CN103180440B

CN103180440B - 向细胞中导入核酸的方法以及核酸复合物

Info

Publication number: CN103180440B
Application number: CN201180034113.8A
Authority: CN
Inventors: 藤井政幸
Original assignee: Kindai University
Current assignee: Kindai University
Priority date: 2010-07-10
Filing date: 2011-07-07
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2031-07-07

Abstract

本发明公开了一种向细胞中导入核酸的方法以及用于其的核酸复合物，所述方法具备以下工序：在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有下述肽链的核酸载体与双链核酸分子接触，介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及氢键的一者或两者，使前述双链核酸分子与前述肽链结合而形成核酸复合物，其中，所述肽链形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β‑折叠结构。

Description

向细胞中导入核酸的方法以及核酸复合物

技术领域

本发明涉及向靶细胞中导入双链核酸分子的方法、用于该方法的核酸载体的改良、以及利用前述核酸载体与双链核酸分子得到的核酸复合物。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是以碱基长为21~25左右的低分子量双链RNA(siRNA)为诱因，碱基序列特异性地分解mRNA，从而抑制特定基因的表达的现象，与已经进入临床试验阶段的反义核酸相比，RNA干扰的有效性和碱基序列特异性更优异，因此强烈期待其在医药中的应用。然而，还残留有siRNA向细胞内的导入、在细胞内的稳定性和抑制效果的持续性的确保等大量需要解决的问题。

由于包含siRNA的聚(寡)核苷酸为多聚阴离子，因此直接使用时，与疏水性的细胞膜的亲和性低，难以导入细胞内。另外，由于核酸酶会分解外源性的核酸，为了确保其在细胞内的稳定性和抑制效果的持续性，需要保护其不受细胞内存在的核酸酶的影响。鉴于上述问题，针对核酸向细胞内的导入，至今为止提出了各种方法，但这些方法大致分为使用病毒载体的方法和不使用病毒载体的方法。

病毒载体是指欠缺复制能力的病毒，在使用了病毒载体的基因导入方法中，具有可以利用病毒的增殖方式的优点，使从进入细胞内至蛋白质合成均高效地推进这样的优点。作为病毒载体，使用来源于腺病毒、反转录病毒、慢病毒、腺相关病毒（アデノ随伴ウイルス）的重组病毒载体(例如，参照专利文献1、非专利文献1)。然而，使用病毒载体的方法被指出存在因病毒而致癌等的危险性，实际上也确认存在死亡病例。另外，存在因产生病毒中和抗体而导致失活等问题，同时还伴随着难以大量生产、难以进行品质管理的问题。

另一方面，作为不使用病毒载体而向靶细胞内导入核酸的方法，提出了磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、脂转染物法、显微注射法、流体动力学法、利用抗体、肽等载体与核酸的复合物的方法等各种方法(例如，参照非专利文献1)。

然而，不使用病毒载体的现有核酸导入方法中，用于将以siRNA为首的核酸导入细胞中的基因医药构建无法说是充分的。即，正在寻求不限细胞种类、兼具实现高效且以高重现性导入核酸、提高对细胞内的核酸酶的耐性、提高序列特异性地与靶核酸结合以及亲和性、低细胞毒性等性质的新型核酸载体。

截止至今，开发了各种向核酸载体、细胞中导入核酸的方法，近年来，使用了生物体内的信号肽等功能性肽的、向核酸载体和细胞中导入核酸的方法备受瞩目。例如有以下方法：使用核定位化信号肽(例如，参照专利文献2、3)、其它信号肽(例如，参照专利文献4)、设计肽(例如，参照专利文献5)，向细胞内导入阴离子性核酸的方法；组合使用利用糖修饰肽使细胞特异性提高的核酸载体(例如，参照专利文献6)、两亲性聚合物与肽结合而成的功能性分子(例如，参照专利文献7)、已有的核酸载体与肽的方法(例如，参照专利文献8)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-146191号公报

专利文献2：日本特表2003-514564号公报

专利文献3：日本特开2001-288200号公报

专利文献4：日本特表平10-506001号公报

专利文献5：日本特开2002-316997号公报

专利文献6：日本特开平11-290073号公报

专利文献7：日本特表2003-503370号公报

专利文献8：日本特开2004-65238号公报

非专利文献

非专利文献1：仲岛一范、北村义浩编著、“必ず上手くいく遺伝子導入と発現解析プロトコール”、羊土社、2003年9月、ISBN9784897064116

发明内容

如上所述，截止至今，开发了向各种核酸载体和细胞中导入核酸的方法，但尚无已经确定的方法。另外，这些方法中大多以DNA为靶，因此并不一定适合将低分子量且反应性比DNA还高的siRNA导入至细胞中。

本发明是鉴于所述情况而进行的，其目的在于，提供一种向细胞中导入核酸的方法、核酸载体和核酸复合物，所述方法能够将siRNA等双链核酸分子高效地导入靶细胞中，能够对双链核酸分子赋予对核酸酶的高耐性，且由细胞毒性带来的副作用风险小。

用于实现前述目的的本发明的第一实施方式通过提供下述(1)~(9)所述的向细胞中导入核酸的方法来解决上述问题。

(1)一种向细胞中导入核酸的方法，该方法具备以下工序：在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的前述碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、前述疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链的核酸载体与前述双链核酸分子接触，介由前述碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及前述双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者，使前述双链核酸分子与前述肽链结合而形成核酸复合物的工序，以及，将前述核酸复合物导入细胞的工序。

(2)根据(1)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组，前述疏水性氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组。

(3)根据(1)或(2)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述肽链具有(RL)_n和(LR)_n中任一者所示的氨基酸序列。

(其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，n表示5以上且10以下的自然数。)

(4)根据(1)~(3)中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，在前述形成核酸复合物的工序中，前述双链核酸分子与核酸载体的摩尔比为1:4~1:30。

(5)根据(1)~(4)中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述双链核酸分子为siRNA。

(6)根据(1)~(5)中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述核酸复合物具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性。

(7)根据(6)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述核酸复合物所含的前述双链核酸分子或前述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。

(8)根据(7)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述信号肽具有下述的序列号1~13中任一个所示的氨基酸序列，

QAKKKKLDK [序列号1]

SPQPKKKP [序列号2]

RQARRNRRRRWR [序列号3]

GPKKKRKV [序列号4]

NSAAFEDLRVLS [序列号5]

RQIKIWFQNRRMKWKKEN [序列号6]

GRKKRRQRRRPPQG [序列号7]

LPPLERLTL [序列号8]

ALQKKLEELELDE [序列号9]

LALKLAGLDI [序列号10]

SLEGAVSEISLRD [序列号11]

LPVLENLTL [序列号12]

LASLMNLGMS [序列号13]。

(9)根据(7)或(8)所述的向细胞中导入核酸的方法，其中，前述信号肽的末端结合于前述核酸载体所含的肽链或前述双链核酸的末端。

本发明的第二实施方式通过提供下述的(10)~(16)所述的核酸复合物来解决上述问题。

(10)一种核酸复合物，其中，该核酸复合物为在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的前述碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、前述疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链的核酸载体与双链核酸分子介由前述核酸载体的肽链所含的碱性氨基酸的侧链与前述双链核酸分子的磷酸基的静电相互作用而结合得到的。

(11)根据(10)所述的核酸复合物，其中，前述碱性氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组，前述疏水性氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组。

(12)根据(10)或(11)所述的核酸复合物，其中，前述肽链具有(RL)_n和(LR)_n中任一者所示的氨基酸序列。

(其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，n表示5以上且20以下的自然数。)

(13)根据(10)~(12)中任一项所述的核酸复合物，其特征在于，前述双链核酸分子为siRNA。

(14)根据(10)~(13)中任一项所述的核酸复合物，其中，前述双链核酸分子或结合于其的前述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。

(15)根据(14)所述的核酸复合物，其中，前述信号肽具有上述的序列号1~序列号13中任一个所示的氨基酸序列。

(16)根据(14)或(15)所述的核酸复合物，其中，前述信号肽的末端结合于前述核酸载体所含的肽链或前述双链核酸的末端。

本发明的核酸载体在具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，具有形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链。有报告称，形成β-折叠结构的肽与双链DNA等双链核酸分子可介由双链核酸分子与肽之间的氢键等而结合，从而形成复合物(例如，参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.74(1977),p.1458-1462)。本发明的核酸载体所含的肽链中，由于碱性氨基酸与疏水性氨基酸交替排列，因此在形成β-折叠结构时，具有正电荷的碱性氨基酸的侧链以约7nm的间隔配置在β-折叠结构的单面一侧。该间隔与核苷酸链中的磷酸基之间的间隔基本一致。因此，本发明的核酸载体在形成有β-折叠结构的肽链部分处介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者与双链RNA、双链DNA等双链核酸分子牢固地结合，从而可以大幅提高这些双链核酸分子的核酸酶耐性，同时，由于疏水性氨基酸的侧链露出至复合物的外面，因此由脂质双分子膜形成的细胞膜的透过性提高，从而可以提高向细胞中导入双链核酸分子的效率。另外，通过适当选择肽链部分的氨基酸序列，还可以增加与核酸载体的双链核酸分子的亲和性、碱基序列特异性。另外，本发明的核酸载体由于以多肽为基底，因此细胞毒性低，可以降低应用于基因治疗、基因制剂时的副作用。进而，通过用信号肽修饰等，还可以实现细胞内的定位化控制、增加细胞特异性，可以赋予增加核酸导入效率、降低基因治疗中的副作用等各种功能。

本发明的向细胞中导入核酸的方法中，由于使用具有上述那样的特征的核酸载体向靶细胞中导入双链核酸分子，因此具有以下效果：能够将siRNA等双链核酸分子高效地导入靶细胞中，能够对双链核酸分子赋予对核酸酶的高耐性，且由细胞毒性带来的副作用的风险小。

另外，本发明的核酸复合物在能够高效地向靶细胞内导入siRNA等双链核酸分子的同时，还具有对核酸酶的高耐性。进而，由于以多肽为基底，因此细胞毒性低，可以降低应用于基因治疗、基因制剂时的副作用，可以适合地用于这些用途。

附图说明

图1为siRNA、核酸载体(RL)₇和核酸复合物的圆二色性(CD)谱图。

图2为显示核酸载体中的肽链长度对向Jurkat细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片。

图3为显示核酸载体与双链核酸分子的摩尔比对向Jurkat细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片和荧光谱图。

图4为显示核定位化信号(NLS)肽和长链羧酸与(RL)₇的共轭对向Jurkat细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片。

图5为显示核酸载体与双链核酸分子的摩尔比对向HeLa细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片和荧光谱图。

图6为显示核输出信号(NES)肽与(RL)₇的共轭对向HeLa细胞中导入核酸复合物的效率所产生的效果的荧光显微镜照片。

图7为显示核酸复合物所含的siRNA在10%胎牛血清(FBS)中的经时变化的凝胶电泳的结果。

图8为显示核酸复合物所含的siRNA在10%胎牛血清(FBS)中的经时变化的凝胶电泳的结果。

图9为显示在核酸载体和RNAiFect的存在下对Jurkat细胞进行培养时的存活率的经时变化的图。

图10为显示在核酸载体和RNAiFect的存在下对K562细胞进行培养时的存活率的经时变化的图。

具体实施方式

接着，针对将本发明具体化的实施方式进行说明，以供于理解本发明。

本发明的第一实施方式涉及的向细胞中导入核酸的方法(以下，有时简称为“向细胞中导入核酸的方法”或“本方法”。)具备以下工序：在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链的核酸载体与双链核酸分子接触，介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与肽链之间的氢键的一者或两者，使双链核酸分子与前述肽链结合而形成核酸复合物的工序，以及将核酸复合物导入细胞的工序。

首先，针对本方法中使用的核酸载体(以下，有时简称为“核酸载体”。)和本发明的第二实施方式涉及的核酸复合物(以下，有时简称为“核酸复合物”或”复合物”。)进行更详细的说明。

(1)核酸载体

在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，核酸载体具有形成β-折叠结构的肽链，所述β-折叠结构中，具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧。如上所述，呈β-折叠结构的多肽链可以与双链DNA(dsDNA)等双链核酸分子形成复合物，尤其是，如果肽链呈现具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在折叠结构的单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的二级结构，则可以介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者，在两者之间形成稳定的结合。如此形成的核酸复合物中，疏水性氨基酸的侧链朝向外侧，因此与由复合物的脂质双分子膜形成的细胞膜的亲和性增大，导入细胞内的效率提高。

对于肽链的氨基酸序列而言，只要是满足上述条件，即满足在具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，可以形成具有正电荷的碱性氨基酸的侧链配置在单面一侧、疏水性氨基酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构，介由碱性氨基酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与前述肽链之间的氢键的一者或两者，在两者之间形成稳定的结合的条件，则没有特别限定。另外，β-折叠结构只要满足上述条件，也可以是平行β-折叠和反平行β-折叠结构中的任一种。

β-折叠结构的形成可以使用圆二色性(CD)谱图等任意的公知方法进行确认。

作为肽链的优选氨基酸序列，可列举出选自由精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸组成的组中的碱性氨基酸与选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和色氨酸组成的组中的疏水性氨基酸交替排列而成的氨基酸序列。碱性氨基酸和疏水性氨基酸的种类可以根据用于形成复合物的双链核酸分子的种类、结构等进行适当选择。另外，多肽链长度可以根据用于形成复合物的双链核酸分子的链长、即双链核酸分子具有的磷酸基(负电荷)的数量等进行适当选择。多肽链相对于双链核酸分子过短时，无法形成稳定的复合物，同时无法获得保护双链核酸分子不受核酸酶影响的效果。另一方面，多肽链相对于双链核酸分子过长时，由于碱性氨基酸残基所具有的正电荷，向细胞中导入核酸复合物的效率降低。

作为更优选的肽链的氨基酸序列，可列举出(RL)_n和(LR)_n中任一项所示的氨基酸序列。其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基。精氨酸(R)残基含有胍基作为碱性基团，如下述的化学式所示的那样，由于其可与磷酸基强烈地相互作用，因此在形成稳定的复合物的方面是优选的。

[化学式1]

另外，n为表示RL或LR的重复次数的自然数，可以根据用于形成复合物的双链核酸分子的链长、即双链核酸分子所具有的磷酸基(负电荷)的数量等进行适当选择。双链核酸为siRNA时，n为例如5以上、优选为5以上且20以下、更优选为7以上且10以下的自然数。n低于5时，难以与双链核酸分子形成稳定的结合，另一方面，n变得过大时，可能会产生显现细胞毒性、或难以完全中和磷酸基的负电荷等问题。

核酸载体优选对靶细胞以及靶细胞内的特定部位或细胞器(细胞内小器官)的一者或两者具有定位化活性。关于成为核酸复合物的定位化对象的靶细胞、或者靶细胞内的特定部位或细胞器，可以根据要导入靶细胞内的双链核酸分子的种类和该细胞内的功能等进行适当选择。

赋予定位化活性的手段可以根据成为核酸复合物的定位化对象的靶细胞、或者靶细胞内的特定部位或细胞器来使用任意的公知手段。例如，作为用于赋予对靶细胞的定位化活性的手段的具体例子，可列举出使特异性地存在于该靶细胞的受体所对应的配体与核酸载体结合。另外，作为用于赋予对靶细胞内的特定部位或细胞器的定位化活性的手段的具体例子，可列举出使具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽与核酸载体结合。作为可以结合的信号肽的具体例子，可列举出各种核定位化信号(NLS)和核输出信号(NES)等。

向核内定位化通过以下实现：NLS与作为转运蛋白的输入蛋白和作为GTP结合蛋白之一的Ran结合，使该结合体被核孔复合物识别，从而从细胞质通进核内来实现。

作为NLS的具体例子，可列举出具有下述的序列号1~7中任一个所示的氨基酸序列的肽。

QAKKKKLDK [序列号1](来源于核质蛋白（ヌクレオプラスミン，nucleoplasmin）的NLS序列)

SPQPKKKP [序列号2](来源于人p53的NLS序列)

RQARRNRRRRWR [序列号3](来源于HIV-1Rev蛋白的NLS序列)

GPKKKRKV [序列号4](来源于SV40T抗原的NLS序列)

NSAAFEDLRVLS [序列号5](来源于流感病毒核质蛋白的NLS序列)

RQIKIWFQNRRMKWKKEN[序列号6](来源于触角足穿膜肽(アンテナペディアペネトラチン，antennapedia penetratin)的NLS序列)

GRKKRRQRRRPPQG[序列号7](来源于HIV-1Tat蛋白的NLS序列)

由核内向细胞质的转运通过以下实现：NES与作为转运蛋白的CRM1和作为GTP结合蛋白之一的Ran结合，使该结合体被核孔复合物识别，从而从核通进细胞质来实现。

作为NES的具体例子，可列举出具有下述的序列号8~13中任一个所示的氨基酸序列的肽。

LPPLERLTL [序列号8](来源于HIV-1Rev蛋白的NES序列)

ALQKKLEELELDE [序列号9](来源于MAPKK的NES序列)

LALKLAGLDI [序列号10](来源于PKI-α的NES序列)

SLEGAVSEISLRD [序列号11](来源于Dsk-1的NES序列)

LPVLENLTL [序列号12](来源于TFIIIA的NES序列)

LASLMNLGMS [序列号13](来源于Matrin3的NES序列)

关于这些信号肽，在不会抑制复合物的形成和向细胞内的导入的条件下，可以结合于核酸载体分子内的任意位置，例如与双链核酸分子成键的多肽链的N-末端侧或C-末端侧，或者在不会抑制β-折叠结构的表达的条件下，可以结合于侧链，信号肽的N-末端侧和C-末端侧的任一侧与双链核酸分子结合均可，优选的是，信号肽的C-末端结合于与双链核酸分子成键的肽链的N-末端。与双链核酸分子成键的多肽链与信号肽可以直接结合，也可以介由适当的间隔分子(spacer molecule)进行结合。作为间隔分子的具体例子，可列举出亚烷基、聚氧亚乙基、寡肽等。

核酸载体也可以结合除靶细胞上的受体所对应的配体、信号肽以外的功能性分子。作为功能性分子的具体例子，可列举出用于提高对细胞膜的亲和性的长链烷基、脂质分子等。

由于核酸载体以多肽为主要构成要素，因此细胞毒性比阳离子系脂质体等现有的核酸载体低，可以降低应用于基因治疗、基因制剂时的副作用，可以适合地应用于这些用途。

核酸载体的细胞毒性可以通过将其导入靶细胞并经过规定时间后的细胞存活率来评价。

(2)核酸复合物

通过介由核酸载体中的碱性氨基酸的侧链与双链核酸分子中的磷酸基的静电相互作用而使两者结合，可以得到核酸复合物。

作为用于形成复合物的双链核酸分子，可以是DNA、RNA中的任一种，关于向细胞内导入的目的，例如，可以是用于产生期望的蛋白质、用“诱饵”短链核酸捕捉识别双链DNA的序列的转录因子等(诱饵法，decoymethod)、或RNA干扰法(RNAi)等任意目的。因此，作为双链核酸分子，可列举出编码欲使其在细胞内表达的蛋白质的双链DNA、诱饵核酸(decoynucleic acids)、siRNA等。双链核酸分子的碱基长和碱基序列根据向细胞中导入核酸复合物的目的、靶细胞、成为治疗对象的疾病种类等而异，在siRNA的情况下，碱基数为9~50碱基、优选为15~30碱基、更优选为18~28碱基。在人的情况下，如果碱基数为17以上，则所得聚核苷酸的总数(4¹⁷=1.7×10¹⁰)超过人的基因总数(6×10⁹)，从而使仅抑制特定基因的表达在统计学上成为可能。

关于碱基序列，在成为表达对象的蛋白质的氨基酸序列或靶基因的碱基序列已知的情况下，可以以能够从GenBank、EMBL、PDB、DDBJ等数据库中得到的序列数据为基础，使用任意的公知方法，设计向靶细胞内导入的双链核酸分子。或者，也可以通过任意的公知方法来决定利用任意的公知方法分离的靶蛋白质的氨基酸序列或编码该氨基酸序列的mRNA的碱基序列，并根据这些序列来设计双链核酸分子。

作为抑制具有与要导入的双链核酸分子互补的碱基序列的靶核酸的表达的机构，可列举出：(1)通过特异性地水解RNA/DNA杂交链中的RNA链的核糖核酸酶H来分解mRNA/聚核苷酸复合物；(2)通过核糖体复合物来抑制翻译；(3)在聚核苷酸以内含子和外显子的接界部为靶时，抑制mRNA的剪接；(4)通过RNA干扰来特异性地水解mRNA的碱基序列；(5)通过诱饵核酸来抑制转录控制因子等。

核酸复合物优选对靶细胞以及靶细胞内的特定部位或细胞器(细胞内小器官)的一者或两者具有定位化活性。关于核酸复合物的定位化对象即靶细胞、或者靶细胞内的特定部位或细胞器，可以根据要导入靶细胞内的双链核酸分子的种类和该细胞内的功能等进行适当选择。

赋予定位化活性的手段可以根据核酸复合物的定位化对象即靶细胞、或者靶细胞内的特定部位或细胞器来使用任意的公知手段。例如，作为用于赋予对靶细胞的定位化活性的手段的具体例子，如上所述，可列举出使特异性地存在于该靶细胞的受体所对应的配体与核酸载体结合，或者使该配体与双链核酸分子结合。另外，作为用于赋予对靶细胞内的特定部位或细胞器的定位化活性的手段的具体例子，如上所述，可列举出使信号肽与核酸载体的至少一部分结合，或者使该信号肽与双链核酸分子结合。另外，向核酸复合物中导入的信号肽的量过多时，有可能会因核酸复合物的疏水性的降低而导致细胞导入效率的降低等，因此向核酸复合物中导入的信号肽的量可以根据双链核酸分子的分子量、靶细胞内的特定部位或细胞器、信号肽的分子量和亲水性等进行适当调节。优选的是，信号肽的N-末端或C-末端结合于双链核酸分子的5’-末端或3’-末端。

能够结合于核酸载体或双链核酸分子的信号肽的具体例子与上述情况相同，故省略详细说明。

(3)向细胞中导入核酸的方法

核酸复合物的制备可以使用任意的公知方法进行，例如，可以通过将双链核酸分子与核酸载体溶解在规定的pH缓冲液中，并混合，在规定温度下放置规定时间(例如，在室温下放置30分钟)来制备。双链核酸分子与核酸载体的混合比(摩尔比)优选后者过量以确实地形成复合物。优选的双链核酸分子与核酸载体的混合比为1:4~1:30、优选为1:10~1:30、更优选为1:15~1:20。根据需要，为了去除过量的核酸载体，可以使用凝胶过滤色谱法、离子色谱法、反相液相色谱法等任意的公知方法来提纯核酸复合物。

向靶细胞中导入核酸复合物也可以使用任意的公知方法来进行。在体外(invitro)向培养细胞中导入核酸基因时，例如，也可以通过向包含靶细胞的培养基或培养液中添加核酸复合物，在规定温度下培养规定时间来进行，还可以使用电穿孔法、磷酸钙法、超声波照射法等其它公知方法来进行。在体内(in vivo)向靶细胞中导入核酸复合物可以通过使用了注射、点滴等方法的全身给药或局部给药等来进行。向细胞中导入的效率可以通过荧光显微镜观察等使用标记有荧光标记的双链核酸分子来进行。

对成为核酸复合物的导入对象的靶细胞没有特别限定，只要可以通过导入外源性的核酸来控制基因的表达，则可以以任意细胞作为靶细胞。

由本发明提供的向细胞中导入核酸的方法、核酸载体以及核酸复合物通过修补细胞内缺损的基因、或者修复或改正因带有异常基因而罹患功能不全的细胞的缺陷，可以适用于治疗疾病的基因治疗等。

实施例

以下，针对为了确认本发明的作用效果而进行的实施例进行说明。

[实验操作]

(1)核酸载体

本实施例中使用的核酸载体如下述的表1所示。需要说明的是，表1的氨基酸序列使用单字母简称来表示。另外，表1中，“-C₁₈”表示N-末端经十八烷基修饰的肽，“-Cholic A”表示N-末端介由酰胺键而结合有胆酸的肽，“Ac-”表示N-乙酰基酰胺。

为了与下述表1中示出的核酸载体(下述的序号1~21)进行比较，使用了作为阳离子性脂质体系核酸载体的RNAiFect(QIAGEN K.K..)。

[表1]

序号	氨基酸序列	序列号
			1	(RL)₅	14
2	(RL)₆	15
			3	(RL)₇	16
4	(RL)₈	17
			5	(RL)₉	18
6	(RL)₁₀	19
			7	(RL)₇-C₁₈
8	(RL)₇-Cholic A
			9	(RL)₈-C₁₈
10	Ac--QAKKKKLDK-(RL)₇-GK-OH	20
			11	Ac-SPQPKKKP-(RL)₇-GK-OH	21
12	Ac-RQARRNRRRRWR-(RL)₇-GK-OH	22
			13	Ac-GPKKKRKV-(RL)₇-GK-OH	23
14	Ac-NSAAFEDLRVLS-(RL)₇-GK-OH	24
			15	Ac-GRKKRRQRRRPPQG-(RL)₇-GK-OH	25
16	Ac-LPPLERLTL-GGGG-(RL)₇-GK-OH	26
			17	Ac-ALQKKLEELELDE-GGGG-(RL)₇-GK-OH	27
18	Ac-LALKLAGLDI-GGGG-(RL)₇-GK-OH	28
			19	Ac-SLEGAVSEISLRD-GGGG-(RL)₇-GK-OH	29
20	Ac-LPVLENLTL-GGGG-(RL)₇-GK-OH	30
			21	Ac-LASLMNLGMS-GGGG-(RL)₇-GK-OH	31

(2)靶细胞

将作为急性淋巴母细胞性白血病细胞的Jurkat细胞、作为慢性随性白血病细胞的K562细胞以及作为子宫颈癌细胞的Hela细胞用作靶细胞。

(3)双链核酸分子

针对Jurkat细胞和Hela细胞，使用hTERT(人端粒酶逆转录酶：与癌细胞的无限增殖化有关。)基因所对应的siRNA(21碱基对)作为双链核酸分子。Jurkat细胞和Hela细胞的hTERT基因相对应的siRNA的碱基序列分别如下述的序列号32和33所示。

5'-GGAGCAAGUUGCAAAGCAUTT-3'[序列号32]

5'-AUGCUUUGCAACUUGCUCCTT-3'[序列号33]

对于K562细胞，使用Bcr/abl(为9号染色体上的abl基因与22号染色体上的bcr基因融合而产生的嵌合体基因即费城染色体上存在的慢性随性白血病的致病基因，使细胞增殖信号异常亢进、使白血病细胞无序增殖。)基因相对应的siRNA(21碱基对)作为双链核酸分子。使用的siRNA的碱基序列如下述的序列号34和35所示。

5'-GCAGAGUUCAAAAGCCCUUTT-3'[序列号34]

5'-AACGGCUUUUGAACUCUGCTT-3'[序列号35]

(4)核酸复合物的制备

将200μM肽水溶液(超纯水)10μL与20μM的siRNA水溶液(超纯水)10μL在室温下混合，在37℃下培养30分钟。

(5)向靶细胞中导入

向靶细胞的培养液或培养基中添加上述(4)中制备的核酸复合物。添加量为100nM、200nM或400nM中的任一种。添加核酸复合物后，在37℃下培养规定时间。对于培养时间，Jurkat细胞和K562细胞的情况为24小时，HeLa细胞的情况为48小时。

(6)向靶细胞中导入核酸复合物的效率的评价

对于向靶细胞中导入核酸复合物的效率进行如下评价：使用用荧光标记进行了标记的双链核酸分子，对制备的核酸复合物和培养后的靶细胞进行荧光显微镜观察来评价。

(7)半衰期的评价

通过37℃下10%FBS中的核酸复合物所含的siRNA的分解率的经时变化求出核酸复合物所含的siRNA的半衰期。siRNA的分解率通过将核酸复合物加热后分离的siRNA的甲醛改性琼脂糖凝胶电泳来求出。

(8)细胞毒性的评价

核酸载体的细胞毒性通过核酸载体和培养的靶细胞的存活率的经时变化而求出。

(9)基于RNAi的靶基因的沉默效果的研究

基于RNAi的靶基因的沉默效果进行如下研究：使培养后的细胞溶解，使用RT-PCR法进行靶基因的扩增后，以β-肌动蛋白基因为内标，定量地求出表达量的变化。

[结果]

(1)核酸复合物中的核酸载体的构造

用于制备核酸复合物的siRNA、由氨基酸序列(RL)₇形成的核酸载体3(表1中的序号。以下相同。)、以及由这些得到的核酸复合物的圆二色性(CD)谱图示于图1。核酸载体3单独存在时，可观测到来源于无规卷曲结构的CD谱图，而与此相对，核酸复合物中，在217nm处可观测到β-折叠结构特有的强负Cotton效果。由这些结果可知，核酸载体3在具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，形成了具有正电荷的精氨酸(R)的侧链配置在单面一侧、疏水性的亮氨酸(L)的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构。另外，对于氨基酸序列不同的肽，未观测到与双链核酸形成复合物以及β-折叠结构的表达，因此暗示了：介由精氨酸的胍基与磷酸基的静电相互作用以及双链核酸分子与核酸载体3的肽链之间的氢键的一者或两者，两者之间形成了强结合。

(2)向靶细胞中导入核酸复合物的效率

针对由碱性氨基酸即精氨酸与疏水性氨基酸即亮氨酸交替排列而成的氨基酸序列(RL)_n(5≤n≤10)形成的核酸载体1~6，研究了向Jurkat中导入hTERT相对应的荧光标记siRNA的效率，结果示于图2。为了比较，一并示出使用RNAiFect时的结果。由这些结果可确认，siRNA单独存在时，无法侵入细胞内部，但使用RNAiFect以及n为7以上的核酸载体3~6时，可以将siRNA导入细胞内部。

使用由氨基酸序列(RL)₇形成的核酸载体3，一并研究了核酸载体3与siRNA的摩尔比对向Jurkat细胞中导入siRNA的效率产生的效果。结果示于图3。由这些结果可确认，为了充分确保向Jurkat细胞中导入siRNA的效率，核酸载体3与siRNA的摩尔比需要为1:6以上、更优选为1:10以上。

向核酸载体3和4中导入疏水性基或信号肽(NLS)对向Jurkat细胞中导入siRNA的效率产生的效果示于图4。由这些结果可确认，核酸载体3与Jurkat细胞的组合(核酸载体12)中，通过向N-末端导入十八烷基和来源于HIV-1Rev蛋白质的NLS，向Jurkat细胞中导入siRNA的效率大幅提升。

针对HeLa细胞进行同样试验的结果示于图5和图6。根据图5的结果可确认，为了充分确保向HeLa细胞中导入siRNA的效率，核酸载体3与siRNA的摩尔比需要为1:15以上。另外，由图6的结果可确认，针对向HeLa细胞导入siRNA，向核酸载体3中导入来源于HIV-1Rev蛋白质的NES序列(核酸载体16)、来源于Dsk-1的NES序列(核酸载体19)以及来源于Matrin3的NES序列(核酸载体21)时，siRNA的导入效率增大。

(3)核酸复合物所含的siRNA的半衰期

用凝胶电泳监测10%FBS中的siRNA和核酸复合物所含的siRNA的分解率的经时变化的结果示于图7、图8、下述表2和表3。根据图7的结果可确认，siRNA在10%FBS中迅速(半衰期为2小时左右)分解，但通过与核酸载体3~6形成核酸复合物，半衰期增大至数倍~20倍左右。另外，针对未观测到向细胞中导入siRNA的效率出现增加的核酸载体1和2，未观测到这样的半衰期的增加，因此可以认为是在10%FBS中的半衰期的增加是因形成核酸复合物而造成的。另外，针对RNAiFect，未观测到由复合物的形成而引起的半衰期的增加。另外，如图8所示那样，导入NES序列的核酸载体16~21也观测到半衰期的增加，尤其是核酸载体16可观察到显著的效果。

[表2]

[表3]

(4)细胞毒性

针对Jurkat细胞和K562细胞，研究了在核酸载体1~6和RNAiFect的存在下培养时的存活率的经时变化。24小时后的存活率示于图9和10。如图9所示可知，相对于Jurkat细胞，核酸载体1~6几乎均未显示细胞毒性。另一方面，相对于K562细胞，如图10所示，可观测到，以高浓度添加核酸载体2~5时，24小时后的存活率降低。然而可知，在实际使用的1~2μM程度的浓度下，核酸载体1~6全部显示出90%以上、明显高于RNAiFect的细胞存活率。尤其是，核酸载体1和6相对于K562细胞几乎未显示细胞毒性。

(5)使用了核酸复合物的RNAi带来的Jurkat细胞hTERT基因的沉默效果

在Jurkat细胞的hTERT基因相对应的siRNA(21碱基对：序列号32)与核酸载体3的复合物的存在下培养Jurkat细胞(48小时)时的、hTERT基因的表达量的测定结果示于下述的表4。由该结果可以确认：核酸载体3显示出与RNAiFect同程度的核酸导入效率。

[表4]

(6)使用了核酸复合物的RNAi带来的HeLa细胞hTERT基因的沉默效果

在HeLa细胞的hTERT基因相对应的siRNA(21碱基对：序列号33)与核酸载体3的复合物的存在下培养HeLa细胞(48小时)时的、hTERT基因的表达量的测定结果示于下述的表5。由该结果可以确认，核酸载体3在siRNA的添加量比使用RNAiFect时更少的情况下，显示出与RNAiFect同程度的沉默效果。

[表5]

(7)使用了核酸复合物的RNAi带来的K562细胞Bcr/abl基因的沉默效果

在K562细胞的bcr/abl基因相对应的siRNA-revNES共轭(共价键体)(100nM)(具有序列号34所示的碱基序列的siRNA的5’-末端直接共价结合具有序列号8所示的氨基酸序列的HIV-1rev蛋白NES序列的N-末端。)与核酸载体3(10当量)或核酸载体LRALLRALLRALLRALLRALLRAL(序列号36、10当量)的复合物的存在下培养K562细胞(48小时)时的、bcr/abl基因的表达量的测定结果示于下述的表6。

由这些结果可确认，在K562细胞的情况下，通过使用利用结合有信号肽的siRNA制备的核酸载体，向细胞中导入核酸的效率和K562细胞Bcr/abl基因的沉默效果大幅提升。

[表6]

Claims

1.一种向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，该方法具备以下工序：在具有精氨酸与疏水性氨基酸亮氨酸交替排列而成的(RL)_n和(LR)_n中任一者所示的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的所述精氨酸的侧链配置在单面一侧、所述疏水性氨基酸亮氨酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链的核酸载体与所述双链核酸分子接触，介由形成了β-折叠结构的所述肽链中的所述精氨酸的侧链与磷酸基的静电相互作用以及所述双链核酸分子与形成了β-折叠结构的所述肽链之间的氢键的一者或两者，使所述双链核酸分子与所述肽链结合而形成核酸复合物的工序；以及，将所述核酸复合物导入细胞的工序；

其中，在所述(RL)_n和(LR)_n中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，n表示7以上且10以下的自然数。

2.根据权利要求1所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，在所述形成核酸复合物的工序中，所述双链核酸分子与核酸载体的摩尔比为1:4～1:30。

3.根据权利要求1所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述双链核酸分子为siRNA。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述核酸复合物具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性。

5.根据权利要求4所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述核酸复合物所含的所述双链核酸分子或所述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。

6.根据权利要求5所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述信号肽为下述的序列号3以及序列号8～序列号11中任一个所示的氨基酸序列，

7.根据权利要求5或6所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述信号肽的末端结合于所述核酸载体所含的肽链或所述双链核酸的末端。

8.根据权利要求1所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述肽链具有用(RL)_n表示的氨基酸序列，并且所述核酸复合物所含的所述双链核酸分子或所述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽；

其中，R、L分别表示精氨酸残基、亮氨酸残基，n表示7以上且10以下的自然数。

9.根据权利要求8所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述信号肽为下述的序列号3和序列号8～序列号11中任一个所示的氨基酸序列，

10.根据权利要求8或9所述的向细胞中导入核酸的方法，其特征在于，所述信号肽的末端结合于所述核酸载体所含的肽链或所述双链核酸的末端。

11.一种核酸复合物，其特征在于，该核酸复合物为在具有精氨酸与疏水性氨基酸亮氨酸交替排列而成的(RL)_n和(LR)_n中任一者所示的氨基酸序列、并具有双螺旋结构的双链核酸分子的存在下，使具有形成具有正电荷的所述精氨酸的侧链配置在单面一侧、所述疏水性氨基酸亮氨酸的侧链配置在对面一侧的β-折叠结构的肽链的核酸载体与双链核酸分子介由所述核酸载体的形成了β-折叠结构的肽链中含有的所述精氨酸的侧链与所述双链核酸分子的磷酸基的静电相互作用以及所述双链核酸分子与形成了β-折叠结构的所述肽链之间的氢键的一者或两者而结合得到的；

12.根据权利要求11所述的核酸复合物，其特征在于，所述双链核酸分子为siRNA。

13.根据权利要求11或12所述的核酸复合物，其特征在于，所述双链核酸分子或结合于其的所述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽。

14.根据权利要求13所述的核酸复合物，其特征在于，所述信号肽为下述的序列号3以及序列号8～序列号11中任一个所示的氨基酸序列，

15.根据权利要求13所述的核酸复合物，其特征在于，所述信号肽的末端结合于所述核酸载体所含的肽链或所述双链核酸的末端。

16.根据权利要求11所述的核酸复合物，其特征在于，所述肽链具有用(RL)_n表示的氨基酸序列，并且所述核酸复合物所含的所述双链核酸分子或所述核酸载体的至少一部分结合有具有对靶细胞和/或其特定部位的定位化活性的信号肽；

17.根据权利要求16所述的核酸复合物，其特征在于，所述信号肽为下述的序列号3和序列号8～序列号11中任一个所示的氨基酸序列，

18.根据权利要求16或17所述的核酸复合物，其特征在于，所述信号肽的末端结合于所述核酸载体所含的肽链或所述双链核酸的末端。