CN103360461B - 一种人il-12亲和纯化层析柱、其制备方法及利用其纯化重组人il-12的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备重组人IL‑12亲和纯化层析柱的工艺、由该工艺制得的重组人IL‑12亲和纯化层析柱、及用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL‑12的方法。具体地说，本发明涉及用抗人IL‑12的杂交瘤细胞株制备抗人IL‑12单克隆抗体，并用该抗体制备重组人IL‑12亲和纯化层析柱，然后用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL‑12的工艺流程。更具体地说，本发明涉及一种采用亲和层析柱纯化重组人IL‑12的方法，其特征在于用抗人IL‑12单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备抗体，用该抗体制备人IL‑12亲和纯化层析柱，然后以该亲和纯化层析柱为基础进行纯化重组人IL‑12的方法。

Description

一种人IL-12亲和纯化层析柱、其制备方法及利用其纯化重组人IL-12的 方法

技术领域

本发明涉及一种制备重组人IL-12亲和纯化层析柱的工艺、由该工艺制得的重组人IL-12亲和纯化层析柱、及用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的方法。具体地说，本发明涉及用抗人IL-12的杂交瘤细胞株制备抗人IL-12单克隆抗体，并用该抗体制备重组人IL-12亲和纯化层析柱，然后用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的工艺流程。

背景技术

重组人白细胞介素12(IL-12)最初称作自然杀伤细胞刺激因子(naturalkiller cell stimulatory factor，NKSF)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF)，主要是由激活的单核细胞和其他类型的细胞(树突状细胞、B细胞、中性粒细胞以及角质细胞)产生。IL-12所具备的增加NK细胞和活化T细胞的细胞毒活性、诱生IFN-γ、调节Th1细胞的发育等免疫学活性是IL-12抗肿瘤、抗病毒效应的理论基础，动物实验亦充分证实其药用价值。以此为基础，重组人IL-12(rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病的II/III期临床试验阶段。

人IL-12是由p40和p35两个亚基通过二硫键共价连接而成异二聚体糖蛋白，其分子量约为70-75kDa，等电点为4.5-5.5，其中p35亚单位有197个氨基酸残基，含7个半胱氨酸(cys)和3个N糖基化位点，p40亚单位306个氨基酸残基，有10个半胱氨酸，4个N-糖基化位点。p35有3个分子内二硫键，p40有4个分子内二硫键，同时p35和p40之间存在一对分子间二硫键在。单独p40或p35均无生物学活性，而且游离p40可以竞争IL-12p70与IL-12受体的结合位点，从而抑制IL-12的活性。由于人IL-12的分子的特殊性和复杂性，用原核表达系统或酵母系统进行表达时，其产品无生物学活性，通常采用昆虫或哺乳动物细胞进行表达。本课题组采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达人IL-12(见专利ZL03131567.4)。

重组人IL-12的纯化工艺是人IL-12工业生产的重要环节，国内外多个研究组或公司均有相关专利或文献报道，例如在本研究组已公开的专利申请200410080518.7(纯化重组人白细胞介素12的方法田志刚等2004年)中采用了超滤、阴离子、阳离子、疏水、分子筛的五步工艺法进行纯化。在国内专利CN 101033254(一种纯化重组人白细胞介素12的方法浦勤等2007年)中采用了超滤、阴离子/阳离子、硫胺沉淀、阳离子/阴离子、疏水、分子筛的六步工艺法进行纯化，这两种方法相对繁琐，步骤较多。虽然国内专利ZL01133658.7(人白细胞介素-12在银纹夜蛾中的表达及其纯化的方法孟小林等2004年)中采用亲和法纯化人IL-12，但是该过程为亲和层析一步法纯化，无样品预处理，容易污染亲和柱，而且无人IL-12聚体去除过程。此外，由于重组人IL-12纯化的困难性，目前生物公司所提供的商业重组人IL-12产品，售价往往很高，非常不利于涉及人IL-12的研究及其大规模药用生产的开展。

本发明中采用抗人IL-12的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，并用该抗体制备重组人IL-12亲和纯化层析柱，然后用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的工艺流程。该流程只需4步即可得到纯度超过95％的rhIL-12样品，可以大大缩短工作流程及时间，并提高回收率和产物的纯度。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种制备重组人IL-12亲和纯化层析柱的工艺，以及由该工艺制得的重组人IL-12亲和纯化层析柱。具体地说，本发明涉及用抗人IL-12的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，并用该抗体制备重组人IL-12亲和纯化层析柱。本发明还涉及利用该亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的方法。

在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种采用亲和层析柱纯化重组人IL-12的方法，其特征在于用抗人IL-12单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备抗体，用该抗体制备人IL-12亲和纯化层析柱，然后以该亲和纯化层析柱为基础进行纯化重组人IL-12的方法。

本发明的一个目的是提供利用人IL-12亲和层析柱纯化重组的人IL-12的方法。具体地，所述方法包括超滤、阴离子交换层析、亲和层析和分子筛四个纯化步骤：

a.超滤：获得含重组人IL-12(rhIL-12)的培养上清，选用10-30kD的超滤膜，将上清液超滤浓缩约10-15倍，0.22-0.45μm滤膜过滤除去不溶性微粒；

b.阴离子交换层析：采用阴离子交换层析柱，20mM Tris-HCl平衡液平衡，40mM组氨酸缓冲液洗脱杂蛋白，0.25M NaCl 20mM Tris-HCl洗脱目的蛋白；

c.亲和层析：采用按照本发明的工艺制得的人IL-12亲和层析柱(这构成本发明的另一个方面，见下)纯化rhIL-12，用20mM Tris-HCl平衡液平衡，用20mM Gly-HCl缓冲液洗脱，用1M Tris将洗脱蛋白的pH调为7.0左右；

d.分子筛：利用分子筛去除聚体蛋白，得到纯化的重组人IL-12单体。

本领域技术人员应该理解，其中，获得含重组人IL-12(rhIL-12)的培养上清可以通过按国内专利ZL03131567.4中公开的培养方法培养表达重组人IL-12的CHO细胞而获得。在ZL03131567.4中，发明人构建分别表达人IL-12的p40亚单位和p35亚单位的真核表达载体pcDNA3/p40和pEF13/p35，共转染CHO细胞，利用G418和甲硫氨酸亚砜筛选获得高表达重组人IL-12的工程细胞株。所述方法简单的利用人IL-12 P40和P35天然表达不平衡的特性，采用两种表达效率不同的载体，以使两条链的表达尽量平衡。该专利的内容通过引用完全结合在本申请中。当然，本发明对如何获得包含重组人IL-12(rhIL-12)的培养上清没有任何限制，只要所述培养上清中包含有活性的重组人IL-12即可用于本发明的纯化方法。

本领域技术人员应该理解，所述阴离子交换层析柱包括，但不限于，Sepharose，Capto，Sephadex，Sephacel等为骨架，Q，QAE，DEAE为活性基团的凝胶，例如：Q-Sepharose FF，Capto Q，Q-Sepharose HP，CaptoDEAE，QAE Sephadex，DEAE-Sepharose FF，DEAE Sephadex等；可用的分子筛包括，但不限于，Sephacryl，Superdex，Sephadex，Superose，Sepharose等为骨架的凝胶，例如：Sephacryl S-200 HR，Superdex 200，Sephadex G-100等。

另外，本领域技术人员还应该理解，本发明提供的利用重组人IL-12亲和层析柱纯化重组的人IL-12的方法所包含的超滤、阴离子交换层析、亲和层析和分子筛四个纯化步骤之间的顺序不是固定不变的，本领域技术人员可以根据实际需要进行适当的调整，例如，可以在进行超滤步骤之后，进行亲和层析，然后再进行阴离子交换层析，等等。

本发明的再一个目的是提供利用抗人IL-12的单克隆抗体制备亲和纯化层析柱的方法，所述方法包括下述步骤：

a.活化凝胶预处理：

取适量的活化凝胶(例如，CNBr或NHS活化的琼脂糖凝胶，购自GE公司)，用1mM HCl进行完全溶解，并用1mM HCl冲洗胶体，然后再用0.1M NaHCO₃，冲洗胶体；

b.抗rhIL-12抗体的偶联及亲和层析柱的制备：

通过超滤浓缩的方法将按本发明下文提供的方法制备的或购买的抗rhIL-12抗体浓缩至4-5mg/ml，然后将抗rhIL-12抗体加入活化凝胶中，置4℃过夜，然后用0.1M NaHCO₃冲洗胶体，用0.1M Tris-HCl缓冲液封闭未结合的活性基团，然后用0.1M Tris-HCl缓冲液和0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液交替冲洗胶体，最后将共价结合抗rhIL-12抗体的凝胶装柱，制备成纯化rhIL-12的亲和层析柱。

其中，步骤a中的活化凝胶可以为CNBr(溴化氰)、NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)、Epoxy(环氧树脂)等活化的Sepharose为骨架的凝胶，例如：CNBr-activated Sepharose 4FF、NHS-activated Sepharose 4FF、CNBr活化的Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B、Activated CHSepharose 4B、EAH Sepharose 4B、ECH Sepharose 4B、Thiopropyl Sepharose6B等。

本发明的又一个目的是提供利用人IL-12杂交瘤制备抗人IL-12单克隆抗体的方法。

通常，从产生抗人IL-12抗体的杂交瘤细胞(例如，ATCC CRL-2382，克隆号为20C2，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC))收集本发明的抗人IL-12单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞培养上清中获得抗体，具体来说，细胞传代培养3-5天后收培养上清，上清中含有一定浓度的单克隆抗体。或者将杂交瘤细胞注射到不完全弗氏佐剂预先处理的小鼠腹腔，通过抽取小鼠腹水中获得单克隆抗体。通常，杂交瘤都采用BALB/c小鼠作为免疫动物进行抗体生产，常规做法为石蜡或降脂烷腹腔注射1周后，再腹腔注射1-2×10⁶杂交瘤细胞，7-10天左右产生腹水。但是克隆号为20C2的杂交瘤用常规的石蜡预先处理无腹水产生。虽然用不完全弗氏佐剂预先处理可以在10-14天左右产生腹水，但是其效价比裸鼠低至少100倍(图1)。因此，本发明提供利用人IL-12杂交瘤制备抗人IL-12单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤：用不完全弗氏佐剂处理8-10周龄的裸鼠，每只小鼠腹腔注射500μl不完全弗氏佐剂；3天之后腹腔注射杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶细胞；7-10天左右产生腹水，收集小鼠腹水，离心收上清即腹水抗体。通过上述方法获得的抗人IL-12抗体，可以Protein G亲和层析方法纯化。

有益效果：本发明提供了一种快速高效的rhIL-12的纯化方法，通过采用hIL-12亲和纯化层析柱纯化重组人IL-12的工艺流程，只需4步即可得到纯度超过95％的rhIL-12样品，可以大大缩短工作流程及时间，并提高回收率和产物的纯度，特别适合工业生产。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1，由BALB/c和裸鼠生成的抗人IL-12抗体的亲和力比较。

图2，抗人IL-12抗体的Protein G纯化图谱。

图3，抗人IL-12抗体纯度鉴定结果。

图4，阴离子交换柱纯化rhIL-12的结果。

图5，利用本发明的人IL-12亲和柱纯化rhIL-12的结果。

图6，分子筛纯化rhIL-12结果。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售分析纯级别产品。

实施例1：单克隆抗体的制备

1.培养上清或腹水制备：

从产生抗人IL-12的杂交瘤细胞(ATCC CRL-2382，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC))收集本发明的抗人IL-12单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞培养上清中获得抗体，具体来说，细胞传代培养2-3天后收培养上清，上清中含有一定浓度的单克隆抗体。或者将杂交瘤细胞注射到不完全弗氏佐剂预先处理的小鼠腹腔，通过抽取小鼠腹水中获得单克隆抗体，具体来说，用不完全弗氏佐剂处理8-10周龄的裸鼠，每只小鼠腹腔注射500μl不完全弗氏佐剂。一周之后腹腔注射杂交瘤细胞，每只小鼠1-2×10⁶细胞，7-10天左右产生腹水，收集小鼠腹水，离心收上清，用PBS(pH7.0)稀释3-5倍后用0.45μm滤膜过滤。

2.抗人IL-12单克隆抗体的纯化：

通过上述方法获得的培养上清/腹水，可以用Protein G亲和层析方法纯化。用PBS缓冲液平衡Protein G亲和层析柱，将处理过的腹水或培养上清上样，再用PBS缓冲液平衡Protein G亲和层析柱，用0.1M柠檬酸洗脱目的抗体，并立即用0.5M Na₂CO₃的调节目的抗体的pH为7左右，以免蛋白变性。抗体的纯度用SDS-PAGE鉴定。如图2所示，经过纯化的单克隆抗体的纯度达到95％以上，单克隆抗体分子量重链约50kDa，轻链约26kDa。

实施例2：人IL-12亲和层析柱的制备

1.CNBr活化的Sepharose 4B凝胶预处理

称取适量CNBr(溴化氰)活化的Sepharose 4B凝胶(购自GE公司)，慢慢地加入1mM HCl中并且不断的摇匀，待凝胶完全溶解，静置至凝胶沉底，弃去上清，再加入适量的1mM HCl重新悬起凝胶，再静置15min，弃去上清，反复操作5次。然后再用0.1M NaHCO₃(pH＝8.3)，冲洗胶体，每毫升的胶体用至少5ml 0.1M NaHCO₃(pH＝8.3)冲洗。

2.抗rhIL-12抗体的偶联及亲和层析柱的制备

通过超滤浓缩的方法将按实施例1制备的或从BD公司购买的(货号为555065，克隆号为20C2)抗rhIL-12的抗体浓缩至4-5mg/ml，然后将rhIL-12抗体加入经步骤1处理的凝胶中，测上清蛋白浓度，置4℃过夜。然后用0.1M NaHCO₃(pH＝8.3)冲洗胶体5次，用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)封闭未结合的活性基团3次，并静置2h。然后用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)和0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.0)交替冲洗胶体，至少洗5个循环。将结合rhIL-12抗体的胶体装柱，制备成纯化rhIL-12抗体的亲和层析柱。

实施例3：利用实施例2制备的人IL-12亲和层析柱纯化rhIL-12的方法

1.超滤：含rhIL-12的培养上清，选用10-30kD的超滤膜(购自Millipore)，将上清液超滤浓缩至约10-15倍，用0.22-0.45μm滤膜(购自Millipore)过滤除去不溶性微粒。

2.阴离子交换层析：采用Q-Sepharose Fast Flow柱(购自GE公司)，20mMTris-HCl平衡液(pH＝8.0)平衡，40mM组氨酸缓冲液洗脱杂蛋白，0.25MNaCl 20mM Tris-HCl(pH＝8.0)洗脱目的蛋白。阴离子柱纯化的rhIL-12样品的纯度达20％以上(结果见图4)。

3.亲和层析：采用实施例2制备的人IL-12亲和层析柱纯化rhIL-12，用20mMPBS平衡液(pH＝7.2)平衡，用20mM Gly-HCl缓冲液(pH＝2.5)洗脱，用1M Tris(pH＝9.0)将洗脱蛋白的pH调为7.0左右。纯化的rhIL-12样品的纯度达80％以上(结果见图5)。

4.分子排阻层析：利用Sephacryl S-200HR(购自GE公司)去除聚体蛋白，最终rhIL-12蛋白纯度超过95％(结果见图6)。

本领域技术人员还应该理解，本发明提供的利用重组人IL-12亲和层析柱纯化重组的人IL-12的方法所包含的超滤、阴离子交换层析、亲和层析和分子筛四个纯化步骤之间的顺序不是固定不变的，本领域技术人员可以根据实际需要进行适当的调整，例如，可以在进行超滤步骤之后，先进行亲和层析，然后再进行阴离子交换层析，等等。

实施例4：rhIL-12活性测定

参考国内专利201010134960.9(一种检测重组人白细胞介素-12蛋白活性的方法，田志刚等)，采用IFN-γ诱生法，使用Bender Systems公司生产的Human IFN-γ ELISA试剂盒检测IFN-γ的含量。具体检测步骤如下：

1.标准品和待检样品的稀释：IL-12标准品(购自NIBSC)用1640完全培养液(购自GIBCO公司)稀释成以下11个稀释度(ng/ml)：25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025，待检样品也稀释成以下11个稀释度(ng/ml)：25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025，备用；

2.IFN-γ的诱生：收集37℃，5％CO₂培养的处于对数生长期的NKG细胞(CGMCC No.2901，购自中国微生物菌株保藏委员会普通微生物中心(CGMCC))于50ml无菌离心管中，800rpm，10min，离心，弃上清，PBS溶液洗涤两遍后，悬于含1640完全培养基中，调整细胞浓度为5×10⁵个/ml，按100μl/孔将细胞加入96孔板。向加有细胞的96孔板对应孔中加入100μl不同稀释度的IL-12标准品和待测上清(每个稀释度做双复孔)。37℃，5％CO₂培养24小时后，每孔取50μl培养上清ELISA测定IFN-γ含量；

3.IFN-γ的测定：参考Bender Systems公司Human IFN-γ ELISA试剂盒的说明书，用标准品的浓度和对应的A值作标准曲线，输入待检样品A值直接求出待检样品IFN-γ含量；

4.IL-12活性计算：以IFN-γ含量对样品稀释度作曲线，计算各个实验样品的ED50(即IFN-γ含量为最大浓度的一半时的样品浓度)，并按下式计算结果：效价＝Pr×ED50r/ED50s。Pr：标准品效价，IU/mg；ED50r：标准品ED50；ED50s：待检样品ED50。

结果显示，由本发明实施例3的亲和法纯化的rhIL-12其比活性超过5.0×10⁶IU/mg，因此，按此方法纯化的IL-12有较高的活性。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (7)

1.一种利用抗人IL-12的单克隆抗体制备人IL-12亲和纯化层析柱的方法，所述方法包括下述步骤：

a.活化凝胶预处理：取适量的活化凝胶，用1mM HCl进行完全溶解，并用1mM HCl冲洗胶体，然后再用0.1M NaHCO₃冲洗胶体；

b.抗人IL-12抗体的偶联及亲和层析柱的制备：通过超滤浓缩的方法将抗人IL-12抗体浓缩至4-5mg/mL，然后将抗人IL-12抗体加入步骤a中预处理的活化凝胶中，置4℃过夜，然后用0.1M NaHCO₃冲洗胶体，用0.1M Tris-HCl缓冲液封闭未结合的活性基团，然后用0.1M Tris-HCl缓冲液和0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液交替冲洗胶体，最后将结合抗人IL-12抗体的胶体装柱，制备成纯化人IL-12的亲和层析柱；

其中步骤a所述的活化凝胶选自CNBr活化的Sepharose 4B凝胶、CNBr活化的Sepharose 4FF或NHS活化的Sepharose 4FF，并且

其中所述抗人IL-12抗体通过下述步骤制得：用不完全弗氏佐剂处理8-10周龄的裸鼠，每只小鼠腹腔注射500μL不完全弗氏佐剂；3天后，将保藏号为ATCC CRL-2382的杂交瘤细胞注射到裸鼠腹腔中，每只裸鼠1×10⁶个细胞；7-10天后产生腹水，收集裸鼠腹水，纯化制得所述抗人IL-12抗体。

2.一种纯化重组的人IL-12的方法，所述方法包括超滤、阴离子交换层析、亲和层析和分子筛四个纯化步骤，所述步骤的特征如下：

a.超滤：获得含重组人IL-12的培养上清，选用10-30kD的超滤膜，将上清液超滤浓缩10-15倍，0.45μm滤膜过滤除去不溶性微粒；

b.阴离子交换层析：采用阴离子交换层析柱，20mM Tris-HCl平衡液平衡，40mM组氨酸缓冲液洗脱杂蛋白，0.25M NaCl 20mM Tris-HCl洗脱目的蛋白；

c.亲和层析：采用权利要求1的方法制备用于亲和层析的层析柱来纯化重组人IL-12，用20mM Tris-HCl平衡液平衡，用20mM Gly-HCl缓冲液洗脱，用1M Tris将洗脱蛋白的pH调为7.0；

d.分子筛：利用分子筛去除聚体蛋白，得到纯化的重组人IL-12单体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述含重组人IL-12的培养上清由培养表达重组人IL-12的CHO细胞获得。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述阴离子交换层析是用填充了以Sepharose、Capto、Sephadex或Sephacel为骨架且以Q、QAE、DEAE为活性基团的凝胶的阴离子交换层析柱进行的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述阴离子交换层析柱选自Q-Sepharose FF，Capto Q，Q-Sepharose HP，Capto DEAE，QAE Sephadex，DEAE-Sepharose FF，或DEAE Sephadex。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述分子筛是以Sephacryl、Superdex、Sephadex、Superose或Sepharose为骨架的凝胶。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述分子筛选自Sephacryl S-200HR，Superdex 200或Sephadex G-100。