CN103374531A - 一种布拉迪活性干酵母及生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种布拉迪活性干酵母，其中干酵母的细胞总数为300-750亿/克、活细胞率为50-88％、水分为4-6％。该方法包含如下步骤：(1)菌种培养，将布拉迪酵母Saccharomyces boulardii菌株接种培养；(2)发酵罐种子培养；(3)发酵罐通气流加培养，当发酵20-28h时，将发酵液的pH调节至6.1-6.4，进行细胞脱色，以便使得产品的颜色更淡；在调节pH至6.1-6.4后的1.5-3h时，将发酵液的温度升高到30-35℃进行发酵，同时加入氯化钠；(4)分离；(5)加入乳化剂和植物油后进行造粒成型；以及(6)干燥得到酵母颗粒。
Description
技术领域
本发明涉及一种布拉迪活性干酵母，特别是涉及一种布拉迪活性干酵母的生产方法。
背景技术
布拉迪酵母菌(Saccharomy boulardii)又称布拉氏酵母菌、布拉酵母菌，其最早是在印尼荔枝中分离得到的.是酿酒酵母的亚种，曾被广泛应用于人类抗腹泻的药物中。其制剂应用于畜牧业，可有效降低病原菌和有关毒素的浓度.并能加强微生态平衡.刺激免疫系统.作为饲料添加剂的应用已得到包括中国、欧盟在内的世界上许多国家的认可。但是.其制剂在存放及运输过程中.布拉迪酵母菌体易死亡，以致影响其应用效果。因此，运输不方便成为制约布拉迪酵母发展的瓶颈。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种运输方便的布拉迪活性干酵母。得到了一种布拉迪活性干酵母，特别是涉及一种生产布拉迪活性干酵母的方法。
具体来说，本发明是通过下述技术方案解决技术问题的：
本发明提供了一种布拉迪活性干酵母，其中干酵母的细胞总数为300-750亿/克、活细胞率为50-88％、水分为4-6％。
本发明还提供了上述制备方法，包含如下步骤：
(1)菌种培养：将布拉迪酵母Saccharomyces boulardii接种到含糖量为5-20％的培养液中，在温度26-32℃条件下进行培养得到种子培养液；优选含糖量为10-20％，培养温度为27-30℃；
(2)发酵罐种子培养：将步骤(1)得到的种子培养液接种到含有营养源 的种子发酵罐中通入无菌空气到含糖量为5-20％的培养液中，在温度24-35℃条件下进行培养，得到发酵罐种子培养液；优选通入无菌空气的风量控制在10-30m3空气/m3发酵液/hr；优选培养液的含糖量为10-20％，培养温度为30-35℃；
(3)发酵罐通气流加培养：将步骤(2)得到的发酵罐种子培养液接种到发酵罐中，后流加含糖量为15-30重量％的糖源、同时补充营养源，通入无菌空气在温度24-35℃条件下进行培养，当发酵20-28h时，将发酵液的pH调节至6.1-6.4；优选在调节pH至6.1-6.4后的1.5-3h时，将发酵液的温度升高到30-35℃进行发酵；得到流加培养液；优选通入的无菌空气风量控制在30-80m3空气/m3发酵液/hr；
(4)分离：将步骤(3)得到的流加培养液进行分离得到鲜酵母；
(5)成型：在步骤(4)得到的鲜酵母中加入乳化剂和植物油后进行造粒，得到成形的酵母；以及
(6)干燥：将步骤(5)得到的成形酵母进行干燥得到酵母颗粒。
其中，步骤(1)接种的布拉迪Saccharomyces boulardii菌株为保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2012116的Saccharomyces boulardii布拉迪酵母安琪1.27菌株。
其中，步骤(3)中，将发酵液的温度升高到30-35℃进行发酵时加入氯化钠，优选按照最终得到流加培养液总质量的0.05％-0.2％加入氯化钠，更优选按照最终得到流加培养液总质量的0.05％-0.1％加入氯化钠。
其中，步骤(5)中在加入乳化剂和植物油搅拌均匀后，加入淀粉后进行造粒，优选按照鲜酵母中干物质的质量的1.5-3％加入淀粉；优选淀粉选自玉米淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉、马铃薯淀粉和/或红薯淀粉中的一种或几种；优选按照鲜酵母中干物质的质量的0.5-1％加入植物油。
其中，步骤(1)中所述菌株培养经过斜面菌种培养、一级液体种子培养和二级液体种子培养。
其中，步骤(1)和(2)中培养液的pH值为4-6，优选pH值为4.8-6.0。
其中，步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤重复进行两次以上。
其中，步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤中，控制发酵液中乙醇的含量在0.35％以下；优选通过降低糖源流加速度和加大通入无菌空气风量来控制发酵液中乙醇的含量。
其中，所述营养源为氮源、磷源、氯化钾、硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6和生物素；优选氮源选自硫酸铵、碳酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵和磷酸氢二铵中的一种或其组合；优选磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或其组合。
其中，步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤中，营养源的加入方式为氮源、磷源采用流加方式，氯化钾、硫酸镁及微量元素随同发酵罐种子培养液一同加入。
其中，所述乳化剂选自山梨醇单硬脂酸酯、山梨聚糖月桂酸酯、山梨聚糖棕桐酸酯、山梨聚糖硬脂酸酯、山梨聚糖硬脂酸甘油酯、山梨聚糖油酸酯或山梨聚糖甘油三油酸酯中的一种或其组合。
其中，所述植物油选自豆油，玉米油、芝麻油、菜籽油、葵花籽油、橄榄油和/或花生油。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的布拉迪活性干酵母。
本发明的有益效果是：
本发明以布拉迪酵母菌株通过本发明的工艺生产得到一种高活性干酵母产品，该工艺方法制备的布拉迪活性干酵母的活细胞率较高，可以以较低的成本大规模的工业化生产。
本发明制备布拉迪活性干酵母可以用于动物饲养和作为人使用的保健品，起到良好的止腹泻作用，通过此工艺生产的布拉迪活性干酵母的生产成本低于冻干制剂，同时其活细胞率高于一般工艺生产的干酵母，克服了因工艺不合适造成的不易干燥以及由此带来的活细胞率下降的弊病。
具体实施方式
本发明通过如下方法制备布拉迪活性干酵母，包括如下步骤：
(1)菌种培养：将布拉迪酵母Saccharomyces boulardii接种到含糖量为 5-20％的培养液中，在温度26-32℃条件下进行培养得到种子培养液；优选含糖量为10-20％，培养温度为27-30℃；
(2)发酵罐种子培养：将步骤(1)得到的种子培养液接种到含有营养源的种子发酵罐中通入无菌空气到含糖量为5-20％的培养液中，在温度24-35℃条件下进行培养，得到发酵罐种子培养液；优选通入无菌空气的风量控制在10-30m3空气/m3发酵液/hr；优选培养液的含糖量为10-20％，培养温度为30-35℃；
(3)发酵罐通气流加培养：将步骤(2)得到的发酵罐种子培养液接种到发酵罐中，后流加含糖量为15-30重量％的糖源、同时补充营养源，通入无菌空气在温度24-35℃条件下进行培养，得到流加培养液；优选通入的无菌空气风量控制在30-80m3空气/m3发酵液/hr；
(4)分离：将步骤(3)得到的流加培养液进行分离得到鲜酵母；
(5)成型：在步骤(4)得到的鲜酵母中加入乳化剂和植物油后进行造粒，得到成形的酵母；以及
(6)干燥：将步骤(5)得到的成形酵母进行干燥得到酵母颗粒；
本发明步骤(1)中的接种的布拉迪酵母菌株可以是市购的布拉迪酵母菌株，也可以是通过常规方法从自然界分离的布拉迪菌株，优选为通过本发明的方法分离的布拉迪酵母菌株。
在一种优选的实施方式中，在步骤(3)中，当发酵20-28h时，将发酵液的pH调节至6.1-6.4；优选在调节pH至6.1-6.4后的1.5-3h时，将发酵液的温度升高到30-35℃进行发酵；同时按照最终得到流加培养液总质量的0.05％-0.2％加入氯化钠。在该步骤中，在发酵到20-28小时的时候将pH用调节到6.1-6.4的目的是由于在此pH值下可以有效降低布拉迪酵母细胞对色素的吸附，使得最终产品的颜色更淡，活细胞率更高。其中在调节pH至6.1-6.4后的1.5-3h时，将发酵液的温度升高到30-35℃进行发酵，可以提高海藻糖在酵母细胞里的积累。其中同时加入氯化钠可以降低酵母细胞所含的水分，同时也可以提高海藻糖在细胞内的积累，有利于后期的干燥和今后的储藏。
在一种具体的实施方式中，造粒成型步骤中加入乳化剂和植物油混合可以 使得干燥的酵母产品在复水活化的时候的抗逆性增加，活细胞率提高。在该步骤中加入淀粉的目的是降低鲜酵母乳的粘度，有利于造粒步骤的顺利进行，缩短造粒时间，降低生产成本。
在上述制备过程中的有关术语在此定义如下：
所述“糖源”是指在酵母发酵过程中，提供主要碳源的物质，包括但不限于糖蜜如甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜，淀粉水解糖等。
实施例
首先，对下面实施例中布拉迪干酵母制备过程及产品进行分析时所用的测定装置和测定方法进行说明如下：
酵母菌种：安琪酵母有限公司的保藏菌种酵母Saccharomyces boulardii菌种(保藏于中国典型培养物保藏中心)
叠片式分离机：广重集团生产型号为D424；
真空转鼓过滤机：西玛常州通用设备有限公司；
造粒机：常州益民干燥设备有限公司；
沸腾流化床：荆州市五环容器制造有限公司；
麦芽汁固体培养基：生研(上海)生物科技有限公司；
麦芽汁：英博金龙泉啤酒(湖北)有限公司；
其中，具体测定方法如下：
发酵罐深层通气流加培养步骤中，乙醇的测定方法
实验器材：纱布、0.45μm过滤器、注射器、安捷伦高效气相色谱检测仪(GC7890A)。
检测方法
(1)取发酵液将其进行八层纱布过滤得到过滤初液；
(2)将该过滤初液用0.45μm微孔过滤器过滤得到气相检测样品；
(3)将步骤(2)的处理样品进行气相色谱检测鉴定；
气相色谱检测条件：
进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；分流比：37∶1；载气：N2； 色谱柱：反向HP-INNOWAX柱；
升温条件：起始温度40℃，保留5min，以4℃/min升温到73℃，再以12℃/min升温到150℃，最后以25℃/min升温到180℃，终温保留2min。
干酵母中细胞总数的测定方法
将干酵母用无菌生理盐水活化后，用显微镜和血球计数板所测得总的细胞数，是死细胞数和活细胞数之和；
干酵母中活细胞率的测定方法
将干酵母加入无菌生理盐水活化后，用次甲基蓝溶液进行染色，用显微镜和血球计数板测得的酵母活细胞数和总细胞数之比的百分数，染上蓝色的细胞为死细胞，没染上蓝色的细胞为活细胞；
干酵母中水分的测定方法为：以样品在103℃±2℃烘箱中烘干干燥，所失质量的百分数即为水分值；
海藻糖含量的测定方法：
1.原理
蒽酮和海藻糖起反应，使溶液呈亮绿色，而且成比例关系，于分光光度计630nm处测定其吸光度，以此计算海藻糖含量。
2.主要仪器
a 分析天平；分度值0.1mg；b 分光光度计；
c 离心机； d 振荡器；
e 10mL刻度试管； f 5mL刻度吸管；
g 1mL刻度吸管； h 50mL容量瓶；
I 50mL小烧杯。
3.试剂与溶液
3.1三氯乙酸：分析纯，CCl3COOH浓度为0.5mol/L；配制过程：称取40.8g三氯乙酸，加水溶解，稀释至500mL，混匀。
3.2硫酸：分析纯，稀硫酸；配制过程：于1000mL烧杯中加入150mL水，然后用500mL量筒量取485mL硫酸，慢慢倒入烧杯中，边加边缓缓搅动，冷却。
3.3蒽酮：分析纯；配制过程：称取0.04g蒽酮，加稀硫酸(4.7.3.2)25mL， 使之溶解，混匀。
4.操作步骤
4.1精确称取鲜酵母0.1g(精确到0.0002g)于离心管中，加入4.0mL0.5mol/L三氯乙酸溶液于振荡器振荡混匀后置带有冰块的冰水中，每15分钟振荡一次，共1小时，得到震荡液。
4.2将得到的震荡液在转速为3000r/min的离心机离心5min，得到上清液。
4.3将上清液倒入50mL容量瓶中，用冰水洗涤离心机上部及沉淀，振荡混匀后，再于离心机3000r/min离心5min，将上清液倒入50mL容量瓶中，然后用冰水稀释至刻度，摇匀。
4.4空白：于50mL容量瓶中加入4.0mL 0.5mol/L三氯乙酸溶液，用冰水稀释至刻度，摇匀。
4.5准确吸取空白及样品1.00mL于两个洁净干燥的试管中，再分别准确加入蒽酮试液5mL，振荡摇匀，在沸浴中反应10min，拿出立即冷却至室温，摇匀，于分光光度计630nm处，用1cm比色皿测定吸光度，以空白作对照。
5.结果计算
试样中海藻糖含量按下式计算：
其中，X-----试样中海藻糖的百分含量，％；
E-----试样的吸光度；
6.29-----当E＝1时，相应海藻糖的质量，mg；
W-----试样质量，g；
Ds-----试样干物质的百分含量，％；
6.结果的允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1％。
7.注意事项
7.1三氯乙酸的挥发性较强，所以整个实验用水必须用冰蒸馏水，海藻糖转化时要放在带有冰块的水中。
7.2在不知道离心机转速的情况下，离心时间以上清液是否清亮为准，若上清液还存在浑浊的情况，需继续离心至澄清，否则引入较大误差。
7.3蒽酮极易氧化，所配制的蒽酮溶液放置时间不得超过4小时。
7.4本实验所使用的玻璃仪器，必须十分清洁干净。
菌株制备实施例：
1、对取自果园的土壤按照常规的方法进行分离的酵母，经过分离得到大约1000株酵母，对分离出的1000株酵母进行鉴定。
1.1菌种形态学特性
利用沙氏琼脂培养基于32℃恒温箱中培养24h，然后观察菌落情况，并用结晶紫染色，在显微镜下观察其形态。从平板可以看到，布拉氏酵母菌在沙氏琼脂平板上的情况，菌落呈米白色、隆起、表面光滑、近圆形，其菌体成椭圆形，在生长后期近圆形。
2、菌种鉴定
将得到酵母菌株按照常规方法提取酵母基因组DNA，对其进行鉴定，布拉迪酵母的鉴定根据C.HENNEQUIN等最新研究结果，布拉酵母菌4号基因座的专一性序列(CAG)9进行鉴定，具体鉴定方法如下：
2.1微卫星(CAG)n序列引物的合成：上游引物：5′-CTTAAACAACAGCTCCCAAA-3′
下游引物：5′-ATTTCTGATGCGCTGATTCAT-3′
2.2扩增利用上述合成的引物对酵母基因组DNA进行扩增，
PCR反应体系：
每管中加入10×PCR buffer 2.5μL；20μmol/L上下引物各0.5μL；2.5mmol/LdNTP 2μL；模板DNA1μL，5.0U/μL Taq酶0.125μL，共25μL。
PCR反应条件：
95℃4min；95℃30s，55℃30s，72℃90s，循环30次；72℃10min。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳1h。
2.3测序及确认
扩增产物经纯化后，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序结果为微卫星序列CAG重复次数为9，确认为布拉迪酵母Saccharomyces boulardii，将该菌株命名为Saccharomyces boulardii布拉迪酵母安琪1.27。
3、选育
对筛选出的布拉迪酵母菌株进行紫外诱变选育，对选育出的14株菌株进行海藻糖含量、生物量和耐干燥能力的测定，选出一株海藻糖含量和生物量都较高的菌株，其海藻糖含量为17％，生物量达到150克/升发酵液，干燥后活细胞率达到88％。
上述海藻糖含量和活细胞率的测定方法按照前述的方法进行，其中生物量的测定方法是按照常规方法将酵母菌株进行发酵得到发酵液，将该发酵液在5000r/min的转速下离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两遍，称重，计算每毫升中菌体的质量，后换算为每升发酵液菌体的质量，即为生物量的数值，以克/升发酵液计算。
4、保藏
将该菌株在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，该保藏单位的地址：中国武汉武汉大学，保藏日期是：2012年4月16日，保藏编号是：CCTCC NO.M2012116。
实施例1
1)斜面菌种培养：将制备实施例中制备的布拉迪酵母菌种接种到含糖量为5重量％，pH值为4的麦芽汁琼脂固体斜面上，在26℃培养20小时，得到斜面酵母菌种；
2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种1环到装有100ml的含糖量为5重量％，pH值为4的麦芽汁F瓶中，在26℃培养20小时，得到一级液体种子培养液约100ml；
3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装有10L的含糖量为5重量％的麦芽汁，pH值为4的卡氏罐中，在26℃培养20小时， 得到二级液体种子培养液约10L；
4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有1m3的含糖量为5重量％的淀粉水解糖，补充硫酸铵10千克、磷酸铵3.5千克、硫酸镁1.5千克、泛酸钙20克、VB115克、VB220克、VB620克、生物素25克，pH值为4的种子发酵罐中，在24℃通气搅拌培养培养20小时，通入的无菌空气风量控制在10m3空气/发酵液m3/hr，最终得到发酵罐种子培养液约1m3；
5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到15m3发酵罐中，不断流加含糖量为15重量％pH值为4的淀粉水解糖，共流加11200千克，同时补充硫酸铵150千克、磷酸铵35千克、硫酸镁15千克、泛酸钙400克、VB1100克、VB2150克、VB 680克、生物素200克，其中硫酸铵、磷酸铵、采用流加方式，氯化钾、硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随种子培养液一起加入，后在24℃通气搅拌培养20小时，后将发酵液的pH用10％的氢氧化钠溶液调节至6.1；在调节pH至6.1后的1.5h时，将发酵液的温度升高到30℃进行发酵，同时加入氯化钠6.5kg。通入的无菌空气风量控制在30m3空气/发酵液m3/hr，发酵过程中每1小时检测一次发酵液中的乙醇含量，当发酵液中乙醇含量超过0.35％时，通过降低糖的流加速度和加大无菌空气的通风量以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％以下，最终得到流加培养液约10.5m3；
6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母约2200kg；
7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入1kg的山梨醇单硬脂酸酯和3.1kg植物油作为混合乳化剂，在造粒机中通过搅拌混匀，后加入9.3kg的干淀粉，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状的酵母条；
8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风温度115℃，出风温度80℃，干燥时间25分钟；
9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总数、活细胞率和水分含量结果见表1；
10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为布拉迪活性干酵母产品。
实施例2
1)斜面菌种培养：将制备实施例中制备的布拉迪酵母菌种接种到含糖量为20重量％，pH值为5的麦芽汁琼脂固体斜面上，在32℃培养48小时，得到斜面酵母菌种；
2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种6环到装有250的含糖量为20重量％，pH值为5的麦芽汁F瓶中，在32℃培养48小时，得到一级液体种子培养液约250ml；
3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装有20L的含糖量为20重量％的甘蔗糖蜜，pH值为5的卡氏罐中，在32℃培养36小时，得到二级液体种子培养液；
4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有3m3的含糖量为20重量％的甘蔗糖蜜，补充氨水150千克、磷酸氢二铵60千克、氯化钾20千克、硫酸镁8千克、泛酸钙120克、VB1100克、VB2120克、VB6120克、生物素125克，pH值为5的种子发酵罐中，在35℃通气搅拌培养培养36小时，通入的无菌空气风量控制在30m3空气/发酵液m3/hr，最终得到发酵罐种子培养液约3m3；
5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到180m3发酵罐中，不断流加含糖量为30重量％pH值为5的甘蔗糖蜜，共流加85000千克，同时补充氨水1100千克、磷酸氢二铵300千克，硫酸镁120千克、泛酸钙2400克、VB1360克、VB2750克、VB6360克、生物素1100克，其中碳酸氢铵、氨水采用流加方式加入，硫酸镁及泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随同种子培养液一起加入，后在35℃通气搅拌培养28小时，后将发酵液的pH用10％的氢氧化钠溶液调节至6.4；在调节pH至6.4后的3h时，将发酵液的温度保持在35℃进行发酵，同时加入氯化钠200kg，其中该步骤中通入的无菌空气风量控制在50m3空气/发酵液m3/hr，发酵过程中发酵过程中每1小时检测一次发酵液中的乙醇含量，当发酵液中乙醇含量超过0.35％时，通过降低糖的流加速度和加大无菌空气的通风量以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％以下，最终得到流加培养液75m3；
6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母 31000kg；
7)造粒：在步骤6)的鲜酵母中加入240kg的山梨聚糖月桂酸酯和87kg植物油作为混合乳化剂，在造粒机中通过搅拌混匀，后加入260kg的干淀粉搅拌均匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状的酵母条；
8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风温度70℃，出风温度40℃，干燥时间65分钟；
9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总数、活细胞率和水分含量的结果见表1；
10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为布拉迪活性干酵母产品。
实施例3
1)斜面菌种培养：将制备实施例中制备的布拉迪酵母菌种接种到含糖量为10重量％，pH值为6的麦芽汁琼脂固体斜面上，在30℃培养36小时，得到斜面酵母菌种；
2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种4环到装有500ml的含糖量为10重量％，pH值为6的麦芽汁F瓶中，在30℃培养36小时，得到一级液体种子培养液约500ml；
3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装有40L的含糖量为10重量％的麦芽汁和甜菜糖蜜的混合物，pH值为6的卡氏罐中，在30℃培养30小时，得到二级液体种子培养液；
4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有5m3的含糖量为10重量％的淀粉水解糖和甜菜糖蜜的混合物(1∶1)，补充氨水250千克、磷酸氢铵90千克、硫酸镁15千克、泛酸钙60克、VB140克、VB260克、VB660克、生物素70克，pH值为6的种子发酵罐中，在30℃通气搅拌培养培养30小时，通入的无菌空气风量控制在20m3空气/发酵液m3/hr，最终得到发酵罐种子培养液约5m3；
5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到100m3发酵罐中，不断流加含糖量为25重量％pH值为6的淀粉水解糖和甜菜糖蜜的混 合物(1∶1)，共流加144000千克，同时补充氨水1700千克、磷酸氢铵350千克、硫酸镁200千克、泛酸钙800克、VB1120克、VB2250克、VB6120克、生物素350克，其中硫酸铵、碳氨水、磷酸氢二铵采用流加方式，氯化钾、硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随同种子培养液一起加入，后在30℃通气搅拌培养24小时，后将发酵液的pH用10％的氢氧化钠溶液调节至6.2；在调节pH至6.2后的2h时，将发酵液的温度升高到35℃进行发酵，同时加入氯化钠157kg，其中该步骤中通入的无菌空气风量控制在80m3空气/发酵液m3/hr，发酵过程中每小时检测一次发酵液中的乙醇含量，当发酵液中乙醇含量超过0.35％时，通过降低糖的流加速度和加大无菌空气的通风量以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％以下发酵过程中控制糖的流加速度为，最终得到流加培养液约130m3；
6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母60000kg；
7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入130kg的山梨聚糖棕桐酸酯和151kg植物油作为混合乳化剂，在造粒机中通过搅拌混匀，后加入336kg的干淀粉搅拌均匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状的酵母条；
8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风温度100℃，出风温度80℃，干燥时间45分钟；
9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总数、活细胞率和水分含量结果见表1；
10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为布拉迪活性干酵母产品。
实施例4
1)斜面菌种培养：将制备实施例中制备的布拉迪酵母菌种接种到含糖量为15重量％，pH值为5.5的麦芽汁琼脂固体斜面上，在30℃培养30小时，得到斜面酵母菌种；
2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种5环到装有400ml的含糖量为15重量％，pH值为5.5的麦芽汁F瓶中，在30℃培养30小时，得到一 级液体种子培养液约400ml；
3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装有25L的含糖量为15重量％的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的混合物，pH值为5.5的卡氏罐中，在30℃培养30小时，得到二级液体种子培养液；
4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有4m3的含糖量为15重量％的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的混合物(1∶2)，补充硫酸铵300千克、磷酸100千克、硫酸镁12千克、泛酸钙90克、VB160克、VB290克、VB690克、生物素120克，pH值为5.5的种子发酵罐中，在30℃通气搅拌培养30小时，通入的无菌空气风量控制在25m3空气/发酵液m3/hr，最终得到发酵罐种子培养液约4m3；
5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到150m3发酵罐中，不断流加含糖量为25重量％pH值为5.5的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的混合物(1∶2)，共流加115900千克，补充硫酸铵1700千克、磷酸400千克、硫酸镁150千克、泛酸钙2300克、VB1370克、VB2800克、VB6360克、生物素1200克，其中硫酸铵、磷酸采用流加方式，硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随同种子培养液一起加入，后在30℃通气搅拌培养24小时，后将发酵液的pH用10％的氢氧化钠溶液调节至6.2；在调节pH至6.2后的2h时，将发酵液的温度升高到35℃进行发酵，同时加入氯化钠80kg，其中该步骤中通入的无菌空气风量控制在60m3空气/发酵液m3/hr，发酵过程中减少糖的流加速度为以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％，最终得到流加培养液105m3；
6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母42000kg；
7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入190kg的山梨聚糖硬脂酸酯和90kg植物油作为混合乳化剂，在造粒机中通过搅拌混匀，后加入200kg的干淀粉搅拌均匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状的酵母条；
8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风温度80℃，出风温度45℃，干燥时间50分钟；
9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总 数、活细胞率、水分含量和耐氯化钠浓度结果见表1；
10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为布拉迪活性干酵母产品。
实施例5
该实施例的布拉迪活性干酵母的制备方法中除了步骤5)采用下述步骤进行外，其他制备过程和参数控制均与实施例4相同，最终得到布拉迪活性干酵母铲平，测定各种参数见表1。
5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到150m3发酵罐中，不断流加含糖量为25重量％pH值为5.5的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的混合物(1∶2)，共流加115900千克，补充硫酸铵1700千克、磷酸400千克、硫酸镁150千克、泛酸钙2300克、VB1370克、VB2800克、VB6360克、生物素1200克，其中硫酸铵、磷酸采用流加方式，硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随同种子培养液一起加入，后在30℃通气搅拌培养26小时，其中该步骤中通入的无菌空气风量控制在60m3空气/发酵液m3/hr，发酵过程中减少糖的流加速度为以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％，最终得到流加培养液105m3。
实施例6
该实施例的布拉迪活性干酵母的制备方法中除了步骤7)采用下述步骤进行外，其他制备过程和参数控制均与实施例4相同，最终得到布拉迪活性干酵母产品，测定各种参数见表1。
7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入190kg的山梨聚糖硬脂酸酯在造粒机中通过搅拌混匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状的酵母条。
实施例7
该实施例的布拉迪活性干酵母的制备方法中除了步骤5)和7)采用下述步骤进行外，其他制备过程和参数控制均与实施例4相同，最终得到布拉迪活性干酵母产品，测定各种参数见表1。
5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到150m3 发酵罐中，不断流加含糖量为25重量％pH值为5.5的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的混合物(1∶2)，共流加115900千克，补充硫酸铵1700千克、磷酸400千克、硫酸镁150千克、泛酸钙2300克、VB1370克、VB2800克、VB6360克、生物素1200克，其中硫酸铵、磷酸采用流加方式，硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随同种子培养液一起加入，后在30℃通气搅拌培养26小时，其中该步骤中通入的无菌空气风量控制在60m3空气/发酵液m3/hr，发酵过程中减少糖的流加速度为以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％，最终得到流加培养液105m3。
7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入190kg的山梨聚糖硬脂酸酯在造粒机中通过搅拌混匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状的酵母条。
表1实施例1-6制备布拉迪迪高活性干酵母的技术指标测定结果
上表表明，其中实施例1-7制备的布拉迪活性干酵母的细胞总数在450-750亿/克，特别是实施例1-4制备的布拉迪活性干酵母的细胞总数在620-750亿/克。实施例1-7制备的布拉迪活性干酵母的活细胞率在65-88％之间，特别是实施例1-4制备的布拉迪活性干酵母的活细胞率在80％以上。另外，本发明实施例1-7制备的布拉迪活性干酵母的海藻糖含量为7.5-17.5％，特别是实施例1-4制备的布拉迪活性干酵母的海藻糖含量为15-17.5％；实施例1-7制备的布拉迪活性干 酵母过程中造粒步骤的时间为30-70min，特别是实施例1-4制备的布拉迪活性干酵母的过程中造粒步骤的时间在30-40min。上述结果证明本发明的制备方法制备的布拉迪迪高活性干酵母的质量较好。本发明的制备方法制备得到的布拉迪活性干酵母的工艺合适。
Claims (14)
1.一种布拉迪活性干酵母，其特征在于，其中干酵母的细胞总数为300-750亿/克、活细胞率为50-88％、水分为4-6％。
2.如权利要求1所述布拉迪活性干酵母的生产方法，包含如下步骤：
(1)菌种培养：将布拉迪酵母Saccharomyces boulardii接种到含糖量为5-20％的培养液中，在温度26-32℃条件下进行培养得到种子培养液；优选含糖量为10-20％，培养温度为27-30℃；
(2)发酵罐种子培养：将步骤(1)得到的种子培养液接种到含有营养源的种子发酵罐中通入无菌空气到含糖量为5-20％的培养液中，在温度24-35℃条件下进行培养，得到发酵罐种子培养液；优选通入无菌空气的风量控制在10-30m3空气/m3发酵液/hr；优选培养液的含糖量为10-20％，培养温度为30-35℃；
(3)发酵罐通气流加培养：将步骤(2)得到的发酵罐种子培养液接种到发酵罐中，后流加含糖量为15-30重量％的糖源、同时补充营养源，通入无菌空气在温度24-35℃条件下进行培养，当发酵20-28h时，将发酵液的pH调节至6.1-6.4；优选在调节pH至6.1-6.4后的1.5-3h时，将发酵液的温度升高到30-35℃进行发酵；得到流加培养液；优选通入的无菌空气风量控制在30-80m3空气/m3发酵液/hr；
(4)分离：将步骤(3)得到的流加培养液进行分离得到鲜酵母；
(5)成型：在步骤(4)得到的鲜酵母中加入乳化剂和植物油后进行造粒，得到成形的酵母；以及
(6)干燥：将步骤(5)得到的成形酵母进行干燥得到酵母颗粒。
3.如权利要求2或3所述的布拉迪活性干酵母的制备方法，其中步骤(1)接种的布拉迪Saccharomyces boulardii菌株为保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2012116的Saccharomyces boulardii布拉迪酵母安琪1.27菌株。
4.如权利要求2或3所述的布拉迪活性干酵母的制备方法，其中步骤(3) 中将发酵液的温度升高到30-35℃进行发酵时加入氯化钠，优选按照最终流加培养液总质量的0.05％-0.2％加入氯化钠，更优选按照最终得到流加培养液质量的0.05％-0.1％加入氯化钠。
5.如权利要求2-4任一项所述布拉迪活性干酵母的制备方法，其中步骤(5)中在加入乳化剂和植物油搅拌均匀后，加入淀粉后进行造粒，优选按照鲜酵母中干物质的质量的1.5-3％加入淀粉；优选淀粉选自玉米淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉、马铃薯淀粉和/或红薯淀粉中的一种或几种；优选按照鲜酵母中干物质的质量的0.5-1％加入植物油。
6.如权利要求2-5任一项所述的布拉迪活性干酵母的制备方法，其中步骤(1)中所述菌株培养经过斜面菌种培养、一级液体种子培养和二级液体种子培养。
7.如权利要求2-6任一项所述布拉迪活性干酵母的制备方法，其中步骤(1)和(2)中培养液的pH值为4-6，优选pH值为4.8-6.0。
8.如权利要求2-7任一项所述布拉迪活性干酵母的制备方法，其中步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤重复进行两次以上。
9.如权利要求2-8任一项所述布拉迪干酵母的制备方法，其中步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤中，控制发酵液中乙醇的含量在0.35％以下；优选通过降低糖源流加速度和加大通入无菌空气风量来控制发酵液中乙醇的含量。
10.如权利要求2-9任一项所述布拉迪活性干酵母的制备方法，其中所述营养源为氮源、磷源、氯化钾、硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6和生物素；优选氮源选自硫酸铵、碳酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵和磷酸氢二铵中的一种或其组合；优选磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或其组合。
11.如权利要求2-10任一项所述布拉迪酵母活性干酵母的制备方法，其中骤(3)发酵罐通气流加培养步骤中，营养源的加入方式为氮源、磷源采用流加方式，氯化钾、硫酸镁及微量元素随同发酵罐种子培养液一同加入。
12.如权利要求2-11任一项所述布拉迪酵母活性干酵母的制备方法，其中所述乳化剂选自山梨醇单硬脂酸酯、山梨聚糖月桂酸酯、山梨聚糖棕桐酸酯、 山梨聚糖硬脂酸酯、山梨聚糖硬脂酸甘油酯、山梨聚糖油酸酯或山梨聚糖甘油三油酸酯中的一种或其组合。
13.如权利要求2-12任一项所述布拉迪酵母活性干酵母的制备方法，其中所述植物油选自豆油，玉米油、芝麻油、菜籽油、葵花籽油、橄榄油和/或花生油。
14.一种权利要求2-13任一项所述制备方法制备得到的布拉迪活性干酵母。
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