.5或6% w/v。
本发明因此涉及稳定的(例如贮存稳定的)包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述制剂包含不超过6重量/体积% (w/v%)、例如范围为3% w/v-6% w/v的已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)，其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa，例如介于130 - 250kDa的范围。
具体地讲，所述药物、牙科和/或美容制剂是一种制剂，其中釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白包含至少60-90%珐琅蛋白，例如至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、80或90%，其具有选自以下的平均分子量：介于18与25 kDa之间、介于20与24 kDa之间、介于20与22 kDa之间以及20 kDa。
与目前可获得的包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白的类似制剂相比，本发明的药物、牙科和/或美容制剂随时间推移更稳定，即它在至少18个月、例如至少24个月、例如18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个月的时间内，优选在2-8℃的温度范围内，具有大于pH 3.5的pH值，然而也可采用更高温度。按照本发明的一个实施方案，本发明的药物、牙科和/或美容制剂是稳定的，即它在至少34个月、例如至少36个月的时间内，具有大于pH 3.5的pH值。
与目前可获得的包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白的类似制剂相比，本发明的药物、牙科和/或美容制剂随时间推移更稳定，即它在至少18个月、例如至少24个月的时间内，具有超过pH 3.5的pH值。本发明的制剂优选保持在2-8℃的温度范围内。然而，本发明的制剂也可保持在更高温度下。
已灭菌PGA通过对未灭菌PGA进行电子束灭菌而获得。因此，在一个实施方案中，本发明特别涉及包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述已灭菌PGA获自对起始重量平均分子量(MW0)为至少250 kDa的未灭菌PGA进行电子束灭菌，例如获自对具有范围为250-500 kDa的起始重量平均分子量(MW0)的未灭菌PGA进行电子束灭菌。在本文情况下，所施用的电子束灭菌剂量选自约25-30 kGy的剂量范围，所述剂量至少为25 kGy。
此外，本发明首次公开并因此涉及产生药物、牙科和/或美容制剂的方法，所述方法的特征在于从发育中的哺乳动物的牙中分离釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白，对起始重量平均分子量(MW0)大于250 kDa的未灭菌PGA进行电子束灭菌，并将两种组分混合。
因此，本发明还涉及包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂，所述已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa，其中所述制剂通过以下方法产生，包括：从发育中的哺乳动物牙中分离釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白，对起始重量平均分子量(MW0)范围为250-500 kDa的未灭菌PGA进行电子束灭菌，并将两种组分混合。
在一个实施方案中，本发明涉及经电子束灭菌的起始重量平均分子量(MW0)范围为250-500 kDa的未灭菌PGA在制备包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂中的用途，其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa、例如大于或等于135 kDa、例如大于或等于185 kDa，且其中在至少18个月、例如至少24个月、例如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个月的时间内，所述制剂具有大于3.5的pH值。该制剂优选保持在2-8℃范围的温度。然而，也可使用更高温度。
本发明还涉及经电子束灭菌的起始重量平均分子量(MW0)范围为250-500 kDa的未灭菌PGA在制备包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂中的用途，其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa、例如至少135 kDa、例如至少185 kDa，且其中所述制剂在至少18个月、例如至少24个月的时间内具有大于3.5的pH值。该制剂优选保持在2-8℃范围的温度。然而，也可使用更高温度。
以基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和已灭菌PGA但不包括其它赋形剂的总的组合重量计，本发明的药物、牙科和/或美容制剂包含范围为93%-约98%、94%-约97%和95%-约96%重量/体积的釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白。
本发明还涉及包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和PGA或者两种或更多种本文定义的EMD蛋白的组合的药物制剂，其中灭菌前，PGA的重量平均分子量(MW0)范围为250-500 kDa。这类药物制剂任选还包含药学可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明的药物、牙科和/或美容制剂还包含至少两种表面稳定剂，其可选自阴离子表面稳定剂、阳离子表面稳定剂、两性离子表面稳定剂和离子型表面稳定剂。
本发明的药物、牙科和/或美容制剂可用于医学。对于这类预期应用，可配制所述制剂用于选自以下的任何给药途径(administration)：口服、经肺、直肠、眼、结肠、胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部、口腔、经鼻和局部给药。按照其预期的给药途径，将制剂配制成选自以下的剂型：液体分散体、口服混悬剂、凝胶剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂、控释制剂、速溶制剂、冻干制剂、片剂、胶囊剂、迟释制剂、延释制剂、脉冲释放制剂及即释和控释混合制剂。
此外，本发明的药物、牙科和/或美容制剂可包含一种或多种药学可接受的赋形剂、药学上可接受的载体或其组合以及一种或多种非釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白活性剂。
在本文情况下，药物制剂还包含美容组合物以及属于介于药物与美容品间的所谓灰色区域即药用美容品(cosmeceuticals)的组合物。
药物制剂可呈例如固体、半固体或流体制剂的形式，例如
- 递送装置、植入物；
- 散剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂、琼脂糖或脱乙酰壳多糖珠粒、微球体、纳米粒；
- 喷雾剂、气雾剂、吸入装置；
- 凝胶剂、水凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、皂、牙膏；
- 溶液剂、分散体、混悬剂、乳剂、合剂、洗剂、漱口剂、洗发剂、灌肠剂；
- 装有例如两个独立容器的药盒，其中第一容器包括任选与其它活性药物物质和/或药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂混合的本发明制剂，第二容器包括为了得到即用型制剂而在使用前欲加入到第一容器中的合适介质。
本发明的制剂可适用于手术期间，例如适用于局部施用(例如口腔中)，呈凝胶剂、膜或干的小丸剂的形式或作为冲洗液，或者用糊剂或乳膏剂治疗。
制剂可按照常规药学实践配制，参见例如"Remington's PharmaceuticalSciences"和"Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", 由Swarbrick, J.和J.C. Boylan主编, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988。
本发明的制剂可应用于例如假牙、假体(prostheses)、植入物和体腔例如口腔、鼻腔和阴道腔，尤其预期牙科/齿科领域内的应用。
药学上或美容上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂是对被给予制剂的个体基本无害的物质。这类赋形剂、载体和/或稀释剂通常满足国家卫生当局规定的要求。法定药典例如例如英国药典、美国药典和欧洲药典制订了药学可接受的赋形剂的标准。
药学可接受的赋形剂是否适用于药物制剂一般取决于所选剂型的类型。下面给出用于本发明用途的不同制剂类型的合适的药学上可接受赋形剂的实例。
一般无法预测用于本发明用途的组合物中药学上可接受赋形剂的选择及其最佳浓度，并且必须根据最终组合物的实验评价来确定。然而，药物制剂领域的技术人员可在例如以下文献中找到指引："Remington's Pharmaceutical Sciences"，第18版，MackPublishing Company，Easton，1990。
药学可接受的赋形剂可包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、螯合剂、抗氧化剂、稳定剂、乳化剂、助悬剂、凝胶形成剂、软膏基质、渗透促进剂、香料和护肤剂。
溶剂的实例为例如水、醇、植物油或海产油(例如食用油，像杏仁油、蓖麻油、可可脂、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻子油、橄榄油、棕榈油、花生油、罂粟籽油、菜籽油、芝麻油、大豆油、向日葵油和茶籽油)、矿物油、脂肪油、液状石蜡、聚乙二醇、丙二醇、甘油、液体聚烷基硅氧烷及其混合物。
缓冲剂的实例为例如柠檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、氢磷酸(hydrogenphosphoricacid)、二乙胺等。
用于本发明制剂的防腐剂的合适实例是对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、溴硝丙二醇、bronidox、MDM乙内酰脲、碘代丙炔基氨基甲酸丁酯、EDTA、苯扎氯铵(benzalconiumchloride)和苯甲醇或防腐剂的混合物。
湿润剂的实例为甘油、丙二醇、山梨醇、乳酸、脲及其混合物。
螯合剂的实例为EDTA钠和柠檬酸。
抗氧化剂的实例为丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、半胱氨酸及其混合物。
乳化剂的实例为天然存在的树胶，例如合金欢树胶(gum acacia)或西黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；脱水山梨醇单油酸酯衍生物；羊毛脂；羊毛醇；脱水山梨醇酯；单甘油酯；脂肪醇；脂肪酸酯(例如脂肪酸的甘油三酯)及其混合物。
助悬剂的实例为例如纤维素和纤维素衍生物例如羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素(例如Avicel® RC 591、甲基纤维素)；角叉菜胶(carraghenan)、天然存在的树胶，例如金合欢树胶、阿拉伯胶、黄原胶或西黄蓍胶及其混合物，例如合金欢树胶、纤维素，例如藻酸盐和脱乙酰壳多糖，例如藻酸钠等。
凝胶基质、增粘剂或能够从伤口吸收渗出物的组分的实例为：液状石蜡、聚乙烯、脂肪油、胶态二氧化硅或铝、锌皂、甘油、丙二醇、西黄蓍胶、羧乙烯基聚合物、硅酸镁铝、Carbopol®、亲水聚合物例如淀粉或纤维素衍生物例如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和其它纤维素衍生物、水溶胀性水胶体、角叉菜胶(carragenan)、透明质酸盐(例如任选含有氯化钠的透明质酸盐凝胶)和藻酸酯，包括丙二醇藻酸酯。
用于本发明制剂的凝胶的其它实例包含水凝胶例如PEG (聚乙二醇(PolyEthylene Glycol))、硫酸葡聚糖、葡萄糖、硫酸乙酰肝素、明胶等。
软膏基质的实例为例如蜂蜡、石蜡、鲸蜡醇、鲸蜡醇棕榈酸酯、植物油、脂肪酸的脱水山梨醇酯(Span)、聚乙二醇和脂肪酸的脱水山梨醇酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween)。
疏水性或水乳化性软膏基质的实例为石蜡、植物油、动物脂、合成甘油酯、蜡、羊毛脂和液体聚烷基硅氧烷。
亲水性软膏基质的实例为固体聚乙二醇(macrogol, polyethylene glycol)。
软膏基质的其它实例为三乙醇胺皂、硫酸化脂肪醇和聚山梨酯。
粉剂组分的实例为：藻酸盐、胶原、乳糖、当施用于伤口时能够形成凝胶的粉剂(吸收液体/伤口渗出物)。通常，欲施用于大的开放性创伤上的粉剂必须是无菌的，必须使存在的颗粒微粉化。
其它赋形剂的实例为聚合物，例如羧甲纤维素(carmelose)、羧甲纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、果胶、黄原胶、刺槐豆胶、金合欢树胶、明胶、卡波姆、乳化剂样维生素E、硬脂酸甘油酯、十六烷基葡糖苷、胶原、角叉菜胶、透明质酸盐和藻酸盐和kitosans。
合适的分散剂或湿润剂为例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂或大豆卵磷脂；环氧乙烷与例如脂肪酸、长链脂族醇的缩合产物或衍生自脂肪酸和己糖醇或己糖醇酐的偏酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯等。
正如技术人员容易理解的一样，本发明的药物制剂中EMD蛋白和/或釉基质蛋白的浓度可随制剂的预期用途而变化。通常，药物制剂中肽的浓度范围为0.01-100 mg/ml、例如0.05-90 mg/ml、例如0.5 - 80 mg/ml、例如1-70 mg/ml、例如5-65 mg/ml、例如10-60 mg/ml、例如15-55 mg/ml、例如20-50 mg/ml、例如25-45 mg/ml、例如25-40 mg/ml、例如26-39mg/ml、例如27-36 mg/ml、例如27、28、29、30、31、32、33、34、35或36 mg/ml。体内施用于受试者的量通常为约10 ng/cm2-0.1 mg/cm2，例如约1 μg/cm。
纯化的釉基质衍生物(EMD)蛋白含有可通过高压液相色谱法(HPLC)分离的3种主要的蛋白质流分。这些流分分别称为流分A、B和C。分别在20、14和5 kDa的主要蛋白质峰之间，分离和/或纯化的蛋白质的典型重量比为约80/8/12。
如上所述，通过SDS PAGE电泳测定，流分C通常具有介于约3.5和5 kDa之间的分子量，例如约5 kDa、4 kDa和3.5 kDa。通过SDS PAGE电泳测定，流分A通常具有约20 kDa的分子量。通过SDS PAGE电泳测定，流分B通常具有介于约6 kDa和15 kDa之间，例如约15 kDa、12 kDa、10 kDa和6 kDa的分子量。
EMD蛋白和/或釉基质蛋白由多种蛋白质组成，例如珐琅蛋白、enamelin、tuft蛋白、蛋白酶和白蛋白。珐琅蛋白，其为EMD蛋白和/或釉基质蛋白的主要组分(高达约90%)，是通过可变剪接和受控分泌后加工而可来源于单个基因的疏水蛋白质的家族。它们在整个脊椎动物进化中是高度保守的，在所有已研究的高等脊椎动物(80%)中显示高的序列同源性整体水平。实际上，猪和人珐琅蛋白基因转录物的序列仅在4%的碱基中不同。因此，釉基质蛋白或EMD蛋白虽然来源于猪，但当在人体中遇到时仍被视为是“自身”的，并且可在不引发变态反应或其它不良反应的情况下促进人的牙再生。
因此在本文中，纯化的釉基质衍生物(EMD)蛋白可定义为这样的釉基质蛋白，其包含至少60-70%珐琅蛋白，例如至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%，分子量为约20-25 kDa、例如20、21、22、23、24或25 kDa，或者例如介于20-22、20-24或20-23 kDa之间。总的说来，分别在流分A、B和C的主要蛋白质峰之间，纯化和/或分离的釉基质蛋白的重量比为约80/8/12、例如75-85/5-12/5-15，或者例如至少80%、至少8%和至少5%。约60-90%，例如至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、80、70-90、60-70、70-80或80-90%的纯化和/或分离的釉基质蛋白为珐琅蛋白和/或珐琅蛋白的片段或衍生物。
在本发明中，局部算法程序最适于确定蛋白质的同一性。局部算法程序(例如Smith-Waterman)对一个序列中的亚序列与第二序列中的亚序列进行比较，并找出亚序列的组合和所述亚序列的比对，其得到最高的总体相似性评分。如果允许的话，对内部空位进行罚分。对于比较共有单个结构域或仅结合部位的两种多结构域蛋白质，局部算法运行良好。
在公众可获取的程序中，对测定同一性和相似性的方法编程。测定两个序列间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J等(1994))BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul，S.F.等(1990))。BLASTX程序可公开获自NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.F.等，Altschul，S.F.等(1990))。另一个优选的实例为Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)。各个序列分析程序具有默认评分矩阵和默认空位罚分。总的说来，分子生物学者可预期使用通过所应用的软件程序确立的默认设置。
就化学、异构性(isometry)而言或以任何其它方式，可对EMD蛋白和/或釉基质蛋白中的氨基酸进行进一步修饰，只要该蛋白质的序列完整。EMD蛋白和/或釉基质蛋白的氨基酸修饰可增加蛋白质的活性、稳定性、生物相容性或临床性能，或者降低蛋白质的毒性和不良反应。化学修饰的实例包括但不限于糖基化和甲基化。氨基酸还可以是立体异构形式的所有不同类型，例如氨基酸的D型或L型，或者S或R异构体。本发明的EMD蛋白和/或釉基质蛋白中的氨基酸还可被其合成类似物替换。合成类似物的使用可产生例如更稳定和较不易降解的EMD蛋白和/或釉基质蛋白。非天然氨基酸的实例包括α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-a-氨基丁酸*、L-g-氨基丁酸*、L-a-氨基异丁酸*、L-e-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe (4-氨基)#、L-Tyr (甲基)*、L-Phe (4-异丙基)*、L-Tic (1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe (4-苄基)*。本文使用符号*说明衍生物的疏水性质，而使用#说明衍生物亲水性质，#*说明两亲性质。
EMD蛋白和/或釉基质蛋白还可包含N端和/或C端标签，其包含氨基酸His和/或Met。Met含有硫，这在以前被解释为促进与金属表面结合。His对例如Ni和其它金属具有强的亲和力。因此使用这些标签具有能够使蛋白质与以下金属表面附着的优势：像钛、锆、铝、钽、金、手术用钢和镍或金属氧化物氢氧化物和/或氢化物表面等。例如当EMD蛋白和/或釉基质蛋白附着于金属表面时，例如当它们被用来改进生物矿化和/或医学假体装置(medical prosthetic device)的骨整合时，这极为重要。如技术人员所熟知，C端和/或N端标签还可用于所得蛋白质纯化的方法。使用N端和/或C端标签还允许蛋白质充分暴露，即标签用来使蛋白质与表面结合，而其余蛋白质不与例如原子、分子、细胞和组织相互作用。在蛋白质产生期间，在EMD蛋白和/或釉基质蛋白的各端使用一个标签可能是有益的，这允许在从未完全蛋白质产物中纯化出目的蛋白期间，肽的一端与柱连接，同时蛋白质的另一端可用来与目的表面结合。因此，本发明的一个优选实施方案涉及包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白、另还包含N端和/或C端组氨酸标签的制剂。如前所述，这类标签可包含已经与本发明的EMD蛋白和/或釉基质蛋白连接的甲硫氨酸和/或组氨酸残基。在一个优选的实施方案中，该标签包含3个或更多个残基，例如介于3-5或5-10个残基之间。标签可包含任何量的残基，其依然与本发明的EMD蛋白和/或釉基质蛋白一起提供稳定的制剂，不以负面方式影响EMD蛋白和/或釉基质蛋白的二级结构。优选该组氨酸标签由5个组氨酸残基组成。在另一个优选的实施方案中，EMD蛋白和/或釉基质蛋白包含N端和/或C端甲硫氨酸标签，所述标签优选由5个甲硫氨酸残基组成。在另一个优选的实施方案中，包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白的制剂在其C端或N端包含甲硫氨酸标签，在另一端包含组氨酸标签。
在一个实施方案中，EMD蛋白和/或釉基质蛋白通过例如合成生产或生物合成来产生，而不是从天然来源分离。EMD蛋白和/或釉基质蛋白或其片段可通过用于生产肽的任何已知方法产生，例如通过化学合成的合成生产。合成生产还允许使用可提高所产生蛋白质或片段的稳定性的氨基酸类似物。技术人员了解可用于氨基酸序列合成的方法。
优选生物生产可用作产生EMD蛋白和/或釉基质蛋白或其片段的方法。生物生产意指氨基酸序列在生物系统例如细胞培养或微生物细胞例如细菌细胞中的生产。对于生物生产，必需构建编码特定氨基酸序列的相应核酸序列。技术人员容易了解一旦确定要合成的特定氨基酸序列时如何构建这类核酸序列，以及如何产生EMD蛋白和/或釉基质蛋白或其片段并从其生产所用系统中纯化出来(参见例如Svensson J, Andersson C, Reseland JE,Lyngstadaas SP, Bulow L. Histidine tag fusion increase expression levels ofactive recombinant Amelogenin in Escherichia coli (大肠杆菌中组氨酸标签融合物提高活性重组珐琅蛋白的表达水平). (Protein Expr Purif, 48; 134-41 (2006))。
在本文情况下，医学假体装置涉及欲植入脊椎动物、特别是哺乳动物、特别是人体内的任何装置。在本文情况下，医学假体装置可用来置换解剖结构和/或恢复机体的任何功能。这类装置的非限制性实例是置换解剖结构或恢复机体功能的医学装置，例如股骨髋关节；股骨头；髋臼杯；肘，包括杆(stems)、楔形物(wedges)、关节插入物(articularinserts)；膝，包括股骨和胫骨组件、杆、楔形物、关节插入物或髌骨部件；肩，包括杆和头(head)；腕；踝；手；手指；脚趾；椎骨；脊椎盘；人工关节；牙植入物；听骨链成形植入物；中耳植入物，包括砧骨、锤骨、镫骨、砧骨-镫骨、锤骨-砧骨、锤骨-砧骨-镫骨；耳蜗植入物；矫形固定装置，例如钉子(nails)、螺丝、钉(staples)和托基(plates)；心瓣膜；起搏器；导管；脉管(vessel)；空隙填充植入物(space filling implant)；用于助听器固位的植入物；用于外固定的植入物；还有子宫内装置(IUD)；以及生物电子装置例如耳蜗内或颅内电子装置。
本发明的制剂还可包含颗粒，颗粒的实例为孔径大小直径范围为100-500微米的多孔颗粒。
给药
本发明的药物、牙科和/或美容制剂可用于促进和/或诱导硬组织再生、组织矿化、骨生长和/或骨再生长、牙质再生、牙骨质发生和/或活的矿化组织之间的结合；用于活的矿化组织件与其它活组织件上的粘结部位的粘结、用于支持硬组织间的结合和/或用于填充手术和/或创伤后矿化伤口的腔和/或组织缺陷。
本发明的药物、牙科和/或美容制剂可备选和/或另外用于促进和/或诱导软组织再生和/或用于治疗和/或预防炎症和/或感染和/或用于治疗SIRS。
因此，本发明还涉及包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白的药物、牙科和/或美容制剂在用于制备用于以下方面的药物组合物中的用途：用于促进和/或诱导硬组织再生、组织矿化、骨生长和/或骨再生长、牙质再生、牙骨质发生和/或活的矿化组织部分之间的结合、用于活的矿化组织件与其它活组织件上的粘结部位的粘结、用于支持硬组织间的结合和/或用于填充手术和/或创伤后矿化伤口的腔和/或组织缺陷、以及用于促进和/或诱导软组织再生和/或用于治疗和/或预防炎症和/或感染和/或用于治疗SIRS，其中所述制剂包含不大于6重量% (wt)的已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)，并且其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。
此外，预期用于以下方面的方法：用于促进和/或诱导硬组织再生、组织矿化、骨生长和/或骨再生长、牙质再生、牙骨质发生和/或活的矿化组织部分之间的结合、用于活的矿化组织件与其它活组织件上的粘结部位的粘结、用于支持硬组织间的结合和/或用于填充手术和/或创伤后矿化伤口的腔和/或组织缺陷、以及促进和/或诱导软组织再生和/或用于治疗和/或预防炎症和/或感染和/或用于治疗SIRS，所述方法包括将包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白的药物、牙科和/或美容制剂给予有需要的患者，其中所述制剂包含不大于6重量/体积% (w/v%)的已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)，并且其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。
可将包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂通过任何合适的途径给予有需要的受试者，其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa，所述途径取决于要给予肽的组织，例如经局部(皮肤)、口服、含服、经鼻、经耳、经直肠或阴道给药，或者通过给予体腔，例如牙根、牙根管或骨折(bone fracture)。此外，本发明的制剂可适于与手术结合给予，例如与体内切口结合给予。还可通过局部注射、通过以凝胶剂施用或经由医学装置例如医学假体装置，例如移植物、支架或生物玻璃材料给予本发明的制剂。经由藻酸盐或脱乙酰壳多糖(缓释)珠粒、牙膏、以洗发剂、牙镶补料给予本发明的制剂也是可能的。如果将包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高平均分子量的PGA的本发明药物制剂局部给予例如骨折、牙周缺陷、拔牙后的牙槽(extraction alveolas)或窦抬高术，则所述蛋白质可改进和/或加快骨愈合。
可将制剂装入胶囊，并通过摄取而口服递送、通过吸入经鼻腔或肺或者通过注射入血液、脊髓液、关节或腹膜内递送作为缓释贮库制剂(depot)。
另一方面，本发明涉及包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白(EMD)和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂在制备用于诱导生物矿化的药物中的用途，其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。具体地讲，本发明还涉及包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高重量平均分子量的PGA的药物制剂在制备用于骨形成和/或再生的药物中的用途。在一个具体的实施方案中，本发明还涉及包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高重量平均分子量的PGA的药物制剂在制备用于软骨、牙骨质和/或牙组织形成和/或再生的药物中的用途。包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高重量平均分子量的PGA的本发明药物制剂还可用于制备治疗骨质疏松症、骨折、牙周炎、创伤、骨代谢综合征、牙髓炎、牙尖病损等的药物。
包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂还可用于制备用于骨折愈合的药物，其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。
一方面，本发明还涉及用于诱导生物矿化的包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白(EMD)和已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述已灭菌PGA的重量平均分子量(MW)大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。例如包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高平均分子量的PGA的本发明药物制剂可用于制备用于软骨、牙骨质和/或牙组织形成和/或再生的药物。
另一方面，本发明涉及用于骨形成和/或再生的包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高重量平均分子量的PGA的本发明药物制剂。
再一方面，本发明涉及用于骨折愈合的包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高重量平均分子量的PGA的本发明药物制剂。
EMD蛋白和/或釉基质蛋白还可与诱导矿物沉淀和/或生物矿化和/或骨形成的天然蛋白质(例如BMP)联用。也可能使用两种或多种蛋白质的组合，用于诱导和/或刺激矿物沉淀(包括生物矿化)。
包含EMD蛋白和/或釉基质蛋白和具有如上定义的高重量平均分子量的PGA的本发明药物制剂，还可用于两种生物矿化结构的融合或生物矿化结构与另一种材料的融合。这类材料的实例包括可植入生物材料，例如钛和钢、生物玻璃、磷酸钙、磷灰石等。其它实例包括柱材料、过滤材料等。
本发明的补充制剂是还可包含纤维素衍生物和藻酸盐(例如羧甲基纤维素和PGA)的制剂。
本发明还涉及由釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白组成(consisting)的制剂，其中至少60-70%，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%的蛋白质的分子量介于16-40 kDa之间，例如大于20 kDa，例如16、17、18或19 kDa，且不超过3-6重量/体积% (w/v%)、例如3、4、5或6% w/v的已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。本发明还涉及基本上由釉基质蛋白和/或釉基质衍生物(EMD)蛋白组成的制剂，其中至少60-70%，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%的蛋白质的分子量介于16-40 kDa之间，例如大于20 kDa，例如16、17、18、19或20kDa，且不超过3-6重量/体积% (w/v%)、例如3、4、5或6 w/v %的已灭菌丙二醇藻酸酯(PGA)的重量平均分子量大于130 kDa，例如大于或等于135、140、150、180或185 kDa。
实验部分
实施例1
重量平均分子量(MW)
采用GPC (Agilent)和下列参数，按照分析方法AM-S01测定重量平均分子量：
洗脱液：磷酸缓冲液pH 7.0
Precolumn柱： PSS Suprema 10 μm 100 Å 8 x 50 mm
PSS Suprema 10 μm 100 Å 8 x 300 mm
PSS Suprema 10 μm 1000 Å 8 x 300 mm
PSS Suprema 10 μm 100 Å 8 x 300 mm
泵：Agilent 1100
流速：1.0 ml/分钟
自动进样器：Agilent 1100，注射体积50μl
样品浓度：2.0、3.0 g/L
温度：23℃
检测器：Aglient 1100 Rl
计算：PSS WinGPC Unity 7.20版
根据用Pollulan摩尔质量标准的常规校准进行校准
自2002到2009以来未灭菌PGA和Kelcoloid® O的重量平均分子量公开于表1。
表1
该表显示，先前所用的PGA的重量平均分子量介于210-245 kDa之间，意味着约230kDa或不大于245 kDa。此外，该表显示对于Kelcoloid® O 9B02535，MW和MZ之间的差异比之前所用PGA高得多。
实施例2
按照ISO 1137-2 (2006)建议，用于Emdogain制剂的已灭菌PGA获自对未灭菌PGA进行电子束灭菌。灭菌方法包括以下步骤：
1. 无菌保证水平(SAL) 10-6 (one milliomod)应用于PGA的1灭菌单位(100 gPGA/袋)
2. 计算该灭菌单位(100 g PGA/袋)的总生物负荷：总生物负荷= 100 g * CFU/g-->如果该灭菌单位改变，例如包装仅50 g PGA，则总生物负荷降低
3. 因此，应用该总生物负荷VDmax 25 --> min 25 kGy
在电子束照射期间，PGA不进行交联。由电子束照射引起的主要过程是断链。因此，在这种情况下，重量平均分子量(MW)随着电子束剂量(R)变化而发生的改变可通过charlesby方程式(方程式1)简化。PGA的起始重量平均分子量(MW0)、所用电子束剂量(R)和放射性产率(radiolitic yield) (Gs)基本上决定已灭菌PGA的分子量(MW) (参见例如图8)。
Gs对于化学上相同的PGA为常数。Manucol® (GsM)酯B和Kelcoloid® O (GsK) PGA的计算值在以下偏差内几乎相等：
因为电子束剂量检测误差范围为2 kGy，因此可发现所递送的灭菌电子束剂量在R= 26.4-28.4 kGy的狭窄范围中(提供良好的安全界限)，初始MW0主要决定已灭菌PGA的MW。MW0 =未灭菌PGA的MW。这就是为什么初始分子量应高的原因。这是具有良好增稠性质的驱动力。
(T.Q Nguyen, H.H Kausch, J. App. Polym. Sci. 29(1984), 第455页)
(A. Schiltz等, Revue Phys. Appl. 19(1984)439 (439-444))
实施例3
C.J. Gray. A. J. Griffiths, D. L. Stevenson, J. F. Kennedy (Studieson the Chemical Stability of Propylene Glycol alginates Ester (对丙二醇藻酸酯的化学稳定性的研究), Carbohydrate Polymers, 1990, 12, 419-430)研究了PGA的降解。
他们鉴定出两种降解类型：
1) 提供羧酸和丙二醇的酯键水解(pH改变)
2) 伴有粘度降低的多糖骨架中糖苷键的降解
他们发现在酸性条件下，PGA中的酯基对水解是稳定的，仅发生多糖骨架的水解降解。然而，中度酸性条件(约pH 3-5)下这种陈述未得到证实。聚合物骨架水解断裂与酯水解同时发生，且pH和粘度两者降低。
酯的总体水解速率可写为各个酸催化速率的各个速率之和：k A [酯][H + ]，中性速率(neutral rate)：[酯]和碱催化的水解速率：k B [酯][OH - ]
其中为反应速率常数，[酯]、[H + ]、[OH - ]分别为酯、质子(氢离子)和羟基离子浓度。
在酸性条件下，与酸催化反应相比，中性和碱催化的水解可以忽略，因此，方程式1可简化为
在羧酸产生与酯消耗之间相等(图3)。
因此，酯的消耗率等于羧酸产生，方程式2可转换成
总体产酸率被认为与d[H + ]/dt成比例，得到
Emdogain中的PGA水解类似于酯水解。介于pH 5和pH 3之间的[H + ]浓度改变2个数量级。从初始pH (约pH 5)到当pH降低至3.0的时间内，酯浓度的变化程度比[H + ]的增加小得多，其后，与酯浓度的变化相比，[H + ]的变化表示对总体速率较大的影响。出于简化，[酯]涉及反应速率常数k A ，得到k'准一级速率常数。
考虑到初始[H + ]为[H 0 +]，对方程式5积分，得到
因pH = -log [H + ]，ln [H + ] = -2.3025*pH，方程式7可写为
其中k" = 2.3025*k'为在Emdogain中已灭菌PGA水解的准一级反应速率常数，t为Emdogain的贮存时间，pH为时间 = t时的实际pH，pH 0 为初始pH。
方程式8表示在pH与贮存时间(t)之间为线性相关，且其中斜率为准一级反应速率常数(k")。实际上，只要pH达到规格(specification)的控制下限(pH 3.5)，就可推定这种线性(图4)。
除pH 3.5以外，应考虑酸催化的脱酯化和酯化的平衡行为。接近平衡pH (pH 2.7- 2.8附近)时，pH对时间曲线变平(图5)。因为产品规定的接受限度为pH 3.5，可利用方程式8描述规定pH值内pH改变的总体速率。
已灭菌PGA浓度对反应速率常数的作用
为了简化准一级反应动力学方程式的模型(从方程式4到方程式5)，使酯的浓度[酯]与反应速率常数k A 合并。在Emdogain的稳定性方案(Biora STP文件)中，未按照其酯浓度。根据同样的考虑，当将方程式4转换成方程式5时，不能数量级地扩大酯浓度的变化，且可用已灭菌PGA浓度[已灭菌PGA]替换。
其中k' A = 2.3025*k A 酸性PGA水解速率常数，Const为已灭菌PGA浓度酯化的零级(zero)速率常数。后者是指当溶液中只存在相应的羧酸和醇时的酸催化酯化。
k"与[已灭菌PGA]之间的线性回归得到
根据方程式9和14，当pH由初始pH 0 降低至3.5时，可对时间进行大致估算(pH决定Emdogain t pH3.5 的保存期限或耐久性)。
从方程式14计算的持续24个月耐久性的所用已灭菌PGA浓度[已灭菌PGA]被证明是在不将产品暴露在较高温度的情况下，在24个月内保持pH在规格要求内的临界浓度。较高温度加快水解过程。
温度对反应速率常数的作用
温度对pH下降的作用是明显的。Straumann® Emdogain暴露于高温显著加快pH下降的总体速率。按照Arrhenius方程式，反应速率常数(k")随温度(T)而变化
方程式12
以对数形式写为
方程式13
其中R = 8.314472 J/(K*mol) - 通用气体常数；A为频率因子；E a 为反应的活化能[J/mol]；T为温度，单位为开尔文。
按照方程式10，以下存在线性关系
方程式14
其允许从线性回归线求出log A和E a /R常数。温度依赖性概括于表2。
表2
准一级反应速率常数相对于贮存温度
包括温度和PGA浓度依赖性和暴露温度加快的酸化，确定6重量/体积% (w/v%)PGA作为EMD – PGA系统pH稳定性的阈值。对于适用性和临床测验证实的制剂粘度需要3.0- 4.0 Pa*s (22℃，19 1/s)。为此目的，PGA重量平均分子量的阈值应大于130 kDa，这通过Pollulan校准标准的GPC测量。
实施例4. EMD制剂的贮存稳定性
样品制备：
EMD溶液
按照正常的EMD本体溶液(bulk solution)生产，在常规生产线上制备浓度为33mg/ml的EMD溶液。在过滤除菌后，从生产线中取出溶液。EMD溶液包含乙酸和水，溶液的pH介于4.9-5之间。
PGA
Kelcoloid® O购自FMC Biopolymer。按照上文已描述的方法测定MW。所得MW值在上表1中示出。
通过电子束灭菌对PGA进行灭菌。所用设备：sterigenics San Diego，所递送的电子束剂量：25-30 kGy。所得已灭菌PGA的MW = 184 kDa +- 12 kDa。
Emdoqain样品制备：
在环境温度(约20℃)下，在分层气流(LAF)下将所得已灭菌PGA (30.0 g)慢慢加入EMD本体溶液(500 mL)中。搅拌溶液，持续搅拌超过24小时后停止。在LAF下，将Emdogain制剂样品转移到无菌样品管(50 mL)中。取出一份样品，测量pH和粘度：
粘度= 3.0 Pa.s (22℃，18.9 1/s) (Anton Paar MRC Physica 300流变仪，配置：CP-25-2 --> Serial N° 12513)
pH 4.70 (Metrohm 780 pH计，配备Entrich pH探针N° 6.00226.100)
在制备后，将所得样品立即放入冰箱。调节冰箱的温度至+4℃，在样品附近控制温度。温度偏差决不超过﹢﹣2.0℃
在14个月内测量样品的pH (参见图9)
参比样品：
从Emdogain稳定性程序提取pH稳定性数据。从使用电子束灭菌的PGA MW= 1 17kDa制备的Emdogain样品中选择数据。
参比样品的名称为E7254
初值：粘度：，pH 4.5
未加工PGA：MW 219 kDa
无菌的(电子束处理的) PGA：MW 117 kDa
在24个月内测量参比样品的pH (参见图9)
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Claims (24)
1.包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述制剂包含范围为3重量/体积% (w/v%)-6重量/体积% (w/v%)的已灭菌丙二醇藻酸酯，且其中所述已灭菌丙二醇藻酸酯的重量平均分子量(MW)范围为130 kDa-250kDa。
2.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其包含范围为3重量/体积% (w/v%)至6 w/v%且重量平均分子量等于135 kDa的已灭菌丙二醇藻酸酯。
3.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述已灭菌丙二醇藻酸酯的重量平均分子量(MW)等于185 kDa。
4.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述已灭菌丙二醇藻酸酯获自对起始重量平均分子量(MW0)为250-500 kDa的未灭菌丙二醇藻酸酯进行电子束灭菌。
5.权利要求4的药物、牙科和/或美容制剂，其中所用电子束灭菌剂量选自25-30 kGy范围内的剂量。
6.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白包含至少60%具有介于18与25 kDa之间平均分子量的珐琅蛋白。
7.权利要求6的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白包含60-70%具有介于18与25 kDa之间平均分子量的珐琅蛋白。
8.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述制剂在至少18个月时间内的pH大于3.5。
9.权利要求8的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述制剂在24个月时间内的pH大于3.5。
10.权利要求8的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述制剂在2-8℃的温度范围内的pH大于3.5。
11.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述制剂还包含一种或多种药学可接受的赋形剂、药学上可接受的载体或其组合。
12.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其中以釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯而不包括其它赋形剂的总的组合重量计，所述釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白的量的范围为94%-97%重量/体积。
13.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其还包含一种或多种非釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白活性剂。
14.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其包含至少两种表面稳定剂。
15.权利要求14的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述表面稳定剂选自离子型表面稳定剂。
16.权利要求15的药物、牙科和/或美容制剂，其中所述离子型表面稳定剂为阴离子表面稳定剂、阳离子表面稳定剂或两性离子表面稳定剂。
17.药物组合物，其包含前述权利要求1-16中任一项的药物、牙科和/或美容制剂。
18.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其中配制所述制剂用于选自以下途径的给药：口服给药。
19.权利要求1的药物、牙科和/或美容制剂，其被配制成选自以下的剂型：液体分散体、口服混悬剂、凝胶剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂、控释制剂、速溶制剂、冻干制剂、片剂、胶囊剂、迟释制剂、延释制剂、脉冲释放制剂和即释和控释混合制剂。
20.前述权利要求1-16中任一项的药物、牙科和/或美容制剂，其特征在于，所述药物、牙科和/或美容制剂促进和/或诱导硬组织再生、组织矿化、骨生长和/或骨再生长、牙质再生、牙骨质发生和/或活的矿化组织部分之间的结合、活的矿化组织件与其它活组织件上的粘结部位的粘结、支持硬组织间的结合和/或填充手术和/或创伤后矿化伤口的腔和/或组织缺陷。
21.前述权利要求1-16中任一项的药物、牙科和/或美容制剂，其特征在于，所述药物、牙科和/或美容制剂促进和/或诱导软组织再生和/或治疗和/或预防炎症和/或感染和/或治疗SIRS。
22.权利要求1-16中任一项的药物、牙科和/或美容制剂在制备用于以下方面的药物组合物中的用途：促进和/或诱导软组织再生和/或治疗和/或预防炎症和/或感染和/或治疗SIRS，促进和/或诱导硬组织再生、组织矿化、骨生长和/或骨再生长、牙质再生、牙骨质发生和/或活的矿化组织部分之间的结合、活的矿化组织件与其它活组织件上的粘结部位的粘结、支持硬组织间的结合和/或填充手术和/或创伤后矿化伤口的腔和/或组织缺陷。
23.一种生产前述权利要求1-16中任一项的药物、牙科和/或美容制剂的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a. 从发育中的猪的牙中分离釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白，
b. 对初始重量平均分子量(MW0)250-500 kDa的未灭菌丙二醇藻酸酯进行电子束灭菌，且剂量在25-30 kGy范围内，和
c. 将获自a.的制品和获自b.的制品混合使得所述制剂包含3-6重量/体积% (w/v%)的已灭菌丙二醇藻酸酯。
24.包含釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白和已灭菌丙二醇藻酸酯的药物、牙科和/或美容制剂，所述已灭菌丙二醇藻酸酯的重量平均分子量为130-250 kDa，其中所述制剂通过包括以下步骤的方法产生：
a. 从发育中的猪的牙中分离釉基质蛋白和/或釉基质衍生物蛋白，
b. 对初始重量平均分子量(MW0)范围为250-500 kDa的未灭菌丙二醇藻酸酯进行电子束灭菌，且剂量在25-30 kGy范围内，和
c. 将获自a.的制品和获自b.的制品混合使得所述制剂包含3-6重量/体积% (w/v%)的已灭菌丙二醇藻酸酯。
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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